JP2024517624A - ナノスケール反応チャンバー、およびその使用方法 - Google Patents

ナノスケール反応チャンバー、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

ナノスケール反応チャンバー、およびナノスケール反応チャンバーを生物学的アッセイに使用する方法が提供される。【選択図】図６Ｂ

Description

相互参照
本出願は、２０２１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／１７４，８４７号の利益を主張するものであり、これは全体として参照により本明細書に援用される。
現在の標準的なアッセイ形式は、細胞集団を調査し、データを収集する。調査およびデータを収集するプロセス中に、例えば、アッセイおよび／または機器の間で、工程間での細胞のプールに起因して細胞特異的情報が失われることがある。したがって、細胞集団のデータを調査かつ収集すること、さらに収集されたデータに関連付けられ得る細胞特異的な情報を保持することが可能なアッセイプラットフォームの必要性が存在している。
機能的単一細胞ベースのアッセイ情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞ベースのアッセイ情報と結び付けることができるアッセイの満たされていない必要性が存在している。本開示は、アッセイの過程の全体にわたって、細胞特異的情報を維持しながら細胞特異的アッセイを実施する、ナノスケール反応チャンバー（例えば、ナノバイアル）を提供することにより、この満たされていない必要性を満たす。本開示のナノバイアル反応チャンバーは、ナノバイアル中で実施されたアッセイ（例えば、機能的アッセイ）から得た結果が、データ分析の完了後に、アッセイの単一細胞の成分のゲノム分析、トランスクリプトーム分析、および／またはプロテオーム分析と相関し得、これにより、非常に標的化された多次元分析を提供するという点で特徴的である。
一態様では、関心対象の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントを特定する方法が提供され、方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部に、抗体産生細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが、抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するようにナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程と、（ｅ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、（ｇ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程とを含む（例えば、これらのうち１つ以上を実施する）。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、抗体への検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。場合によっては、標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である。場合によっては、親和剤は抗体捕捉部分である。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群から選択される。場合によっては、親和剤は関心対象の抗原である。場合によっては、親和剤は、その表面で関心対象の抗原を発現する抗原提示細胞である。場合によっては、検出剤は関心対象の抗原である。場合によっては、検出剤は、抗体またはそのフラグメントである。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識される。場合によっては、検出可能な標識は、蛍光標識、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される。場合によっては、検出可能な標識は蛍光標識である。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む。場合によっては、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む。場合によっては、フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出可能な標識はオリゴヌクレオチドタグである。場合によっては、方法は、オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、抗体産生細胞を溶解する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、溶解後に、抗体産生細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、関心対象の抗原に対して所望の解離定数（ＫＤ）を有する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定するように構成される。場合によっては、１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、関心対象の抗原に対して約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ、または約１ｎＭ未満の所望のＫＤを有する。場合によっては、方法は、１つ以上の異なる濃度で、検出剤を複数のナノバイアルに添加する工程をさらに含む。場合によっては、１つ以上の異なる濃度は、所望のＫＤの１桁以内である。場合によっては、方法は、関心対象の抗原に対して所望の特異性を有する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定するように構成される。場合によっては、方法は、複数の異なる検出剤を複数のナノバイアルに添加する工程をさらに含み、異なる検出剤の少なくとも１つは、検出可能な標識を有している。場合によっては、方法は、検出可能な標識の測定に基づいて、異なる検出剤のうちの１つに特異的に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含む。場合によっては、検出剤は関心対象の抗原である。
別の態様では、関心対象のシグナル伝達経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する方法が提供され、上記方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞および抗原産生細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが、抗体産生細胞から分泌され、かつ抗原産生細胞内の関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｅ）抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、（ｆ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｇ）（ｆ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル伝達経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程とを含む（例えば、これらのうちの１つ以上を実施する）。場合によっては、方法は、（ｅ）の前に、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む。場合によっては、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む。場合によっては、１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面で抗原に結合することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する。場合によっては、１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面でリガンドの抗原への結合に干渉することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、もしくはその両方の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、またはその両方の表面に存在する標識に結合する。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、またはその両方が結合することのできる抗原である。場合によっては、抗原産生細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される。場合によっては、１つ以上の検出可能な標識は、蛍光レポータータンパク質を含む。場合によっては、（ｄ）の検出する工程は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出することを含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する。場合によっては、方法は、（ｅ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む。場合によっては、フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。場合によっては、（ｄ）の検出する工程は、抗原産生細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出することを含む。場合によっては、検出することは、抗原産生細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む。場合によっては、（ｆ）の関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、抗原産生細胞のｍＲＮＡレベルを、抗体産生細胞からの核酸配列情報と結び付けることを含む。場合によっては、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、ナノバイアルに関連付けられた１つ以上の固有のオリゴヌクレオチドタグを含む。場合によっては、方法は、（ｅ）の前に、抗体産生細胞および抗原産生細胞を溶解する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、溶解後に、抗体産生細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、および操作されたプロデューサー細胞からなる群から選択される。場合によっては、ナノバイアルは単一の抗体産生細胞を含む。場合によっては、方法は、複数のナノバイアルに方法を実施する工程をさらに含み、ナノバイアルのそれぞれは、ナノバイアルの空洞部内に個々の抗体産生細胞を含む。場合によっては、複数のナノバイアルは、少なくとも２０，０００のナノバイアル、少なくとも１００，０００のナノバイアル、または少なくとも５００，０００のナノバイアルを含む。場合によっては、個々の抗体産生細胞は、それぞれ異なる抗体を産生する。場合によっては、ナノバイアルは、架橋ヒドロゲルを含む。場合によっては、架橋ヒドロゲルはＰＥＧベースの架橋ヒドロゲルである。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、その中に配置された液体を含む。場合によっては、ナノバイアルは、油相中で懸濁している。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、約１００ｆＬ～約１０ｎＬの容量を有している。いくつかの実施形態では、ナノバイアルの空洞部は、約５μｍ～約２５０μｍの長さ寸法を有している。
さらに別の態様では、機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける方法が提供され、方法は、（ａ）ナノバイアルの空洞部に位置する単一細胞に対して機能的アッセイを実施する工程であって、機能的アッセイは、第１のバーコードまたは第１の標識に関連付けられる、工程と、（ｂ）ナノバイアル中の単一細胞に対してゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイを実施する工程であって、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイは、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けられる、工程と、（ｃ）第１のバーコードまたは第１の標識を、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けることによって、機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける工程とを含む。場合によっては、方法は、（ｂ）の前に、機能的アッセイによって生成されたシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、機能的アッセイは、抗体分泌スクリーニングアッセイである。場合によっては、機能的アッセイは、抗体親和性アッセイである。場合によっては、機能的アッセイは、抗体特異性アッセイである。場合によっては、ゲノムアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングアッセイである。場合によっては、ナノバイアルは、固有のオリゴヌクレオチドタグに関連付けられる。場合によっては、固有のオリゴヌクレオチドタグは、ポリ－ｄＴ捕捉領域を含む。場合によっては、第１のバーコードまたは第１の標識は、ポリＡ領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
さらに別の態様では、生物学的薬剤がナノバイアルの空洞部から拡散するのを防止する方法が提供され、上記方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルは、ナノバイアルの中に形成されるとともにナノバイアルの表面への開口部を含む空洞部、および空洞部内に配置された１つ以上の生物学的薬剤を含む、工程と、（ｂ）遮断粒子が空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小するように遮断粒子を添加する工程であって、それによって、ナノバイアルが流体中に配置されたときに、生物学的薬剤が空洞部から拡散するのを阻害する、工程とを含む。場合によっては、遮断粒子の最大直径は、空洞部の開口部の直径より大きい。場合によっては、遮断粒子は、空洞部の開口部に接している。場合によっては、遮断粒子は、空洞部の開口部を囲んでいる。場合によっては、遮断粒子は、（ｂ）の後、空洞部の容量の５０％超を維持するようにサイズ設定される。場合によっては、遮断粒子は、約２０マイクロメートル～約５０マイクロメートルの平均直径を有している。場合によっては、遮断粒子の形状は、球状または実質的に球状である。場合によっては、遮断粒子はポリマーヒドロゲルを含む。場合によっては、ポリマーヒドロゲルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。場合によっては、遮断粒子は、１つ以上の親和剤で被覆される。場合によっては、１つ以上の親和剤は抗体捕捉部分を含む。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群から選択される。場合によっては、１つ以上の親和剤は抗原を含む。場合によっては、１つ以上の親和剤は核酸を含む。場合によっては、核酸は、オリゴヌクレオチドタグまたはオリゴヌクレオチドバーコードである。場合によっては、ナノバイアルおよび／または遮断粒子は、メッシュ様構造を含む。場合によっては、メッシュ様構造は平均孔径を含む。場合によっては、平均孔径は所望のサイズを有する生物学的薬剤が空洞部内で保持され、かつ所望のサイズより小さなサイズを有する生物学的薬剤がメッシュ様構造を通って拡散できるようにサイズ設定される。場合によっては、平均孔径は、ナノバイアルの空洞部内への流体および試薬の輸送が可能となるようにサイズ設定される。場合によっては、流体および試薬は、染色剤、界面活性剤、洗浄剤、溶解緩衝液、薬物、サイトカイン、ケモカイン、培地、馴化培地、および緩衝液からなる群から選択される。場合によっては、（ｂ）は、複数の遮断粒子が空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、複数の遮断粒子を添加する工程を含む。場合によっては、複数の遮断粒子のそれぞれは、約２マイクロメートル～約２０マイクロメートルの平均直径を有している。場合によっては、複数の遮断粒子のそれぞれは、室温の生理食塩水よりも大きい密度を有している。場合によっては、遮断粒子対ナノバイアルの数は、１００：１より大きい。場合によっては、複数の遮断粒子は、ＰＥＧ、ポリスチレン、ポリ－メタクリル酸メチル、ガラス、および金属からなる群から選択されるポリマーで構成される。
別の態様では、１つ以上の細胞、１つ以上のビーズ、またはその両方を含むナノバイアルを濃縮する方法が提供され、上記方法は、（ａ）それぞれがナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む、複数のナノバイアル、および（ｉ）複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む混合物を提供するか、または得る工程と、（ｂ）混合物を溶液中で懸濁する工程と、（ｃ）少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）の複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両方とは別のナノバイアルの空洞部内に配置されるように、溶液の密度を調整する工程と、（ｄ）ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルを収集する工程とを含む。場合によっては、（ｃ）は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より大きな密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む。場合によっては、（ｃ）は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より低い密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む。場合によっては、方法は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルをさらに濃縮するために、（ａ）～（ｄ）を１回以上実施する工程をさらに含む。場合によっては、溶液の密度は、（ａ）～（ｄ）の各ラウンドで異なる。場合によっては、方法は、（ａ）の前に、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、あるいは（ｉｉ）の複数の空のナノバイアルを除去する工程をさらに含む。
さらに別の態様では、関心対象の細胞内のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する方法が提供され、上記方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルは、ナノバイアルの中に形成される空洞部を含み、空洞部が、（ｉ）薬物または化合物、および（ｉｉ）薬物または化合物に関連付けられるバーコードもしくは標識を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に関心対象の細胞を担持させる工程と、（ｃ）薬物または化合物が関心対象の細胞と相互作用するように、ナノバイアルの空洞部内の液体容量へ薬物または化合物を放出するためにナノバイアルを刺激にさらす工程と、（ｄ）薬物または化合物が関心対象の細胞内の関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｅ）関心対象の細胞内のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）バーコードまたは標識を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｇ）（ｆ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する工程とを含む（例えば、これらのうちの１つ以上を実施する）。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む。場合によっては、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、関心対象の細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、関心対象の細胞の表面に存在する標識に結合する。場合によっては、関心対象の細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される。場合によっては、１つ以上の検出可能な標識は、蛍光レポータータンパク質を含む。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出することを含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む。場合によっては、フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、関心対象の細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出することを含む。場合によっては、検出することは、関心対象の細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む。場合によっては、（ｆ）の関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、関心対象の細胞のｍＲＮＡレベルを、薬物または化合物と結び付けることを含む。場合によっては、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、薬物または化合物に関連付けられたバーコードに関連付けられた１つ以上の固有のオリゴヌクレオチド配列を含む。場合によっては、方法は、（ｅ）の前に、関心対象の細胞を溶解する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、溶解後に、関心対象の細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む。
さらに別の態様では、関心対象の抗原に対する機能的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定する方法が提供され、上記方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上のサイトカインが、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）検出剤が１つ以上のサイトカインに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程と、（ｅ）１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、（ｇ）ＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原と機能的に相互作用するＣＡＲまたはＴＣＲを特定する工程とを含む（例えば、これらのうちの１つ以上を実施する）。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面に存在する標識に結合する。場合によっては、標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、その表面で関心対象の抗原を発現するか、またはＭＨＣ複合体において抗原を提示する抗原提示細胞である。場合によっては、親和剤は抗体捕捉部分である。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗ＩＬ２、抗ＴＮＦ－α、および抗ＩＦＮ－γからなる群から１つ以上選択される。場合によっては、検出剤は、１つ以上のサイトカインに特異的な二次抗体または抗体フラグメントである。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識される。場合によっては、検出可能な標識は、蛍光標識、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される。場合によっては、検出可能な標識は蛍光標識である。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合された検出剤の量を判定することを含む。場合によっては、１つ以上の抗体に結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む。場合によっては、フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出可能な標識はオリゴヌクレオチドタグである。場合によっては、方法は、オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。場合によっては、方法は、（ｆ）の前に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を溶解する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、溶解後に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む。場合によっては、方法は、（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む。
別の態様では、粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器に適合するとともに機器に使用されるように構成された、サイズ、形状、界面化学、密度、またはそれらのあらゆる組合せを有する、ナノバイアルが提供される。場合によっては、粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器は、フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、イメージングフローサイトメーター、画像活性化セルソーター、コールターカウンター、パーティクルカウンター、マイクロ流体液滴生成器、マイクロウェルアレイ、マイクロバルブを備えるマイクロ流体チップ、マイクロ流体ＳｌｉｐＣｈｉｐ、光流体マイクロデバイス、マイクロ流体液滴生成器、およびマイクロ流体チャネルからなる群から選択される。場合によっては、ナノバイアルのサイズは直径約１００μｍ未満であり、キャッピングされた反応性官能基を含む。場合によっては、ナノバイアルのサイズは直径約６０μｍ未満である。場合によっては、ナノバイアルは、ガラス毛細管、キュベット、および／またはマイクロ流体チャネルを通って流されるように構成される。場合によっては、ナノバイアルは、光励起、電気励起、および／または磁気励起によって分析されるように構成される。場合によっては、ナノバイアルのサイズ、界面化学、および／または浮力は、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずにナノバイアルが機器を通って迅速に流れることができるようなものである。場合によっては、ナノバイアルは、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずに、１０ｃｍ／秒超、または１ｍ／秒超で機器を通って流れることができる。場合によっては、ナノバイアルは、９０μｍより大きい直径を有するチャネルを通って流されるように構成される。場合によっては、ナノバイアルは、粒子および／または細胞を分析するように設計された第１の機器、ならびにその後粒子および／または細胞を分析するように設計された第２の機器と共に使用されるように構成される。場合によっては、ナノバイアルは、蛍光活性化セルソーター、画像活性化セルソーター、または光流体マイクロデバイスによって分類され、その後マイクロ流体液滴生成器に導入されるように構成される。
さらに別の態様では、関心対象の抗原の結合に応答するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現Ｔ細胞の細胞殺傷機能を検出する方法が提供され、上記方法は、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルは、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞を担持させる工程と、（ｃ）ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞を、関心対象の抗原を産生する標的細胞と接触させる工程と、（ｄ）ナノバイアル上で、標的細胞の溶解または透過処理時に標的細胞から放出された１つ以上の細胞殺傷マーカーを捕捉する工程と、（ｅ）細胞殺傷シグナルを得るために、１つ以上の細胞殺傷マーカーを直接または検出剤を用いて検出する工程とを含む。場合によっては、方法は、（ｆ）ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、（ｇ）ＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、１つ以上の細胞殺傷シグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原と機能的に相互作用するＣＡＲまたはＴＣＲを特定する工程とをさらに含む。場合によっては、方法は、（ｅ）の後に、１つ以上の細胞殺傷シグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面に存在する標識に結合する。場合によっては、標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である。場合によっては、１つ以上の細胞捕捉剤は、その表面で関心対象の抗原を発現するか、またはＭＨＣ複合体において抗原を提示する抗原提示細胞である。場合によっては、親和剤は抗体捕捉部分である。場合によっては、抗体捕捉部分は、蛍光タンパク質に対する親和性を有する。場合によっては、検出剤は、標的細胞からの細胞内生体分子に対する親和性を有する抗体またはオリゴヌクレオチドである。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識される。場合によっては、検出可能な標識は、蛍光標識、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される。場合によっては、検出可能な標識は蛍光標識である。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合された検出剤の量を判定することを含む。場合によっては、１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する。場合によっては、方法は、（ｅ）に続いて、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む。場合によっては、フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出可能な標識はオリゴヌクレオチドタグである。場合によっては、方法は、オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。場合によっては、方法は、（ｅ）に続いて、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を溶解する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、溶解後に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む。場合によっては、方法は、（ｄ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む。場合によっては、方法は、（ｄ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、（ｅ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む。
本開示の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲とともに説明される。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載とを参照することによって得られる。
本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた４０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた４０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた４０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた６０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた６０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々なＵＶパワー／強度設定を用いた６０ミクロンのナノバイアルの製作および特徴付けを実証する実験データを描く。 本開示の様々な態様に係る、蛍光ストレプトアビジンで標識されたビオチン化ナノバイアルを描く。 本開示の様々な態様に係る、蛍光ストレプトアビジンで標識されたビオチン化ナノバイアルを描く。 本開示の様々な実施形態に係る、ポリスチレンビーズのナノバイアルの散乱に基づく除去を描く。 本開示の様々な実施形態に係る、ポリスチレンビーズのナノバイアルの散乱に基づく除去を描く。 本開示の様々な実施形態に係る、ポリスチレンビーズのナノバイアルの散乱に基づく除去を描く。 本開示の様々な態様に係る、遊離細胞の細胞を有するナノバイアルまたは空のナノバイアルの浮力濃縮（ｂｕｏｙａｎｃｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の概略図を描く。 プールしたアッセイと比較して、ナノバイアルのプラットフォームを使用した結合アッセイの概略図を描く。 プールしたアッセイと比較して、ナノバイアルのプラットフォームを使用した結合アッセイの概略図を描く。 １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ ｃｈｉｐ Ｇを使用する単一細胞シーケンシングのために液滴中で担持される４０ミクロンのナノバイアルを描く。 １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ ｃｈｉｐ Ｇを使用する単一細胞シーケンシングのために液滴中で担持される４０ミクロンのナノバイアルを描く。 １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ ｃｈｉｐ Ｇを使用する単一細胞シーケンシングのために液滴中で担持される４０ミクロンのナノバイアルを描く。 １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ ｃｈｉｐ Ｇを使用する単一細胞シーケンシングのために液滴中で担持される４０ミクロンのナノバイアルを描く。 本開示の様々な態様に係る、蛍光読み出しを使用する単一細胞抗体親和性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、バーコード化抗体および単一細胞シーケンシングを使用する、単一細胞抗体親和性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＦＡＣＳおよび／またはシーケンシング手法を使用する、単一細胞抗体特異性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、抗原提示細胞アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な実施形態に係る、シグナル伝達経路を調節する生物学的製剤をスクリーニングするためのアッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、シグナル伝達経路を調節する生物学的製剤のスクリーニングのためのアッセイにおいて使用することができるオリゴヌクレオチドバーコードの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ナノバイアルへの複数の物体の担持を描く。 本開示の様々な態様に係る、ナノバイアルへの複数の物体の担持を描く。 本開示の様々な態様に係る、異なる形状の粒子上の細胞から放出された分子の定常状態の拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、異なる形状の粒子上の細胞から放出された分子の定常状態の拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、異なる形状の粒子上の細胞から放出された分子の定常状態の拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、異なる形状の粒子上の細胞から放出された分子の定常状態の拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、異なる形状の粒子上の細胞から放出された分子の定常状態の拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアル上の細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアルの細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアルの細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアルの細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアルの細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、空洞部の開口部から異なる距離で配置されたビーズまたは遮断粒子を有するナノバイアルの細胞から放出された、分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアルの細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアルの細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアルの細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアルの細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアル上の細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な空洞部形態を有するナノバイアル上の細胞から放出された分子の定常状態拡散シミュレーションを描く。 本開示の様々な態様に係る、ナノバイアルからの分子の漏出もしくは輸送を低減させるためのビーズまたは他の遮断粒子の使用を描く。 本開示の様々な態様に係る、より大きなナノバイアルの空洞部を遮断するより小さなナノバイアルの顕微鏡画像を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＤＮＡによりコードされたライブラリーを使用するスクリーニングアッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＤＮＡによりコードされたライブラリーを使用するスクリーニングアッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターなどのイメージングフローサイトメトリーを利用するナノバイアルの分析の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターなどのイメージングフローサイトメトリーを利用するナノバイアルの分析の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターなどのイメージングフローサイトメトリーを利用するナノバイアルの分析の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩイメージングフローサイトメーターなどのイメージングフローサイトメトリーを利用するナノバイアルの分析の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、マイクロウェルアレイ内に担持されたナノバイアルの蛍光顕微鏡画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、溶液の密度および遠心分離の調節により分離されている遊離細胞、空のナノバイアル、ならびに細胞を担持させたナノバイアルの顕微鏡画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、混合の効果および細胞の数とナノバイアルの数との間の比率を含む、ナノバイアルに細胞を担持させるための様々な条件についての実験データの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、乳化状態および非乳化状態の両方で分泌物を蓄積するために、様々な温度でナノバイアルに担持され、インキュベートされたＩｇＧ分泌ハイブリドーマからの抗原特異的シグナルの明視野顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、乳化状態および非乳化状態の両方で分泌物を蓄積するために、様々な温度でナノバイアルに担持され、インキュベートされたＩｇＧ分泌ハイブリドーマからの抗原特異的シグナルの明視野顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、散乱シグナルを使用した、空のナノバイアル、遊離細胞、および細胞を担持させたナノバイアルを特定するためのゲーティング方策の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、単一細胞分泌アッセイを実施した後のブランクのナノバイアルと比較した、細胞を担持させたナノバイアル、遊離細胞、および空のナノバイアルのＩｇＧシグナルの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、単一細胞分泌アッセイを実施した後のブランクのナノバイアルと比較した、細胞を担持させたナノバイアル、遊離細胞、および空のナノバイアルのＩｇＧシグナルの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、１０Ｘ ｃｈｒｏｍｉｕｍ機器を使用して、ＧＥＭビーズと共に液滴に担持させた後にオリゴバーコード化ＰＥストレプトアビジンで標識された、３５ミクロンのナノバイアルの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、１０Ｘ Ｃｈｏｍｉｕｍ ｃｈｉｐ Ｇを使用した、球状ゲルビーズと共に３５ミクロンおよび６０ミクロンの両方のナノバイアルの内包を示す、タイムラプス画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、１０Ｘ Ｃｈｏｍｉｕｍ ｃｈｉｐ Ｇを使用した、球状ゲルビーズと共に３５ミクロンおよび６０ミクロンの両方のナノバイアルの内包を示す、タイムラプス画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ナノバイアルに担持された細胞のヒトおよびマウスの転写物の回収、ナノバイアルまたは懸濁液に担持された細胞の回収された転写物と遺伝子の比較、ならびに１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞シーケンシングプラットフォームを使用した、ストレプトアビジン標識および抗体標識の両方による、単一細胞転写物への、ナノバイアルに付着させた特徴バーコードの回収および連結を実証する実験データの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、ナノバイアルに担持された細胞のヒトおよびマウスの転写物の回収、ナノバイアルまたは懸濁液に担持された細胞の回収された転写物と遺伝子の比較、ならびに１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞シーケンシングプラットフォームを使用した、ストレプトアビジン標識および抗体標識の両方による、単一細胞転写物への、ナノバイアルに付着させた特徴バーコードの回収および連結を実証する実験データの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、同じナノバイアルへの、一方は蛍光タグを有しており、もう一方は蛍光タグを有していない２つの異なる細胞型の担持を実証する実験データの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、磁気分離によって選択的に濃縮された、捕捉されたＩｇＧを有するナノバイアルの明視野画像および蛍光画像の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、様々な混合手法および磁力を使用した分離下で、ＩｇＧ特異的磁性粒子を用いたＩｇＧ特異的ナノバイアルを標識することによって濃縮されたナノバイアルの実験結果の非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、機能的ＣＡＲ構築物およびＴＣＲ構築物のスクリーニングのために使用され得る細胞殺傷アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。 本開示の様々な態様に係る、フローサイトメトリー分析による、溶解された細胞からのナノバイアル上での赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の捕捉、およびナノバイアル上の捕捉されたＲＦＰ蛍光の観察を示す、細胞致死アッセイの実験結果の非限定的な例を描く。
ナノバイアルを情報の担体として使用して、機能的単一細胞特性（例えば、分泌物）を、細胞のゲノム特性、プロテオーム特性、および／またはトランスクリプトーム特性と結び付けるための方法およびシステムが本明細書に提供される。ナノバイアル中で実施されるアッセイの特異性および／または感度を改善するための方法およびシステムが、本明細書にさらに提供される。さらに、ナノバイアルを濃縮する、ナノバイアルを梱包する、およびナノバイアルを保管するための方法およびシステムが本明細書に提供される。さらに、ナノバイアル分析および分類のための統合システムおよびソフトウェアが本明細書に提供される。
方法
本明細書中の本開示は、ナノバイアル中で（例えば、ナノバイアルの空洞部内で）アッセイ（例えば、単一細胞ベースのアッセイ）を実施する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、機能的情報をトランスクリプトーム単一細胞、ゲノム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付けるためなどの、情報を結び付けるための方法を提供する。図６Ａおよび図６Ｂは、プール後のアッセイを実施する方法（図６Ａ）とナノバイアル結び付きアッセイを実施する方法（図６Ｂ）との間の差を実証する。プール後のアッセイ（図６Ａ）中、アッセイ間での細胞のプールに起因して、かつ／または細胞集団が機器間で移されるときに、細胞特異的情報が失われることがある。有利には、（例えば、本明細書に提供される）ナノバイアルシステムを使用すると、調査されている細胞に関連付けられるナノバイアル上に直接情報を記憶することができ、その情報は、情報間の直接の連結を可能にする複数のプロセス（例えば、機能的情報（例えば、分泌）および配列（例えば、トランスクリプトーム）情報を結び付けること）の全体にわたって保持され得る。図６Ｂに描かれるように、第１のアッセイ（アッセイ１）から得られた情報は、第２のアッセイ（アッセイ２）から得られた情報と結び付けられてもよく、これは、次に第３のアッセイ（アッセイ３）から得られた情報と結び付けられてもよい。非限定的な例では、結び付けられたナノバイアルのアッセイは、例えば、ナノバイアル中またはナノバイアル上に（例えば、ナノバイアルの空洞部内に）位置する関心対象の単一細胞から産生された、分泌抗体の親和性および／または特異性を調査するスクリーニングアッセイを含み得る。得られた関心対象の単一細胞からのアッセイ情報（例えば、親和性、特異性、またはそれらのあらゆる組合せ）は、（例えば、分泌された、かつ非常に機能的な抗体の固有の配列を決定するために関心対象の単一細胞のｍＲＮＡを分析することなどによって）ナノバイアルに含有される関心対象の単一細胞のゲノム情報、トランスクリプトーム情報、および／またはプロテオーム情報に結び付けられ得る。
様々な態様では、方法は、第１のアッセイ情報を生成するために、ナノバイアル中またはナノバイアル上に（例えば、ナノバイアルの空洞部内に）位置する（例えば、単一または個々の）細胞に対して第１のアッセイを実施する工程を含む。場合によっては、第１のアッセイは、本明細書に記載される機能的細胞ベースのアッセイ（例えば、抗体分泌アッセイ）である。機能的細胞ベースのアッセイは、本明細書に記載される任意の機能的細胞ベースのアッセイを含む、任意の機能的細胞ベースのアッセイを含み得る。いくつかの実施形態では、機能的細胞ベースのアッセイは抗体分泌スクリーニングアッセイである。いくつかの実施形態では、機能的細胞ベースのアッセイは抗体親和性アッセイである。いくつかの実施形態では、機能的細胞ベースのアッセイは抗体特異性アッセイである。いくつかの実施形態では、機能的細胞ベースのアッセイは、（例えばＤＮＡ）コード化ライブラリースクリーニングアッセイである。いくつかの実施形態では、機能的細胞ベースのアッセイは、Ｔ細胞分泌表現型アッセイである。場合によっては、機能的細胞ベースのアッセイは、第１のバーコードまたは第１の標識に関連付けられる。様々な態様では、方法は、第２のアッセイ情報を生成するために、ナノバイアル中またはナノバイアル上（例えば、ナノバイアルの空洞部内）の（例えば、単一または個々の）細胞に対して第２のアッセイを実施する工程をさらに含む。場合によっては、第２のアッセイは、細胞表面マーカー染色、生存率アッセイ、細胞内染色アッセイ、および／または成長アッセイであり得る。第２のアッセイは、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイ（例えば単一細胞シーケンシング）であり得る。場合によっては、ゲノムアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングアッセイを含み得る。第２のアッセイは、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けられ得る。様々な態様では、方法は、第１のバーコードまたは第１の標識を、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けることによって、機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける工程をさらに含む。
ナノバイアルは、異なる分析様式間の情報を独立してアドレスおよび結び付ける様々な種類のバーコードまたは標識を含み得る。通常、（第１のアッセイ、例えば、機能的細胞ベースのアッセイに関連付けられる）第１のバーコードまたは第１の標識および（第２のアッセイ、例えば、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイに関連付けられる）第２のバーコードまたは第２の標識は、第１のバーコードまたは標識を、第２のバーコードまたは標識と識別できるように、識別可能である。第１のバーコードまたは標識および第２のバーコードまたは標識に使用できる異なる種類のバーコードまたは標識の例は、全体にわたって提供される。一実施形態では、第１のバーコードまたは第１の標識は、ポリＡ領域を有するオリゴヌクレオチドを含む。
さらに、各ナノバイアルは、個々のナノバイアルそれぞれが他のナノバイアルと識別され得るように、固有のナノバイアル関連付けバーコードまたは標識をさらに含み得る。好適なナノバイアルのバーコードまたは標識の非限定的な例としては、固有の核酸またはオリゴヌクレオチドバーコード、固有のペプチドバーコード、光学的バーコード（例えば、色素、フルオロフォア）、例えば、前方散乱もしくは側方散乱フローサイトメトリーにより観察可能な固有の散乱シグネチャー、同位体、またはマスバーコード（例えば、ＣｙＴＯＦまたはマスサイトメトリーによって判読可能）が挙げられる。非制限的な実施形態では、ナノバイアルは、固有のオリゴヌクレオチドバーコード、標識、またはタグに関連付けられる。場合によっては、固有のオリゴヌクレオチドバーコード、標識、またはタグは、（例えば、ポリＡ領域を、例えば、第１のバーコードまたは第１の標識上で、および／または細胞から放出されたｍＲＮＡから捕捉するための）ポリ－ｄＴ捕捉領域を含む。
さらに、あるいは代わりに、ナノバイアルは、画像サイトメトリーまたは画像活性化セルソーティングの手法により認識可能な固有の形状および／またはサイズを含み得る。ナノバイアル内に埋め込まれたフルオロフォアを蛍光漂白または活性化するために光学源を使用することにより、ナノバイアルは画像化の後、さらにタグ付けまたはバーコード化され得る。特に、２つ以上の分析モード間で情報を移し、かつ結び付けるために、一方の種類の特定のバーコードまたは標識を、もう一方の種類の特定のバーコードまたは標識と結び付けることができる。例えば、第１のヌクレオチド配列（例えば、ＧＡＣＴＴＣＣ）を含むオリゴヌクレオチドバーコードを有するナノバイアルは、加えて、特定のレベルのフルオロフォア強度（例えば、バックグラウンドの１０００倍を上回る強度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８）を含み得る。同じ例において、第２の識別可能なヌクレオチド配列（ＧＣＴＡＡＣＣ）を含むオリゴヌクレオチドバーコードを有する別のナノバイアルは、加えて、異なるレベルのフルオロフォア強度（例えば、バックグラウンド強度の１００倍のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８）を含み得る。（例えば、本明細書に提供される）バーコードまたは標識の種類のあらゆる組合せも、本明細書に提供される方法で（例えば、情報を結び付けるために）使用することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のバーコードまたは標識を、結び付けることができる（例えば、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０以上のバーコードまたは標識）。
別の実施形態では、第１のアッセイ情報（例えば、機能的単一細胞ベースのアッセイ情報）は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または他の単一細胞分析および調剤技術（例えば、Ｎａｍｏｃｅｌｌ、Ｎｏｄｅｘｕｓ、Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔなどの商業機器を使用して）を使用するインデックスソーティングの使用によって、第２のアッセイ情報（例えば、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞ベースのアッセイ情報）と結び付けられ得る。この実施形態では、中に細胞を含有するナノバイアルは、細胞上の蛍光シグナルおよび／または細胞からの分泌物または放出物に関連付けられるナノバイアルに基づいて分析および分類され得る。分類は、様々なパラメーター（例えば、蛍光強度ピーク高さ、蛍光強度幅、蛍光強度面積、蛍光色、散乱強度ピーク高さ、散乱強度幅、散乱強度面積など）に対するソートゲートに基づいて実施され得る。場合によっては、ソートゲート内の単一ナノバイアルは、フローサイトメーター（例えば、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＩＩＩ、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００、または他のインデックスソーティングに適合するＦＡＣＳシステム）を使用してプレートの別個のウェル（例えば、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート）に分類され得る。分類ベースの情報（例えば、ナノバイアルに関連付けられた蛍光強度）は、それが分類されたプレート中の特定のウェルに結び付けられ得、その後、後続のゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイから得られた下流の情報と結び付けることができる。
非限定的な例では、第２のアッセイ（例えば、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイ）は、（例えば、関心対象の細胞中に存在する核酸を）配列決定することを含む。オリゴヌクレオチドバーコードまたは標識が使用されるとき、方法は、オリゴヌクレオチドバーコードまたは標識を配列決定する工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、第２のアッセイ（例えば、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイ）の前に、第１のアッセイ（例えば、機能的アッセイ）によって生成されたシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。非限定的な実施形態では、ナノバイアルは、ＦＡＣＳベースの分類技術または任意の他の粒子、細胞、もしくは液滴の分類技術を使用して分類される。
