JP2016521350A - 規定された多細胞の組み合わせの分析のための方法および装置 - Google Patents

規定された多細胞の組み合わせの分析のための方法および装置 Download PDF

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Abstract

細胞捕捉、特徴付け、移送および培養を含む、細胞分析方法が提供される。例示的な方法では、個々の細胞（および／または細胞単位）がマイクロ流体チャネル内に流され、チャネルは、複数の隣接するセグメントに分配され、少なくとも１つのセグメントで少なくとも１つの細胞が捕捉される。１つまたはそれよりも多くの捕捉細胞の特徴が測定され、細胞（複数の細胞）および細胞の組み合わせが、測定された特徴に基づいて、特定の細胞保持チャンバ（複数のチャンバ）に移送される。細胞分析のための装置およびシステムもまた提供される。

Description

関連出願
本出願は、その内容が参照によりここに組み込まれる、２０１３年３月１５日に出願された、米国仮出願第６１／８５２，１３５号に対する優先権を請求する。
本発明の分野
本発明は、個々の細胞および規定された細胞の組み合わせの分析のための方法および装置に関する。
背景
多くの刊行物が、以下のSims et al., 2007, “Analysis of single mammalian cells on-chip” Lab Chip 7:423-440; Wheeler et al., 2003, “Microfluidic device for single-cell analysis” Anal Chem 75:3581-3586; Skelley et al., 2009 “Microfluidic control of cell pairing and fusion” Nat Methods 6:147-152; Marcus et al., 2006, “Microfluidic single-cell mRNA isolation and analysis” Anal Chem 78:3084-3089; Bontoux et al., 2008 “Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling” Lab Chip 8:443-450; Zhong et al., 2008 “A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells” Lab Chip 8:68-74; Wheeler 2003 “Microfluidic Device for Single-Cell Analysis Anal. Chem.” 75:3581-3586; and White et al., August 23, 2011 “High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR PNAS” Vol. 108, 34:13999-14004を含み、単一の細胞の操作についての方法を議論してきた（これらのいずれも、先行技術と認めるものではない）。上記に挙げた刊行物のそれぞれは、参照によりここに組み込まれる。
本発明は、先行技術の方法および装置ではみられない特徴および利点を有する新たな方法を提供する。
本発明は、個々の細胞および規定された細胞の組み合わせの分析ための方法および装置に関する。以下の実施態様は、制限を意図するものではない。むしろ、本明細書に記載される実施例および実施態様は、例示のみの目的であること、これに照らして種々の変更または変化が当業者に示唆され、本出願の精神および権限の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
本実施態様の以下の詳述においておよび全体の本明細書にわたって、簡略化のために、概して、参照は、「個々の細胞」または「単一の捕捉細胞」に対してなされる。そのような詳述のそれぞれおよび全ては、文脈から別途明らかである場合を除いて、代替的な実施態様において、「個々の細胞」および「単一の捕捉細胞」は、「個々の細胞単位」および「単一の捕捉細胞単位」と読み取られるべきであることが考慮される。単一の細胞がいくつかのセグメントおよびプロセスで捕捉され、単一の細胞の単位が他のセグメントで捕捉されて処理される実施態様もまた考慮される。
一態様では、本出願は、少なくとも２ラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送を行うことを含む、細胞分析のための方法であって、各ラウンドは、ａ）第１のマイクロ流体チャネルに、複数の個々の細胞および／または細胞単位を含む溶液を流すことと、ｂ）前記チャネルを複数の隣接するセグメントに分配することにより、少なくとも１つの前記セグメントにおいて、少なくとも１つの前記細胞を捕捉することと、ｉ）１つまたはそれよりも多くの前記セグメントが単一の捕捉細胞および／または単一の捕捉細胞単位を含み、ｃ）１つまたはそれよりも多くの前記単一の捕捉細胞および／または細胞単位の少なくとも１つの特徴を測定することと、ｄ）測定された前記特徴に基づいて、特定の細胞保持チャンバに各前記捕捉細胞または単位を独立して移送することにより、各特定のデスティネーション（仕向け先）チャンバについて、そこに移送された前記細胞の前記特徴が分かることを含む、態様１を開示する。
一態様では、本出願は、態様１の方法であって、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送が行われる、態様２を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、ステップｂ）において、少なくとも３０％の前記セグメントが、１以下の前記細胞を含む、態様３を開示する。
一態様では、本出願は、態様３の方法であって、大部分の前記セグメントが１以下の前記細胞を含む、態様４を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、１つまたはそれよりも多くの前記セグメントが、何らの前記細胞を含まない、態様５を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、分配される前記第１のマイクロ流体チャネルの一部分に流される個々の細胞または細胞単位の数が、前記分配の結果として産生される前記セグメントの数よりも少ない、態様６を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、方法は、２つまたはそれよりも多くの分配チャネルを含む装置において行われ、前記細胞は、任意の分配チャネルの任意の前記セグメントから任意の前記細胞保持チャンバへと移送される、態様７を開示する。
一態様では、本出願は、態様７の方法であって、２つの分配チャネルがある、態様８を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記第１の（分配）マイクロ流体チャネルの内腔は実質フィーチャーレスである（実質的に特色がない、実質のっぺりしている、等）、態様９を開示する。
一態様では、本出願は、態様１から９のいずれかの方法であって、測定された前記特徴は、前記細胞のサイズ、形態、または細胞外もしくは細胞内抗原の存在もしくは不存在である、態様１０を開示する。
一態様では、本出願は、態様１から９のいずれかの方法であって、測定された前記特徴は、細胞挙動である、態様１１を開示する。
一態様では、本出願は、態様１から９のいずれかの方法であって、測定された前記特徴は、物理的、化学的、または生物学的挑戦に対する前記細胞による反応である、態様１２を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記細胞は、バルク流体流により移送される、態様１３を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、コンパウンドマニホールドシステムは、任意の前記セグメントから任意の前記細胞保持チャンバへと前記細胞を移送するために使用される、態様１４を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記セグメントから前記細胞保持チャンバに移送された前記各細胞は、同じコネクタチャネルにより移送される（例えば、流れる）、態様１５を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記セグメントのそれぞれは、共通の第２のマイクロ流体チャネルと流体的に接続し、前記捕捉細胞は、特定の前記細胞保持チャンバへの移送において、前記第２のマイクロ流体チャネルにより移送される、態様１６を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、少なくとも１０の個々の前記細胞または細胞単位が前記セグメントから前記細胞保持チャンバへ移送され、および／または少なくとも１０の前記細胞保持チャンバが前記細胞により占められる、態様１７を開示する。
一態様では、本出願は、態様１６または１７の方法であって、前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも５つの前記セグメントと少なくとも５つの前記細胞保持チャンバを接続する、態様１８を開示する。
一態様では、本出願は、態様１８の方法であって、前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも１０の前記セグメントと少なくとも１０の前記細胞保持チャンバを接続する、態様１９を開示する。
一態様では、本出願は、態様１９の方法であって、前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも１０の前記セグメントと少なくとも１０の前記細胞保持チャンバを接続する、態様２０を開示する。
一態様では、本出願は、態様２０の方法であって、前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも２０の前記セグメントと少なくとも２０の前記細胞保持チャンバを接続する、態様２１を開示する。
一態様では、本出願は、態様２１の方法であって、前記コンパウンドマニホールドが、少なくとも１０の前記セグメントおよび少なくとも１０から１００の前記細胞保持チャンバ接続する、態様２２を開示する。
一態様では、本出願は、態様２２の方法であって、前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも５０の前記セグメントと少なくとも５０から１００の前記細胞保持チャンバを接続する、態様２３を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記細胞保持チャンバの数に対する前記セグメントの数の割合は、１より大きい、態様２４を開示する。
一態様では、本出願は、態様２４の方法であって、前記セグメントの数が、前記細胞保持チャンバの数よりも、約１０％、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、または約２００％だけ多い、態様２５を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、複数の前記細胞が、同じ前記細胞保持チャンバに個々に移送されることにより、規定された組み合わせの前記細胞を含む前記細胞保持チャンバを産生する、態様２６を開示する。
一態様では、本出願は、態様２６の方法であって、２、３、または４の前記細胞は、同じ前記細胞保持チャンバに個々に移送される、態様２７を開示する。
