JP2020014461A - 粒子懸濁液から単粒子を分離する装置及び方法 - Google Patents

粒子懸濁液から単粒子を分離する装置及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】改善した粒子分離装置を提供する。【解決手段】懸濁液試料から粒子を分離するための粒子分離装置１００は、キャリア基板２０から懸濁液試料を回収するため、及びターゲット基板３０に液滴を分注するための、液滴ディスペンサ装置１０と、液滴ディスペンサ装置１０の中に希釈液を充填するために、且つ懸濁液試料の第１の部分を液滴ディスペンサ装置１０の中に吸引するために液滴ディスペンサ装置１０に結合される、機械式ポンプ装置４０と、液滴ディスペンサ装置１０に結合され、液滴ディスペンサ装置１０の中に懸濁液試料の第２の部分を吸引するように構成される、サイフォンポンプ装置５０とを備える。好ましくは、液滴ディスペンサ装置１０は、ターゲット基板３０に単粒子の液滴を分注するように適合される。さらに、懸濁液試料から粒子を分離する方法が説明される。【選択図】図１

Description

本発明は、粒子分離装置に関し、粒子、具体的には生体細胞、細胞凝集体、細胞成分、又は生物高分子を粒子懸濁液試料から分離するように構成される。さらに、本発明は、粒子懸濁液試料から粒子を分離する方法に関する。本発明の用途は、具体的には、例えば、培養又は分子解析の目的のために単一の生体細胞、又は細胞亜集団を処理及び回収するための、生体試料などの粒子懸濁液処理の分野で使用可能である。
生化学及び生物医学の分野において、例えば、血液試料中の特定の細胞を識別するために、細胞周辺領域（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌｓ）のより大きい集団内で希少細胞を識別することに関心が寄せられており、これは（腫瘍細胞などの）疾患を示し、或いは別の細胞処理に有用である。一般に、細胞懸濁液など細胞混合物中の細胞の識別は、細胞を互いに分離する第１のステップと、単一細胞を解析する第２のステップとを含む。
細胞を分離する一般的な方法は、既存の液的スポット法に基づき、懸濁液滴を取り扱うための液滴ディスペンサが使用される。細胞懸濁液の液滴は、ウェル構造から液滴ディスペンサの中に吸引され、その結果、液滴ディスペンサ内の緩衝液の希釈が得られる。その後、単一細胞を含む液滴は、その後の単一細胞の解析及び別の処理用に、ターゲット上に堆積される。しかしながら、不利な点として、このような技法は細胞回収率が低く、例えば、５％〜６０％の範囲内であり、少数細胞系（ｐａｕｃｉｃｅｌｌｕｌａｒ）生体試料を扱う技法としては実用性に欠ける。例えば、１ｍｌあたり１０００未満の細胞を含む細胞懸濁液から単一細胞を分離するためには、９０％を上回る回収率が必要とされる。欧州特許出願公開第３３２３８７７号明細書、及び米国特許出願公開第２００２／００１６７５号明細書は、液滴分注法を開示しており、リザーバから液滴ディスペンサに液体を送出するのにサイフォンポンプの吸引動作が使用される。しかしながら、このような従来の構成では、回収率を上げることはできない。
スポット法の代替として、希少細胞の分離及び解析用にマイクロ流体システムが使用されている。生体細胞を含む液体懸濁液は、マイクロ流体システムを通って流れ、懸濁液が狭い流路を通って流れ、個々の細胞の列を形成することによって、細胞は互いに分離される。その後、単一細胞は、細胞バイオマーカ、特定の物理特性、又は誘電特性の発生に応じて解析され分類される。希少細胞分離のためのマイクロ流体法の概要は、Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」，２０１４，１４（４），６２６−６４５に記載されている。開流路マイクロ流体チップを使用したマイクロ流体法の具体例は、Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．「ＰＬＯＳ Ｏｎｅ」，２０１７，１２（４），ｅ０１７４９３７に記載されている。
マイクロ流体法は、細胞の損失が最小化されるため、回収率が高いという利点がある。しかしながら、マイクロ流体システムの流路内での細胞の取り扱いが細胞を変化させる可能性があることから、不都合が生じる。さらに、マイクロ流体システムは複雑な装置であり、流体力学的シグネチャ（大きさ、密度、又は変形性）、誘電泳動シグネチャ（特定の膜性能）、免疫化学シグネチャ（特定の抗体）、或いは磁気泳動シグネチャ（磁化率又は磁性ナノ粒子との免疫特異的接着）などの特定の細胞シグネチャを検出できなければならない。マイクロ流体システムは、限定的な方法でのみ、使用可能な液滴処理法と一体化され得る。
上述した従来技術の制限は、単一細胞の分離に関して生じるだけでなく、他の種類の生物学的粒子、又は環境調査などにおける非生物学的粒子の分離など他の粒子分離技術においても同様に生じる。
欧州特許出願公開第３３２３８７７号明細書 米国特許出願公開第２００２／００１６７５号明細書
Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」，２０１４，１４（４），６２６−６４５ Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．「ＰＬＯＳ Ｏｎｅ」，２０１７，１２（４），ｅ０１７４９３７
本発明の目的は、改善した粒子分離装置を提供することであり、従来技術の欠点及び制限を回避しながら、懸濁液試料から粒子を分離することができる。具体的には、粒子分離装置は、向上した回収率、高いスループット能力、及び／又は使用可能な液滴処理法と容易に統合できることとともに、粒子を分離することが可能になる。さらに、本発明の目的は、従来技術の欠点及び制限を回避しながら懸濁液試料から粒子を分離する、改善された方法を提供することである。
上述の目的は、粒子分離装置、及び懸濁液試料から粒子を分離する方法によってそれぞれ解決され、独立クレームの特徴を含む。好ましい実施形態の特徴、及び本発明の用途は、従属クレームで定義される。
本発明の第１の一般的な態様によれば、上述の目的は粒子分離装置によって解決され、液滴ディスペンサ装置と、機械式ポンプ装置及びサイフォンポンプ装置との組み合わせを含む。液滴ディスペンサ装置は、少なくとも１つの圧電液滴ディスペンサなどの、少なくとも１つの液滴ディスペンサを備える。液滴ディスペンサ装置は、懸濁液試料をキャリア基板から回収して、液滴をターゲット基板に分注するように構成される。懸濁液試料は、生体細胞などの複数の粒子を含む、ある量の液体を含んでもよい。懸濁液試料は、キャリア基板表面の液滴として、或いはキャリア基板の３Ｄウェルなどの、区画の内容物として供給され得る。液滴ディスペンサ装置は、負圧の効果によって、好ましくは少なくとも１つの液滴ディスペンサの液滴ディスペンサ先端を通して、少なくとも１つの液滴ディスペンサの中に、懸濁液試料を回収するように適合される。負圧は、機械式ポンプ装置、又はサイフォンポンプ装置によって印加される。
機械式ポンプ装置は、好ましくは上部液滴ディスペンサ接合部を介して、液滴ディスペンサ装置に結合される。機械式ポンプ装置は、非圧縮性の希釈液、即ち緩衝液などを、液滴ディスペンサ装置の中に充填するように適合される。さらに、機械式ポンプ装置は、負圧の効果によって、懸濁液試料の第１の部分を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するように適合される。機械式ポンプ装置は、任意のポンプ装置を備え、例えば、希釈液によって提供されるシステム液体内でピストンを動かすことによって、或いは蠕動ポンプによって、正圧又は負圧を生成することができる。機械式ポンプ装置は、希釈液、又は純水などの別の液体を含む、システム液体で動作される。
本発明によれば、更にサイフォンポンプ装置が、好ましくは少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部液滴ディスペンサ接合部で、液滴ディスペンサ装置に結合される。サイフォンポンプ装置は、負圧の効果によって、懸濁液試料の第２の部分を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するように構成される。サイフォンポンプ装置は、希釈液、又は純水などの別の液体を含む、システム液体で動作される。好ましくは、サイフォンポンプ装置、及び機械式ポンプ装置は、同じシステム液体を使用する。
