JP2016142616A

JP2016142616A - 微小粒子回収装置

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Publication number: JP2016142616A
Application number: JP2015018410A
Authority: JP
Inventors: 片山　晃治; Koji Katayama; 晃治片山; 健治増井; Kenji Masui; 原　克幸; Katsuyuki Hara; 克幸原; 智之及川; Tomoyuki Oikawa
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2016-08-08
Anticipated expiration: 2035-02-02
Also published as: JP6572547B2

Abstract

【課題】基板上に設けた保持部に保持された微小粒子の中から、目的とする微小粒子を、吸引吐出手段を用いて容易にかつ正確に回収可能な装置を提供すること。【解決手段】微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする微小粒子を回収する回収手段とを備えた微小粒子回収装置であって、前記ノズルの先端部を透光性材料で形成し、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けることで、前記課題を解決する。【選択図】図４

Description

本発明は、微小粒子を回収可能な装置に関する。特に本発明は、基板上に設けた保持部に保持された微小粒子の中から、吸引吐出手段により目的の微小粒子を選択的に回収可能な装置に関する。

溶液中に同じ種類の細胞が含まれていたとしても、当該細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる細胞から通常得られる情報は、個々の細胞の情報が平均化された情報となるため、個々の細胞の情報を得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる細胞を個別に解析し、個々の細胞の情報を得ることへの関心が高まっている。

溶液中に含まれる細胞を個別に解析する例として、血中循環癌細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌｓ、以下ＣＴＣ）の解析があげられる。ＣＴＣは癌の転移や再発に重要な役割を果たすと考えられており、ＣＴＣの解析が可能になると、癌患者の術後診断や投薬方針を決定することができるため、治療の最適化や効率化につながると考えられる。しかしながら、ＣＴＣは未解明な点が多く、またＣＴＣが有する遺伝子の変異やコピー数変化が個々の細胞で異なるという報告もあるため、個別に細胞を解析する必要がある（非特許文献２）。

ＣＴＣは血液中に存在する数が血球細胞と比較して非常に少ない。具体的には、血液１ｍＬあたり、赤血球細胞は５０億個、白血球細胞は３００万から１０００万個含まれているのに対し、ＣＴＣは１０個程度しか含まれない。そのためＣＴＣを解析する際は、多数の血球細胞と少数のＣＴＣとが混合された状態から、ＣＴＣを極力ロスすることなく血球細胞から分離した上で解析する必要がある。

溶液中に含まれる細胞を個々に解析する方法として、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ）や、光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを用いた方法が知られている（非特許文献３から５、特許文献１）。ＦＡＣＳとは、蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光や前方散乱光、側方散乱光を測定することによって種々の細胞情報を取得し、その情報に基づき特定の細胞を分取する細胞解析方法である。しかしながら特定の細胞を確実に選別することが困難であり、かつソーティングにより細胞が損傷する可能性がある。

光ピンセットは、光を物体に照射した際に生じる光の放射圧を用いて、溶液中の微小粒子を保持する技術である。この技術を光学顕微鏡に導入することで、微小粒子（例えば、１つの細胞）を顕微鏡で観察しながら、非接触・非侵襲で保持し、三次元的に自由に動かすことができる。誘電泳動は、空間的に不均一な電場で分極した微小粒子（例えば、１つの細胞）に力を作用させて当該微小粒子を操作する技術である。この技術は酵素処理や高電圧を必要としないため前記微小粒子へのダメージが少なく、前記微小粒子を特定の位置へ移動可能な技術である。マイクロマニピュレーションは、マイクロオーダーの微小粒子（例えば、１つの細胞）をマイクロマニピュレーターといった精密な操作が可能な装置を用いて操作する技術である。この技術は高い電場や高い圧力をかける必要がないため前記微小粒子へのダメージが少ない。

