JP5712396B2 - イメージングセルソーター - Google Patents
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Description
1)目視による形態学的な細胞分類:例えば尿中に出現する異型細胞検査による膀胱がんや尿道のがんなどの検査や血中の異型細胞分類、組織中における細胞診によるがん検査などをあげることができる。
2)蛍光抗体法による細胞表面抗原(マーカー)染色による細胞分類:一般にCDマーカーと呼ばれる細胞表面抗原を、それに特異的な蛍光標識抗体で染色するもので、セルソーターによる細胞分離やフローサイトメーターや組織染色によるがん検査などに用いられている。もちろんこれらは、医療面のみならず、細胞生理研究用や、工業的な細胞利用の上でも多用されている。
3)あるいは、幹細胞の分離に関しては、細胞内に取り込まれる蛍光色素をレポーターとして幹細胞を含む細胞を大まかに分離し、更にその後で実際に培養を行うことで目的の幹細胞を分離する例がある。これは、幹細胞の有効なマーカーがまだ確立されていないので、実際に培養し、分化誘導したもののみを利用することで、実質的に目的細胞を分離しているのである。
また、現在の、細胞を用いた解析手段については、対象となる細胞がアポトーシス等の状態となっているかどうか、細胞回収時に解析をする手段を有していないという課題があった。
また特開2011−257241では、血液中のがん細胞の存在有無を検出するための手段として、がん細胞の表面のみに存在する分子(がんマーカー)と選択的に結合する抗体に蛍光色素を取り付けたものを血液と作用させて、血中にがん細胞が存在する場合はがん細胞が蛍光を発するようにすることで検出する技術が示されている。その手段と装置構成としては、マイクロチップ中を流れるがん細胞を含む血液に蛍光励起光を照射した後、がん細胞から発せられた蛍光を、特定の波長の光のみ反射してその他の波長の光は通過させる鏡(ダイクロイックミラー)を複数回通過させて各ステップでの特定の波長幅の蛍光を抽出し、その波長幅の蛍光の各々について光検出器で蛍光量を測定する仕組みとなっているが、ダイクロイックミラーを通過する際に検出すべきがん細胞からの蛍光量もダイクロイックミラーを通過する回数に応じて減衰するため、各波長幅での計測する蛍光強度にダイクロイックミラー通過に起因した違いが発生し、特に後段の波長での微弱な蛍光を検出することが難しく、そのため多重染色したがんマーカー分子の定量的な検出が困難であった。また、多数の蛍光色素を同時に利用するために波長の異なる複数の励起光をがん細胞に照射し、さらに発せられた複数波長の蛍光を同時に検出するためには、蛍光波長と励起波長が重複する複数のダイクロイックミラーを通過させて光を波長毎に分解せねばならないため、装置構成が複雑になり、また、各波長帯域も狭くする必要があり、シグナル蛍光が一層減衰するばかりでなく、波長帯が近い光を分離することは原理的にも困難であった。
すなわち、本発明は、以下の装置、システムおよび方法を提供する。
(B) 上記第1の装置からの染色された細胞の試料液を濃縮・分離・精製する第2の装置と、
(C) 上記第2の装置からの細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第3の装置と、
(D) 上記第1〜第3の装置にわたって連続的に上記細胞試料液を送液する第4の装置と、
(E) 上記各装置の動作を制御し、上記細胞試料の解析を行う制御・解析部と
を備える細胞分析装置システムであって、
(a) 上記第1の装置が、
上記細胞試料液中の細胞を濃縮、染色、洗浄するフィルターを備えたチャンバーと、
上記細胞試料液、染色液および洗浄液をそれぞれ収容する容器と、
各上記容器中の各液を上記チャンバー中に順次導入する機構と、
を備え、
(b) 上記第2の装置が、
対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、上記流路が、上記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、上記濃縮された上記細胞の検出および上記対象細胞の選別が行われる、上記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
各上記流路を流れる上記細胞が、上記第一の流路において濃縮され、かつ上記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各上記流路を流れる上記細胞に対して外力を与える機構と、
上記第二の流路中を流れる上記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも200フレーム/秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
を備え、
(c) 上記第3の装置が、
試料液を添加して反応させる反応槽と、
上記反応槽との間で熱を交換する熱交換槽と、
上記熱交換槽の温度を制御する温度制御機構と、
を備える、細胞分析装置システム。
(2)上記細胞試料液中の精製された細胞の遺伝子解析・発現解析を行う第3の装置の前段に、上記細胞試料液を送液する第4の装置によって搬送された上記細胞の内容物を細胞破砕によって試料液に溶出させる細胞破砕機構をさらに含み、
上記制御・解析部が、上記細胞試料液を送液する第4の装置によって上記第2の装置からの上記細胞試料液が上記細胞破砕機構へ搬送され、上記細胞破砕機構において破砕された試料液が、上記第4の装置によって上記第3の装置に搬送されるように上記各部を制御する、上記(1)に記載の細胞分析装置システム。
(3)上記細胞破砕機構が、
上記細胞試料を容れるための容器と、
