CN109716102B - 微粒分注装置、微粒分析装置、反应检测装置、以及使用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种将细胞以单一细胞进行分注的技术。所述问题能够通过如下微粒分注装置来解决，所述微粒分注装置是本发明的具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元的微粒分注装置，具有对中空吸移管中的分注液拍摄两次以上的单元、对两个以上所拍摄的图像进行比较，将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子的单元、以及对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的单元。

Description

微粒分注装置、微粒分析装置、反应检测装置、以及使用它们的方法
技术领域
本发明涉及一种微粒分注装置、微粒分析装置、反应检测装置、以及使用它们的方法。
背景技术
在癌症研究中，用一个单位来分析夹杂细胞组中的特定细胞的方法变得越发重要。例如，在癌免疫治疗方法的治疗药物的开发中，免疫细胞将癌细胞识别为非自身细胞是很重要的。在该研究中，需要进行癌细胞的各种蛋白质的发现曲线分析。为了进行该发现曲线分析，而需要单一细胞的分注技术。
首先，对单一细胞分注技术所需的现有技术进行说明。例如，与用于对夹杂细胞中的特定细胞进行分选的细胞分选仪的技术有关。细胞分选仪是分选目标细胞并进行浓缩的装置，具有作为识别目标细胞的流式细胞仪的分析功能。流式细胞仪的技术记载于专利文献1中。
在专利文献2中记载有普通的细胞分选仪中所使用的细胞或者微粒的分离方法。该方法通过从液滴形成用喷嘴将试样液体作为液滴向空气排出，并向包含分离对象的细胞的液滴施加电荷，从而利用电场进行分离。专利文献4记载了一种流式细胞仪技术，其使用实现了最适于再生医疗的无污染物的一次性更换型的微流道通道盒。专利文献5记载了一种在一次性更换型的微流道通道盒内分离细胞的方式。而且，在专利文献6中记载了一种为了降低微流道内的流动的影响而进行改善的方式。
对在使细胞在微流道中流动的情况下，用于防止细胞在流道内堵塞的搅拌技术进行说明。专利文献11记载了一种在与微流道连接的样本储液室中旋转推进器而对细胞悬浊液进行搅拌的技术。
对与分注细胞的技术有关的当前技术进行说明。在专利文献7中记载了一种用中空吸移管吸取细胞移动到不同的位置进而排出来进行分注的技术。在专利文献8中记载了一种用图像识别确认了有无细胞后，利用基于压电元件的压力脉冲驱动而以液滴单位滴下来进行分注的技术。另外，在专利文献10中记载了一种能够更换分注头的分注方法。在专利文献14中记载了一种能够更换分注头，并且用图像识别确认有无细胞并以液滴单位进行分注的技术。
在当前的技术中，在更换型微流道盒内，依次执行包括检测体的处理、检测等的不同的多个时间的不同的处理，在流道中需要使流动停止的结构，而并不是不需要该结构。在一次性能够更换的盒中，不组装特别的结构的技术便于盒的量产。在现有技术中，全部是特别的结构都是需要的内容。作为为了进行微流道内的基因检测而进行多个工序处理的现有技术，报告有如下的技术。在冈田等人的方法(非专利文献1)中，记载有一种使用设置于流道内的阀和泵来控制不同的处理间的样本流的方法。在美国公开专利US20130288254(专利文献12)中记载有一种在微流道中利用电场来控制油中液滴的流动的方法。作为基因放大反应的方法，专利文献9公开了一种使用乳液细分PCR反应空间的数字PCR技术。关于以等温放大DNA的方法，在专利文献13中记载了一种在微流道以等温进行增殖反应的方法，在非专利文献2中记载了一种与SmartAmp法相关的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第3710933号说明书
专利文献2：美国专利第3826364号说明书
专利文献3：国际公开第98/10267号
专利文献4：美国专利第8248604号说明书
专利文献5：专利第5382852号说明书
专利文献6：国际公开第2011/086990号
专利文献7：美国专利申请公开第2005/0136528号说明书
专利文献8：美国专利第8834793号说明书
专利文献9：美国专利第7968287号说明书
专利文献10：专利公开平成11-295323号公报
专利文献11：美国公开专利第20150367346号说明书
专利文献12：美国公开专利第20130288254号说明书
专利文献13：国际公开第1998/022625号
专利文献14：专利公开2015-158489号公报非专利文献
非专利文献1：(生物传感器与生物电子杂志(J Biosens Bioelectron))2012年(美国)第3卷，第4版，1000126
非专利文献2：(自然方法(Nature-Methods))2007年(英国)第4卷，p.257-262
发明内容
(一)要解决的技术问题
将细胞以单一细胞进行分注的技术问题在于，识别分注的细胞的个数是一个、细胞损伤、细菌污染、以及不同的样本间的交叉污染。专利文献7记载了一种用中空吸移管吸取细胞移动到不同的位置并排出来进行分注的技术，但不是一种以一个细胞单位进行分注的技术。在专利文献8中记载了一种用图像识别确认有无细胞，并利用基于压电元件的压力脉冲驱动而以液滴单位滴下来进行分注的技术。但是，由于不能按每个样本液更换样本液所接触的流道系统整体，因此无法否定样本分注后的细胞是不同的样本液的残留细胞的可能性。问题在于这在不同的患者的医疗用检测体中会导致误诊断。下面，所谓的分注用的中空吸移管是一种在分注前分注液所通过的内部是中空的容器，指分注流道的前端部的部件，称为分注吸移管。
本发明的发明人研究出一种为了分注单一的细胞而使用图像识别的方法。但发现当要从图像中测定出分注吸移管中的细胞的个数时，难以将分注吸移管的划痕或者附着异物与细胞区别出来。即，在通过图像识别来测定分注吸移管内的细胞数量的情况下，难以将分注吸移管的划痕与细胞区别出来，所识别的细胞数量与分注的细胞数量不一致。因而，发现需要对细胞与分注吸移管的划痕进行判别的技术。另外，关于细胞损伤，在分注操作的时间较长的情况下，会对细胞造成损伤。即，通过将细胞长时间暴露于大气气氛下而不是存在于适于细胞增殖的5％程度的CO2下，细胞会受到损伤。该细胞损伤取决于细胞的种类。关于细菌污染，在分注装置的细胞所接触的流道是固定的流道的情况下，由于细菌在该流道中增殖，因此会发生细菌污染。为了防止细菌污染，而会使用放入了防腐剂的缓冲液。但是，会由于防腐剂而产生细胞损伤。而且，在固定流道的情况下，存在会发生样本间的交叉污染的问题。
因而，本发明的目的在于，提供一种无污染物且无损伤的单一细胞分注技术。
作为单一细胞分注的前期阶段，优选从夹杂细胞组中分选出目标细胞。因此，优选进行一次性更换型的微流道盒内的细胞分选。一次性更换型的微流道盒对于存在检测体间污染问题的医疗诊断用的流式细胞仪或者细胞分选仪而言是重要的。本发明的发明人发现，当使用微流道盒时，在流道截面积小的微流道中，由于细胞向样本储液室的底面堆积、细胞向流道侧面吸附，因而容易引起流道堵塞。针对该问题，专利文献11的技术是一种防止细胞因重力沉淀而堆积于样本储液室底面的技术，是一种用于在微流道中流动一定的细胞浓度的技术。该技术具有预防细胞堵塞的效果，但却没有解除堵塞状态的效果。
因而，本发明的目的在于，提供一种防止或者消除微流道盒中的细胞堵塞的流道的技术，而且，改善从夹杂细胞组中纯化并分析上述的单一细胞分注用的目标细胞的技术。
更换型微流道盒的优点在于，除了无污染物之外，通过将流道系统整体收纳于小型盒中，从而能够使装置小型化。在这种情况下，认为存在能够当场分析在临床现场所获得的样本的可能性。但是，在目标细胞或者基因等的分析中，在临床样本中会混合大量成为分析障碍的夹杂物。需要一种用于即使在存在高浓度夹杂物的情况下也高灵敏度地检测目标基因的前期处理。为了即使在存在高浓度夹杂物下也高灵敏度地进行检测，存在一种如数字PCR法那样利用油中液滴进行检测的方法。但是，为了执行该方法，为了在一次性更换型的微流道盒内一边流动样本液一边相继有序地实施不同的反应，需要在相同的流道盒中进行处理时间不同的多个处理。当前，作为在更换型微流道盒内依次执行包括检测体的处理、检测等的不同的多个处理的技术，仅有在流道内组装控制元件的技术，还未开发出不需要控制元件的技术。非专利文献1是一种利用组装控制元件的技术来实现多个处理的技术。
例如，当前的利用乳液液滴的数字PCR的伯乐(Bio-Rad)公司的产品和飞雨科技(RaindanceTechnologoes)公司的产品由乳液形成、基因放大反应、以及分析三道工序构成，但分别由不同的装置构成，而不是用一台装置实现。
因而，本发明的目的在于，提供一种在更换型微流道盒内依次执行包括检测体的处理、检测等的不同的多个处理的技术。