前述した、光ピンセット、誘電泳動やマイクロマニピュレーションを用いた方法は、微小粒子を含む溶液の中から当該微小粒子を１個単位で操作可能な方法である。溶液中に含まれる微小粒子を、基板上に設けた保持部に保持し、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を、光ピンセット、誘電泳動またはマイクロマニピュレーションを用いて採取する場合、目的とする微小粒子を形状や光学的情報を基に選別した後、目的とする微小粒子を採取する。光学的情報に基づく選別は、微小粒子表面または内部に存在する特定物質（微小粒子が細胞の場合はタンパク質や遺伝子）へ蛍光物質を結合させ、当該蛍光物質を蛍光顕微鏡で観察して行なうのが一般的である。ＣＴＣのように溶液中に含まれる量が少ない微小粒子を採取する場合は、当該操作によるロスを極力減らしながら採取する必要がある。

特許５００６１１７号公報

Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９−２２６５（１９８４）Ｍａｒｔｉｎａ，Ａｕｅｒ．ｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，４，８１２−８１３（２０１３）Ｆｕ，ＡＹ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１０９−１１１１（１９９９）Ｈｅｌｌｍｉｃｈ，Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３６８９−３６９６（２００５）Ｖｏｌｄｍａｎ，Ｊ．，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，４２５−４５４（２００６）

基板上に設けた保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を、マイクロマニピュレーションを用いて回収する場合、極微細なノズルを、顕微鏡および複数軸を有するリニアスライダーを用いて、目的とする微小粒子の位置まで移動させた後、当該微小粒子を吸引し、容器に吐出することで行なうが、その際、前記ノズル先端部分が画像として不明瞭になるため、前記ノズルの位置決めを自動的に行なうのが困難であり、目的とする微小粒子の正確な回収も困難であった。

そこで本発明の課題は、基板上に設けた保持部に保持された微小粒子の中から、目的とする微小粒子を、吸引吐出手段を用いて容易にかつ正確に回収可能な装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、
微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板と、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段と、ノズルによる吸引吐出により当該目的とする微小粒子を回収する回収手段とを備えた、微小粒子回収装置であって、
前記ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けた、前記回収装置である。

また本発明の第二の態様は、ノズルが１か所以上屈曲している、前記第一の態様に記載の回収装置である。

また本発明の第三の態様は、回収手段に設ける照射手段を、当該手段で照射された光がノズルの先端部から発せられる光の照射位置に照射されない位置に設ける、前記第一または第二の態様に記載の回収装置である。

さらに本発明の第四の態様は、以下の（１）から（４）の工程を含む、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の回収装置を用いた、液体に含まれる微小粒子を回収する方法である。
（１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を検出する工程
（４）目的とする微小粒子を回収手段で回収する工程
さらに本発明の第五の態様は、以下の（１）から（４）の工程を含む、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の回収装置を用いた、液体に含まれる目的の微小粒子に液体を投与する方法である。
（１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を検出する工程
（４）回収手段を用いて目的とする微小粒子に液体を投与する工程
また本発明の第六の態様は、前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、前記第四または第五の態様に記載の回収方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の微小粒子回収装置を構成する基板は、微小粒子を保持可能な保持部を設けてればよく、微小粒子を含む液体を界面張力等で維持できれば平面でもよいが、側壁を設けた方が当該液体を基板上に安定に保持できる点で好ましい。また微小粒子を含む液体を前記基板に導入し、前記微小粒子を前記保持部に保持させる方法に特に限定はなく、単に保持部に微小粒子を含む液体を導入するだけでもよいし、微小粒子を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に微小粒子を導入させてもよい。中でも細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、微小粒子を保持部へ効率的に保持させることができる点で好ましい。

本発明の微小粒子回収装置は、目的とする微小粒子を回収する回収手段を構成するノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および前記照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けていることを特徴としている。ノズルは、その先端部が透光性材料で形成されていればよく、ガラスであってもよいし、樹脂であってもよい。中でも、ガラスは耐衝撃性および光透過性が高い点で好ましい。なお照射手段で照射した光による、ノズル検出部でのノズル位置の誤認識を防止するため、ノズルを１か所以上屈曲させる、および／または、照射手段で照射した光がノズルの先端部から発せされる光の照射位置に照射されないようにする、と好ましい。照射手段の光源に特に限定はなく、電球、ハロゲンランプ、メタハライドランプ、水銀ランプ、ＬＥＤ、半導体レーザー、ガスレーザーなどを用いることができる。中でも、レーザーやＬＥＤなど直線性を有した光源を照射手段の光源として用いると好ましく、小型化および低コストの観点においてＬＥＤが特に好ましい。導光手段は、前記照射手段から照射した光をノズルの先端部まで導くだけの透光性を有した材料で形成すればよく、前記材料の一例として、ガラス、樹脂、光ファイバーがあげられる。