一態様では、本出願は、態様２７の方法であって、それぞれ個々に移送された前記細胞は、異なるラウンドの分配において捕捉される、態様２８を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記第１のマイクロ流体チャネルに流された前記細胞は、真核細胞である、態様２９を開示する。
一態様では、本出願は、態様２９の方法であって、前記細胞は、動物細胞である、態様３０を開示する。
一態様では、本出願は、態様３０の方法であって、前記細胞は、ヒトである、態様３１を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、前記細胞は、植物細胞である、態様３２を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位を含む前記溶液は、２つの異なる真核生物種由来の細胞を含む、態様３３を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位を含む前記溶液は、同じ種の２つの異なる個体または標本由来の細胞を含む、態様３４を開示する。
一態様では、本出願は、いずれかの上記態様の方法であって、ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位は、レア（希少、希薄）細胞および他の細胞を含み、ステップｄ）において前記細胞保持チャンバへ移送される少なくとも１つの細胞は、レア細胞であり、前記他の細胞対前記レア細胞の前記溶液における割合は、１００：１より大きく、場合によっては１０００：１より大きく、場合によっては１０，０００：１より大きく、および場合によっては、１００，０００：１より大きい、態様３５を開示する。
一態様では、本出願は、態様３５の方法であって、前記レア細胞は、幹細胞、腫瘍細胞、随意に、循環性腫瘍細胞、循環性内皮細胞、または胎生細胞である、態様３６を開示する。
一態様では、本出願は、態様１から３６のいずれかの方法であって、前記細胞は、前記細胞保持チャンバで培養される、態様３７を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７の方法であって、前記細胞は、約１時間から約４週間の間培養される、態様３８を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７の方法であって、前記細胞は、約１時間から約２４時間の間培養される、態様３９を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から３９のいずれかの方法であって、前記細胞は、後代を産生するために分裂する、態様４０を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４０のいずれかの方法であって、前記細胞は培養中に観察される、態様４１を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４１のいずれかの方法であって、前記細胞は培養中にチャレンジ（挑戦、負荷、曝露、等）される、態様４２を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４２のいずれかの方法であって、前記チャレンジは、薬剤に前記細胞をさらすことを含む、態様４３を開示する。
一態様では、本出願は、態様４３の方法であって、前記薬剤は、薬物、試験薬剤、タンパク質、核酸、または小分子である、態様４４を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４４のいずれかの方法であって、第１の細胞または細胞の組み合わせは、少なくとも１時間の間培養され、その後、装置において、細胞捕捉、特徴付け、および移送により得られる１またはそれよりも多くの追加の細胞が、前記細胞保持チャンバ内に導入される、態様４５を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４５のいずれかの方法であって、培養期間後に、生細胞が前記細胞保持チャンバから収穫される、態様４６を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４６のいずれかの方法であって、培養期間後に、前記細胞保持チャンバにおける前記細胞がインサイツ（インシトゥー、生体内原位置、等）で固定される、態様４７を開示する。
一態様では、本出願は、態様３７から４５のいずれかの方法であって、試薬、溶液、または物理的刺激が、１つまたはそれよりも多くの前記細胞保持チャンバにおける前記１つの細胞または複数の細胞に適用され、前記１つの細胞または複数の細胞の溶解をもたらす、態様４８を開示する。
一態様では、本出願は、態様４８の方法であって、溶解された前記細胞から放出された高分子は、少なくとも１つの前記細胞保持チャンバの外に移送される、態様４９を開示する。
一態様では、本出願は、態様４９の方法であって、前記高分子が収集される、態様５０を開示する。
一態様では、本出願は、態様４９の方法であって、溶解された前記細胞から放出された前記高分子は、前記細胞保持チャンバから対応するマイクロ流体チャンバへと移送され、前記対応するマイクロ流体チャンバは、前記細胞保持チャンバと流体的に接続し、他の前記細胞保持チャンバとは流体的に接続しない、態様５１を開示する。
一態様では、本出願は、態様５０または５１の方法であって、前記高分子は核酸であり、前記核酸は、随意に増幅され、随意に逆転写されて、随意に、前記核酸または対応する増幅産物がマイクロ流体システムでアッセイされ、前記ステップは、前記流体循環路内で全て生じ、随意に、前記アッセイは、遺伝子的な特徴または遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質発現パターンを測定した、態様５２を開示する。
一態様では、本出願は、生細胞を収受し、かつ、維持するために構成されるマイクロ流体装置におけるチャンバであって、有核の真核細胞が前記チャンバへと前記インプットチャネルを無傷で通るように構成されたインプットチャネルと、有核の真核細胞を含まない流体が前記チャンバを出るように複数の４つまたはそれよりも多くのドレインチャネルと、供給チャネルから前記チャンバを分離するガス透過膜とを備え、前記供給チャネルは、前記チャンバへとガス状混合物を運ぶように構成され、前記ガス透過膜は、前記チャンバおよび前記供給チャネルとの間でガスが交換されるように構成されるチャンバである、態様５３を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３のチャンバであって、前記チャンバまたは前記インプットチャネルは、前記チャンバで前記細胞を保持しかつ処理するための１つまたはそれよりも多くの試薬を含む流体を供給するように構成される、試薬チャネルに接続される、態様５４を開示する。
一態様では、本出願は、態様５４のチャンバであって、前記試薬チャネルは、細胞栄養物を含む流体の供給に接続される、態様５５を開示する。
一態様では、本出願は、態様５４のチャンバであって、前記試薬チャネルは、前記チャンバへの前記流体の送達の際に、前記細胞を溶解する流体の供給に接続される、態様５６を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から５６のいずれかのチャンバであって、前記インプットチャネルが前記チャンバに向かってテーパ状であることにより、前記チャンバの中心に向かって細胞を方向づける、態様５７を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から５７のいずれかのチャンバであって、前記ドレインチャネルは、前記流体が前記インプットチャネルから前記チャンバへと流れて、前記ドレインチャネル向かって前記チャンバにおける前記細胞を引き出すことなく、前記ドレインチャネルを出るように、前記チャンバの周りに分布される、態様５８を開示する。
一態様では、本出願は、態様５８のチャンバであって、前記チャンバは、実質的に円または卵円形状の周囲を有し、前記ドレインチャネルは、前記周囲の１８０度以上にわたって分配される、態様５９を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から５９のいずれかのチャンバであって、１０またはそれよりも多くの前記ドレインチャネルを含む、態様６０を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６０のいずれかのチャンバであって、前記ドレインチャネルは、ドレイン開口を通じて前記チャンバに接続し、前記インプットチャネルは、インプット開口を通じて前記チャネルに接続し、前記ドレイン開口の前記直径は、前記インプット開口の前記直径の２０％以下であることにより、前記ドレインチャネル内の無傷な前記細胞の通過を阻害する、態様６１を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６１のいずれかのチャンバであって、前記ドレインチャネルは、ビーズまたはフィルターを含むことにより、前記ドレインチャネル内の無傷な前記細胞の通過を阻害する、態様６２を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６２のいずれかのチャンバであって、少なくとも３つの前記真核細胞を収容するのに十分な大きさである、態様６３を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６３のいずれかのチャンバであって、少なくとも１０の前記真核細胞を収容するのに十分な大きさである、態様６４を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６４のいずれかのチャンバであって、最も狭い直径で少なくとも５０ミクロン（μｍ）にわたる、態様６５を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６５のいずれかのチャンバであって、最も狭い直径で少なくとも２００ミクロンにわたる、態様６６を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６６のいずれかのチャンバであって、凸状の下面を含む、態様６７を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から６７のいずれかのチャンバであって、細胞接着を促進する物質によりコートされた下面を含む、態様６８を開示する。
一態様では、本出願は、態様６８のチャンバであって、前記物質は細胞外マトリクスである、態様６９を開示する。
一態様では、本出願は、態様６８のチャンバであって、前記物質はフィブロネクチンである、態様７０を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から７０のいずれかのチャンバであって、前記チャンバ、前記インプットチャネル、および前記ドレインチャネルが、流体で満たされている、態様７１を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から７１のいずれかのチャンバであって、少なくとも２つの前記真核細胞を含む、態様７２を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から７１のいずれかの４つまたはそれよりも多くの複数のチャンバを備える装置であって、各々はその独自の独立インプットチャネルを有し、各前記インプットチャネルは、共通のソース由来の細胞を供給するために構成される、態様７３を開示する。
