CN116615229A - 测定生物细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于对生物细胞进行测定的方法，包括一般功能测定。本文还公开了对来自生物细胞的RNA的5'端进行条形码化的方法和从条形码化RNA制备表达构建体的方法。条形码化RNA可以编码目标蛋白，例如B细胞受体(BCR)重链和轻链序列。可以单独或以配对/多重方式生成表达构建体，从而允许快速重新表达个体蛋白或蛋白复合物。

Description

测定生物细胞的方法

本申请是非临时申请，根据35U.S.C.119(e)要求2020年9月21日提交的美国临时申请号63/080,960；于2020年9月7日提交的美国临时申请号63/075,269；以及于2021年6月16日提交的美国临时申请号63/211,337的权益，其中每项公开内容均通过引用以其整体并入本文。

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2021年8月27日创建的名称为“01149-0018-00PCT_ST25.txt”的文件形式提供，大小为17,595字节。序列表电子格式的信息通过引用以其整体并入本文。

发明介绍和概述

本申请涉及测定生物细胞的方法。本申请还涉及对来自生物细胞的RNA的5'端进行条形码化的方法以及从条形码化RNA制备表达构建体的方法。

在过去的三十年里，针对许多不同疾病开发了抗体疗法，从自身免疫性病症到感染性疾病和癌症。基于细胞的测定法能够针对天然抗原进行筛选，因此可以加速治疗性抗体先导候选物的选择。然而，使用典型工作流程筛选先导候选物细胞所需的时间显著增加了药物开发时间表。例如，在对动物进行免疫并从脾脏、骨髓或淋巴结中收集产生抗体的B淋巴细胞(或B细胞)后，可能需要至少12周的时间才能产生杂交瘤并筛选所有潜在的命中，从而延长了开发过程。

片上筛选系统的最新发展允许更快地选择先导候选物。例如，可以在微流体装置的腔室中平行克隆数万个细胞，并且可以进行多次测定以全面表征有希望的先导候选物。可以在芯片上进行自动细胞裂解和逆转录，以生成稳定的cDNA分子，随后可以将其回收用于配对的重链/轻链扩增和测序。然而，由于抗体产生细胞(尤其是浆细胞)的寿命较短，因此可以回收的序列总数受到该时间范围内的输出能力的限制。此外，验证获得的抗体序列需要克隆输出的cDNA、在培养物中重新表达抗体以及芯片外测定。使用传统的克隆和重新表达方法完成这项工作可能会很慢并且需要大量劳动。因此，需要允许快速选择和/或重新表达抗体的抗体发现工作流程。

本文公开了用于从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法。此外，本文还公开了从捕获的条形码化cDNA序列制备用于蛋白表达的表达构建体的方法。

在一些实施方案中，提供了测定第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的抑制的方法。在一些实施方案中，该方法在具有腔室的微流体装置内进行，该方法包括：将微物体引入微流体装置的腔室中，其中微物体包含多个第一分子；将细胞引入腔室中，其中细胞能够产生目标分子；在微物体的存在下，并且在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在腔室中孵育细胞；在腔室中孵育细胞后，将第二分子引入腔室中，其中第二分子与可检测标记结合；以及监测第二分子在微物体上的积累，其中第二分子在微物体上的积累不存在或减少表明目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。

在一些实施方案中，将微物体引入腔室中还可以包括基于检测微物体的活力情况来选择单个微物体。检测活力情况还可以包括采用机器学习算法为微物体分配活力概率。

在一些实施方案中，提供了一种从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法。在一些实施方案中，该方法包括在腔室内提供生物细胞；在腔室中提供捕获物体，捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列；裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA；以及反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均包含与相应的一个捕获的RNA互补的寡核苷酸序列，该捕获的RNA共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列。

在一些实施方案中，将生物细胞引入腔室中还可以包括基于检测生物细胞的活力情况来选择生物细胞。检测活力情况还可以包括采用机器学习算法为生物细胞分配活力概率。

在一些实施方案中，提供捕获物体，该捕获物体包含标记、多个第一和第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列，以及在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，并且其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其包括本文描述的多个捕获物体。在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，包括具有多个腔室的微流体装置和多个捕获物体，根据本文所述的任何捕获物体，每个捕获物体均具有多个第一和第二寡核苷酸。

在一些实施方案中，提供了一种用于将微物体引入微流体装置的腔室中的方法，该方法包括：将一个或多个微物体引入微流体装置的流动区域中；确定一个或多个微物体的活力情况；从一个或多个微物体中选择具有活力的至少一个微物体；以及将该至少一个微物体引入微流体装置的腔室。在一些实施方案中，在不标记一个或多个微物体的情况下执行确定活力情况，例如，微物体是无标记的。在一些实施方案中，确定活力情况还可以包括采用机器学习算法为一个或多个微物体中的每一个分配活力概率。在一些实施方案中，机器学习算法可以包括经训练的机器学习算法，其中训练可以包括对具有区分活力情况的标记的微物体进行成像。具有该标记的微物体形成分子训练集，并且可以是与引入到微流体装置的流动通道的一个或多个微物体相同种类的微物体。

所公开方法的这些和其他特征和优点将在随后的描述和所附权利要求中阐明或变得更加明显。这些特征和优点可以通过所附实施例、部分实施方案列表和权利要求中特别指出的目的和组合来实现和获得。此外，所描述的方法的特征和优点可以通过实践获知或者将从如下文所阐述的描述中显而易见。

应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对权利要求的限制。包含在本说明书中并构成本说明书一部分的附图举例说明一个(多个)实施方案，并且与描述一起用于解释本文描述的原理。

附图简要说明

图1A示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置和具有相关联的控制设备的系统。

图1B示出了根据本公开的实施方案的具有隔离坞的微流体装置。

图2A-2B示出了根据本公开的一些实施方案的具有隔离坞的微流体装置。

图2C示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的隔离坞。

图3示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的隔离坞。

图4A至4B示出了根据本公开的一些实施方案的微流体装置的动电特征。

图5A示出了根据本公开的一些实施方案的用于与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统。

图5B示出了根据本公开的一些实施方案的成像装置。

图6示出了根据本公开的一些实施方案的用于抗体发现的工作流程。

图7示出了根据本公开的某些实施方案的RNA捕获和逆转录以产生条形码化cDNA序列。

图8显示了根据本公开的某些实施方案使用转录活性PCR(TAP)形成抗体重链的表达构建体。

图9示出了根据本公开的某些实施方案的多路分配条形码化cDNA序列的示意图。

图10是本公开的捕获物体的一个实施方案的示意图。

图11是根据本公开的一些实施方案的用于比对序列片段以提供浆细胞的V(D)J序列的方法的示意图。

图12A是根据本公开的一些实施方案的基于参考的组装算法中的序列比对的图示。

图12B是根据本公开的一些实施方案的基于参考的组装算法中的序列比对的图示。

图12C是根据本公开的一些实施方案的基于参考的组装算法中的序列比对的图示。

图13是用于比对序列片段以提供B细胞受体序列的重链和轻链的寡核苷酸序列的方法的示意图。

图14A-B是根据本公开的一些实施方案的基于参考的组装算法中的序列比对的图示。

图15是用于序列识别的基于Sanger测序的模型的示意图。

图16A-16C显示了同时或平行进行的多个重组PD-L1珠结合测定。通道内进行的重组PD-L1珠结合测定(图16A-16C，顶行)向下选择(down-select)结合PD-L1包被珠的抗体。在所示实施方案中，封闭抗体和非封闭抗体都结合PD-L1包被珠。在坞内进行的细胞结合测定(图10A-10C，中间行)与重组PD-L1珠结合测定同时进行，并鉴定与报告细胞表达的天然PD-L1结合的抗体。在所示的实施方案中，封闭和非封闭抗体都与报告细胞结合。配体/受体封闭测定鉴定具有封闭PD-1/PD-L1相互作用的能力的抗体(图16A-16C，底行)。在所示的实施方案中，通过非荧光报告细胞检测封闭抗体，而非封闭抗体产生荧光报告细胞。

图17显示，更深入的表征能够向下选择高质量先导候选物。不到2％的筛选的浆B细胞分泌结合重组PD-L1的抗体。在这598种抗体中，只有273种抗体(不到筛选的浆B细胞的1％)与基于细胞的PD-L1结合(如CHO-K1细胞结合测定中所示)。用配体/受体封闭测定进一步筛选向下选择46个先导候选物(筛选的浆B细胞的0.1％)。

图18显示通过使用根据本公开的某些实施方案的方法从多个器官筛选B细胞来鉴定大量功能活性的先导候选物。与脾脏相比，从骨髓中的浆B细胞中鉴定出多三倍(3x)的配体/受体封闭抗体(46个候选者物中有34个，或74％)。

图19A-19D显示当使用常规的基于孔板的测定法评价时，重新表达的抗体表现出预期的功能行为。克隆和重新表达的24个先导候选物中有20个在ELISA测定(图19A)中表现出对PD-L1胞外结构域(ECD)的结合亲和力以及在FACS测定(图19B)中表现出对CHO-K1细胞表达的全长PD-L1蛋白的结合亲和力。相同的20种抗体还结合了最有可能在药物开发的临床前阶段期间用于专性(obligate)动物研究的食蟹猴PD-L1蛋白(图19C)。最后，纯化抗体中有20种有效封闭了PD-1/PD-L1相互作用(图19D)。这些抗体中有20％的IC50值与目前临床上的PD-1/PD-L1封闭抗体相当。

图20是在明场(顶部)、FITC(钙黄绿素)和DAPI(Zombie)(中间)和CY5(CD138)(底部)立方体通道(过滤器立方体)处成像的微流体装置内设置的染色细胞的照片表示。通道和腔室中都有细胞，这可能很难在明场图像(顶部)中确定。例如，圆圈2010圈出三个钙黄绿素阳性细胞，如中间图像所示；圆圈2020圈出另外4个细胞，其中3个是Zombie阳性的，其中1个是钙黄绿素阳性的，如中间图像所示。

图21显示了三个箱线图，分别示出了微流体装置内部用钙黄绿素(顶部)、Zombie(中间)和CD138(底部)染色的细胞的荧光水平(亮度)。每个通道确定细胞是否染色阳性的阈值基于高于每个通道平均值的2个标准偏差(stdev)。n＝5837个细胞。

图22显示了比较用Zombie(顶部)、钙黄绿素(中间)和CD138(底部)在通道内和坞内染色的细胞的荧光水平(亮度)的箱线图。提供了从三个微流体装置(芯片)收集的数据：D70161，通道中n＝4403，细胞中n＝3179；D70163，通道中n＝4698个细胞，坞中n＝3561个细胞；D70169，通道中n＝4523个细胞，坞中n＝3563个细胞。通过门控细胞直径(10微米)排除异常值，并且在Image Analyzer 2.1中验证的细胞碎片/团块也被排除在外。每个点代表通道中的浆细胞。晶须(whisker)延伸到IQR的1.5倍以内的数据。

图23显示了基于未染色细胞的阈值(钙黄绿素为328.9AFU，Zombie为4101.7AFU，CD138为2024.6AFU)，通道内和坞内用CD138(顶部)、Zombie(中间)和钙黄绿素(底部)染色的细胞之间的亚群频率差异的图表。

图24显示密度散点图，示出了比较通道内和坞内位置的CD138、钙黄绿素、Zombie细胞表达水平的关系。数据以对数标度显示。从显示钙黄绿素和Zombie表达水平的图中，可以清楚地观察到两个亚群；而从Zombie和CD138表达水平的比较中观察到一个主要的亚群。密度散点图证明钙黄绿素以最大的荧光分离度将活的和死的亚群分开。

图25A-25B显示了示出来自显示活细胞(图25A)或死细胞(图25B)(散点图)的信号强度的芯片外FACS分析和反向门控分析每个小图右侧的三个图)的数据的图表。这些图表验证了片上数据与片外流式细胞术数据非常匹配。在BD FACS Celesta细胞分析仪上进行分析，并使用FlowJo v10软件分析数据。

图26A-26B显示了示出来自片外FACS分析的数据的散点图。这些散点图展示了Zombie(DAPI)与钙黄绿素(FITC)(图26A)以及Zombie(DAPI)与CD138(AF647)(图26B)之间的相关性。

图27展示了在明场下观察到的三种典型细胞形态，其可用于与指定的细胞活力值相关联。

图28显示了钙黄绿素强度与细胞形态之间的相关性。

图29显示了在明场和FITC通道(钙黄绿素)拍摄的组合图像。

图30显示了图29中检测到的B细胞(用“+”表示)的图像，其用作活/死分类模型的输入。

图31显示了活/死分类模型的预期输出。每个活细胞都用实心圆圈表示；而每个死细胞都用'+'表示。

图32显示了通过经过训练的活/死分类模型执行的无染色样品的检测。左侧图像显示了算法识别的活细胞(白色实心圆圈)和死细胞(黑色实心圆圈)。右侧图像是由人眼标注的明场图像，验证了算法是准确的。

图33显示了在明场和FITC通道(钙黄绿素)拍摄的组合图像，这展示了活/死分类模型仅基于OEP图像就将检测到的B细胞正确分类为活/死细胞。每个活细胞都用实心圆圈表示；而每个死细胞都用'+'表示。

图34显示与图33相同但OEP通道关闭的图像。每个活细胞都用实心圆圈表示；而每个死细胞都用'+'表示。

图35A-35B显示了两个图，展示了阈值的设置如何影响活/死检测的精确度(图35A)和召回率(图35B)。

图36显示了示出F1分数的图，F1分数是从图35A-35B中的精确度和召回率数据计算的调和平均值。

图37是根据本公开的一些实施方案的来自使用条形码特异性正向引物扩增cDNA的PCR反应的具有预期条形码的扩增子的频率的图示。

图38显示分别由密度为1.7x10^8的Jurkat细胞(上)和由密度为1x10^8的K562细胞(下)填充的通道的片上图像。

图39示出了受体封闭测定的一般示意图。

图40示出了配体封闭测定的一般示意图。

图41示出了芯片上的受体封闭测定。分泌B细胞显示为“B”圆圈。报告细胞显示为“R”圆圈。染料标记的配体显示为“L”矩形。上图展示了分泌的抗体与报告细胞结合并封闭配体结合的情况。下图展示了分泌的抗体是非封闭的，允许配体与报告细胞结合的情况。

图42示出了芯片上的配体封闭测定。分泌抗体的B细胞显示为“B”圆圈。报告细胞显示为“R”圆圈。染料标记的配体显示为“L”矩形。上图展示了分泌的抗体与配体结合并封闭与报告细胞结合的情况。中间图展示了分泌的抗体是非封闭的，允许配体与报告细胞结合的情况。下图展示了分泌的抗体结合并阻断配体的情况，但由于配体浓度显著超过分泌的抗体的浓度，一些配体可能会到达并与报告细胞结合。

图43示出了受体封闭测定的设计。CD3在Jurkat报告细胞的表面上内源性表达，并结合分泌的OKT3抗体以及染料标记的HIT3a(配体)。带有OKT3分泌杂交瘤细胞的坞应封闭HIT3a结合，并且报告细胞将在配体成像通道中显得暗。缺少OKT3分泌细胞的坞将是非封闭的，并且HIT3可以自由地与报告细胞结合，其在配体成像通道中会显得明亮。

图44A显示作为配体浓度的函数的背景(平均背景亮度)和报告细胞(最大亮度)的强度分布。

图44B显示作为配体浓度的函数的背景消除报告细胞强度(Max-BG)的中值、第75和第95百分位数。

图45A显示了作为时间的函数的背景(平均背景亮度)和报告细胞(最大亮度)的强度分布。

图45B显示作为配体浓度的函数的背景消除报告细胞强度(Max-BG)的中值。

图46A-46B显示了在即将用培养基冲洗芯片之前(图46A)和冲洗芯片之后5分钟(图46B)的平均背景亮度(“BG”)和最大亮度(“Max”)的分布。黑色垂直线(“阈值”)表示由平均背景信号加上2个标准偏差定义的细胞检测阈值。

图47A显示了在即将用培养基冲洗之前和之后5分钟的背景消除报告细胞强度直方图。

图47B显示作为时间的函数的背景(平均背景亮度)和报告细胞高于检测阈值的分数()。

图48是显示基于坞的假阳性命中率作为报告检测率和每坞加载的报告细胞的函数的热图。原始热图以彩色显示，黑白版本如图48所示。

图49A-49B显示了每坞的背景荧光分布(平均背景亮度)、来自装载IgG分泌OKT3的坞的每坞最亮报告细胞荧光(OKT3最大亮度)和来自装载IgG分泌OKT8的坞的每坞最亮报告细胞荧光(OKT8最大亮度)。图49B是荧光分布的放大图。

图50A-50C显示了作为每坞具有≥1个Jurkat报告细胞(图50A)、≥3个Jurkat报告细胞(图50B)和≥5个Jurkat报告细胞(图50C)的信号阈值的函数的OKT3命中、OKT8命中和假阳性命中率。

某些实施方案的详述

本说明书描述了本公开的示例性实施方案和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的元件尺寸可以被夸大或者可以不成比例。此外，当在本文中使用术语“在…上”、“附接到”、“连接到”或“耦接到”或类似词语时，一个元件(例如，材料、层、基板等)可以“在另一元件上”、“附接到另一元件”、“连接到另一元件”、或“耦接到另一元件”，而不论该一个元件是直接位于该另一元件上、附接、连接或耦接到该另一元件，还是在该一个元件与该另一元件之间存在一个或多个中间元件。而且，除非上下文另有所指，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在…下、在…上、上部、下部、水平、竖直、“x”、“y”、“z”等)，它们是相对地且仅作为示例提供的，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。此外，在提及元件列表(例如，元件a、b、c)的情况下，这种提及旨在包括所列出的元件的任何一个本身、少于全部列出的元件的任意组合和/或全部所列出的元件的组合。本说明书中的段落划分仅为了便于查看，并且不限制所讨论元件的任意组合。

在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸均位于与微流体装置的基板和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于与微流体装置的基板和/或盖平行的平面。在一些情况下，诸如通道或通路的微流体特征的横截面积可以参照x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。

I.定义

尽管术语“第一”和“第二”可在本文中用于描述各种特征/元素(包括步骤)，但是这些特征/元素不应受这些术语限制，除非上下文另有说明。这些术语可用于将一个特征/元素与另一个特征/元素区分开来。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下面讨论的第一特征/元素可以被称为第二特征/元素，并且类似地，下面讨论的第二特征/元素可以被称为第一特征/元素。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”的变体是指各种组分可以共同用于方法和物品中(例如，组合物和设备，包括装置和方法)。例如，术语“包含”将被理解为暗示包括任何所述的元素或步骤但不排除任何其他元素或步骤。

如本文在说明书和权利要求中所用，包括如在实施方案中所用，除非另有明确说明，否则所有数字都可以理解为好像以词语“约(about)”或“大约(approximately)”开头，即使该术语没有明确出现。在描述数值和/或位置时可以使用短语“约”或“大约”来表示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，一个数值的值可能是所述值(或值范围)的+/-0.1％、所述值(或值范围)的+/-1％、所述值(或值范围)的+/-2％、所述值(或值范围)的+/-5％、所述值(或值范围)的+/-10％等。本文给出的任何数值也应理解为包括约或大约该值，除非上下文另有说明。例如，如果值“10”被公开了，则“约10”也被公开了。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应当理解，当一个值被公开时，“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围也被公开了，如本领域技术人员适当理解的那样。例如，如果值“X”被公开，则“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是一个数值)也被公开了。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点、以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10至15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果10和15被公开，则11、12、13和14也被公开了。

如本文所使用的，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许从绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，诸如本领域普通技术人员可以预期的，但这些变化对整体性能没有明显影响。当与数值或者可以表示为数值的参数或特征一起使用时，“基本上”意指在百分之十之内。

术语“数个”意味着多于一个。如本文所使用的，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。

如本文所使用的：μm意指微米，μm³意指立方微米，pL意指皮升，并且μL(或uL)意指微升。

如本文所用，“空气”是指地球大气中占主导地位的气体的组成。四种最丰富的气体是氮气(通常以约78体积％的浓度存在，例如，在约70-80％的范围内)、氧气(在海平面上通常以约20.95体积％存在，例如在约10％至约25％的范围内)、氩气(通常以约1.0体积％存在，例如在约0.1％至约3％的范围内)和二氧化碳(通常以约0.04％存在，例如在约0.01％至约0.07％的范围内)。空气中可能含有其他微量气体，如甲烷、一氧化二氮或臭氧，微量污染物和有机物质，如花粉、柴油微粒等。空气可包括水蒸气(通常以约0.25％的量存在，或者可以在按体积计约10ppm至约5％的范围内存在)。空气可以作为过滤的受控组合物提供用于培养实验，并且可以如本文所述进行调节。

如本文所用，术语“布置(disposed)”在其含义内包括“位于”。

如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是一种装置，其包括被配置为容纳流体的一个或多个离散微流体回路，每个微流体回路包括流体互连的回路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞，以及被配置为允许流体(以及任选地，悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置的至少一个端口。通常，微流体装置的微流体回路将包括流动区域，其可包括微流体通道和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL，例如小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、或2μL的流体体积。在某些实施方案中，微流体回路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体回路可配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。

如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是具有包含至少一个回路元件的微流体回路的一种类型的微流体装置，该至少一个回路元件被配置为保持小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可包括多个回路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000个或更多个)。在某些实施方案中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置为保持以下流体体积：约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或者1至50nL。在其他实施方案中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置为保持以下流体体积：约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或者250至750nL。

微流体装置或纳米流体装置在本文中可称为“微流体芯片”或“芯片”；或者“纳米流体芯片”或“芯片”。

如本文所用，“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。通道的长度通常由通道的流动路径限定。在直通道的情况下，长度将是通道的“纵轴”。通道的“水平尺寸”或“宽度”是在定向为垂直于通道的纵轴的横截面中观察到的水平尺寸(或者，如果通道是弯曲的，则在横截面平面上垂直于与通道的流动路径相切的轴线)。通道的“垂直尺寸”或“高度”是在定向为垂直于通道的纵轴的横截面中观察到的垂直尺寸(或者，如果通道是弯曲的，则在横截面平面上垂直于与通道的流动路径相切的轴线)。

例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，是所述长度的至少10倍、所述长度的至少25倍、所述长度的至少100倍、所述长度的至少200倍、所述长度的至少500倍、所述长度的至少1000倍、所述长度的至少5000倍，或者更长。在一些实施方案中，流动通道的长度是约100000微米至约500000微米，包括在其之间的任何值。在一些实施方案中，水平尺寸是约100微米至约1000微米(例如，约150到约500微米)，垂直尺寸是约25微米至约200微米(例如，从约40至约150微米)。应该注意，流动通道在微流体装置中可以具有各种不同的空间构造，并且因此不限于完美的线性元件。例如，流动通道可以是或者可包括具有以下构造的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下倾、分叉(例如，多个不同的流动路径)及其任意组合。此外，流动通道可以具有沿其路径的不同的横截面积(扩宽和收缩)，以在其中提供期望的流体流动。流动通道可包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的示例在美国专利6,408,878和9,227,200中公开，其全部内容通过引用整体合并在本文中。

例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如所述长度的至少10倍、所述长度的至少25倍、所述长度的至少100倍、所述长度的至少200倍、所述长度的至少500倍、所述长度的至少1,000倍、所述长度的至少5,000倍，或者更长。在一些实施方案中，流动通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括其间的任何值。在一些实施方案中，水平尺寸为约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)且垂直尺寸为约25微米至约200微米(例如，约40至约150微米)。应注意，流动通道在微流体装置中可具有多种不同的空间配置，并因此不限于完美的线性元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降、分叉(例如，多个不同的流动路径)及其任何组合。此外，流动通道沿其路径可具有不同的横截面积(扩宽和收缩)，以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的示例在美国专利6,408,878和9,227,200中公开，其全部内容通过引用整体并入本文。

流体流动通过流动区域(例如，通道)或其他回路元件(例如，腔室)的方向决定了流动区域或回路元件的“上游”和“下游”方向。因此，入口通常位于上游位置，而出口通常位于下游位置。本领域技术人员将理解，“入口”或“出口”的指定可以通过反转装置内的流动或通过打开一个或多个替代孔来改变。

如本文所用，术语“透明”是指允许可见光穿过而基本上不改变穿过的光的材料。

如本文所用，“明场”照明和/或图像是指来自广谱光源的微流体视场的白光照明，其中对比度由视场中的物体对光的吸收形成。

如本文所用，“结构光”是经调制以提供一种或多种照明效果的投射光。第一照明效果可以是投射光照亮设备表面的一部分而不照亮(或至少最小化照亮)表面的相邻部分，例如用于激活DEP基板内的DEP力的投射光图案，如下文更全面描述的。当使用结构光模式来激活DEP力时，强度(例如结构光调制器如DMD的占空比变化)可用于改变施加到光激活DEP致动器的光功率，从而改变DEP力而无需更改标称电压或频率。可由结构光产生的另一种照明效果包括投射光，其可针对表面不规则性和与光投射本身相关联的不规则性进行校正，例如，在照明场的边缘处衰减。结构光通常由结构光调制器生成，例如数字镜像器件(DMD)、微快门阵列系统(MSA)、液晶显示器(LCD)等。用结构光对表面的小区域(例如选定的目标区域)进行照明改善信噪比(SNR)，因为仅对选定的目标区域的照明减少了杂散/散射光，从而降低图像的暗度水平。结构光的一个重要方面是它可能会随着时间的推移而迅速改变。来自结构光调制器(例如DMD)的光图案可用于自动聚焦于困难的目标，例如干净的镜子或远离焦点的表面。通过使用干净的镜子，可以复制许多自测试特征，如调制传递函数和场曲率/倾斜的测量，而无需更昂贵的Shack-Hartmann传感器。在结构光模式的另一种用途中，可以使用简单的功率计代替相机在样品表面测量空间功率分布。结构光模式也可用作光学模块/系统组件对齐的参考特征，以及用作手动对焦的手动读数。通过使用结构光模式可能实现的另一种照明效果是选择性固化，例如微流体装置内水凝胶的固化。

如本文所用，术语“微物体”通常指代根据本公开可被分离和/或操纵的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、玻璃珠、无定形固体底物、Luminex^TM珠等)；磁珠；微棒；微丝；量子点等；生物微物体，如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制剂)；脂质纳米筏等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包被的微珠、脂质体包被的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价连接的部分/分子，如荧光标记、蛋白(包括受体分子)、碳水化合物、抗原、小分子信号部分或能够在测定中使用的其他化学/生物种类。在一些变形中，包括部分/分子的珠/固体底物可以是捕获珠，例如，配置成选择性或非选择性地结合邻近存在的分子，包括小分子、肽、蛋白质或核酸。在一个非限制性实例中，捕获珠可以包括被配置为结合具有特定核酸序列的核酸的核酸序列，或者捕获珠的核酸序列可以被配置为结合具有相关核酸序列的一组核酸序列。任何一种类型的结合都可以理解为是选择性的。当进行结构不同但物理化学相似的分子的结合时，含有部分/分子的捕获珠可以非选择性地结合，例如，尺寸排阻珠或沸石被配置为捕获选定大小或电荷的分子。例如，在Ritchie等人(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in PhospholipidBilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中描述了脂质纳米筏。

如本文所用，术语“细胞”可与术语“生物细胞”互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞，如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼类细胞等，原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等，从组织分离的细胞，如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝、肺、神经组织等，免疫细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等，胚胎(例如受精卵)、卵母细胞、卵细胞、精子细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。

如果一个生物细胞集落中所有能够繁殖的活细胞均源自单一亲本细胞的子细胞，那么该集落就是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过10次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过14次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过17次分裂的单一亲本细胞。在其他实施方案中，克隆集落中的所有子细胞均源自不超过20次分裂的单一亲本细胞。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。

如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000、或大于1000个细胞)。

如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞有活力和/或扩增所必需的条件。

如本文所用，当提及细胞时，术语“扩增”是指细胞数量的增加。

如本文所指，“气体可渗透”是指材料或结构对于氧气、二氧化碳或氮气中的至少一种是可渗透的。在一些实施方案中，气体可渗透材料或结构对于氧气、二氧化碳和氮气中的多于一种是可渗透的，并且可进一步对于所有这三种气体都是可渗透的。

流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生化分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。

如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着向下的浓度梯度的热力学运动。

短语“介质的流动”意指主要由于扩散以外的任何机制引起的流体介质的整体运动，并且可以包括灌注。例如，介质的流动可涉及由于点之间的压力差引起的流体介质从一个点到另一个点的运动。这种流动可包括液体的连续流动、脉冲流动、周期性流动、随机流动、间歇性流动或往复流动，或者其任意组合。当一种流体介质流入另一种流体介质中时，会产生介质的湍流和混合。流动可以包括将溶液拉动通过和拉出微流体通道(例如，抽吸)或将流体推入和推动通过微流体通道(例如灌注)。

短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，当对时间进行平均时，该流速小于材料组分(例如，目标分析物)扩散到流体介质中或流体介质内的扩散速率。流体介质中组分的流速(即平流)除以该组分的扩散速率的比率可以用无量纲佩克莱数(Peclet number)表示。因此，微流体装置内的一个区域在佩克莱数小于1时基本上没有流动。与微流体装置内特定区域相关的佩克莱数可能随所考虑的流体介质的一种或多种组分(例如，目标分析物)而变化，因为流体介质中的一种或多种组分的扩散速率可能取决于例如，温度；该一种或多种组分的大小、质量和/或形状，以及该一种或多种组分与流体介质之间的相互作用的强度。在某些实施方案中，与微流体装置的特定区域和位于其中的组分相关的佩克莱数可以是0.95或更小、0.9或更小、0.85或更小、0.8或更小、0.75或更小、0.7或更小、0.65或更小、0.6或更小、0.55或更小、0.5或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小、0.1或更小、0.05或更小、0.01或更小、0.005或更小或0.001或更小。

如本文中关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上填充有液体(诸如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单一体(single body)。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上一定是相同的。相反，微流体装置的不同的流体连接区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，诸如蛋白、碳水化合物、离子或其他分子)，由于溶质沿着它们各自的向下的浓度梯度运动和/或由于流体流经装置，这些成分不断变化。

如本文所用，“流动路径”是指限定介质流的轨迹并经历介质流的轨迹的一个或多个流体连接的回路元件(例如，(多条)通道、(多个)区域、(多个)腔室等)。因此，流动路径是微流体装置的扫过区域的示例。其他回路元件(例如，未扫过区域)可以与包括流动路径而不经历流动路径中的介质流的回路元件流体连接。

如本文所使用的，“隔离微物体”将微物体限制到微流体装置内的限定区域。

限定区域可以例如是腔室。如本文所用，“腔室”是微流体装置内的区域(例如，回路元件)，其允许一个或多个微物体与位于微流体装置内的其他微物体隔离。腔室的示例包括微孔，其可以是从基板(例如，平面基板)蚀刻出的区域，如美国专利申请公开号2013/0130232(Weibel等人)和2013/0204076(Han等人)中所述的，或在多层装置如WO 2010/040851(Dimov等人)或美国专利申请号2012/0009671(Hansen等人)中描述的微流体装置中形成的区域。腔室的其他示例包括带阀腔室，如在WO 2004/089810(McBride等人)和美国专利申请公开号2012/0015347(Singhal等人)中所述的。腔室的其他示例包括描述于以下文献中的腔室：Somaweera等人(2013),“Generation of a Chemical Gradient Across anArray of 256Cell Cultures in a Single Chip”,Analyst.,Vol.138(19),pp 5566-5571；美国专利申请公开号2011/0053151(Hansen等人)；和美国专利申请公开号2006/0154361(Wikswo等人)。腔室的其他示例包括本文详细描述的隔离坞。在某些实施方案中，腔室可被配置成容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，腔室可被配置成容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或250至750nL的流体体积。

如本文所用，“移入坞中(pen)”或“移入坞中(penning)”具体是指将微物体置于微流体装置内的隔离坞内。用于将微物体移入坞中的力可以是本文所述的任何合适的力，如介电泳(DEP)，例如光学致动介电泳力(OEP)；重力；磁力；局部致动流体流动；或倾斜。在一些实施方案中，将多个微物体移入坞中可以重新定位基本上所有的微物体。在一些其他实施方案中，可以将选定数量的多个微物体移入坞中，并且可以将多个微物体的剩余部分不移入坞中。在一些实施方案中，当将选定的微物体移入坞中时，可以使用DEP力例如光学致动DEP力或磁力重新定位所选定的微物体。通常，可以将微物体引入微流体装置的流动区域，例如微流体通道，然后通过移入坞中引入腔室中。

如本文所用，“从坞中移出(unpen)”或“从坞中移出(unpenning)”是指将微物体从隔离坞内重新定位到微流体装置的流动区域(例如微流体通道)内的新位置。用于从坞中移出微物体的力可以是本文所述的任何合适的力，如介电泳，例如光学致动介电泳力；重力；磁力；局部致动流体流动；或倾斜。在一些实施方案中，从坞中移出多个微物体可以重新定位基本上所有的微物体。在一些其他实施方案中，可以从坞中移出选定数量的多个微物体，并且多个微物体的剩余部分可以不从坞中移出。在一些实施方案中，当从坞中移出选定的微物体时，可以使用DEP力例如光学致动DEP力或磁力来重新定位所选定的微物体。

如本文所用，“导出(export)”或“导出(exporting)”可包括以下，由以下组成或基本上由以下组成：将微物体从微流体装置内的一位置(例如，流动区域、微流体通道、腔室等)重新定位到微流体装置外部的位置(例如孔板、管或其他接收容器)。在一些实施方案中，导出微物体包括从微流体装置内取出(例如，微移液)一定体积的含有微物体的介质，并将该体积的介质布置在微流体装置外部的位置中或之上。在一些相关实施方案中，在取出该体积的介质之前先拆卸微流体装置(例如，从微流体装置的下层(如底座或基板)移除微流体装置的上层(如盖或盖子))以促进(例如，微移液的)进入微流体装置的内部区域。在其他实施方案中，导出微物体包括使一定体积的含有微物体的流体流动通过微流体装置的流动区域(包括例如微流体通道)，通过微流体装置的出口流出，以及将该体积的介质布置在微流体装置外部的位置中或之上。在这样的实施方案中，微流体通道内的微物体可以被导出而不需要拆卸(例如，移除装置的盖子)或将工具插入微流体装置的内部区域中以移除微物体用于进一步处理。“导出(Export)”或“导出(exporting)”可以进一步包括将微物体从可以包括隔离坞的腔室内重新定位到流动区域(如微流体通道)内的新位置，如上文关于“从坞中移出”所述。如本文关于隔离坞所述的，腔室相对于微流体通道的平面取向，使得腔室从微流体通道横向打开，允许容易地导出已经被定位或重新定位(例如，从腔室中从坞中移出)的微物体以被布置在微流体通道内。