本発明の装置は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板と前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とノズルによる吸引吐出により当該目的とする微小粒子を回収する回収手段とを備えた装置であって、前記ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および前記照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けていることを特徴としている。本発明の装置は、目的とする微小粒子が保持された保持部の位置（水平位置および垂直位置）の位置合わせが容易となるため、その後の回収手段（ノズル）による、前記目的とする微小粒子を回収する工程や前記目的とする微小粒子へ液体を投与する工程を、確実かつ容易に行なうことができる。

本発明の装置は液体中に含まれる細胞を回収する装置、または前記細胞に液体を投与する装置として好ましい。中でも、血中循環癌細胞（ＣＴＣ）といった、生体試料（血液試料）中に含まれる数が少ない細胞を回収する装置として特に好ましい。

本発明の微小粒子回収装置を構成する基板の一例を示した図（分解図）である。図１に示す基板の正面図である。本発明の微小粒子回収装置の一例を示した図である。（Ａ）は平面、正面および右側面を、（Ｂ）は平面、正面および左側面を、それぞれ示した図である。本発明の微小流路回収装置に備えた回収手段を構成する、ノズル、照射手段および導光手段の一例を示す図である。本発明の微小粒子回収装置を用いた、微小粒子の回収方法の一例を示した図である。図４に示す微小粒子の回収方法のうち、（６）から（８）の工程を詳細に示した図である。検出部を上下させた時に得られた画像の輝度微分値（最大値）の変化を示す図である。照射手段および導光手段による、ノズル先端部への導光の有無による、検出部での検出結果を示す図である。「ＬＥＤＯＦＦ」が導光がないときの結果であり、「ＬＥＤＯＮ」が導光があるときの結果である。

以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の微小粒子回収装置を構成する基板の一例を図１に示す。また図１に示した基板の正面図を図２に示す。

図１に示す基板１００は、
貫通孔１１１ａを有した平板状の遮光部材１１１と、貫通孔１１２ａを有した平板状の絶縁体１１２と、導入口１１３ａ、排出口１１３ｂおよび貫通部１１３ｃを有した平板状のスペーサ１１３とからなる微小粒子導入保持手段１１０と、
微小粒子導入保持手段１１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極１２１・１２２と、
電極１２１・１２２同士を接続する導線１３０と、
電極１２１・１２２に信号を印加する信号発生器１４０と、
を備えている。遮光部材１１１が有する貫通孔１１１ａと絶縁体１１２が有する貫通孔１１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けている。貫通孔１１１ａ、貫通孔１１２ａおよび遮光部材１１１の下部に密着して設けた電極基板１２１により保持部１５０が構成され、導入口１１３ａから微小粒子を含む液体を導入すると、貫通部１１３ｃを通じて保持部１５０へ微小粒子が導入される。電極１２２はスペーサ１１３上部に密着して設けており、導入口１１３ａから導入した、微小粒子を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部１５０に保持した微小粒子の回収を容易にするため、電極１２２はスペーサ１１３から取り外し可能な構造となっている。