一態様では、本出願は、態様７３の装置であって、前記独立インプットチャネルのそれぞれは、他の前記独立インプットチャネルのバルブと独立した操作がなされるバルブを有する、態様７４を開示する。
一態様では、本出願は、態様７３または態様７４の装置であって、前記独立インプットチャネルは、第１のマルチプレクサの一部であり、前記共通のソースは、前記第１のマルチプレクサを第２のマルチプレクサと接続する接続チャネルであり、前記第２のマルチプレクサは、複数の異なるソースから前記接続チャネルに前記細胞を送達するように構成される、態様７５を開示する。
一態様では、本出願は、態様７５の装置であって、前記異なるソースは、共通の分配チャネルの分配された領域である、態様７６を開示する。
一態様では、本出願は、培養において細胞を保持する方法であって、態様５３から７２のいずれかの前記チャンバに前記細胞をデリバーする（送る、送達する）ことと、前記インプットチャネルまたは別個の試薬チャネルにより前記チャンバ内に栄養培地を供給することと、前記供給チャネルにより前記ガス透過膜にガスを供給することとを含む、態様７７を開示する。
一態様では、本出願は、態様７７の方法であって、細胞混合物から前記チャンバへと送達された前記細胞を個々に選択することをさらに含む、態様７８を開示する。
一態様では、本出願は、態様５３から７２のいずれかの前記チャンバに存在する一またはそれよりも多くの細胞由来の細胞内成分を抽出する方法であって、前記チャンバ内で細胞溶解を生じさせる流体を送達することにより前記細胞を溶解することと、前記チャンバから溶解物の産生物を回収することとを含む、態様７９を開示する。
一態様では、本出願は、態様７９の方法であって、前記産生物が、前記ドレインチャネルにより回収される、態様８０を開示する。
一態様では、本出願は、態様７９または態様８０の方法であって、前記産生物が核酸を含む、態様８１を開示する。
一態様では、本出願は、態様７８から８１のいずれかの方法であって、化学的または生化学的反応に、前記産生物を供することをさらに含む、態様８２を開示する。
一態様では、本出願は、マイクロ流体装置における、チャネルおよびバルブの配置であって、（ａ）インプットマルチプレクサであり、（ｉ）複数の４またはそれよりも多くのインプットチャネルと、（ｉｉ）該インプットチャネルのいずれか１つにおける流体が、他の前記インプットチャネルにおける流体と独立して流れるように、前記インプットチャネルを制御するように構成されかつ配置される複数のインプットバルブと、（ｉｉｉ）任意の１つまたはそれよりも多くの前記インプットチャネルを通って流れる流体を収受し、単一の接続チャネルにより前記流体を送るように構成されかつ配置される、１つまたはそれよりも多くのコンバイニングチャネルと、を備え、（ｂ）前記接続チャネルと、（ｃ）アウトプットマルチプレクサであり、（ｉ）複数の４つまたはそれよりも多くのアウトプットチャネルと、（ｉｉ）前記アウトプットチャネルのいずれか１つにおける流体が、他の前記アウトプットチャネルにおける流体と独立して流れるように、前記アウトプットチャネルを制御するために構成されかつ配置される複数のアウトプットバルブと、（ｉｉｉ）前記アウトプットバルブの操作に応じて、前記接続チャネルを通って流れる流体を収受するように、および任意の１つまたはそれよりも多くの前記アウトプットチャネルを通って前記流体を送るように構成されかつ配置される１つまたはそれよりも多くの分配チャネルを備える、態様８３を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３の配置であって、１つまたはそれよりも多くの前記コンバイニングチャネルがマニホールドである、態様８４を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３または態様８４の配置であって、前記インプットチャネルのいずれか１つから、前記コンバイニングチャネルを通って、前記接続チャネルまでの経路長が同じである、態様８５を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３から８５のいずれかの配置であって、１つまたはそれよりも多くの前記分配チャネルがマニホールドである、態様８６を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３から８６のいずれかの配置であって、前記接続チャネルから前記分配チャネルを通り前記アウトプットチャネルのいずれか１つまでの経路長が同じである、態様８７を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３から８７のいずれかの配置であって、真核細胞が、前記インプットチャネルのいずれか１つからまたはこれを通って、前記コンバイニングチャネルを通って、前記接続チャネルを通って、前記分配チャネルを通って、前記アウトプットチャネルのいずれか１つを通って、無傷で通過するように構成される、態様８８を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３から８８のいずれかの配置であって、前記インプットチャネルのそれぞれが、分配チャネルに接続して、その異なる領域からの流体を収受するように構成される、態様８９を開示する。
一態様では、本出願は、態様８９の配置であって、前記インプットバルブが、前記分配チャネルと前記コンバイニングチャネル間に配置される、態様９０を開示する。
一態様では、本出願は、態様８９の配置であって、前記分配チャネルは、前記インプットバルブと前記分配チャネル間に配置される、態様９１を開示する。
一態様では、本出願は、態様８３から９１のいずれかの配置であって、複数の前記アウトプットチャネルは、それぞれ、別個の保持チャンバに接続する、態様９２を開示する。
一態様では、本出願は、態様９２の配置であって、前記保持チャンバは、細胞培養のために構成される、態様９３を開示する。
一態様では、本出願は、態様９１から９３のいずれかの配置であって、インプットマニホールドにおけるチャネル、前記接続チャネル、アウトプットマニホールドにおけるチャネルが、流体により全て満たされる、態様９４を開示する。
一態様では、本出願は、マイクロ流体装置を支持しかつ操作するように構成された装置であって、（ａ）プラットフォームであり、（ｉ）前記マイクロ流体装置を収受しかつ支持するような大きさにされかつ形作られたキャビティと、（ｉｉ）細胞が前記キャビティにおける装置により処理される場合に、前記細胞が光学的に透明な（例えば、ガラス）窓を通じて結像されるように、前記キャビティの上に配置された前記窓と、（ｉｉｉ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置でチャネルを制御するために、および空気圧により前記装置においてバルブを操作するために、密閉するように構成された複数の開口を備える、インターフェースプレートと、（ｉｖ）細胞培養のために適切な温度で、前記キャビティで前記マイクロ流体装置を保持するように構成され、前記プラットフォームの面で前記キャビティを取り囲む一体的な加熱部材とを備え、（ｂ）混合ボックスであり、（ｉ）ガス混合物を収受するように構成されたインレットと、（ｉｉ）前記ガス混合物を湿らせるように構成された加湿器と、（ｉｉｉ）細胞培養のために適切な温度へと前記ガス混合物を加熱するように構成されたヒーターとを備え、（ｃ）前記混合ボックスにおいて前記ヒーターにより加熱されたガスが、前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置内へと前記プラットフォームを通過するように構成される導管とを備える、態様９５を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５の装置であって、（ｄ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置からの使用されたガスが、前記混合ボックスへと戻り、これを通って外に出るように構成された導管と、（ｅ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置からの使用された液体が、前記混合ボックスへと戻り、これを通って外に出るように構成された導管と、をさらに備える、態様９６を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５または態様９６の装置であって、前記プラットフォームは、（ｖ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置内へとおよび／または前記マイクロ流体装置の外へと通過するガス混合物の湿度を測定するように構成された湿度センサをさらに備える、態様９７を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５から９７のいずれかの装置であって、前記混合ボックスは、（ｖｉ）ガス混合物のソースに、前記インレットを接続するように構成されたルアーロックコネクタと、（ｖ）電気ソケットをさらに備える、態様９８を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５から９８のいずれかの装置であって、前記一体的な加熱部材は、前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置および前記混合ボックスにおけるガス混合物を同時に加熱するように、前記プラットフォームから前記混合ボックスへと通過する、態様９９を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５から９９のいずれかの装置であって、前記一体的な加熱部材はポリアミドを含む、態様１００を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５から１００のいずれかの装置であって、前記光学的に透明な（例えば、ガラス）窓は、凝縮を阻害するコーティングによりコートされる、態様１０１を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０１の装置であって、前記コーティングは、イリジウムおよびスズを含む、態様１０２を開示する。
一態様では、本出願は、態様９５から９８のいずれかのマイクロ流体システムであって、前記キャビティで前記マイクロ流体装置とともに支持器具を備える、態様１０３を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０３のマイクロ流体システムであって、前記マイクロ流体装置が、上記記載された装置である、態様１０４を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０３または態様１０４のマイクロ流体システムであって、前記マイクロ流体装置において細胞を培養するための栄養培地の供給およびガス混合物の供給をさらに含む、態様１０５を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０３から１０５のいずれかのマイクロ流体システムであって、前記マイクロ流体装置における細胞の画像をとるように構成された結像装置をさらに備える、態様１０６を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０３から１０６のいずれかのマイクロ流体システムであって、前記マイクロ流体装置の操作を制御するように構成されかつプログラムされるコンピュ-タ処理装置をさらに備える、態様１０７を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０７のマイクロ流体システムであって、前記コンピュ-タ処理装置は、専用プロセッサである、態様１０８を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０７のマイクロ流体システムであって、前記コンピュ-タ処理装置は、前記マイクロ流体装置の操作を制御するためのコード化されるａｐｐを含む、ポータブルコンピュータシステムにおけるプロセッサである、態様１０９を開示する。