本発明の第２の一般的な態様によれば、上述の目的は、懸濁液試料から粒子を分離する方法によって解決され、この方法は以下のステップを含む。分離方法の準備として、平坦な基板表面、又は３Ｄウェル構造の区画などのキャリア基板に懸濁液試料が供給される。さらに、希釈液、即ち緩衝液が、液滴ディスペンサ装置の少なくとも１つの液滴ディスペンサに充填される。懸濁液試料から単粒子を分離するために、懸濁液試料は、懸濁液試料が希釈液で希釈されるように、液滴ディスペンサ装置に充填される。希釈液での希釈は、２つの吸引段階を含む。第１の吸引段階では、懸濁液試料の第１の部分が、機械式ポンプ装置の動作によって、液滴ディスペンサ装置、具体的には少なくとも１つの液滴ディスペンサの中に引き込まれる。第２の吸引段階では、懸濁液試料の第２の部分、具体的には残留している懸濁液試料が、サイフォンポンプ装置の動作によって、液滴ディスペンサ装置、具体的には少なくとも液滴ディスペンサの中に吸引される。懸濁液試料を吸引することにより、少なくとも１つの液滴ディスペンサ内で懸濁液試料が希釈される。最後に、液滴ディスペンサ装置が、液滴をターゲット基板に分注するステップを含めて動作され得る。ターゲット基板は、キャリア基板の別の部分、又はキャリア基板から分離された別の基板を含んでもよい。希釈された懸濁液試料の液滴は、自由液滴として、平坦なターゲット基板表面上、又はターゲット基板の３Ｄウェルの中に分注される。液滴ディスペンサ装置は、ターゲット基板上に分注された液滴が、時間平均で１滴毎に１粒子未満を含むように動作される。言い換えれば、液滴ディスペンサ装置は、ターゲット基板上に分注された各液滴が１つの単粒子を含むか、又は粒子を含まないように制御される。１粒子より多く含む可能性がある液滴は、ターゲット基板上に分注されない。
主な利点として、液体を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するのにサイフォンポンプ装置を使用することによって、従来技術と比較して、分離している粒子の回収率を上げることができる。デッドボリューム、又は不完全な試料回収が排除されるため、９０％を上回る回収率が得られる。サイフォンポンプ装置は、液体懸濁液試料の残留部分がキャリア基板に存在する限り有効である。したがって、本発明の好適な実施形態によれば、懸濁液試料は、残留物のない方法でキャリア基板から回収され得る。さらなる利点として、本発明は、粒子の分離をハイスループットプロセスと一体化することができる。さらに、液滴ディスペンサ装置を使用することにより、本発明の技術を液滴の取り扱い技術、及び処理技術と組み合わせることに関して利点が得られる。
従来のマイクロ流体法に反して、粒子は特定のシグネチャによって分類されないが、液滴ディスペンサ内で懸濁液試料を希釈すること、及び単粒子液滴がターゲット基板に配置されるように液滴ディスペンサを動作することによって分類される。好適には、粒子分離は特定の粒子特徴の検出を必要とせず、その結果、粒子分離装置は、１つの懸濁液試料から、又は複数の異なる懸濁液試料から、異なる種類の粒子を分離するために使用され得る。
好ましくは、本発明の粒子分離装置の液滴ディスペンサ装置は、単粒子液滴分注動作に適合される。液滴ディスペンサは、液滴が最大でも１つの粒子を含む場合にのみ、液滴をターゲット基板上に分注するように動作され得るように構成される。この目的のために、液滴ディスペンサ装置は、好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサ内の粒子分布を監視するために配置されるカメラ装置と、カメラ装置の出力信号に応じて分注動作を制御するように適合される、ディスペンサ制御装置と組み合わされる。好ましくは、単粒子分注は、米国特許出願公開２０１７／０２７４６８９号明細書、及び／又は欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）で説明されているように実施される。
本発明の好ましい実施形態によれば、機械式ポンプ装置は、液滴ディスペンサ装置に結合されたシリンジポンプを含む。シリンジポンプは、少量のシステム液体に正圧又は負圧を印加することにおいて特定の利点を有する。
本発明の別の好適な実施形態によれば、サイフォンポンプ装置は、キャリア基板よりも低いレベルに配置され、且つサイフォンラインを介して液滴ディスペンサ装置、好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部液滴ディスペンサ接合部に結合された、システム液体リザーバを備える。好適には、少なくとも１つの液滴ディスペンサをシステム液体リザーバと組み合わせることによって簡素な設定を提供し、懸濁液試料を残留物なく回収する、信頼性の高いポンプ動作が可能になる。
ポンプ装置を液滴ディスペンサ装置に結合することの更なる利点は、本発明の更なる特定の好ましい実施形態によれば、粒子分離装置が弁装置を備えている場合に得られる。弁装置は、機械式ポンプ装置、及び／又はサイフォンポンプ装置の、液滴ディスペンサ装置との液体連通を制御するように構成される。好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部ディスペンサ接合部に、システム液体ラインが１本のみ結合される。好適には、弁装置は、ポンプ装置を共通のシステム液体ラインに結合するのを容易にする。
弁装置が、機械式ポンプ装置と液滴ディスペンサ装置との間、或いはサイフォンポンプ装置と液滴ディスペンサ装置との間に液体連通を提供するために配置された三方弁を備える場合は、小型の構造を提供する特定の利点が得られる。少なくとも１つの液滴ディスペンサのシステム液体ラインを三方弁の第１のポートに接続し、機械式ポンプ装置、具体的にはシリンジポンプを三方弁の第２のポートに接続し、且つサイフォンポンプ装置、具体的にはサイフォンラインを三方弁の第３のポートに接続することによって、上述の２つの吸引段階における懸濁液試料の吸引が容易に制御され得る。
本発明の別の好適な実施形態によれば、キャリア基板は疎水性表面を有する。これに加えて、又はこれに代えて、キャリア基板は、平坦で滑らかな表面、即ち段差やレセプタクルのない表面を有してもよい。好適には、疎水性表面及び／又は平面を設けることにより、滑らかな表面が、懸濁液試料をキャリア基板から残留物なく回収するのを容易にする。
本発明の別の好適な変更によれば、粒子分離装置は、回収容器を備えられ得る。回収容器は、多粒子を含む液滴を再捕捉するように構成される。また、粒子を含まない液滴を再捕捉するように構成されてもよい。好適には、回収容器を設けることにより、再捕捉された液体が本発明の粒子分離方法の別の用途に付され得るため、回収率が更に向上する。
本発明による粒子分離方法の更なる好適な特徴によれば、懸濁液試料の吸引後、具体的には第２の吸引段階後に、追加された量の希釈液が液滴ディスペンサ装置に充填され得る。好適には、少なくとも１つの液滴ディスペンサにおいて、液滴ディスペンサ内の希釈された試料懸濁液と、液滴ディスペンサ先端との間に緩衝領域が生成される。緩衝領域により、ディスペンサ先端の洗浄、及びディスペンサの単粒子操作が容易になる。
本発明の好ましい用途によれば、特に生物学、医学、及び生化学において、粒子は、生体細胞、細胞凝集体、細胞成分、生物高分子、及び／又は生体分子で官能化された微粒子（ビーズ）を含む。このような用途では、希釈液は、好ましくは生理的培養液などの生理的緩衝溶液を含む。
本発明は、以下の更なる利点を有する。本発明は、臨床試料からの希少細胞集団の様々な「オミクス」解析のための試料調整、免疫療法スクリーニングのための希少免疫細胞の個別の培養、生体外実験における希少免疫細胞の個別の培養、及び／又はオルガノイドの細胞間のばらつき（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の解析のためのツールを提供することを含む、広範な用途を有する。
主な利点として、本発明は、より典型的な単一細胞集団のデータ、即ち遺伝子発現データ、免疫グロブリン配列、及び生体外実験の表現型データを得るために、非常に限られた試料から１００％近い細胞を分離することを可能にする。
