KR20230157450A - 세포 선택 방법 - Google Patents
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Abstract
EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 적어도 하나의 특성에 기반한 세포 및/또는 세포 일부 선택 방법이 제공된다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고; 및/또는 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i) 내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고; 및/또는 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i) 내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
Description
본 발명은 바람직한 특성을 기반으로 세포를 선택하는 장치를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이러한 선택된 세포는 치료 또는 제조 용도를 위해 증식될 수 있다. 상기 방법은 입양 세포 치료 (ACT, adoptive cell threapy), 특히 세포 면역치료에서 유용할 수 있으나, 다른 유용성, 구체적으로 일반적으로 세포가 유전적으로 조작된 집단으로부터 세포의 특성을 규명하는 데 다른 유용성이 있다. 또한, 상기 방법은 면역글로불린이나 면역치료 약물과 같은 원하는 분자의 생산능을 기반으로 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 합성 생물학은 급속히 발전하는 분야이며, 제약 약물, 연료, 식음료를 생산하거나, 플라스틱 및 기타 오염물질을 분해할 수 있는 효소를 생산하기 위해 세포를 이용할 수 있다. 본 발명의 장치는 미세유체 분야이며, 미세액적을 조작할 수 있는 미세유체 장치에 관한 것이다.
세포를 빠르고 높은 처리량으로 처리하는 것은 연구, 개발 및 생산 동안 중요한 과제이다. 이는 세포를 식별하고 선택하는 것이 요구되고 동시에 추가 증식 또는 시험을 위해 세포를 유지해야 하는 세포 치료제 및 세포-유래 치료제와 같은 바이오 치료제의 개발의 경우 특히 그렇다. 세포들을 분류, 분석 및 선택하기 위한 종래의 방법들은 미세유체 장치의 발달에도 불구하고 여전히 느리고 번거롭다.
세포-기반 치료의 승인이 증가하고 있으며, 환자에게 주입된 세포가 바람직한 특성을 갖고, 환자에게 어떠한 위험이라도 초래할 수 있는 특성을 가지지 않도록 보장하는 것이 매우 중요하다. 면역계 유전 장애, 헤모글로빈 병증, 대사 질환 및 암을 포함한 많은 질병에 대해 환자로부터 제거하고, 유전적으로 조작(유전자 치료)하며, 환자에게 치환하는 세포의 사용법이 알려져 있다. 세포 기반 유전자 치료의 다른 용도는 눈의 질병 및 장애에 공지되어 있다.
일 예에서, 유전공학은 키메라 항원 수용체(CAR)로 알려진 세포 표면 수용체로 T 세포를 처리한다. 상기 CAR-T 세포는 발현된 세포 표면 마커를 통해 암 세포에 결합하고 특정 항-종양 반응을 유발할 수 있는 주요한 이점이 있다. 현재 허가된 치료법은 자가(autologous) T 세포의 재주입을 포함하지만, 향후에는 동종(allogenic) T 세포의 사용이 가능하다. 그럼에도 불구하고, 안정된 표현형을 가지고, 표면에 변형없이 정확한 CAR을 발현하는 CAR-T 세포를 사용하는 것과 상기 CAR가 환자의 건강한 세포가 표적화 되도록 하는 "표적 상/종양 외" 및 실질적 "표적 외" 결합능을 나타내지 않는 것이 매우 중요하다. 추가로, 주입 전에 CAR-T가 그 표적에 대한 효능을 갖는 지 확인하는 것이 유용하다. 현재 승인된 두 개의 CAR-T 세포 치료는 용량 일관성, 환자 안전성 및 제조 공정 영향과 관련된 여러 가지 알려진 결함이 있다. 이러한 결함은 입양 세포 치료 및 유전자 치료 분야에 걸쳐 공통적인 것으로 이해된다.
중요한 기본적인 요인들은 다음을 포함한다:
ㆍ 환자에게 예측할 수 없는 효능을 야기하는 치료 및 제작된 용량 간 수율의 극심한 변화.
ㆍ 알려진 표적 외 효과(CNS 표적 외 및 심장 표적과 같은)는 일부 환자에게 심각한 부작용을 일으킨다.
ㆍ 백혈구 채집의 수율 가변성으로 인해 최대 세포 생존력을 유지해야 하고, 주입 세포 서브 세트를 신중하게 선택해야 한다.
ㆍ 오염 물질(B 세포와 같은)은 배양물을 망가트릴 수 있다.
ㆍ 종양 표적에 대한 T 세포 활성을 측정하는 직접적이고 자동화된 방법이 없기 때문에 환자의 반응을 예측하는 것이 어렵거나 불가능하다.
또한, 세포는 치료 요법, 분석, 연구, 식음료, 농업 및 원료를 포함하는 다양한 용도를 위한 제품을 만들거나 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이는 세포를 효과적으로 사용하여 면역글로불린과 같이 분비된 생성물로서 세포로부터 수확되거나, 약물 분자와 같이 세포 내 생성물을 회수하기 위해 세포를 용해시킴으로써 수확되는 제품을 생산한다.
특히 흥미로운 것은 하이브리도마 및 림프구로부터 면역글로불린을 제조하는 것이다. 특정 항원 결합 능력을 갖는 면역글로불린을 생산하는 세포를 식별하여 특정 항원 결합 특성이 확인되면 상기 세포를 증식하거나 분석할 수 있도록 하는 것이 때로 바람직하다. 이러한 면역글로불린은 통상 항체, 예를 들어 단일클론 항체이며, 치료적으로 또는 분석 및 연구를 위해 사용될 수 있다. 상기 특성을 갖는 세포 또는 세포들을 선택함에 있어서, 수천 개의 세포들을 스크린하는 것이 필요할 수 있다. 원하는 생성물을 생산하는 세포의 수확 및 식별 간의 중간 단계는 손실 및/또는 성능 저하를 유발할 수 있기 때문에, 장치 상에 세포를 직접 로딩하여 처리 단계를 줄이는 것이 최선이다. 사전 FACs 분류를 하지 않으면, 원하지 않는 세포에 대한 원하는 세포의 비율이 크게 감소한다. 여기에는 대량의 액적 취급 및 스크리닝 능력이 요구된다.
생성물을 생산하는 바람직한 특성을 위해 세포를 선택하는 것은 해당 시험동안 세포가 손상되거나 파괴되는 결과를 초래할 수 있는데, 이는 원하는 생성물을 만드는 세포를 선택할 때 바람직하지 않다.
따라서 원하는 특성에 대해 세포를 스크리닝하는 노동 집약적 프로세스를 간소화하고 상기 세포의 선택 및 추후 증식 또는 추가적인 시험을 할 수 있으며, 원하지 않는 특성을 갖는 특정 세포를 거부할 수 있으며, 총 시간과 비용을 절감할 수 있는 강력한 방법이 필요하다. 따라서, 세포를 시험할 수 있을 뿐만 아니라 회수할 수 있는 것이 중요하다. 이러한 요구를 해결하기 위하여 미세유체 플랫폼이 제안되었지만, 아직까지 임상 환경에서 실용적이고 신뢰할 수 있다고 입증된 방법은 없다. 특히, 복수의 세포에 대해 동시 다중화된 분석을 수행하는 능력, 나아가 많은 세포를 고-처리량으로 동시에 처리하는 능력은 파악하기 어려운 것으로 입증되었다. 실제로, 해당 장치에서의 대부분의 작업은 격리된 펜과 같은 고정 구조의 사용에 의해 결정되며, 이는 세포에 대한 다중 분석을 실시할 수 있는 유연성을 허용하지 않는다. 여러 플랫폼은 개별 세포 수준에서의 조사를 허용하지 않고, 대신 복수의 세포에 대해 분석을 수행한다. 또한, 유연하지 않은 시스템은 연속적인 분석이 이루어지거나 일단 분석이 완료된 후 추가적인 증식을 위해 세포를 유지할 수 있는 메카니즘이 없기 때문에 상기 세포에 대해 단일 시험을 실행하는 것만이 가능함을 의미한다. 분석의 소형화는 분석 단계 동안 소비되는 시약의 부피를 감소시켜 소모성 물질의 비용을 낮춘다.
본 개시는 세포가 미세액적에 위치되고, 미세유체 칩의 표면에서 세포를 함유하는 미세액적을 조작하기 위한 구동 메카니즘이 유전체 상에서의 전기습윤(EWOD), 선택적으로 광학적으로 매개된 유전체 상에서의 전기습윤(oEWOD)인 세포 선택을 위한 방법을 제공한다.
이러한 칩 기반 장치의 사용은 넓은 범위의 크기에 걸친 미세액적을 조작할 수 있으며, 디지털방식으로 제어할 수 있도록 하며, 동적으로 재프로그램 가능한 작동 단계를 제공한다는 장점이 있다. 상기 장치 구조는 미세액적의 독립적인 제어와 같은 종래의 접근 방식과 비교하여 보다 정교하고 통합된 작업흐름을 허용할 뿐 아니라, 미세유체 칩 표면의 영역에 걸쳐 더 큰 밀도를 갖는 미세액적의 제어를 가능하게 한다.
본 개시는 EWOD 또는 oEWOD 미세 유체 칩의 유연성을 사용하여 미세액적의 높은 처리량 처리를 가능하게 하여 스크리닝 응용에서 다중 처리에 대한 필요성을 해결하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 청구된 세포 선택 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같이 세포(들), 세포(들)의 일부(들) 및/또는 세포 유래 종을 포함한다.
세포 선택 방법, 특히 치료 용도 또는 제조를 위한 세포 선택 방법이 본 명세서에 제공되며, 본 개시의 방법은 특히 입양 세포 치료, 유전자 치료 및 세포 기반 제조에 유용하다. 상기 선택된 세포는 더 큰 세포 집단의 서브 세트일 수 있으며, 여기에서 상기 세포는 일반적으로 동일한 유형 또는 동일한 종이다. 상기 선택된 세포는 동일한 유형 또는 동일한 종이 아닐 수 있다. 상기 세포는 세포 집단 내에서 이질성을 제공하도록 선택될 수 있다. 상기 세포는 유전적으로 동일할 수 있지만 특정 유전자가 켜지거나 꺼져있을 수 있다.
본 명세서에는 (바이오)화학물/(바이오)분자 개체 또는 다른 세포들(세포:세포 상호작용)과 같은 다른 개체(entities)들과 세포의 상호작용을 조사하기 위한 세포 선택 방법이 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 둘 이상의 선택된 세포들이 함께 결합되는 표적화된 세포:세포 상호작용을 포함할 수 있다.
본 명세서에는 단일 세포 또는 세포-세포 상호 작용 유래의 분비물(들)을 조사하기 위한 세포(들) 선택 방법이 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 둘 이상의 선택된 세포들이 함께 결합되는 표적화된 세포:세포 상호작용을 포함할 수 있다.
본 개시의 일 양태에 따르면, EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 세포 선택 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고;
및/또는 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i) 내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
따라서 상기 세포는 하나 이상의 특성에 기반하여 선택될 수 있다.
본 명세서에 기술된 상기 방법은 예를 들면 미세액적의 패널이 초기에 분할되어 적어도 하나의 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널을 단계 (i) 전에 제공하는 것과 같이, 적어도 하나의 분할 작업을 포함할 수 있다.
단계 (i) 의 미세액적의 패널이 하나 이상의 세포를 함유하는 경우, 단계 (iii) 이전에 분할 작업을 거칠 필요는 없다.
대안적으로 또는 추가적으로 하나 이상의 추가적인 분할 작업이 상기 방법의 임의의 적절한 단계에 포함될 수 있다. 상기 분할은 적어도 하나의 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널 및/또는 적어도 하나의 배지와 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 테스트 패널을 생성할 수 있다.
분할 작업은 세포가 분비물을 생산할 수 있는 경우, 임의의 분비물이 배지에 포함되도록 수행될 수 있다. 분할 단계는 상기 분비물의 농도가 상이할 수 있는 다수의 자손(child) 액적이 생성되도록 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 자손 미세액적이 상이한 농도의 분비물을 함유할 수 있도록, 분할 작업은 서로 다른 시간에 수행될 수 있다.
상기 분할 작업은 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 하나 이상의 참조 패널과, 적어도 하나의 세포가 있거나 없는 배지를 함유할 수 있는 미세액적의 하나 이상의 테스트 패널의 형성을 초래할 수 있다.
상기 방법은 관심있는 특성에 따라 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널과 적어도 배지를 함유하는 미세액적, 모두를 포함하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 분할 작업의 목적은 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널을 생성하는 것이다.
또는, EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 세포 선택 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 하나 이상의 세포 및 배지를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii. 상기 미세액적의 패널을 적어도 두 개의 미세액적의 패널, 즉 하나 이상의 세포를 포함하는 미세액적의 적어도 하나의 참조 패널 및 적어도 상기 배지를 포함하는 미세액적의 적어도 하나의 테스트 패널로 분할하는 단계;
iii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iv. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
v. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링하는 단계; 및
vi. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 참조 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계.
본 개시의 방법은 세포의 하나 이상의 특성을 검출 또는 결정하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 세포의 특성은 하나 이상의 세포 표면 분자의 존재; 하나 이상의 세포 활성의 존재; 세포의 형태; 하나 이상의 세포 분비물의 존재; 및/또는 하나 이상의 세포 내 생성물의 존재; 중 어느 하나 이상의 임의의 적절한 특성일 수 있다.
세포의 특성은 본 명세서에 기재된 방법에 따른 임의의 적절한 수단에 따라 결정될 수 있다. 상기 방법은 특성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있는 하나 이상의 리포터 개체를 사용할 수 있다. 상기 리포터 개체는 상기 특성에 대한 시험을 진행하고 있는 미세액적과 병합하기 위해, 미세액적 내에 제공될 수 있다.
본 명세서에 기술된 상기 방법은 여기에서는 참조 패널로 정의되는 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널이 생성되도록, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널이 분할되는 세포의 선택에 관한 것일 수 있다. 이러한 분할 단계 또는 분할 작업은 참조 패널이 적절한 지점에 구성되도록, 방법에서 임의의 적절한 지점 또는 단계에서 수행될 수 있다. 상기 참조 패널은 선택 중인 세포에 따라 방법에서 상이한 지점들/단계들에서 구성될 수 있다. 따라서 상기 참조 패널은 원래 고려 중인 세포들의 서브 세트를 함유할 수 있다.
상기 분할 단계는 또한 미세액적의 적어도 하나의 테스트 패널의 생성을 초래한다. 미세액적의 테스트 패널은 전구(pregenitor) 미세액적 유래의 배지를 함유할 수 있다. 세포가 분비할 수 있으면, 상기 배지는 또한 상기 세포로부터의 분비물을 함유할 수 있다. 테스트 패널과 참조 패널은 테스트 패널의 질의 결과와 바람직한 특성의 선택에 따라 적어도 하나의 세포를 함유하는 해당 참조 미세액적을 선택할 수 있도록 서로 연관되어 있다. 따라서, 상기 테스트 패널의 질의 결과가 전구 세포와 서로 연관될 수 있고, 동일한 것이 선택된다.
분할 단계 이전에, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 세포 분할, 선택적으로 클론 증식(clonal expansion)을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 해당 조건은 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 병합하는 것을 통해 상기 세포에 추가의 배지를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 다른 조건은 보충 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 병합하는 것에 의해 성장 인자, 영양소, 세포 시그널링 분자, 화학 물질 등과 같은 보충제를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
미세액적의 패널 내의 세포가 분열이 허용되면, 상기 참조 패널과 미세액적의 테스트 패널은 상기 참조 패널 또는 미세액적이 미세액적의 테스트 패널에 함유된 세포에 대응하는 세포의 적어도 하나의 클론 사본을 함유하도록 분할될 수 있다. 따라서, 상기 테스트 패널의 질의 결과가 전구 세포와 서로 연관될 수 있고, 동일한 것이 선택된다.
일 양태에 따라, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 상기 세포를 용해시키기 위한 약품을 함유하는 미세액적의 패널과 병합될 수 있다. 상기 단계는 결정될 세포의 특성이 세포 내 생성물의 존재인 경우 필요할 수 있다. 또는, 세포 내 생성물은 세포에 들어갈 수 있는 리포터 개체를 사용하여 직접 검출 할 수 있다.
따라서, 패널을 형성하는 미세액적 내의 상기 세포는 특정 리포터 개체에 노출되기 전에 세포 분열을 진행하도록 허용될 수 있다. 일단 상기 세포가 분열되면, 패널 내의 각 미세액적이 분할되어 적어도 두 개의 자손 미세액적 패널이 형성될 수 있으며, 그 안의 상기 미세액적은 적어도 하나의 세포를 포함한다. 적어도 하나의 미세액적 패널은 참조 패널로서 남겨질 수 있고, 적어도 하나의 다른 패널("테스트 패널")은 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 참조 패널과 상기 테스트 패널은 따라서 상응하거나 또는 연관된 세포를 함유하고, 테스트 패널에 대한 결과는 참조 패널에서 그에 상응하는 세포의 식별을 초래할 수 있다. 미세액적의 테스트 패널과 미세액적의 참조 패널은 각각 원래의 전구 세포로부터 유래된 세포를 함유하며, 따라서 유전적으로 동일하거나 클론인 것으로 설명될 수 있다.
본 발명의 임의의 양태에 따라, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 임의의 패널 내의 세포는 그들의 형태학적 특성에 대해 검사될 수 있고 상기 형태학적 특성은 세포의 서브 세트를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이 검사는, 상기 방법의 단계 (ii) 전에 수행하거나 혹은 상기 방법의 임의의 단계 이전에 또는 이후에 수행할 수 있다. 상기 형태학적 특성은 크기, 형상, 접착 상태, 블랩(blebs)과 같은 세포막 특징 및/또는 액포와 같은 세포 내 특징의 존재를 포함할 수 있다.
임의의 양태에 따른 세포의 선택은 세포의 서브 세트를 정의하고 나머지 세포들을 폐기하거나 무시하는 것을 의미한다. 선택은 양(특성의 존재에 기반한 세포의 선택) 또는 음(부정적 특성의 부재를 기반으로 한 세포의 선택)일 수 있다. 상기 폐기/무시된 미세액적은 상기 장치로부터 분배되거나 상기 패널 내에 유지되어 고려로부터 무시될 수 있다.
일부 양태에 따르면, 단계 (i) 이전에 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 세포의 특성을 결정하기 위해 적어도 하나의 분석 대상이 될 수 있으며, 상기 분석은 상기 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 적어도 하나의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 패널을 병합하고 상기 특성에 기반하여 적어도 하나의 리포터 개체에서의 변화를 결정하는 것에 의해 수행된다. 따라서, 임의의 분할 단계 이전에 초기 검사 또는 질의가 수행될 수 있다.
일 양태에 따르면, 일단 선택되면, 상기 세포는 증식 또는 추가의 시험을 위해 상기 장치로부터 분배될 수 있다.
본 개시의 다른 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 세포 선택 방법이 제공된다:
i) 적어도 하나의 세포 및 배지를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii) 하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 미세액적의 병합된 패널을 형성하는 단계;
iv) 상기 세포의 하나 이상의 특성에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 미세액적의 병합된 패널을 모니터링하고, 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 미세액적의 서브 세트를 선택하여 세포를 포함하는 미세액적의 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 세포를 포함하는 상기 미세액적의 선택된 패널을 취하고 선택적으로 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 이상 반복하며, 여기서 단계 (ii)에서는 하나 이상의 상이한 리포터 개체가 사용되는 단계;
vi) 단계 (v)에서 선택된 미세액적의 최종 패널에 기반하여 세포를 선택하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 적어도 두 개의 미세액적의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적절한 적어도 배지를 포함하는 미세액적의 테스트 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널을 분할하기 전에, 미세액적의 테스트 패널이 세포, 선택적으로는 상기 참조 패널로부터의 상기 세포의 클론 세포 사본을 함유하도록 상기 세포를 배양하여 세포 분열되도록 할 수 있다.
또는, 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는:
EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 세포 선택 방법을 제공한다:
i) 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 제1 패널을 제공하는 단계;
ii) 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 제1 패널의 미세액적과 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 제1 패널을 형성하는 단계;
iv) 세포의 하나 이상의 특성에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링하고, 리포터 개체에서의 상기 변화에 기반하여 미세액적의 제1 서브 세트를 선택하여 미세액적의 제1 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 추가 리포터 패널을 제공하는 단계;
vi) 미세액적의 선택된 패널 유래의 미세액적과 미세액적의 추가 리포터 패널 유래의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 제2 패널을 형성하는 단계;
vii) 세포의 하나 이상의 특성에 기초하여 상기 리포터 개체의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 제2 패널을 모니터링하고, 리포터 개체에서의 상기 변화에 기반하여 미세액적의 제2 서브 세트를 선택하여 미세액적의 제2 선택된 패널을 형성하며; 상기 세브 세트는 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 적어도 두 개의 미세액적의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적절한 적어도 배지를 포함하는 미세액적의 테스트 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
하기 특징은 본 명세서에 개시된 방법의 임의의 변형에 적용될 수 있다:
미세액적의 분할은 동일하거나 동일하지 않을 수 있어, 미세액적은 2 이상의 미세액적으로 분할될 수 있으며, 상기 2 이상의 미세액적의 각각은 그 크기가 같거나 다를 수 있다.
일 양태에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널을 분할하기 전에, 미세액적의 테스트 패널이 세포, 선택적으로는 상기 참조 패널로부터의 상기 세포의 클론 세포 사본을 함유하도록 상기 세포를 배양하여 세포 분열되도록 할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 일 실시예에 따르면, 단계 (i)에서 미세액적의 패널은 적어도 하나의 세포를 함유할 수 있거나, 상기 원래의 세포가 세포 분열을 진행한 경우 하나 이상의 세포를 함유할 수 있다. 본 발명의 방법의 목적은 특정 세포 유형의 특성을 규명하는 것이며, 여기에서 분석되는 동일한 유형의 세포 전체 집단에 걸친 세포의 특성은 가변적일 수 있다. 상기 방법은 세포 분열로 인해 발생하지 않은 동일한 유형의 복수의 다른 세포를 포함하는 미세액적을 폐기 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 일 실시예에 따르면, 단계 (i)에서의 미세액적의 패널은 적어도 배지를 함유할 수 있다. 적어도 배지를 포함하는 미세액적은 상기 배지에 세포를 함유하는 미세액적으로부터 분열되었거나, 또는 분할된다. 분할 단계 전에, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 배지를 함유하는 미세액적의 패널과 병합될 수 있으며, 이는 세포가 분비물을 생성하도록 유도하기 위해 선택적으로 시그널링 분자 또는 세포를 포함할 수 있다. 따라서 미세액적의 테스트 패널 내의 배지는 세포로부터의 분비물을 함유할 수 있으며, 이는 세포의 특성을 정의하기 위해 리포터 개체에 노출될 수 있다. 상기 방법은 관심 분비물을 포함하지 않는 미세액적을 폐기 또는 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 배지를 함유하는 액적은 세포를 함유하는 액적과 부피가 다를 수 있다,
또한, 선택적으로, 세포의 선택에 사용된 리포터 패널은 예를 들어 특정 세포 표면 마커의 발현과 같은 세포 표면 특성 또는 원하는 분자의 분비 같은 원하는 특성을 갖는 세포를 식별할 수 있게 한다. 이러한 과정에서의 리포터 개체는 세포 표면 분자 또는 분비된 분자와 결합 또는 상호 작용하는 개체일 수 있다.