微流体(或纳米流体)装置可包括“扫过(swept)”区域和“未扫过”区域。如本文所用，“扫过”区域由微流体回路的一个或多个流体(unswept)互连回路元件组成，当流体正在流经微流体回路时，每个流体互连回路元件都经受着介质流。扫过区域的回路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所用，“未扫过”区域由微流体回路的一个或多个流体互连回路元件组成，当流体流经微流体回路时，每个流体互连回路元件基本上不经受流体通量。只要流体连接被构造为使得能够扩散，但在扫过区域与未扫过区域之间基本上没有介质流，则未扫过区域能够流体连接到扫过区域。微流体装置因此可以被构造为基本上将未扫过区域与扫过区域中的介质流隔离，同时使得基本上仅实现在扫过区域与未扫过区域之间的扩散流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫过区域的示例，而微流体装置的隔离区域(在下面进一步详细描述)是未扫过区域的示例。

如本文所用，流体介质流的“非扫过(non-sweeping)”速率是指足以允许隔离坞的隔离区域中的第二流体介质的组分扩散到流动区域中的第一流体介质中和/或允许第一流体介质的组分扩散到隔离区域中的第二流体介质中的流速；进一步地，其中第一介质基本上不流动进入隔离区域中。

如本文所用，“隔离区域”是指微流体装置内的区域，其被配置为保持微物体，使得微物体不会由于流体流经微流体装置而被抽离该区域。根据上下文，术语“隔离区域”可以进一步指限定可包括底座/基板、壁(例如，由微流体回路材料制成)和盖的区域的结构。

如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)并且包括多克隆和单克隆抗体两者；多链抗体，诸如IgG、IgM、IgA、IgE和IgD抗体；单链抗体，诸如骆驼抗体；哺乳动物抗体，包括灵长类抗体(例如，人)、啮齿类抗体(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等)、兔类抗体(例如，兔)、有蹄类抗体(例如，牛、猪、马、驴、骆驼等)和犬科抗体(例如，狗)；灵长类化(例如，人源化)抗体；嵌合抗体，诸如小鼠-人、小鼠-灵长类抗体等；并且可以是完整分子或其片段(诸如轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)，或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集物；并且可以天然存在或通过例如免疫、合成或基因工程产生。如本文所用，“抗体片段”是指源自抗体或与抗体相关的结合抗原的片段。在一些实施方案中，抗体片段可以被衍生化以表现出促进清除和吸收的结构特征，例如，通过引入半乳糖残基。生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白，诸如抗体)的能力可以在这种微流体装置中测定。在测定的具体实施方案中，包括要被测定以产生目标分析物的生物微物体(例如，细胞)的样本材料可以被加载到微流体装置的扫过区域中。可以针对特定特性选择生物微物体中的一些(例如，哺乳动物细胞，诸如人类细胞)并且将其设置在未扫过区域中。随后，剩余的样本材料可以流出扫过区域并且测定材料流入扫过区域。由于所选择的生物微物体在未扫过区域中，因此所选择的生物微物体基本上不受剩余样本材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生可以从未扫过区域扩散到扫过区域中的目标分析物，其中目标分析物可以与测定材料反应以产生局部化的可检测的反应，每个局部化的可检测的反应可以与特定未扫过区域相关。可以分析与检测到的反应相关联的任何未扫过区域，以确定未扫过区域中的生物微物体中的哪些(如果有的话)是目标分析物的充分的产生者。

如本文所指代的抗原是可以与另一分子(诸如Ag特异性受体)特异性结合的分子或其一部分。抗原可以是分子的任何部分，诸如构象表位或线性分子片段，并且通常可以被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别。抗原可包括肽、多糖或脂质。抗原的特征可以在于其结合到抗体的可变Fab区域的能力。不同的抗体具有区分存在于抗原表面上的不同表位的潜力，其结构可以通过半抗原的存在来调节，该半抗原可以是小分子。

在一些实施方案中，抗原是癌细胞关联抗原。癌细胞关联抗原可以是简单的或复杂的；抗原可以是蛋白上的表位、碳水化合物基团或链、除蛋白或碳水化合物以外的生物或化学试剂、或其任意组合；表位可以是线性的或构象的。

癌细胞关联抗原可以是独特地识别癌细胞(例如，一种或多种特定类型的癌细胞)的抗原，或者与其在正常细胞上的表达相比在癌细胞上被上调的抗原。通常，癌细胞关联抗原存在于癌细胞的表面，从而确保其能够被抗体识别。抗原可以与任何类型的癌细胞相关联，包括可以在本领域已知的或本文描述的肿瘤中发现的任何类型的癌细胞。特别地，抗原可以与肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等相关联。如本文所用，术语“与癌细胞关联”，当用于指抗原时，意指抗原直接由癌细胞产生或由癌细胞与正常细胞之间的相互作用产生。

术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用并且指核苷酸的聚合物。此类核苷酸聚合物可以包含天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指包含核酸分子或多核苷酸的线性核苷酸序列。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“B”是选自G(鸟苷)、C(胞苷)和T(胸苷)核苷酸但不包括A(腺嘌呤)的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“H”是选自A、C和T但不包括G的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“D”是选自A、G和T但不包括C的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“K”是选自G和T的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“M”是选自A或C的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“N”是选自A、C、G和T的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“R”是选自A和G的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“S”是选自G和C的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“V”是选自A、G和C并且不包括T的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“Y”是选自C和T的核苷酸。

如本文所用，用于表示单个核苷酸的“I”是肌苷。

如本文所用，后面带有*的A、C、T、G表示该核苷酸的磷酸酯键中的硫代磷酸酯取代。

如本文所用，IsoG是异鸟苷；IsoC是异胞苷；IsodG是异鸟苷脱氧核糖核苷酸，IsodC是异胞苷脱氧核糖核苷酸。每个异鸟苷和异胞苷核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸都含有一个核碱基，该核碱基分别与鸟嘌呤核碱基或胞嘧啶核碱基异构，通常引入RNA或DNA中。

如本文所用，rG表示包括在另外含有脱氧核糖核苷酸的核酸内的核糖核苷酸。含有所有核糖核苷酸的核酸可以不包括标记以指示每个核苷酸都是核糖核苷酸，但通过上下文使其清楚。

如本文所用，“引发序列”是寡核苷酸序列，其可以是较大寡核苷酸的一部分，但当与较大寡核苷酸分离时使得引发序列包含游离3'端时，可以充当DNA(或RNA)聚合反应中的引物。

II.抗体发现方法

如上所述，使用当前通常使用的大规模工作流程筛选用于先导候选物的细胞所需的时间显著地增加了药物开发时间线。因此，迫切需要减少筛选能够分泌所需抗体的细胞所需的时间，从而加速抗体的发现。图6显示了旨在提供抗体发现活动的加速的一般工作流程。该方法包括分离浆B细胞并将细胞导入微流体装置，优选为以下部分中公开的微流体装置。细胞可以加载到微流体装置的通道或腔室中并单独培养。在一些实施方案中，可以加载多达50k的单个浆B细胞。在一些实施方案中，可以将确定为健康的(例如，有活力的)、基本上健康的或富含一定比例的健康细胞的细胞优先引入微流体装置的腔室中。

该方法还可以包括进行结合或功能测定，其可以是但不限于用于测试每个坞中分泌的抗体的IgG-抗原特异性的基于珠的分析。该方法还可以包括加载核酸捕获物体，其可以是本文所述的任何核酸捕获物体，并进行芯片上裂解、核酸捕获和逆转录。如在以下部分中更详细地解释的，条形码化cDNA序列是通过使用本公开的捕获物体通过这些步骤产生的。核酸捕获物体另外被标记，以允许结合/功能测定结果与从负责测定结果的细胞分离的特定核酸相关联。标记的检测可以在工作流程期间的任何时间点进行，以识别每个腔室中每个捕获物体的标记。

随后，在捕获物体上捕获并包含BCR序列的条形码化cDNA序列(即条形码化BCR珠)可以导出到芯片外培养板。在一些实施方案中，来自超过1000个坞的条形码化BCR珠可以卸载到单个96孔板并允许后续过程的多重处理。

如在以下部分中更详细地说明的，本公开的捕获物体能够识别96孔板上条形码化BCR珠的来源。最后，可以进行后续分析，包括BCR序列的测序和/或选择性克隆、执行生物信息学可视化或BCR序列的重新表达。进一步地，在一些实施方案中，可以进行二次筛选。在一些实施方案中，本公开的方法旨在将筛选通量增加至多达50k单个浆B细胞和超过1000个靶B细胞受体(BCR)序列导出。总体而言，此工作流程提供了高通量抗体发现方法。

III.在导入腔室之前识别健康细胞的方法。

在本公开的方法中在将细胞导入腔室之前识别健康细胞能提供益处。如本文所指，健康细胞是表现出活力特征的细胞，例如，是活细胞并且具有继续生长和任选地产生目标生物分子和/或产生具有相同能力的子代细胞的能力。仅将、基本上仅将或将增加比例的来自导入种群的健康细胞布置到微流体装置的腔室(例如隔离坞)中，能增加鉴定其有用细胞/克隆种群的可能性。进一步地，在生物分子生产开发/鉴定活动期间使用的资源不会耗费在非活细胞上，从而减少浪费并保留使用预定数量的腔室用于有可能表达目标生物分子的细胞。

因此，本公开的另一方面是在将健康细胞导入微流体装置的腔室之前识别健康细胞。然而，由于微流体装置的小规模特性，鉴定微流体装置内的健康细胞可能很困难。此外，对于单个细胞培养方案，只能将相对较少数量的细胞导入装置中，并且对如此少量的细胞进行染色可能无法产生足以进行有意义检测的荧光强度。此外，对于某些生物分子生产方法，可能期望不包括对细胞本身进行任何种类的染料或染色，这取决于细胞的下游用途。因此，可用于开发一种识别和导入健康细胞的方法，这种方法不依赖于对每批待导入隔离坞中的细胞进行染色。

在一些实施方案中，为了识别健康细胞的目的，染色方法可以与明场图像观察相结合。

在一些实施方案中，识别健康细胞可涉及使用机器学习算法来处理图像数据。在一些实施方案中，机器学习算法能够在不染色的情况下识别健康细胞。机器学习算法可包括神经网络，如卷积神经网络。卷积神经网络(CNN)通常通过首先寻找低级特征(如，例如边缘和曲线)然后通过一系列卷积层推进到更抽象的(例如，被分类的图像类型所特有的)概念来实现图像处理和分类/检测的高级形式。CNN可通过将图像传递到一系列卷积、非线性、池化(或降采样，将在下面详细讨论)和全连接层来实现这一点，并获得输出。输出可以是最佳描述图像或检测图像上物体的单个类或类的概率。可用于这些方法中的CNN的一些实例包括已经被描述，例如，于2019年5月31日提交的名称为“Automated Detection andCharacterization of Micro-Object in Microfluidic Devices”的国际申请公开号WO2019/232473；以及于2017年12月1日提交的名称为“Automated Detection andCharacterization of Micro-Object in Microfluidic Devices”的国际申请公开号WO2018102748，其中每篇公开内容均通过引用方式并入本文。

在一些实施方案中，用于建立本公开的CNN模型的训练数据可以包括具有染色的目标细胞的荧光图像、具有注释的目标细胞的明场图像或其组合。适用于本公开的染料可以包括但不限于钙黄绿素、zombie紫染色剂、膜联蛋白、吖啶橙、碘化丙啶，或其组合。可以使用任何合适的区分健康细胞和死亡/垂死和/或非活细胞的染色剂，如本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，也可使用对目标标志物具有特异性的其他染料，例如，Alexa647抗小鼠CD138(Syndecan-1)抗体(BioLegend)，它对终末分化的活浆细胞具有高度特异性并对表面上呈现的CD138进行染色。在一些实施方案中，可使用两种或更多种染料对样品染色以提供交叉参考或验证。

在特定实施方案中，训练数据包括用荧光染料染色的细胞的图像以及明场下的细胞图像。例如，可通过在明场下观察细胞的形态来识别健康细胞。在一些实施方案中，健康细胞，例如活细胞，可以表征为具有清晰的细胞边界、良好的对比度、圆形或其组合。在一些实施方案中，可通过识别不健康细胞来确定健康细胞。例如，不健康的细胞可以被表征为具有碎片样外观、不清晰或不同的对比度或其组合。在许多实施方案中，可以通过比较样品中的细胞以相对方式进行活力评估。例如，健康细胞可具有更大的直径，而其他具有更小直径的细胞更可能是不健康的/死亡的或仅仅是细胞碎片。

在训练方案中，细胞可能首先在明场下检测，然后根据荧光强度标记为活/死细胞。在一些实施方案中，活细胞/死细胞的标记基于荧光强度的截止值，其可根据用户的喜好或需要来选择。

在对所研究的细胞类型完成训练后，可以采用使用经训练的机器学习算法将健康细胞移入坞中的方法，以提高将健康细胞移入坞中的效率，并减少移入坞中的非活细胞的数量。在一些实施方案中，在通过算法识别之后，健康细胞相对于导入腔室(例如隔离坞)中的非活细胞的百分比可以提高约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

IV.测定第一分子和第二分子之间的特异性结合相互作用的方法

可以在微流体芯片的腔室中测量第一分子和第二分子之间的结合相互作用。腔室可以是本文描述或提及的任何腔室，包括微孔或隔离坞，并且测定形式可以广泛变化。例如，测定可以是“夹心”测定，其中表面(如珠子或微流体装置的壁的内表面)被配置为捕获和/或呈递第一分子；通过标记的第三分子检测第二分子的结合，该第三分子能够结合第二分子与第一分子结合形成的复合物，从而以可检测的方式将第三分子的标记与表面相关联。在此类测定中，第二分子可由生物细胞产生。测定表面可以在腔室中(例如，如美国专利申请公开号2015/0165436和PCT国际公开号WO 2010/040851中所述)或靠近腔室，如在腔室连接的通道中(例如，如美国专利申请公开号2015/0151298中所述)。或者，该测定可以是扩散梯度测定，其中第二分子具有标记(其可以连接到第二分子，或者可以是第二分子的固有特性，如自发荧光)和可以监测在第一分子存在下标记的第二分子的扩散性质，例如，如PCT国际公开号WO 2017/181135中所述。在此类测定中，第一分子可以由生物细胞产生。还有，其他测定可以封闭相互作用为特征，其中目标分子与第一分子结合，从而封闭第一分子与第二分子的相互作用。在此类测定中，目标分子可以由生物细胞产生，并且第二分子可以包含标记。与夹心测定一样，封闭测定的特征是第一分子结合到表面上。该表面可以位于例如腔室中或靠近腔室的区域，如通道。封闭测定的实例在下文和本文别处描述，包括在实施方案和权利要求中。

通道内结合测定。在一些实施方案中，提供了一种测定第一分子和第二分子之间的特异性结合相互作用的方法。该方法可以在具有通道和与该通道流体连接的腔室(如微孔或隔离坞)的微流体装置内进行。该方法可包括：将多个生物细胞中的每一个引入多个腔室中的相应一个；孵育生物细胞并允许生物细胞产生和/或分泌目标分子；将包括多个第一分子的微物体引入通道中；以及监测目标分子在微物体上的积累。

在一些实施方案中，监测目标分子在微物体上的积累包括引入第三分子，该第三分子被标记并且能够结合由目标分子与第一分子结合形成的复合物，从而将第三分子的标记与目标分子在微物体上的积累相关联。在2014年10月22日提交并作为国际公布WO2015/061497公布的国际申请中进一步描述了使用包含具有多个第一分子的珠子的微物体的通道内测定的一些方面。

在一些实施方案中，将包括多个第一分子例如报告细胞的微物体引入通道中包括引入多个微物体并允许多个微物体以一定密度填充通道。在一些实施方案中，最佳密度使得几乎整个通道都充满了微物体。低于最佳的密度可能会导致通道中的微物体数量稀少以及对目标分泌分子采样不足，从而难以明确识别分泌腔室。另一方面，过度集中的密度可能会导致更高的通道堵塞风险、芯片的均匀性差，并可能会导致微物体被推入腔室中。在一些实施方案中，最佳密度可根据引入的微物体的大小而变化。在某些实施方案中，微物体是生物细胞，并且密度可以是从约10⁷至10⁹，或约10⁸至2x10⁸个细胞/mL。在一些实施方案中，包括多个第一分子(例如报告细胞)的微物体可以是细胞，该细胞可以是悬浮培养的细胞。在其他实施方案中，当使用分离方案时，贴壁细胞类型可以用作报告细胞。例如，当分离方案可包括：在导入前培养至汇合，例如不超过汇合；以及用分离试剂如Accutase(ThermoFisher Scientific，A1110501)、TrypLE等处理，例如在约22℃下不搅动的情况下处理10分钟时，可以成功使用贴壁CHO细胞。然后，贴壁CHO细胞可作为单分散细胞成功导入，并达到目标细胞密度。可以根据其他细胞类型的需要确定特定的分离方案。预备培养物密度可以变化，例如，小于约100％汇合、小于约90％汇合、小于约80％汇合、小于约60％汇合或小于约50％汇合。分离试剂可以变化。分离处理的持续时间可以变化，例如，从约5分钟到约1小时、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟或其间的任何值。在一些实施方案中，不采用搅动。在又一些实施方案中，可以在分离处理期间搅动细胞。可以改变温度以成功分离细胞，并且可以在约15℃至约36℃、约10℃至约40℃或它们之间的任何温度下变化。通过细胞过滤器过滤可能有助于去除细胞团块或其他大碎片，并且可以在将细胞浓缩至目标导入浓度之前进行。可以通过以400x g离心5分钟来浓缩细胞，并将细胞重悬至所需浓度。第三分子被标记并且能够结合由目标分子与第一分子结合形成的复合物，例如标记的抗体，可以在重悬细胞时添加到培养基中。

在一个具体的实施方案中，如图38所示，Jurkat细胞(上)和K562细胞(下)分别以1.7x10^8个细胞/mL和1x10^8个细胞/mL的密度用作微物体。这些图显示通道几乎被细胞填满，达到通道内结合测定可接受的程度。

在一些实施方案中，第一分子和/或目标分子可以是蛋白。蛋白可以是例如细胞表面蛋白或细胞外蛋白。蛋白可以是修饰的蛋白，例如糖基化蛋白、脂质锚定蛋白等。在一些实施方案中，目标分子可以特异性结合第一分子。在某些实施方案中，第一分子和目标分子可以是抗原-抗体对。例如，生物细胞可以是产生目标抗体(即目标分子)的B细胞，并且在微物体表面上呈递的第一分子可以是产生的抗体的抗原或表位。在一些实施方案中，第三分子可以是与产生的抗体(即分泌的第二分子)结合的二抗，并且其检测与第一分子和目标分子的结合相关联。

在某些实施方案中，微物体可以是表达第一分子的一个或多个珠子或细胞。如果是细胞，则该细胞可以天然表达第一个分子或可以进行遗传修饰(例如，稳定或瞬时转染)以表达第一个分子。如果是珠子，可以通过在其表面缀合第一分子来创建珠子。

封闭测定。在一些实施方案中，提供了测定抑制第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的方法。该方法可在具有腔室(如微孔或隔离坞)的微流体装置内进行，并且可包括：将每个生物细胞和包含多个第一分子的微物体引入微流体装置的腔室中；在微物体的存在下孵育生物细胞并允许生物细胞产生和/或分泌目标分子；将第二分子引入腔室中，其中第二分子与可检测标记结合(或固有地产生信号，如自发荧光)；以及监测第二分子在微物体上的积累。一个或多个微物体可以与细胞一起装载到腔室中。第二分子在一个或多个微物体上的积累不存在或减少表明细胞产生的目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。

在一些实施方案中，监测第二分子在微物体上的积累包括将积累与在目标阳性对照分子和/或目标阴性对照分子的存在下在对照微物体上观察到的积累进行比较。在其他实施方案中，监测第二分子在微物体上的积累包括将积累与在不存在目标对照分子的情况下在对照微物体上观察到的积累进行比较。

如本文所用，术语“减少”表示与在一个或多个对照腔室中观察到的积累相比更低的积累。在一些实施方案中，对照腔室可以是阴性对照腔室。阴性对照腔室的实例可包括但不限于含有对照微物体和阴性对照细胞的腔室。阴性对照细胞可以是产生已知不结合第一分子或第二分子的分子的细胞，或已知不产生目标分子的细胞。阴性对照腔室的其他示例包括含有对照微物体自身(即，不存在对照细胞)的腔室。因此，在一些实施方案中，监测第二分子在微物体上的积累包括将积累与在存在一个或多个阴性对照细胞或没有阴性对照细胞的情况下孵育的对照微物体上观察到的积累进行比较。

在一些实施方案中，对照腔室可以是阳性对照腔室。阳性对照腔室的示例可以包括但不限于含有对照微物体和阳性对照细胞的腔室。阳性对照细胞可以是产生已知结合第一分子或第二分子并由此抑制第一分子与第二分子结合的分子的细胞。

可以将对照细胞(例如，阳性或阴性对照细胞)引入与能够产生目标蛋白的生物细胞相同的微流体装置中，或引入不同的微流体装置中。可以在同一时期或不同时期将对照细胞引入微流体装置中。

在一些实施方案中，该方法在具有多个腔室的微流体装置内进行，并且监测第二分子在微物体上的积累包括将积累与在引入了一个或更多个对照细胞的多个腔室中的一个或多个其他腔室中观察到的积累进行比较。可以有意地引入另一个腔室中的对照细胞(即，当已知对照细胞是阳性或阴性对照细胞时)，或者可以根据用户将预期的事实从引入的细胞库中识别对照细胞，所述事实是并非所有引入的细胞都会产生能够影响第二个分子在微物体上积累的目标分子。在一些实施方案中，监测第二分子在微物体上的累积包括将累积与在没有引入细胞的多个腔室中的一个或多个其他腔室中观察到的积累进行比较。

在一些实施方案中，与单个对照腔室进行比较就足够了(例如，具有单个充分表征的对照细胞或根本没有对照细胞的对照腔室)。在其他实施方案中，该方法包括与多个对照腔室进行比较。例如，比较可以包括将第二分子在微物体上的积累与第二分子在多个对照腔室中的对照微物体上的积累的统计量度(例如，平均积累或比多个对照腔室中的对照微物体的平均积累低一个、两个或三个标准偏差的积累水平)进行比较。或者，比较可包括将第二分子在微物体上的积累与第二分子在多个对照腔室中的对照微物体上的最小积累(或最大积累)进行比较。

在一些实施方案中，该方法在具有微流体通道和多个腔室的微流体装置内进行，并且监测第二分子在微物体上的积累包括将积累与在其中引入了细胞的腔室外部的区域中(例如，在微流体通道中)、引入一个或多个对照细胞的多个腔室中的一个或多个其他腔室中、或未引入细胞的一个或多个腔室中观察到的积累进行比较。

在某些实施方案中，第一分子和/或第二分子可以是蛋白。蛋白可以是例如细胞表面蛋白或细胞外蛋白。蛋白可以是修饰的蛋白，如糖基化蛋白、脂质锚定蛋白等。在某些实施方案中，第一分子和第二分子可以是受体-配体对。本文中使用的“配体”是指具有可以被受体以一定亲和力水平特异性识别和结合的区域、结构或基序的分子。在一些实施方案中，亲和力水平高到足以在本公开的封闭测定操作期间形成和维持受体-配体复合物，但低于目标分子对配体或受体的亲和力水平。在一些实施方案中，第一分子是受体分子，并且其中第二分子是特异性结合受体分子的配体。例如，第一分子可以是生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、粘附受体(例如整联蛋白或细胞粘附分子(CAM))、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、或保留前述任一种各自的全长生物分子活性的片段；并且配体可以是生长因子、细胞因子、趋化因子、粘附配体、离子通道配体、GPCR配体、病毒蛋白(例如，病毒外壳或衣壳蛋白，如融合蛋白)，或保留前述任一种各自的全长生物分子的活性的片段。在一些实施方案中，第一分子是配体，而第二分子是被上面示例的配体特异性结合的受体。在第二分子是受体的某些实施方案中，受体可以是锚定在物体如细胞、珠子、脂质颗粒上的受体分子。或者，当第二分子是受体时，受体分子可以是可溶性受体分子。受体分子可以通过化学合成或半合成过程制造。

在某些实施方案中，一个或多个微物体可以是一个或多个表达第一分子的珠子或细胞。如果是细胞，则该细胞可天然表达第一分子或可进行遗传修饰(例如，稳定或瞬时转染)以表达第一分子。

本文所述的封闭测定可以是受体封闭测定或配体封闭测定。在示例性受体封闭测定(图39)中，靶向的抗原(即第一分子)可以位于报告细胞(即微物体)的表面上，并且分泌的抗体结合该表面-结合抗原“受体”，可封闭染料标记的可溶性“配体”(即第二分子)的结合。相反，在配体封闭测定(图40)中，靶向的抗原(即第二分子)可以在溶液中，并且分泌的抗体结合该抗原“配体”，可封闭其与报告细胞的受体(即第一分子)的结合。在任一设计中，如果分泌的抗体是有效的封闭剂，则很少或没有染料标记的配体(即第二分子)会与报告细胞表面结合，并且报告细胞在与配体相关的荧光通道(“配体通道”)中会变暗。如果分泌的抗体是非封闭的，染料标记的配体将结合报告细胞表面并在报告细胞表面上积累，并且报告细胞将在与配体相关的荧光通道中可见。

在受体封闭测定的一些实施方案中，可以包括用不同于配体的染料标记的任选的第二抗体(即，第三分子)以确认分泌的抗体与报告细胞的结合(图39)。在此设计中，如果分泌的抗体既与受体结合又阻断配体结合，则报告细胞在二级通道中可见，而在配体通道中呈暗色。然而，如果分泌的抗体结合受体但不阻断配体结合，报告细胞将在二级和配体通道中都可见。为了确定配体封闭测定设计中的结合，应进行单独的通道内测定。

在受体封闭测定的一些实施方案中(图41)，可以首先将标记为“B”的产生目标分子的生物细胞移入坞中，然后引入包括第一分子的微物体，例如报告微物体，其可以是珠子或细胞。图41的上排和下排表示两种不同类型的受体封闭测定的时间点，例如，每个室，从左到右，沿着每一行。如图41上排所示，显示了一个示例性实施方案，其中目标分子，例如由细胞“B”产生的抗体，结合报告微物体并阻断配体“L”结合报告微物体“R”。在引入腔室中后，产生目标分子(例如，在这种情况下为抗体)的细胞(“B”)显示在第一个(图41上排的左侧)示例性腔室中。然后，在引入标记为“R”的报告微物体(图41上排左起第二个)之后，可以使微物体与分泌生物细胞一起孵育，从而允许目标分子与报告微物体结合。在图41上排的第三腔室中，显示了标记为“L”的染料标记配体(即，第二分子)的引入。在这个实施方案中，分泌的抗体能够结合并饱和微物体上的受体(即，第一分子，其可以包括抗原结合位点)，从而阻断配体结合。因此，标记的配体不标记报告分子，并且减少或消除了信号在报告微物体上的积累。

在图41图的下排中显示了不同的实施方案。将分泌生物细胞“B”引入腔室(图41下排左起第一个腔室)并产生目标分子，例如抗体。在图41下排的第二个腔室中，如前所述，引入包括第一分子的报告微物体“R”。在图41下排的第三腔室中，引入配体“L”，并且配体“L”能够结合报告微物体并阻断目标分子结合(或稳定结合)报告微物体“R”的第一分子，并且在第四个腔室中显示时间点，在该时间点配体“L”(例如，第二分子)已在报告微物体“R”上积累，结合与其相关联的第一分子，并观察到信号积累。

这两种细胞类型可以使用脉冲培养操作一起培养，脉冲培养操作由交替间隔的零流量孵育和短时间的芯片冲洗组成，被设计成允许分泌的抗体结合并最大限度地减少坞对坞扩散。冲洗体积、冲洗速率和孵育持续时间是可调参数，并可根据用户选择进行调整。经过这段脉冲培养期(通常为30分钟)后，导入含有染料标记的配体的溶液并使其扩散到坞中，在坞中它可以与未封闭的报告细胞结合。最后，执行冲洗以洗掉未结合的配体，并获取图像以评估封闭。

在配体封闭测定的一些实施方案中(图42)，可以按顺序将生物细胞和微物体移入坞中。在这种类型的测定中，不是确保报告细胞受体(例如第一分子)饱和，因为配体是例如抗原，可进行脉冲培养孵育期以使微物体产生目标分子“B”，例如浆细胞，在输入抗原“配体”之前恢复并继续分泌。一旦B细胞恢复并继续分泌目标抗体，染料标记的配体(即第二分子，其在该实施方案中为抗原)被引入并允许扩散到坞中。如果不被分泌的抗体阻断，配体可以与报告细胞“B”结合。分泌的抗体(目标分子)对配体的阻断防止配体与报告分子(例如，包括第一分子的微物体)结合。在图42中，每行从左到右的腔室展示了特定版本的配体封闭测定期间的连续时间点。标记与图41相同。在第一行中，显示了配体封闭测定，其中分泌的目标分子(例如此处所示的抗体)与引入的配体(例如第二分子)结合。因此，减少或抑制了信号在报告微物体“R”的第一分子例如受体分子上的积累。在第二实施方案中，如图42的第二行所示，分泌的目标分子，例如抗体，是非封闭的并且不阻止信号在报告微物体“R”的第一分子上的积累。因此观察到信号积累在包括第一分子的报告微物体上。因此，分泌的目标分子(例如抗体)不会稳定地或以足够的亲和力结合报告微物体的第一分子(例如受体)，以防止被配体(例如，第二分子)置换。图42的底部行表示一个实施方案，其中虽然分泌的目标分子(例如抗体)可能能够结合报告微物体“R”的第一分子，但配体“L”以高浓度引入，足够高使其浓度超过分泌的目标分子的浓度，因此既可与分泌的目标分子结合，也可以与报告微物体的第一分子结合。因此，信号可在报告微物体上累积，并可能导致假阴性结果。

配体滴定和孵育时间。在一些实施方案中，配体浓度(即，第二分子的浓度)可在运行本公开的封闭测定之前被优化。配体太少可导致报告细胞上的信号积累低，从而难以区分封闭抗体和非封闭抗体。配体太多可导致大部分是未结合的配体，从而导致更高的背景和可能更低的封闭测定灵敏度。在受体封闭测定的情况下，配体浓度过高可以其他方式导致封闭抗体因竞争而被浓缩配体取代。在配体封闭设计中，可能没有足够的分泌的抗体来阻断所有高浓度配体。在某些实施方案中，第二分子的浓度为至少5nM、约5至约30nM、至少6nM或约6nM至约30nM。

配体结合特异性。在一些实施方案中，可以确认配体结合对表面表达的受体(即，微物体的第一分子)具有特异性，且与报告分子的非特异性结合最少。在内源性表达报告细胞的情况下，消除受体表达的敲除细胞系可作为有用的阴性对照用来确认配体结合的特异性。类似地，对于转染的报告细胞系，可筛选亲代细胞和转染细胞，以确认配体结合对转染具有特异性，与亲代细胞系的结合最少。这种特异性测量可使用标准流式细胞术方法在芯片外进行，或者通过将报告细胞和阴性对照报告细胞导入并移入坞中至芯片的不同区域，然后导入染料标记的配体并孵育，在芯片上进行。在孵育期间，芯片可以定期在配体的荧光通道中成像，以检测报告细胞群上的信号积累。这两个报告细胞群之间的强度差异可清晰可辨，在阴性对照报告物上有极少的或没有可检测信号。

报告细胞异质性。在一些实施方案中，对于坞内封闭测定可以进行报告细胞(例如，微物体)的异质性，因为只有少数报告细胞被引入任何单个坞中。与细胞结合测定一致，理想的报告细胞群会具有受体的高表面表达和低受体表达变异以使每个细胞都有几乎相同的表达水平。在这种情况下，在没有非封闭抗体的情况下，所有报告细胞都会结合相同量的染料标记的配体，并且所有细胞在配体的成像通道中都会同样明亮。在封闭抗体的存在下，几乎没有染料标记的配体会与报告细胞结合，并且在配体成像通道中会显得“暗”。然而，如果报告群中有很大一部分细胞的受体表面浓度较低，甚至在不存在封闭抗体的情况下，该亚群也可能显得“暗”，导致假阳性封闭命中率增加，尤其是在每个坞中的报告细胞很少的情况下。

在某些实施方案中，微物体是来自转染细胞系的细胞。在一些实施方案中，转染细胞系可以被稳定或瞬时转染以表达多个第一分子。在某些实施方案中，转染细胞系中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的细胞可以以可检测水平表达第一分子。在某些实施方案中，为了降低假阳性率，每个坞被引入至少两个或至少三个微物体，其中每个微物体都包括第一分子。

本文所述的封闭测定可与本文所述的任何其他测定相结合，包括夹心和/或扩散梯度测定。可进一步分析被识别为产生阻断第一和第二分子之间相互作用的目标分子的细胞，例如，使用本文描述的5'条形码化方法。

V.捕获RNA 5'端以及条形码识别的方法

本文提供的是捕获RNA 5'端的方法。本文还提供了通过逆转录从生物细胞捕获的RNA来提供一个或多个5'条形码化cDNA序列的方法。

在一些实施方案中，该方法包括在腔室内提供生物细胞。可以在微流体装置的微孔内提供细胞。可以在位于微流体装置的外壳内的隔离坞内提供细胞。在一些实施方案中，该方法包括将生物细胞置于位于微流体装置外壳内的隔离坞内。在一些实施方案中，在腔室中提供单个捕获物体。生物细胞、试剂、时间段(和任选的其他条件)、隔离坞和微流体装置可以是本文所述的那些中的任何一种。

在一些实施方案中，该方法包括在腔室内提供捕获物体。将一个或多个生物细胞和/或捕获物体置于腔室(例如，微流体装置的微孔或隔离坞)内的更多实施方案在标题为“微流体装置和系统”的部分中进行了描述。

本文所述的捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸。在一些实施方案中，多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列。在一些实施方案中，多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在3'端包含三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列。在一些实施方案中，多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，并且多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列。在一些实施方案中，多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸还包含对应于第一引物序列的引发序列。在一些实施方案中，多个第二寡核苷酸中的每一个第二寡核苷酸还包含对应于第二引物序列的引发序列。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含对应于第一引物序列的第一引发序列，并且其中第二寡核苷酸包含对应于第二引物序列的第二引发序列。在一些实施方案中，第一和第二引物序列相同。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分别连接至捕获物体，例如，第一寡核苷酸是连接至捕获物体的第一分子的一部分或全部，而第二寡核苷酸是连接至捕获物体的第二分子的一部分或全部，其中第一分子和第二分子不同并且独立地连接至捕获物体。