本発明の方法は、完全に自動化され得る。粒子分離装置は、試料懸濁液吸引、及び単粒子分注動作が、自動的に作動されるように制御され得る。
本発明の更なる利点及び詳細が、添付の図面を参照しながら以下に記載される。
本発明による粒子分離装置の、好ましい実施形態の概略図である。 本発明による粒子分離方法の、好ましい実施形態の特徴を示すフローチャートである。 本発明による粒子分離の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 多粒子液滴の再捕捉の概略図である。
本発明の好ましい実施形態の特徴は、単一の圧電液滴ディスペンサを有する液滴ディスペンサ装置を備える、粒子分離装置を例示的に参照しながら以下で説明される。本発明は、この実施形態に限定されない。複数の懸濁液試料で並行動作を実施する利点を有する、液滴ディスペンサのアレイが使用され得る。さらに、圧電液滴ディスペンサの代わりに、他の種類の液滴ディスペンサが使用され得る。さらに、本発明の実施は、図に示されているポンプ及び弁装置の特定の構成に限定されない。具体的には、シリンジポンプは、別の機械式ポンプ装置に置き換えられてもよく、サイフォンポンプ装置の瓶型のシステム液体リザーバは、別の種類のリザーバに置き換えられてもよい。
本発明の実施形態は、生物学的粒子、特に、生体細胞の処理を例示的に参照しながら説明される。本発明は、この用途に限定されない。本発明の技術を用いて、例えば、ナノ技術、又は環境技術において試料から粒子を回収するため、即ち解析目的で、非生物学的粒子も同様に処理され得る。
本発明は実質的に、液滴ディスペンサ内の懸濁液試料の希釈を参照しながら説明される。その後の液滴ディスペンサ装置の単粒子液滴分注動作については、それ自体周知であるため説明されない。米国特許出願公開第２０１７／０２７４６８９号明細書、及び欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）は、特に、単粒子を含む液滴の分注を得るための液滴ディスペンサ装置の制御に関し、参照することによって本明細書に組み込まれる。
図１によれば、本発明の粒子分離装置１００の実施形態は、液滴ディスペンサ装置１０と、機械式ポンプ装置４０と、サイフォンポンプ装置５０と、弁装置６０とを備える。液滴ディスペンサ装置１０は、即ちｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ（メーカー：Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ、ドイツ）タイプのディスペンサシステムである。機械式ポンプ装置４０は、ポンプアクチュエータ４２を有するシリンジポンプ４１を含む。シリンジポンプ４１は、例えば、数ｍｌの作業容積を有する。好適には、構成部品４０、５０、及び６０は、液滴ディスペンサ装置１０の動作プラットフォームに一体化され得る。
液滴ディスペンサ装置１０は、少なくとも１つの液滴ディスペンサ１２を垂直方向に保持するための機械的支持具である、ディスペンサ頭部１１を有する。ディスペンサ頭部１１は、駆動装置（図示せず）に結合され、ディスペンサ頭部１１は全３方向の空間方向に移動できるようになる。液滴ディスペンサ１２は、液滴ディスペンサ先端１３（ノズル先端１３）を有する第１の（下部の）端部と、上部液滴ディスペンサ接合部１４を有する反対側の（上部の）端部を備える。この２つの端部の間に、容積が約６０μｌのディスペンサリザーバと、液滴ディスペンサ１２で液滴を分注するための圧電アクチュエータユニットとが設けられる。上部液滴ディスペンサ接合部１４は、システム液体ライン１５を介して、弁装置６０の三方弁６１の第１のポートに結合される。システム液体ライン１５は、例えば、柔軟なチューブである。
液滴ディスペンサ装置１０は、液滴ディスペンサ１２の動作を制御するように構成される、ディスペンサ制御装置１６を備える。さらに、ディスペンサ制御装置１６は、シリンジポンプの動作を制御するポンプアクチュエータ４２と、三方弁６１の液体連通を切り替える弁アクチュエータ６２とに結合される。
三方弁６１の第２のポートに、機械式ポンプ装置４０のシリンジポンプ４１が結合される。（図１に示されているように）直接結合する代わりとして、シリンジポンプライン（図示せず）を介した結合が設けられてもよい。
三方弁６１の第３のポートには、サイフォンポンプ装置５０が結合される。サイフォンポンプ装置５０は、サイフォンライン５２を介して三方弁６１の第３のポートに結合された、システム液体リザーバ５１を備える。システム液体リザーバ５１は、水などのシステム液体５３を含み、その中にサイフォンライン５２が浸される。システム液体リザーバ５１は瓶であり、システム液体５３がキャリア基板２０の下方に位置するように配置される。したがって、液滴ディスペンサ１２を介したキャリア基板２０（後述）上の試料液滴と、システム液体ライン１５と、三方弁６１と、システム液体５３に至るサイフォンライン５２との間の連続的な液体連通により、試料液滴に負圧が印加される。キャリア基板２０の表面の下方にあるシステム液体５３の高さＨは、例えば、２ｃｍ〜１０ｃｍの範囲で選択される。
さらに、図１は、疎水性基板表面２１と、緩衝チューブ２２と、ターゲット基板３０とを有する、キャリア基板２０を示す。キャリア基板２０及びターゲット基板３０は、（例えば、試料ピックアップスライドによって提供される）平坦な基板として示されている。あるいは、マイクロタイタープレート又はナノタイタープレートなどのウェル構造が基板として使用され得る。キャリア基板２０及びターゲット基板３０は両方とも、共通の基板で提供され得る。
以下、試料懸濁液から粒子を分離する本発明の方法は、図２のフローチャートを参照して説明され、フローチャートのいくつかの動作段階は、残りの図３〜図８に図示される。
図２によれば、本発明の方法の図示されている実施形態は、最初に準備するステップＳ１〜Ｓ３を含む。最初に、液滴ディスペンサ１０は、緩衝チューブ２２（図１を参照）の方へ移動され、その結果、液滴ディスペンサ先端１３（ノズル先端）が、緩衝チューブ２２内の緩衝液の中に導入される（ステップＳ１）。
次に、図３に示すように、希釈液３（試料用緩衝液）が、緩衝チューブ２２から、液滴ディスペンサ１２の中に充填される（ステップＳ２）。試料用緩衝液を充填するために、シリンジポンプ４１がシステム液体ライン１５を介して液滴ディスペンサ１２に結合されるように、三方弁６１が設置される。シリンジポンプ４１の動作によって、試料用緩衝液が希釈液３として、液滴ディスペンサ１２の中に吸引される。実施例では、２０μｌの試料用緩衝液が吸引される。好適には、これにより、試料懸濁液から収容された細胞が浸透圧ショックを受けないことが確実になる。さらに、試料を回収した後に、試料用緩衝液を液滴ディスペンサ１２に更に吸引するために、緩衝チューブ２２が使用され得る（後述する緩衝領域の形成）。緩衝溶液は、例えば、細胞又は粒子型を安定化する溶媒、或いは化学的に類似する液体を含み、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水、及び／又はウシ胎児血清（ＰＢＳ及びＦＢＳ）を含む。
その後、図４の拡大部分に示されているように、懸濁液試料２の液滴がキャリア基板２０に充填され、ディスペンサ１２は、試料懸濁液２の液滴の上方にくるように調節される（ステップＳ３）。キャリア基板２０上の懸濁液試料２の液滴は、生体細胞などの複数の粒子１、例えば、１００個以上の細胞を含んでもよく、これらは互いに分離される。あるいは、液滴は、互いに分離される細胞を数個のみ含む、又は回収されてターゲット基板に移される細胞を１つのみ含んでもよい。例えば、懸濁液試料２の液滴は、１μｌ〜１０μｌなどの細胞懸濁液を含み、この中に、１μｌ毎に約１〜３０細胞の密度で希少細胞を含む。懸濁液試料の液滴をキャリア基板２０に充填するステップは、ディスペンサ頭部１１に設けられた別の液滴ディスペンサ（図示せず）で、或いは別の液滴処理技術、即ちピペット又はマイクロ流体流路の開口部などで行われ得る。