本発明の微小粒子回収装置の一例を図３に示す。

図３に示す装置は、
装置の土台となるベース３１０と、
図１および２に記載の基板１００と、
基板１００および後述する回収チューブ５００をＸＹ軸方向（水平方向）に移動させるための基板移動部３２０と、
基板１００に励起光源を照射するための励起光源照射部３３０と、
励起光源照射部３３０を基板１００に照射することで得られる、基板に設けた保持部および保持部に保持された微小粒子に係る光学的情報を取得するための検出部（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）３５０と、
前記光学的情報を照合・解析することで、前記保持部内に保持された微小粒子由来の光学的情報を抽出するための解析部３６０と、
ベース３１０上に備えた、基板１００に設けた保持部に保持された、目的とする微小粒子を回収するためのノズル４１０および吸引吐出ポンプ４２０と、
ノズル４１０をＺ軸方向（垂直方向）に移動させるためのノズル移動部４３０と、
ノズル４１０で吸引した前記目的とする微小粒子を回収するための回収チューブ５００と、
を備えている。

基板１００に設けた保持部に保持された微小粒子は、検出部３４０および計測部３５０で光学的に検出することから、少なくとも前記保持部は透光性材料で形成する必要がある。ノズル４１０は２か所で屈曲しており、その先端部はガラスなどの透光性材料で形成されている（図４）。ノズル４１０根元に設けたノズル照射部４４０から光を照射４５１すると導光部４６０により、照射した光がノズル先端部まで導かれ、当該先端部から基板へ光４５２が照射される（図４）。なおノズル４１０の先端部は、測定試料由来のコンタミネーションを防止するため、取り外し可能な構造とするとよい。

次に微小流路回収装置が図１から４に示す装置であり、かつ微小粒子が細胞である場合の、本発明の微小粒子回収方法の一例を図５および６を用いて説明する。

（１）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから細胞２００を含む液体を導入し、誘電泳動力６００を利用して細胞２００を保持部１５０へ導入させる。具体的には、信号発生器１４０から電極基板１２１・１２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６００を発生させ、保持部１５０へ細胞２００を導入する。図１に示す基板１００に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。

信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ印加する交流電圧は、保持部１５０に保持された細胞２００の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

（２）接着物質７００を含む試薬を添加する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから接着物質７００を含む試薬を導入することで、保持部１５０を接着物質７００で修飾し、接着物質７００を介して保持部１５０と保持部に導入した細胞２００とを接着させる。なお接着物質７００による保持部１５０の修飾は前記（１）の工程の前に実施してもよい。

接着物質は細胞と特異的に結合な物質であれば特に制限はない。一例として、細胞表面にある物質と特異的に結合可能な分子（リガンド−レセプター、糖鎖−レクチン、抗原−抗体）や、細胞の脂質二重膜に結合する脂質オレイル基を有したＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅＡｎｃｈｏｒｆｏｒＭｅｍｂｒａｎｅ（ＢＡＭ）があげられる。中でも、ポリ−Ｌ−リジンが、比較的短時間に細胞表面と静電的に結合できる点で好ましい。

接着物質としてポリ−Ｌ−リジンを用いる場合、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とすると好ましい。また本工程は、細胞へのダメージを少なくするために、短時間で完了させるとよい。本工程の具体例として、ポリ−Ｌ−リジンを０．０１（ｗ／ｖ）％含む溶液を導入口１１３ａから３分間導入して、保持部１５０を置換する工程があげられる。

本工程を前記（１）の工程の後に実施する場合、信号発生器１４０から電極基板１２１・１２２へ交流電圧を印加した状態（つまり細胞への誘電泳動力が存在する状態）で実施すると、添加した接着物質７００を含む試薬の流れによる保持部１５０からの細胞２００の脱離を防止できる点で好ましい。前記好ましい態様で本工程を実施する場合、接着物質７００を含む試薬に、前記（１）で導入した、細胞２００を含む液体と同じ濃度の糖類（例えば、２５０ｍＭから３５０ｍＭのマンニトール）を含むとよい。

（３）細胞膜透過試薬を添加する工程
排出口１１３ｂから接着物質７００を含む試薬を排出した後、導入口１１３ａから細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を導入することで、保持部１５０に導入した細胞２００を標本化する。