上記容器内にて細胞を破砕するための破砕用回転体と、
上記容器内にて細胞を破砕するための研磨剤とを含み、
上記細胞試料と上記研磨剤とが上記容器の内部に添加され、自転および公転運動が厳密に制御された上記破砕用回転体の動きにより、上記細胞試料が破砕される、上記(2)に記載の細胞分析装置システム。
(4)上記細胞破砕機構がさらに回転シャフトを含み、
上記破砕用回転体が上記回転シャフトにより上から押し付けられることによって、上記容器の内部で回転し、上記破砕用回転体と上記回転シャフト間の摩擦力および滑りの程度が、上記破砕用回転体と回転シャフト間の圧力により制御される、上記(3)に記載の細胞分析装置システム。
(5)上記細胞破砕機構が、破砕用回転体の回転軸と回転シャフトの回転軸をずらすことにより、容器の側面に対して直角方向に破砕用回転体を押し付ける力を発生させることが可能な機構を備える、上記(4)に記載の細胞分析装置システム。
(6)上記細胞破砕機構が、上記回転シャフトの磁力、静電気力、または気体の圧力差による吸引力により上記破砕用回転体が上記容器の内部から持ち上げられ、除去されることが可能な機構を備える、上記(4)に記載の細胞分析装置システム。
(7)上記細胞破砕機構において、上記容器の自動交換を可能とする複数の容器を搭載した駆動機構を備えることにより異なる細胞試料間での汚染を排除できることを特徴とする、上記(3)〜(6)のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
(8)上記細胞破砕機構において、未使用の上記容器の内部には上記破砕用回転体が機密性シールにより封印して容れられており、上記細胞試料破砕時には上記容器および上記破砕用回転体が汚染されていないことが保証できることを特徴とする、上記(3)〜(7)のいずれかに記載の細胞分析装置システム。
(9)(i) 対象細胞を含む細胞を含有する細胞試料液を流す流路を備えるセルソーターチップであって、上記流路が、上記細胞の濃縮が行われる第一の流路と、上記濃縮された上記細胞の検出および上記対象細胞の選別が行われる、上記第一の流路から分岐する第二の流路とを含む、セルソーターチップと、
(ii) 各上記流路を流れる上記細胞が、上記第一の流路において濃縮され、かつ上記第二の流路において所望の方向に収束されるように、各上記流路を流れる上記細胞に対して外力を与える機構と、
(iii) 上記第二の流路中を流れる上記細胞に光を照射する光照射手段と、少なくとも200フレーム/秒の画像取り込みレートで該細胞の画像を取得する高速カメラとを含む光学系と、
(iv)上記各部の動作を制御し、上記光学系により取り込まれた各上記細胞の画像を解析する制御・解析部と、
を備える、画像検出型一細胞分離・精製装置。
(10)上記外力が、超音波放射圧、重力、静電力、または誘電電気泳動力である、上記(9)に記載の装置。
(11)上記対象細胞を含む細胞試料が、血液に由来する、上記(9)または(10)に記載の装置。
(12)上記対象細胞が、癌細胞を含む、上記(9)〜(11)のいずれかに記載の装置。
(13)上記制御・解析部が、上記光学系から得られる上記細胞の画像を2値化し、該2値化画像の輝度重心、面積、周囲長、長径、および短径からなる群から選択される少なくとも1つの指標によって、各上記細胞を一細胞レベルで検出し識別する、上記(9)〜(12)のいずれかに記載の装置。
(14)上記細胞試料液中の上記細胞が蛍光標識されており、上記光学系が、蛍光検出手段をさらに含み、上記細胞の蛍光画像の情報が追加的な指標として上記制御・解析部により利用される、上記(13)に記載の装置。
(15)同じ長さと断面積の1つの試料流路とその両脇に対称に配置された2つのバッファ液流路が合流するように配置され、合流後に下流で再び同じ長さと断面積の中央の回収用流路とその両脇の2つの廃液流路に分配され、上流の3つの流路の入り口を覆うシース液リザーバーと、その中に試料を満たす試料液リザーバーが、その断面積の比が、流路数の比と同じ2:1となるように配置されており液が流れても両者の液面高さが一致するように構成されており、同様に下流でも廃液リザーバーと回収細胞用リザーバーの断面積の比が2:1となるように配置されており、合流点の上流に高速カメラおよび蛍光検出によって細胞を同定する機構を有し、合流点に対称にゲル電極が接するように配置されており、排除したい細胞にのみ電場を印加することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
(16)上記セルソーターのリザーバーにおいて、シース液リザーバー上面に配置された栓と、栓を貫通して圧縮空気を印加する手段と、シース液リザーバーと試料リザーバーに液を連続して追加供給できる手段と、シース液リザーバーと試薬リザーバーの両者での液面高さを計測することができる電気センサーとを備えることを特徴とした上記(15)に記載のセルソーター。
(17)上記セルソーターのリザーバーにおいて、試薬液および2つのシース液を保存する個別の容器が、おのおの3つの流路の上流側入り口にそれぞれ配置されていることを特徴とした上記(15)に記載のセルソーター
(18)画像認識型セルソーターにおいて、細胞像の中での核の像の有無を基準として、選択的に細胞分裂中の細胞を回収することを特徴としたオンチップ・セルソーター。
(19)画像処理型セルソーターにおいて、像のブレを防ぐために、高速カメラの撮影各フレームレート速度において、各フレームで一回発火する時間について、
フラッシュ時間 = 画素サイズ/流速