在一些实施方案中，该方法包括裂解生物细胞。在一些实施方案中，该方法包括允许从裂解的生物细胞释放的RNA分子被(例如，捕获物体包含的)多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获。在一些实施方案中，该方法包括裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA。捕获物体、捕获序列、引发序列和裂解程序可以是本文所述的那些中的任何一种。

在一些实施方案中，进行生物细胞裂解，使得生物细胞的质膜降解，从生物细胞中释放细胞质RNA。在一些实施方案中，裂解剂可以包括至少一种核糖核酸酶抑制剂。一种示例性裂解试剂在单细胞裂解试剂盒(Single Cell Lysis Kit，Ambion目录号4458235)中可商购的。该试剂可流入微流体装置的微流体通道并允许扩散到隔离坞中，然后是合适的暴露时间(例如，10分钟；根据细胞类型、温度等，更短或更长的时间可能是合适的)。可通过在适当的终止裂解缓冲液(例如，来自单细胞裂解试剂盒，Ambion目录号4458235)中流动并孵育适当的时间停止裂解。使用其他裂解缓冲液可以获得类似的结果，包括但不限于Clontech裂解缓冲液(目录号635013)，其不需要终止裂解处理步骤。释放的mRNA可被存在于同一隔离坞内的捕获物体捕获。

在一些实施方案中，该方法包括逆转录捕获的RNA。在一些实施方案中，产生一个或多个条形码化cDNA序列。在一些实施方案中，每个cDNA序列均包含与相应的一个捕获的RNA互补的寡核苷酸序列，该捕获的RNA共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列。在一些实施方案中，该方法包括反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个序列均包含与相应的一个捕获的RNA互补的寡核苷酸序列，该捕获的RNA共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列。逆转录RNA分子可以根据本文所述的任何适当程序进行。在一些实施方案中，捕获序列结合并由此捕获RNA并从捕获的RNA启动转录。在一些实施方案中，逆转录(RT)聚合酶转录捕获的RNA。

图7显示了示例性方法的示意图。生物细胞可以放置在微流体装置内的隔离坞内。捕获物体可以被配置为本文所述的任何捕获物体，其可以被置于相同的隔离坞中，这可以在将细胞置于隔离坞中之前或之后进行。可以使用裂解细胞的外细胞膜但不裂解核膜的裂解试剂来裂解细胞。从这种方法得到裂解的细胞，其释放RNA。捕获物体的第二寡核苷酸包括引发序列，其具有引发序列(例如，对应于P1引物)和捕获序列，在这种情况下，该捕获序列包括PolyT序列，该PolyT序列可捕获在其3'端具有PolyA序列的释放的核酸。捕获序列捕获释放的核酸。接下来，在存在模板转换寡核苷酸的情况下，通过从释放的核酸逆转录扩展第二寡核苷酸。当捕获的RNA被转录时，转录物被扩展到包括几个C(胞嘧啶)核苷酸，这使得PolyA尾部远端的RNA端与带有条形码(包括TSO)的寡核苷酸的rGrGrG末端对齐。条形码的识别可以在RNA捕获到条形码珠之前；在捕获到珠子的RNA逆转录之前，或在珠子上的RNA逆转录之后，使用本文描述的任何方法进行。在一些实施方案中，细胞特异性条形码的识别可以是在将捕获到珠子的RNA逆转录之后进行。在捕获物体的条形码的逆转录和识别都已经实现之后，捕获物体捕获的cDNA被导出到腔室之外进入例如共用(common)容器中。可以同时导出多个cDNA捕获物体，并可以使用共用(common)扩增引物(例如P1引物)进行扩增。

在一些实施方案中，该方法还包括在捕获物体位于腔室内时识别多个第一寡核苷酸的条形码序列。识别可包括用一种或多种标记的反义寡核苷酸检测条形码(例如，如美国专利申请公开号2019/0345488中所述)。

在一些实施方案中，识别条形码包括检测从标记发出的荧光，该标记可以是捕获物体的不可或缺的一部分或能够与捕获物体表面上的另一分子(例如，寡核苷酸)结合的外来标记。在一些实施方案中，标记包含一种或多种荧光团。在一些实施方案中，标记包括单个荧光团。在一些实施方案中，标记包含多个荧光团，每个荧光团以一个或多个水平存在，导致构成独特标记的荧光团和荧光团水平的独特组合。可检测标记可以是例如荧光标记，如但不限于荧光素、花青、罗丹明、苯基吲哚、香豆素或吖啶染料。一些非限制性示例包括Alexa Fluor染料，如Alexa647、Alexa/>405、Alexa/>488；花青染料，如/>5或/>7，或本领域已知的任何合适的荧光标记。可以选择任何一组可区分的荧光团以存在于流入微流体环境中的杂交探针上以检测条形码，只要每种染料的荧光信号是可检测区分的。或者，可检测标记可以是发光剂，如荧光素酶报告分子、镧系元素标签或无机磷光体，或量子点，其可以是可调的并且可以包括半导体材料。可以并入其他类型的可检测标记，如FRET标记，其可以包括猝灭剂分子以及荧光团分子。FRET标记可以包括暗猝灭剂，如Black Hole/>(Biosearch)；Iowa Black^TM或dabsyl。FRET标记可以是探针、发夹探针、/>探针、Molecular Beacon探针等中的任何一种。在一些实施方案中，捕获物体的条形码可以如下进行识别或解卷积。捕获物体最初由明场成像检测。然后在多个荧光通道(例如两个、三个或四个通道，如对应于FITC、Cy5、DAPI和德克萨斯红(TRED)中的两个、三个或四个的通道)中测量荧光，其中在每个通道中进行多次测量。

在一些实施方案中，检测捕获物体的标记可以包括确定在多于一个荧光通道中针对捕获物体观察到的信号，例如，可以通过观察/成像跨越两个、三个或四个荧光通道(如FITC、Cy5、DAPI和TRED)的独特强度特征来确定每个不同的标记。检测每个不同的标记产生与该可区分标记相关的条形码的先前配对身份。在一些实施方案中，可区分标记是如上所述的捕获物体不可或缺的。无论捕获物体的标记是什么类型，确定标记的身份都允许确定细胞的来源坞并将细胞的来源坞与核酸捕获和测序后获得的测序结果相关联，这可以通过任何合适的方法进行，包括大规模并行测序方法。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸的条形码序列对应于捕获物体的标签。例如，第一寡核苷酸的条形码序列与捕获物体的标记之间可存在一对一的关系。在一个非限制性实例中，第一寡核苷酸的条形码序列对应于捕获物体的标记，其是捕获物体不可或缺的，例如，捕获物体的不可或缺的荧光、可见或发光颜色。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的条形码序列是捕获物体的标记。

在一些实施方案中，一种或多种荧光团直接布置在捕获物体本身上。在一些实施方案中，一种或多种荧光团通过结合条形码序列或条形码序列的反向互补序列的寡核苷酸来上色。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含一个或多个位于条形码序列和第一引发序列(如果存在)5’的尿苷核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含位于条形码序列和第一引发序列(如果存在)5’的三个尿苷核苷酸。在进一步的实施方案中，一个或多个尿苷核苷酸邻近或包含第一寡核苷酸的最5’核苷酸。在一些实施方案中，在存在切割含有一个或多个尿苷核苷酸的序列的酶(例如，USER酶)的情况下逆转录捕获的RNA。

在一些实施方案中，一个或多个条形码化cDNA序列中的每一个均与捕获物体相关。在一些实施方案中，一种或多种条形码化cDNA序列在腔室中产生。

在一些实施方案中，该方法还包括从腔室中导出捕获物体。导出多个捕获物体可以包括单独导出多个捕获物体中的每一个。在一些实施方案中，该方法还可以包括将多个捕获物体中的每个捕获物体均递送至微流体装置外部的单独目标容器。目标容器可以是普通容器、细胞培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、多孔板等。

在一些实施方案中，该方法还包括储存一个或多个条形码化cDNA序列。在一些实施方案中，一个或多个条形码化cDNA序列在约4℃的温度下储存。

在一些实施方案中，该方法还包括扩增一个或多个条形码化cDNA序列。在一些实施方案中，扩增一个或多个条形码化cDNA序列包括使用单一引物(例如，P1引物)。在其他实施方案中，扩增一个或多个条形码化cDNA序列包括使用一对引物(例如，P7和P5引物)。

在适用的情况下，本文公开的方法中的提供捕获物体、提供生物细胞、裂解/转录捕获的RNA和识别条形码序列，可按照它们被书写的顺序或其他顺序执行，但限制是重新排列这些活动的顺序不违反逻辑顺序(例如，在裂解之前转录等)。作为一个示例，条形码序列的识别可在提供生物细胞之后、裂解生物细胞之后或转录捕获的RNA之后进行。同样，在腔室中提供捕获物体的步骤可在腔室中提供生物细胞之后进行。

VI.多路分配导出的cDNA池以及由其制备表达构建体的方法

在一些实施方案中，该方法还包括对相应多个腔室中提供的多个生物细胞执行该方法。在一些实施方案中，多个捕获物体被提供给多个腔室，多个捕获物体中的每个捕获物体均具有(i)选自多个独特标记(例如，至少12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000或更多个不同的标记，或落在由任意两个前述值限定的范围内的标记数量)的独特标记，和(ii)多个第一寡核苷酸，其具有对应于独特标记的条形码序列。

在一些实施方案中，该方法还包括将多个捕获物体导出到一个共用容器中；从多个捕获物体中的每个捕获物体扩增一个或多个条形码化cDNA序列，从而产生多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均具有对应于多个独特标记之一的条形码序列。

在一些实施方案中，在腔室中产生多个条形码化cDNA序列，多个条形码化cDNA序列中的每个条形码化cDNA序列均编码连接到相应的反向互补条形码序列的目标蛋白，对应于多种不同蛋白中的任何一种。例如，将对应于多达12个独特标记的条形码化cDNA序列汇集在单个孔中。由于可根据捕获物体上的条形码序列(～10bp)识别来自特定导出的条形码化cDNA序列，而无需在TAP组装之前从单个细胞中扩增抗体转录本，因此可能导致非克隆抗体的表达并使下游表征困难。因此，在一些实施方案中，该方法还包括选择性扩增条形码化cDNA序列以产生编码目标蛋白或其片段的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)。

在一些实施方案中，该方法还包括：

a.任选地扩增多个条形码化cDNA序列；

b.使用条形码特异性正向引物和对目标蛋白特异的反向引物选择性地扩增多个条形码化cDNA序列(或扩增的cDNA序列)以产生编码目标蛋白或其片段的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；

c.将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的5'端退火到用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段的5'相应端以产生退火的TAP产物；和

d.使用TAP接头引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物，以产生用于表达目标蛋白的构建体。

在一些实施方案中，对目标蛋白特异的反向引物包含与编码目标蛋白的保守区(例如，恒定部分)的序列互补的序列，或保守区的3'序列(例如，3'UTR序列)。在一些实施方案中，扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的3'端包含与TAP的DNA片段的3'相应端重叠的区域。

在一些实施方案中，编码对应于多个不同抗体中的任何一个的重链或轻链序列的多个条形码化cDNA序列中的每个条形码化cDNA序列连接到相应的反向互补条形码序列。在这些实施方案中，该方法还包括：

a.任选地扩增多个条形码化cDNA序列；

b.使用条形码特异性正向引物和靶向相应恒定区序列的保守部分(例如，恒定区的5'端或与其相邻的序列)的反向引物选择性地扩增多个条形码化cDNA序列以产生编码条形码特异性可变区的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；

c.将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的末端退火到用于TAP的DNA片段的相应末端退火以产生退火的TAP产物；和

d.使用TAP接头引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物以产生用于表达抗体重链或轻链的表达构建体。

在一些实施方案中，扩增多个条形码化的cDNA序列包括使用单一引物(例如，P1引物)。在一些实施方案中，扩增多个条形码化cDNA序列包括使用不同的正向和反向引物。

在一些实施方案中，在选择性扩增的步骤b中，条形码特异性正向引物可以是包含SEQ ID NO：13-24之一的序列。在一些实施方案中，在选择性扩增的步骤b中，靶向保守部分的反向引物可以是包含SEQ ID NO：54或55的序列。

此外，本文提供了制备用于表达目标蛋白的构建体的方法。

在一些实施方案中，该方法包括提供条形码化cDNA序列，并且条形码化cDNA序列包含编码目标蛋白的核酸，其与第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列连接。在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生条形码cDNA序列。

在一些实施方案中，该方法包括使用条形码特异性引物和对编码目标蛋白的核酸特异的引物扩增条形码化cDNA序列的至少一部分，从而产生扩增的cDNA产物。

在一些实施方案中，该方法包括提供用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段，其包含：

i.启动子序列，

ii.与编码目标蛋白的核酸的5'端(例如，扩增的cDNA产物的5'端)互补的核酸序列，

iii.与编码目标蛋白的核酸的3'端(例如，扩增的cDNA产物的3'端)互补的核酸序列，以及

iv.终止序列。

在一些实施方案中，该方法包括将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中，从而产生用于表达目标蛋白的构建体。

如Clargo等人，mAbs 6:1,143-159；2014年1月/2月中所述的转录活性PCR(TAP)可以用于制备用于抗体表达的构建体，或者更一般地说，用于表达蛋白复合物的构建体。使用TAP，可直接生成目标蛋白(例如，抗体重链或轻链)的表达构建体，而无需将基因克隆到表达载体中或从PCR反应中纯化片段。在一些实施方案中，使用转录活性PCR(TAP)产生如图8所示的重链和轻链可变结构域基因对，其中使用条形码特异性正向引物通过PCR扩增抗体重链的可变结构域，以结合5'端的条形码序列和靶向相应恒定区序列保守部分(例如，恒定区的5'端或与其相邻的序列)的3'反向引物以产生编码条形码特异性可变区(Vh)的扩增的cDNA产物。扩增的cDNA产物包括在5'端与启动子序列(例如，巨细胞病毒(CMV)启动子)重叠的以及在3'端与连接至终止序列(如聚腺苷酸化序列)的重链或轻链恒定结构域序列的5'端重叠的重叠区域(约25个碱基对)。然后，使用TAP接头引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物以产生线性TAP产物，从而提供用于表达抗体重链或轻链的表达构建体。

类似地，通过与轻链可变结构域特异的引物的PCR反应产生编码抗体轻链的TAP产物。随后将单独的TAP产物对(一个编码重链，另一个编码轻链)直接用于细胞转染和重组抗体的生产。

因此，在一些实施方案中，本文所述的方法提供从条形码化cDNA序列制备用于表达抗体或其片段的构建体，如图9所示。在一些实施方案中，制备用于抗体表达的构建体的方法包括：

a.提供通过本文所述的方法产生的条形码化cDNA序列，其中条形码化cDNA序列包含编码抗体或其片段的重链或轻链的核酸，其连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列；

b.使用条形码特异性引物和对编码抗体重链或轻链的核酸特异的引物扩增条形码化cDNA序列的至少一部分，从而产生扩增的cDNA产物；

c.提供用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段，该DNA片段包含：

i.启动子序列，

ii.与编码重链或轻链序列的核酸的5'端(例如，扩增的cDNA产物的5'端)互补的核酸序列，

iii.与编码重链或轻链序列的核酸的3'端(例如，扩增的cDNA产物的3'端)互补的核酸序列，

iv.重链或轻链恒定结构域序列，和

v.终止序列；

d.将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中，从而产生用于表达包含可变结构域和恒定结构域的抗体的重链或轻链的构建体。

在一些实施方案中，条形码化cDNA序列包含在5'端连接至条形码序列的编码抗体的重链或轻链可变结构域的核酸。

在一些实施方案中，扩增的cDNA产物包含重链或轻链可变结构域序列。

在一些实施方案中，用于TAP的DNA片段包含相应可变结构域3'的编码重链或轻链恒定结构域序列的抗体序列。

在一些实施方案中，将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中包括将编码可变区的扩增的cDNA产物相对于启动子序列3'和相对于编码重链或轻链恒定结构域序列5'引入DNA片段中。

在一些实施方案中，用于TAP的DNA片段中的恒定区序列是重链恒定区序列。在一些实施方案中，其中重链恒定区序列包含一个、两个或三个串联免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，用于TAP的DNA片段中的恒定区序列是轻链恒定区序列。

在一些实施方案中，启动子序列包含巨细胞病毒(CMV)启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列提供组成型基因表达。可以使用适合用于组成型基因表达的任何其他已知启动子。

在一些实施方案中，用于TAP的DNA片段还包含编码荧光报告蛋白的序列。在一些实施方案中，用于TAP的DNA片段还包含编码荧光报告蛋白的序列5'的编码自切割肽的序列。在一些实施方案中，自切割肽是T2A、P2A、E2A或F2A。在一些实施方案中，自切割肽是T2A。

在一些实施方案中，通过使用条形码特异性引物进行对条形码化cDNA序列具有选择性的聚合酶链式反应(PCR)来扩增条形码化cDNA序列。

在一些实施方案中，通过使用重叠延伸PCR将扩增的条形码化cDNA序列引入用于TAP的DNA片段中。重叠延伸PCR产生在5'端与启动子序列重叠的和在3'端与恒定结构域序列重叠的重叠区域(例如约25个碱基对)。

在一些实施方案中，该方法还包括扩增表达构建体。

在一些实施方案中，提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供条形码化cDNA序列的混合物，该混合物的每个条形码化cDNA序列均编码重链或轻链序列，对应于多种不同抗体中的任何一种，连接至相应的反向互补条形码序列。

在一些实施方案中，本文描述的方法提供从条形码化cDNA序列制备用于抗体的重链和轻链的一对表达构建体。

在一些实施方案中，该方法包括提供第一条形码化cDNA序列，其包含编码抗体重链的核酸，其在5'端连接至第一条形码序列的反向互补序列；以及提供第二条形码cDNA序列，其包含编码相同抗体的轻链的核酸，其在5'端连接至第二条形码序列的反向互补序列。在一些实施方案中，第一和第二条形码序列相同。在一些实施方案中，第一和第二条形码序列不同。

在一些实施方案中，该方法包括

a.提供用于转录活性PCR(TAP)的第一DNA片段，该DNA片段包含

i.启动子序列，

ii.重链的相应可变结构域3'的恒定结构域序列，和

iii.终止序列；

b.提供用于转录活性PCR(TAP)的第二DNA片段，该DNA片段包含：

i.启动子序列，

ii.轻链的相应可变结构域3'的恒定结构域序列，和

iii.终止序列。

在一些实施方案中，该方法包括

a.提供第一条形码cDNA序列，其包含编码抗体重链的核酸，其在5'端连接至第一条形码序列；

b.提供第二条形码cDNA序列，其包含编码相同抗体的轻链的核酸，其在5'端连接至第二条形码序列；

c.使用第一条形码特异性引物扩增第一条形码化cDNA序列的至少一部分；

d.使用第二条形码特异性引物扩增第二条形码化cDNA序列的至少一部分；

e.提供用于转录活性PCR(TAP)的第一DNA片段，该DNA片段包含：

i.启动子序列，

ii.重链的相应可变结构域3'的恒定结构域序列，和

iii.终止子序列；

f.提供用于转录活性PCR(TAP)的第二DNA片段，该DNA片段包含：

i.启动子序列，

ii.轻链的相应可变结构域3'的恒定结构域序列，和

iii.终止序列；

g.将编码相应可变结构域的扩增的cDNA产物相对于启动子序列3'和相对于相应恒定结构域序列5'引入DNA片段中，

从而产生抗体重链和轻链的一对表达构建体。

VII.捕获物体

本文所述的捕获物体可以包含标记、多个第一和第二寡核苷酸。每个第一寡核苷酸均包括条形码序列和在3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列。每个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列。

多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均可以包括最5'核苷酸和最3'核苷酸，其中引发序列可以邻近或包含最5'核苷酸，并且其中条形码序列可以位于引发序列的3'和最3'核苷酸的5'。

多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均可以包括最5'核苷酸和最3'核苷酸，引发序列可以邻近或包含最5'核苷酸，并且其中捕获序列可以邻近或包含最3'核苷酸。

在图10中示出显示多个捕获物体的构建的示意图。每个捕获物体都有连接第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的珠子，为了说明的目的，仅连接第一寡核苷酸(顶部)和第二寡核苷酸(底部)各一个。第一寡核苷酸的5'端，且特别是第一引发序列5'端的，连接至珠子。第二寡核苷酸的5'端，且特别是第二引发序列5'端的，与捕获物体相连。在这个示例中，引发序列(此处显示为“P1”)是所有捕获物体的所有寡核苷酸共有的，但在其他实施方案中，接头和/或引发序列对于捕获物体上的不同寡核苷酸可以是不同的，或者，接头和/或引发序列对于多个不同的捕获物体可以是不同的。

在这个示例中，引发序列(此处显示为“P1”)对于所有捕获物体的所有第二寡核苷酸是共有的，但在其他实施方案中，接头和/或引发序列对于捕获物体上的不同第二寡核苷酸可以是不同的，或者，接头和/或引发序列对于多个不同的捕获物体可以是不同的。

第二寡核苷酸的捕获序列位于或接近第二寡核苷酸的3'端。在该非限制性示例中，捕获序列显示为PolyT-VN序列，其通常捕获释放的RNA。在一些实施方案中，捕获序列对于多个捕获物体的所有捕获物体的所有第二寡核苷酸是共有的。然而，在其他多个捕获物体中，捕获物体的每个第二寡核苷酸上的捕获序列可能不一定是相同的。

第一寡核苷酸的条形码序列(长度约10bp)位于引发序列的3'。单个捕获物体上的多个第一寡核苷酸的每个第一寡核苷酸均具有相同的条形码序列，并且多个捕获物体的条形码序列对于多个捕获物体中的每一个捕获物体是不同的。

在一些实施方案中，第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的捕获序列与第一寡核苷酸序列的比率为约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5，约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在一些实施方案中，第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率为约1:1(例如，95:100至100:95)。该比率可以通过本领域已知的方法进行测量；在一个非限制性示例中，可以将分别结合第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的两种标记分子引入到珠子中，并且可以通过检测标记分子来确定比率。

多个捕获物体。提供多个捕获物体用于多重核酸捕获。多个捕获物体中的每个捕获物体均是根据本文所述的任何捕获物体的捕获物体，其中多个捕获物体中的每个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列均不同于具有不同标记的多个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列。在一些实施方案中，多个捕获物体包括具有至少4种不同类型的条形码(例如，至少12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000或更多个不同的条形码)的捕获物体。在一些实施方案中，多个包括至少4种类型的捕获物体、至少8种类型的捕获物体、至少12种类型的捕获物体。

在一些实施方案中，多个捕获物体可以包括至少4种不同类型的捕获物体(例如，至少12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000或更多种不同的捕获物体类型)。在其他实施方案中，多个捕获物体可以包括至少10,000个捕获物体。

A.模板转换寡核苷酸(TSO)

在逆转录期间，到达RNA的5'端后，逆转录酶的末端转移酶活性添加一些额外的核苷酸(通常以C开始，例如CCC)。这些额外的核苷酸用于引发模板转换寡核苷酸(TSO)，包括至少三个鸟嘌呤核苷酸(例如GGG)。在该模板转换步骤中，逆转录酶从作为模板的mRNA转换为作为模板的TSO，如图7所示。

因此，在一些实施方案中，第一寡核苷酸在3'端包含至少三个鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸在3'端包含3、4、5、6、7、8或更多个鸟嘌呤核苷酸。

B.捕获序列

第二寡核苷酸包括被配置为捕获RNA的捕获序列。捕获序列是具有约6至约50个核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，捕获序列通过与从目标细胞释放的RNA杂交来捕获RNA。一个非限制性示例包括polyT序列(具有约30至约40个核苷酸)，其可捕获并杂交到在其3'端具有PolyA的RNA片段。polyT序列还可以在其3'端包含两个核苷酸VN或VI。其他捕获序列示例包括随机六聚体(“随机寡核苷酸”)，其可以在混合物中使用以与互补核酸杂交并因此捕获互补核酸。或者，基因特异性序列的互补序列可以用于靶向捕获核酸，例如B细胞受体或T细胞受体序列。

在各种实施方案中，多个第二寡核苷酸中的一个或多个(例如，所有或基本上所有)的捕获序列可以结合释放的RNA之一并引发释放的RNA，从而允许聚合酶(例如，逆转录酶)转录捕获的RNA。

在一些实施方案中，多个捕获物体的第二寡核苷酸的捕获序列包含寡聚dT(oligo-dT)序列。例如，寡聚dT序列可以是N(T)_XVN序列或(T)_XVI序列，其中X大于10、15、20、25或30。

在其他实施方案中，多个第二寡核苷酸中的一个或多个(例如，每个)的捕获序列可以包括基因特异性引物序列。在一些实施方案中，基因特异性引物序列可以靶向(或可以结合)编码T细胞受体(TCR)(例如，TCRα链或TCRβ链，特别是编码可变区的mRNA区域或位于3'但靠近可变区的mRNA区域)的mRNA序列。在其他实施方案中，基因特异性引物序列可以靶向(或可以结合)编码B细胞受体(BCR)(例如，BCR轻链或BCR重链，特别是编码可变区的mRNA区域或位于3'但靠近可变区的mRNA区域)的mRNA序列。

C.引发和其他/额外的序列

捕获物体的寡核苷酸具有引发序列，该引发序列可以邻近或包含寡核苷酸的最5'核苷酸。引发序列可以结合引物，该引物在结合后引发逆转录酶。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含对应于第一引物序列的第一引发序列和/或其中第二寡核苷酸包含对应于第二引物序列的第二引发序列。在一些实施方案中，第一和第二引物序列相同。

引发序列可以是通用的或序列特异性的引发序列。

在一些实施方案中，通用引发序列可以对应于P1引物、P5引物或P7引物。在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸的引发序列可以是包含SEQ ID NO：50-53之一的序列。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)5’的一个或多个尿苷核苷酸。在一些实施方案中，第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)5’的三个尿苷核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个尿苷核苷酸邻近或包含第一寡核苷酸的最5'核苷酸。

D.修饰

如本文所述，包含在捕获物体上的第一和/或第二寡核苷酸可以包括修饰。这些修饰可以为第一和第二寡核苷酸提供广泛的可调功能性。第一或第二寡核苷酸的修饰可以包括非天然核苷酸部分或其他有机小分子部分，其提供与本领域已知的捕获物体的稳定连接。示例性修饰包括但不限于胺修饰的寡核苷酸；硫醇修饰的寡核苷酸、二硫化物修饰的寡核苷酸、酰肼修饰的琥珀酸酯修饰的寡核苷酸或专有接头修饰的寡核苷酸(市售或其他)，它们可以存在于第一和/或第二寡核苷酸的5'或3'末端，取决于所选的用途。或者，第一和/或第二寡核苷酸可以包括生物素、链霉亲和素或能够结合捕获物体上的相应结合分子的其他生物分子。此外，第一和/或第二寡核苷酸可以包括叠氮基修饰或炔基修饰，从而允许点击偶联至捕获物体上的反应对部分。其他修饰可以包括其他不含核苷酸的部分，其邻近此类末端修饰以减少对引发序列、捕获序列、条形码化序列、标记序列或第一和第二寡核苷酸的任何其他序列模块的空间干扰。

第一和/或第二寡核苷酸可以在各自的核苷酸序列内包括一个或多个修饰的核苷酸部分，其可以改善第一和/或第二寡核苷酸对本文所述方法中使用的条件的稳定性。修饰可以增加第一和/或第二寡核苷酸关于解链温度、对靶核苷酸的亲和力、对核酸酶的抗性等中的一个或多个的稳定性。在一些备选实施方案中，修饰的第一和/或第二寡核苷酸可以提供对一种或多种核酸酶的增强的敏感性或沿其长度的选择性化学、光化学和/或热裂解。

第一和/或第二寡核苷酸可具有各种核酸残基，例如未修饰的核苷酸部分、修饰的核苷酸部分或任何其他特征，只要聚合剂能够在引物上作为可行底物起作用。

第一和/或第二寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核苷酸，其能够引入引物中代替核糖基或脱氧核糖基部分。修饰的核苷酸可以在核苷的糖部分的2'位被修饰，其可以包括取代的、未取代的、饱和的、不饱和的、芳香族或非芳香族部分。2'位的合适部分包括但不限于烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基)、2'-氧基-3-脱氧、2'-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基、呋喃基、丙基、吡喃糖基、芘、无环部分等。在其他实施方案中，2’修饰可以包括2’氟修饰的核苷酸、2’烷氧基烷基(例如，2’O-甲氧基乙基(MOE))等。此外，修饰的核苷酸可以是锁核酸(LNA)、解锁核酸或非天然核苷酸类似物，如但不限于5-硝基吲哚、5-甲基dC、Super(IDT)、Super/>(IDT)等。

E.捕获物体的其他特征

捕获物体可以具有任何合适的尺寸，只要它小到足以穿过流动区域的流动通道并进入/离开与其一起使用的微流体装置(例如，如本文所述的任何微流体装置)的隔离坞。此外，可以选择捕获物体使其连接有足够多的寡核苷酸，从而可以捕获足够量的核酸以产生可用于测序的核酸文库。在各种实施方案中，捕获物体可以是珠子。例如，捕获物体可以是具有包括顺磁材料、聚合材料和/或玻璃的芯的珠子(或类似物)。聚合材料可以是聚苯乙烯或可以被功能化以连接多个寡核苷酸的任何其他塑料材料。在一些实施方案中，捕获物体可以是球形或部分球形的珠子并且具有大于约5微米且小于约40微米的直径。在一些实施方案中，球形或部分球形的珠子的直径可以为约5、约7、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24或约26微米，或由上述两个值定义的任何范围。

在一些实施方案中，捕获物体的组成使得它易于使用介电泳(DEP)力例如负DEP力移动。例如，捕获物体可以是具有包括顺磁材料、聚合材料和/或玻璃的芯的珠子(或类似物)。聚合材料可以是聚苯乙烯或可以被功能化以连接寡核苷酸的任何其他塑料材料。可以包被捕获物体的芯材料以提供合适的材料以将接头连接至寡核苷酸，其可以包括功能化的聚合物，尽管其他安排也是可能的。用于将寡核苷酸连接至捕获物体的接头可以是本领域已知的任何合适的接头。接头可以包括烃链，其可以是未取代的或取代的，或者被诸如酰胺基、醚基或酮基的官能团中断或不中断，其可以提供所需的物理化学性质。接头可以具有足够的长度以允许加工酶接近与接头连接的寡核苷酸末端附近的引发位点。如本领域已知的，寡核苷酸可以共价或非共价连接至接头。与接头的非共价连接的非限制性示例可以是通过生物素/链霉亲和素对。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸连接至捕获物体。在一些实施方案中，第一寡核苷酸共价结合至捕获物体。在一些实施方案中，第一寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合连接至捕获物体。

在一些实施方案中，第二寡核苷酸与捕获物体连接。在一些实施方案中，第二寡核苷酸共价结合至捕获物体。在一些实施方案中，第二寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合与捕获物体连接。

额外的引发和/或适配(adaptor)序列。第二寡核苷酸(在本文中有时称为“捕获寡核苷酸”)可以任选地具有一个或多个额外的引发/适配序列，其提供用于引物扩展的着陆位点或用于固定到大规模并行测序阵列或流式细胞内的互补杂交锚位点。

任选的寡核苷酸序列。多个捕获寡核苷酸中的每个捕获寡核苷酸均可以任选地进一步包括独特分子标识符(UMI)序列。多个捕获寡核苷酸中的每个捕获寡核苷酸均可以具有与捕获物体的其他捕获寡核苷酸不同的UMI，从而允许识别独特的捕获而不是若干扩增序列。在一些实施方案中，UMI可以位于引发序列的3'和捕获序列的5'。UMI序列可以是具有约5至约20个核苷酸的寡核苷酸。在一些实施方案中，UMI序列的寡核苷酸序列可以具有约10个核苷酸。

在一些实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的每个捕获寡核苷酸还可以包括Not1限制性位点序列(GCGGCCGC，SEQ ID NO：56)。Not1限制位点序列可以位于捕获寡核苷酸的捕获序列的5'。在一些实施方案中，Not1限制性位点序列可以位于捕获寡核苷酸的条形码序列的3'。

在其他实施方案中，多个捕获寡核苷酸中的每个捕获寡核苷酸还可以包括额外的标签，如池索引序列。索引序列是4到10个寡核苷酸的序列，其独特标识属于一个实验的一组捕获物体，允许多路测序来自几个不同实验的组合测序库以节省测序运行成本和时间，同时仍然允许对测序数据进行解卷积，并将相关性返回到其中相关的正确的实验和捕获物体。

F.示例性条形码序列、第一和第二寡核苷酸

条形码序列组。在各种实施方案中，该方法还可以包括：从一组12至100个不相同的寡核苷酸序列中选择每个条形码序列。在一些实施方案中，该条形码序列组可以基本上由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个条形码序列组成。

表8中提供了示例性条形码序列组，其包括12个不同的条形码序列(SEQ ID NO：1-12)，该组的每个条形码序列均具有根据本文所述的任何条形码的结构。表8中提供了相应条形码特异性正向引物的示例(如SEQ ID NO：13-24)。表8中提供了相应的多路分配正向引物的示例(如SEQ ID NO：25-36)。

在表8中说明了一些示例性但非限制性的第一寡核苷酸。在一些实施方案中，包括第一引发序列、条形码序列和任选的在5'端的UUU和在3'端的至少三个鸟嘌呤核苷酸的第一寡核苷酸可以是包含SEQ ID NO：37-48之一的序列。

在表8中说明了一些示例性但非限制性的第二寡核苷酸。在一些实施方案中，包含第二引发序列和捕获序列的第二寡核苷酸可以是包含以下的序列：

/5Biosg/AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTVI(SEQ ID NO:49)。

VIII.从片段化的NGS(下一代测序，大规模并行测序)数据组装全长V(D)J序列的方法

另一方面，提供了从源自单个抗体产生细胞(例如，B细胞)的片段化NGS数据组装完整V(D)J序列的方法。预期抗体产生细胞(例如，B细胞)具有一条重链和一条轻链序列，它们一起形成抗体。重链和轻链的V(D)J区也称为可变区，代表抗体中负责与特定抗原结合的部分。

在一些情况下，已知抗体产生细胞具有多于一条的重链和轻链。此外，单细胞NGS数据总是有可能被污染，需要一种能识别样本中所有独特的可变区序列的算法。

重链的可变区依次含有V、D和J区。轻链的可变区依次含有V区和J区。与重链不同，轻链有两种类型：κ和λ。当形成轻链时，通常只有一种类型的轻链被细胞保留，并且V和J将来自相同类型的轻链(即来自κ或λ的V和J，但没有混合κ和λ之间的V和J等位基因)。这些基因中的每一个都有许多可能的等位基因，并且这些等位基因的所有版本都得到了很好的表征。