선택적으로, 선택 단계는 원하는 세포:세포 상호 작용 특성, 예를 들어 세포 결합, 활성, 세포 융합, 세포 흡수 또는 세포 사멸에 의해 세포를 식별할 수 있게 한다. 이러한 선택 과정에서의 리포터 개체는 종양세포와 같은 세포일 수 있다.
선택적으로, 선택 단계는 생존력, 활성화 및/또는 증식 특성 또는 능력을 검사하기 위한 분석을 포함할 수 있다.
선택적으로 미세액적의 테스트 패널 내의 세포는, 존재하는 경우, 세포 내용물을 방출하도록 용해된다. 이러한 단계는 세포가 이미 세포 분열을 거쳤고, 각각이 적어도 한때는 세포를 포함한 미세액적의 참조 패널이 생성된 경우에 고려될 수 있다.
추가적인 분석이 필요하지 않은 것으로 판단되는 경우, 상기 방법 동안 어디에서라도 미세액적은 상기 패널로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포가 원하는 특성을 포함하지 않거나, 세포 분열을 진행하지 않거나, 리포터 개체 세포에서 세포 사멸을 촉진하거나 항원에 결합할 수 있는 항체를 방출하는 등 바람직한 특성을 갖지 않는 경우 미세액적은 폐기될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 임의의 종류의 세포를 분석하는 것이 바람직할 수 있지만, 상기 세포는 예를 들어 B 세포 또는 T 세포(림프구)일 수 있으며, 본 발명의 방법은 상기 세포에 내재적으로 존재할 수 있거나, 상기 세포에서 유전적으로 조작될 수 있는 특정 특성을 가진 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 또한 생물학적 세포로 설명된다. 즉 액적 내의 세포가 리포터 세포와 일차 세포의 조합, 또는 조직과 유사한 구조물을 형성하기 위해 상이한 표현형의 상피 세포를 결합한 배양물과 같은 이질적인 유형인 공동 배양물을 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 세포(들)은 자연적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 인위적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 미세세포일 수 있다. 본 발명의 방법은 세포가 없고 세포(들)의 일부, 예를 들면 핵 및/또는 미토콘드리아를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 리포솜을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 치료에 사용하기 위한 바람직한 특성을 갖는 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 연구에 사용하기 위한 바람직한 특성을 갖는 세포를 선택하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 분자/화합물/화학 물질과 같은 원하는 생성물의 제조에 사용하기 위한 바람직한 특성을 갖는 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 세포는 유전적으로 조작된 박테리아 세포 등일 수 있다.
도 1: 환자의 혈액을 수집하여 대량으로 증식하고 재주입하기 전에 T 세포를 분리, 형질도입, 분류 및 선택하는 예시적인 방법을 보여준다. 또한 상기 제조 공정에서 우리의 CAR-T 작업흐름이 목표로 하는 섹션도 나타내었다.
도 2: 예시적인 CAR-T 작업흐름에서 선량 측정 및 프로파일링 전의 초기 단계의 개요를 나타내며, 여기에서 환자 혈액으로부터 분리된 T 세포는 미세액적으로 유화, 정렬 및 형질도입된다. 원하지 않는 미세액적은 폐기되고 나머지 미세액적의 세포에 대해 다중 리포터 세포 표면 마커 분석이 수행된다. 이러한 분석에 기반하여, 미세액적의 패널이 선택된다.
도 3: 예시적인 CAR-T 작업흐름에서 후반 단계의 개요를 나타내며, 여기에서 상기 다중 리포터 세포 표면 마커 분석 후, 미세액적의 선택된 패널의 세포는 세포 생존력, 활성화 및 소진 거동(exhaustion behavior)에 대해 평가된다, 미세액적의 패널은 CAR-T 세포를 참조 패널에 유지하고 클론 CAR-T 세포를 추가 선택 단계에서 사용하도록 분할될 수 있다. 활성화 평가는 예를 들어 T 세포를 함유하는 미세액적을 암 세포를 함유하는 미세액적과 병합하고, 암-세포 사멸 활성을 정량화하는 것을 포함한다. 이후 미세액적의 최종 패널이 선택된다; T 세포는 대량 증식 및 환자에게 재주입을 위해 상기 장치로부터 분배된다.
도 4: 예시적인 면역-종양학 작업흐름에 대한 개요이며, 여기서: A) CHO 세포를 면역치료 약물을 생성하도록 변형하여 미세액적에 로딩시킨다; B) 상기 미세액적은 분할 시점에 따라 동일하거나 상이한 투여량을 함유하는 자손 액적으로 분할된다; C) T 세포를 함유하는 미세액적은 제1 병합 작업에서 암세포를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합되며, 상기 병합된 미세액적은 이후 제2 병합 작업에서 약물 투여량을 함유하는 미세액적과 병합된다; D) 암세포 사멸을 정량하여 양성 판정을 결정하고 양성 판정에 해당하는 CHO 세포를 선택하며; 그리고 E) 선택된 CHO 세포를 웰 플레이트로 분배하여 증식시킨다.
도 5: T 세포 또는 종양 세포와, TCR 약물을 함유하는 미세액적을 생성하기 위한 예시적인 준비 프로토콜을 나타낸다.
도 6: 다양한 T 세포(들)/종양 세포(들) 비율에서 각각 T 세포(들) 및 종양 세포(들)을 함유하는 미세액적의 패널을 나타낸다. 각 액적에 대해, 왼쪽의 각 박스에는 종양 세포(들)의 개수가 표시되어 있고, 우측의 각 박스에는 T 세포(들)의 수가 표시되어 있다. 액적 I, K 및 L은 종양 세포만을 함유하는 음성 대조군이다.
도 7: T 세포와 접촉하였을 때 세포자멸사(apoptossis)된 암 세포의 비율과 시(hour) 단위 시간의 그래프를 나타낸다. 종양만을 포함한 대조군에 대한 비교가 제공된다. 세포자멸사는 상기 시험 조건에서 상기 T 세포의 항 종양 사멸 활성의 리포터로 역할을 하며, 이는 추후 상기 T 세포의 증식이나 추가적인 분석을 위해 이들을 샘플링하기 위한 선택 기준으로 사용될 수 있다.
도 8: 8A는 36시간 동안 주기적으로 촬영한 T 세포와 2개의 종양 세포를 함유하는 미세액적의 명시야 이미지를 나타낸다. T 세포는 2개의 종양 세포를 연속적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 그래프 (8B)는 동일한 시간대에 각 종양 세포에 대한 카스파제 형광 강도를 정량하는 것에 의해 상기 종양 세포 사멸 활성을 확인한다.
도 9: 도9의 A: 동일한 시간대에 정량화된 카스파제 형광 강도를 보여주는 36 시간 실험의 처음 ~ 13시간 동안 주기적으로 촬영된 T 세포과 2개의 종양 세포를 함유하는 미세액적의 명시야 및 딥 레드(Deep Red) 염색된 클로즈업 이미지; 및 도9의 B): 역시 동일한 시간대에 정량화된 카스파제 형광 강도를 보여주는 실험의 후반 ~ 10시간 동안 주기적으로 촬영된 동일한 미세액적의 명시야 및 딥 레드(Deep Red) 염색된 클로즈업 이미지. 여기에서 T 세포의 연속적인 종양 세포 사멸 활성을 시각화할 수 있다.
도 10: 시간에 대한 백분율로 표현되는 하이브리도마 세포 생존력을 나타내며, 여기에서 상기 세포는 상기 장치 내 또는 액적 내에 있다. 세포 생존력은 액적 내에서 최대 5.3시간, 장치 내에서 3.6시간 동안 100%를 유지하였으며, 액적 내에서 최대 20.3시간, 장치 내에서 최대 18.6시간 동안 >90%를 유지하였다.
도 11: 좌) 하이브리도마 세포(들) 및 비드(들) 또는 비드(들)만, 또는 하이브리도마 세포(들)만을 함유하는 미세액적의 패널의 이미지를 나타낸다. 세포는 원으로 표시하는 한편, 비드는 사각형으로 표시하였다. Cl 및 C2는 각각 비드만을 함유하고, C3는 세포만을 함유하며, D1 내지 D3는 각각 2개의 세포와 1개의 비드, D4 및 D5는 각각 1개의 세포 및 1개의 비드를 함유한다. 우) 비드 형광을 함께 보여주는 동일한 패널의 이미지를 나타낸다. 형광 응집체는 D1 내지 D5에서 다양한 정도로 나타났다. 세포만 또는 비드만(대조군)을 포함하는 미세액적에서는 형광이 검출되지 않았다.
도 12: 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 유리 항-표적 항체 농도를 X축에 표시한 그래프를 나타낸다. 가장 오른쪽에는 관련없는 하이브리도마의 집단 및 표적 하이브리도마의 집단에 대한 필터링된 평균 형광을 도시하였다. 표적 하이브리도마 세포를 분비하는 경우 유리 항-표적 항체에 대해 관측되는 최대 수준에 가까운 형광이 측정되었음을 알 수 있다.
도 13: 표적 비드로 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 시간을 X축에 표시한 다중 스파이킹 분석에 대한 데이터를 제시하는 그래프를 나타낸다. 표적 또는 관련없는 하이브리도마 세포(들) 및 리포터를 함유하는 미세액적의 집단에 대해 표적 비드 필터링된 AF488 형광이 시간에 대해 측정된다. 또한 음성 대조군이 포함된다. 관련없는 하이브리도마 세포(들)을 포함하는 D2는 어둡게 유지되어 음성 대조군(들)과 구별할 수 없었다. 모든 표적 하이브리도마는 양성 신호를 나타낸다.
도 14: 10x 대물렌즈를 사용한 SoIR1, R3, R5 비드의 형광 및 명시야(삽입 그림) 이미지를 나타낸다. 상기 그래프는 비드가 쉽게 구별될 수 있도록 허용하는 다수의 SoIR1, R3 및 R5 비드의 집단에 대해 측정된 필터링된 형광을 보여준다.
도 15: 상단) 비드 필터링된 형광을 Y축에, AF488 필터링된 형광을 X축에 표시한 다중 비드 분석에 대한 데이터를 제시하는 그래프. 필터링된 AF488 형광은 표적 또는 관련없는 하이브리도마와, 리포터를 함유하는 미세액적 집단에 대해 각 비드에서 측정된다. 상기 비드는 검출 시스템 (R5 인간 표적, R3 오프-표적 및 R1 사이노 표적)에 의해 디코딩된다. 양성(25 nM 유리 표적 항체)및 음성(항-마우스 AF488 단독) 대조군 미세액적 역시 분석된다. 양성 대조군 미세액적은 두 표적 항원(R1 및 R5) 모두에 대해 유리 표적 항체의 결합이 확인된 반면 음성 대조군 미세액적은 어둡게 유지되는 것을 볼 수 있다. 분비된 항체를 함유하는 미세액적 역시 두 표적 항원 모두에 결합한다. 하단) 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 미세액적 카테고리를 X축에 표시한 막대 그래프를 보여주며, 여기서 각 카테고리는 추가로 R1, R3, R5 하위 카테고리로 나누어진다.
도 16: 예시적인 단일클론 항체 발굴 작업흐름의 개요이며, 여기서: B 세포는 미세액적에 로딩되고, 부피를 증가시켜 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합된다; 병합된 미세액적은 자손 액적으로 분할하여 각 세포에 의해 생성된 복수 용량의 분비 항체를 얻는다; 항체 용량을 함유하는 미세액적은 테스트 패널로 분류되는 한편, B 세포를 함유하는 미세액적은 참조 패널로 분류된다; 테스트 패널은 미세액적의 리포터 패널과 쌍으로 병합된다; 병합된 리포터-mAb 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템이 사용된다; 그리고 상기 양성 판정에 대응하는 B 세포를 함유하는 상기 참조 패널의 미세액적이 웰 플레이트로 분배되고 증식된다.
도 17: 예시적인 박테리아 세포 작업흐름의 개요이며, 여기서: 박테리아 세포는 미세액적에 로딩되고 부피를 증가시켜 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합된다; 상기 병합된 미세액적은 세포 분열을 진행하도록 한 다음 클론 콜로니로 분할된다; 클론 박테리아 세포를 함유하는 미세액적의 한 세트는 참조 패널로 유지되는 한편, 클론 박테리아 세포를 포함하는 미세액적의 추가적 세트 또는 상기 박테리아 세포의 분비물을 함유하는 미세액적의 세트는 미세액적의 테스트 패널로 분류된다; 미세액적의 테스트 패널은 미세액적의 리포터 패널과 쌍으로 병합된다; 박테리아 세포는 용해되어 이들의 내용물을 방출할 수 있다; 병합된 리포터-박테리아 세포 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템이 사용된다; 상기 양성 판정에 대응하는 박테리아 세포를 함유하는 상기 참조 패널의 미세액적이 웰 플레이트로 분배되어 증식된다.
도 18: oEWOD 구성을 나타낸다.
도 19의 A는 액적 쌍을 병렬로 병합하는 액적 병합 작업의 이미지를 제공한다.
도 19의 B는 병합 전에 함께 이동하는 쌍을 이룬 미세액적의 이미지를 제공한다.
도 19의 C는 병합된 미세액적의 이미지를 제공한다.
도 20의 A는 액적의 병렬 분할을 통한 액적 분할 작업을 보여준다.
도 20의 B는 분할 작업 중간에 늘려진 액적을 보여준다.
도 20의 C는 한쌍의 파생(daughter) 액적으로 분할된 액적을 보여준다.
도 21은 단일 세포 점유 상태에서 미세액적에 캡슐화된 S. cerevisiae 바이오 입자(가열된 비활성화 효모)의 이미지를 제공한다.
도 22는 오일 내 세포 배지의 에멀젼에서 미세액적 내부에 사이토카인 리포터 비드로 캡슐화된 사이토카인 분비 세포의 이미지를 제공한다. 분비된 사이토카인의 존재하에서, 리포터 비드는 형광 태그 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 메커니즘을 통해 형광을 발한다. 명시야 이미지는 (a) 액적 내의 세포 및 비드의 분포를 나타낸다. 형광 이미지는 b) 어떤 리포터 비드가 분비된 사이토카인의 존재 하에서 양성 반응을 나타내는 지, c) 온전한 막 무결성을 가진 모든 세포의 위치, d) 모든 비드의 위치, 및 e) 프로피디움 요오다이드 염색에 의해 표시되는 죽은 세포를 나타낸다.
도 23은 로딩, 분류, 병합, 분할 작업과 같은 미세액적의 조작을 포함하는 미세액적의 유연하고 독특한 작업흐름 운영이다. 작업흐름의 어느 지점에서나 프로그램 가능한 결정이 구현될 수 있으며, 이는 원래의 순서에서 벗어나고/거나 액적의 선택에만 작업을 적용할 수 있다.
도 24: 항체를 분비하는 세포는 오일 내 세포 배지의 에멀젼에서 액적 내의 리포터 비드와 함께 캡슐화된다. 분비된 항체의 존재하에서, 리포터 비드는 형광 태그 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 메커니즘을 통해 형광을 발한다. 명시야 이미지 (a)는 액적 내의 세포 및 비드의 분포를 나타낸다. 형광 이미지는 b) 어떤 리포터 비드가 분비된 사이토카인의 존재 하에서 양성 반응을 나타내는 지, c) 온전한 막 무결성을 가진 모든 세포의 위치, 및 d) 죽은 세포를 나타낸다.
도 25: 세포 분비 또는 세포-세포 상호 작용을 모니터링하기 위한 다양한 검출 모드.
도 26: 전형적인 미세액적 작업을 보여주는 작업플로우. 세포를 함유하는 미세액적은 분할, 병합, 분류 작업 등과 같이 조작될 수 있다. 미세액적은 또한 리포터들을 함유할 수 있다.
도 27: 분류 방안 및/또는 병합 및 분배 작업의 조합을 기술하는 작업흐름.
도 28의 A 내지 28의 D: 세포 내 칼슘에 대한 염료의 존재 하에 배양된 미세액적 내에 캡슐화된 세포의 다양한 이미지.
도 2: 예시적인 CAR-T 작업흐름에서 선량 측정 및 프로파일링 전의 초기 단계의 개요를 나타내며, 여기에서 환자 혈액으로부터 분리된 T 세포는 미세액적으로 유화, 정렬 및 형질도입된다. 원하지 않는 미세액적은 폐기되고 나머지 미세액적의 세포에 대해 다중 리포터 세포 표면 마커 분석이 수행된다. 이러한 분석에 기반하여, 미세액적의 패널이 선택된다.
도 3: 예시적인 CAR-T 작업흐름에서 후반 단계의 개요를 나타내며, 여기에서 상기 다중 리포터 세포 표면 마커 분석 후, 미세액적의 선택된 패널의 세포는 세포 생존력, 활성화 및 소진 거동(exhaustion behavior)에 대해 평가된다, 미세액적의 패널은 CAR-T 세포를 참조 패널에 유지하고 클론 CAR-T 세포를 추가 선택 단계에서 사용하도록 분할될 수 있다. 활성화 평가는 예를 들어 T 세포를 함유하는 미세액적을 암 세포를 함유하는 미세액적과 병합하고, 암-세포 사멸 활성을 정량화하는 것을 포함한다. 이후 미세액적의 최종 패널이 선택된다; T 세포는 대량 증식 및 환자에게 재주입을 위해 상기 장치로부터 분배된다.
도 4: 예시적인 면역-종양학 작업흐름에 대한 개요이며, 여기서: A) CHO 세포를 면역치료 약물을 생성하도록 변형하여 미세액적에 로딩시킨다; B) 상기 미세액적은 분할 시점에 따라 동일하거나 상이한 투여량을 함유하는 자손 액적으로 분할된다; C) T 세포를 함유하는 미세액적은 제1 병합 작업에서 암세포를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합되며, 상기 병합된 미세액적은 이후 제2 병합 작업에서 약물 투여량을 함유하는 미세액적과 병합된다; D) 암세포 사멸을 정량하여 양성 판정을 결정하고 양성 판정에 해당하는 CHO 세포를 선택하며; 그리고 E) 선택된 CHO 세포를 웰 플레이트로 분배하여 증식시킨다.
도 5: T 세포 또는 종양 세포와, TCR 약물을 함유하는 미세액적을 생성하기 위한 예시적인 준비 프로토콜을 나타낸다.
도 6: 다양한 T 세포(들)/종양 세포(들) 비율에서 각각 T 세포(들) 및 종양 세포(들)을 함유하는 미세액적의 패널을 나타낸다. 각 액적에 대해, 왼쪽의 각 박스에는 종양 세포(들)의 개수가 표시되어 있고, 우측의 각 박스에는 T 세포(들)의 수가 표시되어 있다. 액적 I, K 및 L은 종양 세포만을 함유하는 음성 대조군이다.
도 7: T 세포와 접촉하였을 때 세포자멸사(apoptossis)된 암 세포의 비율과 시(hour) 단위 시간의 그래프를 나타낸다. 종양만을 포함한 대조군에 대한 비교가 제공된다. 세포자멸사는 상기 시험 조건에서 상기 T 세포의 항 종양 사멸 활성의 리포터로 역할을 하며, 이는 추후 상기 T 세포의 증식이나 추가적인 분석을 위해 이들을 샘플링하기 위한 선택 기준으로 사용될 수 있다.
도 8: 8A는 36시간 동안 주기적으로 촬영한 T 세포와 2개의 종양 세포를 함유하는 미세액적의 명시야 이미지를 나타낸다. T 세포는 2개의 종양 세포를 연속적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 그래프 (8B)는 동일한 시간대에 각 종양 세포에 대한 카스파제 형광 강도를 정량하는 것에 의해 상기 종양 세포 사멸 활성을 확인한다.
도 9: 도9의 A: 동일한 시간대에 정량화된 카스파제 형광 강도를 보여주는 36 시간 실험의 처음 ~ 13시간 동안 주기적으로 촬영된 T 세포과 2개의 종양 세포를 함유하는 미세액적의 명시야 및 딥 레드(Deep Red) 염색된 클로즈업 이미지; 및 도9의 B): 역시 동일한 시간대에 정량화된 카스파제 형광 강도를 보여주는 실험의 후반 ~ 10시간 동안 주기적으로 촬영된 동일한 미세액적의 명시야 및 딥 레드(Deep Red) 염색된 클로즈업 이미지. 여기에서 T 세포의 연속적인 종양 세포 사멸 활성을 시각화할 수 있다.
도 10: 시간에 대한 백분율로 표현되는 하이브리도마 세포 생존력을 나타내며, 여기에서 상기 세포는 상기 장치 내 또는 액적 내에 있다. 세포 생존력은 액적 내에서 최대 5.3시간, 장치 내에서 3.6시간 동안 100%를 유지하였으며, 액적 내에서 최대 20.3시간, 장치 내에서 최대 18.6시간 동안 >90%를 유지하였다.
도 11: 좌) 하이브리도마 세포(들) 및 비드(들) 또는 비드(들)만, 또는 하이브리도마 세포(들)만을 함유하는 미세액적의 패널의 이미지를 나타낸다. 세포는 원으로 표시하는 한편, 비드는 사각형으로 표시하였다. Cl 및 C2는 각각 비드만을 함유하고, C3는 세포만을 함유하며, D1 내지 D3는 각각 2개의 세포와 1개의 비드, D4 및 D5는 각각 1개의 세포 및 1개의 비드를 함유한다. 우) 비드 형광을 함께 보여주는 동일한 패널의 이미지를 나타낸다. 형광 응집체는 D1 내지 D5에서 다양한 정도로 나타났다. 세포만 또는 비드만(대조군)을 포함하는 미세액적에서는 형광이 검출되지 않았다.
도 12: 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 유리 항-표적 항체 농도를 X축에 표시한 그래프를 나타낸다. 가장 오른쪽에는 관련없는 하이브리도마의 집단 및 표적 하이브리도마의 집단에 대한 필터링된 평균 형광을 도시하였다. 표적 하이브리도마 세포를 분비하는 경우 유리 항-표적 항체에 대해 관측되는 최대 수준에 가까운 형광이 측정되었음을 알 수 있다.
도 13: 표적 비드로 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 시간을 X축에 표시한 다중 스파이킹 분석에 대한 데이터를 제시하는 그래프를 나타낸다. 표적 또는 관련없는 하이브리도마 세포(들) 및 리포터를 함유하는 미세액적의 집단에 대해 표적 비드 필터링된 AF488 형광이 시간에 대해 측정된다. 또한 음성 대조군이 포함된다. 관련없는 하이브리도마 세포(들)을 포함하는 D2는 어둡게 유지되어 음성 대조군(들)과 구별할 수 없었다. 모든 표적 하이브리도마는 양성 신호를 나타낸다.
도 14: 10x 대물렌즈를 사용한 SoIR1, R3, R5 비드의 형광 및 명시야(삽입 그림) 이미지를 나타낸다. 상기 그래프는 비드가 쉽게 구별될 수 있도록 허용하는 다수의 SoIR1, R3 및 R5 비드의 집단에 대해 측정된 필터링된 형광을 보여준다.