の関係で決めることを特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(20)開口数0.3以下の対物レンズとズームレンズを組み合わせた焦点深度と被写界深度がマイクロ流路の高さ程度まで維持できる光学系を用いる事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(21)垂直に上方から鉛直下方向に試料液が流れるように配置した事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(22)試料微粒子に斥力を発生させる電極が配置された面に対向するマイクロ流路の内壁面が凸状の形状となっている事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(23)ゲルがゾル状態にあるときに液の表面張力で流路への液の漏出を防ぐことができる一定の距離で支柱が繰り返し並んだ構成の一対のゲル電極を流路に並行して配置されている事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(24)画像認識によって得られた細胞の形状から、
によって、Rが1.1未満の細胞を心筋細胞として精製する事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(25)サイドシース液に水より比重が軽く水と混ざり合わない油を用いた事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
(26)水溶液中の試料微粒子を回収する際に、試料水溶液の伝導率が102μS/cm以下となる溶液を用いる事を特徴としたオンチップ・セルソーターシステム。
上記分岐点よりも上流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致する第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導くための外力付加機構と、
上記光学系および上記外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備える、オンチップ・セルソーターシステム。
[2]上記光学系による上記デジタル画像から上記細胞識別結果を得るタイミングと上記外力付加機構による上記外力を加えるタイミングとの間のタイムラグが最小となるように構成されている、上記[1]に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[3]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導くための外力付加機構と、
上記光学系および上記外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記光学系が、開口数0.3以下の対物レンズと、該対物レンズに光学的に結合されたズームレンズとを備えた顕微鏡を含む、オンチップ・セルソーターシステム。
[4]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く外力付加機構と、
上記光学系および上記外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記第1の流路の上流側から下流側へほぼ鉛直下方向に試料液が流れるように、上記第1の流路が重力の向きに対してほぼ平行になるように上記セルソーターチップが配置されている、オンチップ・セルソーターシステム。
[5]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く外力付加機構と、
上記光学系および上記外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記外力付加機構が上記第1の流路を流れる細胞を含む微粒子に電気力を付加するためのゲル電極または金属電極を含み、上記試料液の導電率が102μS/cm以下である、オンチップ・セルソーターシステム。
[6]上記第1の流路の上流側の上記第1の領域よりも上流の第3の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞を整列させるための外力を該細胞に付加するさらなる外力付加機構をさらに備える、上記[1]〜[5]のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[7]上記試料液中の細胞を整列させるための外力を該細胞に付加する上記さらなる外力付加機構が、電気力またはシース流により外力を付加するものである、上記[6]に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[8]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く外力付加機構と、
上記光学系および上記外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
さらに、
上記第1の流路の上流側に流体接続した、シース液用のバッファ液を溜めたリザーバーと、
上記第1の流路に細胞を含む試料液を導入するための、該流路の上流側に流体接続した試料液導入用流路と、を備え、
上記試料液導入用流路の上記第1の流路に流体接続する側の先端部が、上記バッファ液の該第1の流路への導入部よりも下流側まで伸びている、オンチップ・セルソーターシステム。
[9]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の予備的領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞を整列させるための外力を該細胞に付加する第1の外力付加機構と、
上記分岐点よりも上流の、上記予備的領域よりも下流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く第2の外力付加機構と、