当V、D和J等位基因组合形成给定链时，它们具有不一致的重组位点并不少见，导致最终组装中相对于参考等位基因出现缺失或等位基因之间出现插入。此外，抗体产生细胞(例如B细胞)可经历体细胞超突变阶段，从而产生相对于参考等位基因的错配。这些变异对于产生的抗体的功能至关重要。因此，简单地识别从其构建最终序列的参考等位基因可能是不够的，且应识别真实序列及其相对于参考的所有变异。

因此，提供了一种组装算法来识别和关联序列片段的正确部分，且总体方法示意性地显示在图11中。

基于参考的组装。组装算法中的许多步骤可以包括基于参考的组装。基于参考的组装通过将通过大规模并行测序技术获得的序列读数与参考序列比对来执行序列组装。大规模并行测序可以是75x 75或150x 150测序实验。使用本文描述的基于参考的组装方法可改善序列组装的速度和准确性，并且可减少计算需求。基于参考的组装可以如下进行：

所有读数都从样本到一组参考进行比对。可以如下所述提供参考集，并将其在图15中示意性地示出。

审查所有比对的读数并记录与参考的每个碱基比对的每种类型的碱基的频率，以及相对于参考的插入和缺失的频率和类型。当读数在参考的开始或末端附近有错配时，比对算法可能难以将读数与参考序列进行比对。当这可以被识别时，比对可以扩展到参考的末端以捕获错配。如果读数与参考比对，读数的比对部分在靠近参考的开始或末端处开始或结束，并且比对的读数具有超出参考的开始或末端的未比对的碱基对，比对可扩展到参考序列的末端，如图12A所示。

通过贯通序列的每个核苷酸并添加来自比对数据的最常出现的碱基，可以为原始集合中的每个参考构建新序列。可以根据比对记录的插入和缺失来修饰新序列。为了包括插入，其优选以插入前后碱基频率的至少一半出现。为了包括缺失，其优选比正在删除的任何碱基更频繁地出现。

如果比对的读数不覆盖整个序列，则可以构建部分参考。图12B所示的示例有两个非常相似的参考序列，并且具有比对后没有错配、插入或缺失的读数。

共有序列可以从归因于高度相似性而可被组合的参考构建，如图12C所示。

可以报告所有支持参考序列的总样本读数超过0.5％的最终序列。

使用基于参考的算法组装序列的方法。图13显示了重链和轻链的每个区段的基于参考的组装如何可以并入总体组装算法中。在一些实施方案中，区段可以由从大规模并行(NGS)测序实验获得的75x75或150x150序列片段组装而成。

识别了观察到的重链和轻链的V和J序列。这可以通过对以下参考集执行基于参考的组装来执行，这些参考集可以从IMGT数据库(用于免疫球蛋白或抗体的国际ImMunoGeneTics信息系统)获得：重链V等位基因、重链J等位基因、轻链V等位基因、轻链J等位基因。

识别了观察到的“扩展的重链CDR3区域”集合。这可以通过以下操作进行：可以提取所有观察到的重链V等位基因的末端碱基对(例如，最后10、15、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个碱基对)以创建重链V末端集合。可以提取所有观察到的重链J等位基因的初始碱基对(例如，前10、15、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个碱基对)以创建重链J起始集合。如果重链J等位基因具有少于预选的初始碱基对(例如40个碱基)，则整个序列可以用于创建集合。获得了所有已知的重链D等位基因。重链V末端、重链D等位基因和重链J起始的所有可能组合都可以按该顺序构建，以创建“扩展的重链CDR3”参考集合，如图14A所示。

可以在这个新集合上执行基于参考的组装，以找到观察到的“扩展的重链CDR3”。在图14B所示的示例中，在V和D等位基因之一之间存在观察到的序列。

然后可以识别观察到的“扩展的轻链CDR3区域”集合。这可以通过以下操作来完成。可以提取所有观察到的轻链V等位基因的末端碱基对(例如，最后10、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个碱基对)以产生轻链V末端集合。可以提取所有观察到的轻链J等位基因的初始碱基对(例如，前10、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个碱基对)以创建轻链J起始集合。如果轻链J等位基因具有少于预选的初始碱基对(例如40个碱基)，则采用整个序列。轻链V末端和轻链J起始的所有可能组合都可以按此顺序构建，以创建“扩展的轻链CDR3”参考集合。可以在这个新集合上执行基于参考的组装，以找到观察到的“扩展的轻链CDR3”。

然后可以通过以下操作识别观察到的全长可变序列：

可以通过以下方式为所有观察到的“扩展的重链CDR3”构建可能的全长重链参考：

a.识别观察到的重链V等位基因，其末端与“扩展的重链CDR3”的起始最强重叠。

b.识别观察到的重链J等位基因，其末端与“扩展的重链CDR3”的末端最强重叠。

c.根据重叠序列，通过使用观察到的重链V等位基因、观察到的重链J等位基因和观察到的扩展的重链CDR3构建可能的全长重链可变序列，在解决错配或插入缺失时优先考虑CDR3。

可以通过以下操作构建可能的全长轻链参考：

a.识别观察到的轻链V等位基因，其末端与“扩展的轻链CDR3”的起始最强重叠。

b.识别观察到的轻链J等位基因，其末端与“扩展的轻链CDR3”的末端最强重叠。

c.根据重叠序列，通过使用观察到的轻链V等位基因、观察到的轻链J等位基因和观察到的扩展的轻链CDR3构建可能的全长轻链可变序列，在解决错配或插入缺失时优先考虑CDR3。

然后可以创建组合参考集。

然后可以执行基于参考的组装以找到观察到的全长可变序列。这个最终的基于参考的组装还修复了构建参考序列中的任何可能的错误。

IX.基于参考的Sanger测序。

Sanger测序结果用于训练机器学习算法，以使用NGS序列结果识别源自个体坞的序列。如图15所示，模块A用于开发用于实验的克隆模型。在算法训练部分的操作中，使用包括多达140个特征的比较来开发克隆模型(例如，全模型(合并模型+可空))。虽然135-140个特征提供了出色的准确度和精确度，但使用从全集合中选择的少至30个特征也能获得可接受的准确度。具有50个特征的紧凑特征集提供的准确度和精确度达到甚至超过使用135个特征的模型发现的准确度和精确度。

表1包含对全模型(合并模型+可空)的特征重要性大于0.008的特征列表。

表1.

表2包含对于全模型(合并模型+可空)的特征重要性小于0.0008的特征列表

表2.

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在表3中，显示了紧凑集的特征集合。

表3.

准确度。使用全集合135个特征，获得了83％的准确度和87％的FI分数。使用表6所示的50个特征的紧凑模型以及容忍一些空列值分析了三个数据集合(大小分别等于284、285、284)。获得了各自的准确度为89％(F1-分数为92％)；准确度为93％(F1-分数为96％)；准确度为91％(F1分数为94％)，显示出紧凑模型的出色甚至改进的性能。

特征的代表性描述如表4所示。

表4.

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X.微流体装置和系统

微流体装置/系统特征交叉适用性。应当理解，本文描述的微流体装置、系统和动力技术的各种特征可以是可组合的或可互换的。例如，本文参考如图1A-5B所描述的微流体装置100、175、200、300、320、400、450、520和系统属性描述的特征可以是可组合的或可互换的。

微流体装置。图1A示出了微流体装置100的示例。微流体装置100的透视图被示出为切除其盖110的一部分以提供微流体装置100内的局部视图。微流体装置100大体上包括微流体回路120，该微流体回路包括流动路径106，流体介质180可以流经该流动路径，任选地将一个或多个微物体(未示出)携带到微流体回路120中和/或经过微流体回路120。

如图1A中大体上所示，微流体回路120由外壳102限定。尽管外壳102可以以不同配置物理地构造，但在图1A中所示的示例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，底座)、微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以设置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以设置在微流体回路结构108上方。微流体回路结构108可以与支撑结构104和盖110一起限定微流体回路120的元件，以形成三层结构。

如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体回路120的底部，盖110可以位于其顶部。可替代地，支撑结构104和盖110可以以其他定向配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，盖110可以位于其底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口包括进入或离开外壳102的通道。通道的示例包括阀门、闸门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他部件中，诸如盖110。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体回路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体回路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流经流动路径106的方向。

支撑结构104可包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底均电连接到电极(例如，所有半导体衬底或半导体衬底的子集可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。

微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这样的回路元件可包括当微流体回路120填充有流体时可以流体地互连的空间或区域，诸如流动区域(其可包括或者可以是一个或多个流动通道)、腔室(其类别的回路元件还可包括子类别，其包括隔离坞)、阱(trap)等。回路元件还可包括屏障等。在图1A中所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。框架114可以是例如基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可包括金属材料。然而，微流体回路结构不必包括框架114。例如，微流体回路结构可以由(或基本上由)微流体回路材料116组成。

微流体回路材料116可以被图案化为具有腔室等，以限定微流体回路120的回路元件和互连，诸如腔室、坞和微流体通道。微流体回路材料116可包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如，橡胶、塑料、弹性体、硅树脂、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可以形成微流体回路材料116的材料的其他示例包括模制玻璃、诸如硅树脂的可蚀刻材料(例如，可光图案化的硅树脂或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，这样的材料(并且因此微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体回路材料116可以设置在支撑结构104上和框架114内部。

微流体回路120可包括流动区域，在该流动区域中可以设置一个或多个腔室和/或一个或多个腔室可以与流动区域流体连通。腔室可以具有将其与一个或多个流动区域流体连接的一个或多个开口。在一些实施方案中，流动区域包括或对应于微流体通道122。尽管在图1A中示出了单个微流体回路120，但是合适的微流体装置可包括多个(例如，2或3个)这种微流体回路。在一些实施方案中，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1A所示，微流体回路120可包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个隔离坞可以具有一个或多个开口。在隔离坞的一些实施方案中，隔离坞可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。在一些其他实施方案中，隔离坞可以具有与流动路径106流体连通的多于一个开口，例如，n个开口，但是其中n-1个带阀的开口，使得除了一个开口之外的所有开口均是可关闭的。当所有带阀的开口关闭时，隔离坞将材料从流动区域到隔离坞中的交换限制为仅通过扩散进行。在一些实施方案中，隔离坞包括各种特征和结构(例如，隔离区域)，这些特征和结构已经被优化，用于即使在介质180正流经流动路径106时也将微物体保留在隔离坞内(并且因此保留在诸如微流体装置100的微流体装置内)。

盖110可以是框架114和/或微流体回路材料116的整合部件。可替代地，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。在一些实施方案中，盖110可以是微流体回路材料116的整合部件。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体回路材料116分开的结构，如图所示，或者是框架114或微流体回路材料116的整合部件。同样，框架114和微流体回路材料116可以是如图1A所示的单独结构，或相同结构的整合部件。不管各种可能的集成，微流体装置都可以保持三层结构，该三层结构包括基底层和覆盖层，基底层和覆盖层将微流体回路120所位于的中间层夹在中间。

在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可包括刚性和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，定位在隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可包括与盖110的刚性材料接口连接的可变形材料。具有包括刚性材料和可变形材料两者的盖的微流体装置已经在例如美国专利第10,058,865号(Brinlinger等人)中进行描述，其内容通过引用整体合并在本文中。在一些实施方案中，盖110还可包括一个或多个电极。一个或多个电极可包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。可替代地，一个或多个电极可以是柔性电极，诸如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合，其嵌入在诸如聚合物(例如，PDMS)的可变形材料中。例如，在美国专利第9,227,200号(Chiou等人)中已经描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用整体合并在本文中。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。

在图1A所示的示例中，微流体回路120被示出为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞包括通向通道122的开口，但是以其他方式被封闭，使得坞可以基本上将坞内部的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体隔离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面以提供外壳。隔离坞通向微流体通道122的开口与流体介质180的流106成一定角度定向，使得流106不被引导到坞中。通道122中的大量流体流的矢量可以与隔离坞的开口的平面相切或平行，并且不被引导到坞的开口中。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地隔离微流体回路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔离坞可包括各种形状、表面和特征，这些形状、表面和特征被优化以与DEP、OET、OEW、流体流、磁力、向心力和/或重力一起使用，如将在下面详细讨论和示出的。

微流体回路120可包括任何数量的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体回路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体回路120的微流体隔离坞124、126、128和130分别包括不同的特征和形状，其可以提供对于维持、隔离、测定或培养生物微物体有用的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔离坞。

在图1A所示的实施方案中，示出了包含单个通道122的单个流动路径106。然而，其他实施方案可以在单个流动路径106内包含多个通道122，如图1B所示。微流体回路120还包括与流动路径106流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以进入流动路径106(和通道122)。在一些情况下，流动路径106包括基本上直的路径。在其他情况下，流动路径106以非线性或蜿蜒(winding)的方式布置，诸如之字形图案，由此流动路径106例如沿交替的方向行进穿过微流体装置100两次或更多次。流动路径106中的流动可从入口行进到出口，或者可以反向并从出口行进到入口。

在图1B中示出多通道装置的一个示例：微流体装置175，其在其他方面可以与微流体装置100类似。微流体装置175及其组成回路元件(例如，通道122和隔离坞128)可以具有本文所述的任何尺寸。图1B所示的微流体回路具有两个入口/出口端口107以及包含四个不同通道122的流动路径106。可以选择微流体回路被细分成的通道数量以减小流体阻力。例如，微流体回路可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通道，以提供所选范围的流体阻力。微流体装置175还包括从每个通道122开口的多个隔离坞，其中隔离坞中的每个隔离坞类似于图1A的隔离坞128，并且可以具有如本文描述的任何隔离坞的任何尺寸或功能。然而，微流体装置175的隔离坞可以具有不同的形状，诸如图1A的隔离坞124、126或130或如本文其他任何地方所述的任何形状。此外，微流体装置175可包括具有不同形状的混合的隔离坞。在一些情况下，多个隔离坞被配置为(例如，相对于通道122)使得隔离坞可以并行地加载有目标微物体。

返回图1A，微流体回路120还可包括一个或多个任选的微物体阱132。任选的阱132可以形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一或多者的开口相对定位。任选的阱132可以被配置为从流动路径106接收或捕获单个微物体，或可以被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，任选的阱132包括与单个目标微物体的体积近似相等的体积。在一些情况下，阱132包括比目标微物体更小的侧通道134以便促进通过阱132流动。

隔离坞。本文所述的微流体装置可包括一个或多个隔离坞，其中每个隔离坞适合于保持一个或多个微物体(例如，生物细胞或关联在一起的细胞组)。隔离坞可以被设置在流动区域内并向流动区域敞开，在一些实施方案中，该流动区域是微流体通道。每个隔离坞可以具有用于与一个或多个微流体通道流体连通的一个或多个开口。在一些实施方案中，隔离坞可以仅具有一个通向微流体通道的开口。

图2A-2C示出了微流体装置200的隔离坞224、226和228，其可以类似于图1A的隔离坞128。每个隔离坞224、226和228可包括隔离区域240和将隔离区域240流体地连接到流动区域的连接区域236，在一些实施方案中，该流动区域可包括微流体通道，诸如通道122。连接区域236可包括通向流动区域(例如，微流体通道122)的近端开口234和通向隔离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得在微流体通道122中流动的流体介质(未示出)通过隔离坞224、226和228的流的最大渗透深度不延伸到隔离区域240中，如以下针对图2C所讨论的。在一些实施方案中，来自微流体通道中的流的流线不进入隔离区域。因此，由于连接区域236，设置在隔离坞224、226和228的隔离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的流体介质180的流隔离，并且基本上不受其影响。

图2A-2C的隔离坞224、226和228分别具有直接向微流体通道122敞开的单个开口。隔离坞的开口可以从微流体通道122横向敞开，如图2A所示，该图描绘了微流体装置200的竖直横截面。图2B示出了微流体装置200的水平横截面。电极活化衬底206可以位于微流体通道122以及隔离坞224、226和228两者的下面。形成隔离坞的底板(floor)的隔离坞的外壳内的电极活化衬底206的上表面可以设置在微流体通道122(或流动区域，如果不存在通道的话)内的电极活化衬底206的上表面的相同水平面或基本上相同的水平面上，以形成微流体装置的流动通道(或流动区域，分别地)的底板。电极活化衬底206可以是无特征的或者可以具有不规则或图案化的表面，该表面从其最高高度到其最低凹陷变化小于约3微米(microns)、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。衬底的上表面跨微流体通道122(或流动区域)和隔离坞两者的高度变化可以等于或小于隔离坞的壁高度的约10％、7％、5％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。可替代地，衬底的上表面跨微流体通道122(或流动区域)和隔离坞两者的高度变化可以等于或小于衬底高度的约2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也可适用于本文所述的任何微流体装置。

微流体通道122和连接区域236可以是扫过区域的示例，而隔离坞224、226和228的隔离区域240可以是未扫过区域的示例。类似224、226、228的隔离坞具有隔离区域，其中，每个隔离区域仅具有一个开口，该开口通向隔离坞的连接区域。进入和离开如此配置的隔离区域的流体介质交换可以被限制为基本上仅通过扩散发生。如所指出的，微流体通道122以及隔离坞224、226和228可以被配置为包含一个或多个流体介质180。在图2A-2B所示的示例中，端口222连接到微流体通道122并且允许流体介质180被引入微流体装置200或从该微流体装置移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以用诸如二氧化碳气体的气体灌注。一旦微流体装置200容纳流体介质180，就可以选择性地生成和停止微流体通道122中的流体介质180的流242(参见图2C)。例如，如图所示，端口222可以设置在流动区域(微流体通道122)的不同位置(例如，相对端)，并且可以建立从用作入口的一个端口222到用作出口的另一端口222的流体介质的流242。

图2C示出了根据一些实施方案的隔离坞224的示例的详细视图，该隔离坞可以容纳一个或多个微物体246。微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔离坞224的连接区域236的近端开口234可以引起流体介质180进入和离开隔离坞224的次级流244。为了将隔离坞224的隔离区域240中的微物体246与次级流244隔离，隔离坞224的连接区域236的长度L_con(即，从近端开口234到远端开口238)应该大于次级流244进入连接区域236的穿透深度D_p。穿透深度D_p取决于许多因素，包括：微流体通道122的形状，其可以由连接区域236在近端开口234处的宽度W_con限定；微流体通道122在近端开口234处的宽度W_ch；通道122在近端开口234处的高度H_ch；以及连接区域236的远端开口238的宽度。在这些因素中，连接区域236在近端开口234处的宽度W_con和通道122在近端开口234处的高度H_ch往往是最重要的。此外，穿透深度D_p可能受流体介质180在通道122中的速度和流体介质180的粘度的影响。然而，这些因素(即速度和粘度)可以在穿透深度D_p没有显著改变的情况下变化很大。例如，对于微流体芯片200，其连接区域236在近端开口234处的宽度W_con为约50微米，通道122在近端开口122处的高度H_ch为约40微米，微流体通道122在近端开口122处的宽度W_ch为约100微米至约150微米，次级流244的穿透深度D_p的范围从在0.1微升/秒的流速下小于W_con的1.0倍(即，小于50微米)到在20微升/秒的流速下为W_con的约2.0倍(即，约100微米)，这表示，对于流体介质180的速度增加200倍，D_p仅增加约2.5倍。

在一些实施方案中，微流体通道122和隔离坞224、226或228的壁可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流242的矢量如下定向：微流体通道宽度W_ch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度W_con(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度L_con可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流242。前述内容仅为示例，并且微流体通道122以及隔离坞224、226和228的相对位置可以相对于彼此处于其他定向。

在一些实施方案中，对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置可以固定，而流体介质180在微流体通道122中的流242的速率可以是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别流体介质180在通道122中的流242的最大速度V_max，其确保次级流244的穿透深度D_p不超过连接区域236的长度Lcon。当不超过V_max时，所产生的次级流244能够被完全容纳在连接区域236内，并且不进入隔离区域240。因此，防止流体介质180在微流体通道122(扫过区域)中的流242将微物体246抽出隔离区域240(其为微流体回路的未扫过区域)，从而使微物体246被保留在隔离区域240内。因此，微流体回路元件尺寸的选择和操作参数(例如，流体介质180的速度)的进一步选择可以防止隔离坞224的隔离区域240被来自微流体通道122或另一隔离坞226或228的材料污染。然而，应该注意，对于许多微流体芯片配置，不需要担心V_max本身，因为在能够达到V_max之前，芯片将从与以高速流经芯片的流体介质180相关联的压力中破裂。

微流体通道122中第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122经过连接区域236扩散并且进入隔离区域240中的第二流体介质248中而与隔离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，隔离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从隔离区域240经过连接区域236扩散并且进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，隔离坞的隔离区域和流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于流体交换的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％。

在一些实施方案中，第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。在一些实施方案中，第一介质180和第二介质248可以开始是相同的，随后变得不同(例如，通过由隔离区域240中的一个或多个细胞对第二介质248的调节，或者通过改变流经微流体通道122的介质180)。

如图2C所示，连接区域236的宽度W_con从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。连接区域236在远端开口238处的宽度W_con可以是本文中针对连接区域236在近端开口234处的宽度W_con所识别的值中的任一个。在一些实施方案中，隔离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度W_con基本上相同。可替代地，连接区域236在远端开口238处的宽度W_con可以不同于(例如，大于或小于)连接区域236在近端开口234处的宽度W_con。在一些实施方案中，连接区域236的宽度W_con可在近端开口234和远端开口238之间变窄或变宽。例如，连接区域236可以使用各种不同的几何形状(例如，倒角连接区域、斜切连接区域)在近端开口与远端开口之间变窄或变宽。此外，连接区域236的任何部分或子部分(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)可以变窄或变宽。

图3描绘了包含微流体回路结构308的微流体装置300的另一示例性实施方案，该微流体装置包括通道322和隔离坞324，该隔离坞具有类似于本文所述的用于微流体装置100、175、200、400、520和本文所述的任何其他微流体装置的任何隔离坞的特征和性质。

图3的示例性微流体装置包括微流体通道322，其具有如本文所述的宽度Wch，并且容纳第一流体介质302的流310和一个或多个隔离坞324(图3中仅示出一个)。隔离坞324分别具有长度L_s、连接区域336和隔离区域340，其中隔离区域340容纳第二流体介质304。连接区域336具有宽度为W_con1的近端开口334，该近端开口向微流体通道322敞开，以及宽度为W_con2的远端开口338，该远端开口向隔离区域340敞开。宽度W_con1可以与本文所述的W_con2相同或不同。每个隔离坞324的壁可以由微流体回路材料316形成，该微流体回路材料可以进一步形成连接区域壁330。连接区域壁330可以对应于相对于近端开口334横向定位并且至少部分地延伸到隔离坞324的封闭部分中的结构。在一些实施方案中，连接区域336的长度L_con至少部分地由连接区域壁330的长度L_wall限定。连接区域壁330可以具有长度L_wall，其被选择为大于次级流344的穿透深度D_p。因此，次级流344可以完全容纳在连接区域内而不延伸到隔离区域340中。

连接区域壁330可以限定钩区域352，该钩区域是隔离坞324的隔离区域340的子区域。由于连接区域壁330延伸到隔离坞的内腔体中，所以连接区域壁330可以用作物理屏障以将钩区域352与次级流344屏蔽开，其中L_wall的长度的选择对钩区域的范围具有贡献。在一些实施方案中，连接区域壁330的长度L_wall越长，则钩区域352越被庇护。

在类似于图2A-2C和图3的那些配置的隔离坞中，隔离区域可以具有任何类型的形状和大小，并且可以被选择以调节营养物、试剂和/或介质到隔离坞中的扩散以到达隔离坞的远壁，例如，与连接区域到流动区域(或微流体通道)的近端开口相对。可以进一步选择隔离区域的尺寸和形状，以调节废产物和/或生物微物体的分泌产物从隔离区域经由隔离坞的连接区域的近端开口向流动区域的扩散。大体上，隔离区域的形状对于隔离坞将微物体与流动区域中的直接流动隔离的能力不是关键的。

在隔离坞的一些其他实施方案中，隔离区域可以具有将隔离区域与微流体装置的流动区域流体连接的多于一个的开口。然而，对于具有将隔离区域流体地连接到流动区域(或两个或更多个流动区域)的n个开口的隔离区域，n-1个开口可以带有阀。当n-1个带阀开口关闭时，隔离区域仅具有一个有效开口，并且进入/离开隔离区域的材料交换仅通过扩散发生。

具有其中可以放置、培养和/或监测生物微物体的坞的微流体装置的示例已经在例如以下文件中进行描述：美国专利第9,857,333号(Chapman等人)、美国专利第10,010,882号(White等人)和美国专利第9,889,445号(Chapman等人)，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。

微流体回路元件尺寸。如本文所述，可以选择隔离坞和隔离坞通向的微流体通道的各种尺寸和/或特征，以限制污染物或不需要的微物体从流动区域/微流体通道引入隔离坞的隔离区域中；将来自通道或来自隔离区域的流体介质中的组分的交换限制为基本上仅扩散交换；促进微物体进入和/或离开隔离坞的转移；和/或促进生物细胞的生长或扩增。对于本文所述的任何实施方案，微流体通道和隔离坞可以具有任何合适的尺寸组合，可以由技术人员根据本公开的教导而选择。

对于本文所述的任何微流体装置，微流体通道沿其长度可以具有均匀的横截面高度，即基本上均匀的横截面高度，并且可以是如本文所述的任何横截面高度。在沿微流体通道的任何点处，通道的基本上均匀的横截面高度(其上表面由盖的内表面限定，并且其下表面由底座的内表面限定)可以是与沿着通道的任何其他点处的横截面高度基本相同，例如，具有不超过约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少的与通道内任何其他位置的横截面高度不同的横截面高度。

此外，本文所述的微流体装置的腔室(例如隔离坞)可以相对于该腔室通向其中的微流体通道基本上以共面方向布置。也就是说，腔室的封闭体积由盖的内表面限定的上表面、底座的内表面限定的下表面和微流体回路材料限定的壁形成。因此，腔室的下表面可以与微流体通道的下表面共面，例如，基本上共面。腔室的上表面可以与微流体通道的上表面共面，例如，基本上共面。因此，腔室可以具有与通道相同(例如，基本上相同)的横截面高度，其可以具有如本文所述的任何值，并且微流体装置内的腔室和微流体通道可以具有在微流体装置的整个流动区域内基本上均匀的横截面高度，并且可以在整个微流体装置内基本上共面。

腔室的下表面和微流体通道的共面性可提供明显的优势，使用DEP或磁力在微流体装置内重新定位微物体。当腔室的下表面和腔室通向的微流体通道具有共面方向时，可极大地促进微物体的移入坞中和从坞中移出，特别是选择性移入坞中/选择性从坞中移出。

隔离坞的连接区域的近端开口可以具有至少与隔离坞所针对的微物体(例如，生物细胞，其可以是植物细胞，诸如植物原生质体)的最大尺寸一样大的宽度(例如，W_con或W_con1)。在一些实施方案中，近端开口具有约20微米、约40微米、约50微米、约60微米、约75微米、约100微米、约150微米、约200微米或约300微米的宽度(例如，W_con或W_con1)。前述内容仅为示例，并且近端开口的宽度(例如，W_con或W_con1)可选择为在以上列出的任何值之间的值(例如，约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-75微米、约20-60微米、约50-300微米、约50-200微米、约50-150微米、约50-100微米、约50-75微米、约75-150微米、约75-100微米、约100-300微米、约100-200微米或约200-300微米)。

在一些实施方案中，隔离坞的连接区域可以具有从近端开口到通向隔离坞的隔离区域的远端开口的长度(例如，L_con)，其是近端开口的宽度(例如，W_con或W_con1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。因此，例如，隔离坞的连接区域的近端开口可以具有从约20微米到约200微米(例如，约50微米到约150微米)的宽度(例如，W_con或W_con1)，并且连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度L_con。作为另一个示例，隔离坞的连接区域的近端开口可以具有从约20微米到约100微米(例如，约20微米到约60微米)的宽度(例如，W_con或W_con1)，并且连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度L_con。

隔离坞所通向的微流体装置的微流体通道可以具有指定的尺寸(例如，宽度或高度)。在一些实施方案中，微流体通道在通向隔离坞的连接区域的近端开口处的高度(例如，H_ch)可以在以下范围中的任一范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道(例如，122)的高度(例如H_ch)可以被选择为在以上列出的任何值之间。此外，在除了在隔离坞的近端开口处以外的微流体通道的区域中，微流体通道122的高度(例如，H_ch)可以被选择为这些高度中的任一高度。

在通向隔离坞的连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度(例如，Wch)可以在以下范围中的任一范围内：约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-300微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、70-100微米、80-100微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、100-120微米、200-800微米、200-700微米或200-600微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道的宽度(例如，W_ch)可以是被选择为在以上列出的任何值之间的值。此外，在微流体通道的除了隔离坞的近端开口处之外的区域中，微流体通道的宽度(例如，W_ch)可以被选择为这些宽度中的任一宽度。在一些实施方案中，微流体通道在通向隔离坞的连接区域的近端开口处的宽度W_ch(例如，横向于流体流经通道的整体流动的方向而取的)可以基本上垂直于近端开口的宽度(例如，W_con或W_con1)。

微流体通道在通向隔离坞的连接区域的近端开口处的横截面积可以为约500-50000平方微米、500-40000平方微米、500-30000平方微米、500-25000平方微米、500-20000平方微米、500-15000平方微米、500-10000平方微米、500-7500平方微米、500-5000平方微米、1000-25000平方微米、1000-20000平方微米、1000-15000平方微米、1000-10000平方微米、1000-7500平方微米、1000-5000平方微米、2000-20000平方微米、2000-15000平方微米、2000-10000平方微米、2000-7500平方微米、2000-6000平方微米、3000-20000平方微米、3000-15000平方微米、3000-10000平方微米、3000-7500平方微米或3000至6000平方微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道在近端开口处的横截面积可以被选择为在以上列出的值中的任何值之间。在各种实施方案中，在微流体通道的除了在近端开口处以外的区域处，微流体通道的横截面积可以被选择为在以上列出的任何值之间。在一些实施方案中，横截面积被选择为对于微流体通道的整个长度是基本上一致的值。

在一些实施方案中，微流体芯片被配置为使得隔离坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)可以具有从约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)的宽度(例如，W_con或W_con1)，连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度L_con(例如，236或336)，并且微流体通道在近端开口处可以具有约30微米至约60微米的高度(例如，H_ch)。作为另一示例，隔离坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)可以具有从约20微米到约100微米(例如，约20微米到约60微米)的宽度(例如，W_con或W_con1)，连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度L_con(例如，236或336)，并且微流体通道在近端开口处可以具有约30微米到约60微米的高度(例如H_ch)。前述内容仅为示例，并且近端开口(例如，234或274)的宽度(例如，W_con或W_con1)、连接区域的长度(例如，L_con)和/或微流体通道(例如，122或322)的宽度(例如，W_ch)可以是被选择为在以上列出的任何值之间的值。然而，通常，隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(W_con或W_con1)小于微流体通道的宽度(W_ch)。在一些实施方案中，近端开口的宽度(W_con或W_con1)为约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％或30％的微流体通道的宽度(W_ch)。也就是说，微流体通道的宽度(W_ch)可以是隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(W_con或W_con1)的至少2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍或至少10.0倍。

在一些实施方案中，通道122、322、618、718的尺寸W_c(例如，横截面宽度W_ch、直径、面积等)可以是腔室开口(例如隔离坞开口234、334等)的尺寸W_o(例如，横截面宽度W_con、直径、面积等)的约一又四分之一(1.25)、约一又二分之一(1.5)、约二倍、约二倍半(2.5)、约三(3)倍或更多倍。对于从选定腔室(例如，如图2B的隔离坞224、226)扩散到通道122、322、618、718中并随后重新进入下游或相邻腔室(例如，如隔离坞228)的材料，这可以降低二次流的程度和通过开口234、334的扩散速率(或扩散通量)。分子(例如，目标分析物，如抗体)的扩散速率取决于许多因素，包括(但不限于)温度、介质的粘度和分子的扩散系数D₀。例如，IgG抗体在约20℃下在水性溶液中的D₀为约4.4x10^-7 cm²/sec，而细胞培养基的运动粘度为约9x10^-4 m²/sec。因此，在约20℃下细胞培养基中的抗体可具有约0.5微米/秒的扩散速率。因此，在一些实施方案中，从位于隔离坞如224、226、228、324内的生物微物体扩散到通道122、322、618、718中的时间段可以是约10分钟或更短(例如，约9、8、7、6、5分钟或更少)。扩散的时间段可通过改变影响扩散速率的参数来控制。例如，培养基的温度可升高(例如，至生理温度如约37℃)或降低(例如，至约15℃、10℃或4℃)，从而分别提高或降低扩散速率。可替代地，或此外，可如本文所讨论增加或降低培养基中的溶质浓度，以将选定的坞与来自其他上游坞的溶质隔离。

因此，在一些变型中，隔离坞的连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度(例如，W_ch)可以是约50至500微米、约50至300微米、约50至200微米、约70至500微米、约至70至300微米、约70至250微米、约70至200微米、约70至150微米、约70至100微米、约80至500微米、约80至300微米、约80至250微米、约80至200微米、约80至150微米、约90至500微米、约90至300微米、约90至250微米、约90至200微米、约90至150微米、约100至500微米、约100至300微米、约100至250微米、约100至200微米、或约100至150微米。在一些实施方案中，在隔离坞的连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度W_ch可以是约70至250微米、约80至200微米或约90至150微米。腔室(例如隔离坞)开口的宽度W_con可以为约20至100微米；约30至90微米；或约20至60微米。在一些实施方案中，W_ch为约70-250微米，W_con为约20至100微米；W_ch为约80至200微米，W_con为约30至90微米；W_ch为约90至150微米，W_con为约20至60微米；或其W_ch和W_con的宽度的任意组合。

在一些实施方案中，隔离坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)的宽度(例如，W_con或W_con1)是流动区域/微流体通道在近端开口处的高度(例如，H_ch)的2.0倍或更小(例如，2.0、1.9、1.8、1.5、1.3、1.0、0.8、0.5或0.1倍)，或者具有位于由前述值中的任何两个值限定的范围内的值。

在一些实施方案中，隔离坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)的宽度W_con1可以与其通向隔离区域的远端开口(例如，238或338)的宽度W_con2相同。在一些实施方案中，近端开口的宽度W_con1可以不同于远端开口的宽度W_con2，并且W_con1和/或W_con2可以从针对W_con或W_con1所述的任何值中选择。在一些实施方案中，限定近端开口和远端开口的壁(包括连接区域壁)可以基本上相对于彼此平行。在一些实施方案中，限定近端开口和远端开口的壁可以被选择为彼此不平行。

连接区域的长度(例如，L_con)可以为约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米、约100-150微米、约20-300微米、约20-250微米、约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约30-250微米、约30-200微米、约30-150微米、约30-100微米、约30-80微米、约30-50微米、约45-250微米、约45-200微米、约45-100微米、约45-80微米、约45-60微米、约60-200微米、约60-150微米、约60-100微米或约60-80微米。前述内容仅为示例，并且连接区域的长度(例如，L_con)可以被选择为在以上列出的任何值之间的值。