도 15: 상단) 비드 필터링된 형광을 Y축에, AF488 필터링된 형광을 X축에 표시한 다중 비드 분석에 대한 데이터를 제시하는 그래프. 필터링된 AF488 형광은 표적 또는 관련없는 하이브리도마와, 리포터를 함유하는 미세액적 집단에 대해 각 비드에서 측정된다. 상기 비드는 검출 시스템 (R5 인간 표적, R3 오프-표적 및 R1 사이노 표적)에 의해 디코딩된다. 양성(25 nM 유리 표적 항체)및 음성(항-마우스 AF488 단독) 대조군 미세액적 역시 분석된다. 양성 대조군 미세액적은 두 표적 항원(R1 및 R5) 모두에 대해 유리 표적 항체의 결합이 확인된 반면 음성 대조군 미세액적은 어둡게 유지되는 것을 볼 수 있다. 분비된 항체를 함유하는 미세액적 역시 두 표적 항원 모두에 결합한다. 하단) 필터링된 AF488 형광을 Y축에, 미세액적 카테고리를 X축에 표시한 막대 그래프를 보여주며, 여기서 각 카테고리는 추가로 R1, R3, R5 하위 카테고리로 나누어진다.
도 16: 예시적인 단일클론 항체 발굴 작업흐름의 개요이며, 여기서: B 세포는 미세액적에 로딩되고, 부피를 증가시켜 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합된다; 병합된 미세액적은 자손 액적으로 분할하여 각 세포에 의해 생성된 복수 용량의 분비 항체를 얻는다; 항체 용량을 함유하는 미세액적은 테스트 패널로 분류되는 한편, B 세포를 함유하는 미세액적은 참조 패널로 분류된다; 테스트 패널은 미세액적의 리포터 패널과 쌍으로 병합된다; 병합된 리포터-mAb 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템이 사용된다; 그리고 상기 양성 판정에 대응하는 B 세포를 함유하는 상기 참조 패널의 미세액적이 웰 플레이트로 분배되고 증식된다.
도 17: 예시적인 박테리아 세포 작업흐름의 개요이며, 여기서: 박테리아 세포는 미세액적에 로딩되고 부피를 증가시켜 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍으로 병합된다; 상기 병합된 미세액적은 세포 분열을 진행하도록 한 다음 클론 콜로니로 분할된다; 클론 박테리아 세포를 함유하는 미세액적의 한 세트는 참조 패널로 유지되는 한편, 클론 박테리아 세포를 포함하는 미세액적의 추가적 세트 또는 상기 박테리아 세포의 분비물을 함유하는 미세액적의 세트는 미세액적의 테스트 패널로 분류된다; 미세액적의 테스트 패널은 미세액적의 리포터 패널과 쌍으로 병합된다; 박테리아 세포는 용해되어 이들의 내용물을 방출할 수 있다; 병합된 리포터-박테리아 세포 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템이 사용된다; 상기 양성 판정에 대응하는 박테리아 세포를 함유하는 상기 참조 패널의 미세액적이 웰 플레이트로 분배되어 증식된다.
도 18: oEWOD 구성을 나타낸다.
도 19의 A는 액적 쌍을 병렬로 병합하는 액적 병합 작업의 이미지를 제공한다.
도 19의 B는 병합 전에 함께 이동하는 쌍을 이룬 미세액적의 이미지를 제공한다.
도 19의 C는 병합된 미세액적의 이미지를 제공한다.
도 20의 A는 액적의 병렬 분할을 통한 액적 분할 작업을 보여준다.
도 20의 B는 분할 작업 중간에 늘려진 액적을 보여준다.
도 20의 C는 한쌍의 파생(daughter) 액적으로 분할된 액적을 보여준다.
도 21은 단일 세포 점유 상태에서 미세액적에 캡슐화된 S. cerevisiae 바이오 입자(가열된 비활성화 효모)의 이미지를 제공한다.
도 22는 오일 내 세포 배지의 에멀젼에서 미세액적 내부에 사이토카인 리포터 비드로 캡슐화된 사이토카인 분비 세포의 이미지를 제공한다. 분비된 사이토카인의 존재하에서, 리포터 비드는 형광 태그 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 메커니즘을 통해 형광을 발한다. 명시야 이미지는 (a) 액적 내의 세포 및 비드의 분포를 나타낸다. 형광 이미지는 b) 어떤 리포터 비드가 분비된 사이토카인의 존재 하에서 양성 반응을 나타내는 지, c) 온전한 막 무결성을 가진 모든 세포의 위치, d) 모든 비드의 위치, 및 e) 프로피디움 요오다이드 염색에 의해 표시되는 죽은 세포를 나타낸다.
도 23은 로딩, 분류, 병합, 분할 작업과 같은 미세액적의 조작을 포함하는 미세액적의 유연하고 독특한 작업흐름 운영이다. 작업흐름의 어느 지점에서나 프로그램 가능한 결정이 구현될 수 있으며, 이는 원래의 순서에서 벗어나고/거나 액적의 선택에만 작업을 적용할 수 있다.
도 24: 항체를 분비하는 세포는 오일 내 세포 배지의 에멀젼에서 액적 내의 리포터 비드와 함께 캡슐화된다. 분비된 항체의 존재하에서, 리포터 비드는 형광 태그 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 메커니즘을 통해 형광을 발한다. 명시야 이미지 (a)는 액적 내의 세포 및 비드의 분포를 나타낸다. 형광 이미지는 b) 어떤 리포터 비드가 분비된 사이토카인의 존재 하에서 양성 반응을 나타내는 지, c) 온전한 막 무결성을 가진 모든 세포의 위치, 및 d) 죽은 세포를 나타낸다.
도 25: 세포 분비 또는 세포-세포 상호 작용을 모니터링하기 위한 다양한 검출 모드.
도 26: 전형적인 미세액적 작업을 보여주는 작업플로우. 세포를 함유하는 미세액적은 분할, 병합, 분류 작업 등과 같이 조작될 수 있다. 미세액적은 또한 리포터들을 함유할 수 있다.
도 27: 분류 방안 및/또는 병합 및 분배 작업의 조합을 기술하는 작업흐름.
도 28의 A 내지 28의 D: 세포 내 칼슘에 대한 염료의 존재 하에 배양된 미세액적 내에 캡슐화된 세포의 다양한 이미지.
본 발명자들은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여, 종래 기술에 의한 세포 선택 방법의 결함을 극복할 수 있음을 발견하였다. 본 명세서에 개시된 방법을 사용하면 더 나은 제품 품질, 예측가능성 및 더 많은 수의 유리한 세포 선택이 가능해진다.
본 개시의 방법은 특히, 복수의 특성에 대해 세포를 시험하여 원하는 특성과 최상의 프로파일을 갖는 세포가 선택될 수 있도록 하며, 세포 치료의 관점에서 가장 안전한 프로파일이 될 수 있기 때문에 독특하다. 개시된 상기 방법은 선택 후 추가적인 증식 또는 시험을 허용하는 형식으로 원하는 특성을 갖는 세포의 선택을 허용한다. 원하는 세포 특성은 특정 세포 표면 분자의 존재/부재, 분비물의 존재/부재, 세포 내 생성물의 존재/부존재, 세포의 형태, 생존력, 증식능 및/또는 원하는 세포:세포 상호 작용 활성의 존재 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 방법은 미세액적을 조작할 수 있는 미세유체 장치에서 수행되며, 여기에는 적어도 하나의 세포 또는 세포(들)의 일부(들)이 존재한다. 상기 세포(들)은 자연적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 인위적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 미세세포일 수 있다. 적어도 하나의 리포솜이 존재할 수 있다.
장치
본 발명은 EWOD 또는 oEWOD 장치와 같은 미세액적 조작 장치에서 수행될 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 방법에 따른 미세액적의 조작을 허용하는 임의의 적절한 장치가 사용될 수 있다.
액적 또는 자성 비드를 조작하기 위한 장치는 당업계에 이미 공지된 기술이다; 예를 들어 US6,565,727, US2013-0233425 및 US2015-0027889를 참조하여 기술된다. 액적의 경우 이는 일반적으로, 예를 들어 비혼화성 운반매의 존재 하에서 액적이 카트리지의 대향하는 두 벽 또는 마이크로 유체 튜브에 의해 형성된 마이크로 유체 채널을 통해 이동하게 함으로써 달성된다. 카트리지 또는 튜브의 벽에는 유전체 층으로 피복된 전극이 내장되어 있으며, 이들 각각은 상기 층의 전기습윤 전계 특성을 수정하기 위해 간격을 가지며 빠르게 온/오프 될 수 있는 A/C 바이어싱(biasing) 회로에 연결된다. 이는 주어진 경로를 따라 액적을 조종하는 데 사용될 수 있는 국부적이고 방향성을 가지는 모세관 힘을 발생시킨다.
유전체 상의 전기습윤(EWOD, Electrowetting-on-dielectric)은 액체와 기판 사이에 인가된 전기장이 자연 상태보다 표면에 액체를 더 습윤시키다는 잘 알려진 효과이다. 전기습윤 효과는 기판에 공간적으로 변화하는 일련의 전기장을 가하여 공간적 변화에 따른 표면 습윤성을 차례로 증가시킴으로써 유체를 조작(예, 이동, 분할 또는 모양의 변경)하는 데 사용할 수 있다. 전기습윤 기반 장치에서 조작되는 액적은 일반적으로 두 개의 평행한 판 사이에 끼워져 디지털 전극에 의해 작동된다.
광학 매개 전기습윤에 기반한 이 접근 방식의 변형은 예를 들어 US6,958,132, US2015-0298125 및 US9,815,056에 기술되어 있다. 일반적으로 10 ㎛보다 작은 크기 범위에서 수천 개의 미세액적을 동시에 조작할 수 있도록 하는 이 접근법의 개선된 버전이 WO2018/234445에 기술되어 있으며, 본 명세서에 참조에 의해 통합된다. 상기 oEWOD 장치에서, 미세액적은 함유된 벽(예를 들어 그 사이에 미세유체 공간을 갖는 한 쌍의 평행판)에 의해 정의된 미세유체 공간을 통해 이동된다. 상기 함유된 벽 중 적어도 하나는, 벽 내부에 매립된 반도체 층의 영역을 선택적으로 조명함으로써 생성되는, '가상' 전기습윤 전극위치로 지칭되는 것을 포함한다. 별도의 광원 유래의 빛으로 상기 층을 선택적으로 조명함으로써, 이를 따라 미세액적이 이동할 수 있는 가상 전기습윤 전극위치의 가상 경로가 일시적으로 생성될 수 있다. 또한, 적합한 oEWOD 장치가 W02020/104769에 기술되며, 이 또한 참조에 의해 통합되며, 이는 상기 미세액적이 세포를 함유하는 경우 특히 연관되기 때문에 특히 상기 방법에 적용할 수 있다. 다른 oEWOD 장치는 WO2020/169965에 기술되며, 본 명세서에 참조에 의해 통합된다.
oEWOD의 또 다른 개시는 박, 성-용, Michael A. Teitell 및 Eric PY Chiou, "광 패턴으로 액적 조작을 하기 위한 편면 연속 광전기습윤(SCOEW, sigle-sided continuous ootoelectrowetting)." Lab on a Chip 10.13 (2010): 1655-1661의 편면 오픈 구성 플랫폼이다.
미세액적을 조작하기에 적합한 장치는 선택적으로 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
다음을 포함하는 제1 복합벽:
ㆍ 투명한 제1 기판;
ㆍ 상기 기판 상의, 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 투명한 제1 전도체층;
ㆍ 상기 전도체층 상의, 300 내지 1000 nm 범위의 두께를 갖고 400 내지 1000 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화되는 광활성층; 및
ㆍ 상기 전도체층 상의, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제1 유전체층;
다음을 포함하는 제2 복합벽:
ㆍ 제2 기판;
ㆍ 상기 기판 상의, 70 내지 250 nm범위의 두께를 갖는 제2 전도체층; 및
ㆍ 선택적으로, 상기 전도체층 상의, 120 내지 160 nm 범위의 두께를 갖는 제2 유전체층,
제1 및 제2 유전체층의 노출된 표면은 최소 10μm, 바람직하게는 50~100μm 이격되어 미세액적을 수용하는 미세유체 공간을 형성하도록 배치되며; 두 유전층 중의 하나는 생체적합성 코팅이나 방오성 코팅으로 코팅된다.
선택적으로, 유전체층과 방오성/생체적합성 코팅들 사이에 두께 1~10 nm 두께의 실리카 간극층(interstitial layer);
제1 및 제2 전도체층을 연결하는 제1 및 제2 복합벽에 걸쳐 전압을 제공하는 A/C소스; 제1 유전체층의 표면 상에 대응하는 가상 전기습윤 전극 위치를 유도(induce)하기 위해 광활성층 상에 충돌하도록 구성된 광활성화(photoexcitable) 층의 밴드 갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 제2 전자기장 방사 소스; 및
가상 전기습윤 전극 위치의 배치를 변화시키기 위해 광활성층 상의 전자기장 방사의 충돌 지점을 조작하여 마이크로 액적이 이동될 수 있는 적어도 하나의 광학-매개 전기습윤 경로를 생성하는 조작 수단;이 있을 수 있다.
고 처리량 미세액적 조작을 위한 방법과 장치는 함께 진행중인 출원 PCT/GB2021/050148에 기술되며 상기 장치와 기술은 본 개시의 방법을 실시하기에 적합할 것이다. 상기 출원에 개시된 상기 장치는 개별적으로 제어 가능한 두 개의 광학 조립체를 포함하며, 이들 모두는 oEWOD 칩의 표면 상에 고정 및 스위칭 가능한 광점(light spots) 어레이를 생성할 수 있다. 이러한 구성은 미세액적의 높은 처리량, 유연한 로딩 및 처리를 용이하게 하도록 최적화된다. 상기 제1 광학조립체는 상기 칩의 표면 상에 복수의 oEWOD 트랩을 형성하여 칩의 표면 상에 복수의 미세액적이 oEWOD 트랩의 제1 어레이에 대응하는 미세액적의 어레이를 형성하게 하고; 상기 제2 광학조립체는 칩의 표면 상에 oEWOD 트랩의 제2 어레이를 형성할 수 있다. 상기 제2 어레이의 하나 이상의 oEWOD 트랩은 상기 제1 어레이의 oEWOD 트랩과 정렬된다. 상기 방법은 미세액적의 어레이의 내용물을 검사하고, 하나 이상의 상기 미세액적이 oEWOD 트랩의 제2 어레이에 의해 제자리에 고정되어 있는 동안 상기 제1 광학조립체를 조정하는 것을 포함할 수 있다. PCT/GB2021/050148이 본 명세서에 참조에 의해 통합된다.
일부 실시예에서, 광학 매개 전기습윤을 이용한 미세액적 조작 장치가 제공되며, 상기 장치는 다음을 포함한다.
* 다음을 포함하는 제1 복합벽:
ㆍ 제1 기판;
ㆍ 상기 기판 상의 제1 전도체층;
ㆍ 상기 전도체층 상의 광활성층; 및
ㆍ 상기 광활성층 상의, 20 nm 미만의 두께를 갖는 제1 유전체층;
* 다음을 포함하는 제2 복합벽:
ㆍ 제2 기판;
ㆍ 상기 기판 상의 제2 전도체층; 및
ㆍ 상기 제2 전도체층 상의, 20 nm 미만의 두께를 갖는 제2 유전체층,
상기 제1 및 제2 유전체층은 연속적인 층일 수 있다. 상기 제1 유전체층은 원자층 증착에 의해 상기 광활성층 상에 증착될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제2 유전체층이 상기 광활성층 상에 증착될 수 있다.
놀랍게도, 두께가 20 nm 미만인 연속적인 층으로 상기 제1 및/또는 제2 유전체 층을 제공함으로써 상기 액적을 보다 안정적으로 되게 하고, 따라서 액적이 상기 기판 상에 고정된다는 것을 발견하였다. 대조적으로, 본 발명자들은 상기 제1 및/또는 제2 유전체 층의 두께를 20 nm 이상으로 증가시키면 기판 상에서 제어되지 않은 액적의 이동이 더 많이 발생하며, 따라서 액적이 조명된 영역으로부터 벗어나는 제어되지 않은 움직임을 나타낼 가능성이 더 크다는 것을 발견하였다. 결과적으로, 제어되지 않은 액적은 정확하고 효율적인 oEWOD 작업, 예를 들어 액적의 병합 또는 분할을 더 어렵게 만들 수 있다.
일부 실시예에서, 제1 및/또는 제2 유전체층은 두께가 1 nm 내지 20 nm 사이이거나, 또는 2 nm 내지 20 nm, 3 nm 내지 20 nm, 4 nm 내지 20 nm, 5 nm 내지 20 nm, 6 nm 내지 20 nm, 7 nm 내지 20 nm, 8 nm 내지 20 nm, 9 nm 내지 20 nm, 10 nm 내지 20 nm, 12 m 내지 20 nm, 14 nm 내지 20 nm, 15 nm 내지 20 m 또는 18 nm 내지 20 nm일 수 있다. 또는 1 내지 15 nm, 1 내지 10 nm, 1 내지 5 nm, 5 내지 10 nm, 5 내지 15 nm 또는 10 ~ 15 nm일 수도 있다.
상기 제1 기판과 제1 전도층 및/또는 제2 기판과 제2 전도층은 투명할 수 있다.
상기 장치는 제1 및 제2 전도층을 연결하는 상기 제1 및 제2 복합벽의 양단에 전압을 인가하기 위한 A/C 소스; 상기 제1 유전층의 표면 상에 대응하는 일시적인(ephemeral) 전기습윤 위치를 유도하기 위하여 광활성층에 충돌하도록 구성된 상기 광여기가능층(photoexitable)의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 전자기 방사선 소스; 및 상기 일시적인 전기습윤 위치의 배치를 변화시켜 미세액적을 이동시킬 수 있는 적어도 하나의 전기습윤 경로를 생성하도록, 상기 광활성층 상의 전자기 방사선의 충돌점을 조작하기 위한 마이크로프로세서를 추가로 포함할 수 있다.
상기 장치는 실리콘 산화물의 간극층(interstitial layer)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 간극층의 장점은 방오층 또는 비-오염층(non-fouling layer)의 결합층으로 사용할 수 있다는 것이다. 상기 간극층은 유전체층과 소수성 층 사이에 제공된다. 상기 간극층의 두께는 0.1 nm 내지 5 nm일 수 있다. 상기 간극층의 두께는 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 또는 4.5 nm 이상일 수 있으며, 또는 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5 또는 0.25 nm 미만일 수 있다.
상기 제1 및 제2 유전체층의 노출된 표면은 미세액적을 함유하기에 적절한 미세유체 공간을 정의하기 위하여 200 ㎛ 미만으로 이격되어 배치될 수 있다. 상기 미세유체 공간은 폭이 2 내지 50 ㎛일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 미세유체 공간은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 또는 48 ㎛보다 크다. 일부 실시예에서, 상기 미세 유체 공간은 50, 48, 46, 44, 42, 40, 38, 36, 34, 36, 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 ㎛ 미만일 수 있다.
상기 제1 및 제2 유전체층의 노출된 표면은 미세액적을 함유하기에 적절한 미세유체 공간을 정의하기 위하여 제1 벽과 제2 벽을 소정 거리만큼 이격시켜 유지하기 위한 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 물리적 형상은 장치 내에서 미세액적의 분할, 병합 및 신장을 돕기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 미세액적은 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 상기 미세액적은 또한 세포 배지 및/또는 완충용액과 같은 배지를 포함할 수 있다.
상기 A/C 소스는 상기 제1 및 제2 전도체층을 연결하는 상기 제1 및 제2 복합벽에 걸쳐 0V 및 100V 사이의 전압을 제공하도록 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, A/C 소스는 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 V 보다 높은 전압을 제공하거나, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5V 미만의 전압을 제공하도록 구성될 수 있다.
상기 제1 및 제2 복합벽은 각각 상기 제1 및 제2 유전체층 상에 제1 및 제2 방오층을 추가로 포함할 수 있다. 제2 유전체층 상의 상기 방오층은 소수성일 수 있다. 전자기 방사선의 소스(들)은 상기 어레이로부터 반사되거나 이를 통해 투과된 빛의 픽셀화된 어레이를 포함할 수 있다. 전기습윤 위치는 미세액적의 이동 방향으로 초승달 형상일 수 있다. 장치는 장치의 내부 또는 하류에 위치한 미세액적 내의 광학 신호를 검출하는 광 검출기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 광 신호는 형광 신호일 수 있다. 장치는 비혼화성 운반매 내에 수성 미세액적의 에멀젼을 포함하는 배지를 생성하기 위한 상류 유입구를 추가로 포함할 수 있다.
장치는 미세유체 공간으로의 유입구를 통해 상기 미세유체 공간을 통과하는 비혼합성 운반매 내에 수성 미세액적의 에멀젼을 포함하는 배지의 흐름을 유도하기 위한 상류 유입구를 추가로 포함할 수 있다.
그 사이에 미세유체 공간을 정의하는 제1 및 제2 복합벽은 카트리지 또는 칩의 외면(periphery)을 형성할 수 있다. 장치는 서로 동시에 실행되는 복수의 제1 전기습윤 경로를 추가적로 포함할 수 있다. 장치는 상기 제1 전기습윤 경로와 교차하도록 조정되어 적어도 하나의 미세액적-합착(coalescing) 위치를 생성하는 복수의 제2 전기습윤 경로를 추가로 포함할 수 있다.
장치는 미세액적을 상기 미세유체 공간에 도입하기 위한 상류 입구를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 미세액적의 직경은 미세유체 공간의 폭보다 20% 이상 더 크다.
상기 제2 복합벽은 제2 광여기가능층을 추가로 포함할 수 있으며, 전자기 방사선의 소스는 또한 상기 제2 광여기가능층에 충돌하여 역시 가변적인 임시 전기습윤 위치의 제2 패턴을 생성할 수 있다.
전자기 방사선 소스는 0.005 내지 0.1 Wcm-2 수준의 전자기 방사선을 제공할 수 있는 LED 광원일 수 있다. 일부 실시예에서, 전자기 방사선 소스는 0.005 내지 0.1 Wcm-2 수준이거나, 또는 0.005, 0.0075, 0.01, 0.025, 0.05 또는 0.075 Wcm-2보다 클 수 있다. 일부 실시예에서, 전자기 방사선 소스는 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.01, 0.0075, 0.005 또는 0.0025 Wcm-2보다 작은 수준일 수 있다.
기판 상의 제1 투명 전도체층은 두께가 70 내지 250nm 범위일 수 있다. 광활성층은 전도체층 상에 파장 범위가 400 내지 1000 nm인 전자기 방사선에 의해 활성화될 수 있으며, 이는 두께가 300 내지 1000 nm일 수 있다. 일부 실시예에서, 광활성층은 비정질 실리콘으로 제조될 수 있다.
일부 실시예에서, 미세액적은 두 개의 대향벽에 의해 정의된 미세유체 공간을 통과할 수 있으며, 여기서 상기 각 벽은 유전체층의 유전 항복 전압(breakdown voltage)보다 낮도록 유전체층을 가로질러 충분히 낮은 전압이 인가되는 유전체층을 포함한다. 유전체층을 가로지르는 전압이 충분히 낮은 두 유전체층을 사용하면 전도성 액적의 파괴적인 이온화를 방지할 뿐 아니라, 유전체 핀혼 결함이 액적에 미치는 악영향을 실질적으로 제거하여 두 유전체층의 사용으로 인한 전기습윤력의 감소에도 불구하고 성능이 현저하게 향상된다. 결과적으로, 수천 개의 액적을 동시에 조작하기 위해 예를 들어 0.01 Wcm-2만큼 낮은 전력을 생성하는 LED와 같은 저전력 광원을 사용하여 광학 매개 전기습윤을 달성할 수 있다. 1cm × 1cm 보다 큰 면적을 갖는 대면적 미세유체 장치를 포함하는 실시예의 경우, 상기 장치는 10,000 초과, 초대면적장치 경우에는 50,000 초과, 100,000 초과 또는 1,000,000 초과의 액적을 병렬로 조작하기에 적합하다.