細胞膜透過試薬の例として、エタノール、メタノールなどのアルコール類や、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、ジギトニンなどの界面活性剤があげられる。また添加する細胞固定試薬の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液や、金属塩系固定液があげられる。中でも細胞膜透過試薬としてはエタノールが、細胞固定試薬としてはホルムアルデヒドが、それぞれ好ましい。細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬の好ましい具体例として、０．１から１％のホルムアルデヒドを含んだ３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールがあげられる。細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬の導入時間（保持部への試薬置換時間）は５から１５分が好ましく、１０分前後がより好ましい。

（４）ブロッキング試薬を添加する工程
後述の標識工程における非特異標識の発生を防止するため、導入口１１３ａから洗浄液を導入して、残存した細胞膜透過試薬を除去した後、導入口１１３ａから非特異標識を防止するためのブロッキング試薬を導入する。洗浄液は、細胞膜透過試薬に含まれる有機溶媒成分（エタノール、ホルムアルデヒド等）を除去可能な水系溶媒であればよく、例えば、ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）があげられる。また洗浄液に界面活性剤を添加すると、液置換による洗浄が容易に行なえるため好ましく、前記好ましい洗浄液の一例として、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。

ブロッキング試薬としては、タンパク質や界面活性剤を含んだ水溶液が例示できる。具体的にはタンパク質としてはＢＳＡ、ゼラチン、カゼインなどが、界面活性剤としてはサポニン、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、ジギトニンなどが、それぞれ例示できる。ブロッキング試薬を導入する時間（保持部への試薬置換時間）は含まれる成分およびその濃度によって異なるが、ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含んだＰＢＳをブロッキング試薬として用いる場合、５から１５分導入すればよく、１０分前後の導入時間とすると好ましい。

（５）標識試薬を添加する工程
排出口１１３ｂからブロッキング試薬を排出した後、導入口１１３ａから標識試薬を導入して、標本化した細胞を標識させる（標識化細胞２１０）。標識試薬は、目的細胞の検出に適した標識物質の中から適宜選択すればよい。例えば目的細胞が血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の場合、蛍光標識された抗サイトケラチン抗体もしくは抗ＥｐＣＡＭ抗体を含む溶液や、白血球染色試薬である抗ＣＤ４５抗体と細胞核染色試薬である４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（商品名）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（商品名）等との混合溶液が使用できる。なお抗原抗体反応を利用して目的細胞を標識する場合であって、当該細胞における抗原発現量が少ないときは、当該抗原に対する抗体を含む標識試薬を添加後、添加した抗体に対する抗体を順次添加していくことで蛍光シグナルを増幅させる方法を採用してもよい。

（６）目的細胞２１０を選別する工程
標識試薬に由来するバックグラウンドの上昇を防止するため、導入口１１３ａから洗浄液を導入して、残存した標識試薬を除去した後、基板移動部３２０で基板１００をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部３４０および計測部により、標識化細胞（目的細胞）２１０の光学的情報（可視光または蛍光）および位置情報を取得し、目的細胞２１０の位置を検出する。洗浄液としては、標識試薬を除去できる水系の溶媒であればよく、一例として前記（４）の工程で洗浄液として用いた、ＰＢＳやＴｗｅｅｎ２０を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。目的細胞２１０がＣＴＣの場合、検出部３４０および計測部により、抗サイトケラチン抗体または抗ＥｐＣＡＭ抗体由来の蛍光が確認され、ＤＡＰＩ等の細胞核染色試薬由来の蛍光が確認され、かつ抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光が確認されない細胞を選別すればよい。

（７）目的細胞２１０を回収する工程
検出部３４０および計測部により検出した目的細胞２１０を回収するために、電極１２２をスペーサ１１３から取り外した後、ノズル４１０で吸引することで、基板１００から目的細胞２１０を回収する。電極１２２を取り外す際は、スペーサ１１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１１３が絶縁体１１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、目的細胞２１０が破壊されるからである。

目的細胞２１０の吸引は、基板移動部３２０およびノズル移動部４３０を用いて前記（６）の工程で検出した目的細胞２１０が標本化されている保持部をノズル４１０の中心に移動させ、ノズル４１０により液を吸引することで目的細胞２１０を回収する。なおノズル４１０による目的細胞２１０の吸引位置を、目的細胞２１０を標本化した保持部１５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、目的細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には目的細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部１５０の高さから垂直方向に保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。またノズル４１０による目的細胞２１０の吸引操作の前に、目的細胞２１０と保持部１５０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。