一態様では、本出願は、態様１０７から１０９のいずれかのマイクロ流体システムであって、前記コンピュ-タ処理装置が、前記マイクロ流体装置における細胞の画像を表示するために構成されかつプログラムされる、態様１１０を開示する。
一態様では、本出願は、細胞群のプロセシングにおいて、これまでに記載されたマイクロ流体装置における、分配チャネルの使用である、態様１１１を開示する。
一態様では、本出願は、細胞群のプロセシングにおいて、これまで記載されたマイクロ流体装置における、アウトプットマルチプレクサに接続される、インプットマルチプレクサの使用である、態様１１２を開示する。
一態様では、本出願は、細胞群のプロセシングにおいて、これまで記載されたマイクロ流体装置における、複数の保持チャンバの使用である、態様１１３を開示する。
一態様では、本出願は、細胞群のプロセシングにおいて、これまで記載されたマイクロ流体装置のための支持装置の使用である、態様１１４を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１１から１１４のいずれかの使用であって、前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を分離しかつソーティングすることを含む、態様１１５を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１１から１１５のいずれかの使用であって、前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を別個に培養することを含む、態様１１６を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１１から１１６のいずれかの使用であって、前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を、前記細胞群から分離された他の個々の細胞または細胞単位と、分離しかつ組み合わせることを含む、態様１１７を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１１から１１７のいずれかの使用であって、前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位の内容物を別個に収集すること、および各細胞の内容物を化学的反応に供することを含む、態様１１８を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１８の使用であって、前記化学的反応が分析の一部である、態様１１９を開示する。
一態様では、本出願は、態様１１８から１１９のいずれかの使用であって、前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を別個に結像することを含む、態様１２０を開示する。
一態様では、本出願は、細胞群の特性を測定する方法であって、厳密にＮの細胞由来の高分子を含む無細胞の成分を提供することと、Ｎ＝２である場合、前記Ｎの細胞は、少なくとも２時間ともに培養され、前記高分子の分析ステップを行うこととを含む、態様１２１を開示する。
一態様では、本出願は、態様１２１の方法であって、前記高分子は核酸であって、前記分析ステップは、増幅、転写、逆転写、クローニング、またはシーケンシングを含む、態様１２２を開示する。
一態様では、本出願は、態様１２１の方法であって、前記高分子はタンパク質であり、前記分析ステップは、タンパク質を抗体と組み合わせることを含む、態様１２３を開示する。
一態様では、本出願は、態様１２１から１２３のいずれかの方法であって、Ｎ＝３、４、５、６、７、８、または１０以下であることを除外する、態様１２４を開示する。
本発明を行うための代表的なステップを示すフローチャートである。 チャネルの長さに沿って離間されるバルブおよび分配チャネルを含む、本発明の実施態様の概略図を示す。マルチプレクサは示されていない。図２Ａは、１つの分配チャネルを有する実施態様を示す。 チャネルの長さに沿って離間されるバルブおよび分配チャネルを含む、本発明の実施態様の概略図を示す。マルチプレクサは示されていない。図２Ｂは、２つの分配チャネルを有する実施態様を示す。 任意のセグメントから、任意の所定のデスティネーションチャンバへ単一の細胞を独立して移送するために使用される、主要なマルチプレクサを図示する。図３Ａは、分配チャネルとマルチプレクサの２つの位置関係を図示する。 任意のセグメントから、任意の所定のデスティネーションチャンバへ単一の細胞を独立して移送するために使用される、主要なマルチプレクサを図示する。図３Ｂは、分配チャネルとマルチプレクサの２つの位置関係を図示する。 装置の代表的な設計を示す。図４Ａは、コンバイニングマニホールドのチャネル、および同様に分配マニホールドのチャネルが、２つのブロックに分離され、各ブロックが、二次的なマニホールドシステムを介して接続されたままとなることで、単一の統合されたコンバイニングマニホールド、および同様に、コネクタチャネルにより接続される単一の統合された分配マニホールドを提供する、流体システムを示す。 装置の代表的な設計を示す。図４Ｂは図４Ａの詳細である。 セグメント、フローチャネル、およびマルチプレクサチャネルの一実施態様の関係を図示する。 デスティネーションチャンバの代表的な設計を示す。 代表的な装置の設計を示す。 細胞保持チャンバに流体的に接続される複数のチャンバ反応の構成を示す。 システムのグラフィカルなユーザインターフェイスのバーチャルスクリーンショットを示す。 ＰＤＭＳ ＩＦＣ（例えば、バルブおよびチャネル）内部の制御、並びにＰＤＭＳチップを取り囲む環境的な条件、例えば、湿度、温度、およびガス成分の制御を可能にするインターフェースプレートを含むマイクロ流体システムを示す。 ドレインの図を示す。 セグメントから細胞保持チャンバへ細胞を移送するための代替的な経路を示す。 セグメントから細胞保持チャンバへ細胞を移送するための代替的な経路を示す。 １つより多いコネクタチャネルが使用される実施態様を図示する。 １つより多いコネクタチャネルが使用される実施態様を図示する。
１．イントロダクション
本発明は、個々の細胞（または細胞単位）および規定された細胞の組み合わせの分析のための方法および装置に関する。方法は、いくつかのラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送を行うためにマイクロ流体システムを使用することを含む。細胞および細胞の組み合わせがともに培養され、ジェノタイピング、核酸増幅および前増幅、遺伝子発現の分析、ｍｉＲＮＡによる処理、ＤＮＡおよびタンパク質標的の分析（例えば、活性分析）を含む、さらなる分析または操作に供されることとしてもよい。
一態様では、本発明は、少なくとも２ラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送を行うことを含む、細胞分析のための方法であって、各ラウンドは、ａ）第１のマイクロ流体チャネルに、複数の個々の細胞（または細胞単位）を含む溶液を流すことと、ｂ）前記チャネルを複数の隣接するセグメントに分配することにより、少なくとも１つの前記セグメントにおいて、少なくとも１つの前記細胞を捕捉することと、１つまたはそれよりも多くの前記セグメントが単一の捕捉細胞および／または単一の捕捉細胞単位を含み、ｃ）１つまたはそれよりも多くの前記単一の捕捉細胞および／または単一の捕捉細胞単位の少なくとも１つの特徴を測定することと、ｄ）測定された前記特徴に基づいて、特定のデスティネーションチャンバに各前記捕捉細胞または単一の捕捉細胞単位を独立して移送することにより、各特定のデスティネーションチャンバについて、そこに移送された前記細胞の前記特徴が分かる、方法を提供する。細胞および細胞の組み合わせが、直接分析され、培養され、および随意に分子生物学的プロセシングのために収穫される。図１参照。
細胞単離および操作のための様々な方法および装置が、米国特許出願公開第２０１３−０３０２８８３号として公開され、２０１３年２月２８日に出願された米国特許出願第１３／７８１，２９２号に開示され、全ての目的のために、その全体において本明細書に組み込まれる。
２．定義
「複数」は少なくとも３つを意味する。
「過半数」は５０％越えを意味する。
「細胞」は、真核細胞または原核細胞であることとしてもよい。
「個々の細胞」は、他の細胞と物理的に接触しない細胞、例えば、固形組織または多細胞構造の一部ではない細胞である。個々の細胞は、その天然の状態において、他の細胞と接することなく、少なくともその生命の一部であるものであることとしてもよい（例えば、循環性リンパ球；精子、卵母細胞、有核の赤血球、単一の細胞藻類、原生生物等）。代替的には、個々の細胞は、その天然の状態において、概して、他の細胞（例えば、肝細胞、ニューロン）と接触するが、これらの他の細胞からは分離されたものであることとしてもよい（例えば、組織の脱凝集により）。
「個々の細胞単位」は、わずかな数の細胞の凝集である（例えば、２、３、４、５の細胞、もしくは１０未満の細胞および／または１０００ミクロンの直径の内腔を有するマイクロ流体チャネルを通って流れることが可能なサイズを有する少数の細胞の凝集）。例示のために、多分化能幹細胞の凝集物は、細胞単位であることとしてもよい。
フレーズ「個々の細胞（または細胞単位）」は、「いくつかの実施態様では、個々の細胞；他の実施態様では、個々の細胞単位」および「さらに他の実施態様では、個々の細胞および細胞単位の混合物」と読みとられるべきである。同様に、フレーズ「単一の捕捉細胞または単一の捕捉細胞単位」は、「いくつかの実施態様では、単一の捕捉細胞；他の実施態様では、単一の捕捉された個々の細胞単位」および「さらに他の実施態様では、単一の捕捉細胞と単一の捕捉細胞単位の混合物」と読み取られるべきである。
マイクロ流体装置の２つのコンポーネントは、それらが、１つのコンポーネントから他へと流体を運ぶことが可能であるマイクロ流体チャネルまたは他の導管により接続される場合に、「流体的に接続され」ていることを指す。
「バルブ」は、細胞の移動および／またはチャネルを通る流体（空気または液体）の移動を制限するために使用される。以下の本明細書で述べられるように（§１７Ａ）、バルブは、種々の設計および構造を有することとしてもよい。さらに、バルブは、機能により言及されることとしてもよい（例えば、「分配バルブ」、「上流バルブ」、「下流バルブ」、「マルチプレクサバルブ」、「透過バルブ」、「ワンウェイバルブ」、および「ポンプバルブ」）。
「チャネルフィルター」は、チャネルへ入るまたは通る細胞の流路を妨げるが、液体は流れることができるチャネルにおける作動不能なバリアを指す（例えば、上流チャネルまたはドレインチャネル）。いくつかの実施態様では、フィルターは、チャネルの一部を、ビーズにより充填することにより作成され、または、フリット、ポスト（post）、多孔性ポリマーの一体化した材料等を含む。
マイクロ流体チャネルの「長さ」は、細胞が導入され、かつ複数の隣接するセグメントに分配される、チャネルまたはチャネルの一部を指す。
「捕捉」は、チャネルの特定のセグメントに細胞を拘束するための物理的バリアを使用すること指す。