その後、液滴ディスペンサ１２は、図５に示すように、ノズル先端１３が懸濁液試料２の液滴の中に導入されるように、キャリア基板２０の方へ移動される（ステップＳ４）。図５（特に、図５の拡大部分）によれば、ノズル先端１３は、キャリア基板２０の基板表面２１から距離をあけて配置され、距離は、１００μｍ〜２５０μｍの範囲である。ノズル先端１３は、懸濁液試料２の液滴に接触する。液滴の大きさに応じて、ノズル先端１３は、１００μｍの距離Ｄまで下げて、液滴の中に浸され得る。
その後、第１の吸引段階が行われ、第１の部分４（矢印で示す）は、シリンジポンプ４１の動作によって、ノズル先端１３を介して液滴ディスペンサ１２の中に回収される。シリンジポンプ４１は、第１の部分４として、２μｌなどの所定の体積が液滴ディスペンサの中に吸引されるように制御される（ステップＳ５）。
その後、シリンジポンプ４１の動作が停止され、三方弁６１が切り替えられて、第１のポートが三方弁６１の第３のポートに結合される。したがって、サイフォンポンプ装置５０と、液滴ディスペンサ１２との間に連続的な液体連通が提供される（図６を参照）。この状況において、懸濁液試料２の液滴の第２の部分５は、サイフォンポンプ装置５０の効果によって、第２の吸引段階で回収される（ステップＳ６）。ステップＳ６は、残留している２μｌなどの液体を吸い上げるための、重力サイフォンによる受動的な吸引を含む。サイフォン高さ、及び残量に応じて、これには１０秒〜２分かかる場合がある。好適には、システム液体の表面張力が高く、ノズル先端１３のオリフィスのサイズが小さいために、毛細管現象によって、ノズル先端１３は空気を吸引しない。この第２の吸引段階の間に、懸濁液試料２の液滴は完全に、又はほぼ完全に液滴ディスペンサ１２の中に回収される。
図７は、試料の吸引が完了したときの状態を示す。キャリア基板２０は空になり、懸濁液試料の液滴は、液滴ディスペンサ１２によって完全に収容される。試料の完全な吸引は、キャリア基板２０の疎水性表面２１によって補助される。さらに、試料は高い表面張力を有することが好ましく、これは使用可能な緩衝溶液の大部分によって実現される。
その後、液滴ディスペンサ１２は、液滴ディスペンサ１２の下端部内で緩衝領域を生成するように、ノズル先端１３を通して別の量の緩衝液を吸引するために、緩衝チューブ２２（図１を参照）に移動される（ステップＳ８）。ステップＳ８で緩衝領域を設けることには、液滴ディスペンサ１２内の懸濁液試料が、後続の洗浄するステップＳ９による悪影響を受けないという利点がある。緩衝液は、サイフォンポンプ装置５０の動作によって液滴ディスペンサ１２の中に吸引される。緩衝領域の形成には、１〜２０秒の時間がかかる場合がある。
次のステップ（ステップＳ９）で、液滴ディスペンサは、ノズル１３の外面を洗浄するために、洗浄ステーション（図示せず）に移動される。その後、ディスペンサ頭部１１は、単一細胞の分注動作を開始するために、カメラ装置７０に移動される（ステップＳ１０）。カメラ装置７０、及びディスペンサ制御装置１６（図１を参照）の計算ユニットで、液滴ディスペンサ１２内の細胞の分布が評価される。例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２７４６８９号明細書、及び欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）で、或いはそこに記載されている参考文献で説明されているように、液滴ディスペンサ１２の単一細胞状態が検出されると、単一細胞液滴がターゲット基板３０（図１を参照）上に堆積され、或いは多細胞液滴が検出されると、図８に示すように、回収チューブ２３で再捕捉される（ステップＳ１１）。
より詳細には、試料が液滴ディスペンサ１２の中に充填された後に、カメラ装置７０で細胞検出が行われる。液滴ディスペンサ１２がカメラ装置７０に配置されると、この位置から排出された全液滴が、ノズル１３の下方に配置された回収チューブ２３に捕捉される。単一細胞状態が検出される場合、例えば、排出領域に１つの単一細胞があり（１回のディスペンサ動作で排出される体積に相当する）、排出領域の上方の沈殿領域に細胞がないと、液滴ディスペンサ１２は、単一細胞を含む次の液滴をターゲット基板３０に分注するために、ターゲット基板３０に移動される。沈殿領域は、ディスペンサ装置がターゲット基板まで移動する間に、細胞が排出領域の中に沈殿する体積に相当する。
その後、ターゲット基板３０上の単一細胞で細胞解析が行われ得る。細胞解析は、顕微鏡撮像、光学的な、具体的には蛍光測定、力学的測定、化学検出など、それ自体周知の任意の細胞調査を含むことができる。細胞解析の結果に応じて、細胞は分類される、又は細胞培養などの別の細胞処理にかけられ得る。
本発明の粒子分離装置１００、及び上述の方法では、９５％から９９％以上の範囲の回収率を有する、有利な希少細胞の回収能力を実証実験が示している。自己免疫疾患において注目される細胞のモデルとして、蛍光標識されたＰＢＭＣ試料（５μｌの懸濁液に約７０細胞を含む）を用いて、本発明者による初期実験が行われた。蛍光顕微鏡を使用して、５μｌの液滴を基板表面に広げて粒子の数を数えることにより、５μｌあたり約７０の粒子密度が確認された。本発明の単粒子分離を適用することにより、単粒子が粒子の直線又はマトリクス配置として堆積され、本発明による装置の単粒子分離能力及び高回収率が確認された。平均して９７％の単粒子回収率が得られた。
上述の説明、図面、及び特許請求の範囲で開示されている本発明の特徴は、個別に、且つ組み合わせ又は下位組み合わせの両方において、本発明をその様々な実施形態で実現するための意義を有し得る。
本発明は、粒子分離装置に関し、粒子、具体的には生体細胞、細胞凝集体、細胞成分、又は生物高分子を粒子懸濁液試料から分離するように構成される。さらに、本発明は、粒子懸濁液試料から粒子を分離する方法に関する。本発明の用途は、具体的には、例えば、培養又は分子解析の目的のために単一の生体細胞、又は細胞亜集団を処理及び回収するための、生体試料などの粒子懸濁液処理の分野で使用可能である。
生化学及び生物医学の分野において、例えば、血液試料中の特定の細胞を識別するために、細胞周辺領域（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌｓ）のより大きい集団内で希少細胞を識別することに関心が寄せられており、これは（腫瘍細胞などの）疾患を示し、或いは別の細胞処理に有用である。一般に、細胞懸濁液など細胞混合物中の細胞の識別は、細胞を互いに分離する第１のステップと、単一細胞を解析する第２のステップとを含む。
細胞を分離する一般的な方法は、既存の液的スポット法に基づき、懸濁液滴を取り扱うための液滴ディスペンサが使用される。細胞懸濁液の液滴は、ウェル構造から液滴ディスペンサの中に吸引され、その結果、液滴ディスペンサ内の緩衝液の希釈が得られる。その後、単一細胞を含む液滴は、その後の単一細胞の解析及び別の処理用に、ターゲット上に堆積される。しかしながら、不利な点として、このような技法は細胞回収率が低く、例えば、５％〜６０％の範囲内であり、少数細胞系（ｐａｕｃｉｃｅｌｌｕｌａｒ）生体試料を扱う技法としては実用性に欠ける。例えば、１ｍｌあたり１０００未満の細胞を含む細胞懸濁液から単一細胞を分離するためには、９０％を上回る回収率が必要とされる。欧州特許出願公開第３３２３８７７号明細書、及び米国特許出願公開第２００２／００１６７５号明細書は、液滴分注法を開示しており、リザーバから液滴ディスペンサに液体を送出するのにサイフォンポンプの吸引動作が使用される。しかしながら、このような従来の構成では、回収率を上げることはできない。
スポット法の代替として、希少細胞の分離及び解析用にマイクロ流体システムが使用されている。生体細胞を含む液体懸濁液は、マイクロ流体システムを通って流れ、懸濁液が狭い流路を通って流れ、個々の細胞の列を形成することによって、細胞は互いに分離される。その後、単一細胞は、細胞バイオマーカ、特定の物理特性、又は誘電特性の発生に応じて解析され分類される。希少細胞分離のためのマイクロ流体法の概要は、Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」，２０１４，１４（４），６２６−６４５に記載されている。開流路マイクロ流体チップを使用したマイクロ流体法の具体例は、Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．「ＰＬＯＳ Ｏｎｅ」，２０１７，１２（４），ｅ０１７４９３７に記載されている。