隔离坞的连接区域壁的长度(例如，L_wall)可以是隔离坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，W_con或W_con1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍或至少3.5倍。在一些实施方案中，连接区域壁可以具有约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-80微米或约20-50微米的长度L_wall。前述内容仅为示例，并且连接区域壁可以具有被选择为以上列出的任何值之间的长度L_wall。

隔离坞可以具有约40-600微米、约40-500微米、约40-400微米、约40-300微米、约40-200微米、约40-100微米或约40-80微米的长度Ls。前述内容仅为示例，并且隔离坞可以具有被选择为在以上列出的值中的任何值之间的长度L_s。

根据一些实施方案，隔离坞可以具有指定的高度(例如，H_s)。在一些实施方案中，隔离坞具有约20微米至约200微米(例如，约20微米至约150微米、约20微米至约100微米、约20微米至约60微米、约30微米至约150微米、约30微米至约100微米、约30微米至约60微米、约40微米至约150微米、约40微米至约100微米或约40微米至约60微米)的高度H_s。前述内容仅为示例，并且隔离坞可以具有被选择为在以上列出的值中的任何值之间的高度Hs。

连接区域在隔离坞的近端开口处的高度H_con可以是以下高度中的任一范围内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述内容仅为示例，并且连接区域的高度H_con可以被选择为在以上列出的任何值之间。通常，连接区域的高度H_con被选择为与微流体通道在连接区域的近端开口处的高度H_ch相同。此外，隔离坞的高度H_s通常被选择为与连接区域的高度H_con和/或微流体通道的高度H_ch相同。在一些实施方案中，H_s、H_con和H_ch可以被选择为与以上针对所选择的微流体装置列出的任何值相同的值。

隔离区域可以被配置为容纳仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对少量的微物体。在其他实施方案中，隔离区可以容纳多于10个、多于50个或多于100个微物体。因此，隔离区的体积可以是例如至少1×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸或8×10⁸立方微米或更大。前述内容仅为示例，并且隔离区域可以被配置为容纳多个微物体，并且体积被选择为在以上列出的任何值之间(例如，在1×10⁵立方微米与5×10⁵立方微米之间、在5×10⁵立方微米与1×10⁶立方微米之间、在1×10⁶立方微米与2×10⁶立方微米之间或在2×10⁶立方微米与1×10⁷立方微米之间的体积)。

根据一些实施方案，微流体装置的隔离坞可以具有指定体积。可以选择隔离坞(或隔离坞的隔离区域)的指定体积，使得单个细胞或少量(例如，2-10或2-5个)细胞可以快速地调节介质，从而获得有利的(或最佳的)生长条件。在一些实施方案中，隔离坞具有约5x10⁵、6x10⁵、8x10⁵、1x10⁶、2x10⁶、4x10⁶、8x10⁶、1x10⁷、3x10⁷、5x10⁷或约8x10⁷立方微米或更大的体积。在一些实施方案中，隔离坞具有约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升的体积。前述内容仅为示例，并且隔离坞可以具有被选择为以上列出的任何值之间的任何值的体积。

根据一些实施方案，微流体通道(例如，122或322)内的流体介质的流可以具有指定的最大速度(例如，V_max)。在一些实施方案中，最大速度(例如，V_max)可以被设定在约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24或25微升/秒。前述内容仅为示例，并且微流体通道内的流体介质的流可具有被选择为以上列出的任何值之间的值的最大速度(例如，V_max)。微流体通道内的流体介质的流通常可以以小于V_max的速率流动。虽然V_max可以根据通道以及通向其的隔离坞的具体尺寸和数量而变化，但流体介质可以以约0.1微升/秒至约20微升/秒；约0.1微升/秒至约15微升/秒；约0.1微升/秒至约12微升/秒，约0.1微升/秒至约10微升/秒；约0.1微升/秒至约7微升/秒而不超过V_max的速度流动。在典型工作流程的一些部分中，流体介质的流速可以是约0.1微升/秒；约0.5微升/秒；约1.0微升/秒；约2.0微升/秒；约3.0微升/秒；约4.0微升/秒；约5.0微升/秒；约6.0微升/秒；约7.0微升/秒；约8.0微升/秒；约9.0微升/秒；约10.0微升/秒；约11.0微升/秒；或由上述两个值定义的任何范围，例如1-5微升/秒或5-10微升/秒。微流体通道中的流体介质的流速可以等于或小于约12微升/秒；约10微升/秒；约8微升/秒，或约6微升/秒。

在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所述的实施方案中的任一实施方案中配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约25至约200个隔离坞、约100至约500个隔离坞、约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2500个隔离坞、约2000至约5000个隔离坞、约3500至约7000个隔离坞、约5000至约10000个隔离坞、约7500至约15000个隔离坞、约12500至约20000个隔离坞、约15000至约25000个隔离坞、约20000至约30000个隔离坞、约25000至约35000个隔离坞、约30000至约40000个隔离坞、约35000至约45000个隔离坞或约40000至约50000个隔离坞。隔离坞不必全部是相同的尺寸并且可包括各种配置(例如，隔离坞内的不同宽度、不同特征)。

涂覆溶液和涂覆剂。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个内表面包括涂覆材料，该涂覆材料提供适合于(多个)生物微物体的维持、扩增和/或移动的有机和/或亲水分子的层(即，生物微物体在微流体装置内展现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可移植性)。经调节的表面可以减少表面结垢、参与提供水合层和/或以其他方式保护生物微物体不与微流体装置内部的非有机材料接触。

在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂覆材料。(多个)涂覆的内表面可包括流动区域(例如，通道)、腔室或隔离坞或隔离坞的表面，或者其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个具有涂覆有涂覆材料的至少一个内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面涂覆有涂覆材料。涂覆可以在引入(多个)生物微物体之前或之后施加，或者可以与(多个)生物微物体同时引入。在一些实施方案中，(多个)生物微物体可以在包括一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将(多个)生物微物体引入微流体装置之前，微流体装置(例如，具有电极活化衬底的微流体装置，例如但不限于包括介电泳(DEP)电极的装置)的(多个)内表面可以用包括涂覆剂的涂覆溶液处理或“涂底漆”。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任意组合。

基于合成聚合物的涂覆材料。该至少一个内表面可包括包含聚合物的涂覆材料。聚合物可以非共价结合(例如，其可以非特异性地粘附)到该至少一个表面。聚合物可以具有各种结构基序，例如在嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。多种含亚烷基醚的聚合物可适用于本文所述的微流体装置中，包括但不限于诸如L44、L64、P85和F127(包括F127NF)的/>聚合物。合适的涂覆材料的其他示例在US2016/0312165中描述，其内容通过引用整体合并在本文中。

共价连接的涂覆材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适合于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，以为这样的细胞提供调节的表面。共价连接的分子包括连接基团，其中，连接基团共价连接到微流体装置的一个或多个表面，如下所述。连接基团也共价连接到表面改性部分，该表面改性部分被配置为提供适合于(多个)生物微物体的维持/扩增/移动的有机和/或亲水分子层。

在一些实施方案中，被配置为提供适合于生物微物体的维持/扩增的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括烷基或氟烷基(其包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(其可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸根阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸酯阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。

在各种实施方案中，被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括非聚合部分，例如烷基部分、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。可替代地，共价连接部分可包括聚合部分，其可包括这些部分中的任一部分。

在一些实施方案中，微流体装置可以在衬底的内表面上具有疏水层，该疏水层包括共价连接的烷基部分。共价连接的烷基部分可包括形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子，并且可以是未分支的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可以被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可包括接合到第二片段的第一片段，第一片段可包括全氟烷基，第二片段可包括未取代的烷基，其中第一和第二片段可直接或间接地接合(例如，通过醚键的方式)。烷基的第一片段可位于连接基团远端，烷基的第二片段可位于连接基团近端。

在其他实施方案中，共价连接部分可包括至少一个氨基酸，其可包括多于一种类型的氨基酸。因此，共价连接部分可包括肽或蛋白。在一些实施方案中，共价连接部分可包括可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的氨基酸。

在其他实施方案中，共价连接部分还可包括链霉亲和素或生物素部分。在一些实施方案中，改性的生物部分(例如，生物素化的蛋白或肽)可以被引入到携带共价连接的链霉亲和素的微流体装置的内表面，并经由共价连接的链霉亲和素偶联到表面，从而提供呈现蛋白或肽的改性的表面。

在其他实施方案中，共价连接部分可包括至少一个环氧烷烃部分，并且可包括如上所述的任何环氧烷烃聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100000Da)或替代地是聚环氧乙烷(PEO，Mw>100000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10000Da或20000Da的Mw。在一些实施方案中，PEG聚合物可以进一步被亲水或带电荷部分取代，诸如但不限于醇功能团(alcohol functionality)或羧酸部分。

共价连接部分可包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。共价连接的糖可被改性以引入反应性配对部分，该反应性配对部分允许偶联或精制以附着到表面。一个示例性的共价连接部分可包括葡聚糖多糖，其可以通过非分支的接头间接偶联到表面。

提供经调节的表面的涂覆材料可以仅包括一种共价连接部分，或者可以包括多于一种不同种类的共价连接部分。例如，聚乙二醇调节的表面可以具有共价连接的环氧烷烃部分，该环氧烷烃部分具有指定数量的全部相同的环氧烷烃单元，例如具有相同的连接基团和与表面的共价附着、相同总长度和相同数量的环氧烷烃单元。可替代地，涂覆材料可以具有多于一种附着到表面的共价连接部分。例如，涂覆材料可包括具有共价连接的环氧烷烃部分的分子，该部分具有第一指定数量的环氧烷烃单元，并且涂覆材料还可包括另一组分子，其具有诸如连接到具有更多数量的环氧烷烃单元的共价附着的环氧烷烃连接部分的蛋白或肽的大体积部分。不同类型的分子可以以任何合适的比率变化以获得期望的表面特性。例如，具有第一分子(具有具有第一指定数量的环氧烷单元的化学结构)和第二分子(包含可通过生物素/链霉亲和素结合对联接至共价附着的亚烷基连接部分的肽或蛋白部分)的混合物的经调节的表面可以具有以下第一分子与第二分子的比率：约99：1；约90：10；约75：25；约50：50；约30：70；约20：80；约10：90；或者被选择为在这些值之间的任何比率。在这种情况下，具有不同的、空间要求较低的末端和较少主链原子的第一组分子可以有助于对整个衬底表面的功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。第一分子与第二分子的混合物的比率的选择也可以调节由携带肽或蛋白部分的第二分子引入的表面改性。

经调节的表面性质。各种因素可以改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、浸渍和静电涂覆)。在一些实施方案中，经调节的表面可以具有约1nm至约10nm的厚度。在一些实施方案中，经调节的表面的共价连接部分在共价连接到微流体装置(其可包括具有介电泳(DEP)或电润湿(EW)电极的电极活化衬底)的表面时可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过旋涂制备的表面的值形成对比，例如，该表面通常可以具有约30nm的厚度。在一些实施方案中，经调节的表面不需要完美形成的单层来适当地起作用以用于DEP配置的微流体装置内的操作。在其他实施方案中，由共价连接部分形成的经调节的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。

单一部分或多部分经调节的表面。共价连接的涂覆材料可以通过分子的反应形成，该分子已经包含被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且共价连接的涂覆材料可以具有如下所示的式I的结构。可替代地，共价连接的涂覆材料可以形成为两部分的序列，其具有式II的结构，通过将被配置为提供适合于维持和/或扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联到表面改性配体上，该表面改性配体本身已经共价连接到表面。在一些实施方案中，表面可以形成为两部分或三部分序列，包括链霉亲和素/生物素结合对，以引入蛋白、肽或混合的改性表面。

涂覆材料可以共价连接到DEP配置的或EW配置的衬底的表面的氧化物。涂覆材料可以经由连接基团(“LG”)附着到氧化物，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接地连接到被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接到该部分时，不存在可选的接头(“L”)且n为0，当连接基团LG间接连接到该部分时，存在接头L且n为1。接头L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任意组合的非氢原子，其受到本领域已知的化学键合限制。它可以被一个或多个部分的任意组合中断，该一个或多个部分可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基和/或膦酸酯基团、亚芳基、杂亚芳基或杂环基团。在一些实施方案中，偶联基团CG表示从反应部分Rx和反应配对部分Rpx(即，被配置为与反应部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。CG可以是甲酰胺基、三唑基、取代的三唑基、甲酰胺基、硫代酰胺基、肟基、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者是可以在反应部分与其各自的反应配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。在一些实施方案中，CG还可以表示链霉亲和素/生物素结合对。

合适的涂层处理和改性以及制备方法的其他细节可在美国专利申请公开第US2016/0312165号(Lowe,Jr.等人)、美国专利申请公开第US2017/0173580号(Lowe,Jr.等人)、国际专利申请公开第WO2017/205830号(Lowe,Jr.等人)和国际专利申请公开第WO2019/01880号(Beemiller等人)中找到，这些公开内容分别通过引用整体合并在本文中。

微流体装置动力技术。本文所述的微流体装置可与任何类型的动力技术一起使用。如本文所述，系统的控制和监测设备可包括用于在微流体装置的微流体回路中选择和移动诸如微物体或液滴的物体的动力模块。动力技术可包括例如介电泳(DEP)、电润湿(EW)和/或其他动力技术。取决于被移动的物体类型和其他考虑，微流体装置可以具有多种动力配置。返回图1A，例如，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可包括DEP电极活化衬底，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上引起动力，从而选择、捕获和/或移动各个微物体或微物体组。

在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)跨流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)施加动力以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将动力施加到微流体回路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，动力用于防止隔离坞内的微物体从该隔离坞中移位。此外，在一些实施方案中，动力用于从根据本公开的实施方案先前收集的隔离坞中选择性地移除微物体。

在一些实施方案中，微流体装置被配置为光学致动的电动装置，诸如在光电子镊(OET)和/或光电湿润(OEW)配置的装置中。合适的OET配置的装置(例如，包含光学致动的介电泳电极活化衬底)的示例可包括在美国专利第RE 44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第7,612,355号公布)、美国专利第7,956,339号(Ohta等人)、美国专利第9,908,115号(Hobbs等人)和美国专利第9,403,172号(Short等人)中说明的那些，这些专利中的每一个均通过引用整体合并在本文中。合适的OEW配置的装置的示例可包括美国专利第6,958,132号(Chiou等人)和美国申请第No.9,533,306号(Chiou等人)中说明的那些，其每一个均通过引用整体合并在本文中。包括组合的OET/OEW配置的装置的合适的光学致动的电动装置的示例可包括美国专利申请公开第2015/0306598号(Khandros等人)、美国专利申请公开第2015/0306599号(Khandros等人)和美国专利申请公开第2017/0173580号(Lowe等人)中说明的那些，这些专利中的每一个均通过引入整体合并在本文中。

应该理解，出于简化目的，图1-5B的各种示例可以示出微流体装置的一部分，而没有描绘其他部分。此外，图1-5B可以是一个或多个微流体系统的一部分，并被实施为一个或多个微流体系统。在一个非限制性示例中，图4A和图4B分别示出了具有区域/腔室402的微流体装置400的外壳102的一部分的侧截面图和俯视截面图，该部分可以是具有更详细结构的流体回路元件的一部分，诸如生长腔室、隔离坞(其可以类似于本文所述的任何隔离坞)、流动区域或流动通道。例如，微流体装置400可以类似于微流体装置100、175、200、300、520或如本文所述的任何其他微流体装置。此外，微流体装置400可包括其他流体回路元件，并且可以是包括上述控制和监测设备152的系统的部分，该系统具有介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。微流体装置175、200、300、520和本文所述的任何其他微流体装置可以类似地具有针对图1A-1B和4A-4B详细描述的任何特征。

如图4A的示例所示，微流体装置400包括具有底部电极404和覆盖底部电极404的电极活化衬底406的支撑结构104，以及具有顶部电极410的盖110，其中顶部电极410与底部电极404间隔开。顶部电极410和电极活化衬底406限定区域/腔室402的相对表面。因此，容纳在区域/腔室402中的流体介质180提供了顶部电极410与电极活化衬底406之间的电阻连接。还示出了电源412，其被配置为连接到底部电极404和顶部电极410，并且在电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室402中生成DEP力所需的。电源412可以是例如交流(AC)电源。

在某些实施方案中，图4A和图4B所示的微流体装置200可以具有光学致动的DEP电极活化衬底。因此，可以由动力模块162控制的来自光源416的光418的图案的改变可以选择性地激活和停用电极活化衬底406的内表面408的区域414处的DEP电极的改变图案。(在下文中，具有DEP电极活化衬底的微流体装置的区域414被称为“DEP电极区域”。)如图4B所示，指向电极活化衬底406的内表面408上的光图案418可以以诸如正方形的图案照明所选择的DEP电极区域414a(以白色示出)。未被照明的DEP电极区域414(交叉阴影线)在下文中被称为“暗”DEP电极区域414。在每个暗DEP电极区域414处，通过DEP电极活化衬底406(即，从底部电极404向上直到电极活化衬底406的与流动区域106中的流体介质180交界的内表面408)的相对电阻抗大于通过区域/腔室402中的流体介质180(即，从电极活化衬底406的内表面408到盖110的顶部电极410)的相对电阻抗。然而，被照明的DEP电极区域414a展现出通过电极活化衬底406的降低的相对阻抗，该降低的相对阻抗小于通过每个被照明的DEP电极区域414a处的区域/腔室402中的流体介质180的相对阻抗。

在激活电源412的情况下，前述DEP配置在被照明的DEP电极区域414a与相邻的暗DEP电极区域414之间的流体介质180中产生电场梯度，这进而产生吸引或排斥流体介质180中的附近的微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源416投射到微流体装置400中的光图案418，可以在区域/腔室402的内表面408处的许多不同的这种DEP电极区域414处选择性地激活和停用吸引或排斥流体介质180中的微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源412的频率和流体介质180和/或微物体(未示出)的介电性质之类的参数。取决于施加到DEP配置的功率的频率以及流体介质(例如，诸如PBS的高导电介质或适合于维持生物细胞的其他介质)的选择，可以产生负DEP力。负DEP力可以排斥微物体，使其远离所感应的非均匀电场的位置。在一些实施方案中，结合DEP技术的微流体装置可以产生负DEP力。

图4B所示的被照明的DEP电极区域414a的正方形图案420仅为示例。DEP电极区域414的任何图案都可以被投射到微流体装置400中的光418的图案照明(并且由此激活)，并且被照明/被激活的DEP电极区域414的图案可以通过改变或移动光图案418来重复地改变。

在一些实施方案中，电极活化衬底406可包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底406的内表面408可以是无特征的。例如，电极活化衬底406可包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。例如，a-Si:H可包括约8％至40％的氢(按100*氢原子数/氢原子和硅原子的总数计算)。a-Si:H层的厚度可为约500nm至约2.0μm。在这样的实施方案中，DEP电极区域414可以根据光图案418在电极活化衬底406的内表面408上的任何地方和以任何图案形成。DEP电极区域214的数量和图案因此不必固定，而是可以对应于光图案418。具有包括诸如上面讨论的光电导层的DEP配置的微流体装置的示例已经在例如美国专利第RE 44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第7,612,355号公布)中进行描述，其内容分别通过引用整体合并在本文中。

在其他实施方案中，电极活化衬底406可包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，诸如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底406可包括多个光电晶体管，这些光电晶体管包括例如横向双极光电晶体管，其中每个光电晶体管对应于DEP电极区域414。可替代地，电极活化衬底406可包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这种电极对应于DEP电极区域414。电极活化衬底406可包括这样的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。可替代地，图案可以是形成六边形点阵的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件可以在电极活化衬底406的内表面408处的DEP电极区域414与底部电极404之间形成电连接，并且这些电连接(即，光电晶体管或电极)可以由光图案418选择性地激活和停用，如上所述。

例如，在美国专利第7,956,339号(Ohta等人)和美国专利第9,908,115号(Hobbs等人)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极活化基板的微流体装置的示例，这些专利的全部内容分别通过引用整体合并在本文中。已经在例如美国专利第9,403,172号(Short等人)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的示例，其内容通过引用整体合并在本文中。

在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极410是外壳402的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底406和底部电极404是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室402可以位于第一壁与第二壁之间。在其他实施方案中，电极410是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底406和/或电极410中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源416可以可替代地用于从下方照明外壳102。

利用图4A-4B的具有DEP电极活化衬底的微流体装置400，如本文针对图1A所述，控制和监测设备152的动力模块162可以通过将光图案418投射到微流体装置400中以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案420)激活电极活化衬底406的内表面408的DEP电极区域414a处的第一组一个或多个DEP电极，来选择区域/腔室402中的流体介质180中的微物体(未示出)。动力模块162随后可以通过相对于微流体装置400移动光图案418以激活在DEP电极区域414处的第二组一个或多个DEP电极，来移动原位生成的捕获的微物体。可替代地，微流体装置400可以相对于光图案418移动。

在其他实施方案中，微流体装置400可以是DEP配置的装置，其不依赖于在电极活化衬底406的内表面408处的DEP电极的光激活。例如，电极活化衬底406可包括选择性可寻址和可激励的电极，该电极与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对地定位。开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)可以选择性地打开和闭合以激活或去激活DEP电极区域414处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室402中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源412的频率和区域/腔室402中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特性，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和停用一组DEP电极(例如，在形成正方形图案420的一组DEP电极区域414处)，可以选择区域/腔室402中的一个或多个微物体，并且在区域/腔室402内移动所述一个或多个微物体。图1A中的动力模块162可以控制这样的开关，并且因此激活和停用DEP电极中的各个DEP电极以选择和移动区域/腔室402周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励的电极的DEP电极活化衬底的微流体装置是本领域已知的，并且已经在例如美国专利第6,294,063号(Becker等人)和美国专利第6,942,776号(Medoro)中描述，其内容分别通过引用整体合并在本文中。

不管微流体装置400是否具有介电泳电极活化衬底、电湿润电极活化衬底或者介电泳和电湿润活化衬底两者的组合，电源412可以被用于提供向微流体装置400的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源412可以与图1A中参考的电源192相同或者是其部件。电源412可以被配置为将AC电压及/或电流提供到顶部电极410和底部电极404。对于AC电压，电源412可以提供频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围，其足以生成足够强的净DEP力(或电润湿力)以选择和移动区域/腔室402中的各个微物体(未示出)，如上所述，和/或以改变区域/腔室202中的支撑结构104的内表面408的湿润性质，同样如上所述。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见例如美国专利第6,958,132号(Chiou等人)、美国专利第RE44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第7,612,355号公布)和美国专利申请公开第2014/0124370号(Short等人)、2015/0306598号(Khandros等人)、2015/0306599号(Khandros等人)和2017/0173580号(Lowe,Jr等人)，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。

在微流体装置内可以单独地或组合地利用其他力来移动所选择的微物体。微流体通道内的大量流体流动可以移动流动区域内的微物体。也可使用可在微流体通道内、隔离坞内或另一种类的腔室(例如，储存器)内操作的局部化的流体流来移动所选择的微物体。局部化流体流可以用于将所选择的微物体从流动区域移出到非流动区域中，诸如隔离坞中，或反之亦然，从非流动区域移动到流动区域中。如美国专利第10,058,865号(Brinlinger等人)所述，通过使微流体装置的可变形壁变形可以致动局部化的流动，其内容通过引用整体合并在本文中。

重力可以被用于将微流体通道内的微物体移动到隔离坞中和/或移出隔离坞或其他腔室，如在美国专利第9,744,533号(Breilinger等人)中所述，其内容通过引用整体合并在本文中。重力的使用(例如，通过倾斜微流体装置和/或微流体装置所附接到的支撑件)对于细胞从流动区域进入隔离坞或从隔离坞到流动区域的整体移动可以是有用的。可以采用磁力来移动包括顺磁性材料的微物体，该微物体可包括附着到生物微物体或与生物微物体相关联的磁性微物体。可替代地或额外地，向心力可以用于在微流体通道内移动微物体，以及将其移入或移出微流体装置中的隔离坞或其他腔室。

在移动微物体的另一可替代模式中，激光生成的移位力(dislodging force)可以用于从隔离坞或微流体装置中的任何其他腔室中输出微物体或协助输出微物体，如国际专利公开第WO2017/117408号(Kurz等人)中所描述，其内容通过引用整体合并在本文中。

在一些实施方案中，DEP力与其他力组合，诸如流体流(例如，通道中的整体流体流或通过使微流体装置的可变形表面变形而致动的局部化流体流、激光生成的移位力和/或重力)，以便在微流体回路120内操纵、运输、分离和分类微物体和/或液滴。在一些实施方案中，DEP力可在其他力之前施加。在其他实施方案中，DEP力可在其他力之后施加。在其他情况下，DEP力可与其他力以交替的方式施加。对于本文所述的微流体装置，微物体的重新定位通常可能不依赖于重力或流体动力来将微物体定位或捕获在选定位置。可以选择重力作为重新定位力的一种形式，但是在微流体装置内重新定位微物体的能力并不仅仅依赖于重力的使用。虽然微流体通道中的流体流可以用于将微物体引入微流体通道(例如，流动区域)中，但这种区域流动不依赖于将微物体移入坞中或从坞中移出，而局部化流动(例如，来自致动可变形表面的力)在一些实施方案中可以选自本文所述的其他类型的重新定位力以将微物体移入坞中或从坞中移出或将它们从微流体装置导出。

当DEP用于重新定位微物体时，通常在将DEP应用于微物体以在装置的微流体回路内重新定位微物体之前停止通道中的整体流体流动，无论微物体是否正在从通道重新定位到隔离坞或从隔离坞重新定位到通道中。此后可恢复整体流体流动。

系统。返回图1A，示出了用于操作和控制微流体装置的系统150，诸如用于控制微流体装置100。电源192可以向微流体装置100提供电力，以根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压源或电流源。

系统150还可包括介质源178。介质源178(例如，容器、储存器等)可包括多个部分或容器，每个部分或容器用于保持不同的流体介质180。因此，介质源178可以是微流体装置100外部并与其分离的装置，如图1A所示。可替代地，介质源178可以全部或部分位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可包括作为微流体装置100的一部分的储存器。

图1A还示出了控制和监测设备152的示例的简化框图描绘，该控制和监测设备构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用。如图所示，这种控制和监测设备152的示例可包括主控制器154，该主控制器包括用于控制介质源178的介质模块160、用于控制微物体(未示出)和/或介质(例如，介质的液滴)在微流体回路120中的移动和/或选择的动力模块162、用于控制成像装置(例如，相机、显微镜、光源或其任意组合)以捕获图像(例如，数字图像)的成像模块164以及用于控制微流体装置100的倾斜的可选的倾斜模块166。控制设备152还可包括用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能的其他模块168。如图所示，监测设备152还可包括显示装置170和输入/输出装置172。

主控制器154可包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据作为非暂时性数据或信号存储在存储器158中的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。可替代地或者额外地，控制模块156可包括硬连线数字电路和/或模拟电路。介质模块160、动力模块162、成像模块164，可选的倾斜模块166和/或其他模块168可以类似地配置。因此，本文所述的关于微流体装置100或任何其他微流体装置执行的功能、过程行为、动作或过程步骤可以由如上所述配置的主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、任选的倾斜模块166和/或其他模块168中的任何一个或多个执行。类似地，主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、任选的倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以传输和接收在本文所述的任何功能、过程、行为、动作或步骤中使用的数据。

介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178将所选择的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制介质从外壳102中的移除(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以选择性地将一个或多个介质输入微流体回路120中和从其中移除。介质模块160还可以控制微流体回路120内部的流动路径106中的流体介质180的流。介质模块160还可以向介质源178提供调节气体条件，例如，提供包含5％(或更高)的CO₂的环境。介质模块160还可以控制介质源的外壳的温度，例如，以向介质源中的饲养细胞提供适当的温度控制。

动力模块。动力模块162可以被配置为控制微物体(未示出)在微流体回路120中的选择和移动。微流体装置100的外壳102可包括一个或多个电动机构，所述一个或多个电动机构包括介电泳(DEP)电极活化衬底、光电镊子(OET)电极活化衬底、电润湿(EW)电极活化衬底和/或光电润湿(OEW)电极活化衬底，其中动力模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的活化以选择和移动流动路径106中和/或隔离坞124、126、128和130内的微物体和/或液滴。电动机构可以是任何合适的单个的或组合的机构，如本文在描述用于在微流体装置内使用的动力技术的段落中所述。DEP配置的装置可包括一个或多个电极，所述一个或多个电极在微流体回路120中施加非均匀电场，该非均匀电场足以在微流体回路120中的微物体上施加介电泳力。OET配置的装置可包括可光电激活的电极，以通过光诱导的介电泳提供对微流体回路120中的微物体的移动的选择性控制。

成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可包括由成像装置捕获的任何类型的信息(例如，微物体的存在或不存在、介质的液滴、诸如荧光标签等的标签的积累，等等)。使用由成像装置捕获到的信息，成像模块164可以进一步计算物体(例如，微物体、介质的液滴)的位置和/或这样的物体在微流体装置100内的运动速率。

成像装置(如下所述的成像模块164的一部分)可包括用于捕获微流体回路120内部的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置还可包括用于将激发辐射和/或光束引导到微流体回路120中并收集从微流体回路120(或其中容纳的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。反射光束可包括源自LED或宽光谱灯(例如汞灯(例如，高压汞灯)或氙弧灯)的反射的发射。成像装置还可包括显微镜(或光学系统)，其可包括或不包括目镜。

支撑结构。系统150还可包括支撑结构190，该支撑结构被配置为支撑和/或保持包括微流体回路120的外壳102。在一些实施方案中，可选的倾斜模块166可以被配置为激活支撑结构190以使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。可选的倾斜模块166可以被配置为将微流体装置100支撑和/或保持在水平定向(即，相对于x轴和y轴成0°)、垂直定向(即，相对于x轴和/或y轴成90°)或其之间的任何定向。微流体装置100(和微流体回路120)相对于轴的定向在本文中被称为微流体装置100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，支撑结构190可以可选地用于使微流体装置100相对于x轴倾斜(例如，如由可选的倾斜模块166控制的)0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或在其之间的任何角度。当微流体装置以大于大约15°的角度倾斜时，可以执行倾斜以产生微物体从流动区域(例如，微流体通道)进入隔离坞/从隔离坞进入流动区域的整体移动。在一些实施方案中，支撑结构190可以相对于x轴(水平)以0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°或10°的固定角度保持微流体装置100，只要DEP是将微物体从隔离坞移出到微流体通道中的有效力即可。由于电极活化衬底的表面基本上是平坦的，因此即使当隔离坞的与其通向微流体通道的开口相对的远端沿竖直方向设置在比微流体通道更低的位置处时，也可以使用DEP力。

在微流体装置相对于水平以固定角度倾斜或保持的一些实施方案中，微流体装置100可以以一定定向设置，使得流动路径106的底座的内表面以一定角度定位在横向于流动路径敞开的一个或多个隔离坞的底座的内表面上方或下方。如本文所使用的，术语“上方”表示流动路径106在由重力限定的竖直轴上定位成高于一个或多个隔离坞(即，流动路径106上方的隔离坞中的物体将具有比流动路径中的物体更高的重力势能)，并且反过来，用于将流动路径106定位在一个或多个隔离坞下方。在一些实施方案中，支撑结构190可以相对于x轴(水平)以小于大约5°、大约4°、大约3°或小于大约2°的固定角度保持，从而将隔离坞放置在相对于流动路径更低的势能处。在一些其他实施方案中，当在微流体装置内进行长期培养(例如，超过大约2、3、4、5、6、7或更多天)时，该装置可被支撑在培养支撑件上，并且可以以大约10°、15°、20°、25°、30°或在其之间的任何角度的更大角度倾斜，以在长期培养时间段期间将生物微物体保留在隔离坞内。在培养时间段结束时，容纳培养的生物微物体的微流体装置可以被返回到系统150内的支撑件190，其中倾斜角度减小到如上所述的值，从而提供DEP的使用以将生物微物体移出隔离坞。在美国专利第9,744,533号(Brinlinger等人)中描述了使用由倾斜引起的重力的其他示例，其内容通过引用整体合并在本文中。

巢。现在转到图5A，系统150可包括被配置为保持微流体装置520的结构(也称为“巢”)500，其可以类似于微流体装置100、200或本文所述的任何其他微流体装置。巢500可包括能够与微流体装置520(例如，光学致动的电动装置100、200等)接口连接并且能够提供从电源192到微流体装置520的电连接的插座502。巢500还可包括集成的电信号生成子系统504。电信号生成子系统504可以被配置为将偏置电压供应到插座502，使得当微流体装置520被插座502保持时，偏置电压被施加在微流体装置中的一对电极上。因此，电信号生成子系统504可以是电源192的一部分。向微流体装置520施加偏置电压的能力并不意味着当微流体装置520由插座502保持时，偏置电压将一直被施加。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏置电压，例如，仅在需要促进在微流体装置520中生成电动力时施加时，例如生成介电泳或电润湿时。

如图5A所示，巢500可包括印刷电路板组件(PCBA)522。电信号生成子系统504可以安装在PCBA 522上并且电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 522上的插座502。

在一些实施方案中，巢500可包括电信号生成子系统504，该电信号生成子系统被配置为测量微流体装置520处的放大电压，随后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置520处的测量电压为期望值。在一些实施方案中，波形放大回路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器生成的+6.5V至-6.5V电源，从而在微流体装置520处得到高达13Vpp的信号。

在某些实施方案中，巢500还包括控制器508，诸如用于感测和/或控制电信号产生子系统504的微处理器。合适的微处理器的示例包括Arduino^TM微处理器，例如ArduinoNano^TM。控制器508可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中示出)通信以执行功能和分析。在图5A所示的实施方案中，控制器508通过接口(例如，插头或连接器)与(图1A的)主控制器154进行通信。

如图5A所示，支撑结构500(例如，巢)还可包括热控制子系统506。热控制子系统506可以被配置为调节由支撑结构500保持的微流体装置520的温度。例如，热控制子系统506可包括珀耳帖热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。在图5A所示的实施方案中，支撑结构500包括入口516和出口518，以从冷却单元的外部储存器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入流体路径514中并通过冷却块，随后将冷却的流体返回到外部储存器。在一些实施方案中，珀尔帖热电装置、冷却单元和/或流体路径514可以安装在支撑结构500的壳体512上。在一些实施方案中，热控制子系统506被配置为调节珀尔帖热电装置的温度，以便实现微流体装置520的目标温度。珀耳帖热电装置的温度调节可以例如通过热电电源来实现，例如Pololu^TM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)。热控制子系统506可包括反馈电路，诸如由模拟电路提供的温度值。可替代地，反馈电路可以由数字电路提供。