上記光学系ならびに上記第1および第2の外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記第1の外力付加機構が、上記第1の流路の一面に沿って配列された、試料液中の細胞を含む微粒子に斥力を発生させるための櫛形電極であり、上記第1の流路の該流路に垂直な断面が該微粒子の整列を促進するために上記電極が配置された上記面に対向する面の中央に向かってテーパー状または凸状となっている、オンチップ・セルソーターシステム。
[10]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の予備的領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞を整列させるための外力を該細胞に付加する第1の外力付加機構と、
上記分岐点よりも上流の、上記予備的領域よりも下流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く第2の外力付加機構と、
上記光学系ならびに上記第1および第2の外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記第2の外力付加機構が、上記第1の流路の両側面で試料液と接触するように配置されたゲル電極であり、ゲルがゾル状態にあるときに該ゾル液が上記第1の流路へ漏出しないように、該ゾル液の表面張力で該流路への該ゾル液の漏出を防ぐことができるように一定の間隔で上記第1の流路に沿って両側面に設けられたスリットのアレイを介して上記試料液と接触するように構成されている、オンチップ・セルソーターシステム。
[11]対象細胞を含む細胞を含有する試料液を流すための第1の流路を備えるセルソーターチップであって、上記第1の流路が下流側の分岐点で、上記対象細胞を含む液を回収するための対象細胞回収用流路と、上記対象細胞以外の細胞を含む液を回収するための廃液回収用流路とに分岐している、セルソーターチップと、
上記分岐点よりも上流の予備的領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞を整列させるための外力を該細胞に付加する第1の外力付加機構と、
上記分岐点よりも上流の、上記予備的領域よりも下流の第1の領域で上記第1の流路を流れる上記試料液中の細胞のデジタル画像を取得して、該画像のデジタル解析により上記対象細胞を識別するための光学系と、
上記分岐点よりも上流の上記第1の領域とほぼ一致するかまたはそれよりも下流の第2の領域で、上記画像解析による細胞識別結果に基づいて、上記第1の流路を流れる対象細胞または対象細胞以外の細胞に対して外力を加えて該細胞の進行方向をシフトさせ、上記対象細胞を上記対象細胞回収用流路へ、上記対象細胞以外の細胞を上記廃液回収用流路へ導く第2の外力付加機構と、
上記光学系ならびに上記第1および第2の外力付加機構の動作を制御する制御部と
を備え、
上記第1の外力付加機構が、上記第1の流路の上流側に流体接続する、サイドシース流を生成するためのサイドシース液を流す一対の流路を含み、上記サイドシース液が水より比重が軽く水と混ざり合わない油である、オンチップ・セルソーターシステム。
[12]上記光学系による上記デジタル画像から上記細胞識別結果を得るタイミングと上記第2の外力付加機構による上記外力を加えるタイミングとの間のタイムラグが最小となるように構成されている、上記[9]〜[11]のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[13]上記細胞を各回収用流路へ導く外力付加機構が、該細胞に電気力を付加するためのゲル電極または金属電極を含む、上記[1]〜[12]のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[14]上記対象細胞が心筋細胞であり、
上記光学系により画像認識によって得られた細胞の形状から、下記式
によって、Rが1.1未満の細胞を心筋細胞として識別する、上記[1]〜[13]のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
[15]上記[1]〜[14]のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステムを用いて、試料液中の対象細胞を選別する方法。
〈1〉被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
上記細胞に対して照射するための明視野光源および蛍光光源を含む光学系と、
上記セルソーターチップの上記流路を流れる上記試料液中の上記細胞の明視野画像と上記細胞に結合した蛍光標識物質の蛍光強度および上記細胞の蛍光画像とを同時に取得する検出系と、
上記明視野画像、上記蛍光強度、および上記蛍光画像に基づいて、上記流路を流れる多核細胞および/または細胞クラスターを同定する制御・解析手段と、
上記同定された多核細胞および/または細胞クラスターを選択的に回収する手段と
を備えるオンチップ・セルソーターシステム。
〈2〉上記制御・解析手段が、
i)上記細胞のサイズ(面積)、周囲長、および該面積と該周囲長によって得られる上記細胞の表面の凹凸の程度を示すRの値からなる群から選択される1つ以上のデータ、ならびに
ii)上記細胞に結合した上記標識物質の蛍光の波長と強度のスペクトル、上記細胞内で蛍光染色された1つ以上の領域の細胞内での各重心座標および面積からなる群から選択される1つ以上のデータ
を取得し、上記データに基づいて上記流路を流れる多核細胞および/または細胞クラスターを同定する、上記〈1〉に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