マイクロ流体法は、細胞の損失が最小化されるため、回収率が高いという利点がある。しかしながら、マイクロ流体システムの流路内での細胞の取り扱いが細胞を変化させる可能性があることから、不都合が生じる。さらに、マイクロ流体システムは複雑な装置であり、流体力学的シグネチャ（大きさ、密度、又は変形性）、誘電泳動シグネチャ（特定の膜性能）、免疫化学シグネチャ（特定の抗体）、或いは磁気泳動シグネチャ（磁化率又は磁性ナノ粒子との免疫特異的接着）などの特定の細胞シグネチャを検出できなければならない。マイクロ流体システムは、限定的な方法でのみ、使用可能な液滴処理法と一体化され得る。
上述した従来技術の制限は、単一細胞の分離に関して生じるだけでなく、他の種類の生物学的粒子、又は環境調査などにおける非生物学的粒子の分離など他の粒子分離技術においても同様に生じる。
欧州特許出願公開第３３２３８７７号明細書 米国特許出願公開第２００２／００１６７５号明細書
Ｙ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．「Ｌａｂ Ｃｈｉｐ」，２０１４，１４（４），６２６−６４５ Ｔ．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．「ＰＬＯＳ Ｏｎｅ」，２０１７，１２（４），ｅ０１７４９３７
本発明の目的は、改善した粒子分離装置を提供することであり、従来技術の欠点及び制限を回避しながら、懸濁液試料から粒子を分離することができる。具体的には、粒子分離装置は、向上した回収率、高いスループット能力、及び／又は使用可能な液滴処理法と容易に統合できることとともに、粒子を分離することが可能になる。さらに、本発明の目的は、従来技術の欠点及び制限を回避しながら懸濁液試料から粒子を分離する、改善された方法を提供することである。
上述の目的は、粒子分離装置、及び懸濁液試料から粒子を分離する方法によってそれぞれ解決され、独立クレームの特徴を含む。好ましい実施形態の特徴、及び本発明の用途は、従属クレームで定義される。
本発明の第１の一般的な態様によれば、上述の目的は粒子分離装置によって解決され、液滴ディスペンサ装置と、機械式ポンプ装置及びサイフォンポンプ装置との組み合わせを含む。液滴ディスペンサ装置は、少なくとも１つの圧電液滴ディスペンサなどの、少なくとも１つの液滴ディスペンサを備える。液滴ディスペンサ装置は、懸濁液試料をキャリア基板から回収して、液滴をターゲット基板に分注するように構成される。懸濁液試料は、生体細胞などの複数の粒子を含む、ある量の液体を含んでもよい。懸濁液試料は、キャリア基板表面の液滴として、或いはキャリア基板の３Ｄウェルなどの、区画の内容物として供給され得る。液滴ディスペンサ装置は、負圧の効果によって、好ましくは少なくとも１つの液滴ディスペンサの液滴ディスペンサ先端を通して、少なくとも１つの液滴ディスペンサの中に、懸濁液試料を回収するように適合される。負圧は、機械式ポンプ装置、又はサイフォンポンプ装置によって印加される。
機械式ポンプ装置は、好ましくは上部液滴ディスペンサ接合部を介して、液滴ディスペンサ装置に結合される。機械式ポンプ装置は、非圧縮性の希釈液、即ち緩衝液などを、液滴ディスペンサ装置の中に充填するように適合される。さらに、機械式ポンプ装置は、負圧の効果によって、懸濁液試料の第１の部分を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するように適合される。機械式ポンプ装置は、任意のポンプ装置を備え、例えば、希釈液によって提供されるシステム液体内でピストンを動かすことによって、或いは蠕動ポンプによって、正圧又は負圧を生成することができる。機械式ポンプ装置は、希釈液、又は純水などの別の液体を含む、システム液体で動作される。
本発明によれば、更にサイフォンポンプ装置が、好ましくは少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部液滴ディスペンサ接合部で、液滴ディスペンサ装置に結合される。サイフォンポンプ装置は、負圧の効果によって、懸濁液試料の第２の部分を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するように構成される。サイフォンポンプ装置は、希釈液、又は純水などの別の液体を含む、システム液体で動作される。好ましくは、サイフォンポンプ装置、及び機械式ポンプ装置は、同じシステム液体を使用する。
本発明の第２の一般的な態様によれば、上述の目的は、懸濁液試料から粒子を分離する方法によって解決され、この方法は以下のステップを含む。分離方法の準備として、平坦な基板表面、又は３Ｄウェル構造の区画などのキャリア基板に懸濁液試料が供給される。さらに、希釈液、即ち緩衝液が、液滴ディスペンサ装置の少なくとも１つの液滴ディスペンサに充填される。懸濁液試料から単粒子を分離するために、懸濁液試料は、懸濁液試料が希釈液で希釈されるように、液滴ディスペンサ装置に充填される。希釈液での希釈は、２つの吸引段階を含む。第１の吸引段階では、懸濁液試料の第１の部分が、機械式ポンプ装置の動作によって、液滴ディスペンサ装置、具体的には少なくとも１つの液滴ディスペンサの中に引き込まれる。第２の吸引段階では、懸濁液試料の第２の部分、具体的には残留している懸濁液試料が、サイフォンポンプ装置の動作によって、液滴ディスペンサ装置、具体的には少なくとも液滴ディスペンサの中に吸引される。懸濁液試料を吸引することにより、少なくとも１つの液滴ディスペンサ内で懸濁液試料が希釈される。最後に、液滴ディスペンサ装置が、液滴をターゲット基板に分注するステップを含めて動作され得る。ターゲット基板は、キャリア基板の別の部分、又はキャリア基板から分離された別の基板を含んでもよい。希釈された懸濁液試料の液滴は、自由液滴として、平坦なターゲット基板表面上、又はターゲット基板の３Ｄウェルの中に分注される。液滴ディスペンサ装置は、ターゲット基板上に分注された液滴が、時間平均で１滴毎に１粒子未満を含むように動作される。言い換えれば、液滴ディスペンサ装置は、ターゲット基板上に分注された各液滴が１つの単粒子を含むか、又は粒子を含まないように制御される。１粒子より多く含む可能性がある液滴は、ターゲット基板上に分注されない。
主な利点として、液体を液滴ディスペンサ装置の中に吸引するのにサイフォンポンプ装置を使用することによって、従来技術と比較して、分離している粒子の回収率を上げることができる。デッドボリューム、又は不完全な試料回収が排除されるため、９０％を上回る回収率が得られる。サイフォンポンプ装置は、液体懸濁液試料の残留部分がキャリア基板に存在する限り有効である。したがって、本発明の好適な実施形態によれば、懸濁液試料は、残留物のない方法でキャリア基板から回収され得る。さらなる利点として、本発明は、粒子の分離をハイスループットプロセスと一体化することができる。さらに、液滴ディスペンサ装置を使用することにより、本発明の技術を液滴の取り扱い技術、及び処理技術と組み合わせることに関して利点が得られる。
従来のマイクロ流体法に反して、粒子は特定のシグネチャによって分類されないが、液滴ディスペンサ内で懸濁液試料を希釈すること、及び単粒子液滴がターゲット基板に配置されるように液滴ディスペンサを動作することによって分類される。好適には、粒子分離は特定の粒子特徴の検出を必要とせず、その結果、粒子分離装置は、１つの懸濁液試料から、又は複数の異なる懸濁液試料から、異なる種類の粒子を分離するために使用され得る。
好ましくは、本発明の粒子分離装置の液滴ディスペンサ装置は、単粒子液滴分注動作に適合される。液滴ディスペンサは、液滴が最大でも１つの粒子を含む場合にのみ、液滴をターゲット基板上に分注するように動作され得るように構成される。この目的のために、液滴ディスペンサ装置は、好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサ内の粒子分布を監視するために配置されるカメラ装置と、カメラ装置の出力信号に応じて分注動作を制御するように適合される、ディスペンサ制御装置と組み合わされる。好ましくは、単粒子分注は、米国特許出願公開２０１７／０２７４６８９号明細書、及び／又は欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）で説明されているように実施される。