(二)技术方案
本发明的发明人对以单一细胞分注细胞的技术进行了认真研究，结果惊讶地发现，通过拍摄两次以上分注吸移管中的分注液，并将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子，从而能够将分注吸移管的划痕或者附着异物与能够容易移动的浮游状态的细胞区别出来。在此，作为不移动的粒子，除了分注吸移管的划痕、附着异物之外，还包括分注对象的细胞但为附着不移动的细胞。由于附着的细胞未被分注，因此不应该作为分注的细胞的数量计数，因此对不移动的粒子不全部计数是没有问题的。
另外，本发明的发明人对防止或者消除微流道盒的流道中的细胞堵塞的技术进行了认真研究，结果惊讶地发现，在微流道盒(也称为微流道芯片)中，通过使鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高，进而使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流，从而能够防止或者消除细胞堵塞微流道盒的流道。
进一步地，本发明的发明人对在更换型微流道盒内依次执行包括检测体的处理、检测等的不同的多个处理的技术进行了认真研究，结果惊讶地发现，通过使用油而从样本及试剂的混合物形成液滴，并在液滴储液室中进行反应，而且使所述液滴储液室中的液滴经由流道倒流，然后检测反应，从而能够在更换型微流道盒内依次执行包括检测体的处理、检测等的不同的多个处理。
本发明基于上述的见解而完成。
因而，本发明涉及以下内容：
[1]一种微粒分注装置，其具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元，所述微粒分注装置具有：对中空吸移管中的分注液拍摄两次以上的单元、对两个以上所拍摄的图像进行比较，将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子的单元、以及对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的单元。
[2]根据[1]所述的微粒分注装置，其中，所述微粒分注装置还具有使所述中空吸移管中的分注液强制地移动的单元。
[3]根据[1]或[2]所述的微粒分注装置，其中，所述微粒分注装置还具有能够将气体气氛调节成0.03～50％的二氧化碳气体气氛的单元。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的微粒分注装置，其中，通过保存临分注前的中空吸移管内的粒子图像从而来记录分注的粒子数量的数据。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的微粒分注装置，其中，所述微粒分注装置具有用于从中空吸移管的上部向中空吸移管供给试样液的分注预备室。
[6]一种微粒分注方法，其是使用具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元的微粒分注装置来对微粒进行分注的方法，包括(1)对中空吸移管内的分注液拍摄两次以上的工序、(2)对两个以上所拍摄的图像进行比较，将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子的工序、以及(3)对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的工序。
[7]根据[6]所述的微粒分注方法，其中，所述微粒分注装置还具有使中空吸移管中的分注液强制地移动的单元，而且所述拍摄工序(1)是在利用使分注液强制地移动的单元使分注液移动的前后对中空吸移管内的分注液拍摄两次以上的工序。
[8]根据[6]或[7]所述的微粒分注方法，其中，所述微粒分注装置还具有能够将气体气氛调节成0.03～50％二氧化碳气体气氛的单元，而且在3～10％二氧化碳气体气氛下进行所述工序(1)～(3)。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的微粒分注方法，其中，在所述拍摄工序(1)之前，向中空吸移管的上部的分注预备室抽吸能够分注多次的量的试样液，当从分注预备室向中空吸移管供给一定量的试样液后，通过实施工序(1)～(3)从而连续地对分注液进行分注。
[10]一种微粒分析装置，其特征在于，包括：流道盒，其是在透明基板上形成流道而形成的；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光；检测单元，其对在照射所述光时从所述微粒产生的散射光或者荧光进行检测，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒，
在所述流道盒中形成有：与第一流道连接样本储液室；连接有从所述第一流道的左右两侧汇合的第二流道及第三流道的鞘液储液室；以及连接于汇合后的第一流道的下游侧的废液储液室，
所述微粒分析装置具有通过使所述鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高，从而使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流的单元。
[11]根据[10]所述的微粒分析装置，其中，所述微粒分析装置还包括力产生单元，所述力产生单元基于来自所述检测单元的信号来作用使微粒的流动的方向变化的力。
[12]根据[11]所述的微粒分离装置，其中，所述流道盒具有以在所述第二及第三流道汇合后的第一流道的两侧对置的方式连接的第四分支流道和第五分支流道、与所述第四分支流道连接的分类储液室、以及与第五分支流道连接的回收储液室，
所述力产生单元是产生从第四分支流道向第五分支流道的方向流动的脉冲流并使微粒的流动向第五分支流道方向变化进而将微粒分选到回收储液室的单元。
[13]一种使用[10]所述的微粒分析装置或者[11]或[12]所述的微粒分离装置的防止或者去除微粒堵塞流道的方法，其中，通过使鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高，而且使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流，从而防止或者去除从样本储液室在第一流道中的微粒堵塞流道。
[14]一种反应检测装置，在微流道盒中使样本液发生反应，并检测该反应的结果，所述反应检测装置具有样本储液室、试剂储液室、油储液室、以及液滴储液室，来自样本储液室的第一流道及来自试剂储液室的第二流道汇合而形成第三流道，来自油储液室的第四流道及第五流道从第三流道的两侧汇合，所述第三流道在第四流道及第五流道的汇合点的下游与液滴储液室结合，并具有使流入所述液滴储液室的在上述汇合点形成的油中液滴经由第三流道倒流的单元，而且具有在第三流道中对反应进行检测的单元。
[15]根据[14]所述的反应检测装置，其中，使所述液滴倒流的单元是使向液滴储液室施加的压力比向样本储液室、试剂储液室、以及油储液室施加的压力高的单元。
[16]根据[14]或[15]所述的反应检测装置，其中，所述反应是基因放大反应，所述反应检测装置具有对液滴储液室的温度进行调整的单元，而且所述反应检测单元是对基于光照射产生的荧光进行检测的单元。
[17]根据[14]～[16]中任一项所述的反应检测装置，其中，所述样本储液室及试剂储液室是一个样本试剂储液室，所述第一流道及第二流道是来自样本试剂储液室的一个第三流道。
[18]根据[14]～[17]中任一项所述的使用反应检测装置的反应检测方法，其包括：(1)通过从第三流道的两侧经由第四流道及第五流道供给油，从而使第三流道的样本及试剂的混合液形成油中液滴的工序；(2)使液滴中的样本反应的工序；以及(3)对液滴中的样本的反应进行检测的工序。
[19]根据[18]所述的反应检测方法，其中，在所述检测工序(3)中，使液滴从液滴储液室向第三流道倒流后，对样本的反应进行检测。
[20]根据[18]或[19]所述的反应检测方法，其中，所述反应是基因放大反应，所述检测是放大的基因的检测。
[21]一种微粒分析或分离装置，其特征在于，包括：流道盒，其是在透明基板上形成流道而成的；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光；检测单元，其对在照射所述光时从所述微粒产生的散射光或者荧光进行检测，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒，所述微粒分析或分离装置具有在微粒是细胞的情况下能够将样本液的周围的气体气氛调节成0.03～50％的二氧化碳气体气氛的单元。
[22]根据[21]所述的微粒分析或分离装置，其中，所述调节单元是用腔室覆盖装置整体并调节二氧化碳气体气氛的单元。