〈3〉上記選択的に回収した多核細胞および/または細胞クラスター由来の遺伝子の核酸配列を計測する手段をさらに備える、上記〈1〉または〈2〉に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
〈4〉上記明視野画像と上記蛍光画像とを、1つの高速カメラの受光面上に、分割して同時に表示する機能を有する画像分割機構を備える上記〈1〉〜〈3〉のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
〈5〉上記明視野画像と上記蛍光画像とで画像の拡大率が異なるように調整する機構を備える、上記〈4〉に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
〈6〉血中がん細胞の候補細胞を同定するために使用される、上記〈1〉〜〈5〉のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
〈7〉上記〈1〉〜〈6〉のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステムを用いて被験者由来の細胞試料液から血中がん細胞の候補細胞を同定する方法であって、
以下の工程:
(1)健常な血液中では存在しない細胞クラスター(塊)を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、
(2)健常な血液中では存在しない多核細胞を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、
(3)健常な血液中では存在しない巨大細胞を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、および/または
(4)上記(1)、(2)、または(3)に加えて、がん細胞のバイオマーカーの1つあるいは複数に対する蛍光抗体の蛍光強度の存在と組み合わせた解析でがん細胞と同定して選択的に回収する工程
を含む、方法。
〈8〉上記蛍光抗体が、EpCam抗体、K-ras抗体、またはサイトケラチン抗体である、上記〈7〉に記載の方法。
〈9〉さらに以下:
上記(1)について、明視野像によるR>1.3による評価、あるいは、明視野像による上記細胞のサイズと蛍光像による核の数および分布(すなわち隣接する複数の核の像について、その重心の距離が互いに3μm以上離れている事)によって判別すること、
上記(2)について、明視野像によってR<1.3で、かつ、核の数と分布(すなわち隣接する複数の核の像について、その重心間の距離が互いに3μm以内で離れている事)によって判別すること、
上記(3)について、明視野像によって、R<1.3かつ、細胞サイズが直径に換算して20μmを超えている事によって判別すること、または
上記(1)〜(3)を組み合わせて、1つ以上の合致条件があったものをがん細胞として判定すること
を含む、上記〈7〉または〈8〉に記載の方法。
〈10〉光が反射する方向を3次元に調整可能な角度調整機能付きの第1のダイクロイックミラー、
上記ダイクロイックミラーで反射した画像データを含む光が導入されるフィルター系、
画像サイズを調整するための可動式の遮蔽板からなり、上記フィルター系を介した光が導入される画像サイズ調整系、
上記画像サイズ調整系を介した光が導入される、光が反射する方向を3次元に調整可能な角度調整機能付きの第2のダイクロイックミラー、および
上記第2のダイクロイックミラーを介した光が導入される、結像位置の差を補正するための光学レンズ系
を備える光学明視野/蛍光顕微鏡系で使用するための光学モジュールであって、
上記光学レンズ系により上記画像の拡大および縮小が可能であり、明視野画像と蛍光画像との間で拡大率の異なる画像を生成することができるように構成されている光学モジュール。
〈11〉蛍光染色した細胞を含む試料液中の上記細胞の明視野画像と上記細胞に結合した蛍光標識物質の蛍光強度および上記細胞の蛍光画像とを同時に取得するために使用される、上記〈10〉に記載の光学モジュール。
(1)被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
上記細胞に対して照射するための明視野光源、1つまたは2つ以上の蛍光光源、それぞれの波長の光を伝導する光ファイバー、および照射部位において観察対象に光を集束させる集光用レンズを含む光学系と、
上記セルソーターチップの上記流路を流れる上記試料液中の上記細胞の蛍光強度を検出するための蛍光を伝導する、1つまたは2つ以上の蛍光波長の各々に対応した光ファイバー、光ファイバーの後段に配置された特定の蛍光波長を通過させるバンドパスフィルター、および蛍光検出器を含む、上記細胞に結合した蛍光標識物質の前記1つまたは2つ以上の蛍光波長に対応した蛍光強度を同時に取得する第1の検出系と、
上記細胞の明視野画像と上記細胞の蛍光画像とを同時に取得する第2の検出系と、
上記各系の動作を制御し、上記明視野画像、上記蛍光強度、および上記蛍光画像に基づいて、上記流路を流れる多核細胞および/または細胞クラスターを同定する制御・解析手段と、
上記同定された対象物を選択的に回収する手段と
を備えるオンチップ・セルソーターシステム。
(1)細胞の濃縮、蛍光抗体標識(あるいは再培養を行う場合は必要に応じてアプタマー等の可逆蛍光標識マーカー)での染色、洗浄を含むプロセスを連続で行う細胞濃縮・染色・脱色部と、
(2)チップ基板上に形成したマイクロ流路を流れる細胞から、毎秒1万画像程度の細胞像の画像データを取得して、その画像情報の分析結果に基づいてリアルタイムで毎秒1万細胞を精製する画像検出型1細胞分離・精製(セルソーター)部と、