本発明の好ましい実施形態によれば、機械式ポンプ装置は、液滴ディスペンサ装置に結合されたシリンジポンプを含む。シリンジポンプは、少量のシステム液体に正圧又は負圧を印加することにおいて特定の利点を有する。
本発明の別の好適な実施形態によれば、サイフォンポンプ装置は、キャリア基板よりも低いレベルに配置され、且つサイフォンラインを介して液滴ディスペンサ装置、好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部液滴ディスペンサ接合部に結合された、システム液体リザーバを備える。好適には、少なくとも１つの液滴ディスペンサをシステム液体リザーバと組み合わせることによって簡素な設定を提供し、懸濁液試料を残留物なく回収する、信頼性の高いポンプ動作が可能になる。
ポンプ装置を液滴ディスペンサ装置に結合することの更なる利点は、本発明の更なる特定の好ましい実施形態によれば、粒子分離装置が弁装置を備えている場合に得られる。弁装置は、機械式ポンプ装置、及び／又はサイフォンポンプ装置の、液滴ディスペンサ装置との液体連通を制御するように構成される。好ましくは、少なくとも１つの液滴ディスペンサの上部ディスペンサ接合部に、システム液体ラインが１本のみ結合される。好適には、弁装置は、ポンプ装置を共通のシステム液体ラインに結合するのを容易にする。
弁装置が、機械式ポンプ装置と液滴ディスペンサ装置との間、或いはサイフォンポンプ装置と液滴ディスペンサ装置との間に液体連通を提供するために配置された三方弁を備える場合は、小型の構造を提供する特定の利点が得られる。少なくとも１つの液滴ディスペンサのシステム液体ラインを三方弁の第１のポートに接続し、機械式ポンプ装置、具体的にはシリンジポンプを三方弁の第２のポートに接続し、且つサイフォンポンプ装置、具体的にはサイフォンラインを三方弁の第３のポートに接続することによって、上述の２つの吸引段階における懸濁液試料の吸引が容易に制御され得る。
本発明の別の好適な実施形態によれば、キャリア基板は疎水性表面を有する。これに加えて、又はこれに代えて、キャリア基板は、平坦で滑らかな表面、即ち段差やレセプタクルのない表面を有してもよい。好適には、疎水性表面及び／又は平面を設けることにより、滑らかな表面が、懸濁液試料をキャリア基板から残留物なく回収するのを容易にする。
本発明の別の好適な変更によれば、粒子分離装置は、回収容器を備えられ得る。回収容器は、多粒子を含む液滴を再捕捉するように構成される。また、粒子を含まない液滴を再捕捉するように構成されてもよい。好適には、回収容器を設けることにより、再捕捉された液体が本発明の粒子分離方法の別の用途に付され得るため、回収率が更に向上する。
本発明による粒子分離方法の更なる好適な特徴によれば、懸濁液試料の吸引後、具体的には第２の吸引段階後に、追加された量の希釈液が液滴ディスペンサ装置に充填され得る。好適には、少なくとも１つの液滴ディスペンサにおいて、液滴ディスペンサ内の希釈された試料懸濁液と、液滴ディスペンサ先端との間に緩衝領域が生成される。緩衝領域により、ディスペンサ先端の洗浄、及びディスペンサの単粒子操作が容易になる。
本発明の好ましい用途によれば、特に生物学、医学、及び生化学において、粒子は、生体細胞、細胞凝集体、細胞成分、生物高分子、及び／又は生体分子で官能化された微粒子（ビーズ）を含む。このような用途では、希釈液は、好ましくは生理的培養液などの生理的緩衝溶液を含む。
本発明は、以下の更なる利点を有する。本発明は、臨床試料からの希少細胞集団の様々な「オミクス」解析のための試料調整、免疫療法スクリーニングのための希少免疫細胞の個別の培養、生体外実験における希少免疫細胞の個別の培養、及び／又はオルガノイドの細胞間のばらつき（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）の解析のためのツールを提供することを含む、広範な用途を有する。
主な利点として、本発明は、より典型的な単一細胞集団のデータ、即ち遺伝子発現データ、免疫グロブリン配列、及び生体外実験の表現型データを得るために、非常に限られた試料から１００％近い細胞を分離することを可能にする。
本発明の方法は、完全に自動化され得る。粒子分離装置は、試料懸濁液吸引、及び単粒子分注動作が、自動的に作動されるように制御され得る。
本発明の更なる利点及び詳細が、添付の図面を参照しながら以下に記載される。
本発明による粒子分離装置の、好ましい実施形態の概略図である。 本発明による粒子分離方法の、好ましい実施形態の特徴を示すフローチャートである。 本発明による粒子分離の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 本発明による粒子分離の更に別の動作段階における、図１による粒子分離装置の概略図である。 多粒子液滴の再捕捉の概略図である。
本発明の好ましい実施形態の特徴は、単一の圧電液滴ディスペンサを有する液滴ディスペンサ装置を備える、粒子分離装置を例示的に参照しながら以下で説明される。本発明は、この実施形態に限定されない。複数の懸濁液試料で並行動作を実施する利点を有する、液滴ディスペンサのアレイが使用され得る。さらに、圧電液滴ディスペンサの代わりに、他の種類の液滴ディスペンサが使用され得る。さらに、本発明の実施は、図に示されているポンプ及び弁装置の特定の構成に限定されない。具体的には、シリンジポンプは、別の機械式ポンプ装置に置き換えられてもよく、サイフォンポンプ装置の瓶型のシステム液体リザーバは、別の種類のリザーバに置き換えられてもよい。
本発明の実施形態は、生物学的粒子、特に、生体細胞の処理を例示的に参照しながら説明される。本発明は、この用途に限定されない。本発明の技術を用いて、例えば、ナノ技術、又は環境技術において試料から粒子を回収するため、即ち解析目的で、非生物学的粒子も同様に処理され得る。
本発明は実質的に、液滴ディスペンサ内の懸濁液試料の希釈を参照しながら説明される。その後の液滴ディスペンサ装置の単粒子液滴分注動作については、それ自体周知であるため説明されない。米国特許出願公開第２０１７／０２７４６８９号明細書、及び欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）は、特に、単粒子を含む液滴の分注を得るための液滴ディスペンサ装置の制御に関し、参照することによって本明細書に組み込まれる。
図１によれば、本発明の粒子分離装置１００の実施形態は、液滴ディスペンサ装置１０と、機械式ポンプ装置４０と、サイフォンポンプ装置５０と、弁装置６０とを備える。液滴ディスペンサ装置１０は、即ちｓｃｉＦＬＥＸＡＲＲＡＹＥＲ（メーカー：Ｓｃｉｅｎｉｏｎ ＡＧ、ドイツ）タイプのディスペンサシステムである。機械式ポンプ装置４０は、ポンプアクチュエータ４２を有するシリンジポンプ４１を含む。シリンジポンプ４１は、例えば、数ｍｌの作業容積を有する。好適には、構成部品４０、５０、及び６０は、液滴ディスペンサ装置１０の動作プラットフォームに一体化され得る。
液滴ディスペンサ装置１０は、少なくとも１つの液滴ディスペンサ１２を垂直方向に保持するための機械的支持具である、ディスペンサ頭部１１を有する。ディスペンサ頭部１１は、駆動装置（図示せず）に結合され、ディスペンサ頭部１１は全３方向の空間方向に移動できるようになる。液滴ディスペンサ１２は、液滴ディスペンサ先端１３（ノズル先端１３）を有する第１の（下部の）端部と、上部液滴ディスペンサ接合部１４を有する反対側の（上部の）端部を備える。この２つの端部の間に、容積が約６０μｌのディスペンサリザーバと、液滴ディスペンサ１２で液滴を分注するための圧電アクチュエータユニットとが設けられる。上部液滴ディスペンサ接合部１４は、システム液体ライン１５を介して、弁装置６０の三方弁６１の第１のポートに結合される。システム液体ライン１５は、例えば、柔軟なチューブである。
液滴ディスペンサ装置１０は、液滴ディスペンサ１２の動作を制御するように構成される、ディスペンサ制御装置１６を備える。さらに、ディスペンサ制御装置１６は、シリンジポンプの動作を制御するポンプアクチュエータ４２と、三方弁６１の液体連通を切り替える弁アクチュエータ６２とに結合される。