[23]根据[21]所述的微粒分析或分离装置，其中，所述调节单元是对流道盒内的液体周围的气体气氛的二氧化碳进行调节的单元。
(三)有益效果
在度高浓度的夹杂细胞中的特定的细胞以一个单位进行分析的技术中，细胞的分选技术、分注一个细胞的技术、以及分析包含于该细胞的DNA、RNA的方法很重要。
根据本发明的微粒分注装置及微粒分注方法，能够将分注吸移管的划痕或者附着异物、是分注对象的粒子但附着于分注吸移管的细胞等不能进行分注的不移动的亮点、与所分注的能够移动的浮游细胞区别出来，能够准确地测定分注吸移管内的能够分注的细胞数量。因而，能够进行准确的细胞数量的分注，尤其是单一细胞的分注。
另外，根据本发明的微粒分析装置、微粒分离装置、以及防止或者去除微粒堵塞流道的方法，通过在可更换的微流道盒内，以不从装置中拆卸微流道盒的方式自动地执行预防细胞在流道内的堵塞以及堵塞后的去除堵塞的方法。
而且，根据本发明的反应检测装置及反应检测方法，使用利用乳液高灵敏度检测基因的方法，能够在更换型流道盒内，通过在同一流道内实现包括乳液形成过程、乳液内的目标基因的放大反应过程、以及乳液液滴的荧光检测过程的多个工序，从而能够使目标基因的高灵敏度检测自动化。
附图说明
图1的(A)是表示细胞分类用的更换型流道盒内的通常的液体的流动状态的图，图1的(B)是表示用于防止或者去除细胞分类用的更换型流道盒内的细胞堵塞的鞘液的流动的图。
图2的(A)是细胞分类用的更换型流道盒的俯视图，图2的(B)是通过使鞘液向样本储液室倒流来搅拌因重力沉淀而堆积于细胞分类用的更换型流道盒的样本储液室底部的细胞的状态的图。
图3的(A)是表示分注吸移管内亮点在时刻T时的相对于Z方向的分布位置的图，图3的(B)是表示分注吸移管内亮点在时刻T+ΔT时的相对于Z方向的分布位置的图，图3的(C)是表示分注吸移管内亮点在时刻T与时刻T+ΔT的差的相对于Z方向的分布位置的图。
图4的(A)是表示更换型流道盒的上游侧储液室内的样本液经由连接的流道通过压力控制向下游侧储液室流动的过程的图，图4的(B)是表示更换型流道盒的上游侧储液室内的样本液全部向下游侧储液室流动后，样本液静止的状态的图，图4的(C)是表示通过使压力反转而使在更换型流道盒的下游侧储液室内静止的状态的样本液倒流的过程的图。
图5的(A)是表示在微流道盒内形成包含乳液中的基因的液滴的过程的图，图5的(B)是表示在微流道盒内形成包含基因的液滴后基因放大反应过程的图，图5的(C)是表示在微流道盒内，在基因放大反应后使液滴倒流，进而分析乳液中的液滴有无荧光的过程的图。
图6是表示本发明的反应检测装置中使用的形成有八条微流道盒的流道图案的、对应八个检测体的更换型流道盒的图。
图7是表示使用对应八个检测体更换型流道盒的反应检测装置的结构的概要图。
图8是表示本发明的微粒分析装置或者微粒分离装置中的基于倒流进行搅拌的效果的图表。
图9的(A)是表示本发明的微粒分注装置的分注头部分的图，图9的(B)是表示微粒分注装置的分注头的操作的图，图9的(C)是表示微粒分注装置的概貌的图。
图10的(A)是表示本发明的微粒分注装置中的分注吸移管内的样本液的图像，图10的(B)是分注吸移管内的样本液的时间差分图像，图10的(C)是识别为沉淀粒子的局部放大图。
图11是表示乳液中的液滴形成的压力条件与液滴尺寸的关系的图表。
图12的(A)是液滴形成过程的微流道的照片，图12的(B)是使包含液滴的乳液从液滴储液室倒流的照片。
图13是表示在本发明的微粒分注装置中，在5％的CO2气体气氛中进行分注的单元一例的图。
图14是表示在本发明的微粒分注装置中，从分注吸移管的上游供给样本液的情况下的样本液内的粒子的分注系统的图。
图15是每次分注向分注吸移管内抽吸分注液的方法的流程图。
图16是从分注吸移管的上部连续供给样本液的方法的流程图。
图17是表示在本发明的微粒分注装置中，从分注吸移管的上游提供样本液的情况下的样本液内的粒子的图像识别方法的图。
图18是表示通过在CO2气体腔室内设置细胞分选仪从而实现在CO2气体气氛中的细胞分类的方法的图。在该方法中，不依赖于细胞分类的原理而实现CO2气体气氛中的细胞分类。
图19是表示通过使图2所示的更换型微流道盒的储液室内成为CO2气体气氛来实现CO2气体气氛中的细胞分类的方法的图。
具体实施方式
〔1〕微粒分注装置
本发明的微粒分注装置是一种微粒分注装置，其具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元，所述微粒分注装置具有：对中空吸移管中的分注液拍摄两次以上的单元、对两个以上所拍摄的图像进行比较，并将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定为浮游粒子的单元、以及对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的单元。
在分注细胞的情况下，需要识别分注吸移管中的细胞数量的技术。在识别细胞数量的技术中，如上所述，存在无法将分注吸移管等的临分注前的容器的划痕、或者附着异物等与细胞区别出来的技术问题。使用附图来说明解决该问题的本发明的微粒分注装置。
图3图示将在分注吸移管内移动的浮游粒子与分注吸移管的划痕、附着异物区别出来的方法。图3(A)示出进行光照明而在时刻T时照相机拍摄的分注吸移管的图像的亮点强度相对于Z方向位置的分布。图3(B)是在时刻T+ΔT时拍摄的同样的分布。图3(C)是时刻T与时刻T+ΔT的差的分布。将基于在时间上没有变化的分注吸移管的划痕、附着异物的亮点强度设置为零，并根据所述的时间差仅检测在时间上进行移动的浮游粒子。细胞由于重力沉淀而向下方移动，因此能够仅通过时间差来检测浮游细胞。
用于本发明的中空吸移管、以及图像拍摄单元不受限定，能够使用在本领域中通常使用的中空吸移管及图像拍摄单元。
(对中空吸移管中的分注液拍摄两次以上的单元)
对中空吸移管中的分注液拍摄两次以上的单元能够规定拍摄次数及拍摄间的时间间隔。拍摄次数只要是两次以上则不受特别限定，优选是两次。只要拍摄间的时间间隔能够检测细胞的移动，也不受特别限定，只要以例如0.1～60秒的时间间隔实施拍摄即可，优选是1～10秒，更优选是2～5秒。该时间间隔适宜设定成，在分注的细胞的尺寸是10μm的情况下使因重力沉淀而移动的距离是20μm以上。
(浮游粒子的判定单元)
本发明的浮游粒子的判定单元对两个以上拍摄的图像进行比较，并将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开，并判定出浮游粒子。特定第一拍摄图像中的微粒状物，并判定在第二拍摄图像、或第三以后的拍摄图像中这些微粒状物是否移动，由此能判别出移动的微粒状物和不移动的微粒状物。
(分注单元)
本发明中使用的分注单元不受限定，可以使用在本领域中通常使用的分注单元。
例如，本发明的微粒分注装置是一种对包含于试样液的微粒以一个单位进行分注的装置，分注吸移管是能够自动更换的透明的中空吸移管，材料是聚丙烯、聚苯乙烯等透明树脂制成的，分注液量是0.3μL以下，能够通过在每次分注时进行中空吸移管的分注液量整体的图像识别，来检测有无4μm以上的粒子和个数，并以指定的个数将粒子分注到多孔板中。然后，通过在不同的时间多次拍摄分注液量整体的图像，从而能够在中空吸移管内将因重力沉淀而移动的浮游粒子与中空吸移管的划痕、附着异物区别出来，并分注浮游微粒。
(强制移动单元)
本发明的微粒分注装置也可以具有使中空吸移管中的分注液强制地移动的单元。由于重力沉淀的移动速度较慢，因此通过使分注吸移管内的液体强制地在短时间内移动也能够使浮游粒子的检测高速化。作为强制移动单元，具体而言，能够举出使中空吸移管中的分注液的空气压变化的方式。
例如，本发明的微粒分注装置是一种对包含于试样液的微粒以一个单位进行分注的装置，分注嘴是能够自动更换的透明的中空吸移管，分注液量是0.3μL以下，能够通过在每次分注时进行中空吸移管的分注液量整体的图像识别，来检测有无尺寸为4μm以上的粒子和个数，并以指定的个数将粒子分注到多孔板中。而且，通过在中空吸移管内使液体强制地移动并在移动的前后多次进行分注液量整体的图像获取，从而能够识别中空吸移管内的浮游粒子，进而对浮游微粒进行分注。作为强制地移动的量，可以在10μm到100μm之间设定。例如，在分注的细胞的尺寸是10μm的情况下，优选移动20μm以上。在这种情况下的压力变动的设定用缸泵的活塞的移动量来设定。