前記（６）の工程で検出した目的細胞２１０が標本化されている保持部をノズル４１０の中心に移動させる操作は、基板移動部３２０により前記保持部の位置情報からノズル４１０先端部の中心位置を保持部の中心（または保持部の中心から水平方向に一定距離ずらした位置）に合致させるよう基板１００を移動させた後、ノズル移動部４３０によりノズル４１０先端部の垂直方向の位置を、保持部１５０の高さから垂直方向に一定の高さ分高い位置（例えば、保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置）まで移動させて行なう。

検出（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）で取得するノズル４１０先端部の画像は不明瞭なため、そのままではノズル４１０先端部の位置を正確に把握するのは困難であり、目的細胞２１０が標本化されている保持部を正確にノズル４１０の中心へ移動させるのは困難である。本態様の微小粒子回収装置に設けたノズル４１０は図４に示すように、根元に照射部４４０を設けており、照射部４４０から光４５１を照射すると、導光部４６０を経由し、ノズル４１０先端から基板へ光が照射される。そうすることでノズル４１０先端部を、検出部３４０および計測部により、リング状の鮮明な画像として取得できるため、ノズル４１０先端部の位置を正確に算出することができ、目的細胞２１０が標本化されている保持部からのずれを算出することが容易となる。

同様にノズル４１０先端部の垂直方向の位置も、図４のノズルによりノズル４１０先端部から基板へ光を照射し、検出部３４０および計測部により得られる画像のコントラストまたは画像微分値の最大値の変化等を計測し、焦点位置を算出することで、正確に算出することができる。その一例を図７に示す。

なお前述した操作を、前記（６）の工程（細胞を選別する工程）を行ないながら実施する際は、ノズル４１０先端部から照射される光および目的細胞由来の蛍光以外の光が検出部（対物レンズ）３４０に極力入射されない必要がある。本態様の微小粒子回収装置に設けたノズル（図４）は、根元から先端部までの間に２か所屈曲しており、ノズル根元から照射する光４５１の方向が基板および検出部３４０に直接照射しない方向となっているため、好ましいノズル４１０の態様といえる。

図３に示す装置では、ノズル４１０で目的細胞２１０を吸引する方法として、ポンプ４２０を用いた陰圧により吸引する方法を採用している。目的細胞２１０は保持部１５０に比較的強く接着されていることから、ポンプとしてシリンジポンプを用いる場合は高流速で吸引する必要があり、具体的には０．０１μＬ／ｓ以上の流量が必要である。しかしながら流量を大きくしすぎると、流路内に気泡が発生し、著しく流量が低下してしまうため、流量は０．０１から５．０μＬ／ｓの間が好ましい。

ノズル４１０の内径は、吸引後のノズル４１０の詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくするとよい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、ノズル４１０の内径を２５μｍから３５μｍの間とするとよい。

（８）回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出する工程
ノズル４１０による吸引で回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出し、回収チューブ５００へ目的細胞２１０が吐出されたかどうかを検出部３４０で検出する。図３に示す装置では、ノズル２１０で目的細胞２１０を吐出する方法としてポンプ４２０を用いた陽圧により吐出する方法を、検出部３４０で目的細胞２１０を検出する方法として、回収チューブ５００底面に吐出された目的細胞２１０由来の蛍光画像を底面側から（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）で取得する方法を、それぞれ採用している。なお検出部３４０で目的細胞２１０を検出する方法としては、前述した方法の他にも、回収チューブ５００底面に吐出された目的細胞２１０由来の蛍光画像を回収チューブ５００開口部側から検出部３４０および計測部で取得する方法や、あらかじめ目的細胞２１０を含む溶液および比重の重たい液体を回収チューブ５００へ滴下した上で、当該回収チューブ５００へ目的細胞２１０を吐出することで重層させた後、回収チューブ５００底面側に設けた検出部３４０から蛍光画像を取得する方法があげられる。