上記の実施形態では、単一ナノバイアル／単一細胞からのデータは、これらの結び付けられたデータセットを、同じ単一ナノバイアルまたは単一細胞の識別子に結び付けられた列またはエントリーとして含む単一のデータ構造で結び付けられ得る。
単一細胞分泌アッセイ
ナノバイアルシステムにおいて使用することができる単一細胞分泌アッセイが本明細書に提供される。ナノバイアルは、例えば、関心対象の細胞からの放出物が、マルチウェルプレートで実施される従来のワークフローと同様の様式で、アッセイの一部としてナノバイアルに関連付けられる基質として作用することができる。例えば、典型的なワークフローでは、標的細胞、標的分子、または捕捉分子は、ナノバイアルの表面で固定され得る。その後、関心対象の細胞は、ナノバイアルの表面（その上に固定された標的細胞または分子を含む）へ接着され得る。関心対象の細胞は、ナノバイアルアッセイで評価されるインキュベーション期間にわたって生物学的産物もしくは分子を分泌または放出し得る。その後、アッセイの読み出しシグナル（例えば、蛍光、コードされたオリゴヌクレオチド、磁気、またはそれらのあらゆる組合せ）は、ナノバイアル上もしくはナノバイアル内、またはナノバイアルに結合した標的細胞上もしくは標的細胞内で得られ、関心対象の細胞からの生物学的産物の機能と相関し得る。洗浄工程はアッセイの工程間で実施され得る。異なる生物学的産物を有する複数の関心対象の細胞を有する複数のそのようなナノバイアルは、生物学的産物の機能的情報に基づいてプラットフォームで分析および／または分類することができる。
いくつかの実施形態では、関心対象の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントを特定するための方法が本明細書に提供される。場合によっては、方法は、以下の工程のうち１つ以上を含む：（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程、（ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程、（ｄ）検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程、（ｅ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程、（ｆ）抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程、（ｇ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程、および（ｈ）工程（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程。上記で提供される工程は、必ずしもそれらが現れる正確な順序で実行される必要はないことを理解されたい。上記で提供される工程は、任意の順序で行われてもよく、ユーザーの必要性を満たすように変更されてもよい。上記で提供されたすべての工程が必要とされるわけではなく、または単一のユーザーによって実行される必要があるわけでもないことも理解されたい。例えば、一実施形態では、工程（ａ）～（ｅ）のうちのいずれかが第１のユーザーによって実施されてもよく、工程（ｆ）～（ｈ）のうちのいずれか１つが第２の異なるユーザーによって実施されてもよい。例えば、方法は、工程（ｅ）が（例えば、異なるユーザーによって）実施された後に、ナノバイアルを得て、工程（ｆ）～（ｈ）を実施することを含み得る。
いくつかの実施形態では、ナノバイアルを提供するか、または得る方法であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部を含む方法である。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、抗体産生細胞を含まない）。他の場合では、ナノバイアルは抗体産生細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つより多い抗体産生細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、その上に固定された親和剤で被覆されるか、またはその親和剤を有する。親和剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは親和剤で被覆されず、方法がナノバイアルを親和剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、親和剤は、（例えば、抗体産生細胞によって分泌された抗体に結合し、捕捉するための）抗体捕捉部分である。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、プロテインＧ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗体産生細胞によって分泌された全てのまたは実質的に全ての抗体が抗体捕捉部分に結合し得るように、特定の種類の抗体に特異的ではない。他の実施形態では、親和剤は関心対象の抗原である。そのような場合、関心対象の抗原に結合することのできる、抗体産生細胞から分泌された抗体は、ナノバイアル上で捕捉される。別の実施形態では、親和剤は抗原提示細胞であり、関心対象の抗原は抗原提示細胞の表面で発現または提示される。そのような場合、関心対象の抗原に結合することのできる、抗体産生細胞から分泌された抗体は、（例えば、ナノバイアルの空洞部内に含有される）抗原提示細胞で捕捉される。
いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持された抗体産生細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。抗体産生細胞は、抗体を産生する任意の細胞である可能性がある。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗体産生細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗体産生細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が（例えば、Ｂ細胞受容体を介して）結合することのできる抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含み、抗体産生細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆されるか、または標識され得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含む。任意の温度、時間、緩衝液、または培地条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、抗体産生細胞がナノバイアルの空洞部内への抗体を産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする前に、ナノバイアルの内容物がナノバイアルの空洞部から拡散することができないか、または実質的に拡散することができないように、ナノバイアルが（例えば、液滴またはエマルジョン内に）内包され得る。他の場合では、１つ以上の遮断粒子が、（例えば、本明細書に記載される）ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために添加され得る。
様々な態様では、方法は、検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出剤は関心対象の抗原である。いくつかの実施形態では、検出剤は、抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に（例えば、一次検出剤に結合する検出可能な標識を含む二次検出剤を使用して）標識される。検出可能な標識は、蛍光標識、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ、磁性粒子、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択され得る。特定の態様では、検出可能な標識は蛍光標識（例えば、蛍光染料、フルオロフォアなど）である。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む。一態様では、検出剤は蛍光標識を含み、方法は蛍光のレベルを検出する工程を含み、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルと相関する。別の態様では、検出剤はオリゴヌクレオチド標識を含む。この例では、方法は、オリゴヌクレオチド標識を配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、抗体への検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）に基づいてナノバイアルを分類する工程を含む。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類する工程はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出剤が磁性粒子標識を含むとき、サンプルは磁力または磁気活性化セルソーティング（例えば、ＭＡＣＳ）を使用して分類される。
様々な態様では、方法は、抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程をさらに含む。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るか、または得た工程、および抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データを下流のシーケンシングデータに関連付けることができるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力（例えば、分泌アッセイデータ）を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞を溶解する工程を含む。別の態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞の溶解物を（例えば、分泌アッセイが実施され、ナノバイアルが分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために抗体産生細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法は、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルが抗体産生細胞を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、異なる抗体を産生する抗体産生細胞（例えば、単一の抗体産生細胞）を含む。そのような方法では、複数のナノバイアルは、関心対象の抗原を標的とする抗体についてスクリーニングすることができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。関連付ける工程は、第１のアッセイ（例えば、分泌アッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識を、第２のアッセイ（例えば、シーケンシングアッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識に関連付けることを含み得る。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含み得る。
抗体親和性アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、図８および図９に描かれるように、抗体分泌細胞（例えば、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せ）から分泌される抗体の結合親和性を分析して、この結合親和性に関連付けられる単一細胞ヌクレオチド配列情報を特徴付ける工程を含み得る。いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、抗体産生細胞を含まない）。他の場合では、ナノバイアルは抗体産生細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つより多い抗体産生細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、その上に固定された親和剤で被覆されるか、またはその親和剤を有する。親和剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは親和剤で被覆されず、方法がナノバイアルを親和剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、親和剤は、（例えば、抗体産生細胞によって分泌された抗体に結合し、捕捉するための）抗体捕捉部分である（１８、４４）。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、プロテインＧ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗体産生細胞によって分泌された全てのまたは実質的に全ての抗体が抗体捕捉部分に結合し得るように、特定の種類の抗体に特異的ではない。他の実施形態では、親和剤は関心対象の抗原である（２０、４６）。そのような場合、関心対象の抗原に結合することのできる、抗体産生細胞から分泌された抗体は、ナノバイアル上で捕捉される。
いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持された抗体産生細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。抗体産生細胞は、抗体を産生する任意の細胞である可能性がある。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗体産生細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗体産生細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ｓｓＤＮＡを含み、抗体産生細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆されるか、または標識され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、親和性アッセイ法において使用されるナノバイアルは、油中で乳化され得る（２２、３０、５０、５２）。場合によっては、ナノバイアルは液滴内に内包され得る。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある（２３、５１）。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含む（２６、２８、３２、５４、５６、５８）。任意の温度、時間、培地緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、抗体産生細胞がナノバイアルの空洞部内への抗体を産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする工程は、抗体産生細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間など）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を含み得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子が使用される他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、またはそれらのあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、方法は、検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程をさらに含む。場合によっては、検出剤は、抗体またはそのフラグメントを含み得る（３４、６２、６０、６８、４２）。いくつかの例では、検出剤は、関心対象の抗原を含み得る（４０、３８、６４、６６）。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識され得る。検出可能な標識は、蛍光標識（３４、３６、３８、４２）、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ（６０、６２、６４、６８）、磁性粒子、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の異なる濃度で、検出剤を複数のナノバイアルに添加する工程を含み得る。１つ以上の異なる濃度は、関心対象の抗原に対する所望の解離定数（ＫＤ）の１桁以内であり得る。所望のＫＤは、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満であり得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む。一態様では、検出剤は蛍光標識を含み、方法は蛍光のレベルを検出する工程を含み（４１）、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルと相関する。別の態様では、検出剤はオリゴヌクレオチド標識を含む。この例では、方法は、オリゴヌクレオチド標識を配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む（７０）。
いくつかの実施形態では、方法は、抗体への検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む（４１）。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）に基づいて、または蛍光強度のゲート内でナノバイアルを分類する工程を含む（４１）。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出剤が磁性粒子標識を含むとき、サンプルは磁力または磁気活性化セルソーティング（例えば、ＭＡＣＳ）を使用して分類される。
様々な態様では、抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程をさらに含む（７０）。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るかまたは得た工程、および抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データを下流のシーケンシングデータに関連付けることができるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力（例えば、分泌アッセイデータ）を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞を溶解する工程を含む。他の態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞の溶解物を（例えば、分泌アッセイが実施され、ナノバイアルが分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために抗体産生細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルが抗体産生細胞を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、異なる抗体を産生する抗体産生細胞（例えば、単一の抗体産生細胞）を含む。そのような方法では、複数のナノバイアルは、関心対象の抗原を標的とする抗体についてスクリーニングすることができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。関連付ける工程は、第１のアッセイ（例えば、分泌アッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識を、第２のアッセイ（例えば、シーケンシングアッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識に関連付けることを含み得る。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、本明細書に提供される方法は、関心対象の抗原に対する所望の親和性を有する抗体をスクリーニングおよび特定することに好適である。本明細書に提供される方法は、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満の関心対象の抗原に対するＫＤを有する抗体をスクリーニングおよび特定するために使用され得る。
本明細書に提供されるように、図８は抗体親和性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。この例では、ナノバイアルは、細胞を担持し、ＩｇＧに対する抗体（１８）または関心対象の抗原（２０）などの親和剤で被覆される。ナノバイアルは、それらを密閉し、かつクロストークを減少するために、任意選択で乳化される（２２、３０）。ナノバイアルはその後インキュベートされ、分泌された抗体は、ナノバイアルの表面で捕捉される（２６、２８、３２）。乳化されたナノバイアルは、水相に戻され、バックグラウンドが洗浄される。サンプルはその後、高親和性抗体対低親和性抗体を特定するために関心対象の抗原と共にインキュベートされ（４０）、その後、抗原に特異的な蛍光タグ付き抗体で標識される（４２）。サンプルはその後、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、または他の単一細胞蛍光読み出し機器を使用して、分析および／または分類される（４１）。別の実施形態では、捕捉され、分泌された抗体を有するナノバイアルは、蛍光タグ付き抗原と共にインキュベートされる（３８）。両方の手法において、ＩｇＧに対する蛍光タグ付き抗体が、分泌された抗体の量を正規化するために使用されてもよい（３６）。別の実施形態では、ナノバイアルは、関心対象の抗原で直接標識される（２０）。分泌された抗体は、抗原に結合するための相対的親和性に基づいて標識され、ＩｇＧに対するものなどの蛍光タグ付き抗体で捕捉される（３４）。サンプルは、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、または他の単一細胞蛍光分析および分類機器を使用して、分析および／または分類される（４１）。
本明細書に提供されるように、図９は、抗体親和性アッセイのワークフローの別の非限定的な例を描く。この例では、ナノバイアルは、細胞を担持し、ＩｇＧに対する抗体（４４）または関心対象の抗原（４６）などの親和剤で被覆される。ナノバイアルは、それらを密閉し、かつクロストークを減少するために任意選択で乳化される（５０、５２）。ナノバイアルはその後インキュベートされ、分泌された抗体は、ＩｇＧに対する抗体（５４、５６）または関心対象の抗原（５８）などの親和剤への結合によってナノバイアルの表面で捕捉される。乳化されたナノバイアルは、水相に戻され、バックグラウンドが洗浄される。サンプルはその後、高親和性抗体対低親和性抗体を特定するために関心対象の抗原と共にインキュベートされ（６６）、その後、オリゴヌクレオチドタグ付き抗体で標識される（６８）。その後、サンプルは、異なる細胞によって産生された抗体の相対的親和性ならびにｍＲＮＡ発現プロファイルおよび抗体配列情報を測定するために、例えば、単一細胞シーケンシングプラットフォームを使用して配列決定される（７０）。別の実施形態では、分泌された抗体を捕捉するナノバイアルは、オリゴヌクレオチドタグ付き抗原と共にインキュベートされる（６４）。その後、サンプルは、単一細胞シーケンシングバーコードによって提供される、結び付けられた情報とともに、タグ付き抗原のオリゴヌクレオチド配列の計数に基づいて、抗体配列情報および親和性情報を含む抗体分泌細胞ｍＲＮＡ発現プロファイルを特定するために、配列決定され得る（７０）。両方の手法において、ＩｇＧに対するオリゴヌクレオチドタグ付き抗体が、分泌された抗体の量を正規化するために使用されてもよい（６２）。別の実施形態では、ナノバイアルは、関心対象の抗原で直接標識される（４６）。分泌された抗体は相対的親和性に基づいて捕捉され、分泌された抗体に対してオリゴヌクレオチドタグ付き抗体で標識した（６０）。このワークフローを用いた単一細胞シーケンシング（７０）では、ナノバイアルに関連付けられたオリゴヌクレオチドバーコードまたはナノバイアル標識（ＮＬ）を使用してもよい。ＮＬは、ナノバイアルまたはナノバイアルおよびその中の細胞と流体連通している別個のビーズに位置してもよい。別個のビーズは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングシステムの一部として使用されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートビーズ（例えば、ＧＥＭビーズまたはＲｈａｐｓｏｄｙビーズ）であり得る。ＮＬを含むオリゴヌクレオチドバーコードは、ポリＡ領域を介して抗体産生細胞からのｍＲＮＡを捕捉するためのオリゴ－ｄＴ配列（ｄＴ）、および抗原または抗体のオリゴヌクレオチドタグをさらに含み得る。抗体産生細胞からのｍＲＮＡならびに抗原および抗体のオリゴヌクレオチドタグを、ＮＬに隣接して連結されたｃＤＮＡならびに任意選択でユニバーサル配列および固有の分子インデックス配列を含む他のオリゴヌクレオチド配列に変換するために逆転写が実施される。ｃＤＮＡは、増幅され、例えば、次世代シーケンシングを使用して配列決定される。このように、増幅されたｃＤＮＡに存在する同じＮＬコードは、抗体産生細胞からの抗体配列を、オリゴヌクレオチドタグ付き抗原および抗体からの分泌および親和性シグナルに結び付けるために使用される。このワークフローでは、抗体結合および親和性をアッセイし、さらに同じＮＬバーコードに繋がれるオリゴヌクレオチドタグバーコードのシーケンシングリードの数を検索することによって、抗体分泌細胞の抗体配列（例えば、重鎖および軽鎖）と結び付けることができる。いくつかの実施形態では、閾値を上回る親和性を有する抗体配列を選択することは、閾値レベルもしくはリード数、またはオリゴヌクレオチドタグ付き抗体バーコード配列読み取りの閾値画分を上回るオリゴヌクレオチドタグ付き抗原のバーコード配列を含有するＮＬバーコード含有リードを特定すること、およびその後、同じＮＬバーコードリードに関連付けられた抗体配列（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を特定することを含む。
抗体特異性アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、図１０で見出されるように、関心対象の抗原に対する所望の特異性を有する抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せ）から分泌される１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程、およびこの所望の特異性に関連付けられたこの抗体の配列情報を特徴付ける工程を含み得る。
いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、抗体産生細胞を含まない）。その他の場合では、ナノバイアルは抗体産生細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つより多い抗体産生細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、その上に固定された親和剤で被覆されるか、またはその親和剤を有する。親和剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは親和剤で被覆されず、方法がナノバイアルを親和剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、親和剤は、（例えば、抗体産生細胞によって分泌された抗体に結合し、捕捉するための）抗体捕捉部分である（７２）。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、プロテインＧ、およびそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される。場合によっては、抗体捕捉部分は、抗体産生細胞によって分泌された全てのまたは実質的に全ての抗体が抗体捕捉部分に結合し得るように、特定の種類の抗体に特異的ではない。
いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持された抗体産生細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。抗体産生細胞は、抗体を産生する任意の細胞である可能性がある。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗体産生細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗体産生細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ｓｓＤＮＡを含み、抗体産生細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆されるか、または標識され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、アッセイ法において使用されるナノバイアルは、油中で乳化され得る（７４）。場合によっては、ナノバイアルは液滴内に内包され得る。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含む（７６）。任意の温度、時間、培地、緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、抗体産生細胞がナノバイアルの空洞部内への抗体を産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする工程は、抗体産生細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間など）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を含み得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子が使用される他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、または前述のあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、ナノバイアルに複数の異なる検出剤を添加する工程を含む（７８、８０）。場合によっては、方法は、異なる検出剤のうちの１つに特異的に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程を含む。場合によっては、検出剤は、複数の抗原のサブセットが抗体産生細胞から分泌された抗体のエピトープに高い特異性で結合し得る、複数の標識抗原（７８）を含み得る。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識され得る。検出可能な標識は、蛍光標識（７８）、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ（８０）、磁性粒子、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。場合によっては、正規化された抗体は、ナノバイアルの分泌された抗体または結合された抗体における電位差を説明するために使用され得る。いくつかの実施形態では、正規化された抗体は、蛍光標識を含み得る（８４）。あるいは、正規化された抗体は、オリゴヌクレオチドバーコード標識を含み得る（８２）。
様々な態様では、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む。一態様では、検出剤は蛍光標識を含み、方法は蛍光のレベルを検出する工程を含み（８６）、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルと相関する。別の態様では、検出剤はオリゴヌクレオチド標識を含む。この例では、方法は、オリゴヌクレオチド標識を配列決定する工程をさらに含む（８８）。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、抗体への複数の検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む（８６）。場合によっては、方法は、１つ以上の蛍光チャネルにおける蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）に基づいて、ナノバイアルを分類する工程を含む（８６）。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類する工程はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出剤が磁性粒子標識を含む場合、サンプルは磁力または磁気活性化セルソーティング（例えば、ＭＡＣＳ）を使用して分類される。
様々な態様では、抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程をさらに含む（８８）。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るかまたは得た工程、および抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データが下流のシーケンシングデータに関連付けられるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力（例えば、分泌アッセイデータ）を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞を溶解する工程を含む。他の態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞の溶解物を（例えば、分泌アッセイが実施され、ナノバイアルが分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために抗体産生細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルが抗体産生細胞を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、異なる抗体を産生する抗体産生細胞（例えば、単一の抗体産生細胞）を含む。そのような方法では、複数のナノバイアルは、関心対象の抗原を標的とする抗体についてスクリーニングすることができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。関連付ける工程は、第１のアッセイ（例えば、分泌アッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識を、第２のアッセイ（例えば、シーケンシングアッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識に関連付けることを含み得る。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象の１つ以上の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含み得る。
本明細書に提供されるように、図１０は抗体親和性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。この例では、ナノバイアルは、細胞を担持し、ＩｇＧに対する抗体などの親和剤で被覆される（７２）。ナノバイアルは、クロストークを減少し、かつシグナルを増加するために任意選択で乳化される（７４）。その中に細胞を有するナノバイアルは、その後インキュベートされ、分泌された抗体はナノバイアルの表面で捕捉される（７６）。ナノバイアルが任意選択で乳化された場合、それらは脱乳化される。その後、ナノバイアルは洗浄される。一実施形態では、ナノバイアル、関連付けられた細胞、および捕捉された抗体は、蛍光コードされる複数の抗原とともにインキュベートされる（７８）。ＩｇＧに対するものなどの蛍光抗体は、任意選択で、捕捉された分泌物の総量に対して測定されたシグナルを正規化するために使用される（８４）。その後、サンプルは、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳを使用して読み出され、かつ／または分類される。１つ以上の蛍光チャネルにおけるゲートに基づいて、１つ以上の蛍光コードされる抗原に結合する抗体を分泌する抗体分泌細胞を単離するために、ＦＡＣＳが使用される（８６）。別の実施形態では、ナノバイアルは、代わりに、固有のオリゴヌクレオチドバーコードでコードされる複数の抗原と共にインキュベートされる（８０）。任意選択で、ＩｇＧに対するものなどの別個のオリゴヌクレオチドタグ付き抗体が、正規化に使用される（８２）。その後、サンプルは、分泌された抗体配列を固有のオリゴヌクレオチドバーコードの抗原結合カウントと結び付けるために、様々な単一細胞シーケンシング手法を用いて分析される（８８）。このワークフローでは、ナノバイアルに関連付けられたオリゴヌクレオチドバーコードまたはナノバイアル標識（ＮＬ）が利用される。ＮＬは、ナノバイアルまたはナノバイアルおよびその中の細胞と流体連通している別個のビーズに位置してもよい。別個のビーズは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングシステムの一部として使用されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートビーズ（例えば、ＧＥＭビーズまたはＲｈａｐｓｏｄｙビーズ）であり得る。ＮＬを含むオリゴヌクレオチドバーコードは、ポリＡ領域を介して抗体産生細胞からのｍＲＮＡを捕捉するためのオリゴ－ｄＴ配列（ｄＴ）、抗原のオリゴヌクレオチドタグ、および任意選択で抗体をさらに含み得る。抗体産生細胞からのｍＲＮＡ、抗原のオリゴヌクレオチドタグ、および任意選択で抗体を、ＮＬに隣接して連結されたｃＤＮＡならびに任意選択でユニバーサル配列および固有の分子インデックス配列を含む他のオリゴヌクレオチド配列に変換するために逆転写が実施される。ｃＤＮＡは、増幅され、例えば、次世代シーケンシングを使用して配列決定される。このように、増幅されたｃＤＮＡに存在する同じＮＬコードは、抗体産生細胞からの抗体配列を、オリゴヌクレオチドタグ付き抗原および抗体からの特異性および分泌シグナルに結び付けるために使用される。このワークフローでは、抗体特異性をアッセイし、さらに同じＮＬバーコードに繋がれた異なる抗原に関連付けられたオリゴヌクレオチドバーコードのシーケンシングリードの数を調べることによって、抗体分泌細胞の抗体配列（例えば、重鎖および軽鎖）に結び付けるすることができる。いくつかの実施形態では、閾値を上回る特異性を有する抗体配列を選択することは、ある種類が閾値レベルまたは閾値数のリードを上回る一方で別の種類が閾値数のリードを下回るリードのオリゴヌクレオチドタグ付き抗原のバーコード配列を含むＮＬバーコード含有リード、または別の種類が閾値数のリードを下回るリードを上回る抗体バーコード配列リードに対して正規化されたリードを特定することを含む。その後、同じＮＬバーコードリードに関連する抗体配列（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を特定するいくつかの実施形態では、閾値を上回る特異性を有する抗体配列を選択することは、閾値レベルまたはリード数を超えるある種類のオリゴヌクレオチドタグ付き抗原バーコード配列を含有するＮＬバーコード含有リードを同定することを含み、別のタイプもまたリード数の閾値を上回る。または、ある種類についてのリードの閾値分率を上回る抗体バーコード配列リードに対して正規化されたリードであるが、別のタイプもまたリードの閾値分率を上回るリードであり、その後、同じＮＬバーコードリードに関連する抗体配列（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を同定する。
抗原産生細胞アッセイ
いくつかの実施形態では、図１１で描かれるように、本明細書に提供される方法は、例えば、抗原提示細胞もしくは抗原産生細胞の表面で発現または提示される抗原に対する所望の親和性を有する抗体産生細胞（例えば、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せ）から分泌される１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程を含み得る。
いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、抗体産生細胞を含まない）。その他の場合では、ナノバイアルは抗体産生細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つ以上の抗体産生細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、そこに固定された抗原提示細胞を有している（９０）。抗原提示細胞は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは、そこに固定された抗原提示細胞を有しておらず、方法がナノバイアルの空洞部の表面に抗原提示細胞を付着させるか、または固定する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、抗体産生細胞を担持させる前にナノバイアルの空洞部に固定され得る。他の実施形態では、抗体産生細胞は、ナノバイアルの空洞部に抗原提示細胞を固定する前にナノバイアルの空洞部に担持され得る。抗原提示細胞は、平均して、少なくとも１つの抗原提示細胞がナノバイアルの空洞部に担持されるような濃度でナノバイアルの空洞部に担持され得る（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ以上）。
ナノバイアルの表面は、抗原提示細胞を捕捉し、かつナノバイアルの表面に固定する細胞捕捉部分で被覆され得る。例えば、ナノバイアルの表面は、抗原提示細胞の表面で発現されるタンパク質と相互作用する抗体またはそのフラグメントで被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞接着ペプチド（例えば、ＲＧＤ）で被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞外マトリックスタンパク質で被覆されてもよい。
抗原提示細胞は、通常それが抗原提示細胞の表面で関心対象の抗原を産生するか、提示するか、または発現するように選択される。場合によっては、抗原提示細胞は生細胞である。他の場合において、抗原提示細胞は死細胞（例えば、固定細胞）である。抗原提示細胞は、原核細胞または真核細胞である可能性がある。抗原提示細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞である可能性がある。抗原提示細胞は、シグナルを最大にするために、正常よりも高いレベルで細胞の表面に関心対象の抗原を発現するように（例えば、組換えにより）操作することができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持された抗体産生細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗体産生細胞の担持の前に、空洞部内で既に担持された抗原提示細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。他の実施形態では、方法は空のナノバイアルを得るか、または提供する工程を含み、抗原提示細胞および抗体産生細胞は、任意の順序でナノバイアルの空洞部内に担持される。抗体産生細胞は、抗体を産生する任意の細胞である可能性がある。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗体産生細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗体産生細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ｓｓＤＮＡを含み、抗体産生細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆されるか、または標識され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、ナノバイアルは、油中で乳化され得る（９２）。場合によっては、ナノバイアルは、液滴内に内包され得る（９２）。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、（例えば、抗原提示細胞の表面で発現された）関心対象の抗原に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含み得る（９４）。任意の温度、時間、培地、または緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、抗体産生細胞がナノバイアルの空洞部内への抗体を産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを必要とする。場合によっては、インキュベートする工程は、抗体産生細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間など）を含み得る。場合によっては、期間は、３時間超（例えば、３時間超、５時間超、１０時間超、１５時間超、または２０時間超以上）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子が使用される他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、またはそれらのあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、方法は、検出剤が（例えば、関心対象の抗原、例えば、抗原提示細胞の表面に結合された）１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程をさらに含む。場合によっては、検出剤は、抗体またはそのフラグメントを含み得る（９６、９８）。例えば、検出剤は、分泌された抗体（例えば、マウスＢ細胞または他の抗体分泌細胞に対する抗マウスＨ＆Ｌまたは抗マウスＦｃ）に特異的な二次抗体であり得る。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識され得る。検出可能な標識は、蛍光標識（９８）、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ（９６）、磁性粒子、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。
様々な態様では、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む。一態様では、検出剤は蛍光標識を含み（９８）、方法は蛍光のレベルを検出する工程を含み（１０２）、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルと相関する。別の態様では、検出剤はオリゴヌクレオチド標識を含む（９６）。この例では、方法は、オリゴヌクレオチド標識を配列決定する工程をさらに含む（１０２）。場合によっては、検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む（１０２）。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）に基づいて、または蛍光強度に基づいてゲート内でナノバイアルを分類する工程を含む（１０２）。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。例えば、関心対象の抗体分泌細胞および抗原提示細胞に結合された分泌抗体は、（例えば、（ＶＨおよびＶＬ配列が対合した）Ｂ細胞受容体の）下流のシーケンシングの前にＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを用いて分類することができる。二次抗体フルオロフォアの蛍光強度の閾値を使用して（９８）、ナノバイアル（および関連付けられた関心対象の抗体分泌細胞）を分類し（１０２）、抗原産生細胞の抗原に特異的な抗体を特異的に産生および分泌する抗体分泌細胞について選択することができる。
様々な態様では、抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程をさらに含む（１０２）。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るかまたは得た工程、および抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データが下流のシーケンシングデータに関連付けられるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力（例えば、分泌アッセイデータ）を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に抗体産生細胞を溶解する工程を含む。他の態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞の溶解物を（例えば、分泌アッセイが実施され、ナノバイアルが分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために抗体産生細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。関連付ける工程は、第１のアッセイ（例えば、分泌アッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識を、第２のアッセイ（例えば、シーケンシングアッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識に関連付けることを含み得る。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含み得る。例えば、バーコード化オリゴヌクレオチドで標識される場合（９６）、ナノバイアル（および関連細胞）は、単一細胞ＲＮＡシーケンシングのワークフロー（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ）に導入することができる。このワークフローには、ナノバイアルに関連付けられたオリゴヌクレオチドバーコードまたはナノバイアル標識（ＮＬ）を利用する。例えば、ＮＬは、ストレプトアビジン（例えば、ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｃ０９７１、製品番号４０５２７１）にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドバーコードの使用を通して、ビオチン官能化ナノバイアルに関連付けることができる。ＮＬは、ナノバイアルまたはナノバイアルおよびその中の細胞と流体連通している別個のビーズに位置してもよい。別個のビーズは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングシステムの一部として使用されるオリゴヌクレオチドコンジュゲートビーズ（例えば、溶解可能なＧＥＭビーズまたはＲｈａｐｓｏｄｙビーズ）であり得る。ＮＬを含むオリゴヌクレオチドバーコードは、ポリＡ領域を介して抗体産生細胞からのｍＲＮＡを捕捉するためのオリゴ－ｄＴ配列（ｄＴ）、抗原提示細胞もしくは抗原産生細胞、および抗体のオリゴヌクレオチドタグをさらに含み得る。抗体産生細胞からのｍＲＮＡ、抗原提示細胞、および抗体のオリゴヌクレオチドタグを、ＮＬに隣接して連結されたｃＤＮＡならびに任意選択でユニバーサル配列および固有の分子インデックス配列を含む他のオリゴヌクレオチド配列に変換するために逆転写が実施される。ｃＤＮＡは、増幅され、例えば、次世代シーケンシングを使用して配列決定される。このように、増幅されたｃＤＮＡに存在する同じＮＬコードは、抗体産生細胞からの抗体配列ｃＤＮＡ、抗原提示細胞の抗原発現レベルを、オリゴヌクレオチドタグ付き抗体からの分泌および親和性シグナルに結び付けるために使用される。このワークフローでは、抗体結合をアッセイし、さらに同じＮＬバーコードに繋がれるオリゴヌクレオチドバーコードのシーケンシングリードの数を調べることによって、抗体分泌細胞の抗体配列（例えば、重鎖および軽鎖）に結び付けることができる。いくつかの実施形態では、閾値を上回る親和性を有する抗体配列を選択することは、閾値レベルもしくは閾値数を超えるリードを上回るオリゴヌクレオチドタグ付き抗体バーコード配列、または抗原ｃＤＮＡリードに対して正規化された読み取りの閾値画分を上回るオリゴヌクレオチドタグ付き抗体バーコード配列を含有するＮＬバーコード含有リードを特定すること、およびその後、同じＮＬバーコードリードに関連付けられた抗体配列（例えば、ＶＨおよびＶＬ）を特定することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルが抗体産生細胞および抗原提示細胞を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、異なる抗体を産生する抗体産生細胞（例えば、単一の抗体産生細胞）を含む。そのような方法では、複数のナノバイアルは、関心対象の抗原を標的とする抗体についてスクリーニングすることができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
本明細書に記載されるように、図１１は抗体親和性アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。この例では、抗体産生細胞または抗体分泌細胞、および抗原提示細胞は両方とも、ナノバイアル内に担持される（９０）。ナノバイアルは、サンプル間のクロストークを減少し、かつシグナルを増強するために任意選択で乳化される（９２）。ナノバイアルのサンプルは、産生細胞が抗体を分泌するのを可能にするためにインキュベートされる（９４）。関心対象の抗原に特異的な抗体は、抗原提示細胞に結合する（９４）。その後、ナノバイアルは水相に戻され、洗浄される。その後、抗原提示細胞に結合された抗体は、二次抗体（例えば、蛍光標識済み（９８）、および／またはオリゴヌクレオチドバーコード（９６）を含有する）で標識され、その後、下流の蛍光および／またはシーケンシング読み出しを使用して分析および／または分類される（１０２）。別の実施形態では、抗体は、抗原への結合時に抗原提示細胞における蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））の産生を誘導し得、これを使用して、分泌された抗体の機能を読み出し、抗体の機能に基づいて抗体分泌細胞を分類することができる（１００）。
抗体調節シグナル経路アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、例えば、図１２Ａに描かれるように、関心対象のシグナル経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程を含み得る。いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、抗体産生細胞を含まない）。その他の場合では、ナノバイアルは抗体産生細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つより多い抗体産生細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、そこに固定された抗原提示細胞または抗原産生細胞を有している（１０４）。抗原提示細胞は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得る。場合によっては、得られるか、または提供されるナノバイアルは、そこに固定された抗原提示細胞を有しておらず、方法がナノバイアルの空洞部の表面に抗原提示細胞を付着させるか、または固定する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、抗体産生細胞を担持させる前にナノバイアルの空洞部に固定され得る。他の実施形態では、抗体産生細胞は、ナノバイアルの空洞部に抗原提示細胞を固定する前にナノバイアルの空洞部に担持され得る。抗原提示細胞は、平均して、少なくとも１つの抗原提示細胞がナノバイアルの空洞部に担持されるような濃度でナノバイアルの空洞部に担持され得る（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ以上）。
ナノバイアルの表面は、抗原提示細胞を捕捉し、かつナノバイアルの表面に固定する細胞捕捉部分で被覆され得る。例えば、ナノバイアルの表面は、抗原提示細胞の表面で発現されるタンパク質と相互作用する抗体またはそのフラグメントで被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞接着ペプチド（例えば、ＲＧＤ）で被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞外マトリックスタンパク質で被覆されてもよい。
抗原提示細胞は、通常それが抗原提示細胞の表面で関心対象の抗原を産生するか、提示するか、または発現するように選択される。通常、これらの実施形態では、抗原提示細胞は（シグナル伝達経路の調節を評価することができるような）生細胞である。抗原提示細胞は、原核細胞または真核細胞である可能性がある。抗原提示細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞である可能性がある。抗原提示細胞は、シグナルを最大にするために、正常よりも高いレベルで細胞の表面に関心対象の抗原を発現するように（例えば、組換えにより）操作することができる。