本明細書で使用されるように、「アドレス」は、マイクロ流体システムでの位置を指す。例えば、本発明のマイクロ流体システムでは、各セグメントは、アドレスを割り当てられることとしてもよく（例えば、１から１０）、各細胞保持チャンバがアドレスを割り当てられることとしてもよい（例えば、ａからｚ）。
３．分配チャネル
個々の細胞（または細胞単位）は、マイクロ流体チャネル（「分配チャネル」として言及される）内へ複数の細胞を含む成分を流し、かつチャネルにおける他の細胞から少なくとも１つの個々の細胞を物理的に単離することにより単離されることとしてもよい。物理的な単離のステップは、分配チャネルを複数のセグメントに分配することにより達成されることとしてもよく、その少なくとも１つが、単一の細胞を含む。図２Ａは、チャネルの長さに沿って離間される分配チャネルとバルブを図示する。バルブが作動される場合、チャネルが複数のセグメントに分配される（図２Ａおよび一定の他の概略図では、選択されたバルブの位置が、塗りつぶされた細長い長方形を用いて図示される。特定の操作の間、バルブが開または閉であることが文脈から明らかであろう。全てのバルブは示されていない。）。
分配チャネルの寸法は、チャネル材料、バルブデザイン、および他のファクターに応じて変化することとしてもよいが、あらゆる事象において、細胞が、概して真核細胞が、チャネルを通って流れるのに十分である。真核細胞の寸法は、概して、約４から約１００ミクロンの範囲である。代表的な分配チャネルの断面の寸法は、約１５ミクロンから約１０００ミクロン、約１５ミクロンから約５００ミクロン、場合によっては約５００ミクロンから約１０００ミクロン、場合によっては約２００ミクロンから約８００ミクロンである。
「分配チャネル」への言及が、しばしば、バルブがセグメントを作成するために作動される分配チャネルの一部を指すことは、文脈から理解されかつ明らかであろう。分配チャネルは、通常、分配バルブを典型的には両端で欠くセグメントを有し、これにより細胞がチャネルから導入されまたは取り除かれることが理解されるであろう。いくつかの実施態様では、マイクロ流体システムは、複数の（例えば、２つの）分配チャネルを含む。下記§４を参照。
４．前記分配チャネルへの細胞の導入
本発明のプロセスにおける第１のステップにおいて、細胞を含む溶液は、分配チャネル内に、および細胞が捕捉される長さのチャネルに流される。概して、細胞は、細胞培養培地のような、細胞が生存可能である溶液中にある。研究される細胞にとって適切な培地を識別することは、当業者にとって可能な範囲内のものである。いくつかの実施態様では、細胞は、特定の温度（例えば、室温または３７℃）、湿度、および／または気圧（例えば、ＣＯ２／Ｏ２分圧）で保持される。
分配チャネル内に細胞を導入する前に、それらは、分配チャネルとの流体連絡において、不変または可逆的であるリザーバに保存されることとしてもよい。
細胞は、概して、下記§９に記載されるようにバルク流体流により分配チャネルに導入されるが、当業者に知られ、また、下記§９に記載されるように、移送の他の方法を用いて、分配チャネルに導入されることとしてもよい。
いくつかの実施態様では、マイクロ流体システムは、複数の（例えば２つの）分配チャネルを含む。図２Ｂ参照。複数の分配チャネルを有する装置は、２つの明確に異なる細胞群またはタイプが、特に有意に異なるサイズの細胞、異なる特徴が測定される細胞、異なる培地を必要とする細胞、細胞調製物間のクロスコンタミネーションが回避されなければならない実験等が、分析されて組み合わされる場合に、利点を有することとしてもよい。
代替的には、以下に述べるように、異なる細胞群およびタイプが、異なる時間（例えば、順次）に、同じ分配チャネルに導入され得る。代替的には、異なる細胞タイプ、または異なる細胞群が、混合されて、測定された特徴に基づく捕捉後に選択され得る。頻繁に、サンプルが異なる細胞タイプの混合物を含んで得られ、本発明の方法およびシステムが、通常、他の細胞を破棄し、混合物由来の個々の関心細胞（または細胞単位）を選択するために使用される。
いくつかの実施態様では、関心細胞は、群では希少である。例えば、分配チャンバに導入された溶液において、他の細胞に対する関心細胞の割合は、１００：１以上、場合によっては１０００：１以上、場合によっては１０，０００：１以上、および場合によっては１００，０００：１以上であることとしてもよい。レア細胞の例は、幹細胞、腫瘍細胞（例えば、循環性腫瘍細胞）、循環性内皮細胞、および胎生細胞を含む。
５．バルブ、分配、セグメント
上記のように、バルブは、分配チャネルの長さに沿って離間され、そのバルブは、チャネルを複数のセグメントに分配するように作動されることとしてもよい。
本明細書で使用されるように、用語「バルブ」は、チャネルによる細胞の移動および／または液体の移動を制限するために使用される構造を指す。バルブは、作動可能であり（作動シグナルに反応して開閉され得る）、概してリバーシブルである（１つのシグナルまたは複数のシグナルに反応してともに開閉され得る）。本明細書で下記§１７Ａに述べられるように、バルブは、種々のデザインおよび構造を有することとしてもよい。また、バルブは、機能により言及されることとしてもよい（例えば、「分配バルブ」、「上流バルブ」、「下流バルブ」、「マルチプレクサバルブ」、「透過バルブ」、「ワンウェイバルブ」、および「ポンプバルブ」）。
いくつかのバルブは、（例えば、チャネル内腔を完全にブロックすることにより）チャネルによる液体の移動を止める。これらのバルブは、また、チャネルにより細胞の移動をブロックする。「透過」バルブは、細胞の移動をブロックするが、液体がそれらを流れることはできる。例えば、部分的に閉じられたバルブは、流体を通過させるが、細胞の通過を防止するために内腔を十分にブロックし得る。部分的に閉じられたバルブに対する１つのアプローチは、例えば、Ｑｕａｋｅ（シーブ（sieve）バルブを記載する）に対する米国特許出願公開第２００８０２６４８６３号にみられる。別の透過バルブは、バルブが閉じられた場合に、柱が、流体は流れることができるが、細胞は流れることができない隙間を保持するように、膜構造と一体的な柱を有するバルブである。例えば、米国特許第７２９１５１２号の図２７ＡＢを参照。非作動可能なチャネル「フィルター」は以下に記載され、また細胞の移動をブロックするが、液体が流れることを可能にする。
分配チャネルを分配するバルブは、「分配バルブ」と呼ばれることとしてもよい。
分配チャネルをセグメントに分配することは、個々の細胞（または細胞単位）が他の細胞から物理的に分離されるメカニズムである。２つの細胞が、物理的に分離される。２つの細胞間を隔てる物理的バリアがある場合、それらは物理的に分離され、細胞はそれぞれ、独自のスペースに拘束される。典型的には、細胞捕捉は、分配チャネルにおける細胞の不規則分布に基づく確率過程である。
分配チャネルは、実質的に特色がない、または、セグメントが個々の細胞（または細胞単位）を含む尤度を増加させるために、細胞を位置づけるために使用される、二次的な特徴を有することとしてもよい。二次的な特徴の例は、分配前にチャネル（例えば、チャネル６１６）における個々の細胞（または細胞単位）を位置づけるために使用され得る「細胞コーム」を記載する、米国特許公開第２０１００１２００７７号の図１７および実施例５にみられる。他の例は、（より遅い領域における微粒子の堆積物を増加させるかもしれない、流速に影響を及ぼすことにより）その長さに沿った幅における、有意なおよび周期的な差異を有するチャネルである。
これに対し、実質的に特色がないチャネルは、概して、一定の内腔寸法および形状を有する。二次的な特徴を有する実施態様が考慮されるが、実質的に特色がない分配チャネルが好ましい。
注記されるように、バルブが作動される場合、チャネルは複数のセグメントに分配される。通常、セグメントは隣接する。一実施態様では、バルブはチャネルの長さに沿って実質的に等しく離間され、略等しいサイズのセグメントをもたらす。
生成されたセグメントの数は、広い範囲にわたって、例えば、１０から２００、しばしば５０から１００、および場合によっては１００より多くにわたって変化し得る。概して、少なくとも２５セグメント、場合によっては少なくとも５０セグメント、および場合によっては少なくとも７５セグメントがある。
セグメントのサイズ（量および寸法）は、大きな範囲にわたって変化し得る。セグメントは、個々の細胞を含むのに十分な大きさであるべきであるが、スペースの効率的な使用のために十分に小さい。代表的なセグメント長は、約２０、約３０、または約４０ミクロンの長さ（例えば、約２０から約４０ミクロンの長さ）である。
いくつかの実施態様では、各セグメントの量は、その単一の標的細胞の複数倍である。最も多い真核細胞の量は、０．０５ピコリットルから４．２ナノリットルの範囲である。
他の実施態様では、流体流は停止せず、様々な細胞および種々の位置がソートされる（つまり、平行シフトレジスタ）。このプロセスは、バルブ作動の緊密な調整を必要とするが、平行モードにおける複数の細胞のより早い細胞選択の利点を有する。
６．細胞濃度
本発明は、単一の細胞、単一の細胞単位、または組み合わせを特徴づけおよび組み合わせるために使用されることとしてもよい。よって、少なくともいくつかの分配セグメントは単一の細胞を含み、概して、実質的な程度、単一の細胞を含む分配セグメントの割合を最大化することに有利であることが望ましい（１つの細胞または複数の細胞を含まないセグメントと対照的に）。セグメントのサイズ、細胞の濃度、および他のファクターが、単一の細胞の捕捉を最大化するために選択されることとしてもよい。分配チャネルへの導入のための最適な細胞濃度は、例えば、経験的に測定され得、または数学的に算出され得る。
セグメントが単一の細胞を含む測定において、いくつかの実施態様では、他の細胞の存在が、行われる分析と干渉しない場合、特定のクラスの細胞がカウントされる。例えば、少しの真核細胞を含む溶液および莫大な過多のバクテリア細胞が使用される場合、いくつかのセグメントが、単一の真核細胞を含み、いくつかのまたは全てのセグメントが、おそらく多くのバクテリア細胞を含むであろう。この場合において、１つの真核細胞および多数のバクテリア細胞を含むセグメントが、（特定のクラスの）単一の細胞を有することが考えられるかもしれない。同様に、少しの有核の細胞および莫大な過剰の無核の赤血球を含む溶液が使用される場合、いくつかのセグメントが、単一の有核の細胞を含み、いくつかまたは全てのセグメントが、おそらく多くの赤血球を含むであろう。いくつかの場合において、関心細胞群が、（ｉ）全ての真核細胞、（ｉｉ）全ての有核の細胞、（ｉｉｉ）全ての動物細胞、（ｉｖ）全てのヒト細胞、（ｖ）全ての原核細胞、（ｖｉ）全ての原生生物、（ｖｉｉ）全ての寄生虫、（ｖｉｉｉ）全ての真菌細胞である。
以下に記載されるように、複数のラウンドの細胞捕捉が、関心細胞を有する複数の細胞保持チャンバを配置することを行うことが考慮される。好ましくは、各ラウンドの細胞捕捉は、単一の細胞を有する少なくとも１つのセグメントをもたらす。通常、細胞を有しない少なくとも１つのセグメントがあるであろう。好ましくは、少なくとも３０％、代替的には、少なくとも４０％、および好ましくは大部分のセグメントが、１つより多い細胞を含まない（つまり、それらは１つの細胞またはゼロの細胞を含む）。
７．捕捉細胞の少なくとも１つの特徴を測定する
１つまたはそれよりも多くの特徴、または同等の捕捉細胞（つまり、いくつかまたは全ての捕捉細胞）の「特性」が測定され、一方、細胞はセグメントに捕捉される。測定され得る特徴の例は、例えば、サイズ、形態、光学特性（例えば、色、屈折率；例えば、Coelho et al., 2006, "Measuring optical and mechanical characterizatoin of a living cell with defocusing microscopy," Biophys J. 91:1108-15参照。）、細胞外または細胞内抗原の存在または不存在、核酸内容物、細胞膜電気特性、モビリティ、刺激に対する反応等を含むがこれに制限されない。