일부 실시예에서, 대면적 장치는 수천개의 액적을 취급하는 데 활용될 수 있다. 본 발명자들은 이전에 액적을 병렬로 취급하기 위해 단일 유전체층을 사용하여 더 큰 장치를 구축하고자 시도하였으나, 발명자들은 액적이 움직이지 못하는 결함 영역에 직면하였다. 실험과 검정을 통해 본 발명자들은 특히 장치가 커질수록 핀홀 결함이 장치 성능의 중요한 제한이 되는 것을 발견하였다.
유전체층은 항상 희박한 핀홀 결함을 가지며, 이에 의해 이들은 작고 고립된 영역에서 전기가 통한다. 공지된 최적화된 공정에 의하면 ㎠ 당 약 38 핀홀 밀도를 제공한다. 핀홀 결함은 액적을 포획하고 움직일 수 없도록 할 수 있다. 이러한 효과는 완충용액과 같은 전도성 배지의 액적을 사용할 때 더욱 심각하다.
일부 실시예에서, 유전 항복 전압 이하에서 사용될 수 있는 2개의 유전체층 구조가 제공된다. 항복 전압 이하에서 실행될 때, 양면 유전체층 구조는 핀홀 결함의 효과를 크게 상쇄하는 신규한 효과를 제공할 수 있다. 상기 액적의 상부 및 하부 모두에 유전체가 배치되면, 제1 유전체 층의 핀홀 결함이 제2 유전체층의 핀홀 결함에 직접적으로 정렬된 경우에만 전도성 경로가 형성될 수 있다. 이러한 것이 발생할 확률은 매우 작다. 제2 유전체층의 존재에 의해 달성되는 이러한 핀홀-완화 특징은 비교적 넓은 영역에서 수천개의 액적을 동시에 조작할 수 있도록 하는 핵심이다.
병렬로 100,000개 이상, 심지어 1,000,000개 이상의 액적을 조작하기에 적합한 대면적 장치 또는 초대면적 장치의 경우, 핀홀 결함과 접촉하는 단일 액적의 확률이 매우 높아지기 때문에 핀홀 결함의 수가 장치 성능에 중요한 제한이 된다. 핀홀 결함에 포획된 단일 액적은 장치 내의 다른 액적의 움직임을 차단하여, 시스템의 작동을 손상시키거나 중단시킬 수 있다. 따라서 핀홀 결함의 영향을 상쇄하는 상기 본 발명의 장점은 많은 수의 미세액적을 함유하는 초대면적 장치의 작동에서 매우 중요하다.
도 18을 참조하면, 미세유체 장치 및 특히 oEWOD 장치(100)가 제공된다. 도 18에 도시된 바와 같은 oEWOD 장치는 다음을 포함한다: 다음을 포함하는 제1 복합벽(102), 유리로 만들어질 수 있는 제1 기판(104), 상기 기판(104) 상의 70 내지 250 nm 범위의 두께를 갖는 제1 투명 전도체층(106); 상기 전도체층(106) 상의, 300 내지 1500 nm 범위의 두께를 갖고 400 내지 850 nm 범위의 파장 범위를 갖는 전자기장 방사에 의해 활성화되는 광활성층(108) 및 상기 광활성층(108) 상의 제1 유전체층 (110). 제1 유전체층(110)은 20nm 미만의 두께를 갖는 연속적인 층으로 형성된다. 상기 층의 두께의 하한은 적어도 부분적으로는, 연속적이어야 하는 아주 얇은 층을 제공하는 방법론에 의해 결정될 것이다. 그러나 이론적으로는 0.1 nm 내지 20 nm 사이의 두께를 가질 수 있다.
장치(100)는 또한 다음을 포함하는 제2 복합벽(112)을 포함한다: 유리로 만들어질 수 있는 기판(114) 및 상기 기판(114) 상의 제2 투명 전도체층(116). 제2 전도체층(116)은 70 내지 250nm 범위의 두께를 가질 수 있다. 제2 유전체층(118)은 투명 제2 전도체층(116) 상에 있을 수 있으며, 여기서 제2 유전체층(118)은 20 nm 미만의 두께를 갖는다. 제1 유전체층과 마찬가지로, 제2 유전체층은 연속적이어야 하고, 두께에 대한 실질적인 하한은 제조 한계에 의해 결정되지만, 1 nm 내지 20 nm 사이일 수 있다. 상기 제1(110) 및 제2(118) 연속적인 유전체층의 노출된 표면은 20 내지 180 μm 이격되어 미세액적(122)을 함유하도록 조정된 미세유체 공간(121)을 정의한다. 광활성층(108)은 비정질 실리콘으로 이루어진다. 상기 제1 및 제2 전도체층은 ITO로 만들어진다.
간극 결합층(124)은 제1 유전체층(110) 상에 제공되며, 제2 유전체층(118) 상에도 제공될 수 있다. 상기 간극층의 두께는 0.1 nm 내지 5 nm일 수 있다. 간극층의 두께는 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 또는 4.5 nm 이상이거나, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5 또는 0.25 nm 미만일 수 있다. 간극층의 장점은 소수성일 수 있는 방오층 또는 비-오염층에 대한 결합층으로 사용될 수 있다는 것이다.
상기 간극 결합층(124) 상에는 소수성층(126)이 제공된다. 소수성층의 예는 플루오로실란일 수 있다. 간극 결합층(124)은 선택적이고 채널벽(120)은 SU8로 제조될 수 있거나, 또는 유리 구조물의 일부일 수 있다. 상기 유전체층(110, 118)과 상기 소수성층(126) 사이에는 간극층(124)이 제공된다.
도 18에 도시된 바와 같이, 입사광(130)은 광 스프라이트 패턴(131)을 제공하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 입사광(130)은 미세액적(122)을 미세유체 공간(121) 내의 정지 위치로 유지시키기 위해 광활성층(110)의 일부에 빛을 제공한다. 오일 운반상(134)은 하나 이상의 세포와 같은 내용물을 살아있고 건강하게 유지할 수 있도록 하는 주요 영양소 및 구성 요소를 보충하기 위하여 상기 장치에서 홀(136)을 통해 미세액적(122)에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 오일상(134)은 세포 성장, 생존 및/또는 생산성을 위한 주요 영양소, 배지 및 내용물을 제공할 수 있다.
제1 및 제2 기판(104, 114)은 기계적으로 강한 물질로 이루어진다. 예를 들어, 제1 및 제2 기판은 유리, 금속 또는 엔지니어링 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 실시예에서, 기판들은 어느 정도의 가요성을 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 기판은 실리콘, 융융 실리카 또는 유리이다. 일부 실시예에서, 제2 기판은 용융 실리카 및 유리이다.
제1 및 제2 전도체층(106, 116)은 제1 및 제2 기판(104, 114)의 일 표면에 위치하고, 전형적으로 70 내지 250 nm, 바람직하게는 70 내지 150 nm의 두께를 갖는다. 이들 층 중 적어도 하나는 인듐 주석 산화물(ITO: Indium Tin Oxide)과 같은 투명 전도성 물질, 은과 같은 전도성 금속의 초박막 또는 PEDOT와 같은 전도성 고분자 등으로 제조된다. 이들 층은 연속성 시트 또는 와이어와 같은 일련의 개별 구조로 형성될 수 있다. 또는, 전도체층은 전자기 방사선이 메시(mesh)의 틈 사이로 향하는 전도성 물질의 메시(mesh)일 수 있다.
광활성층(108)은 전자기 방사선 소스에 의한 자극에 응답하여 국부적인 전하 영역을 생성할 수 있는 반도체 재료로 형성된다. 예로는 300 내지 1500 nm 범위 두께의 도핑되지 않은 수소화된 비정질 실리콘층을 포함한다. 일부 실시예에서, 광활성층은 가시광선의 사용에 의해 활성화된다. 상기 층의 유전 특성은 바람직하게는 10^7 V/m 이상의 고유전강도 및 >3의 유전상수를 포함한다. 일부 실시예에서, 유전체층은 알루미나, 실리카, 하프니아(hafnia) 또는 얇은 비전도성 고분자 필름으로부터 선택된다.
또는, 적어도 제1 유전층 바람직하게는 둘 모두는 방오층으로 코팅되어 다양한 가상 전기습윤 위치에서 원하는 미세액적/분산매/표면 접촉각을 형성하도록 보조한다. 방오층은 추가적으로 액적이 칩을 통하여 이동함에 따라 액적의 내용물이 표면에 흡착되어 감소되는 것을 방지하도록 한다. 최적의 성능을 위해, 방오층은 25℃에서 기-액-표면 3점 계면으로 측정할 때 50~180° 범위의 미세액적/운반매/표면 접촉각을 형성하는 데 도움이 되어야 한다. 일부 실시예에서, 이들 층(들)은 두께가 10 nm 미만이며, 일반적으로 단분자층을 형성한다. 또는, 상기 층들은 메틸 메타크릴레이트나 소수성 기가 치환된 그 유도체; 예를 들면 알콕시 실릴과 같은 아크릴레이트 에스테르 폴리머를 포함할 수 있다. 방오층들 중 하나 또는 둘 모두는 최적의 성능을 확보하기 위하여 소수성이다. 일부 실시예에서, 두께가 20 nm 미만인 실리카 간극층은 방오층과 유전층 사이에 개재되어 화학적으로 화합되는 브릿지(bridge)를 제공할 수 있다.
제1 및 제2 유전체층, 및 따라서 제1 및 제2 벽은 폭이 10 μm 이상, 바람직하게는 20 내지 180 μm인 미세액적이 함유되는 미세유체 공간을 형성한다. 바람직하게는, 미세액적이 함유되기 전에, 미세액적 자체의 고유 직경은 미세액적 공간의 폭보다 10% 초과 또는 20% 초과이다. 따라서, 미세액적은 칩에 들어가면서 구형 미세액적의 변형을 유도하는 압축이 진행되어 예를 들어 더 나은 미세액적 병합 능력을 통해 전기습윤 성능이 향상된다. 일부 실시예에서 제1 및 제2 유전체층은 플루오로실란과 같은 소수성 코팅으로 코팅될 수 있다.
일부 실시예에서, 미세유체 공간은 제1 및 제2 벽을 소정의 양만큼 이격시키기 위한 하나 이상의 스페이서를 포함한다. 스페이서에 대한 선택지는 비드, 지주, 광 패터닝에 의해 생성된 중간 레지스트 층으로부터 만들어지는 융기(ridges)가 포함된다. 또는 실리콘 산화물 또는 실리콘 질화물과 같은 증착된 물질을 사용하여 스페이서를 만들 수도 있다. 또는 접착 코팅이 있거나 없는 가요성 플라스틱 필름을 포함하는 필름층을 사용하여 스페이서층을 형성할 수 있다. 다양한 스페이서 구조가 좁은 채널, 테이퍼 채널 또는 연속된 지주(pillar)에 의해 정의된 부분적으로 둘러싸인 채널을 형성하는 데 사용할 수 있다. 세심한 설계에 의해, 상기 구조를 사용하여 미세액적의 변형을 돕고, 이어 미세액적을 분할하며, 변형된 미세액적에 대한 작업에 영향을 줄 수 있다. 유사하게 상기 스페이서는 칩의 구역을 물리적으로 분리하여 교차 오염을 방지하고, 유압 하에서 칩을 로딩할 때 액적이 올바른 방향으로 유동하도록 촉진하는 데 사용할 수 있다.
제1 및 제2 벽은 그들 사이에 적절하게는 10 내지 50 볼트 범위의 전압 전위차를 제공하기 위해 전도체층에 부착된 A/C 전원을 사용하여 바이어스된다. 이러한 oEWOD 구조는 일반적으로 파장이 400~850 nm 범위, 예를 들면 550, 620 및 660 nm이며, 광활성층의 밴드갭을 초과하는 에너지를 갖는 전자기 방사선 소스와 함께 사용된다. 적절하게는, 상기 광활성층은 사용된 방사선의 입사 강도가 0.005 내지 0.1 Wcm-2 범위인 가상 전기습윤 전극 위치에서 활성화될 것이다. 전자기 방사선 소스는 0.005 내지 0.1 Wcm-2 수준이거나, 0.005, 0.0075, 0.01, 0.025, 0.05 또는 0.075 Wcm-2 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 전자기 방사선 소스는 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.01, 0.0075, 0.005 또는 0.0025 Wcm-2보다 작은 수준일 수 있다.
전자기 방사선 소스가 픽셀화 되는 경우, 이들은 LED 또는 다른 램프로부터의 빛에 의해 광조사되는 디지털 미세거울 장치(DMD, Digital Micromirror Device)와 같은 반사 스크린을 사용하여 직접 또는 간접적으로 적절하게 공급된다. 이는 제1 유전층 상에 고도로 복잡한 패턴의 가상 전기습윤 전극 위치가 신속하게 생성 및 소멸될 수 있도록 함으로써, 미세하게 조절되는 전기습윤력을 이용하여 미세액적이 임의의 가상의 경로를 따라 정밀하게 조종될 수 있게 한다. 상기 전기습윤 경로는 제1 유전체층 상의 가상 전기습윤 전극 위치의 연속체로부터 구성되는 것으로 간주될 수 있다.
상기 제1 및 제2 유전체층은 단일 유전물질로 구성될 수도 있고, 둘 이상의 유전물질의 복합체일 수도 있다. 상기 유전체층은 Al2O3 및 SiO2로부터 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
제1 및 제2 유전체층들 사이에는 구조물이 제공될 수 있다. 제1 및 제2 유전체층 사이의 상기 구조물은, 에폭시, 고분자, 실리콘 또는 유리 또는 이들의 혼합물이나 복합체로, 직선형, 각진형, 곡선형 또는 미세구조화된 벽/면 형상으로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제1 및 제2 유전체층 사이의 구조물은 상부 및 하부 복합벽에 연결되어 밀폐된 미세유체 장치를 생성하고, 상기 장치 내의 채널 및 영역을 정의할 수 있다. 상기 구조물은 두 복합벽 사이의 간격을 점유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전도체와 유전체는 이미 벽을 갖는 성형된 기재 상에 증착될 수 있다.
미세액적
본 발명의 방법은 장치 내에서 적어도 하나의 미세액적을 조작하는 것을 요구하며, 액적은 일반적으로 액체, 예를 들어 세포/세포, 리포터 개체 또는 이 둘의 조합을 함유하는 수성 액체의 방울을 지칭한다. 미세액적은 물질이나 반응을 분리할 수 있는 구획을 제공한다. 이들은 단일 세포와의 작업을 가능하게 하며, 고 처리량 실험에 적합하다. 미세액적을 사용하면 세포 및/또는 리포터 개체를 캡슐화하여, 병합을 원할 때까지 분리된 상태로 유지할 수 있다.
미세액적은 임의의 모양이나 크기일 수 있지만, 바람직하게는 구형 또는 원통형이다. 액적의 크기는 20 내지 600 ㎛ 사이일 수 있으나, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 550, 560 또는 580 ㎛ 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 액적의 크기는 600, 580, 560, 550, 540, 520, 500, 480, 460, 440, 420, 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 250, 240, 220, 200, 180, 160, 150, 140, 120, 100, 80, 60, 50, 40 또는 30 ㎛ 미만일 수 있다. 복수의 액적은 함께 병합되어 더 큰 액적을 형성할 수 있다. 또는, 큰 액적은 적절히 나뉘어져 더 작은 크기의 액적(자손 액적)을 형성할 수 있다.
액적이 상기 미세유체 장치의 높이에 비해 너무 작으면, 상기 액적이 미세유체 챔버 내의 양쪽 벽과 접촉하지 않고 따라서 상기 액적은 oEWOD에 의해 이동될 수 없다. 대조적으로, 상기 장치의 기하형상에 비해 큰 액적은 상기 미세유체 장치 내에서 이동하기 어렵고/거나 느릴 수 있으며, 때로 정상 크기의 다른 액적을 단순히 방해하거나 정상 크기의 액적과 병합되는 방식으로 다른 작업을 방해하는 경우가 많다.
일반적으로, 미세액적은 보통 미세액적의 내용물을 포함하는 수상(예를 들어, 세포 또는 세포들, 영양소, 리포터 개체, 분석 시약, 하이드로겔 비드 중합체)으로 구성된다. 일부 경우에 미세액적은 추가 수성 물질을 둘러싸는 비혼화성 유체의 추가 내부상으로 구성되어, 이중 에멀젼 및 액적 내 액적 에멀젼과 같은 다중 에멀젼을 형성한다.
미세유체 장치에서, 미세액적은 비혼합성 운반상 또는 유체에 의해 서로 분리된다. 적절한 운반상은 실리콘 오일, 미네랄 오일 또는 플루오로카본 오일과 같은 오일일 수 있다.
예시적인 플루오로카본 오일은 HFE7500, HFE7700 또는 FC-40을 포함한다. 운반상은 미세액적 안정성을 유지하기 위해 계면 활성제 및 기타 첨가제를 적절하게 추가로 포함할 수 있다. 계면활성제는 미세액적/운반매 계면에 국소화될 수 있으며, 따라서 표면 장력을 감소시킴으로써 미세액적을 안정화시킬 수 있다. 운반매에 대한 수성 미세액적의 중량비가 낮은 경우, 시간이 지남에 따라 미세액적이 수축하는 경향이 있다; 이 현상은 미세방울 내부에서의 반응성의 손실을 초래할 수 있다.
이러한 효과에 대응하는 한 가지 방법은 수화되어 있는 운반상을 사용하는 것이다. 일반적으로 전술한 운반매는 물을 용해시키는 능력이 높지 않기 때문에, 수화는 운반상 내에서 미셀의 생성, 물의 2차 미세액적 또는 수성 완충액에 의해 적절하게 달성된다. 상기 완충액은 미세액적 그 자체의 조성과 동일하거나 상이한 조성을 가질 수 있다. 일부 실시예에서 상기 미셀 또는 이차 미세액적은 미세액적 자체의 염 함량의 최대 5배까지 함유할 수 있으며, 선택적으로 글리세롤을 함유한다. 일반적으로 상기 미셀 및 2차 미세액적은 크기가 훨씬 더 작다. 일부 상황에서는, 운반상은 분산된 상 액적의 안팎으로 확산될 수 있는 친유성 화합물들을 함유할 수 있다.
본 개시의 방법에 사용되는 미세액적은 그들이 어떤 패널에 존재하는 지에 따라 다양한 구성 요소를 포함한다. 상기 미세액적은 본질적으로 수성이며, 추가적인 구성요소, 예를 들어 겔 또는 코팅된 미소구와 같은 지지 구조를 제공하기 위한 구성요소를 포함할 수 있다. 미세액적은 영양소, 탄수화물과 같은 에너지원, 완충시약 등을 포함할 수 있는 제제와 함께 세포 배양 배지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 사용을 포함한다. 상기 세포는, 선택적으로 상기 세포의 특성에 기반하여, 선택을 위해 분석되거나 시험되어질 세포이다. 이에 대해 선택될 것이 세포의 특성이라는 점을 감안하면, 제1 미세액적은 일반적으로 단일 세포를 함유한다. 본 개시의 방법은 따라서 단일 세포를 포함하는 패널용 미세액적만을 선택하는 단계, 및 비어있거나 다중-점유 세포를 폐기하는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계 이후에, 상기 세포는 상기 미세액적이 적어도 하나의 세포를 포함할 수 있도록 분열이 가능할 수 있다.
적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적은 미세액적의 패널을 형성한다.
미세액적의 패널은 복수의 미세액적에 의해 형성된다. 미세액적의 패널은 각각 유사한 내용물을 갖는 미세액적의 집합, 그룹 또는 어레이이다. 예를 들어, 세포를 포함하는 미세액적의 패널에서, 상기 미세액적 각각은, 선택적으로는 동일한 유형(예를 들어, B 세포)의, 적어도 하나의 세포를 포함할 수 있다. 미세액적의 패널은 대안적으로 세포 배양 배지, 리포터 개체, 선택된 세포, 증식된 세포, 핵산 등을 포함할 수 있다. 미세액적의 패널은 예를 들어 50 ~ 700,000개의 미세액적을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법에서, 적어도 하나의 리포터 개체를 포함하는 미세액적의 패널이 제공된다. 상기 미세액적은 본 명세서에서 추가로 정의된 바와 같이 적어도 하나의 리포터 개체를 포함할 수 있다.
본 개시의 방법은 미세액적의 패널의 서브 세트를 선택하는 것을 포함한다. 상기 선택된 서브 세트는 본 개시의 방법에서 추가로 사용하기 위한 미세액적의 새로운 패널을 형성할 수 있다.
미세액적은 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 장치에서 조작된다. 상기 미세액적은 정렬, 병합, 분할 및 검출 이벤트를 용이하게 하기 위하여 어레이로 조작될 수 있다. 병합 및 분할 이벤트는 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 수행될 수 있다. 원하는 방법을 달성하도록 미세액적을 조작하기 위해 임의의 적합한 레이아웃이 사용될 수 있다. 미세액적은 또한 음향과 같은 다른 방법을 사용하여 조작될 수 있다.
미세액적은 일반적으로 필요한 성분(예를 들어, 세포, 리포터 개체)와 함께 수성 제제를 캡슐화하는 것에 의해 제조된다. 상기 미세액적은 유화 기술을 통해 형성된다. 하나의 예시에서 유화는 와류(vortex) 유화이다. 다른 예에서, 유화는 스텝 유화이다. 미세액적은 미세유체 장치 상에 생성될 수도 있고, 이에 인접하여 생성될 수도 있다.
세포
본 발명의 방법은 특정 또는 원하는 특성을 갖는 세포의 선택을 위한 것이다. 불명확함을 피하기 위하여, 상기 세포는 생물학적 세포이다. 상기 세포(들)은 자연적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 인위적인 것일 수 있다. 상기 세포(들)은 미세세포일 수 있다. 본 발명의 방법은 세포가 없고 세포(들)의 일부, 예를 들면 핵 및/또는 미토콘드리아를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 리포솜을 사용할 수 있다. 상기 세포는 임의의 적절한 소스, 예를 들어, 인간 또는 동물, 식물 또는 미생물로부터의 세포 시료로부터 얻을 수 있다.
상기 세포는 인간 또는 동물, 선택적으로 포유류 유래의 세포일 수 있다. 상기 세포는 식물 세포, 곤충 세포, 곰팡이 세포, 박테리아 세포 또는 아메바(ameobal) 세포일 수 있다. 상기 세포는 하이브리도마와 같은 세포-융합체일 수 있다.
상기 세포는 세포 배양, 예를 들어 줄기 세포, 다능성 세포, 유전적으로 조작된 세포 등의 배양으로부터 얻을 수 있다.