場合によっては、抗原産生細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される。例えば、抗原提示細胞は、蛍光レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、細胞内カルシウム濃度に対して感受性である蛍光レポータータンパク質（例えば、ＧＣａＭＰ（またはカルシウム濃度のレシオメトリック測定のために蛍光タンパク質と共発現されたＧＣａＭＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ））））を発現するように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持された抗体産生細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗体産生細胞の担持の前に、空洞部内で既に担持された抗原提示細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。他の実施形態では、方法は空のナノバイアルを得るか、または提供する工程を含み、抗原提示細胞および抗体産生細胞は、任意の順序でナノバイアルの空洞部内に担持される。抗体産生細胞は、抗体を産生する任意の細胞である可能性がある。場合によっては、抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、遺伝子組換えされたプロデューサー細胞、またはそれらのあらゆる組合せであり得る。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗体産生細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗体産生細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ｓｓＤＮＡを含み、抗体産生細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆されるか、または標識され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、ナノバイアルは、油中で乳化され得る（１０６）。場合によっては、ナノバイアルは、液滴内に内包され得る（１０６）。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ抗原産生細胞において関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含み得る（１０８、１１０）。いくつかの例では、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む。他の例では、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面で抗原に結合することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する（１１０）。他の実施形態では、１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面でリガンドの抗原への結合に干渉することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する（１０８）。リガンドは、例えば、ナノバイアルの空洞に別々に導入されるアゴニストであってもよく、抗体またはそのフラグメントは、リガンドが（例えば、リガンドに直接結合することによって、または抗原産生細胞上の抗原に結合し、それによって抗原へのリガンドの結合を防止することによって）関心対象のシグナル伝達経路を調節することを阻害または遮断してもよい（１０８）。
任意の温度、時間、培地、緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。インキュベーションすることは、抗原産生細胞の抗原と相互作用する好適な量のリガンドまたはアゴニストを含有する培地または緩衝液条件の使用を含み得る。通常、インキュベートする工程は、抗体産生細胞がナノバイアルの空洞部内への抗体を産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする工程は、抗体産生細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間など）を含み得る。場合によっては、期間は、３時間超（例えば、３時間超、５時間超、１０時間超、１５時間超、または２０時間超以上）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子が使用される他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、またはそれらのあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、方法は、関心対象のシグナル経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出する工程を含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する。例えば、下流のシグナル伝達経路に対する抗体またはそのフラグメントの活性は、抗原産生細胞（レポーター細胞とも称される）における蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）の産生またはレポーター細胞におけるカルシウム濃度依存性蛍光レポータータンパク質の蛍光レベルによって評価することができる。いくつかの実施形態では、方法は、抗原産生細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、抗原産生細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナ
ノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）に基づいて、または蛍光強度のゲート内でナノバイアルを分類する工程を含む。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類する工程はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。例えば、特定の蛍光レベル（例えば、カットオフより上または下）または蛍光レベルの比を有する抗原産生細胞を含有するナノバイアルは、ＦＡＣＳを使用して分類することができる。
様々な態様では、方法は、抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程をさらに含む（１１４）。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るかまたは得た工程、および抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データが下流のシーケンシングデータに関連付けられるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力（例えば、分泌アッセイデータ）を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。特定の一実施形態では、（例えば、シグナル伝達経路の調節に関連する１つ以上のシグナルに基づいて）分類された抗体分泌細胞（例えば、Ｂ細胞）は、細胞表面結合または本明細書で論じるアゴニストもしくはリガンドとの相互作用を介して特定のシグナル伝達経路を調節する、（例えば、重鎖配列および軽鎖配列が対合した）抗体配列を特定するために、（例えば、シーケンシングによって）分析され得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に抗体産生細胞および／または抗原産生細胞を溶解する工程を含む。他の態様では、方法は、シーケンシングの前に、抗体産生細胞の溶解物を（例えば、分泌アッセイが実施され、ナノバイアルが分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために抗体産生細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
様々な態様では、方法は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、抗原産生細胞のｍＲＮＡレベルを、抗体産生細胞からの核酸配列情報と結び付けることを含む。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含み得る。共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、ナノバイアルに関連付けられた１つ以上の固有のオリゴヌクレオチドタグを含み得る（１０４）。いくつかの実施形態では、複数のシグナル伝達経路は、複数の別個の蛍光レポータータンパク質で遺伝子改変された抗原産生細胞、またはそれぞれが異なるシグナル伝達経路に特異的な別個の蛍光レポーターを有する複数の異なる抗原産生細胞を使用することによって、単一のアッセイにおいて（例えば、本明細書で提供される任意の方法によって）調べられ得る。この実施形態では、異なるシグナル伝達経路に関連付けられる異なる転写因子またはプロモーター領域は、蛍光タンパク質のそれぞれをコードする遺伝子の上流に組み込まれ得る。これらの方法で調べることができるシグナル伝達経路の非限定的な例としては、特に、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、Ｅｐｈ／エフリンシグナル伝達経路、Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達経路、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、Ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路または操作されたｓｙｎＮｏｔｃｈシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＴＧＦβシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路が挙げられる。複数のシグナル伝達経路が調べられる場合、ナノバイアルおよび関連細胞を標準的な多色ＦＡＣＳを用いて分類し、例えば、１つの特定のシグナル伝達経路を活性化するが、別のシグナル伝達経路を活性化しない抗体、または１つ以上のシグナル伝達経路を活性化するが、別の１つ以上のシグナル伝達経路を活性化しない抗体（例えば、蛍光タンパク質１については高い蛍光、蛍光タンパク質２については低い蛍光など）を特定することができる。さらに、関心対象の抗原産生細胞は、この実施形態を容易にし、特定の過剰発現細胞表面の抗原と相互作用する抗体にスクリーニング方法を集中させるために、細胞表面で関心対象の抗原を過剰発現するように操作することもできる。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルが抗体産生細胞および抗原産生細胞を含む複数のナノバイアルに上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、異なる抗体を産生する抗体産生細胞（例えば、単一の抗体産生細胞）を含む。そのような方法では、複数のナノバイアルは、関心対象の抗原を標的とする抗体についてスクリーニングすることができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
本明細書に記載されるように、図１２Ａは抗体調節シグナル伝達経路アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。抗原産生細胞および抗体産生細胞は、任意選択でオリゴヌクレオチドバーコード分子を含有し得るナノバイアルに播種される（１０４）。担持された細胞を有するナノバイアルは、抗原産生細胞の抗原と通常相互作用するアゴニスト分子と共に培地に導入される（１０４）。分泌された抗体は、抗原産生細胞の表面の抗原に結合し得るか（１１０）、または通常は抗原産生細胞上の抗原に結合するアゴニストに結合して、アゴニストの結合を防止し得る（１０８）。両方のプロセスにより、抗原産生細胞内のシグナル伝達経路が調節され得る。抗原産生細胞のシグナル伝達経路における遺伝子の発現の変動を測定するために、単一細胞シーケンシングを下流で使用することができる（１１４）。このシグナル伝達経路における遺伝子の発現変化の情報は、各ナノバイアルもしくはナノバイアルを含有する液滴に固有のナノバイアル標識（ＮＬ）または単一細胞標識を含むオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、抗体分泌細胞抗体配列（例えば、重鎖および軽鎖配列情報）に結び付けられ得る（例えば、図１２Ｂ）。ＮＬ標識は、ナノバイアルまたはナノバイアルおよびその中の細胞と連通している別個のビーズに位置してもよい。別個のビーズは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングシステムの一部として使用されるオリゴヌクレオチド結合ビーズであり得る。ＮＬを含むオリゴヌクレオチドバーコードは、ポリＡ末端を介して抗体産生細胞および抗原産生細胞からのｍＲＮＡを捕捉するためのオリゴ－ｄＴ配列（ｄＴ）をさらに含み得る。抗体産生細胞および抗原産生細胞からのｍＲＮＡを、ＮＬに隣接して連結されたｃＤＮＡならびに任意選択でユニバーサル配列および固有の分子インデックス配列を含む他のオリゴヌクレオチド配列に変換するために逆転写が実施される。ｃＤＮＡは、増幅され、例えば、次世代シーケンシングを使用して配列決定される。このように、増幅されたｃＤＮＡに存在する同じナノバイアル標識コードを使用して、抗体産生細胞からの抗体配列を、単一のワークフローにおける抗原産生細胞の遺伝子発現の機能的変化に結び付ける。シーケンシングファイルの下流の分析を使用して、抗原産生細胞におけるシグナル伝達経路の調節の程度に対する異なる抗体配列の効力をランク付けすることができる（図１２Ｂ）。
Ｔ細胞分泌表現型アッセイ
関心対象の抗原に対する機能的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定するための方法が本明細書に提供される。
いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。場合によっては、ナノバイアルは空である（例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を含まない）。その他の場合では、ナノバイアルはＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞（例えば、単一細胞または個々の細胞）を含む。場合によっては、ナノバイアルは、１つより多いＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の細胞）を含み得る。
場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、その上に固定された親和剤で被覆されるか、またはその親和剤を有している。親和剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは親和剤で被覆されず、方法がナノバイアルを親和剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、親和剤は、（例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞によって分泌されたサイトカインに結合し、捕捉するための）サイトカイン捕捉部分である。場合によっては、サイトカイン捕捉部分は、抗サイトカイン抗体、例えば、抗ＩＬ２抗体、抗ＴＮＦ－α抗体、または抗ＩＦＮ－γ抗体である。場合によっては、親和剤は、タンパク質のアプタマーまたは非特異的捕捉表面、例えば、ポリリジン、細胞外マトリックスタンパク質などである。
様々な態様では、方法は、ナノバイアルの空洞部内にＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を担持させる工程をさらに含む。他の実施形態では、方法は、空洞部内に既に担持されたＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を有するナノバイアルを得るか、または提供する工程を含む。場合によっては、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、Ｔ細胞である。場合によっては、ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤を含む。１つ以上の細胞捕捉剤は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得、かつ／またはナノバイアルの多孔性マトリックス内にあり得る。場合によっては、得られるまたは提供されるナノバイアルは細胞捕捉剤で被覆されず、方法がナノバイアルを細胞捕捉剤で被覆する工程を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞もしくはＴＣＲ発現細胞および／または抗原提示細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤としては、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、その表面で関心対象の抗原を発現するか、またはＭＨＣ複合体において抗原を提示する抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗原提示細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤は、抗原提示細胞の表面に存在する標識に結合する。例えば、細胞捕捉剤はビオチンであってもよく、抗原提示細胞は、ストレプトアビジンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、細胞捕捉剤はストレプトアビジンであってもよく、抗原提示細胞は、ビオチンで被覆されるか、または標識されてもよい。別の非限定的な例では、ナノバイアルは、細胞接着ペプチド（例えば、ＲＧＤ）でコーティングされてもよく、またはナノバイアルは、抗原提示細胞が結合し得る細胞外マトリックスタンパク質で被覆されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞捕捉剤はｓｓＤＮＡを含み、抗原提示細胞は、細胞捕捉剤とハイブリダイズする相補的ｓｓＤＮＡで被覆または標識され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、親和性アッセイ法において使用されるナノバイアルは、油中で乳化され得る。場合によっては、ナノバイアルは液滴内に内包され得る。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある。
様々な態様では、方法は、１つ以上のサイトカインが、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含み得る。任意の温度、時間、培地、緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞がナノバイアルの空洞部内へのサイトカインを産生し分泌するのに十分な期間生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする工程は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間など）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を含み得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子を使用する他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、またはそれらのあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、検出剤が１つ以上のサイトカインに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程をさらに含む。場合によっては、検出剤は、１つ以上のサイトカインに特異的な抗体またはそのフラグメントを含み得る。場合によっては、検出剤は、検出可能な標識で直接または間接的に標識され得る。検出可能な標識は、蛍光標識、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ、磁性粒子、またはそれらのあらゆる組合せを含み得る。
様々な態様では、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合された検出剤の量を判定することを含む。一態様では、検出剤は蛍光標識を含み、方法は蛍光のレベルを検出する工程を含み、１つ以上のサイトカインに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルと相関する。別の態様では、検出剤はオリゴヌクレオチド標識を含む。この例では、方法は、オリゴヌクレオチド標識を配列決定する工程をさらに含む。場合によっては、検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）、またはゲート内の蛍光強度に基づいてナノバイアルを分類する工程を含む。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類する工程はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。場合によっては、検出剤が磁性粒子標識を含む場合、サンプルは磁力または磁気活性化セルソーティング（例えば、ＭＡＣＳ）を使用して分類される。
様々な態様では、方法は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程をさらに含む。場合によっては、方法は、分類されたナノバイアルもしくは複数の分類されたナノバイアルを（例えば、上記の方法のうちのいずれかが実施された後に）得るかまたは得た工程、およびＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程（例えば、本明細書に記載される）を含む。方法は、データが下流のシーケンシングデータに関連付けられるように、上記の方法のうちのいずれかに関するデータまたはデータ出力を得るか、または得た工程をさらに含む。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を溶解する工程を含む。別の態様では、方法は、シーケンシングの前に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の溶解物を（例えば、ナノバイアルがサイトカイン分泌アッセイに関連付けられた１つ以上のシグナルに基づいて分類された後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するためにＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
様々な態様では、方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。関連付ける工程は、第１のアッセイ（サイトカイン分泌アッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識を、第２のアッセイ（例えば、シーケンシングアッセイ）に関連付けられた１つ以上のバーコードまたは標識に関連付けることを含み得る。いくつかの実施形態では、関連付ける工程は、共有オリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、ＣＡＲ発現細胞およびＴＣＲ発現細胞由来のＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、検出剤に関連付けられた１つ以上のオリゴヌクレオチド標識の配列のカウントに結び付けることを含む。共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、ナノバイアルに関連付けられた１つ以上の固有のオリゴヌクレオチドタグを含み得る。方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原と機能的と相互作用するＣＡＲまたはＴＣＲを特定することをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルがＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。いくつかの例では、各ナノバイアルは、それぞれが異なるＣＡＲまたはＴＣＲを産生するＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を含む。このような方法では、複数のナノバイアルをスクリーニングして、関心対象の抗原に対する機能的ＣＡＲまたはＴＣＲを特定することができる。他の例では、各ナノバイアルは、それぞれが異なる抗原を発現する抗原提示細胞または抗原産生細胞と、同じＣＡＲもしくはＴＣＲを産生するＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞とを含む。このような方法では、複数のナノバイアルをスクリーニングして、ＣＡＲまたはＴＣＲによって機能的に標的化された抗原（抗原配列）を特定することができる。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
シグナル伝達経路アッセイを調節する薬物または化合物
例えば、図１９Ａに描かれるように、関心対象の細胞内のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、関心対象の標的細胞における標的シグナル伝達経路または標的タンパク質の発現レベルを調節する薬物を発見するためにナノバイアルを使用する方法が本明細書に開示される。
いくつかの態様では、方法は、ナノバイアルを提供するか、または得る工程（または得た工程）であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ナノバイアルの表面への開口部を含み得る。ナノバイアルは、本明細書に記載される任意のナノバイアルであり得る。いくつかの例では、ナノバイアルの空洞部は（ｉ）薬物または化合物、および（ｉｉ）薬物または化合物に関連付けられたバーコードもしくは標識を含む。薬物または化合物としては、小分子、ペプチド、タンパク質、アプタマー、抗体、ガイドＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが挙げられ得る。非限定的な例では、薬物または化合物に関連付けられるバーコードもしくは標識は、薬物バーコード配列を含む固有のオリゴヌクレオチドバーコードであり、薬物または化合物は、固有のオリゴヌクレオチドバーコードに関連付けられる。そのような場合、バーコードまたは標識を決定することにより、バーコードもしくは標識が関連付けられた薬物または化合物を特定することができる。いくつかの例では、固有のオリゴヌクレオチドバーコードは、ポリＴ捕捉領域による捕捉を可能にするポリＡ領域（例えば、３０ｍｅｒのポリＡ領域）を含有する。他の例では、固有のオリゴヌクレオチドバーコードは、関心対象の細胞のｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ捕捉領域を含有する。いくつかの態様では、複数のナノバイアルが提供され、各ナノバイアルは、異なる薬物もしくは化合物、２つ以上の薬物もしくは化合物の組合せ、または固有の量の１つ以上の薬物もしくは化合物、および薬物もしくは化合物、２つ以上の薬物もしくは化合物の組合せ、または固有の量の薬物もしくは化合物に関連付けられた固有のオリゴヌクレオチドバーコード（例えば、薬物バーコード配列）または標識を含有する。場合によっては、薬物もしくは化合物は、（例えば、リンカーの使用によって）ナノバイアルに結合される。場合によっては、リンカーは、ナノバイアルが光（例えばＵＶ光）にさらされる場合、光切断型リンカーが切断され、かつ薬物／化合物がナノバイアルの空洞部内に放出されるように、光切断型リンカーである。他の場合では、リンカーは、温度、ｐＨ、化学物質などによって切断可能なリンカーである。方法は、例えば、薬物／化合物のライブラリー（例えば、ＤＮＡによりコードされたライブラリー）をスクリーニングするために使用されてもよい。
様々な態様では、方法は、ナノバイアルの空洞部内に関心対象の細胞を担持させる工程をさらに含む（１２４）。関心対象の細胞は、ナノバイアルの空洞部の表面に固定され得る。場合によっては、得られるか、または提供されるナノバイアルは、そこに固定された関心対象の細胞を有しておらず、方法がナノバイアルの空洞部の表面に関心対象の細胞を付着させるか、または固定する工程を含む。関心対象の細胞は、平均して、少なくとも関心対象の細胞がナノバイアルの空洞内に担持されるような濃度（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つ以上）でナノバイアルの空洞内に担持され得る。
ナノバイアルの表面は、関心対象の細胞を捕捉し、かつナノバイアルの表面に固定する細胞捕捉部分で被覆され得る。例えば、ナノバイアルの表面は、関心対象の細胞の表面で発現されるタンパク質と相互作用する抗体またはそのフラグメントで被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞接着ペプチド（例えば、ＲＧＤ）で被覆されてもよく、またはナノバイアルは、細胞外マトリックスタンパク質で被覆されてもよい。
通常、これらの実施形態では、関心対象の細胞は（シグナル伝達経路の調節を評価することができるような）生細胞である。関心対象の細胞は、原核細胞または真核細胞である可能性がある。関心対象の細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞である可能性がある。場合によっては、関心対象の細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される。例えば、関心対象の細胞は、蛍光レポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、細胞内カルシウム濃度に対して感受性である蛍光レポータータンパク質（例えば、ＧＣａＭＰ（またはカルシウム濃度のレシオメトリック測定のために蛍光タンパク質と共発現されたＧＣａＭＰ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ））））を発現するように遺伝子操作され得る。
任意選択で、方法は、ナノバイアルを内包するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部を遮断する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルの空洞部の開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために１つ以上の遮断粒子を添加する工程を含み得る（例えば、図１７（１２０、１２２））。いくつかの例では、ナノバイアルは、油中で乳化され得る（１２６）。場合によっては、ナノバイアルは、液滴内に内包され得る（１２６）。場合によっては、ナノバイアルは、小さな開口部を有する空洞部を含み得る（１１８）。あるいは、ナノバイアルは内包されない場合がある。
方法は、薬物または前記化合物が関心対象の細胞と相互作用するように、ナノバイアルの空洞部内の液体容量へ薬物または化合物を放出するためにナノバイアルを刺激にさらす工程をさらに含み得る。刺激は、例えば、ｐＨ変化、温度変化、化学物質の添加、光（例えば、ＵＶ光）への暴露などであり得る。薬物または化合物をナノバイアルの空洞内に放出するために使用される刺激は、薬物または化合物をナノバイアルに付着させるために使用される切断型リンカーの種類に基づいて選択されることを理解されたい。
様々な態様では、方法は、薬物または化合物が関心対象の細胞において関心対象のシグナル伝達経路を調節するようにナノバイアルをインキュベートする工程をさらに含み得る（１３２、１３０）。いくつかの例では、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む。他の例では、関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む。
任意の温度、時間、培地、緩衝液条件などを含む、ナノバイアルをインキュベートするための任意の好適な条件が使用され得る。通常、インキュベートする工程は、シグナル伝達経路の調節または遺伝子発現の変化が起こるのに十分な期間、関心対象の細胞が生存可能なままであるような条件下でインキュベートすることを含む。場合によっては、インキュベートする工程は、関心対象の細胞を一定期間インキュベートすることを含み得る。いくつかの例では、期間は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間など）を含み得る。場合によっては、期間は、３時間超（例えば、３時間超、５時間超、１０時間超、１５時間超、または２０時間超以上）を含み得る。場合によっては、期間は最大で２４時間を得る。
様々な態様では、方法は、乳化されたナノバイアルを水相に移して、それにより乳化油被膜を除去する工程をさらに含み得る。場合によっては、その後、検出剤をナノバイアルの空洞部に添加する前に水相ナノバイアルが洗浄され得る。遮断粒子が使用される他の実施形態では、方法は、洗浄、こし取り、物理的破壊、化学的破壊、浮力、磁力、またはそれらのあらゆる組合せによって、過剰な遮断粒子を除去する工程をさらに含み得る。
様々な態様では、方法は、関心対象のシグナル経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出する工程を含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する。例えば、下流のシグナル伝達経路に対する薬物または化合物の活性は、関心対象の細胞（レポーター細胞とも称される）における蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）の産生またはレポーター細胞におけるカルシウム濃度依存性蛍光レポータータンパク質の蛍光レベルによって評価され得る。いくつかの実施形態では、方法は、関心対象の細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、関心対象の細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む。場合によっては、方法は、蛍光のレベル（例えば、バックグラウンドレベルを上回る）、またはゲートの蛍光強度に基づいてナノバイアルを分類する工程を含む。分類する工程は、蛍光シグナルに基づいて粒子、液滴、および／または細胞を分類するために典型的に使用される任意の分類方法であり得る。非限定的な例では、分類する工程はフローベースの分類方法（例えば、ＦＡＣＳ）である。例えば、特定の蛍光レベル（例えば、カットオフより上または下）または蛍光レベルの比を有する関心対象の細胞を含有するナノバイアルは、ＦＡＣＳを使用して分類することができる。
様々な態様では、方法は、バーコードまたは標識を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、（ｆ）の関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、関心対象の細胞のｍＲＮＡレベルを、薬物または化合物に結び付けることを含む。
いくつかの実施形態では、関連付ける工程は、薬物または化合物に関連付けられた固有のオリゴヌクレオチドバーコードおよび関心対象の細胞によって発現されたｍＲＮＡについての配列情報から配列情報を特定すること、およびこの配列情報を結び付けることを含む。他の実施形態では、関連付ける工程は、薬物または化合物に関連付けられた固有のオリゴヌクレオチドバーコードおよび関心対象の細胞によって発現された蛍光レポーターシグナルから配列情報を特定すること、およびこの情報を結び付けることを含む。
様々な態様では、方法は、関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する工程をさらに含み得る。一実施形態では、方法は、対照細胞と比較して、または薬物もしくは化合物への曝露なしの関心対象の細胞と比較して、関心対象の細胞によって発現されるｍＲＮＡに対して有意な効果を有する薬物または化合物を特定する工程を含む。
様々な態様では、方法は、関心対象の細胞から由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程をさらに含む。方法は、薬物または化合物に関連付けられたオリゴヌクレオチドバーコードもしくは標識を配列決定する工程をさらに含み得る。任意の既知のシーケンシング技術が、本明細書に提供される方法において使用するのに好適であり得る。例えば、シーケンシングは、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング、第３世代シーケンシング（例えば、ロングリードシーケンシング）、単一細胞シーケンシング（例えば、単一細胞ｍＲＮＡシーケンシング）などを含み得る。
一態様では、方法は、シーケンシングの前に、関心対象の細胞を溶解する工程を含む。別の態様では、方法は、シーケンシングの前に、関心対象の細胞の溶解物を（例えば、薬物または化合物が関心対象の細胞に作用した後に）得るか、または得た工程を含む。いくつかの例では、方法は、ｃＤＮＡを生成するために関心対象の細胞から放出されるｍＲＮＡを逆転写して、その後ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。
様々な態様では、方法はナノバイアルを洗浄する工程をさらに含み得る。任意の好適な洗浄溶液または洗浄緩衝液を含む、任意の好適な洗浄方法が使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、各ナノバイアルがバーコードまたは標識に関連付けられた異なる薬物もしくは化合物を含む複数のナノバイアルに、上記の方法のうちいずれかを実施する工程を含む。そのような方法では、複数の異なる薬物または化合物は、関心対象の細胞に対する活性についてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、各ナノバイアルは、同じ薬物または化合物を異なる量で有し、その量に関連付けられたバーコードまたは標識を有する。いくつかの実施形態では、各ナノバイアルは、バーコードまたは標識に関連付けられた様々な量で２つ以上の薬物の組合せを有する。複数のナノバイアルは、限定されないが、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも６０，０００、少なくとも７０，０００、少なくとも８０，０００、少なくとも９０，０００、または少なくとも１００，０００以上のナノバイアルを含み得る。
本明細書に記載されるように、図１９Ａは薬物または化合物によって調節されたシグナル伝達経路アッセイのワークフローの非限定的な例を描く。ナノバイアルは、それに関連付けられた固有のバーコードもしくは標識を有する薬物または化合物を含んで、提供されるか、または得られる（１２４）。薬物または化合物は、例えば、切断型リンカー（例えば、光切断型リンカー）の使用によりナノバイアルの空洞部内に付着され得る（１２４）。ナノバイアルは、ナノバイアル関連付けバーコードまたは標識（例えば、オリゴバーコード）をさらに含み得る（１２４）。関心対象の細胞は、ナノバイアルの空洞部内に播種され得る（１２４）。任意選択で、ナノバイアルは乳化され得る（１２６）。担持された細胞を有するナノバイアルは、切断型リンカーを切断し、かつ薬物または化合物をナノバイアルの空洞部内に放出するために刺激（例えば、ＵＶ光）にさらされる（１２８）。その後、ナノバイアルは、薬物または化合物が関心対象の細胞に作用し（例えば、シグナル伝達経路を調節するために）、関心対象の細胞がレポータータンパク質を発現するか、またはｍＲＮＡ発現変化を受けるような適切な条件（例えば、十分な温度、時間、ｐＨなど）下でインキュベートされる。薬物または化合物は、シグナル伝達経路が調節されるように関心対象の細胞に作用し得る（１３０）。さらに、または代わりに、薬物または化合物は、関心対象の細胞がナノバイアルの空洞部内へ生体分子を分泌し、その後、親和剤でナノバイアルに捕捉され得るように、関心対象の細胞に作用し得る（１３２）。この実施形態では、（例えば、全体にわたって記載されるように）親和剤への分泌された生体分子の結合に関連付けられた１つ以上のシグナルを検出するために検出剤が添加され得る（１３４）。その後、ナノバイアルは、フローベースの分類方法またはシーケンシング方法を含む、本明細書で提供される任意の方法を使用して調べられる場合がある（１３６）。図１９Ｂは、これらの実施形態において使用され得るオリゴヌクレオチドバーコード、およびナノバイアルまたはナノバイアルに関連付けられたビーズに付着した捕捉されたオリゴ（ｄＴ）配列から生じるｃＤＮＡへの逆転写後の、連続するｃＤＮＡのシーケンシングによる情報の結び付けの非限定的な例を示す。関心対象の細胞からのｍＲＮＡレベルおよび薬物または化合物は、薬物に関連付けられた固有のバーコード（薬物バーコード配列、ＤＢＣ）ならびにナノバイアル標識（ＮＬ１）によって関連付けられてもよく、これは、産生されたｃＤＮＡ中の連続配列の一部である。あるいは、関心対象の細胞からのｍＲＮＡレベルおよび薬物または化合物は、区画中のナノバイアルに関連付けられたビーズに存在するナノバイアル標識（ＮＬ１）を介して関連付けられ、ＮＬ１およびＤＢＣならびにＮＬ１および関心対象の細胞からのシグナル伝達経路ｃＲＮＡを含有する連続したｃＤＮＡをもたらし得る。関心対象の細胞からの分泌物は、固有のオリゴ（分泌配列）を同じＤＢＣおよび／またはＮＬ１配列に隣接して結び付けることによって、薬物または化合物に関連付けられ得る。
ナノバイアルの浮力濃縮
例えば、図５に描かれるように、１つ以上の細胞、１つ以上のビーズ、またはその両方を含むナノバイアルを濃縮する方法が本明細書に提供される。場合によっては、方法は以下の工程のうち１つ以上を含む：（ａ）それぞれがナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方、および（ｉ）複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、複数のナノバイアルを含む混合物を提供するか、または得る工程と、（ｂ）混合物を溶液中で懸濁する工程と、（ｃ）少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）の複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両方とは別のナノバイアルの空洞部内に配置されるように、溶液の密度を調整する工程と、（ｄ）ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルを収集する工程。
いくつかの実施形態では、調製する工程は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より大きな有効密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む（１０、１４）。いくつかの例では、溶液の密度は、溶液が空のナノバイアルの密度より大きな密度を含み得るように、調節され得る（１０）。あるいは、溶液の密度は、溶液の密度が空のナノバイアルの密度未満になり得るように、調節され得る（１４）。場合によっては、調製する工程は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より低い有効密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む（１２、１６）。いくつかの例では、溶液の密度は、溶液が空のナノバイアルの密度より大きな密度を含み得るように、調節され得る（１６）。あるいは、溶液の密度は、溶液の密度が空のナノバイアルの密度未満になり得るように、調節され得る（１２）。場合によっては、ナノバイアルを濃縮する方法は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルをさらに濃縮するために、（ａ）～（ｄ）の工程を１回以上実施する工程を含み得る。いくつかの例では、溶液の密度は、工程（ａ）～（ｄ）の各ラウンドで異なる密度を含み得る。いくつかの例では、ナノバイアルを濃縮する方法は、（ａ）の工程の前に、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、あるいは（ｉｉ）の複数の空のナノバイアルを除去する工程をさらに含み得る。
溶液の密度は、例えばＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、グリセロール、ＰＥＧ、Ｄｅｘｔｒａｎ、ヒアルロン酸などの生体適合性水溶性添加剤を使用して調節されてもよい。さらにあるいは代わりに、細胞の密度は、例えば、溶液のモル浸透圧濃度を調節することによって、調節されてもよい。例えば、（通常の生理的リン酸緩衝生理食塩水と比較して）低浸透圧溶液の使用によって、細胞が膨潤することができ、その密度が減少される。さらにあるいは代わりに、ナノバイアルの密度が調節され得る。例えば、ナノバイアルの密度は、前駆体溶液中で使用されるＰＥＧの濃度を増加させるか、より低分子量のＰＥＧ分子（例えば５ｋＤの４－ａｒｍ ＰＥＧ）の使用によって架橋密度を増加させるか、ナノバイアルマトリックス中または表面のより高密度のマイクロ粒子またはナノ粒子（例えばＳｉＯ２微粒子／ナノ粒子、酸化鉄微粒子／ナノ粒子など）を埋め込むか付着させるかによって増加されることができる。同様に、ナノバイアルの密度は、例えば、ＰＥＧ前駆体溶液の濃度を減少するか、前駆体高分子の分子量を増加させるか、より低密度のマイクロ粒子／ナノ粒子（例えば、浮力活性化セルソーティング用ガラス気泡粒子）を埋め込むか付着させるかによって減少されることができる。また、ナノバイアルに付着している細胞は、細胞を含まないナノバイアルと比較して、細胞を含有しているナノバイアルの有効密度を調節するための細胞特異的な親和性タグを含む、ガラス、ポリマー、酸化鉄、または金属粒子（例えば、直径１００ｎｍ～約３μｍ）などの粒子で標識されてもよい。細胞に対するナノバイアルの有効密度は、細胞膜には非透過性であるがナノバイアルマトリックスに拡散することができる、より高（またはより低）密度の添加剤を使用することで調節されてもよい。
図５は、本明細書に提供されるように、ナノバイアルの浮力濃縮の非限定的な例を描く。図５は、密度整合および浮力を利用する様々な細胞およびナノバイアル亜集団の濃縮のための一般的な原理を概説する。この例では、規定された分子量および密度特性の濃縮溶液が、ナノバイアル、細胞、および／または結合した細胞を有するナノバイアルのサンプルに添加される（頂部）。細胞と比較してナノバイアルおよび濃縮溶液の密度を調整することによって、空のナノバイアルと比較して細胞を有するナノバイアルを濃縮することができる（１０、１２）。他の実施形態では、細胞を有するナノバイアルは、遊離細胞と比較して濃縮される（１４、１６）。他の実施形態では、複数の濃縮工程が、関心対象の亜集団をさらに濃縮するために連続的に行われる。
ナノバイアル空洞部における生体分子の捕捉の増強のための方法
いくつかの実施形態では、本開示は、生物学的薬剤がナノバイアルの空洞から拡散するのを防止する方法を提供する。場合によっては、生物学的薬剤がナノバイアルの空洞部から拡散するのを防止する方法は、以下の工程を含み得る：（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成されるとともにナノバイアルの表面への開口部を含む空洞部、および空洞部内に配置された１つ以上の生物学的薬剤を含む、工程と、（ｂ）遮断粒子が空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小するように遮断粒子を添加する工程であって、それによって、ナノバイアルが流体中に配置されたときに生物学的薬剤が空洞部から拡散するのを防止する、工程。場合によっては、本明細書中に記載されるような遮断粒子を使用する方法は、全体にわたって記載されるように、エマルジョンまたは内包の工程の代替として使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、遮断粒子の最大直径は、ナノバイアルの空洞部の開口部より大きな直径を含み得る。いくつかの例では、遮断粒子の形状は、球状または実質的に球状であってもよい。いくつかの実施形態では、遮断粒子は、ナノバイアルの空洞部の開口部に接してもよい。場合によっては、遮断粒子は、ナノバイアルの空洞部の開口部を囲んでもよい。いくつかの例では、遮断粒子は、工程（ｂ）の後、空洞部の容量の５０％超を維持するようにサイズ設定され得る。
遮断粒子は、ナノバイアル空洞の開口部のサイズに応じて、約１５～約１００マイクロメートルの範囲の平均直径を有し得る。遮断粒子は、少なくとも約１５μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約２５μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約３５μｍ、少なくとも約４０μｍ、少なくとも約４５μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約５５μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約６５μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約７５μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約８５μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約９５μｍ、または少なくとも約１００μｍの平均直径を有してもよい。遮断粒子は、最大約１５μｍ、最大約２０μｍ、最大約２５μｍ、最大約３０μｍ、最大約３５μｍ、最大約４０μｍ、最大約４５μｍ、最大約５０μｍ、最大約５５μｍ、最大約６０μｍ、最大約６５μｍ、最大約７０μｍ、最大約７５μｍ、最大約８０μｍ、最大約８５μｍ、最大約９０μｍ、最大約９５μｍ、または最大約１００μｍの平均直径を有してもよい。遮断粒子は、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、または１００μｍの平均直径を有してもよい。好ましい実施形態では、遮断粒子は、約２０マイクロメートル～約５０マイクロメートルの平均直径を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、遮断粒子はポリマーヒドロゲルを含んでもよい。場合によっては、ヒドロゲルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。いくつかの例では、複数の遮断粒子は、ＰＥＧ、ポリスチレン、ポリ－メタクリル酸メチル、ガラス、および金属からなる群から選択されるポリマーで構成され得る。
いくつかの実施形態では、遮断粒子は、例えば、過剰な分子を捕捉し、隣接するナノバイアルへのクロストークを防止するために、ナノバイアル内に含有される細胞から放出される生体分子に対する結合部分を有してもよい。いくつかの例では、遮断粒子は、ナノバイアルに結合する接着分子で被覆され得る。いくつかの例では、遮断粒子は、１つ以上の親和剤で被覆され得る。場合によっては、１つ以上の親和剤は抗体捕捉部分を含み得る。いくつかの例では、抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群から選択され得る。場合によっては、１つ以上の親和剤は抗原を含み得る。いくつかの例では、１つ以上の親和剤は核酸を含み得る。場合によっては、核酸は、図１２Ｂおよび図１９Ｂのビーズに見出されるように、オリゴヌクレオチドタグまたはオリゴヌクレオチドバーコードを含み得る。
いくつかの実施形態では、遮断粒子および／またはナノバイアルは、メッシュ様構造を含み得る（１２２）。場合によっては、メッシュ様構造は平均孔径を含み得る。いくつかの例では、平均孔径は所望のサイズを有する生物学的薬剤が空洞部内で保持され、かつ所望のサイズより小さなサイズを有する生物学的薬剤が遮断粒子および／またはナノバイアルを介して拡散できるようにサイズ設定され得る。場合によっては、平均孔径は、ナノバイアルの空洞部内への流体および試薬の輸送が可能となるようにサイズ設定され得る。いくつかの例では、流体および試薬は、染色剤、界面活性剤、洗浄剤、溶解緩衝液、薬物、サイトカイン、ケモカイン、プライマー、ポリメラーゼ、培地、馴化培地、および緩衝液からなる群から選択され得る。場合によっては、平均孔径は、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを保持するようにサイズ設定され得る。
いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、図１７で見出されるように、複数の遮断粒子が空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小す得るように、複数の遮断粒子を添加する工程（１２４）を含み得る。場合によっては、複数の遮断粒子のそれぞれは、約２マイクロメートル～約２０マイクロメートルの平均直径を含み得る。いくつかの例では、複数の遮断粒子のそれぞれは、室温の生理食塩水よりも大きい密度を含み得る。場合によっては、遮断粒子対ナノバイアルの数は、１００：１より大きくてもよい。
多数の機器およびマイクロ流体デバイスを用いてナノバイアルを使用する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器に適合するとともに機器に使用されるように構成された、サイズ、形状、界面化学、および／または密度を有する、ナノバイアルを提供する。場合によっては、粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器は、フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、イメージングフローサイトメーター、画像活性化セルソーター、コールターカウンター、パーティクルカウンター、マイクロ流体液滴生成器、マイクロウェルアレイ、マイクロバルブを備えるマイクロ流体チップ、マイクロ流体ＳｌｉｐＣｈｉｐ、光流体マイクロデバイス、マイクロ流体液滴生成器、およびマイクロ流体チャネルからなる群から選択され得る。いくつかの例では、ナノバイアルのサイズは、直径約１００μｍ未満（例えば、約９５μｍ未満、約８０μｍ未満、約７５μｍ未満、約７０μｍ未満、約６５μｍ未満、またはそれ以下）であり得る。場合によっては、ナノバイアルは、キャッピングされた反応性官能基を含む。場合によっては、ナノバイアルのサイズは、６０μｍ未満（例えば、約５５μｍ未満、約５０μｍ未満、約４５μｍ未満、約４０μｍ未満、またはそれ以下）であり得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、ガラス毛細管、キュベット、および／またはマイクロ流体チャネルを通って流されるように構成され得る。場合によっては、ナノバイアルは、光励起、電気励起、および／または磁気励起によって分析されるように構成され得る。場合によっては、ナノバイアルのサイズ、界面化学、および／または浮力は、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずにナノバイアルが機器を通って迅速に流れることができるようなものであり得る。いくつかの例では、ナノバイアルは、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずに、１０ｃｍ／秒超、または１ｍ／秒超で機器を通って流れ得る。場合によっては、ナノバイアルは、９０μｍより大きい直径を有するチャネルを通って流れるように構成され得る。いくつかの実施形態では、ナノバイアルは、粒子および／または細胞を分析するように設計された第１の機器、ならびにその後粒子および／または細胞を分析するように設計された第２の機器と共に使用されるように構成される。いくつかの実施形態では、ナノバイアルは、蛍光活性化セルソーター、画像活性化セルソーター、または光流体マイクロデバイスによって分類され、その後マイクロ流体液滴生成器に導入されるように構成される。
ナノバイアル