(3)1細胞レベルでの細胞内状態を計測する1細胞ゲノム解析・発現解析部と、
(4)上記各部の間での試料液の搬送を行うための送液部と、
(5)上記各部の動作を制御し、上記解析を行うための制御解析部と
を備える。
図1は、本発明の細胞分析装置を用いて行う、血中サンプルの採取から分析までの手順の一例を図示したものである。
フラッシュ時間 = 画素サイズ/流速
で、各シャッターのインターバルにおいてフラッシュを1回発光させれば良い。たとえば、1/2,000秒カメラの画素サイズは12 μm×12 μmであり、20倍の対物レンズで観察した場合の画素分解能は0.6 μm/pixelであることから、60cm/sの流れで、1μsの速度でフラッシュ発火を行うことができるLED光源を用いれば、実際にブレの無い画像を取得することができる。
を用いて、実際の周囲の長さと、面積から円で換算した場合の周囲の長さを比較することで、表面の粗さ(R)を定量的に数値化することができる。実際に、図28下段にRの数値を示しているが、より詳細な計測をすることで、Rの値が約1.1未満である場合にはこの細胞は心筋細胞、これより大きい値の場合は他の細胞であることがわかっている。このように画像認識によって心筋細胞を精製するための具体的数値化したRを指標とする事で細胞表面の凸凹さの違いに基づいた細胞の識別が可能となる。
10 細胞濃縮・染色・脱色モジュール
101 細胞サンプル容器
102 染色剤容器
103 洗浄剤容器
104 分注ヘッド
105 ターンテーブル
106 濃縮・脱色フィルター
107 濃縮チャンバー
108 チャンバー
109 圧力ポンプ
110 廃液回収チューブ
111 回収ヘッド
112 回収チューブ
113 回収チップ
114 シャーシ
115 回転アーム
20 画像検出型1細胞分離・精製モジュール
201 レーザー
202 ミラー
203 集光レンズ
204 ダイクロイックミラー
205 フィルター
206 蛍光検出用フォトマルチプライヤー
207 高速カメラ
208 前方散乱光検出用フォトダイオード
209 セルソーターチップ
210 チップ基板
211 マイクロ流路
212 流入口
213 流出口
214 細胞濃縮液入り口
215 細胞濃縮部
216 収束部
217 選別部
218 細胞検出領域
219 印加後の細胞の流れ
220 印加前の粒子の流れ
221 流出口
222 流出口
223 廃液回収部
224 細胞回収部
225 V字櫛形電極
30 1細胞ゲノム解析・発現解析モジュール
31 第一の温度制御ユニット
32 第二の温度制御ユニット
301 反応槽
302 熱交換槽
303 液体リザーバタンク
304 ポンプ
305 切り替えバルブ
306 補助温度制御機構
307 インレットA
308 インレットB
309 アウトレットA
310 アウトレットB
311 サンプル液
312 蛍光検出器
313 制御解析部
314 逆支弁
315 制御信号
40 送液モジュール
401 分注ヘッド
402 分注チップ
403a,b Z軸移動ガイド
404 Z軸移動モータ
405a,b アーム回転モータ
406 シャーシ
50 制御・解析モジュール(コンピュータ)
801 容器
802 微量サンプル
803 回転体
804 回転シャフト
805 試料
806 研磨剤
810 回転体
811 容器
812 柔軟性構造体
813 回転シャフト
814 先端部位
815 バネ機構
820 曲面カット
821 擂鉢状カット
822 噛み合い構造
823 半球型回転体
824 卵状回転体
825 突起型回転体
826 お碗状回転体
830 容器
831 回転体
832 研磨剤
833 封印
834 サンプル
835 回転シャフト
836 成分
840 一体化容器
841 開封用カッター
1301 セルソーターチップ
1302,1304,1306 上流側流路
1303,1305,1307 下流側流路
1308 試料液用入り口開口部
1309,1310 シース液用入り口開口部
1311 シース液リザーバー
1312 廃液リザーバー
1313,1314 シース液用出口開口部
1315 精製試料液用出口開口部
1316 ゲル充填のための流路
1317 ゲル充填のための入り口開口部
1318 ゲル充填のための出口開口部
1319 電線
1320 電源
1321 スイッチ
1322 試料液リザーバー
1323 精製試料回収用リザーバー
1401 セルソーターチップ
1402 キャップ
1403 シース液リザーバー
1404 試料液リザーバー
1405 加圧空気導入パイプ
1406 試料溶液導入チューブ
1407 シース液導入チューブ
1408 水位計測センサー
1409 流路
1501 セルソーターチップ
1502 大型リザーバー
1503 空気圧印加装置
1504 圧力センサー
1505 分配バルブ
1506 選別試料回収リザーバー
1507 廃液回収リザーバー
1601 試料溶液の流れ
1602,1603 サイドシース流
1604 細胞モニター領域
1605 ゲル電極
1606 選別試料回収流路
1607 サイドシース流
2001 セルソーターチップ
2002 溶液リザーバー
2003 バッファ導入装置
2004 圧力センサー
2005 分配バルブ
2006 試料液導入装置
2007 試料液流路
2008 バッファ流路
2009 ソーティング用外力印加機構
20101,20102,20103 選別試料、廃液回収リザーバー
2101 セルソーターチップ
2102 バッファリザーバー
2103 バッファ導入装置
2104 圧力センサー
2105 バルブ
2106 試料液導入装置
21061 試料液導入流路
2107 試料液とバッファ液の流路
2109 ソーティング用外力印加機構