作为分注方式，除了按分注单位将样本液吸取到分注吸移管内的情况之外，还存在从吸移管的上部供给样本液的情况。在这种情况下，不需要以分注单位进行吸取的操作，能够连续地供给。在这种情况下，由于所分注的样本液的区域与从上部新供给的样本液的区域连续地连接，因此在基于时间差的图像识别方法中增加以下的改善。在图17中说明该改善内容。每次分注从分注吸移管82(中空吸移管)的上部提供样本液。在这种情况下，由于所分注的液体与从上部新提供的液体连接，因此其边界不明确，而存在所识别的细胞数量混合的问题。为了解决该问题，设定吸移管内的识别区域84和预备识别空间83两种区域，并在各自的区域检测粒子。仅在识别区域中存在要分注的数量的粒子而预备区域内不存在粒子的情况下进行分注。但是，通过使分注的液量成为比识别区域的液量多、且比识别区域的液量与预备区域的液量相加而得的液量少的量，从而能够不混合粒子数量，能够仅分注识别区域内所含的粒子。在图14的(A)中示出从上部向吸移管内提供样本液的情况下的分注系统的例子。分注吸移管能够在XYZ方向上移动，事先从利用圆柱泵89的分注吸移管73(中空吸移管)吸取样本液71，并加入分注吸移管73的上部的分注预备室87。在该分注预备室的上游连接有压电泵86。用照相机76获取的分注吸移管73内部的图像的用于粒子检测的图像识别如图17中说明的那样，通过设定识别区域和预备识别区域而准确地确定分注的区域所含的粒子数量。在判定为分注的粒子数量在目标设定数量的范围内的情况下，如图14的(B)所示，利用该泵的脉冲的压力，从分注吸移管73的前端以液滴单位飞入空中并分注到多孔板中。在分注的粒子数量不是目标设定数量的范围的情况下，使该液体返回至样本容器71。在以液滴单位进行分注的情况下，液滴尺寸是100μm到300μm的范围。图14的(B)所示的系统能够按每个样本液自动更换用虚线区域88表示的范围，不会发生样本液间的残留。
从中空吸移管的上部连续供给样本液的微粒分注装置具有分注预备室87，所述分注预备室87用于含有用于多次分注的样本液。通过具有分注预备室，能够连续地向中空吸移管提供试样液。另外，为了从分注预备室向中空吸移管连续地提供样本液，优选微粒分注装置具有连续分注单元。作为连续分注单元并不受限定，可以举出压电泵86。
关于上述的两种分注方法，在图15和图16中示出表示各自的顺序的流程图。图15是每次分注向分注吸移管内抽吸分注液的方法的流程图。在这种情况下，由于样本容器71中的样本液的粒子由于重力沉淀而沉到底部，因此在进行了搅拌后，抽吸到分注吸移管73，之后用照相机76多次获取分注吸移管内的图像。在图像获取期间，为了使分注吸移管内的液体强制移动而使压力变化。通过比较多个图像来检测分注液内的浮游粒子，在浮游粒子的数量满足设定值的情况下，分注到分注目的地。在不满足的情况下，不分注而返回到样本溶液。图16是从分注吸移管的上部连续供给样本液的方法的流程图。该方法也是从样本容器中的样本液的搅拌起开始。不是每次分注都吸取分注液，而是向设置于分注吸移管73的上游的样本液预备室87一次性吸取相当于分注多次的样本液量后，用照相机76多次获取分注吸移管内的图像。在图像获取期间，为了使分注吸移管内的液体强制移动而使压力变化。通过比较多个图像来检测分注液内的浮游粒子，在浮游粒子的数量满足设定值的情况下，对样本液预备室87施加脉冲压力，并从分注吸移管以液滴状飞入大气中而分注到分注目的地。在浮游粒子的数量不满足设定值的情况下，不进行分注而返回至样本容器。
接着，对分注前的样本液在分注后污染的问题和其防止技术进行说明。例如，设定在分注前具有两种样本液A和样本B液。认为在将包含于样本A的细胞组分注到多孔板后，接着将包含于样本B的细胞组分注到另一多孔板的情况下产生的细胞污染。在分注了包含于样本B的细胞的多孔板内，有可能混入样本A的细胞。以下说明用于消除该可能性的技术。这种方式在每次分注时向能够更换的分注吸移管内吸取样本液并进行分注，且在分注样本液A后，只要更换分注吸移管即可。但是，在使用从样本液中吸取并从分注吸移管的内部的上游供给分注液的流道的情况下，需要从在分注吸移管进行吸取的流道到包含泵的分注吸移管全部进行更换，而只更换分注吸移管不能防止污染。原因在于，无法否定样本液A的细胞吸附于泵部并在分注样本B时分离出来进而发生污染的可能性。因而，必须使样本液接触的部分成为更换型。如果在该部分包含高价的泵，则分注的运行成本变高而没有实用性。因此，在本发明中，即使在使用从分注吸移管的内部上游供给分注液的流道的情况下，如图14所示，样本液所接触的部分作为泵的下游的包含样本液预备室87和分注吸移管73的部分为止能够更换，从而通过在分注不同的样本液时进行更换而能消除污染。样本预备室是为了在最开始吸取不需要每次分注时都吸取的程度的样本液量并在分注吸移管的上游确保样本液而设置的。
(二氧化碳调节单元)
为了解决细胞分注中的细胞损伤，可以举出在与CO2培养器相同的气体气氛中进行分注的方法。
即，本发明的微粒分注装置也可以具有能够将气体气氛调节为0.03～50％的二氧化碳气体气氛的单元。所述调节单元只要能够设成作为大气的二氧化碳浓度为0.03％以上，则不受特别限定。在后述的微粒分注方法中使用的二氧化碳浓度不受特别限定，优选是2～10容量％，更优选是3～7容量％，进一步优选是4～6容量％，最优选是5容量％。图13是表示在调节了二氧化碳气体浓度的气氛中进行细胞分注一例的图。在该图中，设置为用对调节了二氧化碳气体浓度而得的气氛进行维持的容器包围分注装置的结构。
例如，本发明的微粒分注装置是一种将包含于试样液的细胞以一个单位进行分注的装置，分注嘴是能够自动更换的透明的中空吸移管，分注液量是0.3μL以下，能够通过在每次分注时进行中空吸移管的分注液量整体的图像识别，来检测有无尺寸为4μm以上的粒子和个数，并以指定的个数将细胞分注到多孔板中。而且，能够在分注处理中将装置内的气体气氛维持成5％二氧化碳气体。在此，也可以通过在不同的时刻多次进行分注液量整体的图像获取，从而将在中空吸移管内由于自然沉淀而移动的浮游细胞与中空吸移管的划痕、附着粒子区别出来进行检测。而且，也可以通过在中空吸移管内使液体强制地移动并在移动的前后多次进行分注液量整体的图像获取，从而能够将在中空吸移管内移动的浮游细胞与中空吸移管的划痕、附着粒子区别出来进行检测。细胞分注的大多数目的在于对夹杂细胞组中所含的一部分的目标细胞进行分注。在这种情况下，优选对细胞分注用细胞进行前期处理，其通过细胞分选仪从夹杂细胞组中纯化出目标细胞。通过细胞分类处理也与细胞分注的处理同样地在调节了二氧化碳浓度的气氛中进行，从而能够降低由于与细胞分注同样地暴露于大气中造成的细胞损伤。即，为了防止细胞的生物学性能降低，优选进行细胞的分析、或者分离。例如，在如图18所示那样进行细胞分类的情况下，只要在调节了二氧化碳浓度的气氛的容器内设置细胞分选仪进行操作即可。该调节二氧化碳浓度的气氛的容器是用空气配管(303)将CO2储气罐(300)与压力调整器(301)气密地连接的容器，内部用碳酸气体使气压基本上成为大气压。这种情况下的细胞分选仪既可以是使用微流道盒的装置，也可以是通常被称为FACS的在大气中以液滴单位进行细胞分离的细胞分选仪。在使用微流道盒的装置的情况下，样本液是微流道内的储液室，该容量控制在10μL到几十mL的范围，因此样本液的周围的气体的容量也是该范围，因而可以说对于控制成一定的CO2气体浓度而言适用容量小的方式。
而且，在图19中示出了在如图2所示那样通过空气压控制对微流道盒内的液体的流动进行控制的细胞分选仪中，向盒内的贮存样本液的样本储液室内和贮存所需要的分选的细胞的回收储液室内输送CO2气体的单元。在这种情况下，用CO2储气罐(300)、压力调整器(301)、空气配管(305)，气密地连接于细胞分选仪装置的CO2气体配管系统。装置内的CO2配管系统经由蠕动泵(304)气密地连接于微流道盒内的样本储液室(与图2的11对应)和微流道盒内的回收储液室(与图2的17对应)。由于不同的储液室内的空气压控制的输送CO2气体的时机不同，因此用不同的蠕动泵并列地连接。在此，使用蠕动泵的优点是送入的气体量与造成废液的气体量始终相同，因此对于气密的储液室内的用于细胞的流动控制的空气压力控制的压力调整，缓慢流入CO2气体的废弃的控制系统不会造成影响。
〔2〕微粒分注方法
本发明的微粒分注方法是一种使用具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元的微粒分注装置对微粒进行分注的方法，包括(1)对分注吸移管内的分注液拍摄两次以上的工序、(2)对两个以上所拍摄的图像进行比较，并将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子的工序、以及(3)对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的工序。
本发明的微粒分注方法不受限定，可以使用本发明的微粒分注装置来进行。具体而言，也可以通过所述“[1]微粒分注装置”的项中所记载的方法来进行分注。
〔3〕微粒分析装置及微粒分离装置