本明細書に記載される方法およびシステムのいずれかに使用するためのナノバイアルが本明細書に提供される。本明細書に一般に使用されるような用語「ナノバイアル」は、細胞および分子を保持するために使用することができる空洞部または空間を有するマイクロスケールの粒子を指す。空間または空洞部は、ナノバイアルの外部表面に接するか、連通するか、または開口する。本明細書で説明されるように、空間または空洞部は、球体の形状をとった、差し引かれた空間または空洞部として形成されてもよく、図５、図６Ｂ、図８、図９、図１０、図１１、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１５Ａ、図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１７、または図１９Ａのいずれか１つに例示されるものなどの三日月形断面を有する最終的なナノバイアルが作成される。内接空隙または内接空洞は、流体充填のための経路（また、細胞、ビーズ、および他の微小物体へのアクセスも可能である）を作成するために、その表面で球状または楕円形エンベロープと交差する。１つの好ましい態様では、空隙または空洞は、狭い開口部（例えば、ナノバイアルの球形または楕円形エンベロープの実際の表面積の低い割合）で球形または楕円形エンベロープと交差する。いくつかの実施形態では、開口部によって画定されるこの部分領域は、ナノバイアルの全体的な球形／楕円形エンベロープまたは表面積の＜３３％であり、他の実施形態では＜１０％であり、さらなる実施形態では、部分領域は＜５％である。いくつかの実施形態では、ナノバイアルの表面は、親和性作用物質、捕捉作用物質、核酸、ペプチド、タンパク質、フルオロフォア、標識、バーコード、粒子、細胞等を会合させるように、１つ以上の反応性または結合部分で装飾されてもよい。例えば、反応性部分または結合部分は、空隙または空洞内のナノビアの表面に形成され得る。結合部分または反応性部分は、例として、核酸、ペプチド、細胞接着ペプチド、触媒、酵素、抗体、プライマー、抗原、アプタマー、フルオロフォア、ビオチン、またはビオチン／ストレプトアビジン複合体を含み得る。当業者に公知の直交反応性化学もまた、ナノバイアルへの反応性部分または結合部分のコンジュゲーションのために使用され得る。ナノバイアルの製作は、手順に従い、例えば、Ｗ０２０２００３７２１４Ａ１に示されている前述のマイクロ流体デバイス設計を使用することができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。ナノバイアルは、Ｗ０２０２００３７２１４Ａ１に開示されるように、ドロップキャリア粒子とも称され得る。ナノバイアルを製造するために、マイクロ流体液滴発生器デバイスを使用して、油相中に単分散エマルジョンを形成し、それによって内部分散相が水性二相系を含む。水性二相系の一部は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体などの架橋性ヒドロゲル前駆体である。水性二相系の他の部分は、デキストランまたはゼラチンなどのポリマーである。その後、水性二相系の二相は、形成された液滴内の別個の領域に分離する。その後、二相系の一成分（すなわち、架橋性成分）が架橋されてナノバイアルが形成される。図１および図２は、それぞれ、４０マイクロメートル直径および６０マイクロメートル直径のナノバイアルについて、様々な設定の出力／強度および洗浄でＵＶ光で架橋する前の相分離液滴および架橋した後に形成されたナノバイアルを示す。好ましい実施形態では、水性二相系は、架橋性成分であるＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体（例えば、１０ｋＤａの４－ａｒｍ ＰＥＧ－ノルボルネン）（架橋剤を使用する）および架橋されていないデキストラン（例えば、４０ｋＤａ）を含む。マイクロ流体液滴生成器デバイスは、油相内の水性二相系のエマルジョンを生成するために使用される。２つの水相成分（例えば、ＰＥＧおよびデキストラン）を含有する液滴は、相分離操作における液滴形成後に分離する。相分離後、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体成分を架橋してゲルにする。例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体成分内の光開始剤（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９、ＬＡＰなど）の存在下でのジオチオスレイトール（ＤＴＴ）などの架橋剤を次いで光曝露（例えば、ＵＶ励起）に供して架橋を開始する。当然ながら、システイン含有ペプチドまたは他のジチオールまたはマルチアーム架橋剤などの他の架橋剤も使用することができる。関連する実施形態では、ＰＥＧおよび／またはポリマー相のいずれかは、光開始剤および架橋剤の一方または両方の組合せを含有することができる。ナノバイアルは、ビオチン、カルボン酸、アミン、オリゴヌクレオチド、および製造プロセス中の例えばビオチン－ＰＥＧ－チオール、カルボン酸－ＰＥＧ－チオール、アミン－ＰＥＧ－チオール、オリゴヌクレオチド－チオールなどの添加による共有結合性バイオコンジュゲーション反応または非共有結合性会合反応のための当技術分野で公知の他の官能基を含むように修飾することができる。官能基に結合されたＰＥＧは、ナノバイアル表面上の官能基のアクセス可能性を増加させるために使用され得る。その後、ナノバイアルは、例えば、ビオチンコンジュゲートナノバイアルへのストレプトアビジンの結合を介して、さらなる化学でコンジュゲートされ得る。これは、ナノバイアルを蛍光的に可視化すること（図３）、および／または本明細書に記載されるような親和性作用物質もしくは細胞捕捉作用物質に結合することに役立ち得る。架橋後、ナノバイアルを洗浄して油相およびデキストラン相を除去することができる。いくつかの実施形態では、ナノバイアルは架橋ヒドロゲルを含む。架橋ヒドロゲルは、ＰＥＧ系架橋ヒドロゲルであってもよい。いくつかの実施形態では、ナノバイアルの空洞は、その中に配置された水性流体を含む。いくつかの実施形態では、ナノバイアルは油相中に懸濁される。いくつかの実施形態では、ナノバイアルの空洞は、約１００ｆＬ～約１０ｎＬの容量を有する。いくつかの実施形態では、ナノバイアルの空洞は、約５μｍ～約２５０μｍの長さ寸法を有する。本明細書に説明されるように、油相中に懸濁された水溶液（例えば、乳化）とともにナノバイアルを使用する実施形態では、ナノバイアルを含有するエマルジョンの形成は、Ｗ０２０２００３７２１４Ａ１に示されるように、水相中のナノバイアルの懸濁液を油（および任意選択の界面活性剤）と組み合わせて、混合（例えば、ボルテックス、ピペッティングなどによる）することによって達成される。撹拌および混合からの流体力学的剪断は、減少するサイズのエマルジョンを生成する。撹拌を継続した後、液滴内に含有されるナノバイアルは、液滴のさらなる収縮を防止するサイズ抑制剤として作用する。ピペッティングおよびボルテックスの両方を使用して、油相中にナノバイアルを内包することができる。ピペッティングおよびボルテックスの両方を使用して、油相中にナノバイアルを封入することができる。均一のナノバイアルエマルジョンの一実施形態では、実質的に全てのナノバイアル含有液滴（例えば、＞９５％、＞９９％、または＞９９．９％）は、それぞれ単一のナノバイアルと関連付けられる。それらの独特のサイズ範囲に起因して、ナノバイアルは、標準的な濾過技術を使用して、周囲のより小さいサテライト液滴（例えば、乳化中に生成されるバックグラウンド液滴）から容易に濾過され得る。
システム
いくつかの実施形態において、本開示の態様は、ナノバイアルの分析および分類のシステムおよびソフトウェアを提供する。場合によっては、システムおよびソフトウェアは、ナノバイアルを分析および分類することができる統合された機器（例えば、フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、またはそれらのあらゆる組合せ）を備えてもよい。場合によっては、システムは、ナノバイアルの容器またはパッケージ上に存在するバーコードまたはＱＲコードを読み取り、分析するためのスキャナーまたはリーダーを含み得る。場合によっては、バーコードまたはＱＲコードは、ナノバイアルのサイズ、形状、材料、密度、またはそれらのあらゆる組合せに関する情報を含み得る。場合によっては、バーコードまたはＱＲコードは、ナノバイアルの分析を最適化するために、統合された機器（例えば、フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、またはそれらのあらゆる組合せ）のための設定を提供し得る。いくつかの実施形態では、バーコードまたはＱＲコードを読み取り、分析することができるスキャナーまたはリーダーは、スマートフォンを含み得る。場合によっては、スマートフォンは、統合された機器と無線周波数、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＷｉＦＩ、またはそれらのあらゆる組合せで通信することができるアプリを含み得る。
いくつかの実施形態では、統合された機器は、統合された機器の物理的またはクラウドベースのメモリまたはサーバー上に含まれる機械可読命令、またはソフトウェアを含み得る。ソフトウェアは、本明細書で先に記載されるバーコードまたはＱＲコードをスキャンして得られたナノバイアルアッセイに特有の分析を実行するように構成された機械可読命令を含み得る。場合によっては、ソフトウェアは、ナノバイアルイベントの自動ゲーティングを実行するための機械実行可能命令を提供することができる。ソフトウェアは、散乱および蛍光強度データに基づいて細胞を含むナノバイアルの自動ゲーティングを実行するための機械実行可能命令を含み得る。ソフトウェアは、ヒストグラムおよび／または寸法縮小プロット（例えば、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法、ＶｉＳＮＥプロット、またはそれらの組み合わせによる視覚化）の形態で、収集されたナノバイアルデータを解析し、そのグラフィカルな解釈を生成することができる。
いくつかの実施形態では、統合された機器は、インターネットまたはネットワークに接続することができる。いくつかの例では、ソフトウェアは、ナノバイアル分析データをクラウド内のサーバーにアップロードしてもよく、またはクラウド内のサーバーからデータを検索することができる。場合によっては、ソフトウェアは、クラウド（例えば、クラウドコンピューティング）においてオフライン計算を行うことができる。場合によっては、統合された機器は、サーバに接続し、機器設定をすぐに更新することができる。場合によっては、１人以上のユーザーは、ナノバイアルの分析を行う１人以上のユーザーがインターネットを介してアクセスすることができる機器設定をクラウドにアップロードしてもよい。いくつかの例では、ネットワーク接続された統合された機器は、バーコードまたはＱＲコードがスキャンされているネットワーク情報に基づいて地理的位置または他の位置を報告し、この情報をローカルサーバーまたはクラウドベースのサーバー上に、匿名化された形で保存することができる。
他に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての専門用語、表記、その他の技術的および科学的な用語は、主張された主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語が、明確化のため、および／または、すぐに参照できるように本明細書に定義されており、そのような定義を本明細書に含めることは、必ずしも、当該技術分野で一般に理解されているものと実質的に異なることを示すと解釈されてはならない。
本出願の全体にわたって、様々な実施形態が範囲フォーマット（ｒａｎｇｅ ｆｏｒｍａｔ）で提示されてもよい。範囲の形式における記載は単に利便性と簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する確固たる制限として解釈されるべきでないことを、理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲、同様にその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものであると考慮されなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６といった、具体的に開示された部分範囲、同様に、例えば、１、２、３、４、５、および６といった範囲内にある個々の数字を有するものとして考慮されなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、複数形の言及を含む。例えば、「サンプル」という用語は、複数の試料を含み、その混合物も含む。
「判定すること」、「測定すること」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること」、および「分析すること」は、測定の形態を参照するために、本明細書においてしばしば互換可能に使用される。上記用語は、要素が存在するかどうかを決定することを含む（例えば、検出）。このような用語は、定量的、定性的、または定量的かつ定性的な決定を含み得る。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「～の存在を検出すること」は、あるものが文脈次第で存在するか存在しないかを決定することに加えて、存在するあるものの量を決定することを含み得る。
「対象」、「個体」、または「患者」という用語はしばしば、本明細書で互換的に使用される。「対象」は、発現した遺伝物質を含有する生物学的実体であり得る。生物学的実体は、例えば、細菌、ウイルス、真菌類、および原生動物を含む、植物、動物、または微生物であり得る。対象は、ｉｎ ｖｉｖｏで得られたか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞、およびそれらの子孫であり得る。対象は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。対象は、疾患について高いリスクがあると診断されるか、またはそうであると疑われる得る。場合によっては、対象は必ずしも、疾患について高いリスクがあると診断されることも、またはそうであると疑われることもない。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する様々な免疫グロブリン、ならびに、二重特異性抗体、ＢｉＴＥ抗体、ＤＡＲＴ、ＦＡｂフラグメント、ミニボディ、ナノボディ、多価ナノボディ、半減期延長ナノボディ、ｓｃＦｖ、重鎖抗体、アフィボディなどの操作された免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントであるシュシュの免疫グロブリンクラスについて記載する。「抗体」という用語は、ヒト、マウス、ラマ、ウサギ、ヤギ、ラット、ニワトリ、サル、ロバなど由来、ならびに、ヒト化マウスまたは他の種由来の免疫グロブリンおよび操作された免疫グロブリンを指す。
「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、対象の身体の外で生じる事象を説明するために使用される。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイは、対象に対して実施されない。むしろ、アッセイは、対象とは別個のサンプルに対して行われる。サンプルに対し行われるｅｘ ｖｉｖｏの一例として、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」アッセイが挙げられる。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、物質が得られる生物学的供給源から実験用試薬が分離されるように、実験用試薬を保持するための容器内で生じる事象を説明するために使用される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、生細胞または死細胞が用いられる細胞ベースのアッセイを包含し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはまた、インタクトな細胞が用いられていない無細胞アッセイを包含し得る。
本明細書で使用される場合、「約」という用語が付く数字は、その数字のプラスまたはマイナス１０％の数字を指す。「約」という用語が付く範囲は、その最低値のマイナス１０％と、その最大値のプラス１０％の範囲を指す。
絶対的な意味を持つ用語や順序を示す用語、例えば「するだろう（ｗｉｌｌ）」、「しないだろう（ｗｉｌｌ ｎｏｔ）」、「すべきである（ｓｈａｌｌ）」、「すべきでない（ｓｈａｌｌ ｎｏｔ）」、「しなければならない（ｍｕｓｔ）」、「してはならない（ｍｕｓｔ ｎｏｔ）」、「第１に」、「最初に」、「次に」、「その後」、「前に」、「後に」、「最後に」、および「最終的に」の使用は、本明細書に開示される本実施形態の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的なものである。
本明細書に記載のいずれのシステム、方法、ソフトウェア、組成物、およびプラットフォームは、モジュール式であり、順序工程に限定されていない。よって、「第１」および「第２」などの用語は、必ずしも優先順序、重要順序または動作順序を意味していない。
本明細書に使用される段落の見出しは、構成上の目的のために過ぎず、記載される主題を制限すると解釈されてはならない。
番号付けした実施形態
以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組合せの非限定的な順列を詳述する。特徴の組合せのその他の順列も考慮される。特に、これらの番号を付けた実施形態のそれぞれは、列挙されるような順序とは無関係に、前述のまたは以下の番号を付けた実施形態に従属または関連するものとして、考慮される。
実施形態１：関心対象の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントを特定する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）検出剤が１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程と、（ｅ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、（ｇ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程とを含む、方法。
実施形態２：（ｆ）の前に、抗体への検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態３：ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、実施形態３に記載の方法。
実施形態５：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞の表面に存在する標識に結合する、実施形態３に記載の方法。
実施形態６：標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである、実施形態５に記載の方法。
実施例７：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞が結合することのできる抗原である、実施形態３に記載の方法。
実施形態８：親和剤は抗体捕捉部分である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９：抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群から選択される、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０：親和剤は、関心対象の抗原である、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１：親和剤は、その表面で関心対象の抗原を発現する抗原提示細胞である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２：検出剤は、関心対象の抗原である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３：検出剤は、抗体またはそのフラグメントである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４：検出剤は、検出可能な標識を用いて直接または間接的に標識される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５：検出可能な標識は、蛍光標識、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６：検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量を判定することを含む、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８：１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９：（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０：分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１：フローベースの分類方法は、蛍光活性化細胞セルソーティング（ＦＡＣＳ）である、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２：検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグである、実施形態１５に記載の方法。
実施形態２３：オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む、実施形態２２に記載の方法。
実施形態２４：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５：（ｆ）の前に、抗体産生細胞を溶解する工程をさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６：溶解後に、抗体産生細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７：ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８：シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９：（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０：ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３１：（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、実施形態３０に記載の方法。
実施形態３２：（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３３：方法は、関心対象の抗原に対して所望の解離定数（ＫＤ）を有する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定するように構成される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４：１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、関心対象の抗原に対して約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ、または１ｎＭ未満の所望のＫＤを有する、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５：１つ以上の異なる濃度で、検出剤を複数のナノバイアルに添加する工程をさらに含む、実施形態３３または３４に記載の方法。
実施形態３６：１つ以上の異なる濃度は、所望のＫＤの１桁以内である、実施形態３５に記載の方法。
実施形態３７：方法は、関心対象の抗原に対して所望の特異性を有する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定するように構成される、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３８：複数の異なる検出剤を複数のナノバイアルに添加する工程をさらに含み、異なる検出剤の少なくとも１つは、検出可能な標識を有している実施形態３７に記載の方法。
実施形態３９：検出可能な標識の測定に基づいて、異なる検出剤のうちの１つに特異的に結合する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程をさらに含む、実施形態３８に記載の方法。
実施形態４０：検出剤は、関心対象の抗原である、実施形態３～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１：関心対象のシグナル伝達経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成された空洞部を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に抗体産生細胞および抗原産生細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが抗体産生細胞から分泌され、かつ抗原産生細胞内の関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｅ）抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、（ｆ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｇ）（ｆ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル伝達経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程とを含む、方法。
実施形態４２：（ｅ）の前に、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３：関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む、実施形態４１または４２に記載の方法。
実施形態４４：関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む、実施形態４１または４２に記載の方法。
実施形態４５：１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面で抗原に結合することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６：１つ以上の抗体またはそのフラグメントは、抗原産生細胞の表面でリガンドの抗原への結合に干渉することによって、関心対象のシグナル伝達経路を調節する、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７：ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、実施形態４１～４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、もしくはその両方の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、またはその両方の表面に存在する標識に結合する、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５０：１つ以上の細胞捕捉剤は、抗体産生細胞、抗原産生細胞、またはその両方が結合することのできる抗原である、実施形態４７に記載の方法。
実施形態５１：抗原産生細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される、実施形態４１～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２：１つ以上の検出可能な標識は、蛍光レポータータンパク質を含む、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３：（ｄ）の検出する工程は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出することを含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４：（ｅ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５：分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６：フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７：（ｄ）の検出する工程は、抗原産生細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出することを含む、実施形態４１～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８：検出することは、抗原産生細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む、実施形態５７に記載の方法。
実施形態５９：（ｆ）の関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、抗原産生細胞のｍＲＮＡレベルを、抗体産生細胞からの核酸配列情報と結び付けることを含む、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０：共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、ナノバイアルに関連付けられる１つ以上の固有のオリゴヌクレオチドタグを含む、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１：（ｅ）の前に、抗体産生細胞および抗原産生細胞を溶解する工程をさらに含む、実施形態４１～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２：溶解後に、抗体産生細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３：ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４：シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む、実施形４１～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５：（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む、実施形態４１～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６：ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む、実施形態４１～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７：（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８：（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む、実施形態４１～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９：抗体産生細胞は、Ｂ細胞、形質芽球、形質細胞、ハイブリドーマ、および操作されたプロデューサー細胞からなる群から選択される、実施形態１～６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０：ナノバイアルは、単一の抗体産生細胞を含む、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１：複数のナノバイアル上で方法を実施する工程をさらに含み、ナノバイアルのそれぞれは、ナノバイアルの空洞部内に個々の抗体産生細胞を含む、実施形態１～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２：複数のナノバイアルは、少なくとも２０，０００のナノバイアル、少なくとも１００，０００のナノバイアル、または少なくとも５００，０００のナノバイアルを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３：個々の抗体産生細胞はそれぞれ異なる抗体を産生する、実施形態７１または７２に記載の方法。
実施形態７４：ナノバイアルは、架橋ヒドロゲルを含む、実施形態１～７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５：架橋ヒドロゲルは、ＰＥＧベースの架橋ヒドロゲルである、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６：ナノバイアルの空洞部は、それに配置された液体を含む、実施形態１～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７：ナノバイアルは油相中で懸濁される、実施形態１～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７８：ナノバイアルの空洞部は、約１００ｆＬ～１０ｎＬの容量を有している、実施形態１～７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９：ナノバイアルの空洞部は、約５μｍ～２５０μｍの長さ寸法を有している、実施形態１～７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０：機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける方法であって、（ａ）ナノバイアルの空洞部に位置する単一細胞に対して機能的アッセイを実施する工程であって、機能的アッセイは、第１のバーコードまたは第１の標識に関連付けられる、工程と、（ｂ）ナノバイアル中の単一細胞に対してゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイを実施する工程であって、ゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイは、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けられる、工程と、（ｃ）第１のバーコードまたは第１の標識を、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けることによって、機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける工程とを含む、方法。
実施形態８１：（ｂ）の前に、機能的アッセイによって生成されたシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２：機能的アッセイは、抗体分泌スクリーニングアッセイである、実施形態８０または８１に記載の方法。
実施形態８３：機能的アッセイは、抗体親和性アッセイである、実施形態８０または８１に記載の方法。
実施形態８４：機能的アッセイは、抗体特異性アッセイである、実施形態８０または８１に記載の方法。
実施形態８５：ゲノムアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングアッセイである、実施形態８０または８１に記載の方法。
実施形態８６：ナノバイアルは、固有のオリゴヌクレオチドタグと関連付けられる、実施形態８０～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７：固有のオリゴヌクレオチドタグは、ポリ－ｄＴ捕捉領域を含む、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８８：第１のバーコードまたは第１の標識は、ポリＡ領域を有するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態８０～８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８９：生物学的薬剤がナノバイアルの空洞部から拡散するのを防止する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成され、かつナノバイアルの表面への開口部を含む空洞部と、空洞部内に配置された１つ以上の生物学的薬剤とを含む、工程と、（ｂ）遮断粒子が前記空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小するように遮断粒子を添加する工程であって、それによって、ナノバイアルが流体中に配置されたときに、生物学的薬剤が空洞部から拡散するのを阻害する、工程とを含む、方法。
実施形態９０：遮断粒子の最大直径が、空洞部の開口部の直径より大きい、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１：遮断粒子が、空洞部の開口部に接している、実施形態８９または９０に記載の方法。
実施形態９２：遮断粒子が、空洞部の開口部を囲んでいる、実施形態８９～９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９３：遮断粒子は、（ｂ）の後、空洞部の容量の５０％超を維持するようにサイズ設定される、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９４：遮断粒子は、約２０マイクロメートル～５０マイクロメートルの平均直径を有している、実施形態８９～９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５：遮断粒子の形状は、球状または実質的に球状である、実施形態８９～９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９６：遮断粒子はポリマーヒドロゲルを含む、実施形態８９～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７：ポリマーヒドロゲルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９８：遮断粒子は、１つ以上の親和剤で被覆される、実施形態８９～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９：１つ以上の親和剤は抗体捕捉部分を含む、実施形態９８に記載の方法。
実施形態１００：抗体捕捉部分は、抗ＩｇＧ抗体またはそのフラグメント、抗Ｆｃ抗体またはそのフラグメント、プロテインＡ、およびプロテインＧからなる群から選択される、実施形態９９に記載の方法。
実施形態１０１：１つ以上の親和剤は抗原を含む、実施形態９９に記載の方法。
実施形態１０２：１つ以上の親和剤は核酸を含む、実施形態９９に記載の方法。
実施形態１０３：核酸は、オリゴヌクレオチドタグまたはオリゴヌクレオチドバーコードである、実施形態１０２に記載の方法。
実施形態１０４：ナノバイアルおよび／または遮断粒子は、メッシュ様構造を含む、実施形態８９～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０５：メッシュ様構造は平均孔径を含む、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６：平均孔径は、所望のサイズを有する生物学的薬剤が空洞部内で保持され、かつ所望のサイズより小さなサイズを有する生物学的薬剤がメッシュ様構造を介して拡散できるようにサイズ設定される、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０７：平均孔径は、ナノバイアルの空洞部内への流体および試薬の輸送が可能となるようにサイズ設定される、実施形態１０６に記載の方法。
実施形態１０８：流体および試薬は、染色剤、界面活性剤、洗浄剤、溶解緩衝液、薬物、サイトカイン、ケモカイン、培地、馴化培地、および緩衝液からなる群から選択される、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９：（ｂ）は、複数の遮断粒子が空洞部の開口部と相互作用し、かつ空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、複数の遮断粒子を添加する工程を含む、実施形態８９～１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０：複数の遮断粒子のそれぞれは、約２マイクロメートル～約２０マイクロメートルの平均直径を有している、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１：複数の遮断粒子のそれぞれは、室温の生理食塩水よりも大きい密度を有している、実施形態１０９または１１０に記載の方法。
実施形態１１２：遮断粒子対ナノバイアルの数は、１００：１より大きい、実施形態１０９～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３：複数の遮断粒子は、ＰＥＧ、ポリスチレン、ポリ－メタクリル酸メチル、ガラス、および金属からなる群から選択されるポリマーで構成される、実施形態１０９～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４：１つ以上の細胞、１つ以上のビーズ、またはその両方を含むナノバイアルを濃縮する方法であって、（ａ）それぞれがナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む、複数のナノバイアル、および（ｉ）複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む混合物を提供するか、または得る工程と、（ｂ）混合物を溶液中で懸濁する工程と、（ｃ）少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）の複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両方とは別のナノバイアルの空洞部内に配置されるように、溶液の密度を調整する工程と、（ｄ）ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルを採取する工程とを含む、方法。
実施形態１１５：（ｃ）は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より大きな密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１６：（ｃ）は、ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルが、溶液の密度より低い密度を有するように、溶液の密度を調節することを含む、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１７：ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む複数のナノバイアルをさらに濃縮するために、（ａ）～（ｄ）を１回以上実施する工程をさらに含む、実施形態１１４～１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１８：溶液の密度は、（ａ）～（ｄ）の各ラウンドで異なる、実施形態１１７に記載の方法。
実施形態１１９：（ａ）の前に、（ｉ）の複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、あるいは（ｉｉ）の複数の空のナノバイアルを除去する工程をさらに含む、実施形態１１４～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０：関心対象の細胞内のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部を含み、空洞部が、（ｉ）薬物または化合物、および（ｉｉ）薬物または化合物に関連付けられるバーコードもしくは標識を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に関心対象の細胞を担持させる工程と、（ｃ）薬物または化合物が関心対象の細胞と相互作用するように、ナノバイアルの空洞部内の液体容量へ薬物または化合物を放出するためにナノバイアルを刺激にさらす工程と、（ｄ）薬物または化合物が関心対象の細胞内の関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｅ）関心対象の細胞内のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）バーコードもしくは標識を、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｇ）（ｆ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する工程とを含む、方法。
実施形態１２１：（ｆ）の前に、関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１２０に記載の方法。
実施形態１２２：関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の活性化を含む、実施形態１２０または１２１に記載の方法。
実施形態１２３：関心対象のシグナル伝達経路の調節は、関心対象のシグナル伝達経路の阻害を含む、実施形態１２０または１２１に記載の方法。
実施形態１２４：ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、実施形態１２０～１２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５：１つ以上の細胞捕捉剤は、関心対象の細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、実施形態１２４に記載の方法。
実施形態１２６：１つ以上の細胞捕捉剤は、関心対象の細胞の表面に存在する標識に結合する、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７：関心対象の細胞は、関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される、実施形態１２０～１２６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２８：１つ以上の検出可能な標識は、蛍光レポータータンパク質を含む、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１２９：（ｅ）の検出する工程は、ナノバイアルにおける蛍光のレベルを検出することを含み、蛍光のレベルは、関心対象のシグナル伝達経路の調節に対応する、実施形態１２８に記載の方法。
実施形態１３０：（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１２９に記載の方法。
実施形態１３１：分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む、実施形態１３０に記載の方法。
実施形態１３２：フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である、実施形態１３１に記載の方法。
実施形態１３３：（ｄ）の検出する工程は、関心対象の細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出することを含む、実施形態４１～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４：検出することは、関心対象の細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５：（ｆ）の関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、関心対象の細胞のｍＲＮＡレベルを、薬物または化合物に結び付けることを含む、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３６：共有されるオリゴヌクレオチドバーコードは、薬物または化合物に関連付けられるバーコードに関連付けられる１つ以上の固有のオリゴヌクレオチド配列を含む、実施形態１３５に記載の方法。
実施形態１３７：（ｅ）の前に、関心対象の細胞を溶解する工程をさらに含む、実施形態１２０～１３６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８：溶解後に、関心対象の細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９：ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０：シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む、実施形１２０～１３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１：（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む、実施形態１２０～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２：関心対象の抗原に対する機能的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を担持させる工程と、（ｃ）１つ以上のサイトカインが、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から分泌され、かつ親和剤に結合するように、ナノバイアルをインキュベートする工程と、（ｄ）検出剤が１つ以上のサイトカインに結合するように、ナノバイアルの空洞部に検出剤を添加する工程と、（ｅ）１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、（ｆ）ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、（ｇ）ＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原と機能的に相互作用するＣＡＲまたはＴＣＲを特定する工程とを含む、方法。
実施形態１４３：（ｆ）の前に、１つ以上のサイトカインへの検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１４２に記載の方法。
実施形態１４４：ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、実施形態１４２または１４３に記載の方法。
実施形態１４５：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４６：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面に存在する標識に結合する、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４７：標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである、実施形態１４６に記載の方法。
実施形態１４８：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４９：１つ以上の細胞捕捉剤は、その表面で関心対象の抗原を発現するか、またはＭＨＣ複合体において抗原を提示する抗原提示細胞である、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１５０：親和剤は抗体捕捉部分である、実施形態１４２～１４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５１：抗体捕捉部分は、抗ＩＬ２、抗ＴＮＦ－α、および抗ＩＦＮ－γからなる群から１つ以上選択される、実施形態１５０に記載の方法。
実施形態１５２：検出剤は、１つ以上のサイトカインに特異的な二次抗体または抗体フラグメントである、実施形態１４２～１５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５３：検出剤は、検出可能な標識を用いて直接または間接的に標識される、実施形態１４２～１５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４：検出可能な標識は、蛍光標識、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される、実施形態１５３に記載の方法。
実施形態１５５：検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態１５４に記載の方法。
実施形態１５６：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合された検出剤の量を判定することを含む、実施形態１５５に記載の方法。
実施形態１５７：１つ以上のサイトカインに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８：（ｆ）の前に、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１５５～１５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５９：分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む、実施形態１５８に記載の方法。
実施形態１６０：フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である、実施形態１５９に記載の方法。
実施形態１６１：検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグである、実施形態１５３に記載の方法。
実施形態１６２：オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む、実施形態１６１に記載の方法。
実施形態１６３：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上のサイトカインに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計算することを含む、実施形態１６２に記載の方法。
実施形態１６４：（ｆ）の前に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を溶解する工程をさらに含む、実施形態１４２～１６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６５：溶解後に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む、実施形態１６４に記載の方法。
実施形態１６６：ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む、実施形態１６５に記載の方法。
実施形態１６７：シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む、実施形１４２～１６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６８：（ｃ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む、実施形態１４２～１６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６９：ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む、実施形態１４２～１６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７０：（ｃ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、実施形態１６９に記載の方法。
実施形態１７１：（ｄ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む、実施形態１４２～１７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７２：粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器に適合するとともに機器に使用されるように構成された、サイズ、形状、界面化学、密度、またはそれらのあらゆる組合せを有する、ナノバイアル。
実施形態１７３：粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器は、フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、イメージングフローサイトメーター、画像活性化セルソーター、コールターカウンター、パーティクルカウンター、マイクロ流体液滴生成器、マイクロウェルアレイ、マイクロバルブを備えるマイクロ流体チップ、マイクロ流体ＳｌｉｐＣｈｉｐ、光流体マイクロデバイス、マイクロ流体液滴生成器、およびマイクロ流体チャネルからなる群から選択される、実施形態１７２に記載のナノバイアル。
実施形態１７４：ナノバイアルのサイズは直径約１００μｍ未満であり、キャッピングされた反応性官能基を含む、実施形態１７２または１７３に記載のナノバイアル。
実施形態１７５：ナノバイアルのサイズは直径約６０μｍ未満である、実施形態１７２～１７４のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１７６：ナノバイアルは、ガラス毛細管、キュベット、および／またはマイクロ流体チャネルを通って流されるように構成される、実施形態１７２～１７５のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１７７：ナノバイアルは、光励起、電気励起、および／または磁気励起によって分析されるように構成される、実施形態１７２～１７６のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１７８：ナノバイアルのサイズ、界面化学、および／または浮力は、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずにナノバイアルが機器を通って迅速に流れることができるようなものである、実施形態１７２～１７７のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１７９：ナノバイアルは、詰まりを伴わず、または実質的な詰まりを伴わずに、１０ｃｍ／秒超、または１ｍ／秒超で機器を通って流れることができる、実施形態１７８に記載のナノバイアル。
実施形態１８０：ナノバイアルは、９０μｍより大きい直径を有するチャネルを通って流されるように構成される、実施形態１７２～１７９のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１８１：ナノバイアルは、粒子および／または細胞を分析するように設計された第１の機器、ならびにその後粒子および／または細胞を分析するように設計された第２の機器と共に使用されるように構成される、実施形態１７２～１７３のいずれか１つに記載のナノバイアル。
実施形態１８２：ナノバイアルは、蛍光活性化セルソーター、画像活性化セルソーター、または光流体マイクロデバイスによって分類され、その後マイクロ流体液滴生成器に導入されるように構成される、実施形態１８１に記載のナノバイアル。
実施形態１８３：関心対象の抗原の結合に応答するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現Ｔ細胞の細胞殺傷機能を検出する方法であって、（ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、ナノバイアルが、ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、（ｂ）ナノバイアルの空洞部内に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞を担持させる工程と、（ｃ）ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞を、関心対象の抗原を産生する標的細胞と接触させる工程と、（ｄ）ナノバイアル上で、前記標的細胞の溶解または透過処理時に標的細胞から放出された１つ以上の細胞殺傷マーカーを捕捉する工程と、（ｅ）細胞殺傷シグナルを得るために、１つ以上の細胞殺傷マーカーを直接または検出剤を用いて検出する工程とを含む、方法。