巢500可包括串行端口524，该串行端口允许控制器508的微处理器经由接口与外部主控制器154进行通信。此外，控制器508的微处理器可以与电信号生成子系统504和热控制子系统506进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器508、接口和串行端口524的组合，电信号生成子系统504和热控制子系统506可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，主控制器154可以通过执行用于输出电压调整的缩放计算来辅助电信号生成子系统504，等等。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统506和电信号生成子系统504获得的温度和波形数据。可替代地或额外地，GUI可以允许更新控制器508、热控制子系统506和电信号生成子系统504。

光学子系统。图5B是具有用于成像和操纵微流体装置520中的微物体的光学设备510的光学子系统550的示意图，该微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。光学设备510可以被配置为执行微流体装置520的外壳内的一个或多个微物体的成像、分析和操纵。

光学设备510可以具有第一光源552、第二光源554和第三光源556。第一光源552可以将光传输到结构光调制器560，该结构光调制器可包括数字镜装置(DMD)或微型快门阵列系统(MSA)，其中的任一个可以被配置为接收来自第一光源552的光并且选择性地将所接收的光的子集传输到光学设备510中。可替代地，结构光调制器560可包括产生其自己的光(并因此不需要光源552)的装置，诸如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、硅基铁电液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。结构光调制器560可以是例如投影仪。因此，结构光调制器560能够发射结构光和非结构光两者。在某些实施方案中，系统的成像模块和/或动力模块可以控制结构光调制器560。

在实施方案中，当结构化光调制器560包括反射镜时，调制器可以具有多个反射镜。多个反射镜中的每个反射镜可具有约5微米x 5微米至约10微米x 10微米或其之间的任何值的尺寸。结构化光调制器560可以包括2000x 1000、2580x 1600、3000x 2000或其之间的任何值的反射镜(或像素)的阵列。在一些实施方案中，仅使用结构化光调制器560的照明区域的一部分。结构化光调制器560可以将所选择的光的子集传输到第一二向色分束器558，该第一二向色分束器558可以将该光反射到第一镜筒透镜562。

第一镜筒透镜562可以具有大的通光孔径，例如，大于大约40mm至大约50mm或更大的直径，从而提供大的视场。因此，第一镜筒透镜562可以具有足够大的孔径以捕获从结构光调制器560发出的所有(或基本上所有)光束。

可替代地或额外地，具有大约400nm至大约710nm波长的结构光515可以向微流体装置提供荧光激发照明。

第二光源554可以提供非结构化的明场照明。明场照明光525可以具有任何合适的波长，并且在一些实施方案中，可以具有约400nm至约760nm的波长。第二光源554可将光传输到第二二向色分束器564(其也可以接收来自第三光源556的照明光535)，并且第二光、明场照明光525可从其传输到第一二向色分束器558。第二光、明场照明光525随后可以从第一二向色分束器558传输到第一镜筒透镜562。

第三光源556可以通过匹配的对中继透镜(未示出)将光传输到反射镜566。第三照明光535可以从其反射到第二二向色分束器5338，并且从其传输到第一分束器5338，并且向前延伸到第一镜筒透镜5381。第三照明光535可以是激光并且可以具有任何合适的波长。在一些实施方案中，激光照明535可以具有大约350nm至大约900nm的波长。激光照明535可以被配置为加热微流体装置内的一个或多个隔离坞的部分。激光照明535可以被配置为加热流体介质、微物体、隔离坞的壁或壁的一部分、设置在微流体通道或微流体通道的隔离坞内的金属靶、或微流体装置内的光可逆的物理屏障，并且在美国申请公开号第2017/0165667号(Beaumont等人)和第2018/0298318号(Kurz等人)中更详细地描述，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。在其他实施方案中，激光照明535可以被配置为启动微流体装置的改性表面的表面改性部分的光裂解或为微流体装置内的隔离坞内的微物体提供粘附功能的部分的光裂解。使用激光的光裂解的其他细节可以在国际申请公开号第No.WO2017/205830号(Lowe,Jr.等人)中找到，其公开内容通过引用整体合并在本文中。

来自第一、第二和第三光源(552、554、556)的光穿过第一镜筒透镜562，并传输到第三二向色分束器568和滤光器变换器572。第三二向色分束器568可反射光的一部分并将光透射通过滤光器变换器572中的一个或多个滤光器并到达物镜570，该物镜可以是具有可根据需求切换的多个不同物镜的物镜变换器。一些光(515、525和/或535)可以穿过第三二向色分束器568，并且由光束块(未图示)终止或吸收。从第三二向色分束器568反射的光穿过物镜570以照明样本平面574，该样本平面可以是微流体装置520的一部分，诸如本文所述的隔离坞。

如图5A所示，巢500可以与光学设备510集成在一起，并且是设备510的一部分。巢500可以提供到外壳的电连接，并且还被配置为提供到外壳的流体连接。用户可以将微流体装置520加载到巢500中。在一些其他实施方案中，巢500可以是独立于光学设备510的单独部件。

光可以从样本平面574反射和/或发射，以返回穿过物镜570、穿过滤光器变换器572、并穿过第三二向色分束器568到达第二镜筒透镜576。光可以穿过第二镜筒透镜576(或成像镜筒透镜576)并且从反射镜578反射到成像传感器580。杂散光挡板(未示出)可以放置在第一镜筒透镜562与第三二向色分束器568之间、第三二向色分束器568与第二镜筒透镜576之间以及第二镜筒透镜576与成像传感器580之间。

物镜。光学设备可包括物镜570，该物镜被特别设计和配置为用于观察和操纵微流体装置520中的微物体。例如，常规显微镜物镜被设计为观察载玻片上的或通过5mm的含水流体的微物体，而微流体装置520中的微物体在观察平面574内的多个隔离坞内部，其具有20、30、40、50、60、70、80微米或其之间的任何值的深度。在一些实施方案中，透明盖520a(例如，具有大约750微米的厚度的玻璃或ITO盖)可以被放置在多个隔离坞的顶部上，这些隔离坞设置在微流体衬底520c上方。因此，通过使用常规的显微镜物镜获得的微物体的图像可能具有大的像差(例如，球差和色差)，这会降低图像的质量。光学设备510的物镜570可以被配置为校正光学设备1350中的球差和色差。物镜570可以具有一个或多个可用的放大倍率，例如4X、10X、20X。

照明模式。在一些实施方案中，结构光调制器560可以被配置为调制从第一光源552接收到的光束并且将多个照明光束515(可以是结构光束)传输到微流体装置的外壳中，例如，包含隔离坞的区域中。结构光束可包括所述多个照明光束。多个照明光束可以被选择性地激活以生成多个照明图案。在一些实施方案中，结构光调制器560可以被配置为生成照明图案，类似于针对图4A-4B所描述的，该照明图案可以被移动和调整。光学设备560还可包括控制单元(未示出)，该控制单元被配置为调整照明图案以选择性地激活衬底520c的多个DEP电极中的一个或多个DEP电极并且生成DEP力以在微流体装置520内的多个隔离坞内移动一个或多个微物体。例如，可以以受控方式随时间调整多个照明图案以操纵微流体装置520中的微物体。多个照明图案中的每一个可以被移位以移位所生成的DEP力的位置并且将结构光从一个位置移动到另一个位置，以便在微流体装置520的外壳内移动微物体。

在一些实施方案中，光学设备510可以被配置为使得视场内的样本平面574中的多个隔离坞中的每个隔离坞在图像传感器580处和结构光调制器560处同时聚焦。在一些实施方案中，结构光调制器560可以设置在图像传感器580的共轭平面处。在各种实施方案中，光学设备510可以具有共焦配置或共焦性质。光学设备510可被进一步配置为，使得仅视场内的样本平面574中的流动区域的每个内部区域和/或多个隔离坞中的每个隔离坞被成像到图像传感器580上，以便减少整体噪声，从而提高图像的对比度和分辨率。

在一些实施方案中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成准直光束并且将准直光束传输到物镜570。物镜570可以接收来自第一镜筒透镜562的准直光束，并且将准直光束聚焦到流动区域的每个内部区域以及图像传感器580或光学设备510的视场内的样本平面574中的多个隔离坞中的每个隔离坞中。在一些实施方案中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成多个准直光束并且将多个准直光束传输到物镜570。物镜570可以从第一镜筒透镜562接收多个准直光束，并且将多个准直光束会聚到图像传感器580或光学设备510的视场内的样本平面574中的多个隔离坞中的每个隔离坞中。

在一些实施方案中，光学设备510可以被配置为利用多个照明点照明隔离坞的至少一部分。物镜570可以从第一镜筒透镜562接收多个准直光束，并且将可以形成照明图案的多个照明点投影到视场内的样本平面574中的多个隔离坞中的每个隔离坞中。例如，多个照明点中的每一个可以具有大约5微米x 5微米；10微米x 10微米；10微米x 30微米、30微米x60微米、40微米x 40微米、40微米x 60微米、60微米x 120微米、80微米x 100微米、100微米x 140微米以及其之间的任何值的尺寸。照明点可以分别具有圆形、正方形或矩形的形状。可替代地，可以在多个照明点(例如，照明图案)内对照明点分组以形成较大的多边形形状，例如矩形、正方形或楔形形状。照明图案可以包围(例如，围绕)未照明空间，该未照明空间可以是正方形、矩形或多边形。例如，多个照明点中的每一个可以具有大约150至大约3000、大约4000至大约10000、或5000至大约15000平方微米的面积。照明图案可以具有大约1000至大约8000、大约4000至大约10000、7000至大约20000、8000至大约22000、10000至大约25000平方微米以及其之间的任何值的面积。

光学系统510可以用于确定如何重新定位微物体以及向微流体装置的隔离坞中和从微流体装置的隔离坞中重新定位微物体，以及对存在于装置的微流体回路内的微物体数量计数。重新定位和计数微物体的其他细节可在以下文献中找到：美国申请公开号第2016/0160259号(Du)；美国专利第9,996,920号(Du等人)；和国际申请公开号第WO2017/102748号(Kim等)。光学系统510也可以用于测定方法中以确定试剂/测定产物的浓度，并且其他细节可以在以下文献中找到：美国专利第8,921,055号(Chapman)、10,010,882号(White等人)和9,889,445号(Chapman等人)；国际申请公开号第WO2017/181135号(Lionberger等人)；以及国际申请序列号第PCT/US2018/055918号(Lionberger等人)。如本文所述，适用于在用于观察和操纵在微流体装置内的微物体的系统内使用的光学设备的特征的其他细节可在WO2018/102747(Lundquist等人)中找到，其公开内容通过引用整体合并在本文中。

用于维持微流体装置的隔离坞内的细胞的活力的额外系统部件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的额外部件提供有助于维持功能细胞的环境条件。例如，这些额外部件可以提供营养物、细胞生长信号传递种类、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中移除废产物。

A.在腔室内布置生物细胞/捕获物体

在一些实施方案中，该方法还可以包括将一个或多个生物细胞布置在微流体装置的一个或多个隔离坞内。在一些实施方案中，可以将一个或多个生物细胞中的每一个都布置在一个或多个隔离坞中的不同一个中。可以将一个或多个生物细胞布置在微流体装置的一个或多个隔离坞的隔离区域内。在该方法的一些实施方案中，可以将一个或多个生物细胞中的至少一个布置在其中布置有一个或多个捕获物体之一的隔离坞内。在一些实施方案中，一个或多个生物细胞可以是来自克隆群体的多个生物细胞。在该方法的各种实施方案中，可以在布置一个或多个捕获物体之前执行布置一个或多个生物细胞。

在各种实施方案中，捕获物体可以是如本文所述的任何捕获物体。在一些实施方案中，捕获物体可以包括磁性组分(例如，磁珠)。可替代地，捕获物体可以是非磁性的。

在一些实施方案中，将单个生物细胞布置在隔离坞中。在一些实施方案中，将多个生物细胞，例如2个或更多个、2至10个、3至8个、4至6个等，布置在所述隔离坞内。

在各种实施方案中，布置生物细胞还可以包括标记生物细胞(例如，用核酸标记物，例如Dapi或Hoechst染色剂)。

在一些实施方案中，在将所述捕获物体布置在所述隔离坞内之前执行将所述生物细胞布置在所述隔离坞内。在一些实施方案中，在将所述生物细胞布置在所述隔离坞内之前执行将所述捕获物体布置在所述隔离坞内。

在一些实施方案中，所述微流体装置的所述外壳包括至少一个涂覆表面。在一些实施方案中，涂覆表面包含共价连接的表面。在一些实施方案中，涂覆表面包括亲水性或带负电荷的涂覆表面。涂覆表面可以涂覆有Tris和/或聚合物，如PEG-PPG嵌段共聚物。在又一些实施方案中，微流体装置的外壳可以包括至少一个经调节的表面。

至少一个经调节的表面可以包括共价结合的亲水性部分或带负电荷的部分。共价结合的亲水性部分或带负电荷的部分可以是亲水性或带负电荷的聚合物。

在一些实施方案中，微流体装置的所述外壳还包括介电泳(DEP)配置，并且其中通过在所述生物细胞和/或所述捕获物体上或接近所述生物细胞和/或所述捕获物体施加介电泳(DEP)力来执行布置所述生物细胞和/或布置所述捕获物体。

在一些实施方案中，所述微流体装置还包括多个隔离坞。任选地，该方法还包括将多个所述生物细胞布置在所述多个隔离坞内。

布置在所述多个隔离坞内的多个所述生物细胞可以基本上只有一个布置在所述多个隔离坞内的生物细胞。因此，具有布置其中的生物细胞的多个隔离坞中的每个隔离坞通常包含单个生物细胞。例如，被细胞占据的隔离坞的少于10％、7％、5％、3％或1％可能包含多于一个生物细胞。在一些实施方案中，多个生物细胞可以是生物细胞的克隆群体。

布置在所述多个隔离坞内的多个所述捕获物体可以基本上只有一个布置在所述多个隔离坞内的捕获物体。因此，具有布置其中的捕获物体的多个隔离坞中的每个隔离坞通常包含单个捕获物体。例如，被捕获物体占据的隔离坞的少于10％、7％、5％、3％或1％可以包含多于一个捕获物体。

布置在所述多个隔离坞内的多个所述生物细胞和多个捕获物体可以基本上只有一个布置在所述多个隔离坞内的生物细胞和基本上只有一个布置在所述多个隔离坞内的捕获物体。因此，具有布置其中的生物细胞和捕获物体的多个隔离坞中的每个隔离坞通常包含单个生物细胞和单个捕获物体。例如，被细胞和捕获物体占据的隔离坞的少于10％、7％、5％、3％或1％可以包含多于一个生物细胞或多于一个捕获物体。在一些实施方案中，多个生物细胞可以是生物细胞的克隆群体。

XI.生物细胞

在各种实施方案中，生物细胞可以是单个生物细胞。可替代地，生物细胞可以是多个生物细胞，如克隆群体。生物细胞包括真核细胞、植物细胞、动物细胞，如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼类细胞等，或原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等。

在涉及第一和第二生物细胞的一些实施方案中，第一和第二生物细胞属于相同的细胞类型(例如，分化状态)。在一些实施方案中，第一和第二生物细胞属于相同的生物物种。在一些实施方案中，第一和第二生物细胞分离自相同的受试者、样本或细胞系。在一些实施方案中，第一和第二生物细胞是同一克隆群体的成员。

在一些实施方案中，生物细胞来自细胞系。

在一些实施方案中，生物细胞是分离自组织如血液、肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等的原代细胞。

在一些实施方案中，生物细胞可以是免疫细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞等。

在一些实施方案中，生物细胞可以是癌细胞，如黑色素瘤癌细胞、乳腺癌细胞、神经癌细胞等。

在其他实施方案中，生物细胞可以是干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导性多能(iPS)干细胞等)或祖细胞。

在其他实施方案中，生物细胞是胚胎(例如，受精卵、2至200个细胞的胚胎、囊胚等)、卵母细胞、卵子、精子细胞、杂交瘤、培养的细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、或报告细胞。

XII.试剂盒

还提供了用于测定生物细胞(如本文公开的任何生物细胞)的方法中的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的多个捕获物体。在一些实施方案中，试剂盒包括：微流体装置，其包括外壳，其中外壳包括流动区域和多个从流动区域开口的隔离坞；以及本文所述的捕获物体。

在一些实施方案中，试剂盒包括：(i)具有多个腔室的微流体装置，和(ii)多个捕获物体，每个捕获物体均具有多个本文所述的第一和第二寡核苷酸。在一些实施方案中，多个捕获物体包括具有至少10个不同条形码(例如，至少12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000或更多个不同的条形码)的捕获物体。

试剂盒中可以包括的其他材料包括逆转录酶、USER酶、裂解剂(例如，裂解缓冲液)、一种或多种表面条件化剂(例如，用于条件化芯片的内表面)，或其任何组合。

在一些实施方案中，多个捕获物体在包含RNA酶抑制剂的溶液中。在一些实施方案中，RNA酶抑制剂是化学碱基RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，多个捕获物体储存在约4℃的温度下。

XIII.实施例

实施例1：受体封闭测定的优化。

材料和方法

系统和微流体装置：实施例中使用的Beacon系统和微流体装置由伯克利之光生命科技公司(Berkeley Lights,Inc.)制造。该系统至少包括流量控制器、温度控制器、流体介质条件化和泵组件、用于光激活DEP配置的光源、微流体装置的安装台和相机。微流体装置是配置有OptoElectroPositioning(OEP^TM)技术的OptoSelect^TM芯片。微流体装置包括微流体通道和与其流体连接的多个NanoPen^TM腔室。

细胞制备和测定试剂：如图43所示，Jurkat细胞上存在的CD3用作模型抗原(即本实验中的第一分子)，选择Jurkat细胞(ATCC，TIB-152)作为内源性表达报告细胞(即本实验中的微物体，例如，报告细胞，其具有第一分子)。选择OKT3杂交瘤细胞(ATCC，CRL-8001)作为抗CD3分泌细胞，并且使用OKT8杂交瘤细胞(ATCC，CRL-8014)作为阴性对照细胞。选择不同的抗CD3抗体克隆(HIT3a)(Alexa Fluor 647)作为模型配体(即本实验中的第二分子)。

配体滴定和孵育时间。在这个实验中，染料标记的配体(AF647 HIT3a)从低浓度到高浓度进行滴定，并与之前移入坞中的Jurkat细胞一起孵育，以确定给出最高的报告信号及最小的未结合分数的最佳配体浓度。简而言之，导入Jurkat细胞并将其移入坞中选定的视野(FOV)。在本实施例的不同实验中分别以3.1nM(0.5ug/mL)、6.3nM(0.9ug/mL)、12.5nM(1.9ug/mL)、25nM(3.8ug/mL)、50nM(7.5ug/mL)和100nM(15ug/mL)的浓度导入抗CD3抗体(HIT3a)。然后，在CY5通道中拍摄延时图像，用于通过使用Beacon系统的TPS(靶点和坞选择(Target and Pen Selection))分析来分析检测到的细胞周围的背景区域的平均像素强度(平均背景亮度)和检测到的细胞的最大像素强度(最大亮度)。TPS和相关检测方法的其他细节描述在2015年12月8日提交的国际申请公开号WO2016/094459；2017年12月1日提交的WO2018/102748和2019年3月31日提交的WO2019/232473中，出于任何目的，所述公开的每一个都通过引用以其整体并入本文。额外的度量“Max-BG”被计算为最大亮度和平均背景亮度之间的差值，以确定报告细胞的背景消除亮度。

结果在图44A-44B中示出。当配体浓度增加时，背景和报告细胞信号都增加(图44A)。然而，当HIT3A浓度增加到6nM以上时，背景消除信号(Max-BG)达到平稳阶段(图44B)。归因于上面观察到的Jurkat细胞异质性，本分析中包括背景消除信号的中位数、第75和第95百分位数，并且全部都在6nM左右显示相同的稳定状态。这表明在6nM以上，未结合配体的分数在增加，其仅用于降低信噪比。

报告细胞表达和异质性。在本实验中，在如上确定的优化配体浓度下，更彻底地探索了报告细胞表达和异质性。此外，为了增加报告细胞加载密度和改善一致性，Jurkat细胞导入密度从5.6x10^6增加到1.1x10^7个细胞/ml，并且标准导入被“Well Import”(“孔导入”)代替。将报告细胞一起移入坞中，因为所有FOV都将接受相同的配体处理。导入报告细胞后，将芯片以垂直方向放置5分钟，使细胞被动地沉降到坞中，然后在该实验的剩余部分中将芯片重新置于水平方向。在使用的1.7x10^7个细胞/mL导入密度下，20％(2218)的坞没有接收到报告细胞，45％(5045)的坞接收到2个或更多个报告细胞。

加载报告细胞后，如前所述导入AF647 HIT3a配体(1ug/ml，6.7nM)并在延时成像下进行孵育。孵育30分钟后，用500uL培养基冲洗芯片，然后立即进行本申请前面部分所述的脉冲培养，持续额外25分钟。进行冲洗和脉冲培养以确定去除未结合的配体是否会导致降低的背景和改善的报告细胞信号。因为配体是IgG抗体，在这个模型系统中，25分钟的脉冲培养允许配体从坞中扩散出来。

如上所述，TPS用于处理图像序列。图45A显示了背景(平均背景亮度)和报告细胞强度(最大亮度)的时间进程。背景消除报告细胞信号“BG-Max”也在图45B中计算。背景消除报告细胞信号在前15分钟内迅速增加，然后逐渐稳定。在30分钟时，冲洗芯片，背景迅速下降，背景消除细胞信号只有少量暂时增加。

在30分钟时间点即将冲洗之前和冲洗之后立即，在图46A-46B中绘制平均背景亮度(CY5)和最大亮度(CY5)。两个分布之间存在明显重叠，这表明大部分的报告细胞与背景是无法区分的。此外，在图47A中绘制在即将冲洗之前和冲洗之后立即的背景消除信号分布。群体看起来是双峰的，其中相当大的部分可能在背景之上检测不到，这与上面图46中目视观察到的结果一致。通过在每个时间点将2个标准偏差添加到平均背景信号来设置报告细胞检测阈值。平均背景和可检测细胞的分数被绘制为孵育时间的函数(图47B)。在预冲洗孵育期间，可检测到的Jurkat细胞的分数迅速增加到56％。冲洗后，背景下降，导致89％的可检测Jurkat细胞瞬时升高。进一步冲洗导致66％的稳定可检测分数。

如前所讨论的，具有相当大部分低信号或检测不到的信号的报告细胞群能导致假阳性封闭命中率增加，因为阳性封闭由暗报告细胞指示。在上述稳定的66％检测率下，如果向每个坞仅添加1个报告细胞，则预计假阳性封闭命中率为34％。在66％的检测率下，将报告细胞增加到每个坞2个细胞，则将每个坞的预期假阳性率从34％降低到12％，因为两个细胞都低于检测阈值的概率为0.34²＝0.12，或12％。通常，假阳性率可以用以下公式来描述：

FP＝(1–d)ⁿ

其中FP是假阳性率，d是配体结合报告细胞的检测率，n是每个坞的报告细胞数量。

图48显示了一系列报告细胞检测率和每个坞的报告细胞数量的预期假阳性封闭命中率。因此，具有高检测率的报告细胞群是优选的，而如果增加坞内报告细胞密度，则可以使用更多异质报告细胞群。

实施例2：受体封闭抗体筛选

系统和微流体装置：同实施例1。

细胞制备和测定试剂：与实施例1相同，不同的是Jurkat细胞导入密度进一步增加到2.5x10^7个细胞/ml，以达到更大的每坞负载密度。

根据标准程序，加载OptoSelect 11k芯片并将其用杂交瘤加载培养基引发。依次导入OKT8(2.3x10^6个细胞/ml)和OKT3(2.0x10^6个细胞/ml)杂交瘤细胞并将其移入坞中。出于证明目的，选择了移入坞中参数，以便将两种细胞类型加载到交替的坞中，所有细胞之间都有一个空坞。在移入坞中之后，芯片用杂交瘤培养基引发并在36℃下培养过夜，以允许单个细胞负荷的一些扩增和增加分泌以用于待定的测定。

再次使用Well Import和Off Instrument Loading来加载报告细胞。使芯片在明场中成像，并对细胞进行计数以评估芯片上的报告细胞负载分布。70％的坞具有3个或更多个Jurkat细胞/坞，假设之前测量的检测率相同为66％，这将导致预测的假阳性封闭率为4％或更低。17％的坞具有2个Jurkat细胞，这将具有12％的假阳性率。10％的坞只有1个Jurkat细胞，这将导致34％的假阳性率。

加载后，使用脉冲培养在36℃下将报告细胞与已经移入坞中的杂交瘤细胞一起孵育30分钟，以最小化分泌的抗体的坞对坞扩散。使用默认脉冲培养设置：36℃培养温度和每2分钟4uL冲洗。这个孵育期允许分泌的抗体在引入染料标记的配体之前结合报告细胞。

孵育30分钟后，如前所述，导入647HIT3a配体(1ug/ml，6.3nM)，并在延时成像的情况下进行孵育。再孵育30分钟后，用500uL培养基冲洗芯片，然后立即进行脉冲培养25分钟。封闭测定完成后，进行IgG结合测定以确认杂交瘤IgG分泌。

如上所述，使用TPS分析来处理图像序列。将背景(平均背景亮度)和报告细胞强度(最大亮度)制成表格，并将它们的分布绘制为杂交瘤类型和Jurkat细胞负载的函数(图49A-49B)。如图49A-49B所示，来自分泌OKT3坞的报告细胞信号(最大亮度)仅略高于背景，表明封闭了HIT3a抗CD3，正如预期的那样。另一方面，来自分泌OKT8坞的报告细胞信号明显高于背景和OKT3坞，表明封闭结果为阴性。随着报告细胞负载的减少，在非封闭OKT8坞中观察到报告细胞信号逐渐减少。这很可能是由于如上所述的报告细胞群的异质性。当加载五个Jurkat细胞时，坞的“低信号”概率小于1％。然而，当只有一个Jurkat细胞加载在坞中时，对于此报告细胞制备，该坞获得“低信号”的概率为～34％。

没有具体的用于建立一个精确的信号阈值，以实现最高的真阳性命中恢复和最低的可能假阳性率的方法。降低信号阈值和/或将候选坞限制为具有较多数量的报告细胞的坞将降低包括假阳性的风险。然而，这伴随着排除一些真阳性的成本。相反地，提高信号阈值和/或包括具有较少报告细胞的坞会增加真阳性和假阳性的数量。在图50A-50B中针对模型封闭测定证明了这个概念。

无论报告细胞负载如何，增加信号阈值都会导致真阳性命中数和假阳性命中率增加。然而，如上所述，将候选坞限制为具有较多数量的报告细胞的坞降低假阳性率，以真阳性命中总数为代价。下表显示了此数据集在固定信号阈值1400下的真阳性数和假阳性率。

表5：

Jurkat细胞/坞	选定的总命中	真命中	假阳性率(％)
				>＝1	843	762	9.6
>＝3	440	415	5.7
				>＝5	93	90	3.2

生成命中列表的一般方法是根据报告细胞的最大亮度对坞进行分类。报告细胞信号较低的坞很可能是真正的封闭剂。具有较高信号的坞很可能是非封闭剂。如果已经按照建议进行了报告细胞表征，则可以预先确定作为报告细胞负载计数函数的假阳性风险。对于命中率非常低的测定，包括假阳性命中风险较高的坞(报告细胞较少)是合理的，以便卸载和恢复尽可能多的真实命中。另一方面，如果测定导致高命中率，则排除假阳性风险较高的坞是合理的，因为有很多坞可供选择。

实施例3.配体/受体封闭抗体筛选

材料和方法

系统和微流体装置：实施例中使用的系统和微流体装置由伯克利之光生命科技公司制造。该系统至少包括流量控制器、温度控制器、流体介质调节和泵组件、用于光激活DEP配置的光源、微流体装置的安装台和相机。微流体装置是配置有OptoElectroPositioning(OEP^TM)技术的OptoSelect^TM芯片。微流体装置包括微流体通道和与其流体连接的多个NanoPen^TM腔室。

细胞制备和测定试剂：使用CD138+浆细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从用Fc-融合的PD-L1细胞外结构域(huPD-L1 ECD-FC)免疫的Balb/c小鼠的骨髓和脾脏分离原代浆细胞。通过使用AF488标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific)标记重组PD-1-Fc融合蛋白(ChemPartner)来制备PD-1-AF488。通过将生物素化的PD-L1(ChemPartner)与链霉亲和素聚苯乙烯颗粒(Spherotech Inc.)偶联来制备重组PD-LI珠。最后，将CHO-K1细胞工程化为过表达人PD-L1(ChemPartner)。

抗体筛选测定：使用伯克利之光的OEP^TM技术，将单个浆细胞加载到OptoSelect^TM11k芯片上的个体NanoPen^TM腔室中。然后将CHO-K1-PD-L1细胞批量加载到个体NanoPen腔室中，以便每个坞平均加载4个细胞。加载抗原包被的珠子和二抗的测定混合物以同时进行重组PD-L1珠结合测定(通道内)和细胞结合测定(坞内)。然后将测定混合物从芯片中冲洗出以进行配体/受体封闭测定。通过人工验证对基于细胞的测定进行评分。

重组PD-L1珠结合测定(通道内)：将PD-L1包被的珠在具有荧光标记的抗小鼠二抗(AF568)的混悬液中导入OptoSelect 11k芯片的主通道中，以便珠子被集中在每个NanoPen腔室的口周围。分泌的抗体从NanoPen腔室扩散到通道中，在该通道中，光学检测分泌的抗体的结合，作为TRED成像通道中的通道内“发光(blooms)”。在NanoPen的中心观察到的发光表明阳性PD-L1结合。

细胞结合测定(坞内)：通过首先将浆B细胞和CHO-K1-PD-L1细胞共孵育1小时，以允许分泌的抗体使受体饱和，进行坞内细胞结合测定。然后通过OptoSelect 11k芯片灌注荧光标记的抗小鼠二抗(AF568)并使其扩散到NanoPen腔室中。当使用TRED滤光块在Beacon系统上成像时，通过定位带有荧光CHO-K1-PD-L1细胞的坞来识别抗PD-L1细胞结合抗体。

配体/受体封闭测定(坞内)：完成坞内细胞结合测定后，通过OptoSelect11k芯片灌注荧光标记的可溶性PD-1-Fc融合蛋白(AF488)。在FITC成像通道中检测PD-1与报告细胞的结合。含有在TRED和FITC通道中都呈阳性的CHO-K1-PD-L1细胞的NanoPen腔室证实存在具有PD-L1结合但无封闭活性的分泌的抗体。含有在TRED中呈阳性但在FITC中呈阴性的CHO-K1-PD-L1的NanoPen腔室含有具有PD-L1结合和PD-1/PD-L1封闭活性二者的分泌的抗体。

序列回收和功能确认：将分泌PD-L1/PD-1封闭抗体的细胞从特定的NanoPen腔室导出到96孔PCR板。使用Opto^TMPlasma B Discovery cDNA(浆B发现cDNA)合成试剂盒和Opto^TMPlasma B Discovery Sanger Prep(浆B发现Sanger Prep)试剂盒小鼠(伯克利之光)的组分扩增和回收抗体重链和轻链序列。样品制备和测序如2019年3月28日提交的标题为“Methods for Preparation of Nucleic Acid Sequencing Libraries”的国际申请公开号WO2019191459中所述进行，其公开内容通过引用整体并入本文。将回收的序列克隆到表达构建体中，并重新表达和纯化抗体。使用基于板的ELISA和FACS测量确认抗原结合和封闭活性。

结果：

使用配体/受体封闭测定识别封闭抗体：首先同时进行通道内重组蛋白结合测定(图16A-16C，顶行)和坞内细胞结合测定(图16A-16C，中间行)以分别识别结合在报告细胞的细胞表面上表达的重组PD-L1和天然PD-L1的抗体。在重组和基于细胞的结合测定后，在坞内进行PD-1/PD-L1配体/受体封闭测定(图16A-16C，底行)。荧光成像清楚地揭示了有效封闭荧光标记的PD-1结合在CHO-K1细胞上表达的PD-L1的能力的抗体(图16B，下图)以及不是有效的封闭剂的抗体(图16C，中图)，尽管在重组和基于细胞的结合测定中与PD-L1结合(图16A-C，顶行和底行)。

在筛选的33,377个小鼠浆B细胞(16,500个细胞来自脾脏和16,877个细胞来自骨髓)中，598个(1.8％)细胞产生了与PD-L1偶联珠结合的抗体。细胞结合测定使我们能够进一步向下选择273个(0.8％)细胞，这些细胞分泌的抗体与在CHO-K1细胞表面上表达的PD-L1结合(图17)。配体/受体封闭测定识别了46个(0.1％)先导候选物，它们既结合PD-L1又能够封闭荧光标记的PD-1和PD-L1之间的相互作用。向下选择至46个先导候选物的能力消除了对近600个抗体进行测序、克隆、重新表达和纯化的需要。

通过接近骨髓浆B细胞发现更多封闭抗体：Opto Plasma B Discovery能独特地接近来自多个器官(包括脾脏、骨髓和淋巴结)的浆B细胞。与脾脏浆B细胞相比，通过筛选来自骨髓的浆B细胞识别了3倍多的封闭抗体(图18)，表明该B细胞区室可能是治疗分子的重要来源。将分泌PD-1/PD-L1封闭抗体的浆B细胞从芯片上卸载下，用于cDNA回收和抗体重/轻链基因扩增测序。对PD-1/PD-L1封闭抗体进行测序证实，与目前临床上商业批准的抗体(未显示)相比，使用Beacon仪器识别的主要候选物是独特的抗体。

识别性能与商业批准的抗体相当的抗体：选择二十四(24)种封闭抗体进行克隆、再表达和纯化，以使用正交测定进行表征(图19A-19D)。24种抗体中的二十(20)种(83％)抗体结合人PD-L1的细胞外结构域(ECD)，如ELISA所证实的(图19A)。这种结合不仅限于重组蛋白，因为24种抗体中的20种也与表达PD-L1蛋白的CHO-K1细胞结合(图19B)。确定这些候选物结合食蟹猴PD-L1变体(图19C)，这是临床前动物毒理学研究的重要要求。最后，证实了先导候选物在基于孔板的测定中具有功能性配体/受体封闭活性(图19D)。在测试的20种抗体中，根据使用Biacore仪器(GE Healthcare，数据未显示)生成的结果，5种具有与市售治疗性抗体相当的IC₅₀值，2种具有亚纳摩尔亲和力。

实施例4：使用机器学习算法增强活浆细胞移入坞中。

A.用于区分活细胞和死细胞的细胞染色选择：原代浆细胞是从来自免疫的Balb/C小鼠的解剖脾脏中分离出来的。使用市售的小鼠CD138+浆细胞分离试剂盒(Miltenyi，130-092-530)，通过密度梯度离心，然后进行磁激活细胞分选(MACS)，从脾细胞中富集浆细胞。按照制造商的说明，用酯酶活性指示剂钙黄绿素-AM(Bio-Legend，425201)对浆细胞进行染色。细胞还用优化浓度的PE偶联抗小鼠CD138抗体(Miltenyi，130-120-810)和ZombieViolet可固定细胞活力染料(Biolegend,423113)进行标记。所用每种染色剂的细胞染色程序如下进行：