상기 세포가 시료/생물학적 시료로부터 유래된 경우, 이는 적어도 하나의 세포 유형을 포함하는 임의의 인간, 동물, (천연의, 인위적인 또는 변형된) 환경 또는 식품 시료일 수 있다. 상기 시료/생물학적 시료는 다음으로부터 선택될 수 있다: 대변, 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수액, 소변, 뇌척수액(CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 체액, 양수, 귀지, 모유, 기관지 폐포 세정액, 정액, 전립선 유체, 카우퍼의 유체 또는 사정 전액, 여성 사정액, 땀, 배설물, 머리카락, 눈물, 낭포액, 흉막 및 복막액, 심낭액, 림프액, 미즙(chyme), 유미즙(chyle), 담즙, 간질액, 생리, 고름, 피지, 구토, 질 분비물, 유선 분비물, 점막 분비물, 대변액, 췌장액, 부비강 세척액, 기관지폐 흡인물, 양막강액 및 제대혈. 또는, 시료는 조직 시료로부터 유래할 수 있다.
상기 세포는 환자 또는 개인으로부터 분리될 수 있다. 여기에 기술된 방법은 상기 세포를 스크리닝하고 환자에게 되돌려주는 데 (자가 세포 이식) 사용될 수 있다. 상기 세포는 한 개인으로부터 분리되어 환자에게 투여되도록 (동종 세포 이식) 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 동종 유형의 세포, 예를 들면 T 세포와 같은 림프구를 함유한다. 따라서, 상기 세포는 미세액적에 통합되기 전에 미리 선택될 수 있다. 그러나 임의의 생물학적 세포로 일부 오염이 발생할 수 있으며, 여기서 다른 유형의 세포, 예를 들어 T 세포가 원하는 유형인 경우 B 세포 또한 미세액적 내에 포함될 수 있다. 본 개시의 방법은 상기 미세액적을 신속하게 식별하여, 미세액적의 서브 세트에 대해 선택되지 않도록 할 것이다.
일부 실시예에서, 미지의 박테리아 세포가 존재하는 환경 시료를 스크리닝하는 경우와 같이, 미세액적의 패널에 포함된 세포 유형의 다양한 집단이 있을 수 있다.
상기 세포는 인간 또는 포유류 세포일 수 있다. 상기 세포는 신체의 기관 또는 조직과 같은 임의의 조직 유형 유래의 임의의 적합한 유형일 수 있다.
상기 세포는 면역계 세포일 수 있다. 상기 세포는 단핵구, 대식세포, 파골세포, 호중구 (다형핵 백혈구) 수지상 세포, 미세아교세포, 비만 세포, T 세포 (헬퍼 T 세포, 조절 T 세포, 세포독성 T 세포 및 자연 살해 T 세포를 포함), B 세포, 자연 살해 T 세포 및 조혈 줄기 세포가 포함된다.
상기 세포는 배양 기술을 통해 분리 또는 제조된 다능성 또는 줄기 세포일 수 있다. 상기 다능성 줄기 세포는 재프로그램된 성숙 세포 유형일 수 있다.
상기 세포는 상기 미세액적 내로 캡슐화되기 전에 유전적으로 조작될 수 있다. 상기 세포는 미세액적 내에 캡슐화된 후에 유전적으로 조작될 수 있다.
상기 세포의 유전 공학은 형질도입 (바이러스 유전자 전달), 유전자 편집 (아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, CRISPR/CAS9 염기 및 프라임 편집과 같은 뉴클레아제를 사용하는), 비 바이러스 유전자 전달 (예를 들어, 나노 입자 전달), 유전자 녹다운, 유전자 녹인(knock in) 및 예를 들어, 유전자 침묵, 활성화 또는 광유전학과 같은 RNA를 사용한 유전자 조작을 포함한 임의의 적절한 방법에 의한 것일 수 있다. 유전 공학은 일반적으로 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 유전 요소를 도입하는 것을 포함한다.
상기 유전 공학은 단순히 랜덤 돌연변이가 원하는 세포 특성을 초래하는지 여부를 보기 위해 상기 세포의 게놈 내에 돌연변이를 일으키는 개체를 도입하는 것일 수 있다. 본 개시의 방법은 랜덤 또는 의도적 돌연변이를 갖는 많은 수의 세포를 스크리닝할 수 있도록 하여, 돌연변이 후 원하는 특성을 갖는 세포가 선택될 수 있도록 한다. 이는 특히 세포 기반 제조에 의한, 세포 선택의 최적화를 가능하게 한다. 이는 세포의 "지향성 진화"로 기술될 수 있다.
상기 유전 요소는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 선택적으로 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 CAR과 같은 바람직한 생성물을 암호화한다.
상기 유전 요소는 세포에서 발현되거나 또는 세포 내에 포함하기를 원하는 관심 서열을 포함하는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 핵산은 세포에서 발현을 위한 미니서클과 같은 비-바이러스성 "네이키드(naked)" 벡터일 수 있다. 상기 핵산은 세포에서 세포 내에서 유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 성분을 포함할 수 있다. 상기 유전 요소는, 예를 들어 새로운 세포 표면 분자를 발현하기 위해, 임의의 바람직한 유전 공학이 상기 세포에 이루어지도록 하는 임의의 바람직한 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 세포는 미세액적 내로 캡슐화된 상태에서 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널과 적어도 하나의 유전 요소를 포함하는 미세액적의 패널이 제공된다. 본 개시의 방법은 따라서 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 적어도 하나의 유전 요소를 포함하는 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 미세액적의 패널을 형성하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 미세액적은 본 명세서에 기술된 선택 방법의 대상이 될 수 있는 적어도 하나의 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 이후 검정은 유전 공학의 성공을 결정하며, 비개질된 세포는 폐기될 수 있다.
유전 공학은 유도성 프로모터 하에서 유전자 서열을 제공하는 것을 수반할 수 있다. 이는 조작된 세포가 유전자 서열에 의해 암호화된 생성물을 생산하는 것을 촉진할 수 있게 한다.
세포를 함유하는 미세액적의 패널을 제조할 때, 캡슐화 단계가 배지만의 캡슐화를 초래하거나 캡슐화 및 방법의 단계 사이에서 세포가 사멸할 할 수 있기 때문에 일부 미세액적은 비어 있을 수 있다. 또는, 분할 단계는 미세액적 내에 세포의 결여를 초래할 수 있다. 이 과정에서 세포의 캡슐화는 푸아송 통계에 의해 설명되는 점유도를 갖는 액적의 집단을 생성할 것이다.
본 개시의 방법은 단일 세포 캡슐화의 효율을 향상시키기 위해 능동적으로 제어된 액적 생산 방법과 함께 사용될 수 있다. 선택적으로 캡슐화 공정은 단일 세포를 함유하는 미세액적의 패널을 제공한다. 단일 세포 캡슐화는 공정 동안 클론 증식을 허용한다.
그러나, 활용될 수 있는 일부 캡슐화 공정은 효율적이지 않을 수 있다; 상기 시스템에서 액적 당 캡슐화된 세포의 수는 푸아송 통계에 의해 결정되어, 원하는 수의 세포를 함유하는 액적의 비율을 감소시키고, 따라서 단일 세포가 캡슐화될 수 있는 유효률이 감소된다. 따라서, 장치의 사용자에 의해 선택된 캡슐화 공정은 하나 이상의 세포를 함유하는 세포를 소수로 생성하는 결과를 초래할 수 있다. 그러나 당업자라면 이러한 상황에 내성이 있고, 상기 비어있는 미세액적은 동일한 분할 및 병합 조작을 받을 수 있으며 선택 시 무시될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기술된 선택 방법은 유연하고 다양한 세포 캡슐화 방법들과 함께 사용될 수 있다.
따라서, "적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널"이라는 용어가 사용되는 경우, 당업자라면 일부는 하나 이상의 세포가 결여되어 있음을 인식할 수 있을 것이다. 본 개시의 방법은 세포가 요구되는 빈 미세액적을 신속하게 식별하고 추가 고려에서 제외할 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널에서, 실질적으로 모든 미세액적은 적어도 하나의 세포를 함유할 수 있지만, 일부 또는 소정 비율은 비어있을 수 있다. 미세액적의 패널은 또한 대조군 또는 위치 마커로서 빈 미세액적을 의도적으로 포함할 수 있다.
미세액적의 패널은 또한 공지된 특성을 가진 세포 또는 항체와 같이 공지된 제품/분자를 포함하는 미세액적과 같은 대조군 미세액적을 포함할 수 있으며, 이들은 리포터 개체에 대한 양성 대조군을 제공할 수 있다. 음성 대조군도 포함될 수 있다; 이는 리포터 개체와 양성 결과를 생성하지 않을 것으로 예상되거나, 혹은 빈 액적 또는 배지 액적일 수 있다.
마찬가지로, "하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 미세액적의 패널"이라는 용어가 사용되는 경우, 당업자라면 일부는 하나 이상의 리포터 개체가 결여되어 있음을 인식할 수 있을 것이다. 본 발명의 방법은 상기 빈 미세액적을 식별하고 필요한 리포터 개체를 포함하지 않는 어느 것이든 제거할 수 있다; 그러나 필요한 리포터 개체를 갖지 않는 일부 액적은 검정 중 여전히 존재할 수 있다. 어떤 경우에는 리포터 개체가 없는 액적이 패널의 서브 세트에 도입되어 음성 대조군으로 작용할 수도 있다. 실질적으로 모든 패널은 리포터 개체를 포함할 수 있다.
세포 특성
선택될 세포들은 하나 이상의 특성에 기반하여 선택될 수 있다
상기 특성은 다음 중 어느 하나 이상의 특성 및/또는 부재를 포함할 수 있다:
세포 표면 분자, 활성 프로파일, 증식 능력, 분비 능력, 분비 생성물의 친화력, 분비 생성물의 기능적 행동, 세포 내 생성물을 만드는 능력, 생존력, 형태 및/또는 세포:세포 상호 작용 능력 (세포 사멸 또는 세포 활성화 또는 세포 응집 등).
세포는 실질적으로 동시에 (다중) 또는 순차적으로 시험될 수 있는 특성의 임의의 원하는 조합에 기반하여 선택될 수 있다. 따라서, 하나보다 많은 리포터 개체가 필요할 수 있거나, 적어도 하나의 리포터 개체를 함유하는 리포터 미세액적의 패널이 하나보다 더 많이 필요할 수 있다. 연속적인 선택의 과정은 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 서브 세트를 선택할 수 있게 한다.
일 실시예에서, 결정되는 상기 특성은 하나 이상의 세포 표면 분자 또는 마커의 존재 또는 부재이다. 모든 세포는 특징적인 분자 마커(예를 들어: 단백질, 지질, 글리코실화 마커)를 발현하며, 이는 세포 유형을 구분하는 데 사용될 수 있다. 세포 표면 분자 또는 마커의 특정 조합은 특정 세포를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 세포 표면 마커는 CD 분자이다. CD는 분화 클러스터 (지정 또는 분류 결정자의 클러스터로도 알려져 있으며, 종종 CD로 약칭됨)를 나타낸다. CD 분자를 사용하여 세포의 표현형 검사가 가능하다. 상기 마커는 예외가 없는 것은 아니지만, 종종 특정 면역 기능과 관련되어 있는 경우가 많다. 예시적으로, 다양한 T 세포가 CD3, CD4 또는 CD8의 존재에 의해 식별될 수 있다; B 세포는 CD19 또는 CD56에 의해, NK 세포는 CD56에 의해.
일 실시예에서, 세포 표면 분자 또는 마커는 세포 표면 수용체, 세포 표면 수송체, 세포 부착 단백질, 세포 표면 신호 분자 및 세포:세포 상호작용을 담당하는 세포 표면 분자이다.
일 실시예에서, 세포 표면 마커는 세포가 생산하도록 유전적으로 조작된 인공, 합성 또는 키메라 세포 표면 마커이다.
선택적으로, 인공 세포 표면 마커는 키메라 항원 수용체 (CAR, chimeric antigen receptor)이다. CARs는 4개의 영역으로 구성될 수 있다: 항원 인식 도메인, 세포외 힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포 내 신호 도메인. 상기 항원 인식 도메인은 세포 바깥쪽에 노출되어 잠재적인 표적 분자와 상호 작용하며, 변형된 세포를 정합 분자(matching molecule)를 발현하는 임의의 세포로 표적화하는 역할을 담당한다. 항원 인식 도메인은 전형적으로 단일 사슬 가변 단편(scFv, sigle-chain variable frgment)으로서 함께 연결된 단일클론 항체의 가변 영역으로부터 유도되지만, 조작된 단일 도메인으로부터 유도될 수도 있다. 통상 서로 결합하는 리간드/수용체 쌍을 사용하는 것과 같은 비-항체적 접근 방법 역시도 CAR 개발에 사용되어 왔다.
상기 세포 표면 마커(자연적이거나 변형된)는 상기 선택 동안 세포를 선택하여 세포의 제1 서브 세트를 정의하거나, 또는 세포의 제2 또는 추가 세브세트를 정의하는 데 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 선택은 세포 표면 마커 또는 분자에 기반할 수 있다. 따라서 리포터 개체는 세포 표면 마커 또는 분자와 상호 작용하는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 결정되는 상기 특성은 세포로부터의 하나 이상의 분비물의 존재 또는 부재이다. 많은 세포가 분비할 수 있으며, 예를 들어 포유류 세포는 세포외 기질 내로 연속적으로 단백질을 분비한다. 여러 가지의 특수화된 세포가 특수 분비물을 가질 수 있으며, 예를 들어 면역 세포는 사이토카인, 면역글로불린, 리간드 및 수용체와 같은 분비 단백질을 발현할 수 있다. 상기 세포는 당단백질 또는 지단백질, 화학 물질, 핵산, 중합체 또는 분자를 포함하는 단백질을 분비할 수 있다. 분비는 세포 안쪽에서 바깥쪽으로 물질을 이동시키는 단계이며, 이는 세포의 유형에 따라 다양한 경로를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포는 본 발명의 실시예들 중 임의의 것에 포함될 수 있다. 박테리아 세포는 적응 및 생존하기 위한 분비 능력에 의존할 수 있다.
분비물은 예를 들어 B 세포로부터의 항체와 같은 면역글로불린과 같이 세포 고유의 분비물일 수 있으며, 또는 분비물은 분비를 위해 유전자 또는 코딩 서열을 도입하는 세포의 유전 공학에 기인할 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 B 세포 또는 하이브리도마이고 분비물은 단일클론 항체이다.
분비물은 원하는 특성, 예를 들어 결합능을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 이는 하나 이상의 리포터 개체에 의해 질의될 수 있다.
일 실시예에서, 세포 선택은 세포로부터의 분비물에 기반할 수 있다. 따라서 리포터 개체는 세포 분비물과 상호 작용하는 것일 수 있다. 상기 세포 분비물은 적어도 하나의 세포를 함유하는 참조 미세액적과 분비물이 존재하는 배지를 함유하는 테스트 미세액적으로 미세액적을 분할하는 것에 의해 세포로부터 분리될 수 있다.
일 실시예에서, 결정되는 상기 특성은 세포에 의해 생산된 하나 이상의 세포 내 생성물의 존재 또는 부재이다. 전부는 아니라고 해도 대부분의 세포는 당단백질 및 지단백질을 포함하는 단백질을 생산하는 능력이 있긴 하지만, 일부 세포, 특히 박테리아는 화학 물질, 핵산 및 다른 중합체를 만들 수 있다. 유전적으로 조작된 세포는 원하는 생산물을 만들도록 변형되며, 이들은 분비되지 않고 세포 내에 유지되어, 이를 분배하기 위해서는 세포가 용해되어야만 한다.
세포 내 생성물은 원하는 특성, 예를 들어 촉매 능력을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 이는 하나 이상의 리포터 개체에 의해 질의될 수 있다.
상기 생성물은 세포 고유의 생성물일 수 있으며, 또는 생성물은 상기 생성물을 위해 유전자 또는 코딩 서열을 도입하는 세포의 유전 공학에 기인할 수 있다.
일 실시예에서, 세포 선택은 세포 내 생성물의 검출에 기반할 수 있다. 따라서 리포터 개체는 상기 생성물과 상호작용하는 것일 수 있다. 상기 생성물은 세포에 들어갈 수 있는 리포터 개체에 의해 in situ로 검출될 수 있으며, 또는 상기 테스트 미세액적 내에서 세포 용해에 의해 생성물이 상기 세포로부터 분리될 수 있다.
상기 세포 내 생성물은 임의의 적합한 생물학적 또는 화학적 분자일 수 있다. 세포 내 생성물은 호르몬, 효소, 세포 신호 분자, 신호 전달 분자, 면역글로불린 등과 같은 단백질일 수 있다. 상기 세포 내 생성물은 RNA, DNA 또는 이들의 혼성물과 같은 핵산일 수 있다. 상기 세포 내 생성물은 농약, 독소, 항생제, 연료, 약제학 약물, 백신, 항 바이러스제 등과 같은 화학 물질일 수 있다.
일 실시에서, 세포는 증식 능력에 기반하여 선택된다. 상기 선택은 세포 분열 이벤트의 존재 (미세액적 내 세포수의 증가) 또는 증식 마커에 기반하여 결정될 수 있다. 증식 마커는 이에 특이적인 리포터 개체를 사용하여 검출될 수 있다.
일 실시예에서, 세포는 형태에 기반하여 선택된다. 상기 선택은, 예를 들어 적절한 광학 검출 수단을 사용하여, 세포들의 시각적 검사에 의해 결정될 수 있다. 상기 세포의 형태는 블롭과 같은 세포막에서 세포의 접착 특성, 형상, 유착/부재, 돌출부의 존재/부재 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일 실시예에서, 세포는 리포터 개체와의 상호작용의 결과에 기반하여 선택되며, 여기서 리포터 개체는 세포이다. 상기 상호작용은 세포와 리포터 개체 또는 분비물과 리포터 개체 사이의 것일 수 있다. 상기 리포터 개체 세포는 종양 세포, 세포주, 종양체, 박테리아 세포, 면역계 제시 세포(예를 들어, 항원 제시 세포)와 같은 임의의 세포 유형일 수 있다. 상기 리포터 개체 세포에 반응하여, 선택될 세포는 활성화되거나, 분자를 분비하도록 유도되고/거나 상기 리포터 개체 세포의 세포 활성화 또는 사멸을 촉진시킬 수 있으며, 또는 분비물이 이에 결합할 수도 있다.
리포터 개체 세포와의 직접 또는 간접 (분비물을 통한) 상호작용의 결과에 기반한 세포의 선택은 치료적 적응증에 적합한 특성을 허용할 수 있다.
세포는 임의의 수의 원하는 특성 및/또는 원하지 않는 특성의 부재에 기반하여 선택될 수 있다. 이들은 여기에 기술된 특성의 임의의 조합에 기반할 수 있다.
리포터
본 명세서에 기술된 방법은 적어도 하나의 리포터 개체를 포함하는 미세액적의 적어도 하나의 패널의 사용에 관한 것이다. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 패널과 같은 임의의 적절한 수의 패널들이 사용될 수 있다. 각각의 패널은 각각 상이한 하나 이상의 리포터 개체를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 리포터 개체를 포함 하는 미세액적의 임의의 패널은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 리포터 개체를 포함할 수 있다.
리포터 개체는 검출가능한 변화를 제공하기 위해 상기 세포, 세포 생성물 또는 세포 분비물과 상호 작용할 수 있는 임의의 적절한 개체이다. 리포터 개체는 다음의 개체 또는 그 유도체들 중 어느 하나 이상일 수 있다:
i. 항체;
ii. 항원;
iii. 수용체;
iv. 리간드;
v. 기질;
vi .효소;
vii. 리간드;
viii. 핵산;
ix. 세포;
x. 세포의 일부분;
xi. 세포외 소포체;
xii. 리포솜;
xiii. 중합체;
xiv. 화학 물질;
xv. 약물;
xvi. FRET 리포터;
xviii. 화학발광 물질;
xviii. 조직 시료;
xix. 바이러스 또는 박테리오파지;
xx. 사이토카인; 및/또는
xxi. 단백질.
상기 리포터 개체는 세포 또는 이의 일부 또는 이의 파생물(예를 들어 생성물 또는 분비물)과 상호작용할 수 있는 것이며, 상기 상호작용은 상기 리포터 개체에서 검출가능한 변화를 일으킨다. 상기 변화는 결합, 어닐링, 응집, 분리, 증폭, 형태, 활성화 및/또는 파괴일 수 있다. 상기 리포터 개체는 리포터 개체 세포의 경우에서와 같이 검출 가능한 변화를 직접 모니터링 하기에 적합할 수 있다. 상기 리포터 개체는 예를 들어 시각적, 발색성, 발광성, 형광성 또는 인광성 표지와 같은 비드 또는 라벨, 분할 형광, 분할 발광 또는 형광 리간드와 같은 단백질 보완(protein complementation)과 같은 구조물과 관련/접합(conjugate)될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 리포터 개체의 변화는 표지(예를 들어, 시각적, 발광성, 형광성 또는 인광성 표지)되어 있을 수 있는 제2 개체에 의해 검출될 수 있다. 상기 제2 개체는 예를 들어, 리포터 개체의 세포에 대한 결합을 검출할 수 있고, 2차 항체 또는 이의 유도체일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 리포터 개체는 효소에 접합 또는 연결될 수 있으며, 상기 효소에 대한 기질은 검출을 위한 시각적, 발색성 또는 형광성 신호를 유도하는 제2 개체로서 첨가될 수 있다. 당업자는 특정 분석물의 존재를 결정하기 위한 수많은 검정 수단을 인지하고 있을 것이다.
일반적으로, 리포터 개체는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체(예를 들어 항원-결합 단편 (Fab), 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 소형화된 항체 또는 어피바디(affbody))일 것이다.
일 실시예에서, 미세액적의 테스트 패널은 복수의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 패널과 접촉된다. 따라서, 상기 세포는 "다중-요소 리포터 분석" 또는 "다중-리포터 세포-표면 마커 분석"의 대상이 될 수 있다. 상기 분석에서는 다수의 특성이 리포터 개체의 시스템에 의해 질의되며, 각 개체들은 개별적인 검출 가능한 변화를 생성할 수 있다.
일 실시예에서, 리포터 패널들 중 적어도 하나는 적어도 하나의 리포터 개체 세포를 포함한다. 상기 세포는 종양 세포, 암 세포, 세포주, 종양물, 제시 세포, 부속 세포, 또는 상호작용이 바람직하지 않은 "오프 표적" 세포를 포함하는 임의의 적절한 세포 유형일 수 있다. 리포터 개체 세포에서의 변화가 검출된다. 상기 변화는 세포 사멸 또는 파괴, 세포 활성화 또는 세포 응집일 수 있다. 상기 변화는 시각적으로 (적절한 확대를 통해) 또는 미세액적 내의 적절한 분석물의 존재, 예를 들어 내부 세포 성분, 사이토카인과 같은 세포 신호 분자 또는 상향 조절된 세포 표면 분자의 존재를 검출하는 제2 개체를 통해 관찰될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수용체 활성화와 같은 이벤트에 연결된 적어도 하나의 리포터 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 일단 상기 이벤트가 발생하면, 세포 내 신호 케스케이드가 측정 가능한 신호(예를 들면, 필요한 기질이 제공되면 빛을 생성하는 루시페라아제 유전자)를 생성하는 리포터 유전자를 활성화시킨다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 리포터 패널은 다음 중 적어도 하나 이상을 포함한다:
i. 항원 또는 리간드-접합 비드 및 형광 염료 접합 2차 항체;
ii. 2차 항체-접합 비드 및 형광 염료 접합 항원 또는 리간드; 또는
iii. 담체 표면에 접합된 항원 또는 리간드 및 형광 염료 접합 2차 항체 비드
상기 리포터 개체는 항체, 수용체, 효소 등과 같은 결합이 가능한 분자의 검출에 유용하다. 분석 설계 분야의 당업자라면 리포터 개체의 가능한 모든 조합 및 특성을 검출하고 보고할 수 있는 방법에 대해 알 수 있다.