三方弁６１の第２のポートに、機械式ポンプ装置４０のシリンジポンプ４１が結合される。（図１に示されているように）直接結合する代わりとして、シリンジポンプライン（図示せず）を介した結合が設けられてもよい。
三方弁６１の第３のポートには、サイフォンポンプ装置５０が結合される。サイフォンポンプ装置５０は、サイフォンライン５２を介して三方弁６１の第３のポートに結合された、システム液体リザーバ５１を備える。システム液体リザーバ５１は、水などのシステム液体５３を含み、その中にサイフォンライン５２が浸される。システム液体リザーバ５１は瓶であり、システム液体５３がキャリア基板２０の下方に位置するように配置される。したがって、液滴ディスペンサ１２を介したキャリア基板２０（後述）上の試料液滴と、システム液体ライン１５と、三方弁６１と、システム液体５３に至るサイフォンライン５２との間の連続的な液体連通により、試料液滴に負圧が印加される。キャリア基板２０の表面の下方にあるシステム液体５３の高さＨは、例えば、２ｃｍ〜１０ｃｍの範囲で選択される。
さらに、図１は、疎水性基板表面２１と、緩衝チューブ２２と、ターゲット基板３０とを有する、キャリア基板２０を示す。キャリア基板２０及びターゲット基板３０は、（例えば、試料ピックアップスライドによって提供される）平坦な基板として示されている。あるいは、マイクロタイタープレート又はナノタイタープレートなどのウェル構造が基板として使用され得る。キャリア基板２０及びターゲット基板３０は両方とも、共通の基板で提供され得る。
以下、試料懸濁液から粒子を分離する本発明の方法は、図２のフローチャートを参照して説明され、フローチャートのいくつかの動作段階は、残りの図３〜図８に図示される。
図２によれば、本発明の方法の図示されている実施形態は、最初に準備するステップＳ１〜Ｓ３を含む。最初に、液滴ディスペンサ１０は、緩衝チューブ２２（図１を参照）の方へ移動され、その結果、液滴ディスペンサ先端１３（ノズル先端）が、緩衝チューブ２２内の緩衝液の中に導入される（ステップＳ１）。
次に、図３に示すように、希釈液３（試料用緩衝液）が、緩衝チューブ２２から、液滴ディスペンサ１２の中に充填される（ステップＳ２）。試料用緩衝液を充填するために、シリンジポンプ４１がシステム液体ライン１５を介して液滴ディスペンサ１２に結合されるように、三方弁６１が設置される。シリンジポンプ４１の動作によって、試料用緩衝液が希釈液３として、液滴ディスペンサ１２の中に吸引される。実施例では、２０μｌの試料用緩衝液が吸引される。好適には、これにより、試料懸濁液から収容された細胞が浸透圧ショックを受けないことが確実になる。さらに、試料を回収した後に、試料用緩衝液を液滴ディスペンサ１２に更に吸引するために、緩衝チューブ２２が使用され得る（後述する緩衝領域の形成）。緩衝溶液は、例えば、細胞又は粒子型を安定化する溶媒、或いは化学的に類似する液体を含み、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水、及び／又はウシ胎児血清（ＰＢＳ及びＦＢＳ）を含む。
その後、図４の拡大部分に示されているように、懸濁液試料２の液滴がキャリア基板２０に充填され、ディスペンサ１２は、試料懸濁液２の液滴の上方にくるように調節される（ステップＳ３）。キャリア基板２０上の懸濁液試料２の液滴は、生体細胞などの複数の粒子１、例えば、１００個以上の細胞を含んでもよく、これらは互いに分離される。あるいは、液滴は、互いに分離される細胞を数個のみ含む、又は回収されてターゲット基板に移される細胞を１つのみ含んでもよい。例えば、懸濁液試料２の液滴は、１μｌ〜１０μｌなどの細胞懸濁液を含み、この中に、１μｌ毎に約１〜３０細胞の密度で希少細胞を含む。懸濁液試料の液滴をキャリア基板２０に充填するステップは、ディスペンサ頭部１１に設けられた別の液滴ディスペンサ（図示せず）で、或いは別の液滴処理技術、即ちピペット又はマイクロ流体流路の開口部などで行われ得る。
その後、液滴ディスペンサ１２は、図５に示すように、ノズル先端１３が懸濁液試料２の液滴の中に導入されるように、キャリア基板２０の方へ移動される（ステップＳ４）。図５（特に、図５の拡大部分）によれば、ノズル先端１３は、キャリア基板２０の基板表面２１から距離をあけて配置され、距離は、１００μｍ〜２５０μｍの範囲である。ノズル先端１３は、懸濁液試料２の液滴に接触する。液滴の大きさに応じて、ノズル先端１３は、１００μｍの距離Ｄまで下げて、液滴の中に浸され得る。
その後、第１の吸引段階が行われ、第１の部分４（矢印で示す）は、シリンジポンプ４１の動作によって、ノズル先端１３を介して液滴ディスペンサ１２の中に回収される。シリンジポンプ４１は、第１の部分４として、２μｌなどの所定の体積が液滴ディスペンサの中に吸引されるように制御される（ステップＳ５）。
その後、シリンジポンプ４１の動作が停止され、三方弁６１が切り替えられて、第１のポートが三方弁６１の第３のポートに結合される。したがって、サイフォンポンプ装置５０と、液滴ディスペンサ１２との間に連続的な液体連通が提供される（図６を参照）。この状況において、懸濁液試料２の液滴の第２の部分５は、サイフォンポンプ装置５０の効果によって、第２の吸引段階で回収される（ステップＳ６）。ステップＳ６は、残留している２μｌなどの液体を吸い上げるための、重力サイフォンによる受動的な吸引を含む。サイフォン高さ、及び残量に応じて、これには１０秒〜２分かかる場合がある。好適には、システム液体の表面張力が高く、ノズル先端１３のオリフィスのサイズが小さいために、毛細管現象によって、ノズル先端１３は空気を吸引しない。この第２の吸引段階の間に、懸濁液試料２の液滴は完全に、又はほぼ完全に液滴ディスペンサ１２の中に回収される。
図７は、試料の吸引が完了したときの状態を示す。キャリア基板２０は空になり、懸濁液試料の液滴は、液滴ディスペンサ１２によって完全に収容される。試料の完全な吸引は、キャリア基板２０の疎水性表面２１によって補助される。さらに、試料は高い表面張力を有することが好ましく、これは使用可能な緩衝溶液の大部分によって実現される。
その後、液滴ディスペンサ１２は、液滴ディスペンサ１２の下端部内で緩衝領域を生成するように、ノズル先端１３を通して別の量の緩衝液を吸引するために、緩衝チューブ２２（図１を参照）に移動される（ステップＳ８）。ステップＳ８で緩衝領域を設けることには、液滴ディスペンサ１２内の懸濁液試料が、後続の洗浄するステップＳ９による悪影響を受けないという利点がある。緩衝液は、サイフォンポンプ装置５０の動作によって液滴ディスペンサ１２の中に吸引される。緩衝領域の形成には、１〜２０秒の時間がかかる場合がある。
次のステップ（ステップＳ９）で、液滴ディスペンサは、ノズル１３の外面を洗浄するために、洗浄ステーション（図示せず）に移動される。その後、ディスペンサ頭部１１は、単一細胞の分注動作を開始するために、カメラ装置７０に移動される（ステップＳ１０）。カメラ装置７０、及びディスペンサ制御装置１６（図１を参照）の計算ユニットで、液滴ディスペンサ１２内の細胞の分布が評価される。例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２７４６８９号明細書、及び欧州特許出願第１７１８９８７５．２号（本明細書の優先日において未公開）で、或いはそこに記載されている参考文献で説明されているように、液滴ディスペンサ１２の単一細胞状態が検出されると、単一細胞液滴がターゲット基板３０（図１を参照）上に堆積され、或いは多細胞液滴が検出されると、図８に示すように、回収チューブ２３で再捕捉される（ステップＳ１１）。
より詳細には、試料が液滴ディスペンサ１２の中に充填された後に、カメラ装置７０で細胞検出が行われる。液滴ディスペンサ１２がカメラ装置７０に配置されると、この位置から排出された全液滴が、ノズル１３の下方に配置された回収チューブ２３に捕捉される。単一細胞状態が検出される場合、例えば、排出領域に１つの単一細胞があり（１回のディスペンサ動作で排出される体積に相当する）、排出領域の上方の沈殿領域に細胞がないと、液滴ディスペンサ１２は、単一細胞を含む次の液滴をターゲット基板３０に分注するために、ターゲット基板３０に移動される。沈殿領域は、ディスペンサ装置がターゲット基板まで移動する間に、細胞が排出領域の中に沈殿する体積に相当する。