本发明的微粒分析装置包括：流道盒，其是在透明基板上形成流道而形成的；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光；检测单元，其对在照射所述光时从所述微粒产生的散射光或者荧光进行检测，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒，在所述流道盒中形成有与第一流道连接的样本储液室、连接有从所述第一流道的左右两侧汇合的第二流道及第三流道的鞘液储液室、以及连接于汇合后的第一流道的下游侧的废液储液室，所述微粒分析装置具有通过使所述鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高，从而使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流的单元。
本发明的微粒分离装置包括：流道盒，其是在透明基板上形成流道而成的；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光、检测单元，其对在照射所述光时从所述微粒产生的散射光或者荧光进行检测，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒的、以及力产生单元，其基于来自检测单元的信号作用使微粒的流的方向变化的力的力产生单元，在所述流道盒中形成有与第一流道连接的样本储液室、连接有从所述第一流道的左右两侧汇合的第二流道及第三流道的鞘液储液室、以及连接于汇合后的第一流道的下游侧的废液储液室，所述微粒分析装置具有通过使所述鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高从而使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流的单元。
所述微粒分离装置的所述流道盒也可以具有在以所述第二及第三流道汇合后的第一流道的两侧对置的方式连接的第四分支流道和第五分支流道、与所述第四分支流道连接的分类储液室、以及与第五分支流道连接的回收储液室。另外，所述力产生单元也可以是产生从第四分支流道向第五分支流道的方向流动的脉冲流并使微粒的流动向第五分支流道方向变化进而将微粒分选到回收储液室内的单元。
作为使所述鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高的单元，向鞘液储液室赋予压力的单元(例如泵)与向样本储液室赋予压力的单元(例如泵)可以不是同一单元(泵)，而通过使用单独的单元(泵)来实现。
另外，本发明的微粒分析装置或者微粒分离装置优选具有废液储液室、分类储液室、以及/或向回收储液室赋予压力的单元(例如泵)。这些单元(泵)优选是与向鞘液储液室赋予压力的单元(泵)不同的单元(泵)。
〔4〕流道堵塞的防止或者去除方法
本发明的防止或者去除流道堵塞的方法是使用所述微粒分析装置或者微粒分离装置的方法。即，在所述微粒分析装置或者微粒分离装置中，通过使鞘液储液室的压力比样本储液室的压力高，进而使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流，从而防止或者去除从样本储液室在第一流道中的微粒堵塞流道。
如上述那样，通过使向鞘液储液室赋予压力的单元(例如泵)、向样本储液室赋予压力的单元(例如泵)使用单独的单元(泵)，进而提高鞘液储液室的压力，从而能够使鞘液储液室中的鞘液向样本储液室倒流。由此，能够防止或者去除微粒堵塞流道。
向鞘液储液室赋予的压力只要比向样本储液室赋予的压力高，则不受特别限定，优选是2kPa～50kPa，更优选是5kPa～20kPa。另外，向样本储液室赋予的压力也不受特别限定，优选是-2kPa～1kPa，更优选是-1kPa～0kPa。
向鞘液储液室赋予的压力与向样本储液室赋予的压力的差也不受特别限定，优选是4kPa～50kPa，更优选是7kPa～20kPa。
进一步地，向废液储液室、分类储液室、以及/或者回收储液室赋予的压力也不受特别限定，优选是-1kPa～0kPa，更优选是-0.5kPa～0kPa。
使鞘液储液室的压力维持得比样本储液室的压力高时间只要能够防止或者去除微粒堵塞流道，则不受特别限定，例如是1秒～1分钟，优选是1～10秒，更优选是2～5秒，进一步优选是2～4秒。另外，为了进行该搅拌而使压力变化的时机，作为用于预防流道堵塞而优选为一定时间间隔。关于检测流道堵塞的预兆并产生搅拌用压力变化的时机，有时是在使粒子流动的状态下的单位时间的粒子检测个数(检测率)低于设定的阈值，有时是该检测率低于设定的相对的降低率时。在将预防流道堵塞及消除堵塞双方为目的的情况下，优选在满足上述任意一个条件的情况下，产生搅拌用压力变化。
使用图1和图2，来说明用于防止或者去除微粒堵塞流道的搅拌单元的一个方式。图1的(A)是分类用的更换型微流道盒的流道图案，图2的(A)是盒的俯视图。使用该盒的分类方法是在前述的专利文献6中所记载的利用脉冲的空气压来分选需要的细胞的方法。包含细胞的样本液在与样本储液室11连接的流道22中流动。在该流道中，通过使供不包含细胞的鞘液流动的流道23L与流道23R从左右汇合，从而样本液在流道中央部汇聚并进行流动。对在通过激光照射区域35时从细胞发出的散射光、荧光进行检测来判断是否是需要的细胞，在判断为是需要的细胞的情况下，在该细胞通过作为分类区域的流道24L与流道24R的交叉区域时，通过产生从流道24L向流道24R流动的脉冲流，从而向流道24R分选目标细胞，并使目标外的细胞通过并流入废液储液室。以上是分类时的液体的流动。如果持续该状态，则由于重力沉淀而随着时间堆积于包含细胞的样本储液室11的底部。因此，常常发生细胞堵塞在样本储液室11与流道22的连接端口部的情况。因此，使向样本储液室11和鞘液储液室12施加的压力暂时地变化，如图1(B)所示，仅向鞘液储液室施加而使鞘液从流道23L和流道23R流出，当将向样本储液室11施加的空气压设为零时，鞘液向样本储液室11倒流，在样本储液室的底部堆积的细胞被鞘液搅拌。图2(B)示意性地说明利用鞘流的倒流从样本储液室11的底部搅拌堆积的细胞的状态。如果增加向鞘液储液室12施加的压力则倒流增大，因此搅拌力增大。另外，由于在分类中取入的细胞不会通过该搅拌而向废液储液室流出，因此在分类处理中，仅通过使向各储液室施加的压力暂时地变化，就能够实现细胞的搅拌。
以下说明所述微粒分析装置的搅拌单元的一个方式。即，对没有分类功能的流道中的搅拌单元进行说明。例如，微粒分析装置具备：流道盒，其在透明基板上形成流道而成；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光；检测单元，其在照射所述光时检测从所述微粒发出的散射光或者荧光，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒，所述光照射单元基于来自所述检测单元的信号对所述盒的在所述流道中流动的所述微粒分析微粒。而且，微粒分析装置使用流道芯片，该流道芯片形成有：与第一流道连接的试样液用的储液室(样本储液室)、连接有从该第一流道的左右两侧汇合的第二、三流道的储液室(鞘液储液室)、连接于汇合后的第一流道的下游侧的第四储液室(废液储液室)。在所述微粒分析装置中，为了进行细胞分析处理而在使样本流动的过程中，使各种储液室的压力仅在一定时间暂时地变化。即，使向样本储液室内的样本液施加的压力从分析处理用设定值A(正压)变为零。并向鞘液储液室内的鞘液施加的压力是使分析处理用设定值B(正压)增大。另外，向废液储液室内的废液施加的压力的变化从分析处理用设定值C(负压)变为零。利用所述暂时的压力变化，使样本储液室内的细胞停止向外部流出，在样本储液室内，从流道连接的储液室底部发生鞘液倒流，样本储液室的底部的由于重力沉淀而堆积的细胞被搅拌。
以下说明所述微粒分离装置的搅拌单元的一个方式。例如，微粒分离装置包括：流道盒，其是在透明基板上形成流道而成的；光照射单元，其向在所述流道中流动的试样液中的微粒照射光；检测单元，其对在照射所述光时从所述微粒产生的散射光或者荧光进行检测，并基于它们的信号强度来识别所述微粒，检测目标微粒；以及力产生单元，其基于来自所述检测单元的信号对所述盒的在所述流道中流动的所述微粒作用使流的方向变化的力。在所述流道盒中，连接有：与第一流道连接的试样液用的储液室(样本储液室)、连接有从该第一流道的左右两侧汇合的第二、三流道的储液室(鞘液储液室)、以及以在汇合后的第一流道的两侧对置的方式连接的第四分支流道和第五分支流道。另外，形成有：第3A储液室(分类储液室)，其与所述第四分支流道连接并用于输出脉冲流；第3B储液室(回收储液室)，其与第五分支流道连接，所述第五分支流道用于利用所述力产生单元产生的从第四分支流道向第五分支流道的方向流动的脉冲流使微粒的流动向第五分支流道方向变化并分选微粒然后回收；以及第四储液室(废液储液室)，其连接于第一流道的下游侧并储存未被分选的微粒。而且，在为了进行分类处理而使样本流动的过程中，使各种储液室的压力仅在一定时间期间暂时地同时变化。即，使向样本储液室内的样本液施加的压力从分类处理用设定值A(正压)为零。使向鞘液储液室内的鞘液施加的压力使分类处理用设定值B(正压)增大。另外，向废液储液室内的废液施加的压力只要是向回收储液室流入鞘液的条件的压力即可。利用上述暂时的压力变化，不包含细胞的鞘液从鞘液储液室暂时地向样本液储液室、分类储液室、回收储液室、废液储液室流入。在该过程中，使样本储液室内的细胞停止流出，在样本储液室内使鞘液从流道连接的储液室底部倒流，由此样本储液室的底部的由于重力沉淀而堆积的细胞被搅拌。另外，由于鞘液向回收储液室内流入，因此可防止回收储液室内的在分类中回收的细胞向废液储液室流出。如以上那样，不对分类性能造成影响的方式执行流道芯片内的细胞搅拌。