実施形態１８４：（ｆ）ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、（ｇ）ＣＡＲまたはＴＣＲの配列を、１つ以上の細胞殺傷シグナルに関連付ける工程と、（ｈ）（ｇ）の関連付ける工程に基づいて、関心対象の抗原と機能的に相互作用するＣＡＲまたはＴＣＲを特定する工程とをさらに含む、実施形態１８３に記載の方法。
実施形態１８５：（ｅ）の後に、１つ以上の細胞殺傷シグナルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１８３に記載の方法。
実施形態１８６：ナノバイアルの空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、実施形態１８３～１８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１８７：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１８８：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の表面に存在する標識に結合する、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１８９：標識は、ストレプトアビジンまたはビオチンである、実施形態１８８に記載の方法。
実施形態１９０：１つ以上の細胞捕捉剤は、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１９１：１つ以上の細胞捕捉剤は、その表面で関心対象の抗原を発現するか、またはＭＨＣ複合体において抗原を提示する抗原提示細胞である、実施形態１８６に記載の方法。
実施形態１９２：親和剤は抗体捕捉部分である、実施形態１８３～１９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９３：抗体捕捉部分は、蛍光タンパク質に対する親和性を有する、実施形態１９２に記載の方法。
実施形態１９４：検出剤は、標的細胞の細胞内生体分子に対する親和性を有する抗体またはオリゴヌクレオチドである、実施形態１８３～１９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９５：検出剤は、検出可能な標識を用いて直接または間接的に標識される、実施形態１８３～１９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１９６：検出可能な標識は、蛍光標識、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される、実施形態１９５に記載の方法。
実施形態１９７：検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態１９６に記載の方法。
実施形態１９８：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合された検出剤の量を判定することを含む、実施形態１９７に記載の方法。
実施形態１９９：１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合された検出剤の量は、蛍光のレベルに対応する、実施形態１９８に記載の方法。
実施形態２００：（ｅ）に続いて、バックグラウンドレベルを上回る蛍光のレベルに基づいてナノバイアルを分類する工程をさらに含む、実施形態１９７～１９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０１：分類する工程は、フローベースの分類方法を実施することを含む、実施形態２００に記載の方法。
実施形態２０２：フローベースの分類方法は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）である、実施形態２０１に記載の方法。
実施形態２０３：検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグである、実施形態１９６に記載の方法。
実施形態２０４：オリゴヌクレオチドタグを配列決定する工程をさらに含む、実施形態２０３に記載の方法。
実施形態２０５：（ｅ）の検出する工程は、１つ以上の細胞殺傷マーカーに結合されたオリゴヌクレオチドタグの数を計数することを含む、実施形態２０４に記載の方法。
実施形態２０６：（ｅ）に続いて、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を溶解する工程をさらに含む、実施形態１８３～２０５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０７：溶解後に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞から放出されたｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを生成する工程をさらに含む、実施形態２０６に記載の方法。
実施形態２０８：ｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む、実施形態２０７に記載の方法。
実施形態２０９：シーケンシングアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを含む、実施形１８３～２０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１０：（ｄ）の前に、液滴内にナノバイアルを内包する工程をさらに含む、実施形態１８３～２０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１１：ナノバイアルの空洞部は、ナノバイアルの表面への開口部を含む、実施形態１８３～２０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１２：（ｄ）の前に、開口部を遮断するか、または開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、実施形態２１１に記載の方法。
実施形態２１３：（ｅ）の前に、ナノバイアルを洗浄する工程をさらに含む、実施形態１８３～２１２のいずれか１つに記載の方法。
以下の実施例は、説明目的のために含まれたものにすぎず、本開示の範囲を制限することは意図されていない。
実施例１：ナノバイアルの製作および特徴付け
ナノバイアルを、光流体製造設定を使用して製造し、ここで、光流体製造設定は、前駆体高分子流体をマイクロ流体チップに通すためにポンプを含み、かつ、前駆体高分子流体の架橋を開始させるためにマイクロ流体チップに絞られた紫外線光源を備えるように構成された顕微鏡を含む。概して、ナノバイアルは、架橋型ＰＥＧ溶液、および、ＰＥＧ溶液と混合すると相分離するデキストランまたは他の成分を含む架橋剤溶液を含む前駆体高分子流体から製作する。任意選択で、前駆体高分子流体は、検知部分（例えば酸素感受性またはｐＨ感受性のフルオロフォアまたは色素）の付加、親和性タグ（例えばビオチン、オリゴヌクレオチド）の付加、または他の化学官能基もしくは生体分子官能基（例えばペプチド、核酸、化学的結合のための求核剤または求電子剤、カルボン酸、アミン、小分子センサーなど）の付加のために他の添加剤を含有する。光開始系の重合や架橋の場合は、前駆体高分子流体に光重合開始剤も含む。これらの前駆体高分子流体を、液滴生成器を含有するマイクロ流体チップ内に並流で流して、相分離を開始させ、少なくとも架橋型ＰＥＧを多く含む相を形成し、その後、例えば、ＵＶ光への曝露に供して前駆体高分子流体を重合する。
非限定的な例では、架橋型ＰＥＧは、４アームＰＥＧ－ノルボルネンを含み、架橋剤溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）架橋剤を含む。この例では、前駆体高分子流体のうちの１つは、４アームＰＥＧ－ノルボルネン、ビオチン－ＰＥＧ－チオール、およびフェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）光重合開始剤を含み、別の前駆体高分子流体は、デキストランおよびＤＴＴを含む。
架橋型ＰＥＧ溶液は、ＬＡＰ光重合開始剤をＰＢＳ中３％ｗ／ｗの原液に溶解し、続いてビオチンＰＥＧチオールをＬＡＰ原液に溶解して、０．５～１０ｍｇ／ｍＬの濃度、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するようにし、４アームＰＥＧ－ノルボルネンを２８．９％ｗ／ｗの濃度を達成するようにして調製する。架橋剤溶液は、デキストランおよびＤＴＴを、脱イオン（ＤＩ）水に１５％ｗ／ｗおよび５％ｗ／ｗでそれぞれ溶解することによって調製する。その後、溶解したデキストラン溶液およびＤＴＴ溶液をＤＩ水中で混ぜ合わせて、１１％ｗ／ｗのデキストラン濃度を達成する。ノルボルネンに対するチオールの化学量論比を０．８にするために、様々な濃度にわたってＤＴＴ濃度を調整する。ナノバイアルの最適な架橋密度のために、およびビオチンＰＥＧ－チオール結合のために、遊離基を維持する。デキストラン相またはＰＥＧ相は、遊離ノルボルネン基に結合するチオール基またはシステインアミノ酸（例えばＲＧＤ、ポリ－Ｌ－リジン）を持つ接着ペプチドをさらに含んでもよい。これらの前駆体溶液の調製は、好ましくはナノバイアルの製作直前に実施するものとするが、前駆体を凍結して－２０℃で１週間以上保管し、後日、使用するために解凍してもよい。実際には、ビオチン－ＰＥＧ－チオールは、１５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で最も溶解しやすい。ＰＥＧ－ノルボルネンの添加によって溶解度を増強することができ、最終的な層が依然として確実に均質であるようにすることができる。製作後により高濃度のビオチンをナノバイアルにコンジュゲートすることによって組み込んでもよい。
ナノバイアルの製作の準備をするために、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００が予め装填された１ｍＬ容量のプラスチック製シリンジ内に前駆体高分子流体をピペッティングし、前駆体高分子流体の喪失をシリンジやチューブ内のデッドボリュームまで減少させる。代替的な実施形態では、ガラス製シリンジは、シリンジ／チューブシステムの容量を減少させるために使用する。シリンジの先端に２５ゲージのルアースタブをつけ、このルアースタブを内径０．０２０”のＰＥＥＫチューブにつなぐ。その後、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００と界面活性剤、例えば、Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＨ、Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＬ、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）、ＦｌｕｏＳｕｒｆの組合せから仕切り用油を調製する。界面活性剤の濃度は、０．２５％～２％ｗ／ｗとする。界面活性剤として１～５％のスパン８０を含有する鉱物油、または界面活性剤として１～５％のスパン８０を含有するヘキサデカンを使用してもよい。この油を１０ｍＬまたは２０ｍＬ容量のプラスチック製シリンジに装填し、先端に２５ゲージのルアースタブをつける。内径０．０２０”のＰＥＥＫチューブを使用して、スタブを内径０．０２０”のＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブにつなぐ。シリンジを別個のシリンジポンプに入れ、シリンジポンプを０．１～５０μＬ／分の一定流速で送液するように設定する。
ナノバイアルの製作は、ＷＯ２０２００３７２１４Ａ１に記載されているマイクロ流体デバイス設計の手順や使用に従って行ってもよく、当該文献は、全体として参照により本明細書に援用される。一例では、チューブをチップ入口に挿入する前に、流速を増加させて（１０～１００μＬ／分）ポンプを走行させ、チューブから空気を取り除くことによって、シリンジをプライミングする。ＰＥＥＫチューブを使用して、チューブをチップ入口につなぐ。チップを初期化する場合は、最初に油相を流し、ＰＥＧ相およびデキストラン相がチップに装填されて早期に重合することでチップを遮断してしまうのを防ぐ。油を用いてチップを完全にプライミングした後に、ＰＥＧ相およびデキストラン相をチップに送液して、液滴生成を開始する。ＰＥＧ相は、２つのチャネルを通って流れ、マイクロ流体チャネル内のデキストラン相を挟んで同軸流を形成する。オイル相は、同軸流を、ＰＥＧ相およびデキストラン相を含む液滴に区画する。液滴生成の安定性は、使用する流速によって決まる。流速をつかの間増加または減少させて、安定した液滴生成体制に流体を押しやる。好ましくは、流量は、液滴生成が１２００Ｈｚ未満であるように、これより好ましさが低いのは２０００Ｈｚ未満であるように制御する。安定した同軸流は、達成に最大で３０分間の連続作動時間を要してもよい。
ナノバイアルの調製に使用するマイクロ流体デバイスは、標準的な流体集束設計を有する。前駆体入口につながるチャネルは、共に先細になって同軸の流れを形成し、この流れは、油および界面活性剤を運ぶ２つの垂直チャネルと交差する。この合流点の直後で液滴が生成され、下流にあるより深いチャネル領域につながる。前駆体液滴径は、前駆体溶液および油溶液の流速を変更し、液滴生成の合流点の幅および高さを調節することによって調節する。チャネルの高さが１８ミクロン、合流点の幅が４０ミクロン、両前駆体溶液の流速が０．５μＬ／分、油相および界面活性剤相の流速が１０μＬ／分であるデバイスを使用すると、２８ミクロンの前駆体液滴が形成される。チャネルの高さが５０ミクロン、合流点の幅が４０ミクロン、両前駆体溶液の流速が２．２５μＬ／分、油相および界面活性剤相の流速が２７μＬ／分であるデバイスを使用すると、５０ミクロンの前駆体液滴が形成される。安定性を達成すると、液滴は、液滴サイズの１２５％超にサイズ設定されたより深い下流チャネルに沿って移動する。蛍光顕微鏡は、チップを通してＵＶ光を透過する、コリメートされたＵＶ（３６５ｎｍ）ＬＥＤを備えるように構成される。チップの下流領域は、均一な照明を容易にするため、様々な対物レンズサイズにサイズがあうチャネルの幅を有するように構成される。２８ミクロンの前駆体液滴については、２０倍対物レンズによる４００～１０００ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ強度および０．５～１秒の曝露時間によって、十分に高分子前駆体が架橋し、結果として、外径が３８ミクロン、空洞部径が２４ミクロンである、形態の均一性が高い（ＣＶ５％未満）ナノバイアルがもたらされる（図１Ａ～１Ｃ）。理想的には、所定のナノバイアルに対する最適なＵＶ曝露を決定するために、広い範囲のＵＶ条件を使用する。５０ミクロンの前駆体液滴については、ＵＶ強度が４００～１０００ｍＷ／ｃｍ２および曝露時間が０．５～１秒である２０倍対物レンズによって、十分に高分子前駆体が架橋し、結果として、外径が６０ミクロン、空洞部径が３８ミクロンである、形態の均一性が高い（ＣＶ５％未満）ナノバイアルがもたらされる（図２Ａ～２Ｃ）。ＵＶ曝露後、ＷＯ２０２００３７２１４Ａ１で概説されている手順に従って、油中の架橋粒子をチューブに回収して洗浄する。フローサイトメーターおよびＦＡＣＳシステムなどの機器の表面、および流体チャネル、キャピラリー、管路、またはマイクロ流体チャネルへのナノバイアルの付着を軽減するために、ナノバイアル粒子を製造して洗浄した後に、未反応官能基の封鎖を実施する。例えば、ナノバイアル上またはナノバイアル内に残っているチオール基を封鎖して、２つ以上のナノバイアル間にジスルフィド結合が形成されるのを防ぐために、Ｎ－エチルマレイミ（Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｍｉｄｅ）を使用する。これを行うために、濃縮ナノバイアルを、０．０５％ｗ／ｗのプルロニックＦ１２７および１．２５ｍｇ／ｍＬのＮ－エチルマレイミドを加えたＰＢＳ中でほぼ５倍に希釈し、室温で少なくとも２時間インキュベートする。顕微鏡、フローサイトメーター、セルソーターなどを使用して、特徴付けした粒子の均一性を判定する。ナノバイアルの形態は、ＣＶ均一性が５％以内になるように最適化されるが、ナノバイアルの染色は、市販の標識ビーズと同様の均一性になる。完全に開口しているか、または部分的に密閉しているナノバイアルを提供するように、前駆体の比率を調整する。ビオチンなどの親和性分子の確認および特徴付けは、蛍光顕微鏡を使用して相補蛍光分子（例えばストレプトアビジン）で確認するか（図３Ｂ）、またはフローサイトメトリーを使用して測定する（図４Ａ～４Ｃ）。フローサイトメトリーを用いたところ、市販の蛍光ポリスチレンビーズ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｘ Ｏｒａｎｇｅ １０μｍ、２２２７）と比較して同様の標識の均一性が確認される（図４Ａ～４Ｃ）。
製作後、粒子および細胞を分析するために、様々な種類の複数の機器でナノバイアルを使用し、これらの機器として、フローサイトメーター、蛍光活性セルソーター（ＦＡＣＳ）、イメージングフローサイトメーター、画像活性セルソーター、コールターカウンター、パーティクルカウンター、顕微鏡、マイクロ流体液滴発生器、マイクロウェルアレイ、マイクロバルブ付きマイクロ流体チップ、マイクロ流体ＳｌｉｐＣｈｉｐ、光流体マイクロデバイス、マイクロ流体チャネルなどや、本明細書にさらに記載されるものなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ナノバイアルは、これらのシステムで使用するために直径約１００マイクロメートル未満にサイズ設定され、より好ましくは直径約６０マイクロメートル未満にサイズ設定される。概して、ナノバイアルは、ガラス製キャピラリー、キュベット、マイクロ流体チャネルなどを通して流され、光励起、電気励起、または磁気励起によって分析される。ナノバイアルが流れるチャンネルまたはキャピラリーは、ナノバイアルが詰まりを起こすことなく急速に流れることができるようにサイズ設定される。チャネルのサイズがナノバイアルのサイズよりも１．５倍大きいことが好ましい。例えば、直径６０マイクロメートルのナノバイアルについては、チャネルは、直径９０マイクロメートル超のサイズであることが好ましい（例えば直径１００マイクロメートルまたは１３０マイクロメートルのチャネル）。ナノバイアルは、これらのキャピラリーおよびチャネルを通って高速で流される（例えば１０ｃｍ／秒超、または１ｍ／秒超）。ナノバイアルおよびその中にある潜在的な細胞の励起は、例えば、集束レーザー、集束ＬＥＤ、アークランプ、ハロゲンランプ、光ファイバーが発する光、または他の可視光、紫外線光、赤外線光、または他の光源を用いて達成される。場合によっては、キャピラリーまたはチャネル全体に電場または電場の勾配を印加するように構成された電極を用いて電場を印加することによって、励起が供与される。いくつかの事例では、キャピラリーまたはチャネルに接近しているか、または埋め込まれている永久磁石または電磁石による電場または電場の勾配によって、励起が供与される。励起に続いて、ナノバイアルまたはその中にある細胞からのシグナルは、放射光もしくは散乱光、誘電スペクトル、インピーダンススペクトルをもたらす誘電特性、または静電容量、成分の分子量分布、またはコイルもしくは磁気センサーの電流に変動をもたらす磁気特性、またはナノバイアルの偏向もしくは運動、例えば、流体流線全体の運動を含む。このシグナルは、１つ以上のナノバイアルの分析を作成するために使用する。場合によっては、ナノバイアルについての分析は、分類判定の契機として使用する。分類判定は、ナノバイアルおよびその中に含有される潜在的な細胞を別個のチャネルまたは容器もしくはベッセルに直行または偏向せしめるために使用する。
場合によっては、１回の実験当たり１０，０００を超える対象物を分析するＬｕｍｉｎｅｘ製のＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するなどして、イメージングフローサイトメトリーのマイクロ流体チャネルまたはフローセルを通してナノバイアルを流す。例えば、細胞を含有している直径４０マイクロメートルまたは直径６０マイクロメートルのナノバイアルを、１×１０７ナノバイアル／ｍＬの濃度になるようにＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩに導入する。複数のチャネル／染色にわたってナノバイアルおよび細胞を同時に画像化するが、これには、ナノバイアルおよび細胞の形態を観察するための明視野、ナノバイアルの蛍光を観察するためのＡＦ４８８、顆粒性を観察するための側方散乱光、ならびに細胞内のＤＮＡを染色するためのＤｒａｑ５を含む。この例では、固定したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびハイブリドーマ細胞を分析した。ゲーティングを実施し、焦点を合わせるナノバイアル、および細胞を含むナノバイアルを選択する。例えば、焦点を合わせるナノバイアルを特定するためには高勾配ＲＭＳを使用したゲーティング、またはアスペクト比／面積グラフのゲーティングが挙げられる。高アスペクト比（０．４～１）および低面積は、単一のナノバイアルに対応する。細胞を担持するナノバイアルは、高いＡＦ４８８および高いＤｒａｑ５シグナルに基づいてゲーティングする。ナノバイアルの空洞内に細胞を含むナノバイアルも高い内在化スコアに基づいてゲーティングしてもよく、これは、ナノバイアルからの明視野シグナル内に細胞蛍光シグナルが存在していることを示唆する。また、ナノバイアル内に単一で担持する細胞、またはナノバイアル内に複数で担持する細胞を特定するために、Ｄｒａｑ５蛍光画像のスポットカウントを使用し、そして、ナノバイアル内にある単一、または２つ、３つ、複数、または任意の数の細胞についてゲーティングするためにも使用してもよい（図２０Ａ）。イメージングサイトメトリー中にナノバイアル内の細胞を計数するために、他の蛍光ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ、生存率色素、細胞表面染色、または核酸染色を使用してもよい。細胞核間の分離がより大きく、容易に判別できることから、核酸染色が好ましい。ナノバイアルが非球状の構造を有するため、特定の配向で画像化したナノバイアルを判定するために、ナノバイアルの蛍光重心も使用する。分析の均一性を改善するために、特定の配向のナノバイアルのみを分析するためにゲーティングを実施してもよい。
関連する一例では、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩを使用して、ナノバイアルに対して単一細胞分泌アッセイを実施する。この実験では、ヒトＰＢＭＣからＢ細胞を単離して、Ｂ細胞捕捉抗体およびＩｇＧ捕捉抗体で官能化したナノバイアルに担持させる。Ｂ細胞によって、１時間にわたってＩｇＧを分泌させ、これをナノバイアルに捕捉し、その後ＩｇＧに対する蛍光抗体（抗ＩｇＧ ＡＰＣ）を用いて染色する。Ｂ細胞表面マーカーも、蛍光抗体（抗ＣＤ１３８ ＰＥ、抗ＣＤ３８ ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５、抗ＩｇＭ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）を用いて染色した。その後、ナノバイアルをＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（登録商標）ＭＫＩＩに担持させ、それによって、７，０００超の対象物を画像化して、１つの対象物当たり１２枚の画像を用いて分析した。４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４２ｎｍ、および７８５ｎｍのレーザー励起を使用して、以下の波長域を分析した（４３０～４７０ｎｍ、明視野）（５９５～６６０、ＰＥ）（６６０～７４５、ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５）（７４５～７８５、側方散乱光）（４３０～５０５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）（５７５～５９５、明視野）（６６０～７２０、ＡＰＣ）。画像中、表面マーカー染色を用いてナノバイアルの空洞内の細胞を示し、空洞に分泌細胞も存在する場合に抗ＩｇＧ ＡＰＣ染色で染色したナノバイアルの空洞を示した（図２０Ｂ）。０．６～１．０のアスペクト比および２ｅ３～５ｅ３の面積を使用して、細胞を含む単一ナノバイアルをゲーティングした。画像化した、細胞を含むナノバイアルは、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、またはその両方の組合せに基づいてゲーティングする。その後、これらのマーカーは、ＩｇＧの分泌と相関する。別の蛍光チャネル、例えばＣＤ３８チャネルの閾値を使用してナノバイアル内で細胞の位置をマスキングして、マスキングした領域を特定することによって、ナノバイアル上の細胞のまわりに分泌されたＩｇＧを分析してもよい（図２０Ｃ）。その後、ナノバイアル上およびマスキングした領域の外においてＩｇＧ（ＡＰＣチャネル）に関連付けられるナノバイアル上の蛍光強度のみを定量化することができる。マスキングしたＩｇＧ分泌で最も高いシグナルが、収集した画像の中でナノバイアルに関連付けられる細胞上の高レベルのＣＤ３８シグナルおよびＣＤ１３８シグナルに関連付けられることが見出された（図２０Ｄ）。ＢＤ ＣｅｌｌＶｉｅｗ（商標）画像活性セルソーターなどの画像活性セルソーターを用いて、本明細書に記載されるイメージングフローサイトメトリーを使用してナノバイアルサンプルを分析およびゲーティングする類似手法を使用してもよい。
場合によっては、画像化ベースの分析および分類などするためにマイクロウェルアレイに、ナノバイアルを導入する。マイクロウェルアレイは、５，０００超、または２０，０００超の直径５０～１００マイクロメートルの円筒状ウェルを含んでもよい。マイクロウェルアレイのウェルのサイズをナノバイアルのサイズと同様になるように調整することで（例えば、３５マイクロメートルのナノバイアルに対して５０マイクロメートルのウェル）、各ウェルに単一バイアルを担持させることができる（図２１）。ナノバイアルまたは細胞を含有しているナノバイアルは、マイクロウェルアレイ内で画像化し、任意選択で、蛍光画像化情報および／または明視野画像化情報に基づいて分類してもよい。イメージングフローサイトメトリーについて本明細書に記載されるのと同様の画像分析手法を用いる。分類は、下流で回収するために、例えば、マイクロウェルからマイクロウェルアレイ上にあるマイクロチャネルに標的ナノバイアルを排出するために、集束音波および音響力を使用して達成する。
場合によっては、ナノバイアルは、３５マイクロメートルのナノバイアル、または細胞を含む３５マイクロメートルのナノバイアルを導入することによって、自動セルカウンターで分析する。例示的な一実施形態では、ナノバイアル溶液を、生死判定色素トリパンブルーを用いて１：１で染色し、ＣｙｔｏＳｍａｒｔ（商標）自動セルカウンターに導入する。ナノバイアルは、トリパンブルーを取り込み、したがって、自動計数アルゴリズムで「死細胞」として現われることが見出されている。サンプル内のナノバイアルの数または濃度は、「死細胞カウント」数によって自動形式で計数されてもよい。ナノバイアルを正確に計数するために、セルサイズのゲートは、直径４～３３マイクロメートル、または３３マイクロメートル超の対象物などのより大きい範囲を含むように設定してもよい。細胞を含むナノバイアルも計数してもよい。細胞がトリパンブルー染色を取り込まない場合に生存しているものとして計数する。生細胞を含有しているナノバイアルのカウントは、自動計数プロセスで生細胞および死細胞の座標が重なり合った位置を探し出すことによっても得られる。数百から数千のナノバイアル、およびナノバイアルに担持された細胞が自動形式で計数される。
場合によっては、ナノバイアルも、液滴または他の区画に内包するためにマイクロ流体チャネル、キャピラリー、管路、３Ｄ印刷チャネル、誘電体（例えばデジタルマイクロ流体）デバイスのエレクトロウェッティングなどを通して流される。例えば、ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）を水の液滴内に内包して、油中水型エマルジョンを形成するために、ナノバイアルを、流体集束液滴発生器、Ｔ字ジャンクション液滴発生器、ステップ乳化液滴発生器、同軸キャピラリー液滴発生器などの液滴発生器マイクロ流体デバイスを通して、水性サンプル流体の一部として流す。油中水型エマルジョンの液滴は、容量が実質的に均一である。液滴容量は、好ましくは１００ｎＬ未満、より好ましくは１０ｎＬ未満である。液滴容量はまた、好ましくは１ｐＬ超、より好ましくは５０ｐＬ超である。次のポアソンローディング統計：平均ラムダ＝０．２０超、好ましくはラムダ＝約０．１において、ナノバイアルを含有している液滴の大半が単一のナノバイアルのみを含むような濃度になるように、ナノバイアルを導入する。ナノバイアルを他の試薬と共に導入して、ナノバイアルおよびさらなる試薬または緩衝液を含む液滴を形成するために、複数の入口および入口チャネルを含有するデバイスを使用する。液滴中のナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）に対して、これらのさらなる試薬の流れを用いて、細胞溶解、酵素反応、重合反応、染色反応などの他の操作を実施する。
場合によっては、ナノバイアルは、基質に組み込まれたマイクロウェル、マイクロウェルのアレイ、バルブチャンバーを備えたマイクロチャネル、主チャネルまたは開放型流体リザーバーよりも低流速で細胞、粒子、および他のマイクロ対象物を保持可能である、マイクロチャネルとは別のチャンバーまたはリザーバーを備えたマイクロチャネルに導入する。好ましくは、ウェル、チャンバー、またはリザーバーは、チャンバー、隣接チャネル、または送液チャネルへの入口における速度と比較して流速を５倍以上減速させて容量を提供する。ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）は、対流輸送を最小限に抑える低流速の環境下でチャンバーまたはリザーバー内で一定時間インキュベートする。チャンバーまたはマイクロウェルの容量は、好ましくは１００ｎＬ未満、より好ましくは１０ｎＬ未満である。チャンバーまたはマイクロウェルの容量はまた、好ましくは１ｐＬ超、より好ましくは５０ｐＬ超である。次のポアソンローディング統計：平均ラムダ＝０．２０超、好ましくはラムダ＝約０．１において、ナノバイアルを含有しているチャンバーまたはマイクロウェルの大半が単一のナノバイアルのみを含むような濃度になるように、ナノバイアルを導入する。いくつかの実施形態では、ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）は、誘電泳動または光誘起誘電力を使用してチャネル、チャンバー、またはリザーバー内で操作または移動させ、これを、チャンバー内に単一ナノバイアルが存在することを確実にするために使用することができる。場合によっては、ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）は、磁力を使用して移動させる。ナノバイアルまたはその中にある細胞は、酸化鉄マイクロ粒子またはナノ粒子などのいくつかの磁性物質を含む。ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）も、光学励起、電気励起、または磁気励起によってウェル、チャンバー、またはリザーバーで分析する。好ましくは、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、または他の２Ｄ検出器アレイを用いてナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）からの放射光または散乱光を検出することによってナノバイアルを画像化するためにレーザー、ＬＥＤ、アークランプなどの光源を使用する光励起を使用する。励起に続いて、分類または選択するナノバイアルを特定するために分析を実施する。その後、例えば、誘電泳動または光誘起誘電力を使用してナノバイアルをチャンバーから自由流に移動させて収集するために、ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）を分類する。代わりに、高出力レーザーパルスを使用して、ナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）を、位置しているマイクロウェルから自由流に押して収集する。代わりに、集束音波を使用して、ナノバイアル（またはその中にある潜在的細胞）を押す。代わりに、マイクロピペットまたは自動ピッカーを用いて、マイクロウェルに含有されているナノバイアル（およびその中にある潜在的細胞）を取るか、あるいは、ナノバイアルが磁性物質を含む場合は、ナノバイアルを引きつけて選択するために磁気棒またはチップを使用する。
実施例２：フローサイトメーターを用いてナノバイアルを使用する方法。
非限定的な例では、高スループットでナノバイアルならびにそれに関連する細胞および生体分子を分析および／または分類するために、フローサイトメーターおよびフローソーターを使用することが望ましい。結果の改善（例えば収率、純度、詰まりの軽減、シングレットの増強、限界検出の改善、絶対定量）を伴う分析および分類を実施するために、サンプル溶液の調製（例えばサンプルベッセル内のナノバイアルの濃度、緩衝液の選択）や、特定の機器および関連ソフトウェアの設定について配慮する。この例では、フローサイトメーターおよびフローソーター機器でナノバイアルサンプルを実行するための考慮事項および原理を記載する。
ＦＡＣＳで使用するためのナノバイアルの最適な濃度
フローサイトメーターおよびフローソーターでナノバイアルサンプルを走行する場合は、シングレット事象の改善および詰まりの軽減、中断事象の減少、収率の改善、および純度の改善のためにナノバイアルの濃度を調節する。市販のＦＡＣＳ機器の多くは、ポアソン統計によって分析事象間の間隔が決定付けられる。サンプル濃度を増加させると、同事象のウィンドウ内に複数のナノバイアルを有する可能性が増加する。濃度を減少させると、ダブレットまたはマルチプレット事象の可能性が減少する。理想的な濃度は、ナノバイアルのサイズ、ならびに使用するフローサイトメトリーのノズルまたはチップの機器およびサイズによって決まる。概して、各構成（例えば機器、ノズル／チップのサイズ、ナノバイアルのサイズの任意の組合せ）に対して広い範囲の濃度で行い、意図した用途に適切な濃度範囲を特定する。例示的なワークフローとして、蛍光または他の方法で識別可能な標識もしくは染色でナノバイアルの画分を標識すること、ナノバイアルをフローソーターを通して走行させること、標識シグナルに基づいて分類すること、ならびに、顕微鏡検査によって、または分類したサンプルを機器に通して再度走行させることによって下流での純度、回収率、および／もしくは濃縮を測定することが挙げられる。概して、ナノバイアルのサイズが増加すると、濃度（ここではナノバイアルの数／容量として定義する）が減少し、事象間により大きな間隔ができる。ナノバイアルのサイズが減少すると、より高い濃度のナノバイアルが高収率かつ高純度で分析および分類される。分類ノズルのサイズ（例えば断面寸法）が増加すると、ナノバイアルの濃度が減少し、ダブレット事象の可能性が減少する。
様々な用途のための考慮事項
単一細胞またはクローン性コロニー形成が重要である用途（例えばＢ細胞モノクローナル抗体の検出、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクのためのモノクローナル細胞株の開発）では、ナノバイアルをサンプル溶液でさらに希釈してダブレット事象を減少させ、単一細胞の純度を改善する。濃縮が優先事項とされ（例えば希少事象の濃度が増加する）、低純度でも許容し得る（例えばプロデューサー細胞のより多く産生する亜集団の濃縮）用途では、単一細胞の純度を犠牲にするが、濃度が増加してスループットが増加する。
分散光に基づくシングレットの選択
場合によっては、フローサイトメーターの散乱光シグナルの読み出しを使用してナノバイアルサンプルの亜集団を区別することが望ましい。これには、空のナノバイアルと、細胞を含有しているナノバイアルを区別すること、ナノバイアルの事象と、非結合細胞の事象を区別すること、単一の細胞を含むナノバイアルと、複数の細胞を含むナノバイアルを区別することが含まれるが、これらに限定されない。散乱光の測定には、前方散乱光（例えば高さ、幅、および／または面積）、側方散乱光（例えば高さ、幅、および／または面積）、または前述の測定の任意の組合せが含まれる。場合によっては、ナノバイアルは、本明細書に記載されるように、細胞よりも大きく、高い前方散乱光シグナル（例えば前方散乱光の高さ）を有するように製造され、平滑なヒドロゲル物質から製造されるのと同程度または低い側方散乱光シグナルを有してもよい。この固有の特徴によって、様々な集団（例えば細胞、ナノバイアル、および／または細胞を含有しているナノバイアル）を特定する能力が増強される（図４Ａ～４Ｃ）。細胞を含有しているナノバイアルは、高い前方散乱光シグナルと高い側方散乱光シグナルの両方を有していてもよく、細胞やナノバイアルのみとは識別可能であってもよい。
空のナノバイアルや遊離細胞から、細胞を含有しているナノバイアル
細胞を含まないナノバイアルを含むサンプル、細胞を含むナノバイアルを含むサンプル、ナノバイアルなしで細胞を含むサンプルを、個別に機器を用いて分析し、各サンプルに固有な散乱光シグナルの閾値を特定する。ナノバイアルおよび細胞は、別個の蛍光標識で標識し、浮遊細胞、空のナノバイアル、および細胞を含有しているナノバイアルに関連付けられる散乱光シグナルを特定する。細胞が付着しているナノバイアルは、単一の側方散乱成分（例えば高さ、幅もしくは面積）または前方散乱成分（例えば高さ、幅もしくは面積）に、例えば、細胞が付着しているナノバイアルに関連付けられる側方散乱光の閾値、およびナノバイアルの存在に関連付けられる前方散乱光の閾値を使用してゲーティングすることによって、空のナノバイアルとは区別する。細胞が付着しているナノバイアルは、側方散乱光の成分（例えば高さ、幅もしくは面積）および前方散乱光の成分（例えば高さ、幅もしくは面積）を含む２つの散乱光パラメーターの２Ｄ平面における２－Ｄ軸、例えば閾値またはゲートにゲーティングすることによって、空のナノバイアルとは区別する。より高次元の散乱光のゲーティング（例えば３Ｄ、４Ｄ）、または１Ｄ、２Ｄおよびそれより高次元のゲートの複数の組合せを使用して、関心対象の細胞を含有しているナノバイアルの亜集団を選択する。
非限定的な例では、ナノバイアルは、遊離細胞より低い前方散乱光および／またはより低い側方散乱光を有するように固有に操作される。この固有の特徴によって、ユーザーは、細胞を含むナノバイアル集団を、空のナノバイアルおよび／または遊離細胞と比較してＦＳＣ、ＳＳＣ、またはその両方が増加することによって区別することができる（図４Ａ～４Ｃ）。ナノバイアルのサイズを調節して、それらの散乱光または蛍光シグナルを細胞からより認識可能なものにする。例えば、細胞よりも大きいナノバイアルは、同程度の散乱光または蛍光ピークの高さを有する一方、細胞よりも実質的に大きい散乱光または蛍光シグナルの幅を有する場合がある。正確なゲーティングパラメーターは、特定の機器のレーザー電力および検出器感度によって決まる。特定の機器について本明細書に記載される具体的な閾値およびゲートは、上記の対照サンプルを走行させることによって判定する。
ダブレットの除去
単一の細胞を含有しているナノバイアルは、それらの散乱光シグナルに基づいて、２つ以上の細胞を含有しているナノバイアルから区別する。上記の項目「空のナノバイアルや遊離細胞から、細胞を含有しているナノバイアル」で概説されているのと同様の実験方針を使用して、特定のゲートの特定を実施する。２つの亜集団の細胞を２つの固有のフルオロフォアで標識するか、またはフローサイトメーターもしくはフローソーター機器を用いて特定される他の標識で標識する、さらなる方針を用いる。ナノバイアルに、１つ目の種類の標識を含有している細胞、および２つ目の種類の標識を含有している細胞を過剰に担持させ、それによって、かなりの画分が、２つの標識の種類を有する複数の細胞を含有する。その後、サンプルをフローサイトメトリー機器を用いて分析し、複数の細胞と相関する両方の蛍光シグナル型を含有している事象を探し出すことによって、複数の細胞を含有している亜集団を特定する。特定後に、この亜集団に対応する散乱光シグナルを、単一の細胞を含むナノバイアルを含有しているサンプルからの散乱光シグナルと（担持密度が低いことに基づいて）比較する。上記の項目と同様に、関心対象のシングレットの亜集団を選択するために、単純な１Ｄ、２Ｄ、３Ｄ、４Ｄなどのゲーティングおよびより複雑な１Ｄ、２Ｄ、３Ｄ、４Ｄなどのゲーティング、または散乱光のゲーティングおよび閾値の組合せを用いる。
場合によっては、ナノバイアルは、低い側方散乱光シグナルを有するように操作され、それによって、細胞の側方散乱光が区別可能になる。ナノバイアルに担持された細胞ダブレットは、分析事象の側方散乱光の高さ（ＳＳＣ－Ｈ）および側方散乱光の面積（ＳＳＣ－Ａ）の閾値を規定することによって特定する。１つ以上の閾値を上回る事象は、細胞ダブレットとして類別し、さらなる分析からは除外する。上記の実験手順を使用して、各サンプルについて正確な条件をさらに特定する。ナノバイアルの側方散乱光をさらに減少し、それによって、ナノバイアルではなく細胞からのシグナルのみが事象閾値を上回るようにする。これは、ナノバイアル自体の成分を調節することによって、例えば、分子量がより大きい前駆体を使用して架橋密度を減少することによって、またはサンプル緩衝液および／もしくはシース液に添加剤を添加してナノバイアルの屈折率と溶液を一致させることによって、例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐの溶液（原液中では率＝１．４２９）と水（率＝１．３３）を使用して、画分の重量に応じて約１．３５、最大で１．４０のＰＥＧナノバイアルの屈折率と一致させることによって容易になる。この事例では、ナノバイアルは、屈折率が周りの溶液と同じであるので、散乱光シグナルをほとんど含有しておらず、遊離細胞のダブレットおよびマルチプレットをゲーティングするために通常用いられるゲーティング方針を用いる。例えば、側方散乱光の幅（ＳＳＣ－Ｗ）およびＳＳＣ－Ａに基づいたゲーティングでは、ダブレット／マルチプレットは、目立って高いＳＳＣ－Ｗシグナルを有することが予想される。ＳＳＣ－ＨおよびＳＳＣ－Ａに基づいたゲーティングでは、ダブレットは、所与のＳＳＣ－Ａ値に対してわずかに低いＳＳＣ－Ｈを有することが予想される。ＳＳＣ－ＷおよびＳＳＣ－Ｈに基づいたゲーティングでは、ドブレット（ｄｏｕｂｌｅｓ）またはマルチプレットを含むナノバイアルは、所与のＳＳＣ－Ｈシグナル対してより高いＳＳＣ－Ｗを有することが予想される。前方散乱光シグナルに基づいた識別にも、同様の方針を用いる。
場合によっては、細胞および／またはナノバイアルの散乱光シグナルは、光散乱ナノ粒子またはマイクロ粒子（例えばポリスチレンビーズ、磁気ビーズ）を用いた修正によって調節し、検出したシグナルの差異を増加させる。例えば、細胞を、表面マーカーに特異的なビオチン化抗体で標識し、その後、アビジン被覆済みポリスチレン粒子をコンジュゲートして、それらの側方散乱光を増強する（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。
ナノバイアルのために調整したＦＡＣＳシステムの操作
フローサイトメトリー機器は、ナノバイアルを分析および分類するために最良に操作すべく調整する。例えば、ＢＤ Ａｒｉａ ＩＩ／ＩＩＩまたはＳｏｎｙ ＳＨ８００などの空中液滴フローサイトメーターについては、「純度」マスクまたは「単一細胞」マスクなど、分類の純度を改善して単一ナノバイアルを得るために分類マスクを選択する。液滴の正しい形成は、より大きいサイズ設定のナノバイアルのドロップディレイ値を調節することによって改善する。ドロップディレイは、当技術分野において既知のキャリブレーションビーズ（ＳＰＨＥＲＯ（商標）ＡｃｃｕＣｏｕｎｔ Ｕｌｔｒａ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｒｏｐ Ｄｅｌａｙ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と同様の蛍光標識で染色したドロップディレイキャリブレーションナノバイアルを使用して自動的に調整する。また、より大きなサイズ、例えば、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００システムにおいて１００または１３０マイクロメートルのマイクロ流体チップ径という選択は、正常な哺乳動物細胞と比較してより大きいサイズのナノバイアルを収容するために選択する。より大きいナノバイアルのサイズに起因して、ナノバイアルも、流体力学的シース流によって集束されるとよりゆっくりと下流側に移動し、よって、ナノバイアルのよりゆっくりとした速度を考慮して、分類のタイミングが増加し、正しい分類の事象の画分が改善される。５００事象／秒を上回るスループットで事象を分類する高純度および収率を得るために、直径３５～５５マイクロメートルのナノバイアルは、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００のフローソーターおよび１３０マイクロメートルのマイクロ流体分類チップを使用して、初期設定からドロップディレイに調節を加えることなく分類する。その後、個々のナノバイアルに対してインデックスソートを実施し、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートのウェルを分別して、個々のウェルにわたって単一のナノバイアルを有するものが６０％超の占有率を出す。５００事象／秒を上回るスループットで事象を分類するような高純度を出すために、直径３５～４５マイクロメートルのナノバイアルは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩフローソーターおよび１００マイクロメートルのノズルを使用して、分類前にナノバイアルでキャリブレーションしたドロップディレイを用いて高純度分類事象を出すように分類すると、初期設定とは異なる値を出す。３００事象／秒を上回るスループットで事象を分類するような高純度を出すために、直径３５～５５マイクロメートルのナノバイアルは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩフローソーターおよび１３０マイクロメートルのノズルを使用して、分類前にナノバイアルでキャリブレーションした調整済みドロップディレイを用いて高純度分類事象を出すように分類すると、初期設定とは異なる値を出す。１００事象／秒を上回るスループットで事象を分類するような高純度を得るために、３５～８５径マイクロメートルのナノバイアルは、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔマイクロ流体フローソーターと、直径１５０のマイクロ流体チップを使用して分類する。サンプルリザーバー内での素早い沈降を減少させるために、密度整合溶液または増粘剤を添加する。場合によっては、マイクロピペットを使用して、リザーバー内での分類の直前に、サンプルを攪拌する。いくつかの事例では、直径８０マイクロメートルのマイクロ流体チップは、直径が６０ミクロン未満のナノバイアルを分類するために使用し、より好ましくは直径４０ミクロン未満のナノバイアルを分類するために使用し、１秒当たり２００事象超のスループット、純度８０％超である。直径８０ミクロンのチップは、１秒当たり１０００事象超のスループットで、直径４０ミクロン未満のナノバイアルを分類するために使用し、出発集団と比較して４倍の濃縮が示される。総集団の少なくとも１％および１％未満の希少集団について９５％超の高純度を達成するために、複数の濃縮サイクルを使用する。外径が３５マイクロメートル、５０マイクロメートル、または６０マイクロメートルの１０，０００超のナノバイアルを、Ｎａｎｏｃｅｌｌｅｃｔ ＷＯＬＦ Ｇ２セルソーターで分析および分類する。これは、マイクロチャネルベースの分類を使用した、マイクロ流体チップベースのセルソーターである。異なる直径のナノバイアルと、遊離ＣＨＯまたはＪｕｒｋａｔ細胞とは、前方散乱光の高さ対後方散乱の高さのプロット上で明白に分別可能である。ナノバイアルのサイズが３５ミクロンから６０ミクロンまで増加すると、前方散乱光の高さおよび後方散乱光の高さが増加する。分類について、分類されるナノバイアルや、細胞を含有している分類されるナノバイアルにおいて高収率を達成するには、３５ミクロンおよび５０ミクロンのナノバイアルが好ましい。直径３５マイクロメートルのナノバイアルでは、分類純度８８％および回収率８５％を達成する。１８，０００超のナノバイアルを、Ｎｏｄｅｘｕｓ ＮＸ Ｏｎｅを使用して１２０，０００／ｍＬの濃度になるように分析および分類する。蛍光標識ナノバイアルは１０％の濃度で、未標識ナノバイアルから分類されることができ、分類純度８６．４％および回収率７５．６％を達成する。
沈降を防ぐためにフローサイトメーターで使用するための緩衝液
フローサイトメーターでのナノバイアルの操作時に、沈降が生じ、これによって、機器内で事象レートの一貫性のなさが生じる。ナノバイアルの沈降を防止または軽減するために、パルス流をサンプルチューブまたは撹拌棒付きの機械撹拌に入れるなどする撹拌方法を使用する。沈降を防止または軽減して、分析中に均一なナノバイアルの濃度を維持するために、ナノバイアルサンプル溶液に添加剤を添加することも使用する。概して、これは、サンプル溶液の粘度を制御して沈降速度を制御するか、溶液の密度を調節してナノバイアルの純浮力を調整するか、またはその両方の組合せによって達成する。
場合によっては、サンプル溶液に細胞適合性増粘剤（例えばポリエチレングリコール、デキストラン、ヒアルロン酸、アルギン酸など）を添加補充する。サンプル溶液の粘度は、添加剤の様々な特性、とりわけ、濃度、分子量、化学部分などを調節することによって変更する。粘度を１６．７ｍＰａ・秒に増加させるために、５％デキストラン溶液を使用する。概して、沈降速度は、小球の溶液の粘度に反比例する。沈降速度がサンプルのランタイムと比較して十分に低くなる限界において、事象率の変動が極力小さくなることが予想される。例えば、サンプルの予想ランタイムが１時間、かつ、チューブ内のサンプル溶液の深さが１０ｃｍである場合、ランタイム中にナノバイアルが溶液の深さの１０％未満まで沈降するように粘度を調節する。さらなる沈降が許容可能であり、これには例えば、サンプル溶液の深さの５０％未満または２５％未満が挙げられる。粘度に関するさらなる考慮事項として、粘度の増加に起因してナノバイアルおよびナノバイアルの中にある細胞にかかる剪断力の増加が挙げられる。一部のＦＡＣＳ機器においては、機器のチューブまたはチャネル内の粘性抗力および流体抵抗の増加を補うために圧力を増加する。エアロゾルベースのＦＡＣＳ機器においては、場合によっては、添加剤による粘度の変化および界面張力の変化に起因した液滴の分裂の変化を補うために液滴駆動設定を調節する。使用する増粘剤は、光透過性であり、光を散乱する微粒子を含有していない。
場合によっては、ナノバイアルの沈降を軽減するために密度を増加するために、サンプル溶液に添加剤を添加補充する。例示的な密度適合剤として、とりわけ、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、およびＯｐｔｉｐｒｅｐが挙げられる。ナノバイアルがサンプル溶液よりも密度が高い場合は、添加剤を用いて溶液の密度を増加することで、重力と浮力がより緊密に調和され、沈降が軽減される。理想的には、サンプル溶液の密度がナノバイアルと一致しているか、またはこれよりもわずかに密度が低く（例えば、ナノバイアルはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中約１．０３４ｇ／ｍｌであってもよい）、それによって、ナノバイアルはバイアルまたは容器の頂部まで浮上することがない。直径３５～６０ミクロンのポリエチレングリコールナノバイアルについては、中性浮力状態のナノバイアルを作製するにはＰＢＳ中４３～５０％のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ Ｍｅｄｉａを含む溶液が好ましい。場合によっては、ＰＢＳ中４４～５０％のＯｐｔｉｐｒｅｐを含む溶液も使用する。
実施例３：細胞を含有しているナノバイアルの選択的な単離のための緩衝系および密度調整。
ナノバイアル、細胞、および下流での処理前に細胞が結合しているナノバイアルを含有しているが、これらに限定されないサンプルの特定の亜集団を濃縮または枯渇するために、ナノバイアルと細胞との浮力の差を利用する。細胞を含有しているナノバイアルを濃縮し、複数の細胞を含有しているナノバイアルを濃縮し、単一の細胞のみを含有しているナノバイアルを濃縮し、そしてナノバイアルに付着していない細胞を枯渇することが望ましい。
概して、濃縮は、サンプル溶液の密度、ナノバイアルの密度、細胞の密度、または任意の組合せを調節することによって達成し、浮力の差によって、標的集団（例えばナノバイアルに結合した細胞）がバイアルまたは他のベッセルの底部に沈降する一方、望ましくない亜集団（例えば空のナノバイアル）が頂部に浮上する。標的集団をベッセルの底部からピペッティングまたは抽出して新たなベッセルに移すか、あるいは望ましくない集団をベッセルの頂部から取り除き、標的サンプルを濃縮する。関連する実施形態では、標的亜集団が代わりにバイアルまたは他のベッセルの頂部まで浮上し、望ましくない亜集団がバイアルまたは他のベッセルの底部まで沈下する。標的集団をベッセルの頂部からピペッティングまたは抽出して新たなベッセルに移すか、あるいは望ましくない集団をベッセルの底部から取り除き、標的集団を濃縮する。これらの様々なシナリオの例を図５に示す。関連する実施形態では、対象集団は中性浮力を保ち、望ましくない亜集団がベッセルの頂部まで浮上するか、および／またはベッセルの底部に沈降する。標的集団をベッセルの中間部からピペッティングまたは抽出して新たなベッセルに移すか、あるいは望ましくない集団をベッセルの頂部および／または底部から取り除き、標的サンプルを濃縮する。
場合によっては、サンプル溶液、ナノバイアル、細胞、または組合せの密度を調節して、標的亜集団の濃縮を制御する。例えば、サンプル溶液の密度を調節するために、とりわけ、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、グリセロール、ＰＥＧ、Ｄｅｘｔｒａｎ、ヒアルロン酸などの生体適合性水溶性添加剤を使用する。細胞の密度に影響を及ぼして濃縮を増強するためには、溶液のモル浸透圧濃度を調節する。例えば、（通常の生理的リン酸緩衝生理食塩水と比較して）低浸透圧溶液の使用によって、細胞が膨潤し、その密度が減少する。ナノバイアルの密度は、濃縮を増強する多数の方法によって調節する。例えば、密度は、前駆体溶液中で使用されるＰＥＧの濃度を増加させるか、より低分子量のＰＥＧ分子（例えば５ｋＤの４アームＰＥＧ）の使用によって架橋密度を増加させるか、ナノバイアルマトリックス中または表面上（例えばＳｉＯ２微粒子／ナノ粒子、酸化鉄マイクロ粒子／ナノ粒子）のより高密度のマイクロ粒子またはナノ粒子を埋め込むか付着させるかによって増加する。同様に、ナノバイアルの密度は、ＰＥＧ前駆体溶液の濃度を減少するか、前駆体高分子の分子量を増加させるか、より低密度のマイクロ粒子／ナノ粒子（例えば、浮力活性化セルソーティング用ガラス中空粒子－ＢＡＣＳ粒子）を埋め込むか付着させるかによって減少する。また、ナノバイアルに付着している細胞は、細胞を含まないナノバイアルと比較して、細胞を含有しているナノバイアルの有効密度を調節するための細胞特異的な親和性タグを含む、ガラス、酸化鉄、または金属粒子（直径１００ｎｍ～約３μｍ）などの粒子で標識する。細胞に対するナノバイアルの有効密度は、細胞膜には非透過性であるがナノバイアルマトリックスに輸送または拡散するより高（またはより低）密度の添加剤を使用することによって調節する。
底部における、細胞を含むナノバイアルの濃縮
非限定的な例示的な一実施形態では、ナノバイアル（本明細書の別の場所に記載されているプロセスを使用して製作されたもの）、および細胞が付着しているナノバイアルを含有しているベッセル（例えば遠心分離チューブ）に、高分子量の生体適合性密度変更添加剤を添加する（１０）。溶液は、ナノバイアルの密度と等しいか、またはこれよりもわずかに大きい密度（例えば１．０３４ｇ／ｍｌ）を有し、かつ、ナノバイアルマトリックスに拡散してナノバイアルの密度を変化させるのを防ぐために、ナノバイアルへの輸送には大きすぎる密度調節分子を含有する。これらの条件では、細胞が付着していないナノバイアルは浮力があり、ベッセルの頂部まで浮上する。細胞（例えば直径６～２０ミクロンのサイズかつ１．０５～１．０８ｇ／ｍｌの密度を有する細胞）が付着しているナノバイアルは浮力がないが、これは、細胞とナノバイアルの全体的な質量が、置換済みの溶液の質量よりも大きいからである。例えば、密度変更剤として４０％のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ Ｍｅｄｉａ溶液を使用して、１．０３４ｇ／ｍｌよりもわずかに大きい密度を達成する。ベッセル内のナノバイアルを密度変更剤と共にインキュベートすることで、細胞が付着しているナノバイアルをベッセルの底部に沈降させるか、あるいは１８０ｇで遠心分離し、細胞が付着しているナノバイアルの、ベッセルの底部への輸送を加速することで、ベッセルの底部で、細胞が付着しているナノバイアルの濃縮画分が得られる。例えばピペットによって、ベッセルの底部からナノバイアルをベッセルの外に移し、細胞が付着しているナノバイアルの濃縮画分を含有している溶液を作製する。代わりに、例えばピペットによって、ベッセルの頂部の上清中にある、細胞を含まないナノバイアルをベッセルの外に移し、ベッセル内に残存している、細胞が付着しているナノバイアルの濃縮セットを作製する。その後、この密度ベースの濃縮後、下流でのフローサイトメトリーのために上記のように、密度変更添加剤を緩衝液、培地、または他の密度適合溶液と交換する。
上部における、細胞を含むナノバイアルの濃縮
代替的な非限定的な一例では、ナノバイアル、および細胞が付着しているナノバイアルを含有しているベッセル（例えば遠心分離チューブ）に、低分子量の生体適合性密度変更添加剤を添加する。ここで、添加剤は、ナノバイアルのヒドロゲルマトリックスに自在に拡散するような十分に小さい分子量を有し、それによって、その有効密度が増加する。例えば、分子量は、４０ｋＤ未満または１０ｋＤ未満である。例えば、製造例（実施例１）の項目で記載されている方法を使用して製作したナノバイアルは、水中またはＰＢＳ中１．０３ｇ／ｍｌの概略密度を有する。溶液にＯｐｔｉｐｒｅｐを添加した場合は、濃度の増加とともに、ナノビアルの密度が増加する。これらのナノバイアルは、ＰＢＳ中４４％のＯｐｔｉｐｒｅｐから構成されている溶液中でほぼ中性浮力であり、これは、１．１４ｇ／ｍｌの概略密度を有する。この濃度を上回ると、ナノバイアルはベッセルの頂部まで浮上し始める。空のナノバイアルから、細胞が付着しているナノバイアルを分別するために、溶液の密度を、空のナノバイアルの中性浮力状態の時の密度をほんの少し下回るように調節する。サンプル溶液をインキュベートすることで、空のナノバイアルをベッセルの底部に沈降させ、かつ、細胞が付着しているナノバイアルをベッセルの頂部まで浮上させる（１２）。場合によっては、遠心分離を使用して、空のナノバイアルの、ベッセルの底部への輸送速度を増加させ、細胞が付着しているナノバイアルの、ベッセルの上部への輸送速度を増加させることで、ベッセルの上部において細胞が付着しているナノバイアルの濃縮画分が得られる。