特徴を測定する方法は、検出される具体的な特徴によるであろう。例えば、細胞特性は、光学的に（例えば、顕微鏡またはＣＣＤカメラを用いて）、分光的に（例えば、ラマン分光法）、誘電泳動特性を測定することにより（例えば、K. Hoettges 2008, “Dielectrophoresis as a Cell Characterisation Tool” in Methods in Molecular Biology 583:183-19参照）、または細胞の抗原または核酸に関連するシグナル（例えば、蛍光シグナル）を検出することにより、測定され得る。細胞特性を検出するための装置は、マイクロ流体装置と全体的にまたは部分的に一体的であり得、装置に対して外部にあることとしてもよい。測定プロセスは、マニュアル、または部分的にもしくは全体的に自動であり得る。代表的なシグナル検出は、モニターで可視、蛍光、およびＵＶライト（強度、散乱、吸収）発光、差反射率、電気抵抗、抵抗率、インピーダンス、および電圧である。また、出願は、共焦点レーザ走査、放射化学検出、蛍光偏光法、および他の方法を利用し得る。マイクロ流体システムの構造において使用されるデザインおよび材料は、検出のメカニズムと親和性があることが認識されるであろう。例えば、光学的方法が使用される場合、分配チャネルは、少なくとも検出のために必要とされる光の波長に対して透過的な材料を用いて製造されることとしてもよい。代替的には、光ファイバーおよび他のシステムが採用されることとしてもよい。
捕捉細胞が、抗原（タンパク質）、特定のＲＮＡもしくはＤＮＡ配列、またはタンパク質の存在または活性を含む、いくつかの細胞外抗原、または細胞内バイオマーカーの存在または不存在の組み合わせのような１つより多い特徴の組み合わせにより特徴づけられることとしてもよい。
関心細胞の異なる群が、２つの異なる特徴、１つの群の１つの特徴、第２の群の第２の特徴について、捕捉細胞を分析することにより識別されることとしてもよい。１つのアプローチにおいて、少なくとも１つの検出可能な標識が、関心細胞に存在する（ポジティブセレクション）または存在しない（ネガティブセレクション）特性に基づいて群における細胞と関連される。細胞を特徴づけるための適切な免疫細胞化学的方法は、当該技術分野で非常によく知られている。
例示であって、制限ではなく、細胞の特徴は、３つのカテゴリーの特徴を含み、これらのいずれも、細胞を特徴づけるために使用されることとしてもよい。（１）処理されていない細胞の特徴、（２）細胞成分と関連される検出可能な標識、（３）チャレンジに対する細胞の反応。
処理されていない細胞の特性は、形態、光学特性、電気的特性、代謝的特性（例えば、Ｏ２消費）、挙動（モビリティ、膜ラフリング等）を含み得る。
細胞成分と関連される検出可能な標識は、核酸、細胞抗原、および他の細胞成分と関連される検出可能な標識を含み得る。代表的な検出可能な標識の包括的でないリストは、§１７（Ｂ）で提供される。
チャレンジに対する細胞反応が、細胞の物理的または化学的環境における変化に対する反応においてチャレンジする細胞特性の検出に関する。例えば、捕捉細胞は、物理的変化（温度変化、照度、ｐＨ変化等）にさらされ、細胞の反応が検出されることとしてもよい。別の例として、捕捉細胞は、試薬（例えば、薬物、試験試薬、阻害剤等）にさらされることによりチャレンジされ、細胞反応が検出されることとしてもよい。
処理されていない細胞の特徴およびチャレンジに対する細胞の反応は、検出可能な標識を用いて検出されることとしてもよいことが理解されるであろう。例えば、エンドサイトーシス（細胞特性として）または物理的または化学的チャレンジに対する反応において増加されたエンドサイトーシスは、蛍光で標識されたポリスチレンナノ粒子と細胞をインキュベートして、蛍光標識のアップデートを検出するために細胞をさらすことにより検出され得る。
分配チャネル内に細胞を導入する前に、分配チャネル内に細胞が導入された後、または両方で、細胞は、チャレンジされおよび／または検出可能な標識により標識される。
例えば、いくつかの実施態様において、少なくともいくつかの細胞は、分配チャネルに導入される前に、検出可能に標識される。他の実施態様において、少なくともいくつかの細胞が標識され、例えば、チャネルを通して検出試薬を流すことにより、チャネルにおいて捕捉される。細胞群は、捕捉前に１つの標識で標識され、捕捉後に、異なる標識で標識されることとしてもよい。細胞群は、捕捉前に１つの試薬に細胞をさらすことにより標識され、捕捉後に、対応する検出可能な標識にさらされることとしてもよい。例えば、細胞群は、捕捉前に、細胞表面抗原を認識するマウス抗体に対してさらされ、その後、ローダミンタグ化抗マウス抗体に対して、捕捉されながらさらされ、細胞を作製する。
関心特性を有することが測定された単一の捕捉細胞が、細胞保持チャンバへと移送される。残りの細胞は、例えば、分配チャネルにおけるバルブを開口することにより、および細胞保持チャンバへと移送されない細胞および他の材料を除去することにより、破棄されることとしてもよい。一実施態様では、いくつかのクエリーが細胞デスティネーションチャンバへの移送ための細胞を選択するためになされ得る。例示であって制限ではないが、以下のクエリーが各セグメントについてなされ得る。
‐セグメントは細胞を含んでいるか？
↓ もしイエスであれば
‐セグメントは単一の細胞を含むか？
↓ もしイエスであれば
‐単一の細胞が関心特性を有しているか？
８．セグメントと関連するマルチプレクサチャネルおよびフローチャネル
適切な特徴を有するように識別された捕捉細胞は、いくつかの細胞デスティネーションチャンバの１つに移送される（下記§１０に記載）。特定の細胞デスティネーションチャンバに独立して移送されるように、選択された単一の細胞（または単一の細胞単位）を許容する、あらゆる移送システムが、使用されることとしてもよい。この文脈で使用されるように、「独立して移送される」は、複数（例えば、１０から５００）のセグメントのいずれか１つから、個々の細胞が、複数（例えば、１０から５００）の細胞保持チャンバのいずれか１つへと移送されることとしてもよく、細胞の選択された組み合わせが、同じ細胞デスティネーションチャンバに移送されることを可能にすることを意味する。
１つのアプローチでは、細胞は、コンパウンドマニホールドシステムを用いて移送される。コンパウンドマニホールドは、コネクタチャネルＸにより接続される、「コンバイニングマニホールド」および「分配マニホールド」を含む。分配チャネルのセグメントＳのそれぞれが、コンバイニングマニホールドの独自のコンバイニングチャネルＣｃにより流体連絡する。各々の独自のＣｃチャネルを通る流れは、細胞が単一の選択されたチャネルＣｃのみを通って流れることができるように、選択されたバルブを作動することにより、またはそうでなければ、各チャネルＣｃを通る流れ（または電気浸透性の移送の場合には細胞移動）を制御することにより制御され得る。各チャネルＣｃは、コネクタチャネルＸに流体的に連結されている。コンバイニングチャネルＣｃは、単一の共通のチャネルにより（図２および３に概略的に図示されるように）、二次的なマニホールドシステムにより（図４Ａ、図４Ｂ、および図７に図示されるように）、１つ以上のコネクタ、または別の方法により、コネクタチャネルＸに連結されることとしてもよい（用語「コンバイニングマニホールド」または「分配マニホールド」は、関連する二次的なマニホールドシステムを包含する。）。システムは、粒子（例えば、細胞）が、ただ１つのコンバイニングチャネルＣｃにより流れることを可能にするように、チャネルが構成される場合に、粒子はコネクタチャネルＸ内に流れるように配置される。
分配マニホールドは、ある程度は、コンバイニングマニホールドを反映する。細胞保持チャンバＨのそれぞれは、分配マニホールドの独自の分配チャネルＣｄと流体連結する。各独自のチャネルＣｄを通る流れは、細胞が単一の選択されたチャネルＣｄのみを通って流れるように、選択されたバルブを作動することにより、そうでなければ各チャネルＣｄを通る流れ（または電気浸透性の移送の場合には細胞移動）を制御することにより制御され得る。各チャネルＣｄは、コネクタチャネルＸに流体的に連結される。コンバイニングチャネルＣｄは、単一の共通のチャネルにより（図２および３に概略的に図示されるように）、二次的なマニホールドシステムにより（図４および７に図示されるように）、またはそれ以外の方法により、コネクタチャネルＸと連結されることとしてもよい。システムは、粒子（例えば、細胞）が１つの分配チャネルＣｄのみを通って流れることができるように分配チャネルが構成される場合に、粒子がコネクタチャネルＸから１つの細胞保持チャンバＨのみに流れるように配置される。
コンパウンドマニホールドを用いて、細胞が、任意のセグメントＳ（つまり、分配チャネルにおける任意のセグメントのアドレス）から任意の細胞保持チャンバＨ（つまり、任意の細胞保持セグメントアドレス）へと独立して移送され得ることが本明細書の記載および図面に対する参照により理解されるであろう。
「コンバイニングマニホールド」および関連するバルブ、並びに「分配マニホールド」および関連するバルブは、それぞれが、「マルチプレクサ」システムとして参照され得る。
１つのアプローチでは、細胞は、このようなコンパウンドマニホールドまたはマルチプレクサシステムを用いて移送される。単一のマルチプレクサシステムは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７１４３７８５号に記載される。また、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、T. Thorsen “Microfluidic Technologies for High-Throughput Screen Applications,” Ph.D. Thesis, California Institute of Technology, Chapt. 5;およびMelin and Quake, 2007, “Microfluidic Large-Scale Integration: The Evolution of Design Rules for Biological,” Automation Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:213-31; Hua et al., 2006, A versatile microreactor platform featuring a chemical-resistant microvalve array for addressable multiplex syntheses and assays. J Micromech Microeng 16:1433-1443も参照。マイクロ流体マルチプレクサは、複数の個々にアドレス指定可能なインプット（チャネル）から単一のアウトプットへと流れを切り替えることができ、または単一のインプットから複数の個々にアドレス指定可能なアウトプットへと流れを切り替えることができる。