CAR-T 세포에 대해, 다음의 개체들은 적합한 특성이다: CD4, CD8, CD19, scFv 도메인 마커 (특이성 및/또는 친화성 스크리닝을 위한), B 세포 마커 (또는 다른 원하지 않는 오염 세포에 대한 마커) 및/또는 분화 마커 (관련 서브-패널을 선택하기 위한).
검출
리포터 개체의 변화는 검출이 가능하다. 전술한 바와 같이, 상기 검출은 비록 확대(현미경)를 한다고 해도 가시적인 이벤트를 단순히 관찰하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 검출 이벤트는 변화의 시각적 검출일 수 있다.
몇몇 실시예에 대한 검출은, 예를 들어, 사용된 표지는 시각적, 발색성, 발광성, 형광성 또는 인광성일 수 있으므로 광학적이다. 모든 것에 대해 적절한 검출 기술이 사용될 수 있다.
검출 시스템은 각 미세액적에 대한 각각의 독립적인 리포터 개체의 신호를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 일 예에서, 병합된 미세액적의 패널이 이미지화 될 수 있고 그에 대한 임의의 변화가 검출되고 정량화될 수 있다. 상기 검정의 결과는 개별 세포가 발현하는 마커, 세포가 갖는 활성, 세포가 분비할 수 있거나 분비하는 생성물을 스크리닝할 수 있도록 허용하는 세포 특성(표현형)을 결정하는 데 사용될 수 있다.
검출 시스템은 예를 들어 고감도 카메라를 사용하여 광범위한 고품질 이미징을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 검출 시스템은 다중-채널 형광 검출을 지원하며, 암시야 이미징, 명시야 이미징 및 세포 형태학의 검출이 가능하다. 고 N.A.(60x) 렌즈를 포함하는 다중 대물 렌즈에 의해 고품질 이미징이 지원될 수 있다. 별개의 리포터 개체 신호가 검출될 수 있고, 강도는 각 미세액적에 공간적으로 정량되어 세포의 고처리량 스크리닝을 용이하게 할 수 있다.
선택
본 명세서에 개시된 방법은 그들의 특성에 따라 세포들의 서브 세트의 선택을 허용한다. 미세액적 패널에서 세포는 세포 표면 마커/분자, 내부 세포 생성물 또는 상기 세포로부터의 분비물과 같은 특정 특성에 기반하여 선별되거나 선택된다. 상기 특성은 분비물 또는 세포 내 생성물의 특이성/활성을 포함할 수 있다. 선별된 또는 선택된 세포는 미세액적의 패널의 서브 세트를 형성한다. 적어도 하나의 세포를 함유하는 나머지 미세액적은 폐기되거나 무시될 수 있다. 이렇게 선택된 미세액적의 서브 세트는 세포의 특성이 추가로 조사되거나 또는 분석되는 추가 단계의 대상이 되어 추가적인 서브 세트가 선택된다. 일단 본 명세서에 기술된 방법의 최종 단계가 수행되면, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 최종 서브 세트는 선택된 세포를 함유한다.
상기 선택된 세포 또는 세포들은 상기 장치로부터 분배될 수 있다. 일단 선택되어 상기 장치로부터 분배되면, 상기 세포는 추가 분석을 실시할 수 있거나, 세포 유지 및/또는 증식을 촉진하기 위해 배양될 수 있다. 분배 후, 상기 세포는 선택적으로 환자에게 주입 또는 재주입되기 위해 준비될 수 있다. 분배 후, 상기 세포는 면역글로불린 또는 약제학적 약물과 같은 치료 개체를 생산하는 데 사용하기 위해 증식될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 선택된 세포들은 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널에 존재한다. 상기 참조 패널은 테스트 패널 내의 미세액적과 관련된 미세액적을 포함하며, 이는 둘 모두가 동일한 전구(progentor) 미세액적으로부터 유래된 것이기 때문이다. 일 실시예에서, 상기 전구 미세액적의 분할은 적어도 하나의 세포를 함유하는 참조 패널 미세액적 및 적어도 배지를 함유하는 테스트 패널 미세액적을 생성한다. 상기 배지는 상기 세포의 특성인 세포 유래의 분비물을 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 전구 미세액적은 적어도 하나의 세포를 함유하는 참조 패널 미세액적 및 하나의 세포를 함유하는 테스트 패널 미세액적을 생성한다. 상기 미세액적의 참조 패널은 따라서 상기 세포 특성을 결정하기 위한 분석의 대상이 되는 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널의 클론 또는 클론 사본인 세포를 함유한다. 선택 단계는 테스트 패널에서 세포를 용해하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 추가 증식을 위해 세포를 선택할 때에는 바람직하지 않다.
따라서, 임의의 실시예에 따르면, 미세액적의 테스트 패널에 대한 분석으로부터 획득된 결과는 참조 패널 내의 세포와 직접적으로 관련될 수 있다; 즉, 선택된 것이 참조 패널 유래의 세포들이다. 상기 단계의 장점은 참조 패널 세포들이 세포에 유해할 수 있거나, 혹은 종양 세포에의 노출과 같이 치료적 목적으로 사용되는 세포의 제조에 바람직하지 않은 리포터 개체들 중 일부에 노출되지 않았을 수 있다는 것이다.
세포는 특성, 특성의 부재, 또는 둘 모두의 혼합에 기반하여 선택될 수 있다. 상기 세포, 추출물 또는 이들 유래의 분비물은 따라서 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 복수의 특성에 대해 시험되거나 분석될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세포는 단일 단계에서 복수의 특성들에 대해 동시에 시험된다. 해당 다중 테스트는 리포터 개체의 변화가, 예를 들어 형광성, 발광성 및 인광성 라벨 또는 이벤트와 같이, 다른 수단을 사용하여 검출되는 경우 달성 가능하다. 검출 수단은 또한 분할 형광, 분할 발광 또는 형광 리간드와 같은 단백질 보완(protein complementation) 이벤트를 포함할 수 있다.
상기 선택된 세포는 추가로 상기 장치로부터 분배되어, 추가 사용 전에 배양될 수 있으며, 세포 분열을 진행하도록 허용될 수 있다. 일 실시예에서, 세포는 환자에게 주입하기 위한 것이다. 일부 실시예에서, 미세액적의 선택된 패널을 분배 후, 그 안에 함유된 세포를 집단을 증식시키고/거나 클론(들)을 배양하도록 처리할 수 있다.
장치로부터 분배한 후, 미세액적의 서브 세트 내에 함유된 세포 및/또는 분비물, 대사물과 같은 비-세포 개체는 다음 중 어느 하나 이상을 포함하여 분석될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
I. 질량 분석;
II. 표면 플라즈몬 공명;
III. 고성능 액체 크로마토그래피; 및/또는
IV. 핵산 시퀀싱 및 PCR 증폭을 포함하는, 유전적 분석.
배지
본 개시의 발명을 위해 세포는 미세액적에 캡슐화된다. 임의의 실시예에 따른 세포는 일반적으로 배지, 통상 수성 배지에 공급된다. 배지는 단순히 그 안에서 세포가 배양되는 물질이다. 배지는 세포를 유지하기에 충분한 물질을 함유하는 최소 배지일 수 있으며, 상기 최소 배지의 내용물은 캡슐화되는 세포의 유형에 의존할 것이다. 필요한 성분은 연구되는 세포의 유형에 따라 달라질 것이고, 당업자라면 과제를 위해 정확한 배지를 식별하는 방법을 이해할 것이다.
일반적으로, 세포 배양 배지는 탄소원(예를 들어, 글루코스와 같은 당), 물, 하나 이상의 염, pH 완충액, 아미노산 및 질소원을 함유할 수 있다. 상기 배지는 필요한 경우 세포 분열 또는 세포 생존을 보조하거나 촉진하는 분자 또는 시약으로 보충될 수 있다. 상기의 것은 적절한 영양소, 성장 인자, 신호 분자(예를 들어 사이토카인), 비타민, 염, 혈청 단백질, 공동 인자(cofactor), 탄수화물, 가스, 미량원소 및 항생제를 포함한다.
예시적인 배지는 기본 배지(basal medium)이며 단백질이나 성장 촉진제를 함유하지 않는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)이다. 따라서, "완전한"배지가 되기 위해서는 보충이 필요하다. 가장 일반적으로는 5-10% FBS(Fetal Bovine Serum)로 보충된다. DMEM은 포유동물 세포 배양에 널리 적용 가능한 것으로 알려져 있으며, 하이브리도마를 배양하는 데에도 사용될 수 있다. 대체 배지는 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium)이다. EMEM은 균형잡힌 염 용액, 비필수 아미노산 및 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)를 포함한다. EMEM은 비-복합 배지이므로 일반적으로 광범위한 포유동물 세포에 적합하게 하기 위한 추가적인 보충물 또는 더 높은 수준의 혈청으로 강화된다. RPMI는 포유동물 세포, 특히 조혈 세포에 대한 광범위한 적용 범위를 갖는 범용 배지이다. RPMI는 McCoy's 5A의 변형이며 말초 혈액 림프구의 장기 배양에 대해 개발되었으며, 현탁액 상태의 매우 다양한 세포의 성장을 지원한다. 혈청 또는 혈청 대체로 보충된 경우, 상기 배지는 신선한 인간 림프구의 배양, 마우스 하이브리도마 세포와 같은 항체 제조를 위한 혼성화 세포의 융합 프로토콜 및 성장을 포함하여, 포유동물 세포에 대한 광범위한 적용 범위를 갖는다. 또한 말초 혈액 단핵 세포를 유지/부유시키는 데에도 종종 사용된다. 많은 유형의 세포 배양 배지가 가능하며, 선택하고자 하는 세포 유형의 생존을 최적화하도록 배지를 선택하여야 한다.
본 개시의 방법은 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널을 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널과 적어도 배지를 포함하는 미세액적의 테스트 패널로 분할하는 것을 포함할 수 있다. 특히 적어도 하나의 세포를 함유하는 전구 미세액적에서 세포 분열이 일어났다면, 일부 테스트 패널 미세액적 또한 세포를 함유할 수 있다는 것은 당업자라면 알 수 있을 것이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적은 적어도 하나의 미세액적을 함유하는 세포의 참조 패널이 생성되는 분할 작업을 이미 거쳤다. 이로 인해 세포의 클론 사본이 보존되므로, 임의의 후속 단계 동안 상기 테스트 패널에서의 세포를 자극하면 세포의 손상을 초래하는 경우, 참조 패널 또는 미세액적으로부터 세포가 여전히 선택될 수 있다. 특히 이러한 손상은 유전 물질 또는 세포 내 생성물에 접근하기 위해 세포를 용해시키는 과정에서 발생할 수 있다.
상기 분할이 세포 및 배지를 분리하기 위해 사용되는 경우, 적어도 하나의 세포를 함유하는 전구 미세액적은 배지에서 분비물을 축적하도록 허용하는 조건하에서 배양될 수 있다. 상기 조건은 분비를 촉진시키기 위한 자극 또는 신호 분자(예를 들면 사이토카인)와 같은 배지 시약을 배지에 제공하거나, 혹은 분비물의 형성을 유도하도록 세포와 상호작용하는 항체 제시 세포와 같은 세포를 배지에 포함시키는 것을 포함한다. 또는, 분비물이 세포에 의해 생산되도록 유전적으로 조작된 경우, 발현이 활성화되도록 락토오스와 같은 화학물질을 첨가하는 것과 같이 분비물의 발현을 조건적으로 만들기 위해 공학이 적용될 수 있다. 따라서, 발현을 개시하기 위해 적절한 신호가 제공될 수 있다.
일단 세포가 분비를 촉진하기 위해 배양되면, 미세액적의 패널은 분할될 수 있다. 분할 작업은 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 미세액적의 패널 내의 각 미세액적이 분할되어, 적어도 두 개의 자손 액적의 패널을 형성한다. 상기 자손 액적은 대략 동일한 크기일 수 있거나, 또는 미세액적의 하나의 패널이 더 큰 크기를 갖도록 분할이 비대칭일 수 있다. 미세액적이 분할될 때, 하나의 자손 액적은 적어도 하나의 세포를 수용할 수 있고, 상기 미세액적이 참조 패널을 형성한다. 미세액적이 분할될 때, 하나의 자손 액적은 임의의 분비물과 함께 배지를 수용할 수 있으며, 상기 미세액적은 테스트 패널을 형성한다.
배지 내의 분비물의 존재는 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 수성 미세액적의 하나 이상의 패널을 병합하는 것과 같이, 미세액적의 테스트 패널 내의 분비물을 희석하거나 세척할 수 있도록 테스트 패널의 미세액적에 일련의 병합 및 분할 이벤트를 사용하는 것이 유용할 수 있다.
세포 및 배지를 포함하는 미세액적은 제어된 환경 및 온도와 같은 조건으로 세포를 유지하기에 최적의 조건에서 유지될 수 있다. 세포를 유지하는 것은 W02020/104769에 기재된 바와 같이 영양소, 완충액, 질소, 산소 및/또는 이산화탄소의 하나 이상의 포화 수준을 함유하는 비혼화성 운반매의 유동적 흐름의 공급을 포함할 수 있다.
당업자라면 미세액적은 본질적으로 수성이기 때문에, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적 역시 태생적으로 배지를 포함한다는 것을 이해할 것이다.
세포 분열
본 개시의 방법은 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널이 세포 분열을 진행하도록 허용되는 단계를 포함할 수 있다. 세포 분열은 그에 의해 부모 세포가 둘 이상의 딸 세포로 나누어지는 과정이다. 이러한 맥락에서, 각각의 딸 세포는 부모 세포와 유전적으로 동일할 수 있다(진핵생물의 경우 세포가 유사분열을 겪었음). 원핵생물(박테리아 및 고세균)은 유전물질이 두 딸 세포로 똑같이 분리되는 이진 분열을 진행할 수 있다. 상기 세포는 유전 물질이 동일해야 하기 때문에 클론으로 기술될 수 있다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 클론 증식을 진행하도록 허용된다. 클론 증식은 그에 의해 딸 세포가 부모 세포로부터 발생하는 과정이며, 일반적으로 면역세포(예를 들어 NK 세포, B 및 T 림프구)와 같은 특정 유형의 세포에 적용되는 용어이다.
본 개시의 방법에서, 세포 분열 또는 클론 증식은 미세액적의 패널에서 허용되거나 조장된다. 상기 세포에는 미세액적 내에 적절한 배양 배지의 공급, 영양소, 사이토카인, 비타민, 활성제, 호르몬 또는 성장 인자와 같은 관련 보충 분자의 추가를 포함하는, 세포 분열을 허용하기 위한 적절한 조건이 제공될 수 있다. 당업자라면 세포 분열에 요구되는 조건이 문제의 세포 유형에 따라 달라질 것이라는 것을 알고 있을 것이다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널에 존재하는 세포는 림프구(NK 세포, B 세포 또는 T 세포)와 같은 면역 세포이다. 상기 면역 세포는 클론 증식을 유발하기 위한 활성화를 필요로 할 수 있다. 활성화는 특정 사이토카인과 같은 신호 분자를 포함할 수 있다. 활성화는 대안적으로 또는 추가적으로 면역세포 상의 특정 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 포함할 수 있다. 상기의 것은 상기 수용체에 작용하는 항체를 사용한 결합일 수 있다. 또는, 활성화는 적절한 세포(예를 들어, 항원 제시 세포, APC)를 사용하여 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 T 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 항 CD3 항체 또는 항 CD28 항체와 같은 적어도 하나의 T 세포 활성제를 함유하는 미세액적의 패널에 포함되거나 병합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세포는 최소한의 세포 분열이 미세액적 내에서 일어나도록 최소한으로 자극/활성화될 수 있다.
세포가 세포 분열을 활성화하거나 진행하는 것에 실패하면, 이러한 세포의 추가 사본(클론)의 생성 부족으로 인해 미세액적이 선택되지 못하게 될 수 있다. 따라서, 분열을 위한 활성화 및/또는 능력은 본 개시의 방법에서 선택되는 특성일 수 있다.
일단 세포가 세포 분열을 촉진하기 위해 배양되면, 패널 또는 미세액적은 분할될 수 있다. 실제 또는 가상 전기 습윤 전극을 사용하여 분할 동작이 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 미세액적의 패널 내의 각 미세액적이 분할되어, 적어도 두 개의 자손 액적의 패널을 형성한다. 상기 자손 액적은 대략 동일한 크기일 수 있거나, 또는 미세액적의 하나의 패널이 더 큰 크기를 갖도록 분할이 비대칭일 수 있다. 미세액적이 분할될 때, 하나의 자손 액적은 적어도 하나의 세포를 수용할 수 있다. 적어도 하나의 세포가 없는 미세액적은 폐기되거나 선택으로부터 무시될 수 있다. 분할된 미세액적 내의 세포는 사실상 유전적으로 동일하거나 클론이다.
일 실시예에서, 세포 분열 후, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 2개의 패널로 분할된다; 미세액적의 참조 패널과 본 명세서에 기술된 방법에서 추가적으로 사용될 수 있는 테스트 미세액적의 패널. 본 개시의 방법은 미세액적의 참조 패널이 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널 내 세포의 특성에 대한 분석 및/또는 시험에 기반하여 선택될 수 있도록 하는데, 이는 둘 모두가 유전적으로 동일한 세포를 포함하기 때문이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법은 세포 분열을 허용하기 위하여 세포의 "배양"을 제안한다. 상기 기술은 단순히 미세액적 환경 내에서 세포를 성장시키는 것이다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이 적절한 세포 배양 배지, 영양소 등과 같은 성장을 위한 유리한 조건이 사용될 수 있다. 당업자라면 세포 성장 및 분열을 촉진하는 세포 배양 기술을 알고 있을 것이다.
미세액적의 식별 및 추적
본 개시의 미세액적은 본 명세서에 기재된 바와 같은 장치에서 적절하게 조작되어 질 수 있다. 상기 미세액적 조작의 제어는 컴퓨터가 구현하는 것일 수 있다. 장치에서 미세액적의 위치는 상기 미세액적의 식별을 허용하여, 전구 미세액적의 분할 이벤트에서 비롯된 것과 같은, 관련되거나 상응하는 미세액적이 식별되도록 한다. 이는 리포터 개체가 테스트 패널에 결과를 나타내면, 참조 패널로부터 미세액적을 선택할 수 있게 한다. 추가로, 분할 이벤트로부터 생성된 미세액적 중 하나가 미세유체 칩으로부터 회수되어 외부 마이크로웰 플레이트로 분배되면, 분할 이벤트의 원래의 전구 미세액적(참조 패널 내의 칩 상에서 유지되어 있음)은 관련 자손 액적에 대해 수행된 DNA 시퀀싱, PCR 또는 질량 분석과 같은 오프-칩 분석의 결과에 대응될 수 있다.
일 실시예에서, 임의의 패널의 미세액적을 표지 또는 바코드(barcode)할 필요가 없다.
패널 내 미세액적의 위치로부터 미세액적의 신원을 결정하는 것이 가능하다. 미세액적의 위치와 그에 따른 신원은 소프트웨어에 의해 제어될 수 있다. 일단 리포터 개체 미세액적과 병합된 미세액적 내에서 세포의 특성이 결정되면, 동일한 세포와 관련된 상응하는 참조 패널 미세액적과 그 결과를 연관시킬 수 있다.
상기 분석 단계의 소프트웨어 제어는 일련의 작업이 특정 세포 유형 또는 리포터 분석에 대한 정확한 요구사항에 따라 적용되고 수정될 수 있도록 한다. 예를 들어, 분비가 느린 세포의 경우에는 리포터 패널 액적이 병합되기 전의 배양 기간을 조정할 수 있다. 소프트웨어 알고리즘을 구현하여 분석 단계를 칩 상에서 발생하는 시간-의존적인 이벤트에 반응하도록 만들 수 있다. 세포 분열의 경우, 이미지 인식 소프트웨어를 사용하여 미세액적 내의 세포의 수를 카운트하고, 일단 세포 수가 특정 수준에 도달한 경우 액적을 분할하는 과정을 촉발할 수 있다. 일부 실시예에서, 미세액적은 미세유체 칩 내의 소형 밸브 구조 또는 밀폐된 챔버 구조 내의 유체-보유 펜(fluid-retaining pens)과 같은 미세구조를 갖는 트랩 내에 포함된 유체의 액적이다. 일부 실시예에서 액적을 분할하는 공정은 기계적 구조의 적용 또는 미세구조의 변형을 통해 수행된다. 일부 실시예에서, 액적은 음향 조작을 사용하여 분할된다.
일부 실시예에서, 미세액적을 병합하는 공정은 기계적 작동, 전기영동, 음파(aucostic waves) 또는 원심력을 사용하여 서로 충돌하게 함으로써 수행된다.
방법
본 개시는 세포의 선택을 허용하는 방법, 특히 일단 선택이 완료된 후 세포의 추가적인 사용을 허용하는 세포 선택 방법에 관한 것이다.
일 실시예에서, 상기 방법은 다음과 같다:
본 개시의 일 양태에 따르면, EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 세포 선택 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고;
및 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i)내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
따라서 상기 세포는 하나 이상의 특성에 기반하여 선택될 수 있다.
또는, EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 세포 선택 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 하나 이상의 세포 및 배지를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii. 상기 미세액적의 패널을 적어도 두 개의 미세액적의 패널, 즉 하나 이상의 세포를 포함하는 미세액적의 적어도 하나의 참조 패널 및 적어도 상기 배지를 포함하는 미세액적의 적어도 하나의 테스트 패널로 분할하는 단계;
iii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iv. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
v. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계; 및
vi. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 참조 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계.
본 개시의 다른 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 세포 선택 방법이 제공된다:
i) 적어도 하나의 세포 및 배지를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii) 하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 미세액적의 병합된 패널을 형성하는 단계;
iv) 상기 세포의 하나 이상의 특성에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 미세액적의 병합된 패널을 모니터링 하고, 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 미세액적의 서브 세트를 선택하여 세포를 포함하는 미세액적의 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 세포를 포함하는 상기 미세액적의 선택된 패널을 취하고 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 이상 반복하며, 여기서 단계 (ii)에서는 하나 이상의 상이한 리포터 개체가 사용되는 단계;
vi) 단계 (v)에서 선택된 미세액적의 최종 패널에 기반하여 세포를 선택하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 적어도 두 개의 미세액적의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적절한 적어도 배지를 포함하는 미세액적의 테스트 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
다음의 특징들은 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 적용될 수 있다:
모든 패널의 미세액적은 미세액적의 내용물을 희석하거나 미세액적의 내용물을 "세척"하는 목적으로 다중 병합 및 분할 작업될 수 있다. 상기 작업은 미세액적의 패널을 배지, 완충액 또는 적절한 수용액을 포함하는 미세액적의 하나 이상의 패널과 병합하고, 상기 병합된 미세액적의 패널을 자손 미세액적의 둘 이상의 패널로 분할하는 것을 포함한다. 이러한 단계는 내용물을 추가로 희석하기 위해 연속적으로 수행될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 다양한 패널에서의 미세액적은 쌍으로 병합된다; 한 쌍(두 개)의 미세액적을 병합하여 새로운 하나의 미세액적을 형성하도록 한다. 이러한 쌍을 짓는 단계는 복수의 미세액적을 결합하여 병합된 미세액적을 형성하도록 한 번 이상 수행될 수 있다. 따라서, 상기 미세액적을 병합하는 단계는 궁극적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 미세액적을 포함할 수 있다. 각각은 순차적으로 또는 실질적으로 동시에 병합될 수 있다.