21101,21102 選別試料、廃液回収リザーバー
23001 チップ
23002 サンプル導入口
23003 目的粒子
23004 不要粒子
23005 マイクロ流路
23006 粒子整列機構
23007 粒子整列外力インプット(電気力またはシース流)
23008 粒子検出機構
23009 粒子精製機構
23010 粒子精製外力インプット((ゲルまたは金属)電極+電気力)
23011 目的粒子回収口
23012,23013 不要粒子溜
24001 支持基板
24002 金属薄膜電極第1層
24003 金属薄膜電極第2層
24004 絶縁膜層
24005 サンプル流路
25001 サンプル導入口
25002 マイクロ流路
25003 金属薄膜積層型平行櫛形電極
25004 サンプル粒子
25005 金属薄膜積層型V字櫛形電極
25006 シース流路
25007 底面の電極
26001 目的粒子
26002 不要粒子(負帯電)
26003 不要粒子(正帯電)
26004 マイクロ流路
26005 粒子精製電極
26006 目的粒子回収口への流れ
26007,26008 不要粒子溜への流れ
27001 マイクロ流路
27002 電極用ゲル注入口
27003 電極用ゲル通路
27004 電極用ゲル液絡部
27005 電極用ゲル排出口
27006 金属線
27007 直流電圧源
27008 電圧スイッチング機構
27009 サンプル粒子
27010 金属薄膜電極
3001 試料水溶液導入口
3002,3003 油導入口
3004 合流領域
3005 試料水溶液
3006 油
3200 明視野光源
3201 コンデンサレンズ
3202 セルソーティング部
3203 対物レンズ
3204,3206,3208 蛍光光源
3205,3207,3209 蛍光検出系
3210 高速カメラ(画像検出系)
3400 明視野光源3401 コンデンサレンズ
3402 セルソーティング部
3403 対物レンズ
3404,3406,3408 蛍光光源
3405.3407,3409 蛍光検出系
3410 画像分割系
3411 高速カメラ(画像検出系)
3501 入力光路(画像)
3510,3520,3530 画像分割部
3511,3521,3531 角度調節機能付きダイクロイックミラー
3512,3522,3532 フィルター系
3513,3523,3533 画像サイズ調節系
3514,3524,3534 角度調節機能付きダイクロイックミラー
3515,3525,3535 光学レンズ系
3600 細胞
3601 入力画像
3602 高速カメラ受光面
3610 出力画像1(明視野)
3620 出力画像2(蛍光:核染色)
3621 核蛍光像
3701 高速カメラ受光面像
3801〜3807 蛍光励起光源
3808〜3814 励起光源コントローラ
3815〜3820 蛍光検出器
3821 励起光フィルター
3822 レンズ
3823 蛍光フィルター
3824,3825 光ファイバー
3826 集光用マイクロレンズ
3827 マイクロチップ
3828 対物レンズ
3829 マルチビューユニット
3830 高速カメラ
3831 光源コントロールユニット
3832 蛍光検出コントロールユニット
4000 明視野光源
4001 コンデンサレンズ
4002 セルソーティング部
4003 対物レンズ
4004,4006,4008 蛍光光源
4005.4007,4009 蛍光検出系
4010 画像分割系
4011 高速カメラ(画像検出系)
Claims (12)
- 被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
前記細胞に対して照射するための明視野光源および蛍光光源を含む光学系と、
前記セルソーターチップの前記流路を流れる前記試料液中の前記細胞の明視野画像と前記細胞に結合した蛍光標識物質の蛍光強度および前記細胞の蛍光画像とを同時に取得する検出系と、
前記明視野画像、前記蛍光強度、および/または前記蛍光画像に基づいて、前記流路を流れる巨大細胞または細胞クラスターを同定する制御・解析手段と、
前記同定された巨大細胞または細胞クラスターを選択的に回収する手段とを備え、
前記制御・解析手段が、
i)前記明視野画像における前記細胞の座標、および前記細胞のサイズ(面積(S))と周囲長(l)によって得られる前記細胞の表面の凹凸の程度を示すRの値からなる群から選択される1つ以上のデータ(但し、
である。)を含む明視野画像データ、ならびに
ii)前記蛍光画像における前記細胞内で蛍光染色された核の細胞内での重心座標のデータを含む前記核の蛍光画像データ
に基づいて前記流路を流れる、巨大細胞または細胞クラスターを同定する、オンチップ・セルソーターシステム。 - 前記細胞のRの値が、1.3以上である場合に、細胞クラスターであると同定する、請求項1に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
- 被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
前記細胞に対して照射するための明視野光源および蛍光光源を含む光学系と、
前記セルソーターチップの前記流路を流れる前記試料液中の前記細胞の明視野画像と前記細胞に結合した蛍光標識物質の蛍光強度および前記細胞の蛍光画像とを同時に取得する検出系と、
前記明視野画像、前記蛍光強度、および/または前記蛍光画像に基づいて、前記流路を流れる細胞クラスターを同定する制御・解析手段と、
前記同定された細胞クラスターを選択的に回収する手段と
を備え、
前記制御・解析手段が、
前記明視野画像における前記細胞のサイズ(面積(S))および周囲長(l)によって得られる前記細胞の表面の凹凸の程度を示すRの値(但し、