〔5〕反应检测装置
本发明的反应检测装置是在微流道盒中使样本液产生反应，并检测该反应结果的装置，所述反应检测装置具有样本储液室、试剂储液室、油储液室、以及液滴储液室，来自样本储液室的第一流道及来自试剂储液室的第二流道汇合而形成第三流道，来自油储液室的第四流道及第五流道从第三流道的两侧汇合，所述第三流道在第四流道及第五流道的汇合点的下游与液滴储液室结合，所述反应检测装置具有使所述液滴储液室中的液滴经由第三流道倒流的单元，而且，所述反应检测装置还具有在第三流道中对反应进行检测的单元。
在本发明的反应检测装置中，也可以使用预先混合有检测体和试剂的混合液。在这种情况下，所述样本储液室及试剂储液室可以是一个样本试剂储液室，所述第一流道及第二流道可以是来自所述样本试剂储液室的一个第三流道。
(样本液的反应)
本发明的反应检测装置中的检测体的反应不受特别限定，在本领域中，能够不受限定地利用通常使用的反应。例如，可以举出基因放大反应、蛋白质的磷酸化反应、GPCR与肽键反应。作为基因放大反应，可以举出数字PCR等PCR法、LAMP法、或者SmartAmp法。
(反应的检测)
本发明的反应检测装置中的反应的检测方法可以根据反应的种类而适当选择。例如，在反应产物显示出荧光、发光、或者发色等特征的情况下，可以使用与它们对应的检测方法。具体而言，可以举出对用激光、LED等光源进行光照射而发光的荧光进行检测的单元、对化学发光进行检测的单元等。
(对液滴储液室的温度进行调整的单元)
本发明的反应检测装置优选具有对液滴储液室的温度进行调整的单元。利用对液滴储液室的温度进行调整的单元，能够实施各种检测体的反应。温度的调整不受特别限定，优选能够进行温度的上升(加热)、温度的降低(冷却)、以及温度的维持。进行温度的上升(加热)、温度的降低(冷却)、以及温度的维持的单元能够使用在本领域中通常使用的单元。
(使液滴倒流的单元)
本发明的反应检测装置中的使液滴倒流的单元只要是能够使液滴从液滴储液室向流道倒流，则不受特别限定，可以举出例如使向液滴储液室施加的压力比向样本储液室、试剂储液室、以及油储液室施加的压力高的单元。尤其是在使液滴仅向上游的特定的储液室倒流的情况下，具有能够从一处储液室回收荧光检测后的乳液的优点。在检测血液中的ctDNA的情况下，仅通过检测就完成诊断，但在进一步确认基因序列的情况下，必须回收具有荧光的液滴，因此具有使液滴倒流到一处储液室内的优点。
在使液滴仅向样本储液室倒流的情况下，只要使液滴储液室为正压、使样本储液室为负压、使油储液室为正压、使试剂储液室为正压即可。
作为使所述液滴储液室的压力比样本储液室等的压力高的具体的单元，能够通过使用能够单独调整施加的压力的单元(注射泵、或者正压用旋转泵与电动气动调节器的组合、负压用旋转泵与电动气动调节器的组合)来实现向鞘液储液室赋予压力的单元(例如注射泵、或者正压用旋转泵与电动气动调节器的组合、负压用旋转泵与电动气动调节器的组合)、和向样本储液室等赋予压力的单元(例如注射泵、旋转泵与电动气动调节器的组合)。能够单独调整施加的压力的单元在是注射泵的情况下是能够在活塞移动方向上与正压和负压双方对应的单元，在是与旋转泵连接的电动气动调节器的情况下，是通过将与正压用旋转泵连接的电动气动调节器和与负压用旋转泵连接的电动气动调节器并列连接而与双方对应的单元。
最优选地，向液滴储液室赋予压力的单元(泵)、向试剂储液室赋予压力的单元(泵)、向油储液室赋予压力的单元(泵)、以及向液滴储液室赋予压力的单元(泵)分别是单独的单元(泵)。
〔6〕反应检测方法
本发明的反应检测方法是使用所述反应检测装置的反应检测方法。即，本发明的反应检测方法使用所述反应检测装置，包括：(1)通过对第三流道的样本及试剂的混合液从第三流道的两侧经由第四流道及第五流道供给油从而形成液滴的工序、(2)使液滴中的样本反应的工序、以及(3)对液滴中的样本的反应进行检测的工序。
在本发明的反应检测方法中，也可以使用预先混合有检测体和试剂的混合液。在这种情况下，在所述反应检测装置中，所述样本储液室及试剂储液室可以是同一样本试剂储液室，所述第一流道及第二流道可以是来自所述样本试剂储液室的一个第三流道，通过向样本试剂储液室加入混合液而能够实施反应检测方法。
(液滴形成工序)
本发明的反应检测方法中的液滴形成工序为，通过对第三流道的样本及试剂的混合液从第三流道的两侧经由第四流道及第五流道供给油而形成液滴。
通过适当调整混合液的流量、及油的流量，从而能够形成适于反应的液滴。例如，通过相对于混合液的1容量流动例如1～100容量、优选为2～50容量、更优选为3～10容量的油从而能够形成液滴。
所述油只要能够形成液滴则不受特别限定，可以举出矿物油或者Fluorinert(日文：フロリナート)等氟油、或者硅油等。
(样本反应工序)
样本反应工序中的反应不受特别限定，在本领域中，能够不受限定地利用通常使用的反应。例如，可以举出基因放大反应、蛋白质的磷酸化反应、GPCR与肽键反应。作为基因放大反应，可以举出数字PCR等PCR法、LAMP法、或者SmartAmp法。
在PCR法的情况下，能够进行温度的上升(加热)、温度的降低(冷却)、以及温度的维持。即，通过将高温(例如95℃)和中等程度的温度(例如65℃)交替地维持一定时间，从而能够进行基因的放大反应。在LAMP法或者SmartAmp法等的等温放大法的情况下，通过以65℃等维持温度，从而能够进行基因的放大反应。
(反应检测工序)
反应检测工序中的检测方法可以根据反应的种类而适当地选择。例如，在反应产物显示出荧光、发光、或者发色等特征的情况下，可以使用与它们对应的检测方法。具体而言，能够举出对基于激光、LED等光源进行光照射所发光的荧光进行检测的单元、对化学发光进行检测的单元等。
优选地，使结束了反应的液滴从液滴储液室向第三流道倒流，并在第三流道中检测反应。
以下说明本发明的反应检测装置、以及反应检测方法中的处理的机构。在一次性更换型的微流道盒内，一边使样本液流动一边连续地实施不同的反应以及/或者检测。因此，使用图4说明在相同的流道盒进行处理时间不同的多个处理的方法的一个实施方式。在图4中，在一次性更换型的微流道盒形成的最上游侧储液室2与最下游储液室3由流道4连接，通过控制向储液室2内的样本液上面施加的压力1和向储液室3施加的压力2，从而在最开始执行使储液室2内的样本液1向储液室3移动的工序1。如果样本液全部向储液室3移动完成，则工序1结束，流动自动停止而成为静止状态。将该工序作为工序2。接着，使从储液室3向储液室2倒流。将该工序作为工序3。以上表示通过仅控制压力1和压力2而能够依次执行包括流动和静止的不同的工序1、2及3。
以下说明所述反应检测装置、以及反应检测方法的具体的一个实施方式。本实施方式是利用基于空气压控制的倒流而在同一流道内依次执行多个工序的单元，能够适用于使用乳液中的液滴来高灵敏度地检测基因的方法。本实施方式是在同一微流道盒内实施液滴形成工序、基因放大反应、以及检测这三种工序的方法。在依次进行所需时间不同的三种的处理((1)液滴形成、(2)基因放大、(3)检测)的情况下，需要在基因放大的过程中使液滴的流动在反应时间的期间停止。因此在流道中需要基于阀等的停止机构。在本发明中，为了不需要停止机构的方式通过在液滴储液室中进行基因放大反应，从而使其自然地停止。反应结束后，使液滴倒流进行检测。这样的控制在一次性更换微流道内不需要使用特别的元件。即，由于能够仅通过空气压的切换来进行，因此能够降低运行成本，可以说性价比高。图5的(A)是流道盒的俯视图，表示形成包含基因的乳液中的液滴的流道图案。将包括细胞、细菌、或者病毒等的DNA、RNA的样本液加入样本储液室102-1，并在试剂储液室102-2中加入在基因放大反应中所需要的包含试剂的水溶液。在油储液室102-3中加入油中液滴的乳液形成用的油。作为该油，可以选择矿物油或者Fluorinert等氟油等。在该状态下，通过向样本储液室102-1、试剂储液室102-2、油储液室102-3施加比大气压大的空气压，并向液滴储液室103-1施加比大气压或者上游侧小的空气压，从而产生流动，并使分别与样本储液室102-1和试剂用储液室102-2连接的流道汇合进行混合，而且接着通过使来自油储液室102-3的左右的油与流动汇合，从而形成油中液滴，该液滴流入液滴储液室103-1。