底部における、遊離細胞とは別のナノバイアルに結合している細胞の濃縮
別の非限定的な例では、浮力の差を利用して、ナノバイアルに結合している細胞から、非結合細胞を分別する（１４）。例えば、細胞の密度がサンプル溶液よりも小さく、かつ、細胞が結合しているナノバイアルの有効密度がサンプル溶液よりも大きい場合は、細胞が頂部まで浮上し、細胞を含むナノバイアルが底部まで沈下する。一実施形態では、ナノバイアルおよび細胞を含有しているベッセルに、溶液の密度が細胞の中性浮力状態の時の密度をわずかに上回るものの、ナノバイアルの中性浮力状態の時の密度を下回ったままであるように、Ｏｐｔｉｐｒｅｐを添加する。例えば、ＰＢＳ中または培地中３３％ｖ／ｖのＯｐｔｉｐｒｅｐから構成されるサンプル溶液は、１．１ｇ／ｍｌの概略密度を有する。細胞およびナノバイアルに結合している細胞と共にインキュベートすると、遊離細胞は頂部まで浮上するので、ピペッティングまたは吸引によって取り除き、細胞を含むナノバイアルはベッセルの底部まで沈下するので、ピペッティングによって移すことができる。場合によっては、プロセスを高速化するために、上述のように遠心分離を使用する。
頂部における、遊離細胞とは別のナノバイアルに結合している細胞の濃縮
別の非限定的な例では、浮力の差を利用して、ナノバイアルに結合している細胞から、非結合細胞を分別する（１６）。例えば、細胞の密度がサンプル溶液よりも大きく、かつ、細胞が結合しているナノバイアルの有効密度がサンプル溶液よりも小さい場合は、細胞がベッセルの底部まで沈下し、細胞を含むナノバイアルが頂部まで浮上する。例示的な一実施形態では、ナノバイアルおよび細胞を含有しているベッセルに、溶液の密度が細胞の中性浮力状態の時の密度をわずかに下回るものの、ナノバイアルの中性浮力状態の時の密度を上回ったままであるように、Ｆｉｃｏｌｌを添加する。例えば、ＰＢＳ中または培地中８０％ｖ／ｖのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ Ｍｅｄｉａから構成されたサンプル溶液は、１．０６ｇ／ｍｌの概略密度を有する。細胞およびナノバイアルに結合している細胞と共にインキュベートすると、遊離細胞はベッセルの底部まで沈下するので、ピペッティングまたは吸引によって取り除き、細胞を含むナノバイアルはベッセルの頂部まで浮上するので、ピペッティングによって移して、濃縮画分を作製する。場合によっては、細胞およびナノバイアルの、頂部または底部への輸送速度を増加させるために、上述のように遠心分離を使用する。
ナノバイアルの浮力ベースの分別の非限定的な例
一実施形態では、遊離細胞からの、細胞が結合しているナノバイアルの浮力ベースの分別は、最初にビオチン官能化ＰＥＧ－ノルボルネン ３５μｍ直径のナノバイアルに３０μｇ／ｍＬの最終濃度でストレプトアビジンを被覆することによって達成する。その後、洗浄手順（本明細書に記載）を使用して、ストレプトアビジンコンジュゲートナノバイアルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、４０００ナノバイアル／μＬの濃度になるように洗浄緩衝液中に再懸濁する。その後、抗ヒトＣＤ４５抗体（ビオチン化）は、１６５μＬの８μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４５抗体と、１６５μＬのストレプトアビジンコンジュゲートナノバイアル溶液とを混合することによってナノバイアルに結合する。混合溶液をピペッティングし、抗体がナノバイアルに結合するように３０分間室温でインキュベートする。洗浄手順を使用して、ナノバイアル溶液を３回洗浄し、最終濃度３３０μＬになるように再懸濁する。２４ウェルプレートは、ウェル当たり１ｍＬの培地で調製する。各ウェルに、抗体を被覆した３μＬのナノバイアルを導入し、３０分間静置する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、細胞１２２，０００個／ウェルの濃度になるようにウェルに播種する。細胞を２０分間静置して沈降させ、その後、インキュベーターに移して、６０分かけてナノバイアルの空洞部に担持された細胞を結合させる。その後、サンプルをチューブにピペッティングし、３００ｇで１分間遠心分離し、洗浄緩衝液または洗浄緩衝液対照を混合した２４％、２９％、３１％、または３３％のＯｐｔｉで前処理した溶液で再懸濁する。サンプルを１０秒間ボルテックスして再懸濁し、６００ｇで３０分間遠心分離してブレイクオフする。上清およびペレットをピペットアウトして画像化する。図２２は、２４％、２９％、３１％、または３３％のＯｐｔｉで前処理した溶液について、ナノバイアルおよび細胞が付着しているナノバイアルから遊離細胞が大部分取り除かれていることを示す。これによって、対照洗浄緩衝液と比較して、ペレット内の細胞が付着しているナノバイアルの有効濃縮が得られ、遊離細胞が取り除かれる。また、遊離細胞も上清中で回収することができる。
実施例４：ナノバイアルに対するアッセイを実施する方法。
概して、ナノバイアルは、アッセイのための基質として機能し、マルチウェルプレートで実施される従来のワークフローと同様に、関心対象の細胞から放出される産物はアッセイの一部となる。一般的なワークフローでは、標的細胞または分子をナノバイアルの表面に固定する。その後、関心対象の細胞をナノバイアルの表面に付着する。関心対象の細胞は、インキュベーション期間にわたって産物または分子を分泌または放出するので、これを、ナノバイアルアッセイで評価する。その後、ナノバイアルの表面でアッセイ（蛍光、オリゴヌクレオチドコード、磁気）の読み出しシグナルを得て、関心対象の細胞の機能および／または関心対象の細胞からの生物学的産物に関する報告を得る。場合によっては、洗浄工程は、アッセイ工程間に実施する。多数の関心対象の細胞と様々な生物学的産物とを含む、複数のこのようなナノバイアルは、関心対象の細胞の機能情報および／または生物学的産物の機能情報に基づくプラットフォームで分析および／または分類する。
親和性アッセイ
非限定的な例では、方法は、関心対象の細胞（例えばＢ細胞、形質芽細胞、形質細胞、ハイブリドーマ、操作されたプロデューサー細胞など）から分泌される抗体の結合親和性を分析する工程と、結合親和性に関連付けられるこの抗体の配列情報を特徴付ける工程とを含む（図８）。抗体親和性は、分泌抗体捕捉部分および細胞捕捉部分を含むナノバイアルを使用して判定する。分泌抗体捕捉部分として、例えば、分泌抗体を捕捉する抗Ｆｃの抗体が挙げられ、それによって、Ｆａｂ領域は何も含まず、抗原に結合可能である。他の抗体捕捉部分として、プロテインＡ、プロテインＧ、または抗原が挙げられる。細胞捕捉部分として、例えばＢ細胞、形質芽細胞、または形質細胞に対する抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３８、および／または抗ＣＤ１３８が挙げられ、ならびに、高度に発現する他の表面タンパク質に対する抗体が挙げられる。関連する実施形態では、細胞捕捉部分として、ビオチンまたはストレプトアビジンが挙げられ、細胞／Ｂ細胞の細胞表面タンパク質にビオチン化抗体またはストレプトアビジン結合抗体が被覆され、これには、例えばビオチン化抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３８、および／または抗ＣＤ１３８が挙げられる。また、細胞捕捉部分として、抗原が挙げられ、これによって、Ｂ細胞のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）または形質芽細胞がナノバイアルに結合することができる。同様に、抗体捕捉部分は、ナノバイアルに被覆されたビオチンまたはストレプトアビジンを含み、これがその後、ナノバイアルで細胞を捕捉する前または後に、ビオチンまたはストレプトアビジンをコンジュゲートした抗ＦＣ抗体に結合する。関心対象の細胞間の分泌の差を正規化して／考慮することができるので、正確な親和性測定を達成する。これは、（１）ナノバイアルに関心対象の細胞を捕捉する工程、（２）任意選択で、関心対象の細胞およびナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（好ましくは３０分～３時間、これより好ましさが低いのは３～２４時間）にわたって関心対象の細胞をインキュベートし、抗体捕捉部位がすべて飽和する（例えば、分泌抗体に結合される）ように、ナノバイアルの表面に蓄積した分泌抗体を捕捉する工程、（４）所望の親和性に応じて１つ以上の濃度で標識済み抗原を添加する工程（概して、抗原の濃度は、スクリーニングに望ましい解離定数ＫＤカットオフに適合すべきであり、例えば、抗原の濃度は、ＫＤと等しいか、ＫＤよりも１桁低い程度内であるか、またはＫＤよりも１桁高い程度内である）（例示的な濃度として、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、または１ｎＭの抗原）、（５）ナノバイアルに結合して関心対象の細胞の分泌に関連付けられる標識済み抗原の量を判定する工程、およびその後（６）関心対象の細胞からの分泌抗体について配列情報を特定する工程によって達成する。上記の実施形態では、好ましくは、細胞の多様性を考慮して、担持工程において関心対象の細胞を２０，０００超のナノバイアルに担持させ、より好ましくは、より多くの多様性を捕捉するために、関心対象の細胞を１００，０００超のナノバイアルに播種する。さらにより好ましくは、最多の多様性を捕捉するために、関心対象の細胞を５００，０００超のナノバイアルに播種する。場合によっては、工程４は、工程３と同時に実施する。いくつかの事例では、工程２および３は、工程１と同時に実施する。
場合によっては、標識済み抗原は、フルオロフォアで標識している。例示的なフルオロフォアとして、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６４７、フルオレセインなどが挙げられる。フルオロフォアは、当技術分野において既知の標準的なバイオコンジュゲーション技術（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ番号：Ａ１０２３５、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、抗原にコンジュゲートする。これらの標識キットについては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒに結合させるために、抗原に存在する遊離リシン残基を使用するが、しかしながら、そのようなリジン基が存在しない場合、または代替的な手法として、端子リシン残基または他のタンパク質親和性タグ（例えばストレプトアビジン、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグなど）への融合を含有する抗原の組換え版を生成する。抗原がタンパク質親和性タグと関連付けられる場合は、分析または分類に先立って、抗原を、フルオロフォア、オリゴヌクレオチドバーコード、または磁性粒子、およびタンパク質親和性タグに対する親和性を含む抗体または他の親和性試薬（アプタマー、ビオチン、ペプチド）で蛍光標識するか、あるいは他の方法で標識する。抗原がフルオロフォアで標識される、この特定の実施形態では、ナノバイアルに結合している標識済み抗原の量は判定することは、ナノバイアルおよび関心対象の結合細胞を、フローサイトメーターまたは蛍光活性セルソーター（ＦＡＣＳ）を通して流すこと、ならびに、分類判定をおこなうために、ナノバイアルおよび関心対象の関連細胞からの１つ以上の蛍光シグナルを分析することを含む。例えば、バックグラウンドレベルを上回る蛍光シグナルを有する任意のナノバイアルおよび関連細胞を分類するために、ゲートまたは閾値を使用する（例えば、バックグラウンドレベルを上回る１標準偏差、バックグラウンドレベルを上回る２標準偏差、バックグラウンドレベルを上回る３標準偏差）。蛍光シグナルに基づいて、分析される細胞の集団の上位パーセンテージ、例えば、ナノバイアルおよび関心対象の関連細胞の集団の上位１％、あるいは代わりに上位０．１％、上位０．０５％、上位０．０１％、上位５％、または上位１０％を分類するために、閾値も規定する。閾値を上回る、またはゲート内の分類した多数のナノバイアルおよび関連細胞は、貯留容器またはウェルプレートのウェルに分類されるか、あるいは単一のナノバイアルおよび関心対象の関連細胞は、ウェルプレートの個々のウェルに分類される。ナノバイアルの結合抗原の蛍光シグナルと、特定のウェルとをつなぐために、ＦＡＣＳシステムのインデックスソート機能を使用し、マルチウェルプレートに分類した。これによって、抗体の親和性情報を、特定のウェルにある関心対象の特定の細胞に結び付けることができる。その後、ウェルプレートの異なるウェルにある関心対象の個々のナノバイアルおよび関連細胞を溶解し、関心対象の細胞によって分泌される抗体の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡを作製するために、当技術分野において既知のように、ｍＲＮＡを逆転写する。例えば、単一の細胞から逆転写を実施するプライマーセットおよび操作条件は、Ｏｚａｗａ，Ｔａｔｓｕｈｉｋｏら「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＤＮＡ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ｂｙ ５′－ＲＡＣＥ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｅａｖｙ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂ Ｃｅｌｌｓ．」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｖｏｌ．４０、ｎｏ．４、２００６、ｐｐ．４６９～４７８．、ｄｏｉ：１０．２１４４／０００１１２１２３に記載されている。ｃＤＮＡを単離し、Ｏｚａｗａらに記載されて当業者に既知である他の特定のプライマーセットでは、ＰＣＲを使用して、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを増幅する。増幅したｃＤＮＡは、例えば、複数の個々の関心対象の細胞についてＳａｎｇｅｒシーケンシングまた次世代シーケンシングを使用して、ＰＣＲの際にバーコードアダプターを使用して、配列決定する。例えば、ＩＤＴ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のｘＧｅｎ（商標）Ｓｔｕｂｂｙ ＡｄａｐｔｅｒおよびＵＤＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐａｉｒｓ、Ｉｎｄｅｘ １－９６、カタログ番号１０００５９２１を使用して、プールされた次世代シーケンシングのために、９６ウェルプレートから各ｃＤＮＡプールをインデックスする。その後、特定のバーコードアダプターインデックスを有する配列情報と、分類した特定のウェルにある細胞のインデックスとを結び付けることによって、特異的結合または特異的親和性（１／ＫＤ）に関連付けられる抗体をコードするＤＮＡ配列情報を判定し、配列情報と特定の蛍光シグナルとの間の関連付けを得る。
例示的な非限定的な一例では、マウス脾臓または骨髄のハイブリドーマ細胞または形質芽細胞／形質細胞を、直径３５ミクロンのナノバイアルを使用して、抗原に結合している分泌抗体に基づいて分析および分類する。４０００ナノバイアル／マイクロリットル濃度のある容量のナノバイアル溶液を、マイクロ遠心チューブ内で調製する。洗浄緩衝液中６０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンで、ナノバイアル溶液と等しい容量でインキュベートすることによって、ビオチン官能基化ナノバイアルにストレプトアビジンを被覆する。洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１４１９０２５０）中０．５％のウシ血清アルブミン（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、７００－１０２Ｐ）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、および０．０５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７からなる。その後、ナノバイアルを緩衝液で３回洗浄する。洗浄手順は、３００ｇで２～３分間遠心分離すること、ナノバイアルペレットの上方において上清を吸引すること、および（最終洗浄にて）サンプルを元の容量の１０倍または元の容量のいずれかに戻すように希釈することからなる。ナノバイアル溶液のものと等しいビオチン化抗体溶液も調製する。細胞捕捉抗体（ａＣＤ４５－ビオチン、クローン３０－Ｆ１１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、商品番号５０－１１５－４９）およびビオチン化ＩｇＧ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、商品番号１１５－０６５－０７１）を抗体溶液中で混合し、洗浄緩衝液中８μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＣＤ４５と１２μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＩｇＧの標的を達成する。形質細胞に特異的な捕捉については、抗ＣＤ４５－ビオチンの代わりに、ビオチン化抗ＣＤ１３８を添加してもよい。使用する抗体にタンパク質の凝集体が確実に含まれないようにするために、抗体バイアルを１０，０００ｇで１０分間遠心し、バイアルの頂部から溶液を取り出す。ナノバイアルサンプルを、抗体溶液と混合し、室温で少なくとも３０分間インキュベートして、ナノバイアルに抗体を被覆する。ナノバイアルを摂氏４度で一晩保管するか、あるいは被覆した後に続いて使用してもよい。ナノバイアルを洗浄緩衝液で２回洗浄し、その後、新鮮な細胞培地で洗浄して、元の容量になるように再懸濁する。
ナノバイアルへの細胞の担持。最初に細胞４０００個／マイクロリットルの密度で細胞溶液を調製し、高回収率、標準、または高スループットの細胞担持モードならびにナノバイアルの容量に応じて、適切な容量の細胞を添加することによって、ハイブリドーマ細胞（例えばＨｙＨＥＬ－５）をナノバイアルに担持させる。担持は、図２３に示される多数の条件にわたって成功する。高回収率モードについては、細胞を、ナノバイアルと共に１：４の容量比で添加することで、細胞回収率４７％および細胞担持ナノバイアル１２％が得られる。通常モードについては、細胞を、ナノバイアルと共に１：１の容量比で添加することで、細胞回収率２８％および細胞担持ナノバイアル２８％が得られる。高スループットモードについては、細胞を、ナノバイアルと共に４：１の容量比で担持することで、細胞回収率１２％および細胞担持ナノバイアル５０％が得られる。また、単一細胞が担持されている最高画分は、高回収率モードで達成される。細胞を担持するために、細胞懸濁液の容量をマイクロピペットで取り出し、ナノバイアルペレットの中央にゆっくりと分注する。チューブ内の合計容量の少なくとも半分になるようにマイクロピペットの容量を調節して、ナノバイアルと細胞を混合する。ナノバイアルおよび細胞を、円を描きながら３０秒間上下にスムーズにピペッティングして、ナノバイアルおよび細胞を均一になるように混合する。ナノバイアルおよび細胞を含有しているマイクロ遠心チューブを、摂氏４度で６０分間インキュベートして、細胞をナノバイアルに結合させる。
バックグラウンド細胞の除去。２０μｍセルストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＣ９６９９０１８）を使用して、ナノバイアルに付着していないバックグラウンド細胞を取り除く。小端部が５０ｍＬ容量の円錐チューブの廃液より上に上方向に指すようにして２０μｍセルストレーナーを持つ。細胞担持ナノバイアル懸濁液をマイクロ遠心チューブからセルストレーナーの小端部に注意深くピペッティングすることによって、バックグラウンド細胞をこし取る。さらなる約１ｍｌの洗浄緩衝液をサンプルチューブにピペッティングして、さらなるナノバイアルを回収し、セルストレーナーにピペッティングする。ストレーナーを、さらなる２ｍｌの洗浄緩衝液ですすぎ、バックグラウンド細胞をさらに取り除く。細胞ストレーナーをひっくり返してストレーナーによって洗浄緩衝液をピペッティングすることによって、予め被覆済みの１５ｍＬ容量の円錐チューブにナノバイアル粒子を回収する。１５ｍＬ容量の円錐チューブは、チューブに２ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、すべての表面を覆うように手で回転させ、過剰容量を吸引することによって予め被覆する。サンプルは、ナノバイアル粒子をスピンダウンしてペレットにし、上清を吸引し、元のナノバイアル溶液容量になるように培地で再懸濁することによって洗浄する。
分泌物のインキュベーション。細胞を含有している濾過済みの細胞を摂氏３７度で１時間インキュベートして、分泌物をナノバイアルに蓄積する。ナノバイアルを一緒に入れたチューブ内で、ナノバイアルにある分泌細胞をインキュベートし、ナノバイアルの空洞部を遮断して、対流流体や拡散を防ぎ、分泌産物をナノバイアルの空洞部に濃縮する。代わりに、例えば１Ｈｚで作動する実験室用ロッカーを使用して、連続揺動下でインキュベーションを実施してもよい。代わりに、ナノバイアルをピペッティングして、例えば、近接するナノバイアル間に平均１００μｍ超の距離が存在するようにウェルプレート表面上に塗り広げたウェルプレートで、インキュベーションを実施してもよい。
捕捉分泌物の標識。インキュベーション後に、洗浄手順を使用して、ナノバイアルおよび細胞をＰＢＳで３回洗浄し、元のナノバイアル容量になるようにＰＢＳで再懸濁する。蛍光標識済み抗原の溶液（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）６４７とコンジュゲートした蛍光ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ））を、本明細書で記載される予想親和性に応じて所望の濃度でＰＢＳ中で調製する。ＨＥＬについては、５μｇ／ｍＬの溶液を調製する。ナノバイアルサンプル容量と等しい容量のこの標識溶液を混合して、一緒に穏やかにピペッティングする。混合に続いて、標識溶液を含むナノバイアルを摂氏４度で３０分間インキュベートする。分泌抗体への潜在的結合後に、洗浄手順を使用して、ナノバイアルをＰＢＳ中で３回洗浄し、分析および／または分類のために分類用緩衝液中に再懸濁する。分類用緩衝液は、ＰＢＳ中２％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、０．０５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７からなり、これを０．２２μｍ容量のステリカップフィルターで無菌濾過して、摂氏４度で保管する。
分泌ＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ細胞を反射する染色済みナノバイアルの画像を、このプロトコールに従って図２４Ａに示す。担持行程中に摂氏４度、摂氏２１度、および摂氏３７度で細胞を担持させた後に、ＨＥＬ（抗原特異的細胞）に対して抗体を分泌する細胞を、ＨＥＬに対して強いナノバイアル染色に関連付ける。乳化工程なしで摂氏４度または摂氏２１度で担持させた場合は、他のナノバイアル（抗体分泌細胞を含有していないもの）へのクロストークの減少が観察される。９Ｅ１０ハイブリドーマ（非特異的細胞）については、ＨＥＬ－ＡＦ６４７で染色した場合は、同じ条件下ではっきりしたシグナルは観察されない。担持後に分泌物のインキュベーション中に乳化工程を含む場合の結果は、同等に見える（図２４Ｂ）。結果によると、抗原結合がＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ（抗原特異的細胞）に特異的であり、点状蛍光シグナルが細胞担持ナノバイアルに関連付けられることが示されている。ナノバイアルの乳化は、２００マイクロリットルの内包用油を使用し、１００マイクロリットルのピペットを用いて１Ｈｚの速度でピペッティングし、続いて、上に２００マイクロリットルの鉱油を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることで達成した。２００マイクロリットルの乳化不安定化剤（パーフルオロ－オクタノール）を使用し、穏やかに叩き、１０分間回転させてエマルジョンを破壊する。ゆっくりと上下にピペッティングし、油が滴下するのを避けながらナノバイアルを分注した後に、ナノバイアルサンプルを回収する。
ＦＡＣＳによる分析および分類。ＦＡＣＳファルコンチューブは、分類用緩衝液で予め被覆する。収集用チューブには、ハイブリドーマまたは血漿Ｂ細胞を支持する培地を充填する。ナノバイアルサンプルを、分類用緩衝液中で所望の濃度に希釈し、好ましくは、約１００事象／秒～約２，０００事象／秒の分類スループットを達成する。蛍光ストレプトアビジンで染色した少量の対照ナノバイアルサンプルを走行させ、前方散乱光、側方散乱光、シングレットの適切なゲートを特定し、本明細書に記載されるいずれかの蛍光補正を実施する。例えば、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００フローサイトメーターで前方散乱光の幅および側方散乱光の高さを使用して、遊離細胞、何も含まないナノバイアル、および細胞担持ナノバイアルを区別することができる（図２５）。細胞担持ナノバイアルは、前方散乱光の幅および側方散乱光の高さがより大きく、何も含まないナノバイアルおよび遊離細胞を使用して、これらの他の事象を５％未満または１％未満含んでいる閾値を規定することで、前方散乱光の幅および側方散乱光の高さに基づいてゲートアウトすることができる。ナノバイアルにコンジュゲートしたＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素およびＤｙｌｉｇｈｔ４０５標識ストレプトアビジンを使用することでも、細胞担持ナノバイアルをゲーティングし、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒシグナルおよびＤｙｌｉｇｈｔ４０５の両方において高い事象（２つの蛍光高さチャネルで見られる）として選択することができる。図２６Ａおよび２６Ｂは、ＨＥＬ特異的ＩｇＧ分泌シグナルについて、何も含まないまたは空のナノバイアルおよび遊離細胞と比較した細胞担持ナノバイアルのゲートを示す（ＡＦ６４７チャネル蛍光ピークの高さ（Ｈ）およびピークの面積（Ａ））。図２６Ａにゲートを示す。細胞担持ナノバイアルは、蛍光ピークの高さ（ＡＦ６４７－ＩｇＧ（Ｈ））と蛍光ピークの面積（ＡＦ６４７－ＩｇＧ（Ａ））の両方において大幅により高いＨＥＬ特異的ＩｇＧ分泌シグナルを有する（図２６Ｂ）。これは、結合ＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ細胞による抗ＨＥＬ－ＩｇＧの分泌に対応する。分類した細胞は、インデックスソートするか、下流におけるｃＤＮＡライブラリーの調製や、抗体の配列情報を得るためのシーケンシングのためにプールすることができる。
別の非限定的な例では、標識済み抗原を、フルオロフォアに加えて、またはフルオロフォアの代わりにオリゴヌクレオチドバーコードで標識する（図９）。この実施形態では、標識済み抗原を、オリゴヌクレオチド配列のみで標識するが、これは、製造業者の説明書に従って、例えばＡｂｃａｍ製の５’Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標）（ａｂ２７０７０３）を使用する。この手法については、関心対象の分泌細胞に結合して関連付けられる標識済み抗原の量は（工程５）、各ナノバイアルの単一細胞ＲＮＡシーケンシングを使用して特徴付けし、関心対象の分泌細胞に関連付ける。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを実施する際に、工程６を同時に実施する。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフローを使用して、例えば、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム、ドロップシーケンシング、インドロップシーケンシング、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、Ｒｈａｐｓｏｄｙなどを使用して、すべてのナノバイアル、オリゴヌクレオチドバーコードを含む結合抗原、ｍＲＮＡをコードする重鎖および軽鎖を含む細胞を共に分析する。標準的な単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを実行するためにこれらのシステムに単一の細胞を担持させるのと同様の方法で、ナノバイアル（好ましくは直径２０～６０ミクロン）を直接担持させ、通常通りに液滴を形成する。例えば、細胞を担持させて標識したナノバイアルを、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍと互換性のあるマイクロ流体チップのサンプル用入口に導入し、通常通りに液滴を形成する（図７Ａ～７Ｄおよび２７）。例えば、直径３５マイクロメートルのナノバイアルは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ＮｅｘｔＧＥＭ Ｃｈｉｐ Ｇ、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｈｉｐ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｂ、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｈｉｐ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｃ、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｈｉｐ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄでの使用に適合している（図２８Ａ）。これより好ましさが低くなるが、直径６０マイクロメートルのナノバイアルは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ＮｅｘｔＧＥＭ Ｃｈｉｐでの使用に適合している（図２８Ｂ）。場合によっては、ＦＡＣＳを使用して、細胞を含有しているナノバイアルの集団を予め濃縮する（例えば、以上に説明される散乱光情報、蛍光細胞染色、または蛍光生死判定色素を使用）。また、標識済み抗原がオリゴヌクレオチド標識に加えて蛍光標識を含む場合は、ＦＡＣＳを実施して、閾値を上回る抗原からの蛍光シグナルを有するナノバイアルを予め濃縮する。これは、閾値を上回る親和性を有する抗原に結合する抗体を産生する関心対象の分泌細胞を含有しているナノバイアル、または標識済み抗原に対する親和性を有するＢ細胞受容体を含有しているナノバイアルに対応する。その後、この分類したナノバイアルの集団をプールし、以上に説明される単一細胞シーケンシングによって、下流で分析する。特筆すべきは、この場合、親和性と重鎖および軽鎖の配列情報との間の結び付きは、細胞特異的（ここでは、ナノバイアルおよび細胞特定的）ｍＲＮＡの捕捉および単一細胞シーケンシングのワークフロー中に生じるバーコード工程に起因して直接できる。ワークフローを実施するための代替的な手法は、ｍＲＮＡの捕捉と、単一細胞特異的バーコード化のためのオリゴヌクレオチドでのパーコード化とを組み込み、本明細書に記載される技術を使用してナノバイアルに直接結び付けることである。その後、ナノバイアルを乳化し、細胞を溶解し、下流で１０ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムのような機器を使用することなくｍＲＮＡを捕捉する。その後、逆転写を実施し、続いてエマルジョンを破壊して、ナノバイアル特異的バーコードを含む細胞／ナノバイアル特異的ｃＤＮＡを作製する。その後、関心対象の単一の分泌細胞それぞれに対して分泌抗原ならびに重鎖および軽鎖配列の両方に対する抗原親和性をコードする多数のナノバイアル特異的ｃＤＮＡから、配列決定ライブラリーを調製する。
別の非限定的な例では、マウス脾臓または骨髄からのハイブリドーマ細胞または形質芽細胞／形質細胞を、分泌抗体のレベルまたは抗原への分泌抗体の結合に基づいて、直径３５ミクロンのナノバイアルを使用して単一細胞シーケンシングのワークフローを用いて分析する。
ナノバイアルの修正。
場合によっては、直径３５ミクロンのＰＥＧ－ノルボルネンビオチン化ナノバイアルを、ストレプトアビジン（ＳＡ）コンジュゲートオリゴヌクレオチドバーコードで標識して、ナノバイアル標識（ＮＬ）を形成する。例として、ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｃ０９６１ ＰＥ ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎおよびＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｃ０９７１ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎが挙げられる。例示的な実施形態では、ストレプトアビジンコンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび非修飾ストレプトアビジンを、それぞれ２０マイクログラム／ｍＬおよび４０マイクログラム／ｍＬの濃度になるように混合する。この混合済みのストレプトアビジンからなる２５０マイクロリットルの溶液を、２５０マイクロリットルのビオチン化ナノバイアルと共に、４０００ナノバイアル／マイクロリットル（約１，０００，０００ナノバイアル）の濃度になるように回転盤上で室温で２５分間インキュベートし、その後洗浄緩衝液で３回洗浄する。いくつかの実施形態では、単一のストレプトアビジンバーコード配列を含むナノバイアルを使用する。他の実施形態では、ナノバイアルの複数の群を、固有のストレプトアビジンバーコード配列で標識し、その後、複数のサンプルの多重化分析または追跡が可能なように、ワークフローの後段でプールする。ナノバイアル標識（ＮＬ）を使用するワークフローでは、配列を使用して、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭシステムにおいて別個のビーズバーコード、例えばゲルビーズバーコードを用いて特定の画分におけるナノバイアルの存在を確認してもよい。例えば、１０Ｘ単一細胞シーケンシングのワークフローでは、ナノバイアルに標識されているストレプトアビジンバーコードを使用して、ナノバイアルに関連付けられている細胞事象と、ナノバイアルに関連付けられていない細胞事象とを特定することができる。オリゴヌクレオチドバーコードを付した２５０マイクロリットル容量のストレプトアビジン被覆済みのナノバイアルに、ビオチン化抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０４００４）をコンジュゲートして、Ｒａｊｉ細胞（ヒト白血病株）を捕捉する。２５０マイクロリットル容量のストレプトアビジン被覆済みのナノバイアルに、２５０マイクロリットルの８マイクログラム／ｍＬの抗ヒトＣＤ４５抗体を、４０００ナノバイアル／マイクロリットルの濃度になるように添加する。平行して、バーコードを付していないストレプトアビジン被覆済みのナノバイアルを、抗マウスＣＤ４５捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ１１４）で修飾して、マウスハイブリドーマ細胞を捕捉し、抗マウスＩｇＧ（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５－０６５－０７１）で修飾して、分泌されたＩｇＧを捕捉する。１５０マイクロリットルのストレプトアビジン被覆済みのナノバイアルに、１５０マイクロリットルの８マイクログラム／ｍＬの抗マウスＣＤ４５抗体および２０マイクログラム／ｍＬの抗マウスＩｇＧ抗体を、４０００ナノバイアル／マイクロリットルの濃度（約６００，０００のナノバイアル）になるように添加する。バーコード付きのナノバイアルとバーコードなしのナノバイアルの両方について、溶液を回転盤上で摂氏４度で一晩インキュベートする。インキュベーション後に、本明細書に記載される洗浄手順を使用して、ナノバイアルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、元の溶液容量になるように再懸濁する。
細胞の担持。ＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ細胞（標的ハイブリドーマ）およびＲａｊｉ細胞（アッセイの特異性を判定するためのバックグラウンド細胞）の懸濁液を、細胞１，０００，０００個／ｍＬの濃度になるように別個に調製する。オリゴヌクレオチドバーコード付きのＳＡナノバイアルには、２，８２０マイクロリットルのＲａｊｉ細胞懸濁液を添加する。バーコードなしのナノバイアルには、１，２３０マイクロリットルのＨｙＨＥＬ－５細胞懸濁液を添加する。細胞を担持させるために、細胞懸濁液の容量をマイクロピペットで取り出し、ナノバイアルペレットの中央にゆっくりと分注する。チューブ内の合計容量の少なくとも半分になるようにマイクロピペットの容量を調節して、ナノバイアルと細胞を混合する。ナノバイアルおよび細胞を、円を描きながら３０秒間上下にスムーズにピペッティングして、ナノバイアルおよび細胞を均一になるように混合する。ナノバイアルおよび細胞を含有しているマイクロ遠心チューブを、摂氏４度で６０分間インキュベートして、細胞をナノバイアルに結合させる。
バックグラウンド細胞の除去。２０μｍセルストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＣ９６９９０１８）を使用して、ナノバイアルに付着していないバックグラウンド細胞を取り除く。小端部が５０ｍＬ容量の円錐チューブの廃液より上に上方向に指すようにして２０μｍセルストレーナーを持つ。細胞担持ナノバイアル懸濁液をマイクロ遠心チューブからセルストレーナーの小端部に注意深くピペッティングすることによって、バックグラウンド細胞をこし取る。さらなる約１ｍｌの温かい細胞培地をサンプルチューブにピペッティングして、さらなるナノバイアルを回収し、セルストレーナーにピペッティングする。ストレーナーを、さらなる２ｍｌの温かい培地ですすぎ、バックグラウンド細胞をさらに取り除く。細胞ストレーナーをひっくり返してストレーナーによって温かい培地をピペッティングすることによって、予め被覆済みの１５ｍＬ容量の円錐チューブにナノバイアル粒子を回収する。１５ｍＬ容量の円錐チューブは、チューブに２ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、すべての表面を覆うように手で回転させ、過剰容量を吸引することによって予め被覆する。サンプルは、ナノバイアル粒子をスピンダウンしてペレットにし、上清を吸引し、元のナノバイアル溶液容量になるように培地で再懸濁することによって洗浄する。
分泌物のインキュベーション。２つのサンプルをインキュベーターにて摂氏３７度で３０分間インキュベートして、分泌物を蓄積する。３０分後に、２つのサンプルを氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、Ｒａｊｉ担持ナノバイアルが２５０マイクロリットルの容量になるように、かつ、ＨｙＨＥＬ－５担持ナノバイアルが１００マイクロリットルの容量になるように再懸濁する。サンプルはすべて、染色工程のために氷上で保持する。
ナノバイアルにある分泌物の染色。ＨｙＨＥＬ－５担持ナノバイアルサンプルに、１００マイクロリットルの１２マイクログラム／ｍＬのバーコード化抗ＩｇＧ（ＴｏｔａｌＳｅｑ（商標）－Ｃ１１６７抗マウスＩｇＧ１抗体Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４０６６３６）を添加する。標識後に、Ｒａｊｉ担持ナノバイアルおよびＨｙＨＥＬ－５担持ナノバイアルを氷上で４５分間インキュベートし、その後、０．０４％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で３回洗浄する。
１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍによる単一細胞ライブラリーの調製。その後、Ｒａｊｉ担持ナノバイアルサンプルおよびＨｙＨＥＬ－５担持ナノバイアルサンプルをピペッティングして１：１の比率で一緒に混合し、その後、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｃｈｉｐのサンプルリザーバーに導入するために、１０００ナノバイアル／マイクロリットルの最終濃度になるように希釈し、標準的な１０Ｘプロトコールに従って実行する（参照により本明細書に援用される、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ２ （Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ） Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ、ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｅｒｍａｌｉｎｋ／ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｃｈｒｏｍｉｕｍ－ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－５－ｒｅａｇｅｎｔ－ｋｉｔｓ－ｕｓｅｒ－ｇｕｉｄｅ－ｖ２－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘを参照されたい）。十分な細胞事象を得つつ、過剰担持やシステムの詰まりを防ぐために、ナノバイアルの濃度は、好ましくは、５００ナノバイアル／マイクロリットル～２０００ナノバイアル／マイクロリットルの範囲であってもよい。ＧＥＭエマルジョンの形成後に、エマルジョンをインキュベートして、細胞の溶解、ポリ（ｄＴ）およびフィーチャーバーコードゲルビーズプライマーの放出、逆転写試薬の混合を達成する。ポリアデニル化ｍＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを再生成する。同時に、ゲルビーズプライマーによって、フィーチャーバーコードＮＬ配列および抗ＩｇＧ特異的フィーチャーバーコード配列を捕捉する。インキュベーションによって、これらのフィーチャーバーコードから１０ｘバーコード付きのｃＤＮＡを産生し、これを、同じ１６ヌクレオチドの１０ｘバーコードに結び付けてポリアデニル化ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡとする。その後、逆転写反応後に、ＧＥＭエマルジョンを破壊してプールする。磁気ビーズを使用して、ポリアデニル化ｍＲＮＡから１０ｘバーコード付きの一本鎖ｃＤＮＡを精製し、ＮＬおよびＩｇＧ分泌に関連付けられるフィーチャーバーコードから１０ｘバーコードｃＤＮＡを精製する。その後、１０ｘバーコードｃＤＮＡを増幅して、同じサンプルから複数のｃＤＮＡライブラリー、すなわち、遺伝子発現ライブラリーならびにＮＬおよび分泌ＩｇＧに関連付けられるフィーチャーバーコードを作製する。これらのライブラリーを変性し、希釈し、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ２ （Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ） Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅに記載されているように、単一細胞シーケンシングに使用される標準的なプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンサーを使用して配列決定して、さらなる分析のためにＦＡＳＴＱファイルを生成する。
データ分析。ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒおよびＬｏｕｐｅソフトウェアを使用して、シーケンシングデータを分析する。ｔＳＮＥプロット上には、ＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ集団およびＲａｊｉ細胞集団に関連付けられる２つの別個の集団が現われた。異なるナノバイアルにある細胞では、はっきりしたｍＲＮＡ転写物のクロストークはなく、明確かつ分離可能なヒト（Ｒａｊｉ）およびマウス（ＨｙＨＥＬ－５ハイブリドーマ）転写物セットを産出するが、わずかな混合では、ダブレットを含むエマルジョン液滴が予想される（例えば、１つを超えるナノバイアルを担持する）（図２９Ａ）。ＮＬストレプトアビジンフィーチャーバーコードも有している細胞（ナノバイアルに担持されている細胞）に関連付けられる転写物のリード数および遺伝子カウント数は、ＮＬストレプトアビジンフィーチャーバーコードを有していない細胞（遊離細胞）の転写物のリード数および遺伝子カウント数と統計的に異ならなかった（図２９Ｂ）。この結果は、細胞を含むナノバイアルの存在によって、細胞の溶解が干渉されたり、エマルジョン液滴内に溶解されたゲルビーズ中のオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡの捕捉が干渉されたり、下流での他の逆転写またはｃＤＮＡ増幅の化学反応が干渉されたりすることがないことを示唆している。また、抗ＩｇＧ抗体に関連付けられるフィーチャーバーコードは、ＨｙＨＥＬ－５細胞の分泌細胞集団と強く相関しており（図２９Ｂ）、このワークフローを用いて、同じ細胞からのトランスクリプトーム分泌タンパク質の測定が達成可能であってことを示唆している。ＮＬストレプトアビジンフィーチャーバーコードは、ＮＬ標識ナノバイアルに最初に担持させたヒトＲａｊｉ細胞と強く関連していた（図２９Ｂ）。これによって、担持細胞のトランスクリプトームに結び付けられるオリゴヌクレオチドタグでナノバイアルをバーコード化する能力が実証される。トランスクリプトームに存在する分泌抗体の重鎖および軽鎖配列に関する配列情報も、ナノバイアルに結合した分泌シグナルに結び付けられ、抗ＩｇＧフィーチャーバーコードを用いて報告された。平均では、ＨｙＨＥＬ－５細胞の細胞バーコード当たりの予想軽鎖配列のリードは中央値５４７、細胞バーコード当たりの予想重鎖配列のリードは中央値１９７であることが見出された。これは、Ｒａｊｉ細胞の軽鎖および重鎖のリードがそれぞれ６および２であることと比較して、読み取りが特異的であることを示した。リード当たり１５の塩基対を有する、抗体分泌細胞からのこれらのリードの量は、配列の４～１３倍の範囲につながるので、統計的に精度よく完全な配列情報を回収するのに十分である。この範囲は、例えば、１０Ｘ Ｖ（Ｄ）Ｊ増幅キット（製品コード１０００２５３および１０００２５５）を使用して、標的増幅によって改善することができる。
場合によっては、ナノバイアルにある分泌抗体または結合抗体の電位差を説明するために、正規化プロセスを実施する。正規化プロセスは、ナノバイアルにある分泌抗体の捕捉部位が飽和していない場合に特に有用である。正規化プロセスでは、分泌抗体に結合するために、標識済み正規化抗体（例えば、種に特異的な抗Ｆｃまたは抗Ｈ＆Ｌ抗体）を使用する。フルオロフォアおよび／またはオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、以上に説明されるように正規化抗体を標識する。これらの標識済み正規化抗体からのシグナルによって、ナノバイアルにある分泌抗体の量のメトリックを出し、これを使用して、標識済み結合抗原対分泌抗体の量または数の比率を計算する。この比率を使用して、標識済み結合抗原の絶対値と比較して、異なる量の結合抗体の存在下での親和性をより正確に判定する。例えば、より高い比率は、より高い絶対量の標識済み結合抗原と比較してより良好により高い親和性を示しており、これは、例えば、より素早く抗体を分泌する分泌細胞が存在する場合に見られる。
特異性アッセイ
非限定的な例では、前述の手法をわずかに修正を加えて使用し、特異性の高いまたは低い重鎖および軽鎖配列を有するＢ細胞の抗体の特異性および特定のための関連アッセイを実施する（図１０）。特異性が高い抗体は、例えば、偽陽性の読み出しを避けるために診断薬として重要であり、あるいは、治療薬にとって、タンパク質を特異的に標的とするが、タンパク質ファミリー内の類似タンパク質に結合して副作用やオフターゲット効果を引き起こすのを避けるために重要である。特異性がより低い抗体は、例えば、標的となる結合エピトープに様々な突然変異／変異、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質や循環ウイルス内のスパイクタンパク質の多数の突然変異体を有する幅広い範囲の病原体全体にわたる中和のために開発するのに重要である。抗体を分泌する関心対象の細胞（例えばＢ細胞、形質細胞、形質芽細胞、ハイブリドーマ、操作されたプロデューサー細胞）を、分泌工程（工程３）または標識済み抗原の結合工程（工程４）中に高濃度の関連抗原を含有する培地または溶液中でインキュベートすることによって、分泌抗体の特異性を評価する。関連抗原は、非特異的抗体用のシンクとして機能し、それによって、これらの非特異的抗体の結合部位が占有され、標識済み標的抗原には結合しなくなる。これによって、ナノバイアルのシグナルが減少し、ＦＡＣＳおよび蛍光強度の閾値を使用するか、または単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータ、非特異的抗体をコードする関連重鎖および軽鎖配列の閾値を下回るオリゴヌクレオチドバーコードリードのレベルに基づいて計算するかのいずれかで分類する能力につながる。逆に、閾値を上回る蛍光シグナルを有するナノバイアル、または閾値を上回るオリゴヌクレオチドバーコードリードを有するナノバイアルは、特異性がより高い抗体分泌細胞の重鎖および軽鎖に結び付けられる。哺乳動物血清（例えばヒト血清）の存在下で標的抗原に特異的な診断用抗体が望ましく、他の血清成分に結合する非特異的抗体のシンクとして、高濃度の血清、例えば１０％または５０％のヒト血清の存在下でアッセイを実施する。標識済み標的抗原と、別個に標識済み関連抗原（例えば、異なる関連抗原をそれぞれ、スペクトル区別可能および／または固有のオリゴヌクレオチドバーコードである異なるフルオロフォアで標識する）を共インキュベートする（例えば工程４）。このように、異なる抗原に対する相対的結合親和性は、ナノバイアルに付着している抗体に結合した異なる標識済み抗原間の比率に基づいて判定し、関心対象の抗体分泌細胞および抗体配列は、高特異性（優位の標識済み対象抗原に対応）対低特異性（標識済み関連結合抗原の多様なセットに対応）に基づいて分類することができる。この手法を使用して、抗体分泌細胞によって分泌された抗体に対してエピトープマッピングを実施する。エピトープマッピングについては、スペクトルが明確である異なるフルオロフォアで標識するか、あるいは好ましくは異なるオリゴヌクレオチドバーコードで標識する多数の異なる数片の抗原（例えばペプチド）を、工程４のインキュベーション工程で使用する。最も強固に結合している抗原のエピトープは、分泌された特定のナノバイアル結合抗原の捕捉シグナルで優位に立つ。これは、異なるナノバイアルに結合している多数の抗体分泌細胞（例えばＢ細胞、形質細胞、形質芽細胞、ハイブリドーマ、操作されたプロデューサー細胞）全体にわたって、抗体配列（例えば重鎖および軽鎖）と、抗原に関する特定のエピトープ結合情報を結び付けるために行い、これによって、抗原に関連付けられる抗体分泌細胞のレパートリーに加えて、レパートリー内の様々な抗体が結合するエピトープマッピングを得る。場合によっては、エピトープマッピングは、抗原の小片ではなく、多様性（例えば抗原のタンパク質配列に突然変異が生じた異なるアミノ酸）を形成するために異なる領域に突然変異または修正が生じた全抗原を使用し、ここで、各変異体を、別個の蛍光標識またはオリゴヌクレオチドバーコード標識で標識する。
抗原産生細胞のアッセイ。
非限定的な例では、また、上記の方法を適用して、生細胞または死細胞の表面で生産され接近しやすい抗原と相互作用する抗体または他の分泌物を特定する（図１１）。抗体分泌細胞を担持させる前に、最初に、抗原産生細胞または抗原提示細胞をナノバイアルに担持させて、細胞表面タンパク質もしくは接着ペプチド（例えばＲＧＤ）または細胞外マトリックスタンパク質との抗体の相互作用によって付着させる。すなわち、以上に列記した工程１の前である。しかしながら、他の実施形態では、抗体分泌細胞を担持させた後に、抗原産生細胞を担持させてナノバイアルに捕捉する。理想的には、１つ以上の抗原産生細胞が各ナノバイアルに結合するような濃度になるように、抗原産生細胞を担持させる。複数の対象物を担持させる一例は、図１３Ａ～１３Ｂに示されており、ポリスチレン粒子は、細胞とサイズが同様である。２つの異なる種類の粒子が、蛍光画像中に破線の白色の円で描画されているナノバイアルのうちの３つに担持されることが示されており、各ナノバイアにおいて、１つは蛍光粒子として、１つは非蛍光粒子として視認される。別の例は、複数の細胞の担持が示され（図３０）、１Ｆ５ハイブリドーマ細胞は、ヒトＣＤ２０に対する抗体を産生し、Ｒａｊｉ抗原産生細胞は、細胞膜にヒトＣＤ２０抗原を含有する。およそ２０％のナノバイアルは、第１の種類の１つの細胞と、第２の種類の少なくとも１つの細胞とに担持することが可能であった。蛍光と明視野の合併した顕微鏡写真中に、２つの異なる細胞型がナノバイアルの空洞部に結合するように示されており、Ｒａｊｉ細胞およびハイブリドーマ細胞を、円でマーキングする。Ｒａｊｉ細胞は、蛍光標識（ｃｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ）でタグ付けされるが、ハイブリドーマ細胞は未標識である。両方の細胞型を担持させるために、ナノバイアルを、ヒトＣＤ１９およびマウスＣＤ４５に対する捕捉抗体に結び付ける。代わりに、有核細胞に高度に発現される万能性細胞マーカーに対する抗体、例えば、ベータ－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を使用することができる。種交差反応性であるＢ２Ｍ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、製品＃１３５１１－１－ＡＰ）によって、複数の種（例えばマウス細胞およびヒト細胞）の細胞捕捉用の単一の抗体が提供される。場合によっては、抗原産生細胞は、原核細胞または真核細胞である。例えば、細菌細胞もしくは酵母細胞、または哺乳動物細胞（例えば、癌細胞、幹細胞、または他の付着細胞種もしくは浮遊細胞種）が挙げられる。シグナルを最大にするために、抗原産生細胞は、通常よりも高いレベルで抗原を発現するように操作される。付着させた抗原産生細胞を使用する工程は、次の工程で説明される。（０）高いラムダ（例えばラムダ＝１、２、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに抗原産生細胞を担持させて付着させる工程、（１）ナノバイアルで関心対象の分泌細胞を捕捉する工程、（２）任意選択で、関心対象の細胞およびナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（好ましくは３０分～３時間、これより好ましさが低いのは３～２４時間）にわたって関心対象の細胞をインキュベートし、抗原産生細胞に蓄積した分泌抗体を捕捉する工程、（４）分泌抗体に特異的な標識済み二次抗体（例えばマウスＢ細胞または他の抗体分泌細胞については抗マウスＨ＆Ｌまたは抗マウスＦｃ）でインキュベートする工程、（５）抗原産生細胞に結合して関心対象の分泌細胞に関連付けられる標識済み抗体の量を判定する工程、およびその後（６）関心対象の分泌細胞からの分泌抗体についての配列情報を特定する工程が挙げられる。ここで、標識済み二次抗体は、フルオロフォア、単一細胞ＲＮＡシーケンシングに適合するオリゴヌクレオチドバーコード、磁性粒子、または上記のあらゆる組合せを使用して標識する。以上に説明されるように、関心対象の抗原産生細胞およびその抗原産生細胞に結合する分泌抗体を含有しているナノバイアルは、下流での抗体のシーケンシング（例えば、対になったＶＨおよびＶＬ配列）の前に、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して分類する。二次抗体フルオロフォアの蛍光強度に対する閾値を使用してナノバイアル（および関連付けられる、関心対象の抗体分泌細胞）を分類することを使用して、抗原産生細胞の抗原に特異的な抗体分泌細胞について選択する。代わりに、バーコード化オリゴヌクレオチドで標識する場合は、ナノバイアル（および関連付けられる細胞）を単一細胞ＲＮＡシーケンシングのワークフロー（例えば１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ）に導入する。このワークフローでは、抗体の結合をアッセイして、同じ単一細胞またはナノバイアルの（例えばＧＥＭビーズまたはナノバイアルの）バーコードにつながっているオリゴヌクレオチドバーコードのシーケンシングリード数を探し出すことで、抗体分泌細胞の抗体配列に結び付ける。同じ単一細胞（または単一ナノバイアル）のオリゴヌクレオチドバーコード（例えば１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム用のＧＥＭビーズ）に関連付けられる多数のバーコードオリゴヌクレオチドを有する抗体配列を選択する工程は、閾値の数を上回るオリゴヌクレオチドバーコードリードを含有している単一細胞（または単一ナノバイアル）バーコードを特定することを含む。その後、同じ単一細胞（または単一ナノバイアル）バーコードに関連付けられる抗体配列（ＶＨおよびＶＬ）リードを同定する。代わりに、ＭＡＣＳ用の磁性粒子で標識する場合は、磁性粒子標識は、例えば抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１１０３３）をコンジュゲートしたＤｙｎａｂｅａｄｓを含んでもよく、これは、ナノバイアルに関連付けられる分泌ＩｇＧに結合すると、ナノバイアルに磁気特性を付与する（図３１）。その後、ＭＡＣＳカラムフリー手法を使用して５～１０分間標識済みナノバイアルをプルダウンすることで、ＩｇＧ分泌物を含むナノバイアルを濃縮することができる。この手法を使用して、５～１４倍の結合ＩｇＧを含有しているナノバイアルの濃縮を達成する（図３２）。ＩｇＧ結合に基づいて標的ナノバイアルの磁気分離を実証するために、１８０マイクロリットルの標的５５マイクロメートルのＰＥＧ－ノルボルネンナノバイアルを、１８０マイクロリットルの６０マイクログラム／ｍＬのストレプトアビジンと混合し、チューブ回転盤にて１５分間インキュベートし、洗浄手順を使用して３回洗浄し、元の１８０マイクロリットル容量になるように再懸濁する。別の３００マイクロリットルの非標的５５マイクロメートルのＰＥＧ－ノルボルネンナノバイアルを、３００マイクロリットルの６０マイクログラム／ｍＬのストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８と混合し、チューブ回転盤にて１５分間インキュベートし、洗浄手順を使用して３回洗浄し、３００マイクロリットルになるように再懸濁する。標的ナノバイアル溶液を、１８０マイクロリットルの１２マイクログラム／ｍＬのビオチン化抗ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ヤギ抗マウスＦｃ）で回転盤にて室温で３０分間インキュベートし、その後、洗浄手順を使用して３回洗浄した。その後、標的ナノバイアルのサンプルペレット（３６マイクロリットル）を、３．２ｍＬのＨｙＨＥＬ－５馴化培地と混合し、回転盤にて室温で１時間インキュベートする。馴化培地は、４日間後に収集および濾過すると、細胞１５０万個／ｍＬの培地であった。インキュベーション後に、洗浄手順を使用して、ナノバイアルを３回洗浄する。１８０マイクロリットルの標的ナノバイアルサンプルに、１８０マイクロリットルの１０マイクログラム／ｍＬ濃度の蛍光ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）を添加し、洗浄手順を使用して３回洗浄する。標的ナノバイアルサンプルおよび非標的ナノバイアルサンプルは、１：１～１：２５までの変動比率で混合する。混合したナノバイアルサンプルを、抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１１０３３）をコンジュゲートしたＤｙｎａｂｅａｄｓで、ナノバイアル１個当たりＤｙｎａｂｅａｄｓ１０個（例えばナノバイアル５１，０００個当たりＤｙｎａｂｅａｄｓ５１０，０００個）の比でインキュベートする。混合後に、サンプルを強く１０回ピペッティングして、３０分間静置する。サンプルを、洗浄緩衝液を含む１５ｍＬ容量のチューブに移し、５分間磁石を入れる。５ｍＬの緩衝液を吸引し、サンプルを混合し、磁石上に置かれた状態で５ｍＬの緩衝液を再添加し、これを３回繰り返す。標的ナノバイアル対非標的ナノバイアルを画像化して濃縮を計算するために、サンプルを分注する。このプロセスを使用して濃縮したナノバイアルも、本明細書に記載される下流での単一細胞シーケンシングのワークフローに投入することができる。