である。)を算出し、Rの値が1.3以上であるとき、前記流路を流れる細胞を細胞クラスターとして同定する、オンチップ・セルソーターシステム。 - 被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
前記細胞に対して照射するための明視野光源および蛍光光源を含む光学系と、
前記セルソーターチップの前記流路を流れる前記試料液中の前記細胞の明視野画像と前記細胞に結合した蛍光標識物質の蛍光強度および前記細胞の蛍光画像とを同時に取得する検出系と、
前記明視野画像、前記蛍光強度、および/または前記蛍光画像に基づいて、前記流路を流れる多核細胞を同定する制御・解析手段と、
前記同定された多核細胞を選択的に回収する手段と
を備え、
前記制御・解析手段が、
i)前記明視野画像における前記細胞の座標のデータを含む明視野画像データ、および
ii)前記蛍光画像における前記細胞内での蛍光染色された核の重心座標のデータを含む前記核の蛍光画像データ
に基づいて前記核の数を判定し、前記流路を流れる多核細胞を同定する、オンチップ・セルソーターシステム。 - 前記選択的に回収した細胞および/または細胞クラスター由来の遺伝子の核酸配列を計測する手段をさらに備える、請求項1〜4のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
- 前記明視野画像と前記蛍光画像とを、1つの高速カメラの受光面上に、分割して同時に表示する機能を有する画像分割機構を備える請求項1〜5のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
- 前記明視野画像と前記蛍光画像とで画像の拡大率が異なるように調整する機構を備える、請求項6に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
- 血中がん細胞の候補細胞を同定するために使用される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステム。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のオンチップ・セルソーターシステムを用いて被験者由来の細胞試料液から血中がん細胞の候補細胞を同定する方法であって、
以下の工程:
(1)健常な血液中では存在しない細胞クラスター(塊)を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、
(2)健常な血液中では存在しない多核細胞を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、
(3)健常な血液中では存在しない巨大細胞を血中がん細胞候補として同定して選択的に回収する工程、および/または
(4)前記(1)、(2)、または(3)に加えて、がん細胞のバイオマーカーの1つあるいは複数に対する蛍光抗体の蛍光強度の存在と組み合わせた解析でがん細胞と同定して選択的に回収する工程
を含む、方法。 - 前記蛍光抗体が、EpCam抗体、K-ras抗体、またはサイトケラチン抗体である、請求項9に記載の方法。
- さらに以下:
前記(1)について、明視野像によるRの値が1.3以上であることによる評価、あるいは、明視野像による前記細胞のサイズと蛍光像による核の数および分布(すなわち隣接する複数の核の像について、その重心の距離が互いに3μm以上離れている事)によって判別すること、
前記(2)について、明視野像によってR<1.3で、かつ、核の数と分布(すなわち隣接する複数の核の像について、その重心間の距離が互いに3μm以内で離れている事)によって判別すること、
前記(3)について、明視野像によって、R<1.3かつ、細胞サイズが直径に換算して20μmを超えている事によって判別すること、または
前記(1)〜(3)を組み合わせて、1つ以上の合致条件があったものをがん細胞として判定すること
を含む、請求項9または10に記載の方法。 - 被験体由来の蛍光染色された細胞を含む試料液を流すための流路を備えたセルソーターチップと、
前記細胞に対して照射するための明視野光源、1つまたは2つ以上の蛍光光源、それぞれの波長の光を伝導する光ファイバー、および照射部位において観察対象に光を集束させる集光用レンズを含む光学系と、
前記セルソーターチップの前記流路を流れる前記試料液中の前記細胞の蛍光強度を検出するための蛍光を伝導する、1つまたは2つ以上の蛍光波長の各々に対応した光ファイバー、光ファイバーの後段に配置された特定の蛍光波長を通過させるバンドパスフィルター、および蛍光検出器を含む、前記細胞に結合した蛍光標識物質の前記1つまたは2つ以上の蛍光波長に対応した蛍光強度を同時に取得する第1の検出系と、
前記細胞の明視野画像と前記細胞の蛍光画像とを同時に取得する第2の検出系と、
前記各系の動作を制御し、前記明視野画像、前記蛍光強度、および前記蛍光画像に基づいて、前記流路を流れる巨大細胞または多核細胞または細胞クラスターを同定する制御・解析手段と、
前記同定された対象物を選択的に回収する手段と
を備え、
前記制御・解析手段が、
i)前記明視野画像における前記細胞の座標、および前記細胞のサイズ(面積(S))と周囲長(l)によって得られる前記細胞の表面の凹凸の程度を示すRの値からなる群から選択される1つ以上のデータ(但し、
である。)を含む明視野画像データ、および/または
ii)前記蛍光画像における前記細胞内で蛍光染色された1つ以上の領域の細胞内での各重心座標のデータを含む蛍光画像データ
を取得し、前記データに基づいて前記流路を流れる巨大細胞または多核細胞または細胞クラスターを同定する、オンチップ・セルソーターシステム。
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