JP4574707B2 - 細胞分取及び培養方法とその装置 - Google Patents
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Description
(1)比重の違いで細胞を分離する方法、
(2)蛍光標識抗体で染色した情報あるいは目視の情報による方法、
(3)セルソーターによる方法。
いずれの方法も細胞懸濁液から目的の細胞を分離することができ、目的に応じて使用されている。
(1)複数の細胞を含む溶液を保持でき、所定の大きさの細胞ないし細胞塊が通過するにふさわしい先端開口径を持つピペットと、
前記ピペット先端の細胞を観察する手段と、
前記ピペット先端部に細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する手段と、
前記液滴内に所定の細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを判断する手段と、
を備え、前記ピペット先端部に形成された前記液滴を基板上の所定の位置に滴下し並べることを特徴とする細胞分取装置。
(2)所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段と、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列するための基板と、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層からなることを特徴とする細胞培養システム。
(3)所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列する基板、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層、前記基板上の液滴の溶媒を交換する手段、前記細胞の培養中に前記液滴の温度をコントロールする手段、前記基板上にアレー状に配した液滴中の細胞を観察する手段、所定時間培養した後前記細胞を回収する手段からなることを特徴とする細胞培養システム。
(4)所定の大きさを持つ基板の一面を疎水性の領域にするとともに該疎水性の領域に所定の間隔で独立した複数の親水性の領域を形成した基板、前記複数の親水性の領域を囲う基板上に形成された壁とよりなるとともに、前記親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列し、かつ、前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層で覆ったことを特徴とする細胞培養チップ。
(5)前記溶媒層を先に設けた後、前記基板の複数の親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列した上記(4)記載の細胞培養チップ。
(6)前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する上記(1)記載の細胞分取装置。
(7)前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する上記(2)または(3)記載の細胞培養システム。
(8)前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された上記(6)記載の細胞分取装置。
(9)前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された上記(7)記載の細胞培養システム。
本発明では、所定の数の細胞または細胞塊を、細胞培養チップの所定の位置に配置できるように、細胞培養チップの表面に親水領域を所定の間隔で独立して形成する。この親水領域に対して、細胞の懸濁液を吸い上げたピペット先端から必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴として滴下させる。この際、ピペット先端を光学系でモニターして液滴の大きさおよび細胞数を監視して、制御する。
図1(a)は、実施例1に好適な細胞培養チップ100の平面図、(b)は平面図のA−A位置で矢印方向に見たときの断面図である。1はシリコン基板であり、例えば、その厚さは1mm、大きさは20mm×20mmである。2は壁であり、シリコン基板で製作され、その厚さは、例えば、1mm、高さは0.5mmである。壁2で囲われた領域は疎水性領域3とされ、そのなかに、親水性領域4が周期的に配列される。親水性領域4の大きさは、この領域の一つに収容する細胞の大きさあるいは数によって決定されるが、400μm×400μm程度である。親水性領域4の間隔は、細胞を含む液滴が、お互いが接触して混ざらないだけの間隔とするが、取り扱いの便を考えると、2000から4000μm程度が良い。5は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板1の一面に形成される。
図2(a)は、細胞培養チップ100に細胞を分配する実施例2のシステム構成を説明する概念図、図2(b)は、細胞培養チップ100の親水性領域4に細胞が分配された結果を示す断面図である。
より長時間、細胞をインキュベーションして観察できるようにするには、酸素透過性を確保するだけでは不十分で、細胞12を包み込んでいる液滴15を新しい培養液に交換する必要がある。
所定時間、細胞をインキュベーションし、モニター25による観察が終了し、所定の細胞のみを回収する操作について説明する。
図5(a)は、本発明の実施に好適な実施例5の細胞培養チップ100の他の構成例を示す平面図、図5(b)は平面図のA−A位置で矢印方向に見たときの断面図、図5(c)は、液滴の形成法を説明する図である。図5(a)と図1(a)とを対比して明らかなように、実施例5の細胞培養チップ100は、実施例1のそれと同じ平面構造である。また、材料、サイズ、製法も同様である。実施例5の細胞培養チップ100の断面構造は、実施例1のそれとは異なる。すなわち、壁2で囲われた領域は疎水性領域3とされ、そのなかに、親水性領域4が周期的に配列される点では変わらないが、親水性領域4がウェルとして形成されている。この大きさは、直径400μm(あるいは400μm×400μm)で深さ100μmとする。
上述の実施例では、いずれも、一つのピペットは、一つの機能を持つものとして説明されているが、実施例6では、一つのピペットに、二つの機能を持たせた例について説明する。
上述したいずれの実施例でも、基板1の下面には細胞をインキュベーションする場合の基板温度をコントロールする手段22が存在する。基本的に細胞を顕微鏡で観察しながらのインキュベーションとなるので、基板1そのものは透明である必要がある。温度をコントロールするヒーター22も透明である必要があり、ITO素子を用いるのが良い。ITO素子としない場合は、例えば、透明な循環液が内部を温調した溶液が流れている構造のものを使用しても良い。この場合は、モニター25の光学系に制約が生ずることがあるが長焦点対物レンズを用いれば解決する。
Claims (6)
- 所定の数の細胞が通過するのを許す先端部の直径を有するピペットを含む、所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段と、
前記ピペットに連結されたシリンジポンプおよびその駆動装置を含む、前記液滴のサイズをコントロールする手段と、
細胞培養チップであって、
前記液滴を基板上にアレー状に配列するための基板と、
前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ液滴と混ざらない溶媒層とを含む、細胞培養チップと
を含むことを特徴とする細胞培養システム。 - 所定の数の細胞が通過するのを許す先端部の直径を有するピペットを含む、所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段と、
前記ピペットに連結されたシリンジポンプおよびその駆動装置を含む、前記液滴のサイズをコントロールする手段と、
細胞培養チップであって、
前記液滴を基板上にアレー状に配列する基板、
前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ液滴の溶媒と混ざらない溶媒層とを含む、細胞培養チップと、
前記基板上の液滴の溶媒を交換する手段と、
前記細胞の培養中に前記液滴の温度をコントロールする手段と、
前記基板上にアレー状に配した液滴中の細胞を観察する手段と、
所定時間培養した後前記細胞を回収する手段と
を含むことを特徴とする細胞培養システム。 - 前記細胞培養チップが、
所定の大きさを持つ基板の一面を疎水性の領域にするとともに該疎水性の領域に所定の間隔で独立した複数の親水性の領域を形成した基板と、
前記複数の親水性の領域を囲う基板上に形成された壁とよりなるとともに、
前記親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列し、かつ、前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ液滴の溶媒と混ざらない溶媒層で覆われていることを特徴とする、請求項1または2に記載の細胞培養システム。 - 前記細胞培養チップが、前記溶媒層を先に設けた後、前記基板の複数の親水性の領域に配列された所定の液滴に包含された細胞を含む、請求項3記載の細胞培養システム。
- 前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する請求項1〜4のいずれか記載の細胞培養システム。
- 前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された請求項5記載の細胞培養システム。
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