随意に、マルチプレクサシステムは、シフトレジスタを含む。（Sai et al., 2102, “Pressure driven digital logic in PDMS based microfluidic devices fabricated by multilayer soft lithography” Lab on a Chip 12, 4809-4815; DOI: 10.1039/c2lc21155f参照。）随意に、マルチプレクサシステムは、シフトレジスタにより生成されたシグナルを制御することにより操作し、シフトレジスタは、ユーザーが設定可能なインプット、繰り返し「クロック」、およびトリガーバルブにより制御される。ユーザーが設定可能なインプットは、シフトレジスタに「読み取られ」、「クロック」サイクルごとのレジスタによりインプットシグナルのものである「ビット」を移動する、連続的なインプットインストラクションを提供する。トリガーバルブは、空気圧式シフトレジスタアウトプットおよび流体マルチプレクサ「制御」チャネル間で連絡を開くための役割を果たす。
図３Ａおよび図３Ｂは、本発明の主要なマルチプレクサシステムを図示する。これらの図では、制御チャネル５００により作動されるエラストマーのバルブが示される。Unger et at., 2000, "Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography" Science 288: 113-116参照。図において、制御チャネルは、より広い領域およびより狭い領域を有する。バルブ６００は、制御チャネルの広いセクションが流体チャネルの上を（または下を）横断するところに作成される。制御チャネルの選択された組み合わせを作動することにより、流路が、任意のセグメントから任意の細胞保持チャンバへと作成されることとしてもよい。図３Ａおよび図３Ｂにおけるバルブパターンは例示のためのものであり、種々の他のパターンが使用され得ることが理解されるであろう。例えば、図７参照。エラストマーシステムは非常に効率的であり、ｎ未満の制御チャネルを用いて、ｎの流体チャネルにより流れを制御することが可能となる。しかしながら、方法は、エラストマーの実施態様に制限されないことが理解されるであろう。実質的に流体流を完全に止める任意の数のバルブが使用され得る。例えば、１つのアプローチにおいて、各マルチプレクサチャネルを通る流れは、独立して作動可能なバルブにより制御され得、流れは、例えば、分配チャンバセクターにおける１つを除く全てのバルブおよび保持チャンバセクターにおける１つを除く全てのバルブを閉じることにより制御され得る。
一実施態様では、バルク流体流は、セグメントから細胞保持チャンバへ選択された細胞を移送するために使用される。例示のために、図５に関連して、各分配チャネルセグメントは、マルチプレクサチャネル１０７とフローチャネル１０５を流体的に連絡する。マルチプレクサチャネルは、下流マルチプレクサチャネル（図３Ａ、図７）または上流マルチプレクサチャネル（図３Ｂ）であることとしてもよい。フローチャネル１０５は、上流フローチャネル（図３Ａ、図７）または下流フローチャネル（図３Ｂ）であることとしてもよい。下流チャネルは、分配チャネルと細胞デスティネーションチャンバとの間に位置する。各アプローチにおいて、下流チャネルは、適切な寸法を有し、そうでなければ、細胞を運ぶのに適している（つまり、細胞が下流チャネルを通って流れる）。対照的に、上流チャネルは、下流チャネルへの細胞の流れを促進する液体を提供する。下流マルチプレクサチャネルは、上流フローチャネルとともに使用され、および逆もまた同じであることが認識される。
分配後に、細胞は、以下の経路、（１）流体ソース→（２）上流チャネル→（３）セグメント→（４）下流チャネル→（５）コネクタ（例えば、接続マニホールド）→（６）保持チャンバセクターフローチャネル→（７）細胞保持チャンバ→（８）（随意に）複数のチャンバ反応構成の流体流により移送されることとしてもよい。
図５に示されるように、分配チャネルの分配からもたらされる長手方向の分離を成し遂げるために使用されるバルブに加えて、追加のバルブが、上流チャネル（上流バルブ１０６）および／または下流チャネル（下流バルブ１０４）への細胞の流れを制御するために随意に使用されることとしてもよい。例えば、細胞は、分配バルブ１０２を開いた状態で、分配チャネルを通って流れることとしてもよく、バルブ１０４および１０６は、細胞が上流または下流チャネルへと流れるのを防止するために閉じられることとしてもよい。代替的には、上流および／または下流チャネルは、バルブを有していないこととしてもよい。例えば、上流チャネルは、細胞がチャネルに入るのを防止するチャネル寸法または構造を有することとしてもよい。別のアプローチでは、それらは、液体がそれらを通って流れるが、細胞の通過をブロックすることを可能にするチャネルフィルターを有することとしてもよい。別のアプローチでは、上流マルチプレクサの場合には、マルチプレクサバルブが、閉じられている場合に、上流チャネルをブロックするであろう。この場合において、例え、細胞が上流チャネルに移動する場合であっても、それらは、デスティネーションチャンバへまたは廃棄へと、これらのチャネルの外に移送され得る。このデザインは、非選択細胞の除去のステップをより複雑にすることとしてもよいことが認識されるであろう。別のアプローチでは、チャネル寸法は、上流および／または下流バルブを必須とはしないことを選択され得る。これは、分配チャネルを流れる細胞が、流体により占められる上流または下流チャネルに入らない傾向にある結果、細胞が分配チャネルに流されるローディングステップ中に、分配チャネルを通って流れるが、システムの残りを通る流れはない（静流）ためである。
概して、各セグメントは、異なる（独自の）マルチプレクサチャネルにより連絡する。代替的には、対または複数のチャネルは、このようなデザインは、概して、効率性における犠牲を必要とするが、分配マルチプレクサチャネルに接続されるように（例えば、接続された対の１つのセグメントのみが標的細胞を含む場合に使用される）、セグメントの対を接続するマニホールドを使用することを可能にする。
図７は、マルチプレクサシステムの代表的なデザインを図示する。システムは、分配チャネル１００、分配バルブ１１０、上流フローチャネル１０５、下流マルチプレクサチャネル１０１および下流バルブ１０４を含む分配チャネルセレクター（マルチプレクサ）２００、二次的なマニホールドシステム３００、コネクタ４００（図示せず）、細胞保持チャンバチャネルセレクター（マルチプレクサ）５００、および細胞保持チャンバ６００を含む。格納バルブを制御する制御チャネル７００もまた示される。
図３に示される概略的なマルチプレクサとは対照的に、二次的なマニホールドシステムが図７に示される。マニホールドは、任意のセグメント間および任意の細胞保持チャンバ間の距離（および近似の通過時間）が同じであることを確実にする。この均一性は、任意のセグメントから任意の細胞保持チャンバへと細胞を移送する、バルブのある分配間の一貫性のある作動時間およびルーチンを保持する利点を有する。
図１４および１５は、１つ以上のコネクタチャネルが使用される実施態様を図示する。図１４では、２つのコンバイニングマニホールドのそれぞれが、セパレートコネクタ（Ｃ１およびＣ２）により単一の分配マニホールドへと接続される（図２Ｂと比較）。図１５は、２つのコネクタ、Ｃ１およびＣ２を有するシステムを図示する。時間Ｎで、細胞はＣ１を通って移送されて細胞保持チャンバに入る。時間Ｎ＋１で、異なる細胞は、Ｃ２を通って移送されて、異なる細胞保持チャンバに入る。
セグメントから細胞保持チャンバへ細胞を移送するための別のアプローチが図１２に示される。このアプローチでは、細胞は、上記のように、分配チャネル１００に導入されて、分配バルブ１０１により、セグメント１０２へと拘束される。選択されたセグメントの内容物（つまり、選択された単一の細胞または細胞のグループ）。選択された細胞は、概して、上述のように、コンバイニングマニホールド２００を通って、コネクタ３００へと移送される。図１２に示されたアプローチは、分配マニホールド５００を通って、コネクタから特定の細胞保持チャンバへと細胞を移送することにおいて、例えば、図７のそれとは異なる。図１２に示されるように、コネクタチャネルは、「第２の分配チャネル」に接続される。混乱を避けるために、この第２の分配チャネルは、「ストップチャネル」４００として言及されるが、ストップチャネルの特徴は、上記の分配チャネルのものと同様である。ストップチャネルは、ストップバルブ４０１およびＣＨＣバルブ４０２を独立して制御可能であることを含む。図１３は、どのように、選択されたストップバルブおよび選択されたＣＨＣバルブを作動することにより、流れを特定の細胞保持チャンバに方向づけるのかを図示する（矢印）。図１２および１３では、細胞が特定のチャンバに向かって方向づけられるように、１つのストップバルブが閉じられているのを図示するために厚くされている。
９．流れ
流体および細胞は、当該技術分野で知られる種々の方法において、チャネルを通っておよびチャネルへと移送されることとしてもよい。概して、本発明における細胞の移送は、バルク流（つまり、細胞は、流動する流体の流れで運ばれる）により生じる。溶液の流れは、種々の方法により達成される、例示のために、溶液は、ポンピングにより（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４０８，８７８号に記載される蠕動式ポンプを用いて）、チャネルにおける陽圧差（例えば、細胞が、プランジャを抑制することによりシリンジから分配チャネルへと導入されることにより、圧力差を生成することしてもよい。）、または陰圧差（例えば、シリンジが、チャネルから流体を引き出すために使用され、チャネルを通る流れを生じさせることとしてもよい。）を生成することにより、重力駆動流により、またはあらゆる他の方法により導入されることとしてもよい。
代替的な実施態様では、細胞は、電気泳動的、電気運動的、または電気浸透性の方法を使用して移動される。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Glawdel and Ren, 2009, “Electro-osmotic flow control for living cell analysis in microfluidic PDMS chips” Mechanics Research Communications 36: 75-81,参照。）
１０．細胞保持チャンバおよび細胞培養
１０．１．細胞保持チャンバ
本発明のシステムは、これまで本明細書に記載したように、捕捉され、特徴づけられ、および移送される個々の細胞（または細胞単位）および細胞の組み合わせの培養のための細胞保持チャンバを有する。細胞保持チャンバの数は、広い範囲にわたって変化することとしてもよいが、典型的には、１０から５００、より多くの場合１００から５００、より多くの場合１５０から４００の範囲であり、多くの場合、約３００ミクロンある。細胞保持チャンバの数は、セグメントの数より少なく、同じであり、または多いこととしてもよい。概して、細胞保持チャンバの数はより少ない。
マイクロ流体細胞保持チャンバの最小限の特質は、２部分であり、チャンバは、少なくとも１つの細胞、好ましくは少なくとも２から１０の細胞を含むのに十分な大きさを有し、チャンバは、細胞生存性と適合性がある。生存性の要件は、細胞によって異なるが（例えば、ヒト腫瘍細胞は、ヒト肝細胞または藻類細胞と異なるであろう）、典型的には、チャンバは、適切な温度および湿度で保持されなければならず、栄養素が細胞に供給されなければならず、老廃物は生存に必要とされる範囲に除去されなければならない。チャンバは、典型的には、チャンバの中および外へ流体が流れるのを可能にするインレットおよびアウトレットを含む。細胞増殖をサポートする栄養素は、インレットまたはアウトレットチャネルから供給され得る。