細胞表面抗原に結合する抗体を評価するために、本明細書で説明されるプロセスを使用して、ナノバイアルに関連付けられる関心対象の分泌細胞からの抗体を、最初にナノバイアルに捕捉する。その後、関心対象の分泌細胞から分泌された抗体が抗原産生細胞の抗原に結合している場合は、標識済み抗原産生細胞を共インキュベートし、ナノバイアルと混合してナノバイアルへの付着を生じさせる。抗原産生細胞を、フルオロフォア、磁性粒子、またはオリゴヌクレオチドバーコードで標識するか、あるいは、本明細書で説明される単一細胞シーケンシングのワークフローにおいて標識として、抗原産生細胞に存在する様々な内在性ｍＲＮＡレベルまたはｍＲＮＡレベルの組合せを使用してもよい。例えば、抗原産生細胞の存在やナノバイアルにある分泌抗体への結合に関するバーコードとして、発現される抗原のｍＲＮＡを使用する。例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して、抗原産生細胞が結合しているナノバイアルを分類し、続いて、下流で配列決定して、抗原産生細胞の結合に関連付けられる関心対象の分泌細胞の抗体配列を特定する。代わりに、抗原産生細胞をバーコード化オリゴヌクレオチドで標識する場合や、代わりに細胞内の内在性ｍＲＮＡレベルを使用する場合は、ナノバイアルを単一細胞ＲＮＡシーケンシングのワークフロー（例えば１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ）に導入する。このワークフローでは、抗体に結合する抗原産生細胞をアッセイし、同じ単一細胞（または単一ナノバイアル）バーコード（例えばＧＥＭビーズまたはナノバイアルからのもの）に関連付けられる抗原産生細胞からのｍＲＮＡに対応するバーコードオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡを示すシーケンシングリードを探し出し、抗原産生細胞からのｃＤＮＡリードまたはオリゴヌクレオチドバーコードリードの量を計数し、閾値に基づいて高性能単一細胞またはナノバイアルバーコードのセットを特定することによって、関心対象の分泌細胞からの抗体配列に結び付ける。その後、抗体配列を特定し、これらの高性能単一細胞またはナノバイアルバーコードに結び付けまたは関連付けられる抗体配列を特定する。抗原の存在に基づいて、例えば磁気ビーズ、スライドガラス、またはナノバイアルに捕捉するために抗原産生細胞の表面への結合を容易にすることができる親和性試薬または他の抗体を特定する際に、この段落に記載される代替的な関連する実施形態が特に有用である。その後、これを使用して、細胞の亜集団を完全に分別するか、またはこれを使用して、本明細書に記載されるナノバイアルベースのワークフローの一部を容易にする。
また、抗体結合の標的として抗原産生細胞を使用して、抗原が細胞表面抗原に結合することでの細胞シグナル伝達に対する下流での作用も、ナノバイアルベースのアッセイでアッセイする（図１２）。場合によっては、シグナル伝達経路の活性化に関連付けられる蛍光レポータータンパク質を含むように、抗原産生細胞を遺伝子操作する（例えば、シグナル伝達経路に関連付けられるプロモーター領域／転写因子結合領域を含む抗原産生細胞にＤＮＡ配列を導入すること、そして、蛍光レポータータンパク質遺伝子、例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、または細胞内カルシウム濃度に対する感受性が高い蛍光レポータータンパク質、例えばＧＣａＭＰ（または、カルシウム濃度のレシオメトリック測定を実施するために、ｍＣｈｅｒｒｙのような赤色蛍光タンパク質と共に共発現するＧＣａＭＰ）の遺伝子のこの上流で融合することによる）。ナノバイアルにある抗体分泌細胞によって分泌される抗体が、抗原産生細胞の表面上の抗原／標的に結合することによって、その後、シグナル伝達経路が調節（活性化または阻害）されるか、下流のシグナル伝達経路を調節するために抗原と相互作用する、別個に導入されたアゴニストまたはリガンドの活性化または阻害が干渉されるかのいずれかである。その後、抗原産生細胞（すなわちレポーター細胞）中の蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、シアン色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）の産生、またはレポーター細胞中のカルシウム濃度依存性蛍光レポータータンパク質の蛍光レベルによって、下流のシグナル伝達経路における抗体の活性を評価する。その後、特定の蛍光レベル（例えば、カットオフを上回るもしくは下回る）または特定の蛍光レベルの比率を有する抗原産生細胞を含有するナノバイアルを、ＦＡＣＳを使用して分類し、対応する抗体分泌細胞（例えばＢ細胞、形質細胞、形質芽細胞、操作されたプロデューサー細胞）を分析して、細胞表面結合によって特定のシグナル伝達経路を調節する抗体をコードしている抗体配列（例えば重鎖および軽鎖）、または本明細書に記載される多数の実施形態において説明されるアゴニストまたはリガンドとの相互作用を特定する。例えば、これらの抗体は、細胞表面受容体を結合し、正常なリガンド（例えばアゴニスト）を模倣するか、または正常なリガンドが細胞表面受容体（例えばアンタゴニスト）に結合するのを妨げる。場合によっては、この方法で、複数の別個の蛍光レポータータンパク質で遺伝子組換えされた抗原産生細胞を使用することによって、または異なるシグナル伝達経路に特異的に別個の蛍光レポーターがそれぞれ導入された複数の異なる抗原産生細胞を使用することによって、単一アッセイで複数のシグナル伝達経路を調べる。蛍光タンパク質のそれぞれをコードしている遺伝子の上流に、異なるシグナル伝達経路に関連付けられる異なる転写因子またはプロモーター領域を組み込む。これらの様々な実施形態におけるシグナル伝達経路として、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路、ＡＭＰＫシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、Ｅｐｈ／エフリンシグナル伝達経路、ヘッジホッグシグナル伝達経路、ヒッポシグナル伝達経路、インスリンシグナル伝達経路、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ｍＴＯＲシグナル伝達経路、Ｎｏｄａｌシグナル伝達経路、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路または操作されたｓｙｎＮｏｔｃｈシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路、ＴＧＦβシグナル伝達経路、ＴＬＲシグナル伝達経路、ＶＥＧＦシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、およびその他が挙げられる。ナノバイアルおよび関連付けられる細胞を、標準的なマルチカラーＦＡＣＳを使用して分類し、例えば、１つの特定のシグナル伝達経路を活性化するものの、別のものは活性化しないか、あるいは１つ以上のシグナル伝達経路を活性化するものの、別の１つ以上のシグナル伝達経路は活性化しない抗体を特定する（蛍光タンパク質１は高蛍光、蛍光タンパク質２は低蛍光など）。関心対象の抗原産生細胞も、細胞表面で関心対象の抗原を過剰発現するように操作し、それによって、この特に過剰表現した細胞表面抗原または受容体と相互作用する抗体の発見に焦点を当て、容易にする。
抗原産生細胞および関心対象の分泌細胞（例えば抗体分泌細胞）を含む場合は、ナノバイアルに対して「単一細胞」ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、抗原産生細胞にある抗原との相互作用に基づいて、分泌産物がアゴニスト／アンタゴニストとして機能する能力を直接測定する。ナノバイアルは、（ｉ）１つ以上の抗原産生細胞および（ｉｉ）関心対象の分泌細胞を含有する。以下の工程を実施する。（０）高いラムダ（例えばラムダ＝１、２、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに抗原産生細胞を担持させて付着させる工程、（１）ナノバイアルで関心対象の抗体分泌細胞を捕捉する工程、（２）任意選択で、担持細胞およびナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（３０分超、好ましくは、抗原産生細胞において大幅に遺伝子発現を変化させるために３～２４時間、これより好ましさが低いのは３０分～３時間）にわたって関心対象の細胞をインキュベートし、分泌抗体を蓄積し、抗原産生細胞の抗体と相互作用させて、遺伝子発現の変化に影響を及ぼす工程、（４）関心対象の分泌細胞からの分泌抗体に関する配列情報、および抗原産生細胞によって発現されるｍＲＮＡに関する配列情報を特定する工程、（５）この配列情報と、固有のオリゴヌクレオチドバーコード（すなわち単一細胞またはナノバイアルバーコード）を結び付ける工程、（６）任意選択で、非抗原産生対照細胞と比較して、または抗原分泌細胞に曝露されていない抗原産生細胞と比較して、抗原産生細胞によって発現されるｍＲＮＡに対して大幅な作用を有する抗体配列を特定する工程が挙げられる。工程０および工程１の順序が同時または逐次であるか、順序が反転されることに留意されたい。工程４および５は、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用するか、または当該技術分野において既知の他のそのような単一細胞ＲＮＡシーケンシングプラットフォーム（例えばＤｒｏｐ－ｓｅｑ、Ｓｅｑ－ｗｅｌｌ、ｄｒｏｐｉｃｌｅベースのＲＮＡ－ｓｅｑ Ｒｈａｐｓｏｄｙ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１など）を使用することで実施する。単一細胞シーケンシングを実施する場合は、オリゴヌクレオチドバーコード、例えばＧＥＭは、例えば分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、重鎖および軽鎖配列）などの関心対象の分泌細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ならびに、抗原産生細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの両方に隣接して付着する。したがって、抗原産生細胞のｍＲＮＡプロファイルと、分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡとは、それらの対応するｃＤＮＡ中の同じオリゴヌクレオチドバーコードの存在によって結び付けられる。異なる種に属する抗原産生細胞および関心対象の分泌細胞を選択し、それによって、細胞によって発現される遺伝子は、異なる細胞種に由来しているので、容易に区別される。例えば、関心対象の分泌細胞は、マウス由来のＢ細胞または形質細胞である一方、抗原産生細胞は、ヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）である。関連する実施形態では、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフロー（単一細胞バーコード）にＧＥＭビーズが存在する代わりに、ナノバイアル（ナノバイアルバーコード）にバーコードオリゴヌクレオチドが存在する。工程６は、バーコードオリゴヌクレオチドが結び付けられるｃＤＮＡライブラリーのシーケンシングに続いて、シーケンシングリードの分野において既知の標準的な生物情報分析（例えばｆａｓｔｑデータファイル）を使用して実施する。この手法は、例えば、抗原産生細胞と相互作用してシグナル伝達経路の活性化または抑制する抗体の抗体配列を、抗原産生細胞のｍＲＮＡプロファイルの経路分析（例えばＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施することによって特定するために使用する。このｍＲＮＡプロファイルは、細胞表面受容体を有する抗体のアゴニズムまたはアンタゴニズム、あるいは抗体とリガンド／アゴニストの相互作用を推測するために使用する。重要なことに、この手法は、抗原を過剰発現するように操作されていない抗原産生細胞、あるいはレポーター機能を有する（例えば蛍光タンパク質を産生する）ように操作されていない抗原産生細胞で実施する。この手法はまた、アゴニストの存在下で、アポトーシス経路または細胞増殖経路の活性化または活性化の防止、細胞の分化、免疫細胞の活性化、細胞の老化、または細胞多分化能もしくは万能性の維持を導く抗体をコードする抗体配列を特定するために使用する。アッセイは、通常の培地、または細胞活性またはシグナル伝達の変化を導く特定の化合物、リガンド、アゴニスト、もしくはタンパク質を含有している培地の存在下で実施する。場合によっては、分泌抗体の量の正規化は、本明細書の他の項目に記載されるようにオリゴヌクレオチドバーコードが付着している抗マウス抗体にナノバイアルを曝露することによって実施する。この正規化工程は、上記の方法の工程３と工程４との間に実施する。
非限定的な例では、内皮細胞のＴＮＦ－α受容体（例えばＴＮＦＲ１）によってＴＮＦＲ１上の結合部位を遮断するか、またはＴＮＦ－αへの結合を遮断するかしてシグナル伝達を防ぐ抗体が発見される。そのような抗体は、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、および関節炎などの自己免疫疾病を処置する薬剤として使用される。この例では、マウスをＴＮＦ－αもしくはＴＮＦＲ１またはそれらのペプチドで免疫化し、１つ以上の抗原産生細胞は、ＴＮＦＲ１を発現する内皮細胞を含み、単一抗体分泌細胞は、免疫化したマウスの脾臓または骨髄から単離した、ＩｇＧ抗体を分泌する単一Ｂ細胞、プラズマブラスト、または形質細胞を含む。内皮細胞およびＢ細胞、プラズマブラスト、または形質細胞を、内皮細胞およびＢ細胞の表面にビオチン化抗体を被覆するか（例えば、内皮細胞に対してビオチン化抗ＣＤ３１、およびＢ細胞／プラズマブラスト／形質細胞に対して抗ＣＤ４５抗体を使用）、あるいはナノバイアルの表面に抗ＣＤ３１および抗ＣＤ４５抗体を等量モル比率となるように被覆するかしてトレプトアビジン部分を持たせたナノバイアル（直径３０～５０マイクロメートル）に担持させる。内皮細胞は、平均占有数：ラムダ＞２およびラムダ＜５になるようにナノバイアルに播種し、確実にナノバイアル当たり少なくとも１つの内皮細胞があるようにする。Ｂ細胞は、好ましくは平均占有数：ラムダ＝０．１になるようにナノバイアルに播種し、Ｂ細胞を含有するナノバイアルの大半が確実に１つのＢ細胞を保有するようにする。細胞は、３０分超の期間にわたって付着させる。細胞が付着しているナノバイアルを含有する培地に、変形性関節症または乾癬などの疾患に関連付けられる生理学的に関連する濃度（例えば２ｐｇ／ｍＬ～１０ｐｇ／ｍＬ）になるようにＴＮＦ－αを添加する。任意選択で、ナノバイアルを油層内に内包し、ナノバイアルの空洞部に付着しているＢ細胞からの分泌抗体を濃縮して蓄積する。分泌抗体は、付着している内皮細胞のＴＮＦ－αまたはＴＮＦＲ１に結合する。ナノバイアルを、好ましくは３～５時間インキュベートして、ＴＮＦαシグナル伝達に対する分泌抗体の時間依存性の生物学的影響、具体的には、分泌抗体に起因する内皮細胞中のタンパク質／下流のタンパク質のｍＲＮＡ発現に対する影響を評価する。例えば、分泌抗体のＴＮＦ－αへの結合によって、ＴＮＦＲ１への結合を防ぎ、下流の多数のタンパク質のｍＲＮＡ転写物の変化につながるようなＮＦカッパＢシグナル伝達の活性化を防ぐ。これによって、炎症および免疫細胞の動員に関連付けられるＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１ ｍＲＮＡの増加を防ぐ。さらなるナノバイアルにある他のＢ細胞からの他の抗体は、ＴＮＦ－αまたはＴＮＦＲ１に結合せず、さらなるナノバイアルに関連付けられる内皮細胞で発現されるより高いレベルの、例えばＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１ ｍＲＮＡにつながる、そのようなシグナル伝達に干渉することもない。乳化している場合は、本明細書に記載される技術を使用して、ナノバイアルエマルジョンを破壊してナノバイアルを水相に戻す。その後、内皮細胞および単一Ｂ細胞／プラズマブラスト／形質細胞が担持された複数のナノバイアルを、単一細胞ＲＮＡシーケンシングのワークフロー（例えば１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ、ナノバイアルベースの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフロー）に導入し、このワークフローによって、バーコーディングを使用して、逆転写を使用して単一のナノバイアル内の細胞（単一の分泌Ｂ細胞、Ｂ細胞分泌抗体に曝露される内皮細胞）すべてに対して同じ単一細胞（または単一ナノバイアル）オリゴヌクレオチドバーコードを有するｍＲＮＡ転写物からのｃＤＮＡに、連続するタグを追加する。その後、Ｂ細胞／プラズマブラスト／形質細胞ならびにＢ細胞分泌抗体に曝露される内皮細胞のｍＲＮＡ転写物からのこれらのｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅させ、次世代シーケンシング（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ＳＰ １ｘ１００ｂｐ）を使用して配列決定する。ｃＤＮＡは、例えばＧＥＭビーズからの単一細胞（または単一ナノバイアル）オリゴヌクレオチドバーコードを使用して、あるいはナノバイアル自体に組み込まれたオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、分析工程で共に結び付ける。ＴＮＦ－αシグナル伝達のアンタゴニストとして機能する抗体に係る抗体のスクリーニングおよび発見は、（１）分泌Ｂ細胞が存在していない対照細胞と比較して、特定の細胞／ナノバイアルオリゴヌクレオチドバーコードの他のハウスキーピング遺伝子リード（例えばＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＢ）に対する、ＴＮＦ－αシグナル伝達の下流での内皮細胞からのｍＲＮＡ転写物、例えばＩＣＡＭ－１およびＶＣＡＭ－１のリードの増加を特定し、（２）同じ細胞／ナノバイアルオリゴヌクレオチドバーコードに関連付けられる抗体遺伝子配列（重鎖および軽鎖遺伝子が一致する）を特定することによって達成する。この手法は、第一の発見工程で、細胞シグナル伝達を調節する抗体の機能を高スループットでスクリーニングし、標的への結合や親和性のような、機能にそれほど強い相関がない他のメトリックスを最初に見ることなく、より良好な抗体をより素早く見つけ出すという点で有利である。
非限定的な例では、関心対象の分泌細胞は、二重特異性抗体、ラクダ科抗体、ナノボディ、アフィボディ、ＤＮＡ／ペプチド／ＲＮＡアプタマーを含む、他のバイオロジクスまたはタンパク質を分泌するか、または産生するようにトランスフェクトされた細胞ライブラリー（例えばＣＲＩＳＰＲ操作ライブラリー）由来である。関心対象の分泌細胞として、操作されたＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、バキュロウィルス－昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞が挙げられる。また、関心対象の分泌細胞として、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、もしくは他の幹細胞、または前駆細胞も挙げられる。例えば、関心対象の分泌細胞としてＴ細胞を含む実施形態には、細胞表面上に抗原を提示するか、あるいはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ複合体の一部として抗原を提示する抗原提示細胞の使用が含まれ、これには、以下の工程が含まれる。（０）高いラムダ（例えばラムダ＝１、２、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに抗原提示細胞を担持させて付着させる工程、（１）ナノバイアルで（例えば抗ＣＤ４５を使用して）関心対象のＴ細胞を捕捉するか、あるいは細胞表面に結合する抗原または提示される抗原との相互作用に基づいて、ナノバイアルに付着している抗原提示細胞で関心対象のＴ細胞を捕捉する工程、（２）任意選択で、ナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（３０分超、好ましくは、遺伝子発現に大幅な変化をもたらすために３～２４時間）にわたってナノバイアルをインキュベートし、分泌物（例えばパーフォリン、グランザイム、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ）を蓄積し、この分泌物によって、抗原産生細胞と相互作用したり、遺伝子発現の変化に影響を及ぼしたりすることができる工程、（４）関心対象の分泌Ｔ細胞からのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する配列情報、ならびに／または、関心対象の分泌Ｔ細胞および／もしくは抗原提示細胞によって発現されるｍＲＮＡに関する配列情報、ならびに／または、抗原提示細胞によって発現されるｍＲＮＡに関する配列情報を特定する工程、（５）この配列情報と、特異的なオリゴヌクレオチドバーコードを結び付ける工程、（６）任意選択で、非抗原提示細胞と比較して、または関心対象の分泌Ｔ細胞にさらされていない抗原提示細胞と比較して、抗原提示細胞によって発現されるｍＲＮＡに対して大幅な作用を有するＴＣＲまたはＣＡＲ配列を特定する工程、（７）任意選択で、抗原提示細胞と相互作用しない関心対象の分泌Ｔ細胞と比較して、関心対象の分泌Ｔ細胞によって発現されるｍＲＮＡに対して大幅な作用を有する抗原提示細胞から抗原配列を特定する工程が挙げられる。ＦＡＣＳを使用して、付着している抗原提示細胞と相互作用すると分泌するように活性化されるＴ細胞を分類する関連する実施形態を、次の工程で説明する。（０）高いラムダ（例えばラムダ＝１、２、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに抗原提示細胞を担持させて付着させる。（１）ナノバイアルで関心対象の分泌Ｔ細胞を捕捉するか、あるいはナノバイアルに付着している抗原提示細胞で関心対象の分泌Ｔ細胞を捕捉する工程、（２）任意選択で、ナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（好ましくは３０分～３時間、これより好ましさが低いのは３～２４時間）にわたって関心対象のＴ細胞をインキュベートし、分泌されたサイトカインまたは他の分泌物をナノバイアルに蓄積する工程、（４）分泌物に特異的な標識二次抗体（例えば抗ＩＬ２、抗ＴＮＦ－α、抗ＩＦＮ－γ）でインキュベートする工程、（５）フローサイトメーターまたはＦＡＣＳ機器を使用して、ナノバイアルに結合し、関心対象の分泌Ｔ細胞に関連付けられる標識二次抗体の量を判定する工程、（６）分泌物に関連付けられる１つ以上の二次抗体標識の閾値またはゲートに基づいてＦＡＣＳ分類する工程、そして（７）任意選択で、関心対象の分泌Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲまたはＣＡＲに関する配列情報を特定する工程が挙げられる。標識二次抗体は、蛍光標識ならびにオリゴヌクレオチドバーコードラベルを含んでもよい。
上記の非限定的な例では、担持工程０において、単一の細胞と、異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する複数のＴ細胞とを発現する複数の抗原提示細胞を使用する。これによって、標的抗原提示細胞または抗原産生細胞と機能的に相互作用するＴＣＲまたはＣＡＲをスクリーニングすることが可能となり、それによって、細胞殺傷機能または免疫活性機能に関連付けられる高レベルの分泌物をもたらす。代わりに、異なる抗原を発現し、すべて単一のＴＣＲまたはＣＡＲを発現するような複数のＴ細胞を発現する抗原提示細胞を使用する。これによって、例えばヒトまたは動物モデルの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に関連付けられるＴＣＲまたはＣＡＲに標的とされる抗原の脱オーファン化の実施が可能となる。この場合、工程０において、抗原提示細胞をより低いラムダ、例えばラムダ＝０．１～０．３で担持し、工程１において、Ｔ細胞をより高いラムダ、＞１で担持する。代わりに、複数の抗原提示細胞によって異なる抗原を発現し、複数のＴ細胞によって異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現するという両方で、ＴＣＲまたはＣＡＲおよび認識される可能性のある抗原について機能レパートリー分析を実施する。この場合、工程０において、抗原提示細胞をより低いラムダ、例えばラムダ＝０．１～０．３で担持し、工程１において、Ｔ細胞を同様により低いラムダ、ラムダ＝０．１～０．３で担持する。好ましくは、細胞の多様性を考慮して、担持工程において関心対象の細胞を２０，０００超のナノバイアルに担持させ、より好ましくは、より多くの多様性を捕捉するために、細胞を１００，０００超のナノバイアルに播種する。
関連する非限定的な例では、担持工程０において、抗原提示細胞の代わりに、単一の抗原またはペプチド－ＭＨＣ抗原で修飾した複数のナノバイアルを使用し、異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する複数のＴ細胞を導入する。これによって、ナノバイアルにある標的抗原と機能的に相互作用するＴＣＲまたはＣＡＲをスクリーニングすることが可能となり、それによって、細胞殺傷機能または免疫活性機能に関連付けられる高レベルの分泌物をもたらす。代わりに、複数のナノバイアルを、異なる抗原と、その抗原に関連付けられる特定の標識、例えばオリゴヌクレオチドバーコードとで修飾し、ナノバイアルに、単一のＴＣＲまたはＣＡＲを発現する複数のＴ細胞と相互作用させる。下流では、結合Ｔ細胞分泌サイトカインの存在と、抗原特異的標識を結び付けることができる。これによって、例えばヒトまたは動物モデルの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に関連付けられるＴＣＲまたはＣＡＲに標的とされる抗原の脱オーファン化の実施が可能となる。代わりに、異なる抗原（および関連付けられる標識）を含む複数のナノバイアルと、異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する複数のＴ細胞の両方を混合し、ＴＣＲまたはＣＡＲおよび認識される可能性のある抗原について機能レパートリー分析を実施する。好ましくは、細胞の多様性を考慮して、担持工程において関心対象の細胞を２０，０００超のナノバイアルに担持させ、より好ましくは、より多くの多様性を捕捉するために、細胞を１００，０００超のナノバイアルに播種する。
別の非限定的な例では、図３３に例示されるように、細胞殺傷および／または分泌などの機能に基づいてＣＡＲまたはＴＣＲを発見する。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、液性癌を有する患者にとって益をもたらすことが示されている。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）およびＢ細胞リンパ腫治療には、ＣＤ１９に対する２つのＣＡＲＴ産物がＦＤＡの承認を得ていた。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ療法の開発には大きな課題があり、これには、（１）設計されたＣＡＲ－Ｔ細胞内の多数の様々なＣＡＲ構築物を細胞殺傷に基づいてスクリーニングする、時間を要する処理、（２）活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞候補からのトランスクリプトーム情報の不足に起因し得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏ・ｉｎ ｖｉｖｏ間の結果の不整合が挙げられる。ナノバイアルは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性に基づいてハイスループットで評価や分類を行う革新的な方法を提供する。ナノバイアルに関連付けられる単一のＣＡＲ－Ｔ細胞についての細胞殺傷アッセイは、以下のとおり実施する。細胞捕捉抗体（抗ヒトＣＤ４５抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｃａｔ＃３０４００４）、溶解物捕捉抗体（例えば抗ＲＦＰ抗体、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃６００－４０６－３７９）、および分泌物捕捉抗体（抗ＴＮＦ－α、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１３－７３４９－８１／抗ＩＦＮγ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｍ７０１Ｂ／抗ＩＬ－２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｃａｔ＃５１７６０５）で修飾した直径５０μｍナノバイアルを洗浄し、改変ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃Ａ１０４９１０１）中に懸濁する。ナノバイアルを再懸濁し、２４ウェルプレートのウェルに２ｍＬのＲＰＭＩ培地で添加するか、または代わりに、ナノバイアルを再懸濁し、マイクロ遠心チューブに０．５ｍＬのＲＰＭＩ培地で添加する。ＣＡＲ構築物（エフェクター細胞）のライブラリーで形質導入したＴ細胞を、ナノバイアルに、ナノバイアル当たり細胞０．９個の比率で担持させ、結合させる。プレートまたはチューブを４℃で３０分間インキュベートし、その後、２０μｍストレーナー（Ｐａｒｔｅｃ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、ｃａｔ＃ＮＣ９６９９０１８）を使用して、細胞を含有しているナノバイアルをこし取り、洗浄して、何も担持されていないＣ－ＡＲＴ細胞を取り除く。予め温めた新鮮な改変ＲＰＭＩ培地でナノバイアルを回収し、続いて、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）１：５の比率で、関心対象の抗原を発現する標的細胞を添加する。代わりに、１：１０の比率、または１：１００の比率さえ使用してもよく、それによって、エフェクターと標的細胞との間の相互作用を最大にする。また、標的細胞も細胞殺傷マーカーを含み、これには、細胞死滅後に放出されて細胞溶解物捕捉抗体によって捕捉される細胞内生体分子も含まれる。好ましくは、細胞殺傷マーカー（または溶解分子）はなどの、蛍光タンパク質（例えばＲＦＰ、ＧＦＰ、ＰＥ、ＡＰＣ）などの蛍光性であるが、非蛍光性細胞殺傷マーカーも使用することができ、これも、溶解物捕捉抗体によって捕捉することができる（例えば、その後、標識（蛍光標識、磁性標識、オリゴヌクレオチド）にコンジュゲートした細胞殺傷マーカーに特異的な二次抗体で染色する）。構築物を含有している細胞付近のナノバイアルに局所的に蓄積するＴ細胞活性およびＴ細胞介在性標的細胞殺傷シグナルを収集するために、共培養混合物を摂氏３７度でインキュベートする。任意選択で、ナノバイアルを乳化し、細胞殺傷および分泌中のクロストークを防ぐ。一例として、ＣＤ１９－ＢＢｚ ＣＡＲおよびＧＦＰで形質導入されたＴ細胞は、ＲＦＰを発現するＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞に遭遇すると活性化し、これによって、サイトカインおよび初期標的細胞殺傷の産生を引き起こし、パーフォリン／グランザイムの産生によって標的細胞膜完全性の喪失を引き起こし、標的細胞からＲＦＰの漏出を引き起こし、ナノバイアルにある細胞溶解捕捉抗体によって捕捉する（図３３、図３４）。説明されるように、溶解される標的細胞からのＲＦＰシグナルの代わりに、またはこれに加えて、細胞死に関連付けられる他のタンパク質または細胞内放出ｍＲＮＡは、適切な抗体または相補的なオリゴヌクレオチドを含むナノバイアルで捕捉され、分析される。２４時間にわたるインキュベーション後に、任意選択で、ナノバイアルおよび関連付けられる細胞を乳化し、洗浄して、バックグラウンド分泌物を取り除く。ＣＡＲ－Ｔ細胞および分泌物を含むナノバイアルの半分は、分泌サイトカインを標的とするオリゴタグ付き抗体と、ＲＦＰを標的とするか、または細胞アポトーシスタンパク質およびｍＲＮＡを標的とする別個のオリゴタグ付き抗体とで標識し、本明細書に記載されるように単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフローを使用して分析し、ＣＡＲ構築物配列を、１つ以上の細胞殺傷マーカーおよび分泌マーカーの存在に結び付ける。６時間または１２時間（一晩）にわたるインキュベーションなど、他のインキュベーション時間でも実施できることに留意されたい。ＣＡＲＴ細胞ならびに捕捉分泌物および細胞殺傷マーカーを含むナノバイアルの他の半分は、分泌サイトカインを標的とする二次蛍光抗体（例えばＢＶ７８５抗ヒトＴＮＦ－α抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ｃａｔ＃５０２９４７、ＢＶ６０５マウス抗ヒトＩＦＮ－γ抗体、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃５６２９７４、ＢＶ６０５ラット抗ヒトＩＬ－２抗体、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃５６４１６５）で標識し、その後、フローサイトメーターを使用して、分泌産物および細胞殺傷マーカー、例えばＲＦＰの量に基づいて分析および分類するか、または細胞殺傷マーカータンパク質および／またはｍＲＮＡを標的とする二次抗体で染色する。ナノバイアルおよびＴ細胞を含有し、かつ、ＲＦＰ／Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔチャネルにおいて蛍光高さ、蛍光幅、蛍光領域、または上記の組合せの閾値を上回る事象は、活性集団として特定し、ＣＡＲに関連付けられる下流配列決定のために分類する。代わりに、本明細書に記載される方法を使用して細胞殺傷および／またはＣＡＲ構築物のシーケンシングの下流機能性評価のために、分類した集団を培養下で増殖させる。同じワークフローを、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＡＲマクロファージ、ＮＫ－Ｔ細胞、および操作されたＴＣＲを有するＴ細胞を含むがこれらに限定されない様々な細胞種に適用できることが、当業者には明らかである。
Ｔ細胞の分泌表現型。
１つの例示的な非限定的な例では、直径３５ミクロンのナノバイアルを使用して、Ｔ細胞を、分泌されたサイトカインに基づいて分析および分類する。４０００ナノバイアル／マイクロリットル濃度のある容量のナノバイアル溶液を、マイクロ遠心チューブ内で調製する。洗浄緩衝液中６０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンで、ナノバイアル溶液と等しい容量でインキュベートすることによって、ビオチン官能基化ナノバイアルにストレプトアビジンを被覆する。洗浄緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１４１９０２５０）中０．５％のウシ血清アルブミン（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、７００－１０２Ｐ）、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、および０．０５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７からなる。その後、ナノバイアルを緩衝液で３回洗浄する。洗浄手順は、３００ｇで２～３分間遠心分離すること、ナノバイアルペレットの上方において上清を吸引すること、および（最終洗浄にて）サンプルを元の容量の１０倍または元の容量のいずれかに戻すように希釈することからなる。ナノバイアル溶液のものと等しいビオチン化抗体溶液も調製する。細胞捕捉抗体（ａＣＤ４５－ビオチン、クローン番号３０－Ｆ１１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、製品＃５０－１１５－４９）およびビオチン化抗ＩＦＮ－γ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、商品＃ＢＡＦ２８５）および／またはビオチン化抗ＴＮＦ－α抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＢＡＦ２１０）および／またはビオチン化抗ＩＬ－２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品＃５１７６０５）を抗体溶液中で混合し、洗８μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＣＤ４５および１２μｇ／ｍＬの各ビオチン化サイトカイン捕捉抗体の標的を達成する。抗原特異的Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の捕捉には、抗ＣＤ４５の代わりに、１０～２０μｇ／ｍＬのビオチン化抗原またはペプチド－ＭＨＣ複合体を使用してもよい。抗体バイアルを１０，０００ｇで１０分間遠心し、バイアルの頂部から溶液を取り出すことによって、使用する抗体にタンパク質の凝集体が確実に含まれないようにする。抗体溶液と混合したナノバイアルサンプルを室温で少なくとも３０分間インキュベートして、ナノバイアルに抗体を被覆する。ナノバイアルを摂氏４度で一晩保管するか、あるいは被覆した後に続いて使用してもよい。ナノバイアルを洗浄緩衝液で２回洗浄し、その後、新鮮な細胞培地で洗浄して、元の容量になるように再懸濁した。
ナノバイアルへの細胞の担持。最初に細胞４０００個／マイクロリットルの密度で細胞溶液を調製し、高回収率、標準、または高スループットの細胞担持モードならびにナノバイアルの容量に応じて、適切な容量の細胞を添加することによって、Ｔ細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）をナノバイアルに担持させる。高回収率モードについては、細胞を、ナノバイアルと共に１：４の容量比で添加することで、細胞回収率４７％および細胞担持ナノバイアル１２％が得られる。通常モードについては、細胞を、ナノバイアルと共に１：１の容量比で添加することで、細胞回収率２８％および細胞担持ナノバイアル２８％が得られる。高スループットモードについては、細胞を、ナノバイアルと共に４：１の容量比で担持することで、細胞回収率１２％および細胞担持ナノバイアル５０％が得られる。また、単一細胞が担持されている最高画分は、高回収率モードで達成される。細胞を担持するために、細胞懸濁液の容量をマイクロピペットで取り出し、ナノバイアルペレットの中央にゆっくりと分注する。チューブ内の合計容量の少なくとも半分になるようにマイクロピペットの容量を調節して、ナノバイアルと細胞を混合する。ナノバイアルおよび細胞を、円を描きながら３０秒間上下にスムーズにピペッティングして、ナノバイアルおよび細胞を均一になるように混合する。ナノバイアルおよび細胞を含有しているマイクロ遠心チューブを、摂氏４度で６０分間インキュベートして、細胞をナノバイアルに結合させる。
バックグラウンド細胞の除去。２０μｍセルストレーナー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＣ９６９９０１８）を使用して、ナノバイアルに付着していないバックグラウンド細胞を取り除く。小端部が５０ｍＬ容量の円錐チューブの廃液より上に上方向に指すように２０μｍセルストレーナーを持つ。細胞担持ナノバイアル懸濁液をマイクロ遠心チューブからセルストレーナーの小端部に注意深くピペッティングすることによって、バックグラウンド細胞をこし取る。さらなる約１ｍｌの洗浄緩衝液をサンプルチューブにピペッティングして、さらなるナノバイアルを回収し、セルストレーナーにピペッティングする。ストレーナーを、さらなる２ｍｌの洗浄緩衝液ですすぎ、バックグラウンド細胞をさらに取り除く。細胞ストレーナーをひっくり返してストレーナーによって洗浄緩衝液をピペッティングすることによって、予め被覆済みの１５ｍＬ容量の円錐チューブにナノバイアル粒子を回収する。１５ｍＬ容量の円錐チューブは、チューブに２ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、すべての表面を覆うように手で回転させ、過剰容量を吸引することによって予め被覆する。サンプルは、ナノバイアル粒子をスピンダウンしてペレットにし、上清を吸引し、元のナノバイアル溶液容量になるように培地で再懸濁することによって洗浄する。
分泌物のインキュベーション。細胞を含有している濾過済みの細胞を摂氏３７度で３時間インキュベートして、サイトカイン分泌物をナノバイアルに蓄積する。ナノバイアルを一緒に入れたチューブ内で、ナノバイアルにある分泌細胞をインキュベートし、ナノバイアルの空洞部を遮断して、対流流体や拡散を防ぎ、分泌産物をナノバイアルの空洞部に濃縮する。代わりに、例えば１Ｈｚで作動する実験室用ロッカーを使用して、連続揺動下でインキュベーションを実施してもよい。代わりに、ナノバイアルをピペッティングして、例えば、近接するナノバイアル間に平均１００μｍ超の距離が存在するようにウェルプレート表面上に塗り広げたウェルプレートで、インキュベーションを実施してもよい。
捕捉分泌物の標識。インキュベーション後に、洗浄手順を使用して、ナノバイアルおよび細胞をＰＢＳで３回洗浄し、元のナノバイアル容量になるようにＰＢＳ中に再懸濁する。蛍光標識済みサイトカインレポーター抗体の溶液を、ＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬになるように調製する。ナノバイアルサンプル容量と等しい容量のこの標識済み溶液を混合して、一緒に穏やかなピペッティングをする。混合に続いて、標識済み溶液を含むナノバイアルを摂氏４度で３０分間インキュベートする。分泌されたサイトカインへの潜在的結合後に、洗浄手順を使用して、ナノバイアルをＰＢＳ中で３回洗浄し、分析および／または分類のために分類用緩衝液中に再懸濁する。分類用緩衝液は、ＰＢＳ中２％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン、０．０５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７からなり、これを０．２２μｍ容量のステリカップフィルターで無菌濾過して、摂氏４度で保管する。
ＦＡＣＳによる分析および分類。ＦＡＣＳファルコンチューブは、分類用緩衝液で予め被覆する。収集用チューブには、ハイブリドーマまたはＴ細胞を支持する培地を充填する。ナノバイアルサンプルを、分類用緩衝液中で所望の濃度に希釈し、好ましくは、約１００事象／秒～約２，０００事象／秒の分類スループットを達成する。蛍光ストレプトアビジンで染色した少量の対照ナノバイアルサンプルを走行させ、前方散乱光、側方散乱光、シングレットの適切なゲートを特定し、本明細書に記載されるいずれかの蛍光補正を実施する。分類した細胞は、インデックスソートするか、下流におけるｃＤＮＡライブラリーの調製や、ＴＣＲまたはＣＡＲ配列情報を得るための配列決定のためにプールする。同じワークフローを、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、ＣＡＲマクロファージ、ＮＫ－Ｔ細胞、および操作されたＴＣＲを有するＴ細胞を含むがこれらに限定されない、サイトカインを分泌するか、抗原の特定の活性化によってサイトカインを分泌する様々な細胞種に適用できることが、当業者には明らかである。
Ｔ細胞の分泌表現型を特徴付けるための非限定的な例では、方法は、Ｔ細胞を活性化し、Ｔ細胞からの１つ以上のサイトカインおよび／または他の分泌産物の結合を、ナノバイアルシステムを使用して分析することを含む。サイトカイン分泌は、分泌サイトカイン捕捉部分および細胞捕捉部分を含むナノバイアルを使用して判定する。分泌サイトカイン捕捉部分として、抗サイトカイン抗体、例えば、市販されている抗ＩＬ２、抗ＴＮＦ－α、抗ＩＦＮ－γが挙げられ、また、タンパク質、例えばポリリジン、細胞外マトリックスタンパク質にはアプタマーまたは非特異的捕捉表面も挙げられる。細胞捕捉部分として、抗ＣＤ４５もしくは抗ＣＤ４もしくは抗ＣＤ８、または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８、ならびに、例えばＴ細胞活性化をもたらすために使用するペプチドＭＨＣ分子、ならびに、Ｔ細胞をビオチン化細胞表面タンパク質またはストレプトアビジン結合細胞表面タンパク質に対する抗体で予めインキュベートしている場合は、他の高度に発現される表面タンパク質またはビオチン／ストレプトアビジンに対する抗体が挙げられる。複数のナノバイアルを使用して複数のＴ細胞の分泌表現型を特徴付けるためのワークフローは、（１）関心対象のＴ細胞をナノバイアルに捕捉する工程、（２）任意選択で、関心対象のＴ細胞およびナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程、（３）一定期間（好ましくは３０分～３時間、これより好ましさが低いのは３～２４時間）にわたって関心対象のＴ細胞をインキュベートし、ナノバイアルの表面に蓄積された分泌物を捕捉する工程、（４）ナノバイアルの表面に蓄積された分泌物に特異的な標識二次抗体を添加する工程、（５）ナノバイアルに結合して関心対象のＴ細胞に関連付けられる分泌物の量を判定する工程、およびその後（６）任意選択で、単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施して、蓄積された分泌物に結び付けられる関心対象のＴ細胞のｍＲＮＡプロファイルを判定する工程を含む。ここで、標識二次抗体は、フルオロフォア、単一細胞ＲＮＡシーケンシングに適合するオリゴヌクレオチドバーコード、磁性粒子、または上記のあらゆる組合せを使用して標識する。オリゴヌクレオチドバーコードを有する標識二次抗体は、例えばＡｂｃａｍ製の５’Ｆｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－Ｌｉｎｋ（登録商標）（ａｂ２７０７０３）を使用してオリゴヌクレオチド配列で標識したものである。この手法については、関心対象のＴ細胞に結合して関連付けられる分泌物の量は、各ナノバイアルの単一細胞ＲＮＡシーケンシングを使用して特徴付けし、関心対象のＴ細胞に関連付ける。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを実施する際に、工程５および工程６を同時に実施する。単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフローを使用して、例えば、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム、ドロップシーケンシング、インドロップシーケンシング、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、Ｒｈａｐｓｏｄｙなどを使用して、すべてのナノバイアル、オリゴヌクレオチドバーコードを有する結合分泌物および二次抗体、ならびに、Ｔ細胞ｍＲＮＡを一緒に分析する。標準的な単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑを実行するためにこれらのシステムに単一の細胞を担持させるのと同様の方法で、ナノバイアル（好ましくは直径２０～６０ミクロン）を直接担持させる。ＦＡＣＳを使用して、細胞を含有するナノバイアルの集団を予め濃縮する（例えば、本明細書の別の場所で説明される散乱光情報、蛍光細胞染色、または蛍光生死判定色素を使用）。また、標識二次抗体がオリゴヌクレオチド標識に加えて蛍光標識を含む場合は、ＦＡＣＳを実施して、二次抗体から閾値を上回る蛍光シグナルを有するナノバイアルを予め濃縮する。これは、閾値を上回るレベルで分泌産物を産生する関心対象のＴ細胞を含有しているナノバイアルに対応する。その後、この分類したナノバイアルの集団をプールし、以上に説明される単一細胞シーケンシングによって、下流で分析する。特筆すべきは、この場合、分泌物とＴ細胞ｍＲＮＡとの間に結び付きは、抗体でｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド標識を捕捉する単一細胞バーコード（単一ナノバイアルバーコード）に起因して直接できて、逆転写されても、ｃＤＮＡに単一細胞（単一ナノバイアル）バーコード情報を隣接して付着する。したがって、Ｔ細胞ｍＲＮＡからのｃＤＮＡは、二次抗体のオリゴヌクレオチドバーコードに関連付けられるｃＤＮＡと結び付けられ、次の配列決定および分析に関連付けられる。ワークフローを実施するための代替的な手法は、ｍＲＮＡによって捕捉し、本明細書に記載される技術を使用して、単一細胞特異的バーコード化のためのバーコード化オリゴヌクレオチドによってナノバイアルへの組み込みおよび直接結び付けることである。その後、ナノバイアルを乳化し、細胞を溶解し、下流で１０ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムのような機器を使用することなくｍＲＮＡを捕捉する。逆転写を実施し、続いてエマルジョンを破壊して、ナノバイアル／細胞特異的バーコードを含む細胞／ナノバイアル特異的ｃＤＮＡを作製する。その後、各関心対象の単一分泌Ｔ細胞に対してＴ細胞分泌物およびＴ細胞ｍＲＮＡの両方をコードする多数のナノバイアル／細胞特異的ｃＤＮＡから、配列決定ライブラリーを調製する。上記の実施形態では、好ましくは、細胞の多様性を考慮して、担持工程においてＴ細胞を２０，０００超のナノバイアルに担持させ、より好ましくは、より多くの多様性を捕捉するために、Ｔ細胞を１００，０００超のナノバイアルに播種する。
実施例５：ナノバイアルへの親和性結合後に単一細胞またはクローン集団を配列決定するための方法。
非限定的な例では、生体分子、例えば抗原またはＭＨＣ提示抗原への結合に関連付けられる核酸および／またはペプチド配列を発見するためにナノバイアルを使用する方法を提供する。この例の目的のために、ナノバイアルは、（ｉ）ポリＡ領域（例えば３０ｍｅｒ）および／またはポリＴ領域（例えば３０ｍｅｒ）を含む固有のオリゴヌクレオチドバーコード、ならびに（ｉｉ）抗原もしくは抗原フラグメント、ＭＨＣ提示抗原フラグメント、または表面結合抗原もしくは抗原フラグメントを有する細胞を含む。任意選択で、複数のナノバイアルを開示され、ここで、少なくとも一部のナノバイアルは、異なる生体分子を含み、固有の生体分子を含む異なるナノバイアルのそれぞれも、固有の生体分子に特異的な別個のオリゴヌクレオチドバーコードを有する。当該技術分野で既知のスプリットプールペプチド合成手法を使用して、異なる生体分子を含む複数のナノバイアルを製造する（Ｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ － Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（ＲＳＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ８ＣＣ０２４８６Ｃ）。この例のために、最初に、ナノバイアルを、表面に親和性モチーフを提示する細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、酵母細胞、またはファージディスプレイのために操作されたファージ）でインキュベートして、細胞またはファージとナノバイアルにある生体分子の間の親和性相互作用に基づいて、細胞の亜集団とナノバイアルを結合する。次の工程、すなわち（１）高いラムダ（例えばラムダ＝５、１０、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに関心対象の細胞を結合する工程、（２）一定期間（３０分超、好ましくは３～２４時間）にわたってナノバイアルをインキュベートし、抗原または抗原フラグメントが表面に結合している細胞において大幅な遺伝子発現変化を引き起こす工程（３）任意選択で、フローサイトメーターまたはＦＡＣＳ機器を使用することによって、散乱光または蛍光シグナルに基づいて、細胞が結合しているナノバイアルを分類する工程、（４）生体分子（例えば抗原または抗原フラグメント）に関連付けられる固有のオリゴヌクレオチドバーコードからの配列情報、および抗原または抗原フラグメントが表面に結合している細胞によって発現されるｍＲＮＡに関する配列情報を特定する工程（５）ナノバイアル／生体分子に結合していない対照細胞と比較して、生体分子への結合の際に抗原または抗原フラグメントが表面に結合している細胞によって発現されるｍＲＮＡに有意な作用を有する生体分子を特定する工程を実施する。工程３は、様々な市販の機器、ならびに本明細書に記載される、ナノバイアルを分析および分類する方法を使用して実施する。工程４は、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用するか、または当該技術分野において既知の他の他のそのような単一細胞ＲＮＡシーケンシングプラットフォーム（例えば乳化に続いてＤｒｏｐ－ｓｅｑ、Ｓｅｑ－ｗｅｌｌ、ｄｒｏｐｉｃｌｅベースのＲＮＡ－ｓｅｑなど）を使用して実施し、これに続いて、逆転写、核酸増幅、および次世代シーケンシングを実施する。単一細胞シーケンシングを実施する場合は、別個のオリゴヌクレオチドバーコード、例えばＧＥＭを、抗原または抗原フラグメントが表面に結合している細胞からのｍＲＮＡに関連付けられるｃＤＮＡ、ならびに、生体分子に関連付けられるナノバイアルからのポリＡ領域を有する固有のオリゴヌクレオチドバーコードに関するｃＤＮＡに隣接して添加する。したがって、抗原または抗原フラグメントが表面に結合している細胞のｍＲＮＡプロファイルと、生体分子をコードするオリゴヌクレオチドバーコードとを、形成されるｃＤＮＡ内の同じ別個のオリゴヌクレオチドバーコード配列の存在によって結び付ける。ｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用して増幅し、次世代シーケンシングを使用して配列決定する。ポリＴ捕捉部位を含む固有のオリゴヌクレオチドは、ＧＥＭを使用しない単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑワークフローのＧＥＭビーズまたは他の単一細胞ＲＮＡシーケンシングビーズの代わりに、ナノバイアルのみに存在する。工程５は、バーコードオリゴヌクレオチドが結び付けられるｃＤＮＡライブラリーのシーケンシングに続くシーケンシングリードの分野において既知の標準的な生物情報分析を使用して実施する。この手法は、例えば、関心対象の細胞のｍＲＮＡプロファイルの経路分析（例えばＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施することによって、関心対象のＢＣＲまたはＴＣＲと相互作用してＢ細胞またはＴ細胞シグナル伝達経路の活性化を産出する標的生体分子を特定するために使用する。いくつかの実施形態では、生体分子への付着によってナノバイアルに結合する細胞の濃縮は、最初に、ＦＡＣＳを使用して、下流の単一細胞シーケンシングのためにアッセイするナノバイアルおよび細胞の数を減少して実施する。
実施例６：ＤＮＡによりコードされたライブラリーのための薬物を発見する方法。