미세액적의 세트가 병합되면, 효과적으로 동시에, 각 패널로부터 하나의 미세액적을 병합하여 새로운 병합된 미세액적 패널을 형성한다. 이러한 병합 작업을 위한 미세액적의 세트는 각각 별도의 패널로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 미세액적을 함유할 수 있다.
적어도 하나의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 복수의 패널이 제공되는 경우, 각 패널은 적어도 하나의 리포터 개체를 함유하는 미세액적을 포함할 수 있다. 각 리포터 개체는 특정 세포의 특성의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 복수의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 단일 패널이 병합 단계에서 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단계 (ii)는 특정 세포 마커 또는 분자의 존재 또는 부재와 같은 세포의 세포 표면 특성을 결정하기 위한 리포터 개체를 사용하는 것을 포함한다. 미세액적의 테스트 패널은 이후 미세액적의 추가의 리포터 패널과 병합될 수 있다; 이후 다른 세포 유형을 활성화 또는 사멸시키는 능력과 같은 세포:세포 상호작용 특성을 결정하기 위한 리포터 개체를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
또는, 다른 실시예에서 상기 단계들은 먼저 다른 세포 유형을 활성화 또는 사멸시키는 능력과 같은 세포:세포 상호 작용 특성을 결정하기 위한 리포터 개체를 사용하여 특성을 규명하고, 두 번째로 특정 세포 마커의 존재 또는 부재와 같은 세포 표면 특성을 결정하기 위한 리포터 개체를 사용하여 특성을 규명하는 것과 같이 역순으로 이루어질 수 있다.
미세액적의 리포터 패널과 미세액적의 테스트 패널을 병합하는 다중 단계가 사용되면, 상기 다중 단계전, 그 동안 또는 그 후에 분할 단계가 사용되어 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 상기 방법 중 임의의 적절한 지점에서 구축될 수 있도록 할 수 있다. 참조 패널은 따라서 원래 제공되는 세포들의 서브 세트를 나타낼 수 있다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 적어도 하나의 리포터 개체를 포함하는 리포터 개체의 패널을 병합하기 전에, 미세액적은 미세액적의 적어도 두 개의 패널로 분할되어 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널이 유지될 수 있다. 상기 세포는 이후 세포에 유해할 수 있는 리포터 개체와 접촉하지 않거나, 치료 등에서 세포의 추가 사용을 방지한다. 다른 구성된 미세액적의 패널 ("테스트 패널")은 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 함유할 수 있다. 분할 단계 이전에, 세포는 세포 분열 또는 세포 분비를 허용하는 조건에서 배양될 수 있다.
특정 실시예에서 방법은 다음을 포함한다:
다음 단계를 포함하는 EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 CAR를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 T 세포와 같은 면역 세포 선택 방법이 제공된다:
i) CAR를 암호화하는 핵산으로 형질전환된 적어도 하나의 면역세포를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii) 세포 표면 마커에 특이적인 하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 미세액적의 병합된 패널을 형성하는 단계;
iv) 상기 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 미세액적의 병합된 패널을 모니터링 하고, 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 미세액적의 서브 세트를 선택하여 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 적어도 하나의 세포를 포함하는 상기 미세액적의 선택된 패널을 취하고 선택적으로 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 이상 반복하며, 여기서 단계 (ii)에서는 하나 이상의 상이한 리포터 개체가 사용되며 세포를 포함하는 단계;
vi) 단계 (iv) 또는 (v)에서 선택된 미세액적의 최종 패널에 기반하여 세포를 선택하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 세포 분열되도록 배양되며, 그 후에 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 두 개 이상의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
상기 면역세포는 T 세포일 수 있다. T 세포에 대해 검출될 수 있는 적절한 마커는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함한다:
CD4, CD8, CD19, scFv 도메인 마커 (특이성 및/또는 친화성 스크리닝을 위한), B 세포 마커 (또는 다른 원하지 않는 오염 세포를 위한 마커) 및/또는 분화 마커 (관련 서브-패널을 선별하기 위한).
분열, 활성화되지 않거나 필수적인 세포 사멸 특성(T 세포)을 보유하지 않는 세포는 폐기될 수 있다.
다른 실시예에서, 방법은 다음을 제공한다:
다음 단계를 포함하는 EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 유전자 변형된 조혈 줄기 세포 선택 방법이 제공된다:
i) 적어도 하나의 유전자 변형된 조혈 줄기 세포를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii) 하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 미세액적의 병합된 패널을 형성하는 단계;
iv) 상기 세포의 하나 이상의 특성에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 미세액적의 병합된 패널을 모니터링 하고, 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 미세액적의 서브 세트를 선택하여 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 적어도 하나의 세포를 포함하는 상기 미세액적의 선택된 패널을 취하고 선택적으로 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 이상 반복하며, 여기서 단계 (ii)에서는 하나 이상의 상이한 리포터 개체가 사용되는 단계;
vi) 단계 (iv) 또는 (v)에서 선택된 미세액적의 최종 패널에 기반하여 세포를 선택하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 세포 분열되도록 배양되며, 그 후에 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 두 개 이상의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적절한 적어도 하나의 세포를포함하는, 미세액적의 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
다른 실시예에서, 방법은 다음을 제공한다:
EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 면역글로불린 생성에 기반한 세포 선택 방법으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 면역 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 면역글로불린의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고;
및/또는 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i)내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
다른 실시예에서, 방법은 다음을 제공한다:
EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 의약품 생성에 기반한 세포 선택 방법으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 유전자 조작된 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 의약품의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고;
및/또는 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i)내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
다음의 특징들은 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 적용될 수 있다:
임의의 패널 내의 미세액적의 조작은 실제 또는 가상 전기습윤 전극을 사용하여 이루어진다. 미세액적이 병합되는 경우, 이는 복수의 분리된 미세액적을 결합하여 단일 미세액적을 형성하는 것을 포함한다.
선택적으로, 상기 방법은 임의의 병합 단계 이전에 장치에서 분화를 허용하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 리포터 개체는 유전 공학을 통해 도입된 이식 유전자(transgene)의 활성을 결정하거나, 혹은 특정 세포 표면 마커, 세포 생성물 또는 세포 분비물을 검사할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 방법은 유전적으로 추가된 이식 유전자의 발현에 기반하여 특정 유전 변형된 세포를 선택하기 위한 것이며, 여기서 동일한 것이 생성물(예를 들어 화학 물질 또는 단백질)을 생산하는 데 사용될 수 있다.
다음 단계를 포함하는 EWOD 또는 oEWOD 장치를 사용한 유전자 조작된 세포 선택 방법이 제공된다:
i) 적어도 하나의 유전자 조작된 세포를 포함하는 미세액적의 패널을 제공하는 단계;
ii) 하나 이상의 리포터 개체를 포함하는 리포터 미세액적의 적어도 하나의 패널을 제공하는 단계;
iii) 상기 적어도 하나의 세포를 포함하는 패널의 미세액적과 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 미세액적의 병합된 패널을 형성하는 단계;
iv) 상기 세포의 하나 이상의 특성에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 미세액적의 병합된 패널을 모니터링 하고, 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 미세액적의 서브 세트를 선택하여 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 선택된 패널을 형성하는 단계;
v) 적어도 하나의 세포를 포함하는 상기 미세액적의 선택된 패널을 취하고 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 이상 반복하며, 여기서 단계 (ii)에서는 하나 이상의 상이한 리포터 개체가 사용되는 단계;
vi) 단계 (v)에서 선택된 미세액적의 최종 패널에 기반하여 세포를 선택하는 단계;
여기에서, 단계 (iii) 및/또는 단계 (v) 이전에, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 패널은 세포 분열되도록 배양되며, 그 후에 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 두 개 이상의 패널로 분할되며, 상기 패널은 다음과 같다:
a. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널; 및
b. 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 참조 패널.
선택적으로, 상기 방법은 미세액적의 리포터 패널과 병합하기 전에 패널의 미세액적에 있는 세포를 용해하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 일반적으로 각각 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 구성된 후에 수행된다.
세포는 포유류, 곤충, 식물, 박테리아 또는 곰팡이와 같이 유전자 변형에 적절한 모든 유형의 세포일 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법의 임의의 조합이 고려되며, 방법이 수행되는 단계 및 순서는 선택 중인 세포의 특성 및 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다.
미세액적은 액적이라고도 지칭될 수 있다.
[실시예]
본 발명의 몇몇 양태 및 실시예가 예로서, 그리고 상기 기술된 도면을 참조하여 설명될 것이다. 본 명세서에 기술된 방법은 당사의 미세유체 장치(Lightcast Discovery LTD, 영국)를 사용하여 수행되었다.
실시예 1 - 예시적 CAR-T 작업흐름
이 작업흐름은 T 세포의 유전적 변형으로 시작하여 선택된 T 세포의 대량 증식 및 재주입 전에 종료되는(도 1에 묘사 된 바와 같이) 상기 CAR-T 세포 제조 공정의 특정 구간을 대상으로 한다.
기본적으로, 두 부분으로 구성되는 스크리닝은 CAR-T 세포의 선택에 사용되며 다음을 포함하고: 1) 다중-리포터 세포-표면 마커 분석; 및 2) 활성화 평가, 및 이들 단계는 어느 순서로든 수행될 수 있다.
환자 혈액을 수집하고 환자-유래 T 세포(변형되지 않은)를 분리한다. 상기 T 세포는 통상적인 수단에 의해 미세액적으로 에멀젼화 하고 미세유체 플랫폼 상에 로딩한다. 상기 T 세포는 이후 형질도입되며 - 본 단계는 각각 T 세포를 함유하는 상기 미세액적의 패널을 각각의 벡터를 포함하는 미세액적의 패널과 쌍을 지어 병합하여 병합된 미세액적의 제1 패널을 형성하는 것을 포함한다. 상기 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산을 포함하며, 여기에서 상기 핵산 서열은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 형질도입 후, 상기 T 세포는 제1 스크리닝 단계로 진행하였다. 비어있거나 혹은 다중 점유 미세액적은 필요한 경우 폐기한다(도 2).
다중 요소 리포터 분석은 상기 형질도입된 T 세포 상의 다중 마커를 분석하기 위한 검출 시스템의 사용을 포함할 수 있으며, 이후 이를 기반으로 미세액적이 선택된다. 리포터 설계는 예를 들어 다음의 마커들을 포함할 수 있다: CD4/CD8, CD19, scFv 도메인 마커 (특이성 및/또는 친화성 스크리닝을 위한), B 세포 마커 (또는 다른 원하지 않는 오염 세포에 대한 마커) 및/또는 분화 마커 (관련 서브-패널을 선택하기 위한). T 세포에서 다중 마커를 분석하는 것은 형질도입된 T 세포를 함유하는 미세액적을 리포터(예를 들어, 1차 항체 및 형광 염료-접합된 검출 항체)를 함유하는 미세액적으로 병합하는 단계를 포함한다. 최적이 아닌 세포들은 증식 전에, 가능한 가장 빠른 단계에서 여기서 제거된다. 이렇게 하면 이후 증식 및 프로파일링 단계에 대한 최상의 가능한 입력값을 제공한다. 여기에서, 선택된 미세액적은 이후 (도 2에 묘사된 바와 같이) 선량 측정 및 프로파일링 단계로 진행한다.
CAR-T 세포의 참조 패널은 상기 세포가 활성화되고 분열이 허용된 후, 적어도 하나의 CAR-T 세포를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 구성될 수 있다.
선택된 미세액적의 세포는 칩 상에서(온-칩) 증식되어, 생존력, 활성화 및 소진 거동이 평가된다. 상기 활성 스크리닝은 예를 들면 항-종양 활성 및 효능에 대한 스크리닝을 포함할 수 있다. 항-종양 세포 활성을 평가하기 위한 상세한 방법은 실시예 3에 기재되어 있다. 상기 분석 결과에 따라 원하지 않는 미세액적은 폐기되고 미세액적의 최종 패널이 선택되며, 이는 참조 패널의 서브 세트일 수 있다. 상기 온-칩 활성 분석은 예를 들어 다양한 T 세포/종양 세포 비율에서 T 세포 용량을 함유하는 미세액적과 종양 세포(들) 또는 종양체(들)을 함유하는 미세액적을 병합하고, 상기 T 세포의 상기 암 세포 사멸 활성을 측정하는 것을 포함한다. 용량 효능(dose efficacy) 및 안전성 프로파일은 본 단계에서 평가될 수 있다. 상기 T 세포의 게놈을 시퀀싱하고 여기에서 단일 세포 게놈 데이터를 얻을 수 있다(도 3).
미세액적의 최종 선택된 서브 패널의 T 세포는 대량 증식 및 추후 환자에게 재주입을 위해 상기 장치로부터 웰 플레이트로 분배될 수 있다. 이 방법은 선택된 세포의 최상의 일관성 및 생존력을 허용하고 효능 및 안전성 프로파일 정보의 정량화를 가능하게 한다.
실시예 2 - 면역 종양학 작업흐름
중국 햄스터 난소(CHO, Chinese hamster ovary) 세포는 면역-치료 약물(예를 들어, TCTR)을 생산하기 위해 변형된 다음 미세액적으로 에멀젼화 되어 미세유체 플랫폼 상에 로딩된다. 비어있거나 또는 다중 점유된 미세액적은 폐기된다. 단일 CHO 세포를 함유하는 나머지 미세액적은 면역 치료제의 생산을 촉진하기 위하여 온-칩 배양된다. CHO를 함유하는 액적은 이후 분할되어 각 세포에 의해 생성된 약물의 다중 용량을 얻는다. T 세포 및 표적 종양 세포는 개별적으로 에멀젼화 되고 각 미세액적의 세포 점유를 원하는대로 조절하여 미세유체 플랫폼 상에 어레이로 로딩된다. 상기 T 세포 및 종양 세포 어레이는 이후 병합된다. 제2 병합 작업은 면역치료 약물의 용량을 추가하기 위해 사용되며, 각 용량이 어떤 CHO 세포로부터 유래하였는 지 추적한다. 결과적인 분석은 배양하고 T 세포 사멸 행동을 상기 검출 시스템을 사용하여 세포자멸사의 형광 마커인 카스파제 3/7 형광을 검출함으로써 모니터링 된다. 시험 약물의 유효 용량을 생산한 CHO 세포는 웰 플레이트로 분배될 수 있다(도 4).
실시예 3 - Pan T 세포 사멸 분석
준비 프로토콜
EMEM (10% FCS, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 80% 컨플루언스(confluence)로 배양된 종양 모델 세포주(계대 59+1)를 1μM 카스파제 3/7, 50μM Hoechst 33342 및 0.1 nM TCR 약물이 보충된 3e6/mL 밀도의 액적 배지(RPMI 1640 (10% FCS, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 5% CO2 및 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 한편, 인간 공여자 유래 Pan T 세포를 해동하고 PBS에서 세척한 다음, 2e6/mL 밀도의 액적 배지 (RPMI 1640)에서 배양하기 전에 1μM Deep Red, 5% CO2 및 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 두 세포 현탁액을 미세액적으로 에멀젼화 하였다(도 5).
액적 패널
Pan T 세포(들)을 함유하는 미세액적을 제1 패널로 분류하고 종양세포(들)을 함유하는 미세액적을 제2 패널로 분류하였다. 상기 두 개의 패널을 쌍을 지어 병합하여 다양한 종양세포(들)/Pan T 세포(들) 비율로 T 세포(들) 및 종양세포(들) 모두를 함유하는 미세액적을 생성하였다. 종양세포(들)만을 포함하는 미세액적 또한 음성 대조군으로 포함하였다(도 6). 병합된 미세액적을 t=0 시간에 카스파제 3/7 형광에 대해 스캔하여 종양세포가 조기에 세포자멸사하지 않았음을 확인하였다.
결과
결과는 50% 생존율 구간이 28시간임을 나타냈으며, 이는 명확한 암세포 사멸 행동을 관찰하기에 충분한 시간이다. 시간-의존적인 종양세포 세포자멸사를 정량하기 위하여 각각의 액적에 대해 시간 경과에 따른 카스파제 강도를 측정하였다. 명시야 현미경이 미세액적 내에서 종양세포와 상호작용하고 연속적으로 사멸시키는 T 세포를 이미지화하는 데 사용되었다(도 8, 도 9).
실시예 4 - 항체 발굴
세포 생존율
관련 없는 하이브리도마 세포를 좀비(zombie) 염색으로 염색하고, 미세액적으로 에멀젼화 하여 미세유체 플랫폼 상에 로딩하였다. 그 후, 상기 세포의 생존율을 상기 미세액적의 이미지화에 의해 평가하였다(10x 렌즈, 좀비 그린/GFP (여기: 457/50, 방출: 520/28): 노출 시간 0.54 s, 100% 램프 전력, BF: 노출 시간 0.1s). 열 사멸된 관련 없는 하이브리도마 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포 생존율은 액적 내에서 최대 5.3시간, 장치 내에서 3.6시간 동안 100%(33 세포)를 유지하였다. 더욱이, 세포 생존력은 액적에서 최대 20.3시간, 장치 내에서 18.6시간 동안 >90%으로 유지되었다(28 세포, 분석 전체에 걸쳐 5개의 세포를 가진 1 액적이 유지되지 않았다). 따라서 분석 기간동안 및 그 이후에 우수한 생존력이 입증되었다. 이는 부분적으로 본 시스템에서 사용되며, 관찰된 지속적인 생존력에 기여하는 가스 재공급 메커니즘에 기인할 수 있다(도 10).
음성 대조군
하이브리도마를 함유하는 미세액적과 리포터(항원 접합 비드 및 2차 검출 항체)를 함유하는 미세액적을 상기 라이트캐스트 플랫폼 상에 로딩하고 쌍으로 병합하여 다음을 포함하는 미세액적을 생성하였다: 1 비드/2 세포, 1 비드/1 세포, 비드만, 및 세포만(도 11). 하이브리도마 세포 또는 리포터만을 함유하는 음성 대조군 미세액적으로부터는 형광이 검출되지 않았다. 세포는 또한 좀비 그린 염색으로 염색되었으며, - 실험 과정 동안 세포 사멸이 검출되지 않았다. 상기 분석은 최대 16시간 20분 동안 실행되었다. 하이브리도마 및 리포터를 포함하는 미세액적에서 형광 응집체가 t=3시간 20분에 나타나기 시작하였다.
대량 분석(bulk assay)
하이브리도마 세포를 미세액적으로 에멀젼화시키고 미세유체 플랫폼 상에 로딩하였다. 리포터(예를 들어, 항원 접합된 비드 및 AF488-접합된 2차 항체) 함유 하이브리도마 배지 또한 미세액적으로 에멀젼화 하여 장치 상에 로딩하였다. 하이브리도마 세포를 함유하는 미세액적을 제1 패널로 분류하고 리포터를 포함하는 미세액적을 제2 패널로 분류하였다. 상기 제1 및 제2 패널을 쌍으로 병합하여 하이브리도마 배지 내에 0.5 M/mL 비드, 0.5 M/mL 세포 및 200 nM AF488-접합된 2차 항체를 함유하는 미세액적을 생성하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 분비된 항-표적 항체에 대해 비드 형광을 이미지화 하였다(BB1, 10x 대물렌즈, 2 s exp.시간).
상온에서 4.5시간 동안 배양된 하이브리도마 배지에 2 M/mL 비드, 200 nm AF488-접합된 2차 항체 및 10-100 nM 유리 항-표적 항체(항-마우스 AF488)를 함유하는 추가 미세액적을 생성하였다. 항-표적 항체 농도에 대해 여과된 형광(a.u.)을 나타내는 곡선을 생성하기 위해 시험된 유리 항-표적 항체의 농도 범위에 걸쳐 비드 형광을 이미지화 하였다(BB1, 10x 대물렌즈, 2 s exp.시간)(도 12).
관련이 없는 하이브리도마 세포를 포함하는 미세액적은 일관되게 어두웠다. 대조적으로, 표적 하이브리도마 세포를 분비하는 것에 대해서는 유리 항-표적 항체에 대해 관찰된 최대 수준에 가까운 형광이 측정되었다(도 12). 상기 검출 시스템은 상기 비드의 증가된 AF488 형광 강도를 스캐닝하였다.
관련이 없는/표적 하이브리도마
Cell Tracker Deep Red 형광 염색을 에멀젼화 전에 관련이 없는 하이브리도마에 적용하고, 미세유체장치 상에서 이를 식별하는데 사용하였다. 이 경우에 관련없는 하이브리도마는 리포터 분자에 의해 검출되지 않아야 하는 단백질을 분비하는 하이브리도마 세포로 정의된다. 하이브리도마 세포를 함유하는 미세액적과 리포터를 함유하는 미세액적을 상기 미세유체 플랫폼 상에 로딩하고 쌍으로 병합하여 관련없는 또는 표적 하이브리도마 세포(들)/비드(들) 비율이 다양한 범위로 함유된 미세액적을 생성하였다. 리포터만을 포함하는 음성 대조군 미세액적 또한 준비하였다. Deep Red를 통해 관련 없는 것으로 식별된 세포와 함께 배양된 음성 대조군 및 비드는 실험 기간(16시간) 동안 빛이 환하게 되지 않는 것으로 확인되었다. 표적 하이브리도마(항-표적 항원 1차 항체를 생산하는 하이브리도마)와 함께 배양된 비드는 병합 후 2시간 20분에 명확한 AF488 신호를 보여주었다(도 13).
다중화된 스파이크 분석
분석 다중화된 스파이크 분석은 각각 관련이 없거나 또는 표적 하이브리도마 세포(들)을 함유하는 미세액적의 혼합 집단을 분리하기 위해 사용되었다. 상기 분석은 많은 수의 미세액적을 필요로 하며, 이들 모두는 10x 해상도 이상에서 이미지화 되었다. 두 개의 별도의 하이브리도마 세포(표적 및 관련없는)의 배양물을 성장시키고 이후 배지로 수확하였다. 표적 및 관련없는 하이브리도마 세포(들)을 이어서 미세액적으로 에멀젼화 시키고 미세유체 플랫폼 상에 로딩하였다. 각각 표적 또는 관련없는 하이브리도마 세포(들)을 포함하는 미세액적을 제1 패널에 분류하였다. 리포터(타겟 항원 접합체 비드와 [AF488-접합된 안티-마우스 2차 항체] 200 nM)를 함유하는 배지 또한 미세액적으로 에멀젼화 시키고 제2 패널로 분류하였다. 상기 제1 및 제2 패널을 쌍으로 병합하여 병합된 미세액적의 패널을 생성하였다. 각 하이브리도마 세포주에 대한 항-표적 항체 분비 곡선을 생성하기 위해 스파이크 실행에서 시간 경과에 따라 병합된 미세액적에 대해, 비드 상에서 여과된 형광(excs. 457/50nm)/a.u.)을 측정하였다(도 13). 관련이 없는 하이브리도마 세포주로부터의 AF488 신호는 음성 대조군과 구별할 수 없었다. 모든 표적 하이브리도마는 양성 신호를 나타내었다. 응집체는 대략 4시간 후 액적에서 형성되기 시작하여 9시간 후 분석을 손상시키기 시작하였다.