以上是乳液液滴形成工序。该乳液中的液滴形成，优选形成充分数量的液滴，直到没有样本液为止。在图5的(B)中，为了使流入液滴储液室103-1的油中液滴组直接储存于液滴储液室103-1，而将压力的施加状态保持为与(A)相同的压力，或者保持不进行倒流程度的低压力。在该状态下进行用于放大包含于液滴中的目标基因序列的反应。作为基因放大反应，可以使用利用等温放大法的方法和利用PCR的方法。在利用PCR的情况下，使液滴储液室103-1的温度以一定时间间隔以一定次数交替地变化为大约95℃和大约65℃。在等温放大法的情况下，是在65℃下进行放大反应的方法，公知有Lamp法或SmartAmp法这两种。在任意的方法中，通过将液滴储液室103-1在大约65℃的保温状态下保持温度至少大约30分钟程度以上，从而进行充分的放大反应。包含该放大的基因的乳液通过荧光探针而发出与基因量成比例的荧光。在基因放大反应后，进行对该乳液进行计数的处理。在图5的(C)中示出该工序。通过使向液滴储液室103-1施加的压力比样本储液室102-1、试剂储液室102-2、油储液室102-3的压力大，从而使乳液中的液滴从液滴储液室103-1倒流，通过向流道中照射激光106，从而对具有荧光的液滴进行检测。通过以上步骤实现在相同盒内处理乳液形成、基因放大、检测这三种处理。
实施例
以下通过实施例具体地说明本发明，但它们并不限定本发明的范围。
(实施例1)
在本实施例中，进行本发明的微粒分注装置及微粒分注方法。具体而言，将细胞以一个单位分注到多孔板。图9的(A)示意性地示出分注细胞的装置。分注前的细胞悬浊液加入软管71。由于细胞重力沉淀于软管71的底部，因此需要至少以5分钟以内的时间间隔进行搅拌。如果该搅拌时间的间隔变长，则在细胞悬浊液的上层部不存在细胞的区域扩大，因此要严守时间间隔。将在控制空气压的注射泵74的前部安装的透明的中空管即分注吸移管73的前部沿着Z轴下方移动进入该细胞悬浊液中。接着，将注射器的活塞提升相当于分注量部分而在吸移管73中抽吸细胞悬浊液。抽吸后向Z轴的上方提升吸移管73，并用照相机获取两次吸移管内的分注量总量的图像。在这种情况下，如果将图像获取的时间差设定为3秒，则尺寸为10μm程度的细胞由于重量沉淀的移动距离是10μm以上，因此能够利用时间差将浮游细胞与分注吸移管的划痕、附着异物区别开来。图10表示基于时间差分图像识别的包含细胞的分注吸移管内的浮游细胞数量的检测例。图10的(A)是最开始的拍摄图像，图10的(B)是时间差分图像，图10的(C)是通过时间差分图像检测的细胞部分的放大图像。在图10的(A)中存在分注吸移管的划痕、附着异物等多个亮点。在图10的(B)中，提取在3秒变化的部分，识别出浮游细胞数量是5个。在图10的(C)中，出现在3秒的移动前和移动后的细胞的亮点。该两个亮点是与图3的(C)的时间差的亮度分布的正部分和负部分两处对应的图像。以上的实施方式是基于在基于细胞由于重力沉淀而移动的前后的时间差进行的细胞检测方法，在使分注吸移管内的液体通过压力而向上下方向强制地移动的情况下，由于通过重力沉淀而提高移动速度，因此能够缩短时间差的时间间隔。如上述那样，通过时间差分图像检测，来评价分注吸移管内的细胞数量，如果在存在一个的情况下，向多孔板的规定位置的孔中移动。向Z轴下方移动，如图9的(B)所示，将分注吸移管73降到已经分注的液体的上面81下方，挤压注射泵的活塞75从而排出吸移管内的液滴。在排出后也一边按下活塞75一边向上方提起分注吸移管。在分注吸移管内的图像识别的结果为液滴的数量为零或者两个以上的情况下，返回软管71而排出分注吸移管73内的乳液液体，并再次抽吸，仅在液滴仅存在一个的情况下进行分注。在作为分注量是0.3μL的情况下，如果将吸移管的内径设定为400μm，则在吸移管内抽吸2.4mm即可。接着，考察能否以照相机拍摄一次的图像在对焦的状态下拍摄0.3μL液量整体，在作为物镜而使用1倍物镜的情况下，景深是440μm，能够在对焦的状态下拍摄吸移管内的内径为400μm整体。如果考虑视角的宽度，则在使用1/2型照相机的情况下覆盖6.4mm，因此能够拍摄吸移管内的长度为2.4mm整体。因而，能够判断为可用一次拍摄图像拍摄分注量为0.3μL整体。但是，由于图像的分辨率是11μm，因此能够识别有无一个细胞和个数。接着，说明光学系统。对分注吸移管内的细胞进行照明的光源是LED光源，从分注吸移管的上部周围向下方照射。检测光学系统通过用1倍的物镜和1/2型照相机拍摄内径为400μm的透明树脂制的中空吸移管内的粒径为10μm的细胞，而使景深为400μm以上。图9的(C)是分注机的概貌。分注机是能够设置于安全盒内的尺寸，通过用5％的CO2气体气氛的容器覆盖分注机进行使用，从而降低细胞损伤。
(实施例2)
在本实施例中，使用本发明的微粒分离装置实施了防止或者去除微粒堵塞流道的方法。
具体而言，使用图2的(A)所示的细胞分类用的更换型微流道盒，基于搅拌进行了防止或者去除细胞堵塞流道。流道盒的基板原材料是透明树脂，是COP、COC、PMMA的任意一种原材料。主流道22的流道宽度是80μm，深度是80μm。在进行分类处理的情况下，向样本储液室11施加的压力是1.8kPa，向鞘液储液室12施加的压力是1.8kPa，向废液储液室21施加的压力是-0.8kPa。涉及分类的储液室16、17在电磁阀关闭的状态下不施加压力。搅拌用的压力设定为，向样本储液室11施加的压力是0kPa，向鞘液储液室12施加的压力是7kPa，向废液储液室21施加的压力是0kPa。为了调查将该压力的维持时间设定为3秒进行维持的情况下的搅拌效果，将108个/mL的高浓度的培养细胞(细胞系Molt4)的PBS缓冲悬浊液加入样本储液室，在向样本储液室11施加的压力是1.8kPa，向鞘液储液室12施加的压力是1.8kPa，向废液储液室21施加的压力是-0.8kPa的条件下进行流动。向流道22照射波长为488nm的激光，并对流动的细胞进行计数。在开始后6分钟左右，细胞的计数降低而为零。认为这是由于细胞沉淀于样本储液室的底部而堆积，并堵塞流道造成的。此时，得知如果将搅拌用压力设定为3秒，则细胞的计数从零开始上升，细胞的堵塞被去除。得知即使在细胞的计数为零之前设定搅拌用压力，细胞的计数也上升。通过以上的数据得知，本发明的搅拌是有效的。为了在分类中自动地实施上述搅拌，通过在满足1)以一定时间间隔自动地开始、2)当计数频率为一定值以下时则自动地开始等多个条件中的任意一个条件的情况下开始，则能够对应防止细胞堵塞、以及堵塞后的解除双方。
(实施例3)
在本实施例中，使用本发明的反应检测装置实施了反应检测方法。具体而言，作为在更换型微流道盒内的多个工序自动处理，而在一个微流道盒内进行乳液中的液滴形成、基因放大反应、以及检测三道工序。图5的(A)是流道盒的俯视图，表示形成包含基因的液滴的流道图案。将含有DNA的样本液放入样本储液室102-1，并在试剂储液室102-2中加入在等温放大法中的基因放大反应中所需的试剂以及若与DNA结合则发出荧光的荧光试剂。对于这样的荧光试剂，使用作为照射光源的488nm的激光和637nm的激光。在这种情况下，可以将嵌入剂方式的Eva green、Sybergreen、或者TaqMan探针(FAM、Cy5等)作为基因检测用荧光色素使用。在油储液室102-3中加入用于在油中形成液滴的油。作为该油可以选择矿物油或者Fluorinert等氟油等。乳液形成条件设定为，向油储液室102-3施加的压力为14kPa，向样本储液室102-1和试剂储液室102-2施加的压力为10kPa。液滴储液室103-1为大气压。利用该压力条件，在作为油而使用包含多种表面活性剂(Span 80、Tween 80、Triton X-100)的矿物油的情况下，能够如图11所示那样形成尺寸为大约55μm的乳液液滴。形成乳液的流道的流道宽度是40μm。所形成的乳液流入液滴储液室103-1。以上是液滴形成工序。该乳液中的液滴形成，优选形成充分数量的液滴，直到没有样本液为止。如图5的(B)所示，流入液滴储液室103-1的油中的液滴储存于液滴储液室103-1内。然后，保持与图5的(A)相同的压力，将液滴储液室103-1的温度保持为65度，然后至少放置30分钟，从而放大包含于乳液的液滴中的目标基因序列。
在基因放大反应中，进行对该乳液中的液滴进行计数的处理。在图5的(C)中示出该处理。向液滴储液室103-1施加的压力为14kPa，使样本储液室102-1、试剂储液室102-2、油储液室102-3的压力为大气压而成为0kPa。利用该压力，使包含液滴的乳液从液滴储液室103-1倒流。图12的(A)是在微流道内形成乳液的状态的照片，图12的(B)是使包含液滴的乳液从液滴储液室103-1倒流的状态的照片。通过向倒流的流道中照射激光106，从而检测具有荧光的液滴。在该检测中，将具有荧光的液滴与没有荧光的液滴双方区别开进行计数。具有荧光的液滴的检测对应包含于样本液的目标DNA的检测。另外，利用具有荧光的液滴数与没有荧光的液滴数的比率来评价目标DNA的存在密度。通过以上步骤，可实现为了检测样本液中的目标DNA，而在一个盒内处理液滴形成、基因放大、检测这三个处理。