回収チューブ５００に回収された目的細胞２１０はその後遺伝子解析等さらなる解析に供される。

（９）目的細胞の近傍に薬液を吐出する工程
本態様の微小流路回収装置は、前記（６）の工程で検出した目的細胞に特殊な薬液を吐出することも可能である。あらかじめ必要な薬液をノズルおよび吸引吐出用ポンプで必要量吸引し、前記（７）の工程に記載の方法と同様な方法で、前記（６）の工程で検出した目的細胞が標本化されている保持部をノズルの中心に移動させた後、ノズルおよび吸引吐出用ポンプで前記保持部へ薬液を吐出すればよい。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本例の内容に限定されるものではない。

基板として図１（図２）に記載の基板を、微小流路回収装置として図３に示す装置を、ノズル４１０として図４に示すノズルを、それぞれ用いた。またノズル照射部４４０としてＬＥＤを用いた。ノズル照射部４４０であるＬＥＤをＯＮにすると、導光部４６０によりガラスからなる先端部まで導光され、先端部から図１に記載の基板（ただし、電極１２２はスペーサ１１３から取り外した状態）へ光４５２が発せされる。得られた蛍光画像を図８に示す。ノズル照射部４４０から光を照射（ＬＥＤＯＮ）することで、リング状からなる保持部の形状認識が容易となり、保持部からのノズル４１０の位置ずれを検出できることを確認した。

一方、ノズル４１０位置はそのままとし、検出部３４０である対物レンズの垂直位置を移動させた。得られた画像のコントラストが最大または画像微分値の最大値の変化などを計測し焦点位置を求めた。次に、この焦点位置と検出部３４０を介して基板に設けた絶縁体１１２表面の焦点位置を対物レンズを上下させることで得られた画像微分値の最大値の変化などを計測し焦点位置を決定した（図７参照）。前記２つの焦点距離の差を計算で求めることでノズル４１０先端の垂直方向の位置を、基板に設けた保持部１５０の高さから垂直方向に一定の高さ分高い位置まで正確に移動できることを確認し、また保持部１５０に保持された目的細胞の吸引および回収チューブへの吐出ができることを確認した。

１００：基板
１１０：微小粒子導入保持手段
１１１：遮光部材
１１２：絶縁体
１１１ａ、１１２ａ：貫通孔
１１３：スペーサ
１１３ａ：導入口
１１３ｂ：排出口
１１３ｃ：貫通部
１２１、１２２：電極
１３０：導線
１４０：信号発生器
１５０：保持部
２００：細胞
２１０：標識化細胞（目的細胞）
３１０：ベース
３２０：基板移動部
３３０：励起光源
３４０：検出部（対物レンズ）
３５０：計測部（画像取得カメラ）
３６０：解析部
４１０：ノズル
４２０：吸引吐出用ポンプ
４３０：ノズル移動部
４４０：ノズル照射部
４５１：ノズル照射部からの光
４５２：ノズル先端部から発せられる光
４６０：導光部
５００：回収チューブ
６００：誘電泳動力
７００：接着物質

Claims

微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板と、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段と、ノズルによる吸引吐出により当該目的とする微小粒子を回収する回収手段とを備えた、微小粒子回収装置であって、
前記ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けた、前記回収装置。
ノズルが１か所以上屈曲している、請求項１に記載の回収装置。
回収手段に設ける照射手段を、当該手段で照射された光がノズルの先端部から発せられる光の照射位置に照射されない位置に設ける、請求項１または２に記載の回収装置。
以下の（１）から（４）の工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載の回収装置を用いた、液体に含まれる微小粒子を回収する方法。
（１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を検出する工程
（４）目的とする微小粒子を回収手段で回収する工程
以下の（１）から（４）の工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載の回収装置を用いた、液体に含まれる目的の微小粒子に液体を投与する方法。
（１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を検出する工程
（４）回収手段を用いて目的とする微小粒子に液体を投与する工程
前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、請求項４または５に記載の回収方法。