その後、ターゲット基板３０上の単一細胞で細胞解析が行われ得る。細胞解析は、顕微鏡撮像、光学的な、具体的には蛍光測定、力学的測定、化学検出など、それ自体周知の任意の細胞調査を含むことができる。細胞解析の結果に応じて、細胞は分類される、又は細胞培養などの別の細胞処理にかけられ得る。
本発明の粒子分離装置１００、及び上述の方法では、９５％から９９％以上の範囲の回収率を有する、有利な希少細胞の回収能力を実証実験が示している。自己免疫疾患において注目される細胞のモデルとして、蛍光標識されたＰＢＭＣ試料（５μｌの懸濁液に約７０細胞を含む）を用いて、本発明者による初期実験が行われた。蛍光顕微鏡を使用して、５μｌの液滴を基板表面に広げて粒子の数を数えることにより、５μｌあたり約７０の粒子密度が確認された。本発明の単粒子分離を適用することにより、単粒子が粒子の直線又はマトリクス配置として堆積され、本発明による装置の単粒子分離能力及び高回収率が確認された。平均して９７％の単粒子回収率が得られた。
上述の説明、図面、及び特許請求の範囲で開示されている本発明の特徴は、個別に、且つ組み合わせ又は下位組み合わせの両方において、本発明をその様々な実施形態で実現するための意義を有し得る。
１ 粒子
２ 懸濁液試料
３ 希釈液
４ 第１の部分
５ 第２の部分
１０ 液滴ディスペンサ装置
１１ ディスペンサ頭部
１２ 液滴ディスペンサ
１３ 液滴ディスペンサ先端（ノズル）
１４ 上部液滴ディスペンサ接合部
１５ システム液体ライン
１６ ディスペンサ制御装置
２０ キャリア基板
２１ 疎水性基板表面
２２ 緩衝チューブ
２３ 回収チューブ
３０ ターゲット基板
４０ 機械式ポンプ装置
４１ シリンジポンプ
４２ ポンプアクチュエータ
５０ サイフォンポンプ装置
５１ システム液体リザーバ
５２ サイフォンライン
５３ システム液体
６０ 弁装置
６１ 三方弁
６２ 弁アクチュエータ
７０ カメラ装置
１００ 粒子分離装置
Ｄ 距離
Ｈ 高さ

Claims (15)

  1. 懸濁液試料（２）から粒子（１）を分離するように構成された、粒子分離装置（１００）であって、
    キャリア基板（２０）から前記懸濁液試料（２）を回収するように、且つターゲット基板（３０）に液滴を分注するように適合される、液滴ディスペンサ装置（１０）と、
    前記液滴ディスペンサ装置（１０）の中に希釈液（３）を充填するために、且つ前記懸濁液試料（２）の第１の部分（４）を前記液滴ディスペンサ装置（１０）の中に吸引するために前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合される、機械式ポンプ装置（４０）と、
    前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合され、前記液滴ディスペンサ装置（１０）の中に前記懸濁液試料（２）の第２の部分（５）を吸引するように構成される、サイフォンポンプ装置（５０）とを備える、粒子分離装置（１００）。
  2. 前記機械式ポンプ装置（４０）が、前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合されるシリンジポンプ（４１）を備える、
    請求項１に記載の粒子分離装置。
  3. 前記サイフォンポンプ装置（５０）が、前記キャリア基板（２０）よりも低いレベルに配置され、且つ前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合される、システム液体リザーバ（５１）を備える、請求項１又は２のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  4. 前記機械式ポンプ装置（４０）、及び前記サイフォンポンプ装置（５０）のうちの少なくとも１つの、前記液滴ディスペンサ装置（１０）との液体連通を制御するように適合される、弁装置（６０）を更に備える、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  5. 前記弁装置（６０）が、前記機械式ポンプ装置（４０）と前記液滴ディスペンサ装置（１０）との間、又は前記サイフォンポンプ装置（５０）と前記液滴ディスペンサ装置（１０）との間に液体連通を提供するように適合される、三方弁（６１）を備える、
    請求項４に記載の粒子分離装置。
  6. 前記キャリア基板（２０）が、疎水性表面（２１）を有する、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  7. 前記液滴ディスペンサ装置（１０）が、前記ターゲット基板（３０）に単粒子の液滴を分注するように適合される、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  8. 多粒子を含む液滴を再捕捉するために配置される、回収容器を更に備える、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  9. 前記サイフォンポンプ装置（５０）、及び前記キャリア基板（２０）が、残留物のない方法で前記懸濁液試料（２）を回収するように適合されることを更に備える、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の粒子分離装置。
  10. 懸濁液試料（２）から粒子を分離する方法であって、
    キャリア基板（２０）に前記懸濁液試料（２）を供給するステップと、
    液滴ディスペンサ装置（１０）に希釈液（３）を充填するステップと、
    前記液滴ディスペンサ装置（１０）に前記懸濁液試料（２）を充填するステップであって、その結果、前記懸濁液試料（２）が前記希釈液（３）で希釈され、機械式ポンプ装置（４０）の動作によって、前記懸濁液試料（２）の第１の部分（４）を前記液滴ディスペンサ装置（１０）の中に吸引する第１の吸引段階、及びサイフォンポンプ装置（５０）の動作によって、前記懸濁液試料（２）の第２の部分（５）を前記液滴ディスペンサ装置（１０）の中に吸引する第２の吸引段階を含む、懸濁液試料（２）を充填するステップと、
    ターゲット基板（３０）に、前記液滴ディスペンサ装置（１０）で液滴を分注するステップであって、前記液滴は、時間平均で１滴毎に１つ未満の粒子を含む、分注するステップとを含む、方法。
  11. 前記懸濁液試料（２）を充填した後に、更なる量の前記希釈液（３）を前記液滴ディスペンサ装置（１０）に充填するステップを更に含む、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 前記粒子が、生体細胞、細胞凝集体、細胞成分、生物高分子、及び／又は生体分子で官能化された微粒子を含むステップを更に含む、
    請求項１０又は１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記希釈液（３）が、生理的緩衝溶液である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記機械式ポンプ装置（４０）が、前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合されるシリンジポンプを備え、
    前記サイフォンポンプ装置（５０）が、前記キャリア基板（２０）よりも低いレベルに配置され、且つ前記液滴ディスペンサ装置（１０）に結合される、システム液体リザーバを備え、
    前記機械式ポンプ装置（４０）、及び前記サイフォンポンプ装置（５０）のうちの少なくとも１つと、前記液滴ディスペンサ装置（１０）との液体連通が、弁装置（６０）、具体的には三方弁で制御され、
    多粒子を含む、分注された液滴が、回収容器で再捕捉される、
    以上の特徴のうち少なくとも１つを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記懸濁液試料（２）が、残留物のない方法で前記キャリア基板（２０）から回収される、
    請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
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