为了提高以上处理的生产率，使用在盒中形成多个图5的流道图案的设备。图6表示对应八个检测体的基因检查用芯片。图6的盒107的流道图案结构是形成有八条图5的流道图案的盒，使乳液PCR法、或者乳液等温放大法以单一盒与八个检测体对应。以单一盒对应多检测体的优点在于，除了降低一个检测体单位的运行成本之外，同时一起处理多检测体的工序可实现检查时间的缩短化。其理由在于，乳液形成和基因放大反应对单一盒上的八条流道同时一起处理，仅在最后的荧光检测的处理中就逐次检查八条流道。如果用公式表示该优点，则如果将乳液形成时间设定为Et，将基因放大反应时间设定为Dt，将检测荧光的时间设定为Ft，则在一个流道盒的情况下的一个检测体单位的处理时间为Et+Dt+Ft，在八个流道盒的情况下的一个检测体单位的处理时间为(Et+Dt)/8+Ft。即，乳液形成时间和基因放大时间缩短为八分之一。关于处理时间，形成100万个乳液所需要时间是20分钟，基因放大反应时间是30分钟。关于乳液的荧光检测处理时间，如果将检测率设定为1000个/秒，则一条流道单位为16.6分钟的8倍，整体的处理时间合计为约3小时。该处理时间是在100万个乳液的情况下的，在10万个的情况下是45分钟。在图7中示出用该多检测体对应盒进行检查的装置。该装置使用如下的方法，在对应八个检测体流道盒209中，从端部的流道开始进行测量，当测量结束时，向下一个相邻的流道移动盒用载置台210来对流道盒209依次进行测量。该装置在八条流道中一起处理了油中液滴构成的乳液的形成功能、用于乳液内基因增殖反应的温度控制功能后，通过以各流道单位进行载置台移动而依次沿着八条流道在使乳液倒流的过程中进行用流式细胞仪测量乳液液滴。但是，通过以使仅向一条流道照射的尺寸的光束在八条流道间依次步进重复的方式使盒移动，从而测量八条流道整体。通过用照相机217进行检测流道的两侧面的图像识别，从而确认移动后的流道的位置精度。在各流道中，利用分色镜214、215、216和带通滤光镜221、222、223对各个液滴通过光照射区域时所产生的散射光和荧光按照波长对光进行分离，散射光用光检测器217检测，荧光用光检测器218、219检测。在上述中，作为照射光源，有时仅使用波长为488nm的激光，有时结合其它波长的激光进行照射。基于波长为488nm激励所产生的荧光色素，可以使用从500nm到550nm范围的SyberGreen或者EVAGreen、TaqMan探针且FAM。在也同时装配波长为637nm的激光(输出为50mW)的情况下，可以使用TaqMan探针且Cy5。
工业实用性
本发明以在不允许检测体间的交叉污染的医疗用途中使用为目的。具体而言，在癌免疫治疗方法中，在免疫细胞攻击癌细胞的靶向研究中，癌细胞的单一细胞表达分析是重要的，因此需要癌细胞的单一细胞分注技术。另外，在癌诊断中，基于包含于癌患者的血液中的癌基因的高灵敏度检测的诊断很重要。
以上以特定的方式对本发明进行了说明，对于本领域技术人员而言显而易见的变更、改良也包含于本发明的范围。
附图标记说明
1-样本液；
2-上游侧储液室；
3-下游侧储液室；
4-流道；
10-更换型微流道盒的外壳；
11-样本储液室(第一储液室)；
12-鞘液储液室(第二储液室)；
13-试样液与主流道的连接端口；
14-试样液与鞘液的隔壁；
15L-左侧的鞘液与鞘液流道的连接端口；
15R-右侧的鞘液与鞘液流道的连接端口；
16-分类储液室(第3A储液室)；
17-回收储液室(第3B储液室)；
18-分类储液室与分类流道的连接端口；
19-回收储液室与分类流道的连接端口；
20-废液与主流道的连接端口；
21-废液储液室(第四储液室)；
22-主流道(第一流道)；
22-E-主流道(第一流道)；
23L-左侧的鞘液流道(第二流道)；
23R-右侧的鞘液流道(第三流道)；
24L-脉冲流Push侧的分类流道(第四流道)；
24R-脉冲流Pull侧的分类流道(第五流道)；
35-光照射区域；
70-分注目的地的多孔板；
71-容器中的分注前的细胞等样本粒子的悬浊液；
72-容器中的清洗液；
73-分注吸移管(透明的中空管)；
74-空气压注射泵；
75-空气压注射泵的活塞部分；
76-照相机；
77-分注机控制PC；
78-粒子分注机；
80-多孔板内的孔；
81-事前分注的孔内的液体；
82-分注吸移管；
83-预备识别区域；
84-识别区域；
85-浮游粒子；
86-压电泵；
87-样本液预备室；
88-按每个样本液更换的部分；
89-注射泵；
90-从分注嘴排出的液滴；
104-流道；
102-1-样本储液室；
102-2-试剂储液室；
102-3-油储液室；
103-1-液滴储液室；
106-激光照射区域；
107-对应八个检测体的芯片；
108-65℃温度保持部；
208-照射光源；
206-照射光；
207-透镜；
209-多检测体流道盒；
210-盒用载置台；
211-运转载置台用脉冲马达驱动器；
213-光束取样器；
214-分色镜；
215-分色镜；
216-分色镜；
217-照相机；
218-光检测器；
219-光检测器；
220-光检测器；
300-CO2储气罐；
301-压力调整器；
302-空气滤清器；
303-空气配管；
304-蠕动泵；
305-空气软管配管(CO2气体流入用)；
306-空气软管配管(CO2气体排出用)；
307-微流道盒内的样本储液室(对应图2的11)；
308-微流道盒内的回收储液室(对应图2的17)；
309-使用微流道盒的细胞分选仪的装置区域的范围；
310-腔室；
311-细胞分选仪(可以是不使用微流道盒的装置，也可以是使用微流道盒的装置)；
312-微流道盒区域的范围。

Claims (9)

1.一种微粒分注装置，其具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元，
所述微粒分注装置具有：对中空吸移管中的分注液量整体拍摄两次以上的单元；对两个以上所拍摄的分注液量整体的图像进行比较，将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子的单元；检测有无浮游粒子和个数，确认浮游粒子的数量满足设定值的单元；以及对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注的单元。
2.根据权利要求1所述的微粒分注装置，其特征在于，
所述微粒分注装置还具有使所述中空吸移管中的分注液量整体强制地移动的单元。
3.根据权利要求1或2所述的微粒分注装置，其特征在于，
所述微粒分注装置还具有能够将气体气氛调节成0.03~50％的二氧化碳气体气氛的单元。
4.根据权利要求1或2所述的微粒分注装置，其特征在于，
通过保存临分注前的中空吸移管内的粒子图像从而来记录分注的粒子数量的数据。
5.根据权利要求1或2所述的微粒分注装置，其特征在于，
所述微粒分注装置具有用于从中空吸移管的上部向中空吸移管供给试样液的分注预备室。
6.一种微粒分注方法，其是使用具有用于对包含微粒的试样液进行分注的透明的中空吸移管、以及图像拍摄单元的微粒分注装置来对微粒进行分注的方法，
所述微粒分注方法包括以下工序：
工序S1：对中空吸移管内的分注液量整体拍摄两次以上；
工序S2：对两个以上所拍摄的分注液量整体的图像进行比较，将所拍摄的微粒状物中的移动的微粒状物与不移动的微粒状物区别开并判定出浮游粒子；
工序S3：检测有无浮游粒子和个数，确认浮游粒子的数量满足设定值；以及
工序S4：对包含目标个数的浮游粒子的试样液进行分注。
7.根据权利要求6所述的微粒分注方法，其特征在于，
所述微粒分注装置还具有使中空吸移管中的分注液量整体强制地移动的单元，而且所述工序S1是在利用使分注液强制地移动的单元使分注液移动的前后对中空吸移管内的分注液量整体拍摄两次以上的工序。
8.根据权利要求6或7所述的微粒分注方法，其特征在于，
所述微粒分注装置还具有能够将气体气氛调节成0.03~50％二氧化碳气体气氛的单元，而且在3~10％二氧化碳气体气氛下进行所述工序S1~S3。
9.根据权利要求6或7所述的微粒分注方法，其特征在于，
在所述工序S1之前，向中空吸移管的上部的分注预备室抽吸能够分注多次的量的试样液，当从分注预备室向中空吸移管供给一定量的试样液后，通过实施工序S1~S3从而连续地对分注液进行分注。
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