非限定的な例では、図１９Ａに図示されるように、関心対象の標的細胞の標的シグナル伝達経路または標的タンパク質発現レベルを調節する薬物の発見のためにナノバイアルを使用する方法を提供する。この例の目的のために、ナノバイアルは、（ｉ）固有のオリゴヌクレオチドバーコード（１２４）、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドバーコードに関連付けられる薬物または化合物（１２４）、および（ｉｉｉ）ナノバイアルの空洞部にある関心対象の細胞（１２４）を含む。固有のオリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、別個のビーズ上のポリＴ捕捉領域による捕捉を可能にするためのポリＡ領域（例えば３０ｍｅｒのポリＡ）を含有する。代わりに、固有のオリゴヌクレオチドバーコードは、関心対象の細胞からのｍＲＮＡを捕捉するためのポリＴ捕捉領域を含有する。方法は、次の工程、すなわち（１）高いラムダ（例えばラムダ＝１、２、またはそれ以上）を使用して、ナノバイアルに関心対象の細胞を担持させて付着させる工程、（２）任意選択で、関心対象の細胞およびナノバイアルを油相内に内包して、エマルジョンを形成する工程（１２６）、（３）ナノバイアルを刺激（例えば光、ｐＨ変化、温度変化）にさらして、薬物または化合物が関心対象の細胞と相互作用することができるように、薬物または化合物をナノバイアル内の液体容量に放出する工程（１２８）、（４）一定期間（３０分超、好ましくは３～２４時間）にわたって関心対象の細胞をインキュベートし、関心対象の細胞からのシグナル伝達経路または遺伝子発現の有意な変化を引き起こす工程（１３２）、（５）薬物または化合物に関連付けられる固有のオリゴヌクレオチドバーコードからの配列情報、および、関心対象の細胞によって発現されるｍＲＮＡに関する配列情報を特定する工程（１３６）、（６）１９Ｂに記載されるように、ポリＴ捕捉部位を有する固有のオリゴヌクレオチドバーコード、またはポリＴ捕捉部位を有する別個の固有のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、この配列情報を結び付ける工程、（７）任意選択で、１９Ｂに記載されるように、対照細胞と比較して、あるいは薬物または化合物にさらされていない関心対象の細胞と比較して、関心対象の細胞によって発現されるｍＲＮＡに対する有意な作用を有する薬物または化合物を特定する工程を含む。工程３は、最初に、当該技術分野、すなわち、全体として参照により本明細書に援用されるＯｆｆ－ＤＮＡ ＤＮＡ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， Ａｍｂｅｒ Ｌ． Ｈａｃｋｌｅｒ， Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｇ． ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ， Ｖｕｏｎｇ Ｑ． Ｄａｎｇ， Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｌ． Ｓａｔｚ， ａｎｄ Ｂｒｉａｎ Ｍ． Ｐａｅｇｅｌ， ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０２０ ２２ （１）， ２５－３４． ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓｃｏｍｂｓｃｉ．９ｂ００１５３において記載されている方法を使用して、化合物をナノバイアルに結合することによって実施するが、ここで、化合物を光切断型リンカーによって結合する。その後、光切断型リンカーを光にさらし、例えば、当技術分野、すなわち、ｈνＳＡＢＲ（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｏｓｅ-Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｂｅａｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｋ． Ｐｒｉｃｅ， Ａｎｄｒｅｗ Ｂ． ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ， ａｎｄ Ｂｒｉａｎ Ｍ． Ｐａｅｇｅｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６ ８８ （５）， ２９０４－２９１１ ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０４８１１）において記載されているようにＵＶ光に、例えば０．９５Ｊｃｍ－２の用量でさらして、光切断型リンカーを切断する。工程５および６は、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用するか、または当該技術分野において既知の他の他のそのような単一細胞ＲＮＡシーケンシングプラットフォーム（例えばＤｒｏｐ－ｓｅｑ、Ｓｅｑ－ｗｅｌｌ、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、Ｒｈａｐｓｏｄｙ、ｄｒｏｐｉｃｌｅベースのＲＮＡ－ｓｅｑなど）を使用して実施し、これに続いて、逆転写、例えばＰＣＲを使用した核酸増幅、および次世代シーケンシングを実施する。単一細胞シーケンシングを実施する場合は、別個のオリゴヌクレオチドバーコード、例えばＧＥＭを、関心対象の細胞からのｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ、ならびに、薬物または化合物に関連付けられるナノバイアルからのポリＡ部位を有する固有のオリゴヌクレオチドバーコード（薬物バーコード配列（ＤＢＣ））と相補的なｃＤＮＡに隣接して組み込む。したがって、関心対象の細胞のｍＲＮＡプロファイルと、薬物または化合物をコードするオリゴヌクレオチドバーコードとを、形成されるｃＤＮＡ内の同じ別個のオリゴヌクレオチドバーコード配列の存在によって結び付ける（図１９Ｂ）。ポリＴ捕捉部位を含む固有のオリゴヌクレオチド（薬物バーコード配列）は、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのワークフローのＧＥＭビーズを使用する代わりに、ナノバイアルのみに存在する（図１９Ｂ）。工程７は、バーコードオリゴヌクレオチドが結び付けられるｃＤＮＡライブラリーのシーケンシングに続くシーケンシングリードの分野において既知の標準的な生物情報分析を使用して実施する。この手法は、例えば、関心対象の細胞のｍＲＮＡプロファイルの経路分析（例えばＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施することによって、関心対象の細胞と相互作用してシグナル伝達経路の活性化および抑制を産出する薬物または化合物を特定するために使用する。また、経路分析によって、細胞の健康や安全な治療薬としての化合物または薬物の有用性に有害である他の経路に干渉することなく特定の経路を標的とする薬物を特定することが可能となる。重要なことに、この手法は、標的を過剰発現するように操作されていない関心対象の細胞、あるいはレポーター機能を有する（例えば蛍光タンパク質を産生する）ように操作されていない関心対象の細胞で実施する。この手法はまた、アゴニストの存在下で、またはアゴニストの存在なしで、アポトーシス経路または細胞増殖経路の活性化または活性化の防止、細胞の分化、免疫細胞の活性化、細胞の老化、細胞多分化能もしくは万能性の維持を導く薬物または化合物を特定するために使用する。場合によっては、アッセイは、通常の培地、または関心対象の細胞における細胞活性またはシグナル伝達の変化を導く特定の化合物、アゴニスト、もしくはタンパク質を含有している培地の存在下で実施する。場合によっては、薬物または化合物は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを含み、アッセイで使用する培地は、Ｃａｓ９酵素およびトランスフェクション試薬など、細胞を調節するためにガイドＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの機能に必要な成分を含む。
実施例７：空洞部の生体分子の補足を増強する方法。
非限定的な例では、本明細書に記載される様々な他の実施形態に適合する、ナノバイアルにある生体分子の補足を増強するための方法が記載される。特に、補足を増強する代替的な方法によって、乳化工程または油内への内包工程を、ナノバイアルからの限定的な輸送に置き換える。この代替的な手法では、ナノバイアルに細胞を播種、付着、または結合するのに続き、他の遮断粒子をナノバイアルのまわり、ナノバイアルの上に導入するか、またはナノバイアルの空洞部の開口部に関連付けて、流体対流およびナノバイアルから離れるような種の拡散輸送を遮断することによって、ナノバイアルに関連付けられる細胞からの物質の輸送を効果的に減少する（図１５Ａ）。遮断粒子のサイズは、遮断粒子の最大直径がナノバイアルの開口部の直径よりも大きいように、および、ナノバイアルと相互作用する際に遮断粒子がナノバイアルの開口部の有効サイズを減少させるように、またはナノバイアルの開口部を完全に密閉するように調整する（図１８）。遮断粒子は、好ましくは、ナノバイアルの空洞部に結合すると洗浄工程中に安定して維持されるように、粘着性である。この実施形態では、封入された開口部を維持するか、あるいは、遮断粒子がナノバイアルの全体容量を占有していないので、部分的に封入された開口部を維持する。遮断粒子は、ナノバイアルの開口部に接して配置した後に元のナノバイアルの空洞部の容量の５０％超を維持するようにサイズ設定する。例えば、遮断粒子は、ナノバイアルの空洞部の開口部のサイズに応じて、１５～１００マイクロメートルの範囲の直径を有する。場合によっては、遮断粒子は、２０～５０マイクロメートルの直径を有する。遮断粒子は球状であり、物質の粘着を防ぐために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子で製造する。代わりに、遮断粒子は、分子を捕捉し、ウェルまたはベッセルに位置している隣接しているナノバイアルへのクロストークを防ぐために、ナノバイアル内に含有される細胞から放出される生体分子のための結合部分を有する（図１７）。例えば、遮断粒子に、抗体捕捉部分（例えば抗Ｆｃ、抗Ｈ＆Ｌ抗体、プロテインＡまたはプロテインＧなど）を被覆する。場合によっては、遮断粒子にはまた、抗原、核酸などを被覆する。場合によっては、遮断粒子に、ポリＴ捕捉領域および／または固有のバーコード配列を有するオリゴヌクレオチドを被覆する。ビオチンを用いて遮断粒子を機能化することで、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン非共有結合による、結合部分の遮断粒子へのコンジュゲートを助ける。遮断粒子は、ボルテックス混合を使用して、高効率でナノバイアルに担持させる。これは、次の工程を実施することによって達成する：（０）ナノバイアルのアリコートと遮断粒子を、所望の比率（例えば１０対１、１対１、１対１０など）で混合する工程、（１）サンプルを所望の濃度（例えば１ｍＬ当たりナノバイアル１０００、１００００、１０００００、１００万の濃度）になるように希釈する工程、（２）１０００～３０００ｒｐｍで１～３分間ボルテックス混合し、ナノバイアルの空洞部に、またはその入口に最大まで捕捉する工程、（４）任意選択で、密度分離、磁気分離、浮力濃縮（ｂｕｏｙａｎｃｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を実施して、非結合遮断粒子を取り除く工程、（５）任意選択で、さらなるボルテックス混合を実施して、ナノバイアルの外面に結合している遮断粒子の集団を減少させる工程が挙げられる。場合によっては、遮断粒子は、空洞部に十分に局在化している。他の場合は、遮断粒子は、ナノバイアルの空洞部の外側縁に付着してもよい。いくつかの事例では、工程０は、工程１と同時に実施する。いくつかの事例では、工程４および５を、同時に実施する。場合によっては、ナノバイアルのサイズは、ダブレットの担持を防ぐサイズ排除効果が可能なように選択する。ナノバイアルの空洞部径に最も近い直径を有する遮断粒子を選択することによって、１つの遮断粒子のみが捕捉されるナノバイアルの集団、例えば、３５ミクロンの遮断粒子を担持する８５ミクロンのナノバイアルを増強する。上記の実施形態では、使用するナノバイアルは、３０～８５ミクロンの平均直径、例えば直径３０ミクロン、直径３５ミクロン、直径４０ミクロン、直径４５ミクロン、直径５０ミクロン、直径５５ミクロン、または直径８５ミクロンを有してもよい一方、遮断粒子は、１５～３５ミクロンの平均直径、例えば直径１５ミクロン、直径２０ミクロン、直径２５ミクロン、直径３０ミクロン、または直径３５ミクロンを有してもよい。遮断粒子は、例えばヒドロゲル物質から構造化し、それによって、ヒドロゲルメッシュの孔径よりも小さい分子、例えば５０ｋＤ未満のタンパク質および他の生体分子、または１０ｋＤ未満のタンパク質および他の生体分子のみ通して拡散できるように、ヒドロゲルメッシュの孔径を調節して、ナノバイアルの空洞部内の細胞からの分泌生体分子または放出生体分子からのシグナルを損失するのを防ぐ。また、遮断粒子またはナノバイアルのヒドロゲルメッシュを介して液体または試薬のナノバイアルの空洞部への輸送が可能となるように、遮断粒子またはナノバイアルのヒドロゲルメッシュの孔径を調節する。例えば、試薬は、染色剤、界面活性剤、洗浄剤もしくは溶解緩衝液、薬物、サイトカイン、ケモカイン、培地、馴化培地、または他の緩衝液を含む（図１７）。概して、ＰＥＧベースのヒドロゲル粒子を製造する方法が、本明細書に記載され、同様に遮断粒子にも適用される。また、市販のポリスチレン、ポリメチルメタクリル酸メチル、および他の熱可塑性の球状ビーズも遮断粒子として使用される。場合によっては、ナノバイアルの空洞部の外への輸送を減少させる単一の遮断粒子に代わり、複数の遮断粒子が、ナノバイアルの空洞部の中を含む、ナノバイアルの中およびまわりに担持させられる。これらの遮断粒子は、流体の対流輸送を減少させ、細胞またはその中で実施される反応によって放出される分子がナノバイアルから離れるように輸送される拡散の時間スケールを増加させる。複数のより小さい遮断粒子は、多数のより小さい遮断粒子がナノバイアルの空洞部に沈降するように、２～２０マイクロメートルの範囲内でサイズ設計され、かつ、より小さい遮断粒子が合理的な時間内にナノバイアルに沈降することができるように、室温で生理食塩水よりも大きい密度（約１．０１ｇ ｃｍ－３超）、好ましくは１．０５ｇ ｃｍ－３を含む。場合によっては、ナノバイアルを十分に覆って、より小さい遮断粒子でナノバイアルの空洞部を充填するために、より小さい遮断粒子対ナノバイアルの数の比率は１００：１を超える。より小さい遮断粒子は、サイズがより大きい遮断粒子について記載されるように、他の特性、表面官能基化、および多孔性を有する。より小さい遮断粒子は、ＰＥＧ、ポリスチレン、ポリ－メタクリル酸メチルのような高分子、またはガラスもしくは金属のような他のより高密度の材料から構成される。
ナノバイアルの空洞部を密閉する遮断粒子の刺激が、図１５Ａ～１５Ｆに示され、関連付けられる遮断粒子を含まないナノバイアル、ならびに他の幾何学形状の粒子と比較して、ナノバイアル内の細胞からの分泌分子または放出分子の濃度が増加していることを示唆する（図１４Ａ～１４Ｅ）。ここで、分泌される分子の拡散定数は、１ｅ－９［ｍ２／ｓ］と仮定し、ナノバイアルの長さスケールは、３０マイクロメートルであり、境界条件として、ナノバイアル内の直径１０マイクロメートルの細胞表面で濃度は一定であり、細胞、ナノバイアル、遮断粒子表面、底部ドメイン境界を通る流動はなく、および上部および側部ドメイン境界において濃度＝０として設定される。軸対称を使用して、対流流体はなしとして、希釈した種の輸送の方程式を解くことによって３Ｄ問題をモデル化する。
Ｄが、分泌される分子の拡散定数である場合は、Ｃは、分泌される分子の濃度であり、ｕは、質量平均速度ベクトルであり、Ｒは、分泌される分子の反応速度式である。
ナノバイアルの局所濃度を増加することは、ナノバイアルの表面の捕捉部分または遮断粒子の表面に結合した際に、抗体などの分泌された分子または放出された核酸の捕捉量がより高くなることに関連付けられることが予想される。標識後に、エマルジョンを形成していなくても、封鎖されていないナノバイアルと比較して、遮断粒子を用いて覆ったナノバイアルについては、より強力なシグナルが予想される。これは、乳化の使用と比較して、アッセイを実施するための工程の数を減少させるという利点を有する。
例示的なアッセイでは、分泌物のインキュベーション工程中に、遮断粒子を使用して、ハイブリドーマ細胞（ＨｙＨＥＬ－５）を含む直径５０マイクロメートルのナノバイアルを、他の直径５０マイクロメートルのナノバイアルによって遮断し、捕捉されたＩｇＧ分泌物をより高レベルで、クロストークをあまり伴わずに局在化する。２００マイクロリットルの直径５０マイクロメートルのナノバイアルのアリコートに、２４マイクロリットルの１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４３４３０１）および１７６マイクロリットルの洗浄緩衝液を添加し、１５分間インキュベートし、続いて、洗浄手順を用いて３回洗浄する。その後、１７６マイクロリットルの洗浄緩衝液に、２６．９マイクロリットルのビオチン化ヤギ抗マウスＣＤ４５（３７．３マイクログラム／ｍＬの原液、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および６．６マイクロリットルのビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬの原液、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、１１５－０６５－０７１）を添加し、ナノバイアルペレットと混合し、３０分間インキュベートした。抗体標識ナノバイアルを、洗浄手順を用いて３回洗浄し、元の２００マイクロリットルの容量に戻す。細胞を担持するために、２００マイクロリットルの細胞４０００個／マイクロリットルの細胞懸濁液の容量をマイクロピペットで取り出し、ナノバイアルペレットの中央にゆっくりと分注する。チューブ内の合計容量の少なくとも半分になるようにマイクロピペットの容量を調節して、ナノバイアルと細胞を混合する。ナノバイアルおよび細胞を、円を描きながら３０秒間上下にスムーズにピペッティングして、ナノバイアルおよび細胞を均一になるように混合する。ナノバイアルおよび細胞を含有しているマイクロ遠心チューブを、摂氏４度で６０分間インキュベートして、細胞をナノバイアルに結合させる。２０マイクロメートルのストレーナーを使用して、本明細書の別の場所に記載されるように、非結合バックグラウンド細胞を取り除く。こし取りに続いて、ナノバイアル（または結合した細胞を含有しているナノバイアル）を液体培地に再導入し、沈降させるか、１００ｇで１～２分間遠心分離してペレットを作製し、マイクロ遠心チューブ内で近接するナノバイアルの他の近くの空洞部の開口部を遮断する。より効果的な遮断を達成するために、好ましくは、ナノバイアルを、マイクロ遠心チューブまたは他の容器内でナノバイアル１０６／ｍＬよりも大きい密度になるように濃縮する。その後、ナノバイアル（または結合した細胞を含有しているナノバイアル）を摂氏３７度で１時間インキュベートして、分泌されるＩｇＧを蓄積する。インキュベーション後に、ナノバイアルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ中５マイクログラム／マイクロリットルの最終濃度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒＴＭ ６４７で標識したニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）で染色する。サンプルを３回洗浄し、２００マイクロリットルの最終容量になるように希釈して、サンプルを画像化する。ハイブリドーマ細胞、および、分泌細胞に局在化する抗原特異的染色を示す染色済みナノバイアルの画像は、図２４Ａで見られ、これは、隣接するナノバイアル粒子によって空洞部の開口部を遮断することによってクロストークが低いことを示す。
遮断粒子を使用する別の例示的な例では、（１）細胞を、任意選択で、ポリＴ領域（例えば３０ｍｅｒ）を含有するバーコード化オリゴヌクレオチド捕捉部分を含有するナノバイアルに担持させて、細胞担持ナノバブルを含有する溶液を形成し、（２）溶液に、任意選択で、バーコード化オリゴヌクレオチド捕捉部分を含有する社団粒子を播種し、細胞により放出される分子の輸送を減少させ、（３）ナノバイアルのヒドロゲルマトリックスおよびナノバイアル内の溶解細胞を通って拡散することができる溶解緩衝液を、溶液に添加し、（４）細胞担持ナノバイアルをインキュベートして、溶解した細胞からｍＲＮＡなどの分子を放出させ、放出された分子をナノバイアルおよび／または遮断粒子に捕捉する。この実施形態では、ナノバイアルまたは遮断粒子の少なくとも１つは、バーコード化オリゴヌクレオチド捕捉部分を含むことに留意されたい。場合によっては、遮断粒子は、ＧＥＭビーズ、Ｒｈａｐｓｏｄｙビーズ、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑビーズ、または単一細胞シーケンシング用途のために使用される市販のバーコード化ビーズを含む。（５）任意選択で、捕捉されたｍＲＮＡに対して逆転写を実施して、ナノバイアルおよび／または遮断粒子からのバーコード配列を含むｃＤＮＡを形成し、続いて、増幅、および増幅後のｃＤＮＡについて配列決定を実施する。
また、図１７で見られるように、細胞による分泌産物または細胞による放出産物のナノバイアルからの輸送を減少させるために、より深い空洞部を有するナノバイアルを製造する（１１６）。細胞をナノバイアルの空洞部内に含有させる場合は、より深い空洞部によって、ナノバイアル内に留まる、細胞から放出された分子の濃度が最大になり、かつ、外に拡散して輸送される放出分子の量が減少する（図１６Ａ～１６Ｆ）。また、ナノバイアルのより深い空洞部内での対流も減少する。
実施例８：ナノバイアルを使用して、機能的単一細胞特性と、下流のゲノム情報およびトランスクリプトーム情報を結び付けるための方法。
非限定的な例では、情報の担体としてナノバイアルを使用して（図６）、機能的単一細胞特性（分泌物など）と、細胞のゲノム特性、プロテオミクス特性、およびトランスクリプトーム特性を結び付ける方法が本明細書において説明される。本開示のナノバイアルは、異なる分析様式間の情報を独立して処理して結び付けるために、様々な種類のバーコードを含む。例えば、ナノバイアルは、固有の核酸バーコードもしくはオリゴヌクレオチドバーコード、または固有のペプチドバーコードを含む。代わりに、ナノバイアルは加えて、染色セットまたは様々の輝度フルオロフォアなどの光学式バーコード、またはローサイトメトリーの前方散乱光および側方散乱光によって観察可能な様々な固有の散乱光シグネチャーを含む。場合によっては、ナノバイアルは、画像サイトメトリーまたは画像活性セルソーティング手法によって認識できる固有の形状またはサイズを有する。いくつかの事例では、ナノバイアルは、ＣｙＴＯＦまたはマスサイトメトリー技術によって判読可能な同位体またはマスバーコードを含む。画像化に続いて、ナノバイアル内に埋め込まれたフルオロフォアを蛍光漂白または活性化するために光学源を使用することによってタグ付けまたはバーコード化する。特筆すべきは、２つ以上の分析モード間で情報を移して結び付けるために、一方の種類の特定のバーコードを、もう一方の種類の特定のバーコードに結び付ける。例えば、ＧＡＣＴＴＣＣなどの特定のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドバーコードを有するナノバイアルは、これに加えて、特定のレベルのフルオロフォア強度、例えばバックグラウンドの１０００倍を上回る強度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８を含む。一方、同じ例において、ＧＣＴＡＡＣＣなどの第２の識別可能なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドバーコードを有する別のナノバイアルは、これに加えて、異なるレベルのフルオロフォア強度、例えばバックグラウンド強度の１００倍のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８を含む。無論、いくつかの事例では、様々な異なる種類のバーコードを結び付け、あるいは２つを超えるバーコードも結び付け得る。
場合によっては、Ｉｎｄｅｘ Ｓｏｒｔｉｎｇによって、ＦＡＣＳまたは他の単一細胞分析および分注技術（例えばＷＯＬＦ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、Ｎａｍｏｃｅｌｌ、Ｎｏｄｅｘｕｓなど）を使用して、細胞機能に関する情報をゲノム情報および／またはトランスクリプトーム情報に結び付ける。場合によっては、本明細書における細胞を含有しているナノバイアルを、細胞および／または細胞からの分泌産物または放出産物に関連付けられるナノバイアルの蛍光シグナルに基づいて分析および分類する。分類は、蛍光強度ピーク高さ、蛍光強度幅、蛍光色、蛍光強度面積、散乱光強度ピーク高さ、散乱光強度幅のセットからのパラメーターを含み得るパラメーターのソートゲートに基づいて実施し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＩＩＩ、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００、またはＦＡＣＳシステムに適合する他のインデックス分類などのフローサイトメーターを使用して、ゲート後の細胞を含有しているナノバイアルを分類して、９６ウェルプレート（または３８４ウェルプレート）のウェルに分別する。ナノバイアル（細胞からの分泌分子または放出分子の量を表わすもの）に関連付けられる蛍光強度に関する情報を、分類したウェルプレートの特定のウェルに結び付け、その後、下流の配列決定工程からの情報に結び付ける。分類後の細胞からのメッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して増幅する。サンガーシーケンシングを使用して、シーケンシングを実施するか、例えば、インデックスキット（ＴＧ Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２ Ｓｅｔ Ａ（９６ Ｉｎｄｉｃｅｓ））、ハッシュタグ、またはその他（ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｓ／ｐｍ／ｏｔｈｅｒｓ／２３－２１３１８．ｐｄｆ） し、配列決定はサンガー法シーケンシングを使用して、実施される、あるいは、各々へｏｌｉｇｏバーコードをよく導入する場合、使用、例えばインデックスキット、ハッシュタグなど（ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｓ／午後／他のもの／２３－２１３１８．ｐｄｆ）を使用して各ウェルにオリゴバーコードを導入する場合は、ウェルプレートの各ウェルからの増幅後のＤＮＡは、次世代シーケンシングを実施するためにプールし、ここで、固有のオリゴバーコードによって、ウェルプレートの特定のウェルへの結び付けを設ける。場合によっては、溶液中に提供したバーコード化オリゴを、ナノバイアル（またはその中の細胞）に結合し、インデックスバーコードを添加したナノバイアルをプールし、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍまたは他の単一細胞シーケンシングプラットフォームを使用して配列決定する。いくつかの事例では、溶液中に提供したバーコード化オリゴを、逆転写工程またはｃＤＮＡ増幅工程中に、ウェルプレートの各ウェルで細胞からのｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡに隣接して結び付け、増幅後のｃＤＮＡを次世代シーケンシングのためにプールする。ウェルプレートの複数のウェルからの増幅後のＤＮＡをプールするためにインデックスオリゴを使用することは、当該技術分野において既知である。
上記の実施形態では、単一ナノバイアル／単一細胞からのデータを、単一データ構造内に結び付け、この単一データ構造に、結び付けたこれらのデータのセットを、同じ単一ナノバイアルまたは単一細胞識別子に結び付けられる列またはエントリーとして含む。
実施例９：ナノバイアル製品を保管／梱包するための方法／デバイス。
非限定的な例では、ナノバイアルを保持または出荷および保管するための容器またはベッセルは、その表面にバーコードまたはＱＲコードを含み、バーコードリーダーまたはＱＲコードリーダー（例えば携帯電話ベースのリーダーが挙げられる）によってスキャンすると、製品の仕様、例えばナノバイアルのサイズ、ロット番号、機能化に関するデータが提供される。場合によっては、ＱＲコードをスキャンすることによって提供されるデータには、本明細書に記載されるような１つ以上のアッセイのためにナノバイアルを使用するための最適ワークフローおよびプロトコールも含まれる。また、ＱＲコードまたはバーコードをスキャンすることを使用して、ナノバイアルの最適な分析または分類を実施するためのサイトメトリーまたはＦＡＣＳ機器の設定を自動的に更新し、例えば、ドロップディレイ値、シース流、およびサンプル流の圧力などを調節する。バーコードまたはＱＲコードをスキャンすることを使用して、クラウドまたはローカルソフトウェアにアクセスする能力を起動または始動し、フローサイトメトリー．ｆｃｓファイルから得たナノバイアルデータ、またはシーケンシングから得たＦＡＳＴＱファイルなどを分析する。
ベッセル内に保管するナノバイアルは、１％～１０％乾燥重量／容量の濃度で冷蔵温度（例えば４℃）で緩衝液中に懸濁液として保管される。ナノバイアルを抗体または他の生体分子で予め官能化しているいくつかの場合では、ナノバイアルを、例えば、アジ化ナトリウムを含む抗菌溶液を含むベッセル内に保管する。いくつかの事例では、ナノバイアルをベッセル内に保管して、凍結乾燥粉末として出荷し、使用時にユーザーが測定および再水和する。この場合、例えば、参照により本明細書に援用されるＳｈｅｉｋｈｉ ｅｔ ａｌ．「Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ－ｔｏ－ｐｏｗｄｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ｃｏｌｌｏｉｄａｌ， ａｎｄ ｂｕｌｋ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ」ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １（８）１９３５－１９４１、２０２０に記載されている技術を使用して、塊を生じさせることなく再水和の成功を向上させるために、ナノバイアルを油相から出して凍結乾燥または乾燥させる。
いくつかの事例では、ナノバイアルを用いてアッセイを実施するためのキットは、中にナノバイアルを含有している容器またはベッセル、中に油と界面活性剤との混合物を含有している第２のベッセル、エマルジョン破壊溶液（例えばパーフルオロ－オクタノール）を含有している第３のベッセルを含む。キットは、ナノバブルの直径の３倍よりも大きい最小内腔寸法を有する手動バブルピペッターまたは他の混合用構成要素をさらに含み、これは、液滴エマルジョンを生成するために最適化している。キットは、細胞担持工程後にナノバイアルを保持するが、ナノバイアルに結合していない未結合を通過させるように調整した孔径を有するフィルター、例えば平均直径が２０ミクロンの孔径を含むフィルターまたはセルストレーナーをさらに含む。場合によっては、キットは、本明細書に記載されるように、例えばＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、またはＯｐｔｉｐｒｅｐを含む密度制御緩衝液を含み、ＦＡＣＳでの操作のためにナノバイアル溶液の密度の調節するか、または細胞を含有しているナノバイアルを、中に細胞を含有していないナノバイアルから分別する。いくつかの事例では、キットは、ナノバイアル溶液の添加、他の陽性対照もしくは陰性対照、あるいはナノバイアルベースのアッセイの測定値をキャリブレーションするのに使用される蛍光強度および／または散乱光シグナルが規定されたキャリブレーションナノバイアルを含む。場合によっては、キャリブレーションナノバイアルの添加濃度は、ナノバイアルの１％未満である。他の事例では、ナノバイアルを用いてアッセイを実施するためのキットは、中にナノバイアルを含む容器またはベッセル、および遮断粒子の溶液を含有している第２のベッセルを含む。
場合によっては、キットは、ナノバイアルを含有している複数のベッセル、および／または、単一のアッセイに適した濃度を有するように分注した他のアッセイ構成を含む。例えば、個別の実験に適したベッセル当たりおよそ１００，０００のナノバイアルを含有している複数のベッセル（例えば３～４または６～１０）が挙げられる。他の関連する実施形態では、キットにナノバイアルを含有しているベッセルは、およそ３００，０００、５００，０００、または１，０００，０００のナノバイアルを含み、通常小さいサイズのものである（例えば直径３５ミクロン）。キットは、これらの関連する実施形態のすべてを含むか、または用途に応じて実施形態のサブセットを含むことに留意されたい。
実施例１０：ナノバイアルの分析および分類のための統合システムおよびソフトウェア。
非限定的な例では、バーコードリーダーまたはＱＲコードリーダーの接続を含む統合機器（例えばフローサイトメーターまたは蛍光活性セルソーター）と、ナノバイアルを分析するソフトウェアとが開示され、これらは、通常の細胞の代わりに、これらのヒドロゲル粒子を用いて操作するために最適化または調整されている。前の例で説明されるように、細胞よりも大きい特定の平均サイズのナノバイアル試薬では、最大収率または純度で操作するために、機器の設定の調整が必要となる。概して、ナノバイアルは、３０～８５ミクロンの平均直径、例えば直径３０ミクロン、直径３５ミクロン、直径４０ミクロン、直径４５ミクロン、直径５０ミクロン、または直径５５ミクロンを有する。場合によっては、Ｂ細胞またはＴ細胞と共に使用するために、直径３５ミクロンのナノバイアルを調整する。いくつかの事例では、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３などのプロデューサー細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞と共に使用するために、直径５５ミクロンのナノバイアルを調整する。統合機器は、ナノバイアルを含有しているベッセル上のバーコードまたはＱＲコードを読み取るように構成されたバーコードリーダーまたはＱＲコードリーダーと通信状態にあるフローサイトメトリーまたはセルソーティング機器を含み、ソフトウェアを介して、ナノバイアルのサイズを反映しているバーコードまたはＱＲコードによって提供される情報に基づいて、フローサイトメトリーまたはセルソーティング機器の設定を調節する。バーコードリーダー／ＱＲコードリーダーは、フローサイトメトリーまたはセルソーター機器のソフトウェアと通信するアプリを備えるように構成されたスマートフォンを含む。
フローサイトメトリーまたはセルソーター機器のソフトウェアは、スループット、収率、および／または、サイズ特性または予想蛍光強度に基づいて分類されるナノバイアルの純度を最大にするために様々な設定を調節する。含まれる設定：レーザー出力、ＰＭＴゲイン、および／または電圧、分類マスクの種類：相、収率、純度、単一細胞など。サンプル流に対する流体力学的シース流の比率／サンプルの圧力に対するシース流の圧力の比率、液滴生成頻度、分類振幅：偏向電極の電圧、ドロップディレイ、マイクロ流体分類のための圧力など。場合によっては、ソフトウェアへのユーザー入力を使用して、収率よりもスループット、収率よりも純度など、最適化すべき好ましいメトリックスを特定する。純度を最大にする設定の例示的な実装形態は、単一細胞のマスクまたは純度マスクを設定するためにソフトウェアを調節することを含む。収率を最大にする設定の例示的な実装形態は、分類振幅（例えば偏向電圧、またはマイクロ流体分類のための圧力）を増加することを含む。スループットを最大にする設定の例示的な実装形態は、サンプル流の圧力に対するシース流の圧力の比率の減少、または液滴生成頻度の増加を含む。
フローサイトメトリーまたはセルソーター機器のソフトウェア、あるいは別個の分析ソフトウェアも、バーコードリーダーまたはＱＲバーコードリーダー、あるいはバーコードまたはＱＲバーコードを読み取るように構成されたスマートフォン対応アプリによるバーコードまたはＱＲバーコードの読み取りに基づいてナノバイアルアッセイに特異的な分析を実施するように構成される。分析ソフトウェアは、特定のバーコードまたはＱＲコードを用いて、ベッセル内に担持されたナノバイアルに関連付けられる既知の散乱光または蛍光シグネチャーに基づいて、ナノバイアル事象の自動ゲーティングを実施する。ソフトウェアはまた、散乱光および／または蛍光強度データに基づいて、細胞を含有しているナノバイアルの自動ゲーティングを実施する。例えば、閾値を上回る側方散乱光強度の値に部分的に基づく。ソフトウェアはまた、１つ以上の蛍光チャネルにおける高シグナル対低シグナルを有するナノバイアルの自動ゲーティングを実施する。この自動ゲーティングは、１つ以上のチャネルにおける既知の蛍光レベルを有する、スパイクされていないキャリブレーションナノバイアルによって支援される。場合によっては、キャリブレーションナノバイアルを使用して強度レベルをキャリブレーションし、閾値を設定して、光シグナル対低シグナルを有するナノバイアルをゲーティングするか、または高キャリブレーションナノバイアル対低キャリブレーションナノバイアルの範囲内に強度をリスケーリングする。また、ソフトウェアは、下流での細胞の亜集団の分析および特定のために、細胞を含むナノバイアルからのデータを含有する多次元データのヒストグラムおよび／または寸法縮小プロット（例えばｔ分布型確率的近傍埋め込み法－ＶｉＳＮＥプロットによる視覚化）を生成する。いくつかの事例では、フローサイトメトリーまたはセルソーティング機器からのデータをサーバーにアップロードし、本明細書に記載される分析をクラウドソフトウェアで実施して、結果をユーザーに返す。
バーコードまたはＱＲコードをスキャンする際に、ソフトウェアは、ベッセルに担持させた特定のナノバイアル試薬の最良の使用のための説明書をスクリーン上に提供する。例えば、ソフトウェアは、グラフィックスユーザーインタフェイスを介して、特定のナノバイアル試薬を使用するアッセイのための実験用ワークフロープロトコールを表示する。特定のナノバイアル試薬に固有であるワークフローの特定の工程を表示する。例えば、バーコードまたはＱＲ情報にコードされているナノバイアルのサイズに基づいて、ソフトウェアは、担持させるのに好ましい細胞濃度、フローサイトメトリーまたは他の下流の機器による分析に好ましいナノバイアル濃度などを含むプロトコールを自動的に表示する。場合によっては、ユーザーが、担持画分または許容可能なダブレットもしくはマルチプレットパーセントを入力し、ソフトウェアが、好ましいナノバイアル濃度および細胞濃度を計算し、これをプロトコールに更新してユーザーに表示する。再び、ソフトウェアは、許容可能なダブレットもしくはマルチプレットパーセントを使用して、散乱光の閾値のゲートを調節し、フローソーターの収集用出口に分類されるダブレット担持ナノバイアルの量を最小にする。また、ナノバイアル試薬の梱包上のＱＲコードを、アプリおよびソフトウェアコードを含むスマートフォンによってスキャンして、スマートフォンの画面上に、特定のナノバイアル試薬に関する特定の実験用プロトコールおよび最良操作条件を開示する。場合によっては、ソフトウェアコードは、ユーザーから申請があると、ナノバイアルに関する分析情報のＱＣ／証明書を開示する。
場合によっては、ソフトウェアは、サーバーにインターネット接続されており、フローサイトメーター、フローソーター、および分析手法について改良版の操作設定が利用可能になると、すぐに設定が更新される。また、インターネット接続しているソフトウェアは、バーコードまたはＱＲコードがスキャンされているネットワーク情報に基づいて地理的位置または他の位置も報告し、この情報をサーバー上に、匿名化された形で保存する。

Claims (50)

  1. 機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける方法であって、
    （ａ）ナノバイアルの空洞部に位置する単一細胞に対して機能的アッセイを実施する工程であって、前記機能的アッセイが、第１のバーコードまたは第１の標識に関連付けられる、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアル中の前記単一細胞に対してゲノムアッセイ、トランスクリプトームアッセイ、および／またはプロテオームアッセイを実施する工程であって、前記ゲノムアッセイ、前記トランスクリプトームアッセイ、および／または前記プロテオームアッセイが、第２のバーコードまたは第２の標識に関連付けられる、工程と、
    （ｃ）前記第１のバーコードまたは前記第１の標識を、前記第２のバーコードまたは前記第２の標識に関連付けることによって、機能的単一細胞の情報を、ゲノム単一細胞、トランスクリプトーム単一細胞、および／またはプロテオーム単一細胞の情報と結び付ける工程と
    を含む、方法。
  2. （ｂ）の前に、前記機能的アッセイによって生成されたシグナルに基づいて前記ナノバイアルを分類する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記機能的アッセイは、抗体分泌スクリーニングアッセイである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記機能的アッセイは、抗体親和性アッセイである、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記機能的アッセイは、抗体特異性アッセイである、請求項１または２に記載の方法。
  6. 前記ゲノムアッセイは、単一細胞ＲＮＡシーケンシングアッセイである、請求項１または２に記載の方法。
  7. 前記ナノバイアルは、特有のオリゴヌクレオチドタグと関連付けられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記特有のオリゴヌクレオチドタグは、ポリ－ｄＴ捕捉領域を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１のバーコードまたは前記第１の標識は、ポリＡ領域を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 関心対象の抗原に対する機能的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアルの前記空洞部内に、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞を担持させる工程と、
    （ｃ）１つ以上のサイトカインが、前記ＣＡＲ発現細胞または前記ＴＣＲ発現細胞から分泌され、かつ前記親和剤に結合するように、前記ナノバイアルをインキュベートする工程と、
    （ｄ）検出剤が前記１つ以上のサイトカインに結合するように、前記ナノバイアルの前記空洞部に前記検出剤を添加する工程と、
    （ｅ）前記１つ以上のサイトカインへの前記検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、
    （ｆ）前記ＣＡＲ発現細胞または前記ＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、
    （ｇ）前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲの配列を、前記１つ以上のサイトカインへの前記検出剤の結合に関する前記１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、
    （ｈ）（ｇ）の前記関連付ける工程に基づいて、前記関心対象の抗原と機能的に相互作用する前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲを特定する工程と
    を含む、方法。
  11. （ｆ）の前に、前記１つ以上のサイトカインへの前記検出剤の結合に関する前記１つ以上のシグナルに基づいて前記ナノバイアルを分類する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ナノバイアルの前記空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の細胞捕捉剤は、前記ＣＡＲ発現細胞または前記ＴＣＲ発現細胞が結合することのできる、抗原またはＭＨＣ提示抗原である、請求項１２に記載の方法。
  14. 関心対象の抗原の結合に応答するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現Ｔ細胞の細胞殺傷機能を検出する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアルの前記空洞部内に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞を担持させる工程と、
    （ｃ）前記ＣＡＲ発現Ｔ細胞または前記ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、前記関心対象の抗原を産生する標的細胞と接触させる工程と、
    （ｄ）前記ナノバイアル上で、前記標的細胞の溶解または透過処理時に前記標的細胞から放出された１つ以上の細胞殺傷マーカーを捕捉する工程と、
    （ｅ）細胞殺傷シグナルを得るために、前記１つ以上の細胞殺傷マーカーを直接または検出剤を用いて検出する工程と
    を含む、方法。
  15. （ｆ）前記ＣＡＲ発現細胞または前記ＴＣＲ発現細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それによりＣＡＲまたはＴＣＲの配列を生成する、工程と、
    （ｇ）前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲの配列を、１つ以上の前記細胞殺傷シグナルに関連付ける工程と、
    （ｈ）（ｇ）の前記関連付ける工程に基づいて、前記関心対象の抗原と機能的に相互作用する前記ＣＡＲまたは前記ＴＣＲを特定する工程と
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. （ｅ）の後に、１つ以上の前記細胞殺傷シグナルに基づいて前記ナノバイアルを分類する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記親和剤は抗体捕捉部分である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記抗体捕捉部分は、蛍光タンパク質に対する親和性を有する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記検出剤は、前記標的細胞由来の細胞内生体分子に対する親和性を有する抗体またはオリゴヌクレオチドである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ナノバイアルの空洞部は、前記ナノバイアルの表面への開口部を含む、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. （ｄ）の前に、前記開口部を遮断するか、または前記開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 生物学的薬剤がナノバイアルの空洞部から拡散するのを防止する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に形成されるとともに前記ナノバイアルの表面への開口部を含む空洞部、および前記空洞部内に配置された１つ以上の生物学的薬剤を含む、工程と、
    （ｂ）遮断粒子が前記空洞部の前記開口部と相互作用し、かつ前記空洞部の開口部を実質的に遮断するか、または前記開口部のサイズを縮小するように前記遮断粒子を添加する工程であって、それによって、前記ナノバイアルが流体中に配置されたときに前記生物学的薬剤が前記空洞部から拡散するのを阻害する、工程と
    を含む、方法。
  23. 前記遮断粒子の最大直径が、前記空洞部の前記開口部の直径より大きい、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記遮断粒子は、前記空洞部の開口部に接している、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記遮断粒子はポリマーヒドロゲルを含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記遮断粒子は、１つ以上の親和剤で被覆される、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記１つ以上の親和剤は核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記核酸は、オリゴヌクレオチドタグまたはオリゴヌクレオチドバーコードである、請求項２７に記載の方法。
  29. 粒子および／または細胞を分析するように設計された複数の異なる種類の機器に適合するとともに前記機器に使用されるように構成された、サイズ、形状、界面化学、密度、またはそれらのあらゆる組合せを有する、ナノバイアル。
  30. 粒子および／または細胞を分析するように設計された前記複数の異なる種類の機器は、
    フローサイトメーター、蛍光活性化セルソーター、イメージングフローサイトメーター、画像活性化セルソーター、コールターカウンター、パーティクルカウンター、マイクロ流体液滴生成器、マイクロウェルアレイ、マイクロバルブを備えるマイクロ流体チップ、マイクロ流体ＳｌｉｐＣｈｉｐ、光流体マイクロデバイス、マイクロ流体液滴生成器、およびマイクロ流体チャネルからなる群から選択される、請求項２９に記載のナノバイアル。
  31. 前記ナノバイアルのサイズは直径約１００μｍ未満であり、キャッピングされた反応性官能基を含む、請求項２９または３０に記載のナノバイアル。
  32. 前記ナノバイアルは、粒子および／または細胞を分析するように設計された第１の機器、ならびにその後粒子および／または細胞を分析するように設計された第２の機器と共に使用されるように構成される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のナノバイアル。
  33. 前記ナノバイアルは、蛍光活性化セルソーター、画像活性化セルソーター、または光流体マイクロデバイスによって分類され、その後マイクロ流体液滴生成器に導入されるように構成される、請求項３２に記載のナノバイアル。
  34. 関心対象の細胞内のシグナル伝達経路を調節する薬物または化合物を特定する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に形成される空洞部を含み、前記空洞部が、（ｉ）薬物または化合物、および（ｉｉ）前記薬物または前記化合物に関連付けられるバーコードもしくは標識を含む、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアルの前記空洞部内に関心対象の細胞を担持させる工程と、
    （ｃ）前記薬物または前記化合物が前記関心対象の細胞と相互作用するように、前記ナノバイアルの空洞部内の容量へ前記薬物または前記化合物を放出するために前記ナノバイアルを刺激薬にさらす工程と、
    （ｄ）前記薬物または前記化合物が前記関心対象の細胞内の関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、前記ナノバイアルをインキュベートする工程と、
    （ｅ）前記関心対象の細胞内のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、
    （ｆ）前記バーコードもしくは前記標識を、前記関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する前記１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、
    （ｇ）（ｆ）の前記関連付ける工程に基づいて、前記関心対象のシグナル伝達経路を調節する前記薬物または前記化合物を特定する工程と
    を含む、方法。
  35. （ｆ）の前に、前記関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する前記１つ以上のシグナルに基づいて前記ナノバイアルを分類する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 関心対象のシグナル伝達経路を調節する１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に空洞部を含む、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアルの前記空洞部内に抗体産生細胞および抗原産生細胞を担持させる工程と、
    （ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが前記抗体産生細胞から分泌され、かつ前記抗原産生細胞内の前記関心対象のシグナル伝達経路を調節するように、前記ナノバイアルをインキュベートする工程と、
    （ｄ）前記関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、
    （ｅ）前記抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、
    （ｆ）前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、前記関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、
    （ｇ）（ｆ）の前記関連付ける工程に基づいて、前記関心対象のシグナル伝達経路を調節する前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程と
    を含む、方法。
  37. （ｅ）の前に、前記関心対象のシグナル伝達経路の調節に関する前記１つ以上のシグナルに基づいて前記ナノバイアルを分類する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  38. 前記抗原産生細胞は、前記関心対象のシグナル伝達経路の調節時に１つ以上の検出可能な標識を発現するように操作される、請求項３６～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. （ｄ）の前記検出する工程は、前記抗原産生細胞における１つ以上のｍＲＮＡレベルの変化を検出することを含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記検出することは、前記抗原産生細胞に由来した核酸に対して単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. （ｆ）の前記関連付ける工程は、共有されるオリゴヌクレオチドバーコードに基づいて、前記抗原産生細胞のｍＲＮＡレベルを、抗体産生細胞からの核酸配列情報と結び付けることを含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 関心対象の抗原に結合する抗体またはそのフラグメントを特定する方法であって、
    （ａ）ナノバイアルを提供するか、または得る工程であって、前記ナノバイアルが、前記ナノバイアルの中に形成される空洞部、およびそこに固定される親和剤を含む、工程と、
    （ｂ）前記ナノバイアルの前記空洞部内に抗体産生細胞を負荷する工程と、
    （ｃ）１つ以上の抗体またはそのフラグメントが前記抗体産生細胞から分泌され、かつ前記親和剤に結合するように、前記ナノバイアルをインキュベートする工程と、
    （ｄ）検出剤が前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントに結合するように、前記ナノバイアルの前記空洞部に前記検出剤を添加する工程と、
    （ｅ）前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの前記検出剤の結合に関する１つ以上のシグナルを検出する工程と、
    （ｆ）前記抗体産生細胞に由来した核酸に対してシーケンシングアッセイを実施する工程であって、それにより前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を生成する、工程と、
    （ｇ）前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントの配列を、前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントへの前記検出剤の結合に関する前記１つ以上のシグナルに関連付ける工程と、
    （ｈ）（ｇ）の前記関連付ける工程に基づいて、前記関心対象の抗原に結合する前記１つ以上の抗体またはそのフラグメントを特定する工程と
    を含む、方法。
  43. 前記ナノバイアルの前記空洞部は、それに固定された１つ以上の細胞捕捉剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  44. 前記親和剤は、前記関心対象の抗原をその表面上で発現する抗原提示細胞である、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 前記検出剤は、検出可能な標識を用いて直接または間接的に標識される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記検出可能な標識は、蛍光標識、タンパク質親和性タグ、オリゴヌクレオチドタグ、および磁性粒子からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ナノバイアルの前記空洞部は、前記ナノバイアルの表面への開口部を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. （ｃ）の前に、前記開口部を遮断するか、または前記開口部のサイズを縮小するために、１つ以上の遮断粒子を添加する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. １つ以上の細胞、１つ以上のビーズ、またはその両方を含むナノバイアルに対して濃縮を行う方法であって、
    （ａ）混合物を提供するか、または得る工程であって、前記混合物が、
    それぞれが前記ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む、複数のナノバイアル、および
    （ｉ）複数の浮遊細胞、前記浮遊ビーズ、またはその両方、
    （ｉｉ）複数の空のナノバイアル、あるいは
    （ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方
    を含む、工程と、
    （ｂ）前記混合物を溶液中で懸濁する工程と、
    （ｃ）少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む前記複数のナノバイアルが、（ｉ）の前記複数の浮遊細胞、浮遊ビーズ、またはその両方、（ｉｉ）の前記複数の空のナノバイアル、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両方とは別の前記ナノバイアルの空洞部内に配置されるように、前記溶液の密度を調整する工程と、
    （ｄ）前記ナノバイアルの空洞部内に配置された少なくとも１つの細胞、少なくとも１つのビーズ、またはその両方を含む前記複数のナノバイアルを採取する工程と
    を含む、方法。
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