·钙黄绿素染色剂(活染色)。1)在50微升PBS中重悬。2)添加0.5微升钙黄绿素-AM(钙黄绿素：BioLegend 76084，批号B255562，购自7/19/2020)。3)室温下避光孵育20分钟。4)沉淀细胞并重悬于温的培养基中，在室温下孵育10分钟以确保钙黄绿素-AM的最佳保留。5)孵育后，钙黄绿素-AM标记的细胞即可用于下游应用或分析。

·细胞的Zombie Violet染色剂(死染色)。1)1:100在50微升PBS中。2)在PBS中，室温孵育10分钟

·CD138染色剂。1)在FACS缓冲液中以1:20稀释AF647抗小鼠CD138(Biolegend，142526)。2)在200uL稀释的CD138染色剂中重悬细胞。3)4C避光孵育30分钟。4)孵育后，Zombie Violet标记的细胞即可用于下游应用或分析

染色后，将细胞导入OptoSelect^TM装置(伯克利之光生命科技公司)，配置有在Beacon系统(伯克利之光生命科技公司)上运行的OptoElectroPositioning(OEP^TM)技术，并在FITC(钙黄绿素)、DAPI(Zombie)、CY5(CD138)立方体通道成像。图20显示用钙黄绿素、Zombie、CD138染色的细胞。为了测试Beacon系统是否能够尽可能准确地区分活的和死的浆细胞，比较了未染色和染色的浆细胞之间导入芯片通道的细胞的平均荧光水平。查看阴性对照(无染色的浆细胞)，在染色中发现背景信号。在所有三种染色剂中，钙黄绿素具有最小的平均背景信号(<1000AFU)。用于确定细胞是否被染色为阳性的每个通道的阈值基于高于每个通道平均值的2个标准差(stdev)，n＝5837个细胞(图21)。

然后在用OEP加载细胞后检查通道中和坞中染色的浆细胞的荧光。使用相同的成像曝光时间和设置，检查每种染色剂的箱线图。通过门控细胞直径(10微米)和图像分析器2.1中验证的任何细胞碎片/团块消除任何异常值。每个点代表通道中的浆细胞。晶须扩展到IQR的1.5倍以内的数据。由于来自OEP的介电泳力预计在活细胞中高于死细胞，因此坞中的细胞在钙黄绿素/CD138中会发出高荧光，而在Zombie中发出低荧光。在3个芯片(D70161，通道中n＝4403，细胞中n＝3179；D70163，通道中n＝4698个细胞，坞中n＝3561个细胞；D70169，通道中n＝4523个细胞，坞中3563个细胞)中，观察到坞内细胞似乎比通道内细胞具有更高的钙黄绿素和Zombie表达水平，而坞内和通道内的CD138表达水平相似。图22表明钙黄绿素是Beacon系统中区分活细胞和死细胞的最佳染色剂。

坞内与通道内细胞之间的亚群频率比较

接下来，检查通道内和坞内细胞之间的亚群频率差异。基于来自未染色细胞的阈值，如图23所示，CD138+通道内亚群低于CD138+坞内亚群。类似地，钙黄绿素+(活)通道内亚群低于钙黄绿素+坞内亚群。此外，Zombie+(死)坞内亚群被认为低于Zombie+通道内亚群。箱线图表明，使用Beacon系统的细胞染色可以观察到通过将细胞移入坞中富集活细胞的过程。

CD138、钙黄绿素、Zombie染色之间的关联：接下来，检查CD138、钙黄绿素、Zombie表达水平之间的关系。在对数标度中，可以看出在密度散点图(图24)中，Zombie(死)和钙黄绿素(活)表达水平可分为2个亚群(一个亚群具有高Zombie和低钙黄绿素，另一个具有低Zombie和高钙黄绿素)。此外，比较Zombie和CD138，观察到一个主要的亚群具有高CD138和低Zombie表达水平。比较钙黄绿素和CD138，观察到具有高钙黄绿素和高CD138表达水平的一个主要亚群。坞内和通道内样本都具有相似的趋势。在Beacon系统中，钙黄绿素被认为以最大的荧光分离来分离活的和死的亚群。芯片上数据与芯片外流式细胞术数据非常匹配(参见以下段落。

CD138、钙黄绿素、Zombie染色剂的芯片外FACS分析：在BD FACS Celesta细胞分析仪上分析染色细胞，并使用FlowJo v10软件进一步分析数据。来自FACS分析的数据表明，具有强钙黄绿素信号的细胞对Zombie Violet的信号非常低甚至没有，Zombie Violet只染色死细胞或垂死细胞。表达CD138(一种已知的浆细胞表面标志物)的细胞也具有很强的钙黄绿素信号。

散点图显示了CD138(AF647)和钙黄绿素(FITC)的活细胞或死细胞的信号强度(图25A-25B)。每幅图右侧的3个图显示了反向门控分析，以显示目标群体(由实线包围)在亲代群体中的位置。底部的表格显示了Zombie Violet(Comp-BV421-A)、钙黄绿素(Comp-FITC-A)和CD138(Comp-AF647-A)的中值荧光强度(MFI)。图26A-26B显示Zombie Violet(DAPI)与钙黄绿素-AM(FITC)(图26A)和CD138(AF647)(图26B)之间的相关性。

明场和荧光(钙黄绿素染色)图像序列之间的关联。

然后尝试确定Beacon系统中浆细胞的活染色和明场图像是否具有良好的相互关联性。在明场图像序列中，看到具有不同形态的细胞(图27)。进行了调查以确定这些形态差异是否与活细胞染色(钙黄绿素)有关。利用用钙黄绿素染色的细胞数据集(图28)，验证了具有低钙黄绿素荧光的细胞与具有不清晰边界和较小细胞直径的细胞相关。新鲜样品(3个芯片的池)：每个点表示一个细胞。虽然OEP中值亮度(还有其他TPS(靶点和坞选择)参数)在区分活细胞和死细胞方面不是特别有效，但是可以目测观察到活细胞轮廓清晰，而死细胞轮廓不清晰。

总之，已证明Beacon系统可用于根据细胞染色(钙黄绿素、Zombie)评估活细胞和死细胞。此外，活染色与明场图像相关联，并与芯片外流式细胞术数据相匹配，证明它是训练卷积神经网络的可靠来源。

B.卷积神经网络的训练。训练并建立了CNN B细胞活/死分类模型。B细胞活/死分类模型可以是额外的神经网络特征，其利用CNN的B细胞检测模型的输出。由于活/死分类模型是独立于B细胞检测模型的模块，因此可以在不影响细胞检测的情况下打开和关闭活/死分类模型。一旦检测到B细胞，就会根据细胞的质心位置产生新的细胞图像，并将其传递到活/死分类模型中。该分类模型的输出是细胞为活细胞的概率。

训练模型：训练数据由使用FITC染料用钙黄绿素染色的细胞，以及OEP(明场)下的细胞图像组成。首先使用OEP下的B细胞检测模型检测细胞。之后，根据FITC荧光立方体下的荧光强度(通过TPS)将细胞标记为活/死细胞。然后使用OEP下的细胞图像和使用FITC染料收集的标记的组合训练分类模型(参见下面的生成输入数据和生成标记段落)。表6显示了六种不同的微流体芯片用于训练活/死细胞分类模型。

表6

图29、图30、图31获自同一图像，并说明了如何生成训练数据。图29显示了用于训练的原始数据，具有OEP(明场)和FITC(钙黄绿素)通道覆盖。绿色发光细胞表示用钙黄绿素染色的细胞，而其他细胞没有这种染色。

生成输入数据。图30显示了在明场下使用图29上的B细胞检测模型检测到的细胞。每个细胞都用作活/死分类模型的输入。每个检测到的B细胞都用'+'表示。垂直线将通道分成多个段，每个段对应一个目标坞。每个坞开口处指示的数字表示在通道的每个段中检测到的B细胞数。

为活/死细胞生成标记。图31中检测到的B细胞的活/死细胞标记是通过TPS基于荧光强度收集的，使用基于FITC通道的平均亮度值为～10000(16位无符号整数)的截止值。实心圆表示活细胞标记。“+”表示死细胞标记。图31用作活/死分类模型的预期输出。

经过训练的活/死分类模型用于无染色样本，以从死B细胞中识别活B细胞。结果在图32中示出。左边的图像显示了算法识别的活细胞(白色实心)和死细胞(黑色实心)。右边的图像是由人眼标注的明场图像，验证了算法是准确的。

定性度量：使用表7中所示的六种不同装置进行评价。图33和图34获自同一图像，并说明如何分析评价数据。这些图像表明模型仅根据OEP图像将检测到的B细胞正确分类为活细胞/死细胞。这是通过使用钙黄绿素染色(FITC通道)来表示真正的活细胞存在的位置来验证的。

表7

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评价数据、OEP和FITC(钙黄绿素)通道重叠。图33显示了未看见的评价数据的输出(在训练模型时保留，以避免输出有偏差)从B细胞检测模型(在OEP下)检测到的所有B细胞都标有“+”(浅绿色和红色)。具有实心圆圈的绿色发光B细胞(表示钙黄绿素染色)被预测为活细胞。带有“+”的细胞被预测为死细胞。这些细胞没有钙黄绿素染色，因为它们不发绿色光。

评价数据，仅FITC(钙黄绿素)通道。图34与上述相同，但OEP通道关闭(无明场)，以提供相同信息的另一个视图。从B细胞检测模型(在OEP下)检测到的所有细胞都标有“+”(浅绿色和红色)。具有实心圆圈的绿色发光B细胞(表示钙黄绿素染色)被预测为活细胞。由于缺乏钙黄绿素染色，具有“+”的细胞被预测为死细胞且无法在FITC立方体下看到。

定量度量：下图提供了对实验D74779的定量度量的深入了解。设置为0的阈值与关闭此活/死分类特征相同。用户可以根据自己的喜好调整适当的截止值，从而权衡精确度和活细胞/死细胞的召回率。如图35A-35B所示，设置更高的阈值截止值将增加真正活细胞的百分比(精确度提高)，代价是重新取回的活细胞总数(召回率减少)。F1分数(图36)是测试准确度的量度，它是精确度和召回率之间的调和平均数。

实施例5.芯片上裂解、RNA捕获、标记检测和导出。

系统、坞内测定试剂和细胞与实施例1中的材料相似。标记的和条形码化的核酸捕获珠包括12组不同标记的(例如，可检测可区分标记的)如本文所述的条形码化核酸捕获物体。每组可检测可区分的核酸捕获珠均具有组成的珠颜色(可从Spherotech商购)，其不同于其他十一组核酸捕获珠中的任何一个。此外，每组可检测可区分的核酸捕获珠的每个捕获珠均包括与该特定组成珠颜色配对的条形码序列(例如寡核苷酸序列)。对于每组可检测可区分的核酸捕获珠的每个核酸捕获珠，标记和条形码序列各自是相同的。十二个不同的条形码序列是表8中SEQ ID NO：1-12所示的序列。

标记检测。珠子类型/条形码检测使用具有随机双坐标上升(SDCA)的最大熵分类模型。该模型使用基于4个过滤器立方体(量程从0到1.0)的归一化荧光强度输入：Cy5、DAPI、FITC、TRED，并输出属于特定珠子条形码的珠子的概率(例如C0D0F0T1，其中C表示Cy5，D表示DAPI，F表示FITC，T表示TRED；0和1是开关二进制数)。在训练期间，模型使用与上述相同的输入特征(Cy5、DAPI、FITC、TRED)，并根据珠子导入数据提供预期的珠子条形码输出地面实况值。地面实况值数据集是通过控制微流体芯片的仪器上的导出/导入针从孔板导入每种珠子类型而创建的。每种珠子类型都被移入坞中至特定的视野并分配给特定的坞ID。在芯片的视野中，珠子类型在空间上是分开的。所有立方体的坞ID、视野编号和荧光图像的地面实况值数据集用于训练和测试珠子分类模型的准确度。

将细胞导入微流体装置中，并使用DEP力将个体细胞导入个体隔离坞中。基于上述实施例2中所述的训练的CNN方法选择个体健康细胞进行移入坞中，但移入坞中可以通过其他方式完成，如手动移入坞中、细胞染色后选择性导入和批量移入坞中。如实施例1中所述进行抗体结合/功能测定。

芯片上裂解、核酸捕获和RT。在设计用于检测细胞分泌的抗体的测定完成后，将上一段中描述的12组不同的标记的、条形码化核酸捕获珠中的多个导入微流体装置的流动通道中。将标记的条形码化核酸珠导入含有单个细胞或单个克隆群的隔离坞中，以在每个隔离坞中递送一个标记的条形码核酸珠。将标记的条形码珠导入隔离坞的过程包括使用DEP力为每个隔离坞选择所需的标记的条形码化珠。通常，但不是必需的，执行标记的条形码化珠的导入以导入不同的颜色，并因此导入条形码，用于一组相邻的隔离坞。

在导入可区分标记的、条形码化核酸捕获珠后，通过以0.1微升/秒的灌注速率导入裂解试剂执行芯片上细胞裂解，所述裂解试剂包含基于去污剂的细胞裂解缓冲液(24微升)；包含镁、氯化钙、F127和RNA酶抑制剂的PBS(31.8微升)；PEG 4000(1.2微升)和RNaseOUT^TM(3微升，Invitrogen)。裂解剂扩散到隔离坞中，并使细胞在25℃下暴露于裂解试剂10分钟。然后用包括盐水柠檬酸钠缓冲液的洗涤缓冲液冲洗微流体芯片。在裂解和冲洗期期间，来自裂解细胞的RNA被捕获到该个体坞内的核酸捕获物体。

通过将微流体装置的温度降低至16℃来执行芯片上逆转录。将包含水；5x RT缓冲液；dNTP；PEG 4000；和RT酶的逆转录试剂(15微升)导入芯片上，并使试剂扩散到隔离坞中。通过如下循环微流体芯片温度进行芯片上逆转录：20C下10分钟；30C下10分钟；42C下90分钟；30C下10分钟；以及在20C下10分钟。然后将芯片冷却至18C以进行珠子分类和随后的导出。

对于珠子条形码/类型检测，使用上述具有随机双坐标上升(SDCA)的最大熵分类模型，在多个荧光通道中对珠子进行成像。标记的身份与隔离坞的身份一起存储。这允许将该坞的抗体结合/功能测定结果与导入那里的核酸捕获物体相关联，从而允许结合/功能测定与该隔离坞中的细胞/克隆群体的测序结果相关联。

虽然在该实验中确定条形码化核酸捕获物体的标签的身份是在捕获的RNA逆转录之后进行的，但可以在将核酸捕获物体布置在隔离坞内时执行的任何过程期间的其他点进行标记的检测。

核酸捕获物体分类后，选择珠子进行导出。通过选择每种颜色类型的一个珠子，例如，每个不同的标记的、条形码化核酸捕获物体组中的一个，并将每组十二个不同标记的捕获物体导出到96孔板中的单个孔中来执行导出。这在整个芯片上按顺序重复。通过导出12种不同类型的珠子作为每孔一批，实现多达1152次目标BCR序列的导出。

如实施例1中所述，对导出的带有cDNA的珠子进行处理以用于下游测序和任选地重新表达。

实施例6.多路分配条形码化导出cDNA。

扩增来自条形码化导出cDNA的特定抗体可变结构域可以通过使用与所需条形码匹配的单个条形码化正向引物和设计用于与Hc或Lc恒定区结合的通用反向引物制备PCR来完成。

使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix扩增来自混合浆细胞导出cDNA的条形码化重链和轻链可变结构域扩增子。使用条形码特异性正向引物和针对重链或轻链恒定结构域的通用反向引物，在独立反应中扩增条形码化扩增子。

PCR在以下条件下运行：

98℃ 3分钟；接着是：

24次循环，包括98℃ 20秒；70℃ 15秒；72℃ 45秒。

完成24次PCR循环后，将反应在72℃下再孵育3分钟；

最后保持在4℃。

通过NGS测序所确定的具有来自使用条形码特异性正向引物的PCR反应的预期条形码的扩增子的频率显示在图37中。一系列12个直方图，每个预期条形码一个，描述了来自使用条形码特异性引物扩增的导出cDNA的扩增子上观察到的条形码的量。如所述使用条形码特异性引物扩增来自12个导出孔的模板，每个孔包含来自12个条形码化珠出口的cDNA。使用标准方案使用标准NGS库对这些可变结构域扩增子进行索引和测序。对每个样本分析包含所有条形码(预期和非预期)的读数部分，以确定条形码引物扩增的特异性。观察到一些样本中非预期条形码的一小部分读数。原始直方图是彩色的，以区分12种不同条形码的频率，直方图的黑白版本在图37中示出。例如，直方图显示了对于条形码8的不同条形码的一小部分读数(由以主条为中心的条表示)，没有一个条形码的频率大于正确条形码读数的百分之几。这表明当具有条形码8的珠子被扩增时，存在一些不正确的扩增。具有预期条形码8的扩增子占读数的87.5％以上，证明了从芯片上裂解和RNA捕获中捕获的每个条形码化cDNA组的扩增特异性。条形码9显示较少的交叉扩增事件，但存在高达总读数的约5％的一个特定的不正确读数，并且存在的预期条形码9约超过使用具有条形码9的珠捕获的读数的88％。条形码10和条形码4显示错误条形码化序列交叉读数的发生率非常低，在从具有条形码10和条形码4的相应珠子组捕获的条形码化cDNA组的读数中提供了大于约95％的预期条形码10或条形码4。

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除了任何先前指出的修改之外，本领域技术人员可以在不脱离本说明书的精神和范围的情况下设计出许多其他变化和替代布置，并且所附权利要求旨在涵盖此类修改和布置。因此，虽然上面已经结合目前认为最实用和优选的方面对信息进行了具体和详细的描述，但对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不背离此处阐述的原则和概念的情况下，可以进行许多修改，包括但不限于形式、功能、操作方式和使用。而且，如本文所用，实施例和实施方案在所有方面都仅是说明性的，不应被解释为以任何方式进行限制。此外，在本文提及元素列表(例如，元素a、b、c)时，此类提及旨在包括所列元素中的任何一个本身、少于所有所列元素的任何组合，和/或所有列出的元素的组合。而且，如本文所用，术语一个/种(a、an)和一个/种(one)各自可以与术语至少一个/种和一个/种或多个/种互换。还应注意，虽然本文使用术语步骤，但该术语可以用于简单地引起对所描述方法的不同部分的注意，并不意味着描述方法的任何部分的起点或终点，或以任何其他方式进行限制。

XIV.其他实施方案

实施方案1.一种测定第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的抑制的方法，其中该方法在具有腔室的微流体装置内进行，该方法包括：将微物体引入微流体装置的腔室中，其中微物体包含多个第一分子；将细胞引入腔室中，其中细胞能够产生目标分子；在微物体存在的情况下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在腔室中孵育细胞；在腔室中孵育细胞后，将第二分子引入腔室中，其中第二分子与可检测标记结合；以及监测第二分子在微物体上的积累，其中第二分子在微物体上的积累不存在或减少表明目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中目标分子与微物体上的第一分子结合，从而抑制第二分子与微物体的结合。

实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中目标分子与第二分子结合，从而抑制第二分子与微物体上的第一分子的结合。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中第一分子是受体分子，并且其中第二分子是与所述受体分子特异性结合的配体。

实施方案5.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中第一分子是配体，并且其中第二分子是被所述配体特异性结合的受体。

实施方案6.根据实施方案4或5所述的方法，其中受体分子是蛋白，并且任选地是糖基化蛋白。

实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中受体是生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、粘附受体(例如，整联蛋白或细胞粘附分子(CAM))、离子通道、G蛋白偶联的受体(GPCR)，或前述任一种的各自全长生物分子的活性保留片段。

实施方案8.根据实施方案4至7中任一项所述的方法，其中配体是蛋白。

实施方案9.根据实施方案4至8中任一项所述的方法，其中配体是生长因子、细胞因子、趋化因子、粘附配体、离子通道配体、GPCR配体、病毒蛋白(例如，病毒融合蛋白)，或前述任一种的各自全长生物分子的活性保留片段。

实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中包含多个第一分子的微物体是细胞。

实施方案11.根据实施方案10所述的方法，其中包含多个第一分子的细胞来自转染的细胞系(例如，稳定或瞬时转染的)。

实施方案12.根据实施方案11所述的方法，其中转染的细胞系中至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或更多)的细胞以可检测水平表达第一分子。

实施方案13.根据实施方案10至12中任一项所述的方法，其中包含多个第一分子的细胞包含编码第一分子的外源核酸分子。

实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中微物体包含的多个第一分子足以结合至少50,000个第二分子(例如，至少60,000、至少70,000、至少80,000、至少90,000、至少100,000、至少110,000、至少120,000、至少130,000、至少140,000、至少150,000或更多个第二分子)。

实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中目标分子是抗体。

实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中能够产生目标分子的细胞是抗体产生细胞(APC)。

实施方案17.根据实施方案15所述的方法，其中能够产生目标分子的细胞是B细胞，并且任选地是浆细胞。

实施方案18.根据实施方案15所述的方法，其中能够产生目标分子的细胞是记忆B细胞，并且任选地，其中在有助于目标分子的产生和分泌的条件下孵育能够产生目标分子的细胞包括使能够产生目标分子的细胞与一种或多种记忆B细胞激活剂接触。

实施方案19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中将微物体引入微流体装置的腔室中包括将单个微物体引入微流体装置的腔室中。

实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中任选地使用介电泳(DEP)力选择性地将单个微物体引入腔室中。

实施方案21.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中将微物体引入微流体装置的腔室中包括将多个微物体引入微流体装置的腔室中。

实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中将多个微物体引入微流体装置的腔室中包括将三个、四个或五个微物体引入微流体装置的腔室中。

实施方案23.根据实施方案21或22所述的方法，其中使用DEP力或重力将多个微物体引入腔室中。

实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中将微物体引入腔室中包括任选地使用介电泳(DEP)力，基于检测微物体的活力情况选择性地引入微物体。

实施方案25.根据实施方案24所述的方法，其中检测活力情况进一步包括使用机器学习算法将活力概率分配给单个微物体或多个微物体。

实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中机器学习算法包括经训练的机器学习算法，其中所述经训练的机器学习算法包括通过对包含区分活力情况的标记的微物体成像来训练机器学习算法。

实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中包含区分活力的标记的微物体是与待选择引入腔室或多个腔室的单个微物体或多个微物体相同类型的细胞。

实施方案28.根据实施方案26或27所述的方法，其中区分活力的标记包含活/死染色剂，活/死染色剂包括钙黄绿素、zombie violet染色剂、膜联蛋白、吖啶橙、碘化丙啶或其任何组合。

实施方案29.根据实施方案26至28中任一项所述的方法，其中所述训练还包括在明场条件下对包含区分活力的标记的微物体进行成像。

实施方案30.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中腔室是微孔。

实施方案31.根据实施方案1至29中任一项所述的方法，其中腔室是隔离坞。

实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中微流体装置包括微流体通道，其中隔离坞包括隔离区域和连接区域，并且其中连接区域具有通向微流体通道的近端开口和通向隔离区域的远端开口。

实施方案33.根据实施方案32所述的方法，其中隔离区域包括通向连接区域的单个开口。

实施方案34.根据实施方案32或33所述的方法，其中隔离坞具有通向微流体通道的单个开口。

实施方案35.根据实施方案1至34中任一项所述的方法，其中所述腔室包含约200pL至约10nL(例如，约200pL至约5nL，或约250pL至约2nL)的体积。

实施方案36.根据实施方案1至35中任一项所述的方法，其中将第二分子引入腔室中包括使包含第二分子的介质流入微流体通道，该微流体通道流体连接到腔室；以及允许第二分子扩散到腔室中。

实施方案37.根据实施方案1至36中任一项所述的方法，其中微流体装置包括多个腔室，并且其中该方法进一步包括：将微物体引入多个腔室的每个腔室中，其中微物体包括多个第一分子；将细胞引入多个腔室的每个腔室中，其中细胞能够产生目标分子；在微物体的存在下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在多个腔室中孵育细胞；在多个室中孵育细胞后，将第二分子引入多个腔室的每个腔室中，其中第二分子与可检测标记结合；以及监测第二分子在微物体上的积累。

实施方案38.根据实施方案1-37中任一项所述的方法，其中监测第二分子在每个微物体上的积累包括将该积累与在目标阳性对照分子和/或目标阴性对照分子的存在下观察到的积累进行比较。

实施方案39.一种从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法，包括：在腔室内提供生物细胞；在腔室中提供捕获物体，捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在每个第一寡核苷酸的3'端均包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列，裂解生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA；以及反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均包含与捕获的RNA的相应一个互补并且共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列的寡核苷酸序列。

实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中腔室包括微孔。

实施方案41.根据实施方案39的方法，其中腔室包括微流体装置的隔离坞。

实施方案42.根据实施方案39至41中任一项所述的方法，其中在腔室中提供单个捕获物体。

实施方案43.根据实施方案39至42中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含对应于第一引物序列的第一引发序列和/或其中第二寡核苷酸包含对应于第二引物序列的第二引发序列。

实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中第一和第二引物序列是相同的。

实施方案45.根据实施方案39至44中任一项所述的方法，其中捕获序列与RNA结合并由此捕获RNA并引发从捕获的RNA的转录。

实施方案46.根据实施方案45所述的方法，其中逆转录(RT)聚合酶转录捕获的RNA。

实施方案47.根据实施方案39至46中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸的条形码序列对应于捕获物体的标记。

实施方案48.根据实施方案47所述的方法，其中标记是捕获物体的组成颜色。

实施方案49.根据实施方案39至46中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸的条形码序列是捕获物体的标记。

实施方案50.根据实施方案39至49中任一项所述的方法，还包括在捕获物体位于腔室内时识别多个第一寡核苷酸的条形码序列。

实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中识别条形码包括检测从标记发出的荧光。

实施方案52.根据实施方案39至51中任一项所述的方法，其中标记包含一个或多个荧光团。

实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中标记包含单个荧光团。

实施方案54.根据实施方案52所述的方法，其中标记包含多个荧光团。

实施方案55.根据实施方案39至54中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)的5'的一个或多个尿苷核苷酸。

实施方案56.根据实施方案39至54中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)的5'的三个尿苷核苷酸。

实施方案57.根据实施方案55或56所述的方法，其中一个或多个尿苷核苷酸邻近或包含第一寡核苷酸的(一个或多个)最5'核苷酸。

实施方案58.根据实施方案39至57中任一项所述的方法，其中逆转录捕获的RNA是在切割含有一个或多个尿苷核苷酸的序列的酶(例如，USER酶)的存在下进行的。

实施方案59.根据实施方案39至58中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸在3'端包含三个鸟嘌呤核苷酸。

实施方案60.根据实施方案39至59中任一项所述的方法，其中多个捕获物体的第二寡核苷酸的捕获序列包含寡聚dT序列(例如，(T)x VN序列或(T)x VI序列，其中X大于10、15、20、25或30)。

实施方案61.根据实施方案39至60中任一项所述的方法，其中捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。

实施方案62.根据实施方案39至61中任一项所述的方法，其中捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率为约1:1(例如，95:100至100:95)。

实施方案63.根据实施方案39至62中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含RNA、由RNA组成或基本上由RNA组成。

实施方案64.根据实施方案39至63中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含至少一个经修饰的碱基。

实施方案65.根据实施方案64所述的方法，其中至少一个经修饰的碱基独立地包含2'-O-甲基碱基、O-甲氧基-乙基(MOE)碱基或锁核酸碱基。

实施方案66.根据实施方案39至65中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯键。

实施方案67.根据实施方案39至66中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸连接至捕获物体。

实施方案68.根据实施方案39至66中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸与捕获物体共价结合。

实施方案69.根据实施方案68所述的方法，其中第一寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合连接至捕获物体。

实施方案70.根据实施方案39至69中任一项所述的方法，其中第二寡核苷酸连接至捕获物体。

实施方案71.根据实施方案39至69中任一项所述的方法，其中第二寡核苷酸与捕获物体共价结合。

实施方案72.根据实施方案70所述的方法，其中第二寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合连接至捕获物体。

实施方案73.根据实施方案39至72中任一项所述的方法，其中一个或多个条形码化cDNA序列中的每一个均与捕获物体结合。

实施方案74.根据实施方案39至73中任一项所述的方法，其中一个或多个条形码化cDNA序列在腔室中产生。

实施方案75.根据实施方案39至74中任一项所述的方法，还包括从腔室中导出捕获物体。

实施方案76.根据实施方案39至75中任一项所述的方法，还包括储存一个或多个条形码化cDNA序列。

实施方案77.根据实施方案39至76中任一项所述的方法，其中在约4℃的温度下储存一个或多个条形码化cDNA序列。

实施方案78.根据实施方案39至77中任一项所述的方法，还包括扩增一个或多个条形码化cDNA序列。

实施方案79.根据实施方案78所述的方法，其中扩增一个或多个条形码化cDNA序列包括使用单一引物(例如，P1引物)。

实施方案80.根据实施方案39至79中任一项所述的方法，还包括对相应多个腔室中提供的多个生物细胞执行该方法。

实施方案81.根据实施方案80所述的方法，其中向多个腔室提供多个捕获物体，多个捕获物体中的每个捕获物体均具有(i)选自多个独特标记(例如，至少12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000个或更多个不同的标记)的独特标记，以及(ii)多个第一寡核苷酸，其具有对应于独特标记的条形码序列。

实施方案82.根据实施方案81所述的方法，还包括：将多个捕获物体导出到共用容器中；以及扩增来自多个捕获物体的每个捕获物体的一个或多个条形码化cDNA序列，从而产生多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均具有对应于多个独特标记之一的条形码序列。

实施方案83.根据实施方案39至82中任一项所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供多个条形码化cDNA序列，多个条形码化cDNA序列中的每个条形码化cDNA序列均编码目标蛋白，其对应于多个不同的蛋白中的任何一个蛋白，连接至相应的反向互补条形码序列；且该方法还包括：任选地扩增多个条形码化cDNA序列；使用条形码特异性正向引物和对目标蛋白特异的反向引物选择性地扩增多个条形码化cDNA序列(或扩增的cDNA序列)以产生编码目标蛋白或其片段的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的5'端退火到用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段的5'相应端以产生退火的TAP产物；以及使用TAP适配引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物，以产生用于表达目标蛋白的构建体。

实施方案84.根据实施方案83所述的方法，其中对目标蛋白特异的反向引物包含与编码目标蛋白的保守区(例如，恒定部分)的序列互补的序列，或保守区3'的序列(例如，3'UTR序列)。

实施方案85.根据实施方案83或84所述的方法，其中扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的3'端包含与用于TAP的DNA片段的3'对应端重叠的区域。

实施方案86.根据实施方案39至82中任一项所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供多个条形码化cDNA序列，多个条形码化cDNA序列中的每个条形码化cDNA序列均编码对应于多个不同抗体中任一个的重链或轻链序列，连接至相应的反向互补条形码序列；该方法进一步包括：任选地扩增多个条形码化cDNA序列；使用条形码特异性正向引物和靶向相应恒定区序列的保守部分(例如，恒定区的5'端或与其相邻的序列)的反向引物选择性地扩增多个条形码cDNA序列以产生编码条形码特异性可变区的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的末端退火至用于TAP的DNA片段的相应末端以产生退火的TAP产物；以及使用TAP适配引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物，以产生用于表达抗体重链或轻链的表达构建体。

实施方案87.根据实施方案83-86中任一项所述的方法，其中扩增多个条形码化cDNA序列包括使用单一引物(例如，P1引物)。

实施方案88.根据实施方案83-87中任一项所述的方法，其中扩增多个条形码化cDNA序列包括使用不同的正向和反向引物。

实施方案89.根据实施方案39至82中任一项所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供条形码化cDNA序列的混合物，混合物的每个条形码化cDNA序列均编码重链或轻链序列，对应于多个不同的抗体中的任何一个，与相应的反向互补条形码序列连接。

实施方案90.根据实施方案39至82中任一项所述的方法，其中该方法包括：提供第一条形码化cDNA序列，其包含编码抗体重链的核酸，其在5'端连接至第一条形码序列的反向互补序列；以及提供第二条形码化cDNA序列，其包含编码相同抗体的轻链的核酸，其在5'端连接至第二条形码序列的反向互补序列。

实施方案91.根据实施方案90所述的方法，其中第一和第二条形码序列是相同的。

实施方案92.根据实施方案90所述的方法，其中第一和第二条形码序列是不同的。

实施方案93.根据实施方案90至92中任一项所述的方法，其中该方法包括：提供用于转录活性PCR(TAP)的第一DNA片段，该DNA片段包括：启动子序列、位于抗体重链相应可变区3'的恒定结构域序列，和终止序列；提供用于转录活性PCR(TAP)的第二DNA片段，该DNA片段包含：启动子序列、抗体轻链相应可变区3'的恒定结构域序列，以及终止序列。

实施方案94.根据实施方案90至93中任一项所述的方法，其中该方法包括：提供第一条形码化cDNA序列，其包含编码抗体重链的核酸，该核酸在5'端连接至第一条形码序列；提供第二条形码cDNA序列，其包含编码相同抗体轻链的核酸，该核酸在5'端连接至第二条形码序列；使用第一条形码特异性引物扩增第一条形码化cDNA序列的至少一部分；使用第二条形码特异性引物扩增第二条形码化cDNA序列的至少一部分；提供用于转录活性PCR(TAP)的第一DNA片段，该DNA片段包含：启动子序列、重链相应可变区3'的恒定结构域序列和终止序列；提供用于转录活性PCR(TAP)的第二DNA片段，该DNA片段包含：启动子序列、轻链相应可变区3'的恒定结构域序列和终止序列；将编码相应可变区的扩增的cDNA产物引入启动子序列3'和相应恒定结构域序列5'的DNA片段中，从而产生抗体重链和轻链的一对表达构建体。

实施方案95.根据实施方案39至94中任一项所述的方法，其中在微孔或隔离坞内提供生物细胞是在微孔或隔离坞内提供捕获物体之前进行的。

实施方案96.根据实施方案39至94中任一项所述的方法，其中在腔室内提供捕获物体是在腔室内提供生物细胞之前进行的。

实施方案97.根据实施方案39至96中任一项所述的方法，还包括将一个或多个捕获物体中的每一个提供给微流体装置内的相应一个或多个腔室中的每一个。

实施方案98.根据实施方案39至97中任一项所述的方法，还包括将一个或多个生物细胞中的每一个提供给微流体装置的相应一个或多个腔室中的每一个。

实施方案99.根据实施方案98所述的方法，其中将一个或多个生物细胞中的每一个提供在一个或多个腔室中的不同腔室中。

实施方案100.根据实施方案98至99中任一项所述的方法，其中当腔室包括隔离坞时，将一个或多个生物细胞提供在微流体装置的一个或多个室的隔离区域内。

实施方案101.根据实施方案98至100中任一项所述的方法，其中将一个或多个生物细胞中的至少一个提供在腔室内，所述腔室具有提供在其中的一个或多个捕获物体中的一个。