단일 세포 분비 데이터 또한 수집되었으며, 단일 세포로부터 시간 의존적인 항체 분비를 나타내는 단일-세포 분비 곡선이 생성되었다. 비드는 128 nM로 로딩되었으며, 비드 형광은 비드-항체 병합으로부터 7시간 동안 측정되었다. 결과는 다중 실행으로 반복되었다. 단일 세포 데이터를 수집하기 위해, 제1 및 제2 패널을 병합하기 전에 다중-점유 하이브리도마 세포 미세액적을 폐기하였다.
다중화 비드
이미징은 하이브리도마 배지에서 대량으로 미세유체 플랫폼 상에서 시험되었다. 각각 높은 농도의 비드(SoIL, R3 및 R5 비드)를 함유하는 미세액적을 디바이스 상에 로딩하였다. 비드가 강도 정량화를 위해 적절한 해상도로 분리될 수 있도록 하면서 다양한 배율(2x, 4x, 10x)에서 이미징을 테스트하여 모든 강도 밴드(R1, R3, R5)를 잘 분리하는 한편 이미징을 위한 최적의 파라미터를 결정하였다. 10x에서 모든 강도 밴드들이 서로 잘 분리되었고, 4x에서 양호하게 분리되었다 (도 14).
컬러 코딩된 비드 (SoIL, R3 및 R5)는 각각 다음의 항원과 접합되었다: 사이노 표적 항원, 오프-표적 항원 및 인간 표적 항원. 항원 접합된 비드 및 항-마우스 AF488 검출 항체를 포함하는 세포 배양 배지를 이어서 미세액적으로 에멀젼화 하고 라이트캐스트 플랫폼 상에 로딩하였다. 단일 표적 또는 관련 없는 하이브리도마 세포를 포함하는 미세액적이 추가로 제공되고, 분할되어 각각 분비된 생성물(예를 들어 1차 항체)을 함유하는 미세액적의 패널과 각각 하이브리도마 세포(들)을 포함하는 참조 패널을 생성하였으며, 각 분비된 항체의 용량이 어떤 하이브리도마 세포로부터 유래하였는 지 추적하였다. 리포터(비드 및 검출 항체)를 포함하는 미세액적을 그 후 분비된 항체를 포함하는 미세액적과 쌍을 지어 병합하였다. 상기 병합된 미세액적 및 대조군 미세액적의 특징을 비드 강도 밴드를 해독하고 (따라서 항원을 식별함) 일치하는 AF488 형광(항-표적 1차 항체의 정량을 가능하게 함)을 정량화할 수 있는 라이트캐스트 검출 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 세포를 함유하지 않는 음성 대조군 미세액적(리포터만 포함) 및 관련이 없는 하이브리도마 세포를 함유하는 병합된 미세액적은 어두운 상태를 유지하여 1차 항체의 부재를 확인하였다. 리포터 및 유리 표적 항체 [25 nM]를 함유하는 양성 대조군 미세액적은 두 표적 항원 (R1 및 R5) 모두에 대해 유리 표적 항체의 결합을 확인하였다. 분비된 항체를 함유하는 미세액적 역시 두 표적 항원 모두에 결합하였다(도 15).
항체 발굴 작업흐름
B 세포는 미세액적으로 에멀젼화 하여 미세유체 플랫폼 상에 로딩하였다. 비어있거나 다중 점유된 미세액적은 폐기하였다. 단일 B 세포를 함유하는 나머지 미세액적은 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위하여 부피를 추가시키기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍을 지어 병합하였다. 이후, 상기 병합된 미세액적을 온-칩 배양하여 단일 클론 항체의 생성을 촉진시킨 다음, 딸 액적으로 분할하여 각 세포에 의해 생성된 상기 항체의 다양한 용량을 얻었다. 그 다음 B 세포를 함유하는 미세액적은 참조 패널로 분류하는 한편 항체 용량을 함유하는 미세액적은 별도의 패널로 분류하여, 항원-접합된 비드 및 검출 항체를 포함하는 미세액적의 리포터 패널과 쌍을 지어 병합하였다. 병합된 리포터-mAb 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템을 사용하였다. 상기 양성 판정에 해당하는 B 세포를 함유하는 참조 패널의 미세액적을 웰 플레이트에 분배하고 증식시켰다(도 16).
실시예 5 - 박테리아 워크플로우
박테리아 세포는 미세액적으로 에멀젼화 하여 라이트캐스트 플랫폼 상에 로딩하였다. 비어있거나 다중 점유된 미세액적은 폐기하였다. 단일 박테리아 세포를 함유하는 나머지 미세액적은 후속의 분할 단계를 용이하게 하기 위하여 부피를 추가시키기 위해 세포 배양 배지를 함유하는 미세액적과 쌍을 지어 병합하였다. 병합된 미세액적은 증식된 후 클론 콜로니로 분할되었다. 클론 박테리아 세포를 함유하는 한 세트의 미세액적은 참조 패널로 분류되는 한편, 클론 박테리아 세포를 함유하는 미세액적의 추가 세트 또는 상기 박테리아 세포의 배설물을 함유하는 미세액적의 세트는 미세액적의 분석 패널로 분류하였다. 미세액적의 분석 패널은 미세액적의 리포터 패널과 쌍을 지어 병합하였다. 분석 성분이 박테리아 막 내부에 있다면, 어느 단계에서라도 박테리아 세포는 내용물을 방출하기 위해 용해될 수 있다. 병합된 리포터-박테리아 세포 패널에서 양성 판정을 결정하기 위해 광학 검출 시스템을 사용하였다. 상기 양성 판정에 해당하는 박테리아 세포를 함유하는 참조 패널의 미세액적을 웰 플레이트에 분배하고 증식시켰다(도 17).
실시예 6 - 미세액적 병합 및/또는 분할의 명시야 이미징
도 19의 A 내지 도 19의 C는 예시적인 병합 작업의 명시야 이미지를 나타낸다. 한 쌍의 액적이 장치 전체에서 병렬로 병합된다. 도 19의 A는 병합 작업을 위해 선택된 미세액적의 쌍을 나타낸다. 도 19의 B는 병합을 위해 가깝게 근접하여 이동하는 쌍을 지은 미세액적들을 나타낸다. 도 19의 C는 병합된 미세액적을 나타낸다.
도 20의 A 내지 도 20의 C는 예시적인 분할 동작의 명시야 이미지를 나타낸다. 미세액적은 두 개의 딸 미세액적 쌍으로 병렬로 분할된다. 도 20의 A는 분할 작업을 기다리는 어레이의 액적을 보여준다. 도 20의 B는 분할 작업 도중에 늘어난 미세액적을 보여준다. 도 20의 C는 딸 액적의 쌍으로 분할된 미세액적을 보여준다. 전구 액적에 대한 전체 정보를 제공하는 작업을 통해 과거의 정보를 유지할 수 있다.
도 21을 참조하면, 단일 세포 점유 상태에서 액적에 캡슐화된 S. cerevisiae 바이오입자(열 불활성화 효모)의 명시야 이미지를 볼 수 있다.
실시예 7 - 오일 중 세포 배지의 에멀젼에서 액적 내에 리포터 비드로 캡슐화된 세포
도 22를 참조하면, 오일 중 세포 배지의 에멀젼에서 액적 내에 사이토카인 리포터 비드와 함께 공동-캡슐화된 사이토카인 분비 세포의 이미지를 나타내었다. 분비된 사이토카인의 존재 하에서, 리포터 비드는 형광 태그된 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 메커니즘을 통해 형광을 발한다. 도 22의 A에서 볼 수 있듯이, 명시야 이미지는 미세액적 내 세포와 비드의 분포를 보여준다. 도 22의 B에 도시된 형광 이미지는 분비된 사이토카인의 존재 하에서 어느 리포터 비드가 양성 반응을 보이는 지를 나타낸다. 도 22의 C는 막이 손상되지 않고 온전한 모든 세포의 위치를 나타낸다. 도 22의 D에 보여주는 형광 이미지는 모든 비드의 위치를 나타내며, 도 22의 E는 요오드화 프로피듐(propidium iodide) 염색에 의해 확인되는 사멸 세포를 나타낸다.
도 24를 참조하면, 오일 중 세포 배지의 에멀젼에서 미세액적 내의 리포터 비드와 함께 공동-캡슐화된 항체 분비 세포의 이미지를 나타내었다. 분비된 항체의 존재 하에서, 리포터 비드는 형광 태그된 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA 메카니즘을 통해 형광을 발한다. 도 24의 A에 도시된 명시야 이미지는 미세액적 내의 세포와 비드의 분포를 보여준다. 도 24의 B에 도시된 형광 이미지는 분비된 항체의 존재 하에서 어떤 리포터 비드(들)이 양성 반응을 보이는 지를 나타낸다. 도 24의 C는 막이 손상되지 않고 온전한 모든 세포의 위치를 나타내며, 도 24의 D는 사멸 세포를 나타낸다.
실시예 8 - 미세액적 모듈식 작업 설계
도 23은 고유한 작업흐름을 구축하기 위하여 전체 또는 일부를 어떤 순서로든 유연하게 결합할 수 있는 모듈식 작업 설계의 개요이다. 작업흐름의 어느 지점에서나 프로그램 가능한 결정이 구현될 수 있으며, 이는 원래의 순서에서 벗어나고/거나 의사결정 트리 로직의 탐색을 기반으로 미세액적의 선택에만 작업을 적용할 수 있다. 따라서 상기 분석은 동적으로 재구성될 수 있다. 미세액적의 로딩 및/또는 분류, 미세액적의 병합, 배양, 분석, 분할 및 배출을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 예시적인 모듈들이 제시된다. 미세액적 분류의 예에는 크기, 내용물 및/또는 점유에 기반한 분류가 포함될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 액적을 병합하는 것은 시약 및/또는 리포터의 전달을 가능하게 할 수 있으며, 세포-세포 상호작용을 촉진하기 위한 세포의 제어된 도입을 가능하게 한다. 액적을 분할하는 것은 후속의 분석을 위해 물질을 회수할 수 있도록 하며, 세포 회수의 경우에는 추가적인 증식을 가능하게 한다.
도 25에 설명된 작업흐름은 세포 분비 또는 세포-세포 상호작용을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 다양한 검출 모드를 예시한다. 검출은 형광 검출, 발광, FRET 또는 명시야 검출일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세포 내 이미징은 세포의 일부 또는 세포 내용물, 예를 들어 핵, 골지체 및/또는 미토콘드리아, 내에서의 신호를 나타낼 수 있다.
실시예 9 - 합성 생물학 작업흐름, 포유류 세포주 개발 및/또는 CRISPR 스크리닝
도 26은 합성 생물학, 포유류 세포주 개발 및/또는 CRISPR 스크리닝에 적합한 예시적인 작업흐름의 개요이지만, 이러한 스크리닝에만 한정되는 것은 아니다. 관심 생성물을 생산하도록 조작된 세포는 플랫폼 상에 로딩되어, 액적 내에 함유되며, 점유에 대해 단일 세포를 선택하도록 분류될 수 있다. 세포는 플랫폼 상에서 배양되어 일정 기간 증식될 수 있다. 증식을 모니터링 하는 것은 강력한 클론을 선택하는 데 사용할 수 있다. 미세액적은 액적 크기를 제어하기 위하여 선택적으로 분할되거나, 다른 작업을 위해 모집단을 유지하면서 후속의 분석을 위한 생성물 또는 세포를 수집할 수 있다. 모집단의 유지는 두 번째 딸 미세액적에서 추가 테스트를 위해 살아있는 세포를 유지하면서, 딸 미세액적에서 세포의 분해를 초래할 수 있는 분석 단계를 수행하는 데 특히 유용하다. 병합은 액적 크기를 제어하고 세포-액적에 구성요소, 예를 들면 세포 수명 연장을 위한 배지 및/또는 리포터를 전달할 수 있다. 리포터는 세포 생산성을 평가하기 위한 다양한 검출 모드를 통해 역가(titre) 판독을 용이하게 할 수 있다. 미세액적은 플랫폼에서 분배하여 회수할 수 있다. 세포의 회수는 추가 증식 또는 후속의 분석을 가능하게 할 수 있다. 하나의 예로서, 생성물 회수를 통해 생성물의 품질을 평가할 수 있다. 작업 순서는 자유롭게 변경할 수 있다. 미세액적은 스크리닝 과정 동안 수행된 평가(예를 들어, 높은 생산성과 우수한 증식을 갖는 상위 클론)를 기반으로 분배할 수 있다.
실시예 10 - 미세 방울 정렬 작업흐름
도 27을 참조하면, 모듈식 작업들의 일 예의 순서에 따른 예시적인 작업흐름이 제공되며, 작업흐름 전반에 걸쳐 미세액적이 선택적으로 분류될 수 있는 잠재적 지점들을 나타낸다. 분류는 액적 크기, 내용물, 점유, 분석 결과 또는 이들의 조합과 같은 다양한 요인을 기반으로 할 수 있다. 명시야, 형광, 발광, FRET은 분류를 위한 검출 양태의 몇 가지 예시이며, 여기서 신호는 미세액적 내에 있을 수 있으며, 리포터 또는 세포 내에 국한될 수 있다.
실시예 11 - 미세액적 내에 캡슐화된 세포의 명시야 이미징
도 28의 A 내지 도 28의 D를 참조하면, 세포 내 칼슘에 대한 염료의 존재 하에 배양된, 미세방울 내에 캡슐화된 세포의 복수의 이미지가 도시되어 있다. 도 28의 A는 액적의 명시야 이미지를 보여주며, 각 액적 내의 세포의 위치 및 개수를 나타낸다. 도 28의 B는 활성 칼슘 대사산물을 나타내는 형광 이미지를 보여준다. 도 28의 C는 세포의 핵 염색의 형광 이미지를 보여주며, 도 28의 D는 요오드화 프로피듐 염색에 의해 식별된 사멸 세포를 나타낸다.
본 발명의 다양한 추가 양태 및 실시예들은 본 개시내용을 감안하여 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "및/또는"은 두 특정 특징 또는 성분의 각각이 다른 하나와 함께 있거나 없는 특정 개시로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B, 각각이 마치 독립적으로 본 명세서에 제시된 것과 같은 특정 개시로서 간주된다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 제시된 특징들의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시예에 제한되지 않으며, 설명되는 모든 양태 및 실시예에 동일하게 적용된다.
본 발명이 몇몇 실시예를 참조하여 예시적으로 기술되었지만, 개시된 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 대안적인 실시예가 구성될 수 있다는 것은 당업자에게는 추가로 이해될 것이다.
Claims (37)
- EWOD 또는 oEWOD 장치에서의 적어도 하나의 특성에 기반한 세포 및/또는 세포 일부 선택 방법으로, 다음을 포함하는 방법:
i. 적어도 하나의 배지 또는 배지 및 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널을 제공하는 단계;
ii. 하나 이상의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 리포터 패널을 제공하는 단계;
iii. 상기 테스트 패널의 미세액적과 상기 적어도 하나의 리포터 패널의 미세액적을 병합하여 병합된 분석 미세액적의 패널을 형성하는 단계;와
iv. 적어도 하나의 특성의 존재에 기반하여 상기 리포터 개체에서의 변화를 검출할 수 있는 검출 시스템을 사용하여 상기 분석 미세액적의 패널을 모니터링 하는 단계, 및
v. 상기 리포터 개체에서의 변화에 기반하여 패널로부터 미세액적의 서브 세트를 선택하며, 상기 서브 세트는 상기 선택된 세포를 함유하는 단계;
여기에서 적어도 배지를 함유하는 미세액적의 테스트 패널은 적어도 하나의 세포와 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 분할함으로써 생성되며, 추가적으로 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이 생성되고;
및/또는 추가로 여기에서, 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널은 단계 (i)내지 단계 (v) 중 어느 하나의 단계 전 또는 후에 적어도 두 개의 미세액적 패널로 분할되고, 상기 패널은: 리포터 개체 패널의 미세액적과 병합하기에 적합한 적어도 배지 또는 배지와 적어도 하나의 세포를 포함하는 미세액적의 테스트 패널;과 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 참조 패널이다.
- 청구항 1에 있어서,
상기 세포의 특성은 하나 이상의 세포 표면 분자의 존재; 하나 이상의 세포 활성의 존재; 세포의 형태; 하나 이상의 세포 분비물의 존재; 및/또는 하나 이상의 세포 내 생성물의 존재; 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2 있어서,
상기 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널의 분할 전에, 상기 세포가 세포 분열이 허용되는 조건에서 배양되는, 방법.
- 청구항 3에 있어서,
상기 조건은 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 배지를 함유하는 미세액적의 패널을 병합하는 것을 포함하는, 방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
상기 참조 패널 또는 미세액적이 미세액적의 테스트 패널에 함유된 세포에 상응하는 세포의 적어도 하나의 클론 사본을 함유하도록, 미세 액적의 상기 참조 패널과 상기 테스트 패널이 분할되는, 방법.
- 청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 세포를 함유하는 상기 미세액적의 테스트 패널은 상기 세포의 용해를 위한 시약을 함유하는 미세액적의 패널과 병합되는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 임의의 패널 내의 세포가 그 형태학적 특성에 대해 관찰되며, 상기 형태학적 특성은 세포의 서브 세트의 선택에 사용될 수 있는, 방법.
- 청구항 7에 있어서,
상기 형태학적 특성은 크기, 형상, 접착 상태, 세포막 상태 및/또는 세포 내 특징이 존재인, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (ii) 전에, 상기 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널은 상기 세포의 특성을 결정하기 위한 적어도 하나의 분석을 실시할 수 있고, 상기 분석은 적어도 하나의 세포를 함유하는 미세액적의 패널과 적어도 하나의 리포터 개체를 함유하는 미세액적의 적어도 하나의 패널과 병합하고, 상기 특성의 존재에 기반하여 적어도 하나의 리포터 개체에서의 변화를 결정하는 것에 의해 수행되는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (iv) 이후에, 수성 미세액적의 적어도 하나의 패널은 미세액적의 병합된 분석 패널을 병합할 수 있으며, 이어서 미세액적의 병합된 패널은 분할되는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법의 임의의 단계에서, 원하지 않거나 비어있는 미세액적이 폐기되는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
미세액적의 선택된 패널의 세포가 장치로부터 분배되는, 방법.
- 청구항 12에 있어서,
미세액적의 선택된 패널이 분배된 후에, 그 안에 함유된 세포는 집단을 증식하고/거나 클론 배양되도록 처리되는, 방법.
- 청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
장치로부터 미세액적의 선택된 패널이 분배된 후, 그 안에 함유된 세포 및/또는 분비물, 대사물과 같은 비-세포 개체가 다음 중 어느 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는 추가 분석되는, 방법:
I. 질량 분석;
II. 표면 플라즈몬 공명;
III. 고성능 액체 크로마토그래피; 및/또는
IV. 핵산 시퀀싱 및 PCR 증폭을 포함하는, 유전적 분석.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
참조 패널에 유지된 세포가 미세액적의 테스트 패널 내의 상기 리포터 개체의 변화에 기반하여 선택되도록, 상기 테스트 패널의 미세액적이 상기 참조 패널의 미세액적에 대응되는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 유전자 조작된 것인, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 단계 (i) 이전에, 다음 단계를 포함하여 유전자 조작될 수 있는, 방법:
a. 미세액적의 패널을 제공하는 단계로, 각각은 적어도 하나의 세포를 포함함;
b. 변형 미세액적의 패널을 제공하는 단계로, 각각은 세포를 변형시킬 수 있는 적어도 하나의 유전 요소를 포함함;
c. 세포를 포함하는 미세액적과 하나 이상의 유전 요소를 포함하는 미세액적을 병합하여 미세액적의 패널을 형성하는 단계로, 각각은 유전자 조작된 세포를 포함함.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포의 특성은 생존력, 세포 활성 및/또는 세포 사멸 능력인, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포의 특성은 세포 내, 세포 표면 분자 및 또는 분비물로서 리포터 개체를 사용하여 검출할 수 있는 다음 생성물 중 어느 하나 이상을 만들 수 있는 것인, 방법:
i. 당단백질 또는 지단백질을 포함하는 단백질;
ii. 화학 물질;
iii. 중합체;
iv. 핵산;
v. 화합물.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 리포터 개체는 다음 개체 중 어느 하나 이상인, 방법.
i. 항체;
ii. 항원;
iii. 수용체;
iv. 기질;
v. 효소;
vi. 리간드;
vii. 핵산;
viii. 세포;
ix. 세포의 일부분;
x. 세포외 소포체;
xi. 리포솜;
xii. 중합체;
XIII. 화학 물질;
xiv. 약물;
xv. FRET 리포터;
xvi. 화학발광 물질;
xvii. 조직 시료;
xviii. 바이러스 또는 박테리오파지;
xix. 사이토카인; 및/또는
xx. 단백질.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 리포터 개체는 변화의 직접적인 검출을 위해 표지되고/거나, 리포터 개체에서의 변화를 검출하고 리포트할 수 있는 제2 표지된 개체를 함께 포함하는, 방법.
- 청구항 21에 있어서,
상기 표지는 가시적, 발광성, 형광성, 인광성, 분할 형광, 분할 발광 또는 형광원성 리간드와 같은 단백질 보완물인, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검출 단계는 광학 검출 단계인, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 다음 유형으로부터 선택되는 어느 하나인, 방법:
i. 면역 세포;
ii. 박테리아;
iii. 곰팡이 세포;
iv. 곤충 세포;
v. 다능성 세포;
vi. 암세포;
vii. 하이브리도마 세포-융합체;
viii. 세포주;
ix. 식물 세포
x. 인공 세포;
xi. 미세세포;
xii. 셀(들)의 일부(들);
xiii. 세포외 소포체; 또는
xiv. 리포솜.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 림프구인, 방법.
- 청구항 25에 있어서,
상기 세포는 B 림프구이며, 면역글로불린을 분비할 수 있는 것인, 방법.
- 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,
상기 리포터 개체는 리포터 세포이며, 선택적으로 원하는 면역글로불린이 리포터 세포에 결합하고 변화를 초래할 수 있는, 방법.
- 청구항 25에 있어서,
하나 이상의 리포터 개체가 다음으로부터 선택되고:
i. 항원-접합된 비드 및 형광-염료 접합된 2차 항체;
ii. 2차 항체-접합된 비드 및 형광-염료 접합된 항원; 또는
iii. 담체 표면에 접합된 항원 및 형광-염료 접합된 2차 항체 비드,
그리고, 면역글로불린의 특성을 모니터링 하는 것은 항원결합 활성에 대한 분석을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 세포 표면 수용체 또는 T 세포 결합(engaging) 분자를 발현하도록 유전자 조작된, 방법.
- 청구항 29에 있어서,
상기 세포는 면역세포이며, 상기 세포 표면 수용체는 키메라 항원 수용체인, 방법.
- 청구항 30에 있어서,
상기 방법은 CRT-T 세포를 선택하기 위한, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 환자로부터 선택된, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 약물을 생산하기 위하여 유전자 조작된 박테리아 세포인, 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 면역치료제를 생산할 수 있는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세액적은 비혼화성 액체로 둘러싸여 있는, 방법.
- 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 리포터 개체가 리포터 패널의 각 미세액적에 존재하며, 선택적으로 단계 (v)는 다중 분석 검출인, 방법.
- 청구항 24에 있어서,
상기 세포는 세포 융합 공정에 의해 형성된 하이브리도마 세포이며, 면역글로불린을 분비할 수 있는, 방법.
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