实施方案102.根据实施方案39至101中任一项所述的方法，其中一个或多个生物细胞是来自克隆群体的多个生物细胞。

实施方案103.根据实施方案39至102中任一项所述的方法，其中提供一个或多个生物细胞在提供一个或多个捕获物体之前进行。

实施方案104.根据实施方案39至103中任一项所述的方法，其中生物细胞是免疫细胞。

实施方案105.根据实施方案39至103中任一项所述的方法，其中所述生物细胞是癌细胞。

实施方案106.根据实施方案39至103中任一项所述的方法，其中生物细胞是干细胞或祖细胞。

实施方案107.根据实施方案39至103中任一项所述的方法，其中生物细胞是胚胎。

实施方案108.根据实施方案39至107中任一项所述的方法，其中生物细胞是单个生物细胞。

实施方案109.根据实施方案39至108中任一项所述的方法，其中提供生物细胞还包括标记生物细胞。

实施方案110.根据实施方案39至109中任一项所述的方法，其中微流体装置还包括用于容纳第一流体介质流的流动区域，以及包含至少一部分流动区域的微流体通道。

实施方案111.根据实施方案39至109中任一项所述的方法，其中微流体装置还包括用于容纳第一流体介质流的流动区域；以及包含用于容纳第二流体介质的隔离区域的隔离坞，所述隔离区域具有单个开口，其中隔离坞的隔离区域是微流体装置的未扫过区域；以及使隔离区域与流动区域流体连接的连接区域。

实施方案112.根据实施方案39至111中任一项所述的方法，其中微流体装置的一个或多个腔室中的每一个腔室均具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面，该涂覆材料提供有机和/或亲水分子的层。

实施方案113.根据实施方案110或111所述的方法，其中微流体装置的流动区域或通道具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面。

实施方案114.根据实施方案112或113所述的方法，其中至少一个涂覆表面包括亲水性或带负电荷的涂覆表面。

实施方案115.根据实施方案39至114中任一项所述的方法，其中微流体装置的外壳还包括介电泳(DEP)配置。

实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其中通过在生物细胞和/或捕获物体上或靠近生物细胞和/或捕获物体处施加介电泳(DEP)力来提供生物细胞和/或提供捕获物体。

实施方案117.一种制备用于表达目标蛋白的构建体的方法，包括：提供通过实施方案39至82中任一项所述的方法产生的条形码化cDNA序列，其中条形码化cDNA序列包含连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列的编码目标蛋白的核酸；使用条形码特异性引物和对编码目标蛋白的核酸特异的引物扩增条形码化cDNA序列的至少一部分，从而产生扩增的cDNA产物；提供用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段，该DNA片段包含：启动子序列，与编码目标蛋白的核酸的5'端(例如，扩增的cDNA的5'端)互补的核酸序列，与编码目标蛋白的核酸的3'端(例如，扩增的cDNA产物的3'端)互补的核酸序列，和终止序列；以及将扩增的cDNA产物引入到用于TAP的DNA片段中，从而产生用于表达目标蛋白的构建体。

实施方案118.一种制备用于表达抗体的构建体的方法，包括：提供通过实施方案39至117中任一项所述的方法产生的条形码化cDNA序列，其中条形码化cDNA序列包含编码抗体或其片段的重链或轻链的核酸，该核酸连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列；使用条形码特异性引物和对编码抗体重链或轻链的核酸特异的引物扩增条形码化cDNA序列的至少一部分，从而产生扩增的cDNA产物；提供用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段，该DNA片段包含：启动子序列，与编码重链或轻链序列的核酸的5'端(例如，扩增的cDNA产物的5'端)互补的核酸序列，与编码重链或轻链序列的核酸的3'端(例如，扩增的cDNA产物的3'端)互补的核酸序列，重链或轻链恒定结构域序列，和终止序列；将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中，从而产生用于表达包含可变结构域和恒定结构域的抗体的重链或轻链的构建体。

实施方案119.根据实施方案118所述的方法，其中条形码化cDNA序列包含编码抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的核酸，其在5'端连接至条形码序列。

实施方案120.根据实施方案118至119中任一项所述的方法，其中扩增的cDNA产物包含重链可变结构域或轻链可变结构域序列。

实施方案121.根据实施方案118至120中任一项所述的方法，其中用于TAP的DNA片段包含编码相应可变区3'的重链或轻链恒定结构域序列的抗体序列。

实施方案122.根据实施方案118至121中任一项所述的方法，其中将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中包括将编码可变区的扩增的cDNA产物引入启动子序列3'和编码重链或轻链恒定结构域序列的序列5'的DNA片段中。

实施方案123.根据实施方案118至122中任一项所述的方法，其中用于TAP的DNA片段中的恒定区序列是重链恒定区序列。

实施方案124.根据实施方案123所述的方法，其中重链恒定区序列包含一个、两个或三个串联免疫球蛋白结构域。

实施方案125.根据实施方案118至124中任一项所述的方法，其中用于TAP的DNA片段中的恒定区序列是轻链恒定区序列。

实施方案126.根据实施方案118至125中任一项所述的方法，其中启动子序列包含巨细胞病毒(CMV)启动子序列。

实施方案127.根据实施方案118至126中任一项所述的方法，其中启动子序列提供组成型基因表达。

实施方案128.根据实施方案118至127中任一项所述的方法，其中用于TAP的DNA片段还包含编码荧光报告蛋白的序列。

实施方案129.根据实施方案128所述的方法，其中用于TAP的DNA片段还包含编码自切割肽的序列，该序列位于编码荧光报告蛋白的序列的5'。

实施方案130.根据实施方案129所述的方法，其中自切割肽是T2A、P2A、E2A或F2A。

实施方案131.根据实施方案129所述的方法，其中自切割肽是T2A。

实施方案132.根据实施方案118至131中任一项所述的方法，其中通过使用条形码特异性引物进行对条形码化cDNA序列具有选择性的聚合酶链反应(PCR)来扩增条形码化cDNA序列。

实施方案133.根据实施方案118至132中任一项所述的方法，其中通过使用重叠延伸PCR将扩增的条形码化cDNA序列引入用于TAP的DNA片段中。

实施方案134.根据实施方案118至133中任一项所述的方法，还包括扩增表达构建体。

实施方案135.一种包含标记、多个第一和第二寡核苷酸的捕获物体，其中多个第一寡核苷酸的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列，和在每个第一寡核苷酸的3'端包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，并且其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸序列均包含捕获序列。

实施方案136.根据实施方案135所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含对应于第一引物序列的第一引发序列和/或其中第二寡核苷酸包含对应于第二引物序列的第二引发序列。

实施方案137.根据实施方案136所述的捕获物体，其中第一和第二引物序列是相同的。

实施方案138.根据实施方案135至137中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸的条形码序列对应于捕获物体的标记。

实施方案139.根据实施方案138所述的捕获物体，其中标记是捕获物体的组成颜色。

实施方案140.根据实施方案135至139中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸的条形码序列是捕获物体的标记。

实施方案141.根据实施方案135至140中任一项所述的捕获物体，其中捕获物体的标记包含一个或多个荧光团。

实施方案142.根据实施方案141所述的捕获物体，其中标记包含单个荧光团。

实施方案143.根据实施方案141所述的捕获物体，其中标记包含多个荧光团。

实施方案144.根据实施方案135至143中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)的5'的一个或多个尿苷核苷酸。

实施方案145.根据实施方案135至144中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含条形码序列和第一引发序列(如果存在)的5’的三个尿苷核苷酸。

实施方案146.根据实施方案144或145所述的捕获物体，其中一个或多个尿苷核苷酸邻近或包含第一寡核苷酸的(一个或多个)最5'核苷酸。

实施方案147.根据实施方案135至146中任一项所述的捕获物体，其中多个捕获物体的第二寡核苷酸的捕获序列包含寡聚dT序列(例如，(T)xVN序列或(T)xVI序列，其中X大于10、15、20、25或30)。

实施方案148.根据实施方案135至147中任一项所述的捕获物体，其中捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。

实施方案149.根据实施方案135至148中任一项所述的捕获物体，其中捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率为约1:1(例如，95:100至100:95)。

实施方案150.根据实施方案135至149中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含RNA，由RNA组成或基本上由RNA组成。

实施方案151.根据实施方案135至150中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含至少一个经修饰的碱基。

实施方案152.根据实施方案151所述的捕获物体，其中至少一个经修饰的碱基独立地包含2'-O-甲基碱基、O-甲氧基-乙基(MOE)碱基或锁核酸碱基。

实施方案153.根据实施方案135至152中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯键。

实施方案154.根据实施方案135至153中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸连接至捕获物体。

实施方案155.根据实施方案135至154中任一项所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸与捕获物体共价结合。

实施方案156.根据实施方案154所述的捕获物体，其中第一寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合连接至捕获物体。

实施方案157.根据实施方案135至156中任一项所述的捕获物体，其中第二寡核苷酸连接至捕获物体。

实施方案158.根据实施方案135至157中任一项所述的捕获物体，其中第二寡核苷酸与捕获物体共价结合。

实施方案159.根据实施方案157所述的捕获物体，其中第二寡核苷酸通过链霉亲和素-生物素结合连接至捕获物体。

实施方案160.根据实施方案135至159中任一项所述的捕获物体，其中一个或多个条形码化cDNA序列中的每一个条形码化cDNA序列均与捕获物体结合(例如，与一个或多个条形码化cDNA序列结合的捕获物体可通过实施方案39至116中的任一项所述的方法获得)。

实施方案161.多个捕获物体，其中多个捕获物体中的每个捕获物体均是根据实施方案135至160中任一项所述的捕获物体，其中多个捕获物体中的每个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列不同于具有不同标记的多个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列。

实施方案162.根据实施方案161所述的多个捕获物体，其中所述多个包括至少4种类型的捕获物体。

实施方案163.根据实施方案161所述的多个捕获物体，其中所述多个包括至少8种类型的捕获物体。

实施方案164.根据实施方案161所述的多个捕获物体，其中所述多个包括至少12种类型的捕获物体。

实施方案165.一种试剂盒，其包含根据实施方案161至164中任一项所述的多个捕获物体。

实施方案166.一种试剂盒，其包含(i)具有多个腔室的微流体装置，和(ii)根据实施方案161至164中任一项所述的多个捕获物体，每个捕获物体均具有多个第一和第二寡核苷酸。

实施方案167.根据实施方案165或166所述的试剂盒，其中多个捕获物体包括具有至少4个不同条形码(例如，至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000个或更多个不同的条形码)的捕获物体。

实施方案168.根据实施方案165至166中任一项所述的试剂盒，还包含逆转录酶、USER酶、裂解剂(例如，裂解缓冲液)、一种或多种表面条件化剂(例如，用于条件化芯片的内表面)，或其任何组合。

实施方案169.根据实施方案165至168中任一项所述的试剂盒，其中多个捕获物体在包含RNA酶抑制剂的溶液中。

实施方案170.根据实施方案169所述的试剂盒，其中RNA酶抑制剂为化学碱基RNA酶抑制剂。

实施方案171.根据实施方案165至170中任一项所述的试剂盒，其中多个捕获物体在约4℃的温度下储存。

实施方案172.一种将微物体引入微流体装置的腔室中的方法，包括：将一个或多个微物体引入微流体装置的流动区域中；确定一个或多个微物体的活力情况；从一个或多个微物体中选择至少一个具有活力的微物体；以及将该至少一个微物体引入微流体装置的腔室中。

实施方案173.根据实施方案172所述的方法，其中将该至少一个微物体引入腔室中包括使用DEP力。

实施方案174.根据实施方案172或173所述的方法，其中确定活力情况包括使用机器学习算法为一个或多个微物体中的每一个分配活力概率。

实施方案175.根据实施方案174所述的方法，其中机器学习算法包括经训练的机器学习算法，其中训练机器学习算法包括对包含区分活力情况的标记的微物体成像。

实施方案176.根据实施方案175所述的方法，其中包含区分活力的标记的微物体是与一个或多个微物体相同类型的细胞。

实施方案177.根据实施方案175或176所述的方法，其中标记包含活/死染色剂，所述活/死染色剂包含钙黄绿素、zombie violet染色剂、膜联蛋白、吖啶橙、碘化丙啶或其任何组合。

实施方案178.根据实施方案175至177中任一项所述的方法，其中训练还包括在明场条件下对包含标记的微物体进行成像。

实施方案179.根据实施方案172至178中任一项所述的方法，其中一个或多个微物体包括多个微物体并且被引入腔室的至少一个微物体包括多个微物体的子集。

实施方案180.根据实施方案172-179中任一项所述的方法，其中腔室包括隔离坞。

实施方案181.一种从自生物微物体或其克隆群体获得的核酸的序列片段组装序列的方法，包括：获得多个序列片段，其中多个序列片段的子集来源于从生物微物体或其克隆种群获得的核酸；

将序列片段的子集与参考序列进行比对；

根据序列片段子集的每个序列片段与参考序列之间的比对，确定序列片段子集的每个序列片段的每个碱基与参考序列的每个对应碱基之间的匹配频率；以及

通过在构建的序列的每个位置选择匹配频率最高的碱基构建序列。

实施方案182.根据实施方案181所述的方法，还包括根据序列片段子集的每个序列片段与参考序列之间的比对，确定序列片段子集的每个序列片段的每个碱基与参考序列的每个对应碱基之间的错配频率。

实施方案183.根据实施方案181或182所述的方法，还包括根据序列片段子集的每个序列片段与参考序列之间的比对，确定更替和相应的更替频率；其中更替包括插入和/或缺失。

实施方案184.根据实施方案183所述的方法，其中构建序列包括基于更替修饰构建的序列。

实施方案185.根据实施方案184所述的方法，其中更替包括插入；并且其中构建的序列通过插入被修饰，条件是用于插入的更替频率至少是插入之前(例如，紧接5')的碱基和插入之后(例如，紧接3')的碱基的频率值的一半。

实施方案186.根据实施方案184或185所述的方法，其中更替包括缺失；并且其中构建的序列通过缺失被修饰，条件是缺失的更替频率大于被该缺失移除的任何碱基的频率。

实施方案187.根据实施方案181至186中任一项所述的方法，其中参考序列包括多个参考序列。

实施方案188.根据实施方案181至187中任一项所述的方法，其中序列片段的子集来源于抗体的重链；并且进一步地，其中重链序列片段的子集包含多个重链V等位基因序列片段、多个重链D等位基因序列片段和多个重链J等位基因序列片段。

实施方案189.根据实施方案188所述的方法，其中将多个重链序列片段与参考序列进行比对进一步包括：

将序列片段的子集与重链V参考序列集中的每一个进行比对，从而识别一个或多个观察到的重链V等位基因序列，以及

将序列片段的子集与重链J参考序列集中的每一个进行比对，从而识别一个或多个观察到的重链J等位基因序列。

实施方案190.根据实施方案189所述的方法，其中重链V参考序列集包含多于一个不同的重链V参考序列。

实施方案191.根据实施方案189或190所述的方法，其中重链J参考序列集包含多于一个不同的重链J参考序列。

实施方案192.根据实施方案189至191中任一项所述的方法，还包括创建重链CDR3参考序列集；其中重链CDR3参考序列集包含至少一个扩展的重链CDR3序列区域；并且进一步地，其中至少一个扩展的重链CDR3序列区域中的每一个均包含以下组合：

来源于一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的一个的重链V等位基因末端序列(例如，3’端序列)；

多个重链D等位基因序列片段中的一个；和

来源于一个或多个观察到的重链J等位基因序列中的一个的重链J等位基因起始序列(例如，5'起始序列)；其中组合序列在每个序列中以V等位基因、D等位基因、J等位基因的顺序提供，并且任选地，其中重链CDR3参考序列集包含前述重链V等位基因末端序列、多个重链D等位基因序列片段和重链J等位基因起始序列的多个(例如，2、3、4、5或更多个，10或更多个、15或更多个、20或更多个或所有可能的)组合。

实施方案193.根据实施方案192所述的方法，其中重链V等位基因末端序列包含一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的一个的至少最后10个(或15个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个)碱基；并且其中重链J等位基因起始序列包含一个或多个观察到的重链J等位基因序列中的一个的至少前10个(或15个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个)碱基。

实施方案194.根据实施方案192至193中任一项所述的方法，其中将多个序列片段与参考序列进行比对包括：将多个序列片段与重链CDR3参考序列集的每个序列进行比对；并且构建序列包括组装观察到的扩展的重链CDR3序列集。

实施方案195.根据实施方案194所述的方法，进一步包括组装可能的全长可变重链序列，包括：

将一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的每一个与观察到的扩展的重链CDR3序列集中的每一个进行比对，从而识别出一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的一个，该序列包含与观察到的扩展的重链CDR3序列集中的一个的5'端序列最强重叠的3'末端序列；

将一个或多个观察到的重链J等位基因序列中的每一个与观察到的扩展的重链CDR3序列集中的每一个进行比对，从而识别出一个或多个观察到的重链J等位基因序列中的一个，该序列包含与观察到的扩展的重链CDR3序列集中的一个的3'端序列最强重叠的5'末端序列；以及

根据最强重叠的序列，从所识别的一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的一个、所识别的一个或多个观察到的重链J等位基因序列中的一个和用于此类识别的观察到的扩展的重链CDR3序列集中的一个构建可能的全长可变重链序列。

实施方案196.根据实施方案181至195中任一项所述的方法，其中序列片段子集来源于抗体的轻链，并且其中序列片段子集包含多个轻链V等位基因序列片段，和多个轻链J等位基因序列片段。

实施方案197.根据实施方案196所述的方法，其中将轻链序列片段子集与参考序列进行比对还包括：

将序列片段子集与轻链V参考序列集中的每一个进行比对，从而识别一个或多个观察到的轻链V等位基因序列，以及

将多个序列片段与轻链J参考序列集中的每一个进行比对，从而识别一个或多个观察到的轻链J等位基因序列。

实施方案198.根据实施方案197所述的方法，其中轻链V参考序列集包含多于一个不同的轻链V参考序列。

实施方案199.根据实施方案197或198所述的方法，其中轻链J参考序列集包含多于一个不同的轻链J参考序列。

实施方案200.根据实施方案196至199中任一项所述的方法，还包括创建轻链CDR3参考序列集；其中轻链CDR3参考序列集包含至少一个扩展的轻链CDR3序列区域；并且进一步地，其中至少一个扩展的轻链CDR3序列区域中的每一个均包含以下的组合：

来源于一个或多个观察到的轻链V等位基因序列中的一个的轻链V等位基因末端序列(例如，3’末端序列)；以及

来源于一个或多个观察到的轻链J等位基因序列中的一个的轻链J等位基因起始序列(例如，5’起始序列)；其中组合序列在每个序列中以V等位基因、J等位基因的顺序提供，并且任选地，其中轻链CDR3参考序列集包含前述轻链V等位基因末端序列和轻链J等位基因起始序列的多个(例如，2、3、4、5或更多个、10或更多个、15或更多个、20或更多个或所有可能的)组合。

实施方案201.根据实施方案200所述的方法，其中轻链V等位基因末端序列包含多个观察到的轻链V等位基因序列中的一个的至少最后10个(或15个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个)碱基；并且其中轻链J等位基因起始序列包含一个或多个观察到的轻链J等位基因序列中的一个的至少前10个(或15个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个)碱基。

实施方案202.根据实施方案200至201中任一项所述的方法，其中将多个序列片段与参考序列进行比对包括：将多个序列片段与轻链CDR3参考序列集的每一个序列进行比对；并且构建序列包括组装观察到的扩展的轻链CDR3序列集。

实施方案203.根据实施方案202所述的方法，进一步包括：组装可能的全长可变轻链序列，包括：

将一个或多个观察到的轻链V等位基因序列中的每一个与观察到的扩展的轻链CDR3序列集的每个序列进行比对，从而识别一个或多个观察到的重链V等位基因序列中的一个，该序列包含与观察到的扩展的轻链CDR3序列中的一个的5'端序列最强重叠的3'末端序列；

将一个或多个观察到的轻链J等位基因序列中的每一个与观察到的扩展的轻链CDR3序列的每个序列进行比对，从而识别一个或多个观察到的轻链J等位基因序列中的一个，该序列包含与观察到的扩展的轻链CDR3序列中的一个的3'端序列最强重叠的5'末端序列；以及

根据最强重叠序列，从所识别的一个或多个观察到的轻链V等位基因序列中的一个、所识别的一个或多个观察到的轻链J等位基因序列中的一个以及用于此类识别的观察到的扩展的轻链CDR3序列集中的一个构建可能的全长可变轻链序列。

实施方案204.根据实施方案203所述的方法，还包括通过获得组合参考集构建从生物微物体或其克隆群体获得的核酸的可能的重链和轻链序列，包括可能的全长可变重链序列和可能的全长可变轻链序列。

XV.序列的描述

表8提供了本文提及的某些序列的列表。

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/>

/>

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*＝PS连接；m＝2'-O-甲基。

序列表

<110> 伯克利之光生命科技公司（Berkeley Lights, Inc.）

<120> 测定生物细胞的方法

<130> 01149-0018-00PCT

<150> US 63/080,960

<151> 2020-09-21

<150> US 63/075,269

<151> 2020-09-07

<150> US 63/211,337

<151> 2021-06-16

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 1

tggtaggctg 10

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 2

gttagctgct 10

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 3

tacataaaga 10

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 4

agccctatca 10

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 5

acctaccgcc 10

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 6

tctccaagac 10

<210> 7

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 7

gtatacatta 10

<210> 8

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 8

agactcgatt 10

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 9

ccaggattaa 10

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 10

ctccttcaag 10

<210> 11

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 11

actacttctg 10

<210> 12

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码

<400> 12

gccttgttgt 10

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 13

cttccgatct tggtaggctg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 14

cttccgatct gttagctgct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 15

cttccgatct tacataaaga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 16

cttccgatct agccctatca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 17

cttccgatct acctaccgcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 18

cttccgatct tctccaagac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 19

cttccgatct gtatacatta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 20

cttccgatct agactcgatt 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 21

cttccgatct ccaggattaa 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 22

cttccgatct ctccttcaag 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 23

cttccgatct actacttctg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性多路分配正向引物

<400> 24

cttccgatct gccttgttgt 20

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 25

ctcacacgac gctcttccga tcttggtagg ctg 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 26

ctcacacgac gctcttccga tctgttagct gct 33

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 27

ctcacacgac gctcttccga tcttacataa aga 33

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 28

ctcacacgac gctcttccga tctagcccta tca 33

<210> 29

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 29

ctcacacgac gctcttccga tctacctacc gcc 33

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 30

ctcacacgac gctcttccga tcttctccaa gac 33

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 31

ctcacacgac gctcttccga tctgtataca tta 33

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 32

ctcacacgac gctcttccga tctagactcg att 33

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 33

ctcacacgac gctcttccga tctccaggat taa 33

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 34

ctcacacgac gctcttccga tctctccttc aag 33

<210> 35

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 35

ctcacacgac gctcttccga tctactactt ctg 33

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 36

ctcacacgac gctcttccga tctgccttgt tgt 33

<210> 37

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 37

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatcttg gtaggctggg 60

g 61

<210> 38

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 38

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctgt tagctgctgg 60

g 61

<210> 39

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 39

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctta cataaagagg 60

g 61

<210> 40

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 40

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctag ccctatcagg 60

g 61

<210> 41

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 41

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctac ctaccgccgg 60

g 61

<210> 42

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 42

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatcttc tccaagacgg 60

g 61

<210> 43

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 43

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctgt atacattagg 60

g 61

<210> 44

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 44

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctag actcgattgg 60

g 61

<210> 45

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 45

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctcc aggattaagg 60

g 61

<210> 46

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 46

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctct ccttcaaggg 60

g 61

<210> 47

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 47

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctac tacttctggg 60

g 61

<210> 48

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性第一寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是52-Bio

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n是u

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> 2'-O-Me

<220>

<221> modified_base

<222> (59)..(61)

<223> PS连接

<400> 48

ntatatannn gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctgc cttgttgtgg 60

g 61

<210> 49

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 包含捕获序列的示例性第二寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n是5Biosg

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> n是肌苷

<400> 49

naagcagtgg tatcaacgca gagtactttt tttttttttt tttttttttt ttttttvn 58

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性引发序列

<400> 50

aagcagtggt atcaacgcag agtac 25

<210> 51

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性引发序列

<400> 51

acactctttc cctacacgac gctcttccga tc 32

<210> 52

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性引发序列

<400> 52

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acga 44

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性引发序列

<400> 53

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性重链恒定区反向引物

<400> 54

acagtcactg agctgct 17

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性轻链恒定区反向引物

<400> 55

gactgaggca cctccagatg 20

<210> 56

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> Not1限制性位点序列

<400> 56

gcggccgc 8

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性条形码特异性引物

<400> 57

cttccgatct tggtaggctg 20

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性cDNA序列

<400> 58

acacgacgct cttccgatct tggtaggctg 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性cDNA序列

<400> 59

cagcctacca agatcggaag agcgtcgtgt 30

<210> 60

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性TAP适配引物

<400> 60

agagtacacg acgctcttcc gatcttggta ggctg 35

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性cDNA序列

<400> 61

ctcttccgat cttggtaggc tg 22

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性cDNA序列

<400> 62

cagcctacca agatcggaag ag 22

<210> 63

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性TAP主链

<400> 63

tatatatttg tggtatcaac gcagagtaca cgacgctctt ccgatct 47

<210> 64

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial序列）

<220>

<223> 示例性cDNA序列

<400> 64

tctcatgtgc tgcgagaagg ctagaaccat ccgac 35

Claims (51)

1.一种测定第一分子和第二分子之间特异性结合相互作用的抑制的方法，其中所述方法在具有腔室的微流体装置内进行，所述方法包括：

将微物体引入微流体装置的腔室中，其中所述微物体包含多个第一分子；

将细胞引入腔室中，其中所述细胞能够产生目标分子；

在微物体的存在下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在腔室中孵育细胞；

在腔室中孵育细胞后，将第二分子引入腔室中，其中所述第二分子与可检测标记结合；以及

监测第二分子在微物体上的积累，

其中第二分子在微物体上的积累不存在或减少表明所述目标分子抑制第一分子与第二分子的结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子与微物体上的第一分子结合，从而抑制第二分子与微物体的结合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子与第二分子结合，从而抑制第二分子与微物体上的第一分子的结合。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述第一分子是受体分子，并且其中所述第二分子是与所述受体分子特异性结合的配体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受体分子是蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受体是生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、粘附受体、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)或任何前述受体的保留其各自全长生物分子活性的片段。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体是蛋白。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体是生长因子、细胞因子、趋化因子、粘附配体、离子通道配体、GPCR配体、病毒蛋白(例如，病毒融合蛋白)或任何前述配体的保留其各自全长生物分子活性的片段。

9.根据权利要求1所述的方法，其中包含多个第一分子的微物体是细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标分子是抗体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中能够产生目标分子的细胞是抗体产生细胞(APC)。

12.根据权利要求1所述的方法，其中将所述微物体选择性地引入腔室中。

13.根据权利要求1所述的方法，其中将微物体引入腔室中包括基于检测所述微物体的活力情况来选择性地引入所述微物体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中检测活力情况件还包括使用机器学习算法为所述微物体分配活力概率。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室是微孔或隔离坞。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室包括约200pL至约10nL的体积。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述微流体装置包括多个腔室，并且其中所述方法还包括：

将微物体引入所述多个腔室的每个腔室中，其中所述微物体包含多个第一分子；

将细胞引入所述多个腔室中的每个腔室中，其中所述细胞能够产生目标分子；

在微物体的存在下，以及在有利于目标分子的产生和分泌的条件下，在所述多个腔室中孵育细胞；

在所述多个腔室中孵育细胞后，将第二分子引入所述多个腔室的每个腔室中，其中所述第二分子与可检测标记结合；以及

监测所述第二分子在微物体上的积累。

18.根据权利要求1所述的方法，其中监测所述第二分子在每个微物体上的积累包括将所述积累与在目标阳性对照分子和/或目标阴性对照分子的存在下观察到的积累进行比较。

19.一种从生物细胞提供一个或多个条形码化cDNA序列的方法，包括：

在腔室内提供生物细胞；

在腔室中提供捕获物体，所述捕获物体包含标记、多个第一寡核苷酸和多个第二寡核苷酸，

其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列和在每个第一寡核苷酸的3'端均包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，

其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列，

裂解所述生物细胞并允许从裂解的生物细胞释放的RNA被所述多个第二寡核苷酸的捕获序列捕获，从而形成捕获的RNA；以及

反转录捕获的RNA，从而产生一个或多个条形码化cDNA序列，每个条形码化cDNA序列均包含与捕获的RNA的相应一个互补并共价连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列的寡核苷酸序列。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述腔室包括微流体装置的微孔或隔离坞。

21.根据权利要求19所述的方法，其中在所述腔室中提供单个捕获物体。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获序列结合RNA并由此捕获RNA并引发捕获的RNA的转录。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，还包括在捕获物体位于腔室内时识别所述多个第一寡核苷酸的条形码序列。

24.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含所述条形码序列5'的一个或多个尿苷核苷酸。

25.根据权利要求19所述的方法，其中逆转录捕获的RNA是在切割含有一个或多个尿苷核苷酸的序列的酶的存在下进行的。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。

27.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一寡核苷酸连接至所述捕获物体。

28.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二寡核苷酸连接至所述捕获物体。

29.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个条形码化cDNA序列中的每一个均与所述捕获物体结合。

30.根据权利要求19所述的方法，还包括从所述腔室中导出捕获物体。

31.根据权利要求19所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供多个条形码化cDNA序列，所述多个条形码化cDNA序列中的每一个均编码目标蛋白，所述目标蛋白对应于多种不同蛋白中的任何一种，所述条形码化cDNA序列连接至相应的反向互补条形码序列；并且该方法还包括：

使用条形码特异性正向引物和对目标蛋白特异的反向引物选择性地扩增所述多个条形码化cDNA序列(或扩增的cDNA序列)，以产生编码目标蛋白或其片段的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；

将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的5'端退火到用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段的5'相应末端以产生退火的TAP产物；以及

使用TAP适配引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物，以产生用于表达目标蛋白的构建体。

32.根据权利要求19所述的方法，其中提供一个或多个条形码化cDNA序列包括提供多个条形码化cDNA序列，所述多个条形码化cDNA序列中的每个条形码化cDNA序列均编码对应于多种不同抗体中的任何一种的重链或轻链序列，连接至相应的反向互补条形码序列；该方法还包括：

使用条形码特异性正向引物和靶向相应恒定区序列的保守部分的反向引物选择性扩增多个条形码化cDNA序列，以产生编码条形码特异性可变区的扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)；

将扩增的cDNA产物(或进一步扩增的cDNA产物)的末端退火到用于TAP的DNA片段的相应末端以产生退火的TAP产物；以及

使用TAP适配引物通过重叠延伸PCR扩增退火的TAP产物，以产生用于表达抗体重链或轻链的表达构建体。

33.一种制备用于表达抗体的构建体的方法，包括：

提供通过权利要求19-32中任一项所述的方法产生的条形码化cDNA序列，其中所述条形码化cDNA序列包含编码抗体或其片段的重链或轻链的核酸，所述核酸连接至第一寡核苷酸的条形码序列的反向互补序列；

使用条形码特异性引物和对编码抗体重链或轻链的核酸特异的引物扩增条形码化cDNA序列的至少一部分，从而产生扩增的cDNA产物；

提供用于转录活性PCR(TAP)的DNA片段，所述DNA片段包含：

启动子序列，

与编码重链或轻链序列的核酸的5'端互补的核酸序列，

与编码重链或轻链序列的核酸的3'端互补的核酸序列，

重链或轻链链恒定结构域序列，和

终止序列；

将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中，从而产生用于表达包含可变结构域和恒定结构域的抗体的重链或轻链的构建体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中用于TAP的DNA片段包含相应可变区3'的编码重链或轻链恒定结构域序列的抗体序列。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中将扩增的cDNA产物引入用于TAP的DNA片段中包括将编码可变区的扩增的cDNA产物于启动子序列3'和编码重链或轻链恒定结构域序列5'引入DNA片段中。

36.根据权利要求33所述的方法，其中通过使用重叠延伸PCR将扩增的条形码化cDNA序列引入用于TAP的DNA片段中。

37.一种捕获物体，其包含标记、多个第一和第二寡核苷酸，其中多个第一寡核苷酸中的每个第一寡核苷酸均包含条形码序列，以及在每个第一寡核苷酸的3'端均包含至少三个连续鸟嘌呤核苷酸的序列，并且其中多个第二寡核苷酸中的每个第二寡核苷酸均包含捕获序列；其中第一寡核苷酸包含对应于第一引物序列的第一引发序列和/或其中第二寡核苷酸包含对应于第二引物序列的第二引发序列；其中第一寡核苷酸的条形码序列对应于捕获物体的标记。

38.根据权利要求37所述的捕获物体，其中第一引物序列和第二引物序列是相同的。

39.根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述标记是捕获物体的组成颜色。

40.根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率范围为1:10至10:1。

41.根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述捕获物体上的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸的比率为约1:1。

42.根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述第一寡核苷酸连接至捕获物体。

43.根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述第二寡核苷酸连接至捕获物体。

44.多个捕获物体，其中所述多个捕获物体中的每个捕获物体均是根据权利要求37所述的捕获物体，其中所述多个捕获物体的每个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列不同于具有不同标记的多个捕获物体的第一寡核苷酸的条形码序列。

45.一种将微物体引入微流体装置的腔室中的方法，包括：

将一个或多个微物体引入微流体装置的流动区域中；

确定所述一个或多个微物体的活力情况；

从所述一个或多个微物体选择具有活力的至少一个微物体；以及

将所述至少一个微物体引入微流体装置的腔室中。

46.根据权利要求45所述的方法，其中将所述至少一个微物体引入腔室中包括使用DEP力。

47.根据权利要求45或46所述的方法，其中确定活力情况包括使用机器学习算法为所述一个或多个微物体中的每一个分配活力概率。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述机器学习算法包括经训练的机器学习算法，其中训练所述机器学习算法包括对包含区分活力情况的标记的微物体进行成像。

49.根据权利要求48所述的方法，其中包含区分活力的标记的微物体是与所述一个或多个微物体相同类型的细胞。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述标记包含活/死染色剂，所述活/死染色剂包含钙黄绿素、zombie violet染色剂、膜联蛋白、吖啶橙、碘化丙啶，或其任何组合。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述训练还包括在明场条件下对包含所述标记的微物体进行成像。