例えば、壁、ルーフ、および／または基質のような、いくつかのまたは全ての培養チャンバの表面は、細胞培養の態様、とりわけ、具体的には、特異的もしくは非特異的な細胞付着性、細胞生存、細胞増殖、および／または細胞分化（またはその欠如）を促進するために処理されまたは変更されることとしてもよい。細胞保持チャンバの表面または底は、組織の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を擬する、細胞増殖を支持する表面を含むように変更されることとしてもよい。典型的なＥＣＭの例は、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸を含むが、これらに制限されない。
細胞培養メカニズムは、あらゆる適切な環境制御メカニズムを用いて、あらゆる適切な環境条件下での培養細胞であることとしてもよい。適切な環境条件は、所望のガス成分、温度、培地交換の割合および頻度、および／または等を含むこととしてもよい。環境制御メカニズムは、マイクロ流体システムに対し、内部または外部を操作することとしてもよい。内部メカニズムは、オンボードヒーター、ガス導管、および／もしくは培地リザーバを含むこととしてもよい。外部メカニズムは、気圧および／もしくは温度が制御されたインキュベーター／熱源、並びに／またはシステムに対する外部の培地源を含むこととしてもよい。気圧が制御されたインキュベータは、システムが、少なくとも部分的に、ＰＤＭＳのようなガス透過性材料から形成されている場合により適することとしてもよい。
培養チャンバは、上記の要件と一貫性のあるあらゆる形状または成分を有することとしてもよい。
１０．２．代表的な細胞保持チャンバ
図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、本発明の細胞保持チャンバについての代表的な配置を示す。細胞を含む流体がインプットチャネルを通って流れ、１つまたはそれよりも多くのドレインチャネルが、流体は流れ出ることができるが、細胞は流れ出ることができないように選択的に操作するアウトレットとして作用するようにチャンバは構成される。本明細書に示される保持チャンバは、共通のアウトプットに接続される、保持チャンバの１８０度より大きく囲んで配置される複数のドレインチャネルを有する、実質的にラウンドまたは円の形状である。
いくつかの実施態様では、本発明の保持チャンバは、直径で５０ミクロンから２ｍｍ、または直径で１００から５００ミクロンの間であることとしてもよい。寸法は、各チャンバにおいて操作者が処理することを望む細胞のサイズおよび数に応じて選択される。生細胞の培養または維持のために、保持チャンバは、流体におけるガスの分圧が、適切に保持されおよび調節されるように、ガス透過膜（典型的には、チャンバの上または下）を有する。保持チャンバは、フィブロネクチンおよび／またはコラーゲンのようなタンパク質、または細胞株から産生されたタンパク質混合物の、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）のような、細胞接着を促進する表面で提供されることとしてもよい。
図６Ｂは、インプットおよびドレインチャネルの適切な配置を示す（直径で３００ミクロンである保持チャンバを示す）。図６Ｃは、ドレインチャネルは、細胞が保持コンパートメントからドレインへと流れるのをさらに阻害するためにビーズ（つまり、「チャネルフィルター」）で満たされている配置を示す。
図６Ａは、マルチプレクサからのインプットチャネルが、集束チャンネルを形成するために保持チャンバに向かってテーパ状である配置を示す。本構成は、細胞がチャンバの中心に向かって流れるまたは移動しやすくなるように、保持チャンバへと送達される各細胞に焦点をあてる。チャンバの周囲についての複数のドレインチャネルの分配は、また、チャンバの中心または中心付近で細胞を保持するのを補助する。この構成は、排出が拡散し、細胞がドレインに向かって引かれないため、保持チャンバの中心でまたはその付近で細胞を維持する傾向がある。また、これらのチャンバに細胞を拘束するため性能は、インレット（Ａ）でおよび／またはアウトレット（ＡおよびＢ）でフローリストリクタを含む要素の組み合わせにより可能である。多孔性から液体の材料の使用に加えて、アウトレットドレインでは、細胞が、チャンバ（Ｃ）に存在するのを防止するために採用され得る。流体の量を制御するための性能、量、圧力、およびシア（sheer）が細胞生存を可能にするための重要な検討事項となる。チャンバの中心に細胞が向かうのを促すための第３の手段は、細胞が培養される際のチャンバの下部における凹形状または支持表面である。チャンバの中心またはその付近に細胞を配置することは、細胞が相互に作用するのを補助する。
細胞培養培地は、細胞によりとられる同じ経路を通ってまたは他のチャネルを通って細胞保持チャンバに導入されることとしてもよい。例えば、図６を参照すると、培地は、メインインプットを介して導入されることとしてもよい。代替的には、培地および他の溶液は、例えば、インプットチャネルと結合するブランチチャネルを介して、他のルートにより導入されることとしてもよい。
ドレインチャネルは、好ましくは、細胞保持チャンバ１００の底面（“フロア）で「壁」の低いところの開口であるが、それらはどこにでも配置され得ることが考慮される（例えば、チャンバの床に）。図６および図１１に示されるように、ドレイン１０１は、メインドレイン１０２に接続する。好ましくは、ドレインの長さは、短い（例えば、約７．５から約２５ミクロン）。幅は、例えば、約１０から約２５ミクロンの範囲であることとしてもよく、ドレインチャネルの高さは、好ましくは、低い（概して、約５ミクロン以下、場合によっては、約３ミクロンのような約４ミクロン以下。）。ドレインチャネルが接続するメインドレインに対し、低い流体抵抗を有するようにデザインされ、１０〜６０ミクロン×２０〜４０ミクロンの寸法を有することとしてもよい。ドレインチャネルのための１つのデザインが、図１１に示される。
１０．３．細胞保持チャンバ内への薬剤の導入
本発明のシステムは、代謝、タンパク質発現等での、細胞の相互作用（または共培養）の影響を研究するための有力な方法を提供する。培地および栄養素に加えて、場合によっては、薬剤と細胞もしくは細胞の組み合わせの反応を評価するために、および／または細胞活性等の分析のための試薬を提供するために、細胞保持チャンバに他の薬剤を添加することが有用である。例えば、制限されることなく、化学的モジュレータまたは生物学的モジュレータ、薬物、潜在的薬物（テスト薬剤）、病原体、タンパク質、抗体、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された核酸、センス／アンチセンス発現ベクター、レポーター遺伝子、ゲノムの統合／修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドについてのベクター、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）のような、種々の薬剤が使用されることとしてもよいことが理解されるであろう。試薬を検出／分析するための試薬は、例示のためであって、制限ではなく、染料、酵素、基質、コファクター、リガンド、抗リガンド、トランスフェクション試薬（例えば、液体試薬、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール、核酸を包むウイルスコート、および／または等を含む。
１０．４．環境制御
細胞保持チャンバの環境は、適切な温度、湿度、ｐＨ、およびガス成分を含む、培養される細胞タイプの生存性のために適している。
１０．５．細胞培養
細胞を培養するためのマイクロ流体技術は、他でも記載されている。Gomez-
Sjoberg et al., 2007, “Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system” Anal Chem. 79:8557-63; Zhong et al., 2008, “A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells,” Lab Chip. 8:68-74; Glotzbach et al., 2011, “An information theoretic, microfluidic-based single cell analysis permits identification of subpopulations among putatively homogeneous stem cells,” PLoS One 6:e21211; Sanchez-Freire et al., 2012,“Microfluidic single-cell real-time PCR for comparative analysis of gene expression patterns,” Nat Protoc. 7:829-38; 米国特許第７，３７８，２８０号“Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening;”米国特許出願公開第２０１０／０２５５４７１号“Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets.”参照。上記刊行物は、ここで、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
１１．ラウンド
個々の細胞（または細胞単位）および細胞の組み合わせの分析のための本発明の実施は、通常、第１のマイクロ流体チャネルの長さ内に複数の個々の細胞（または細胞単位）を含む溶液を流すことと、その長さを複数の隣接するセグメントに分配することにより、少なくとも１つのセグメントに少なくとも１つの細胞を捕捉することと、１つまたはそれよりも多くの単一の捕捉細胞の少なくとも１つの特徴を測定することと、捕捉細胞を細胞保持チャンバに独立して移送することと、の複数のラウンドを伴うことが考慮される。捕捉のラウンドの数は広い範囲にわたって変化し、関心細胞が細胞の群において希少であるかどうかという部分に依存するであろう。概して、ラウンドの数は、２から１０００の範囲である。代表的な実施態様において、方法は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９ラウンドを含む。代表的な実施態様では、方法は、２から１０ラウンド、３から１０ラウンド、４から１０ラウンド、または５から１０ラウンドを含む。一実施態様では、方法は、５０以上、１００以上、または２００以上のラウンドの捕捉および選択を含む。
１２．細胞の破棄
ラウンド間で、細胞保持チャンバへと選択された細胞を移送した後に分配チャネルに残る非選択細胞が取り除かれ得る。１つのアプローチは、分配チャネルから、例えば、廃棄物リザーバへと、非選択細胞を含む溶液を置換する、培地またはバッファによりチャネルを「パージする」ことである。代替的には、非選択細胞は、複数の個々の細胞（または細胞単位）を含む溶液を分配チャネルへ流す作用により置換され得る。
１３．細胞の相互作用
測定される特性により、捕捉細胞は、独立して特定の細胞保持チャンバに移送される。「独立して移送される」とは、各個々の捕捉細胞が、実施者の必要性に従って特定のデスティネーションチャンバに移され得ることを意味する。細胞は、よって、各デスティネーションチャンバにおける各細胞のまたは細胞の組み合わせの特徴を知ることができるように移送され得る。典型的には（しかし随意に）細胞は、細胞保持チャンバで培養される。既知の特性（例えば、既知の細胞タイプ）を有する個々の細胞（または細胞単位）、および／またはそれらの後代間の相互作用の影響を研究することができる。
表１および２は、４セグメント（１〜４）、５つの細胞保持チャンバ（１〜５）、および２つの細胞タイプ（ＡおよびＢ）を有する装置をイメージすることによりこのことを示す。この仮説において、細胞捕捉の６ラウンド後に、表１に要約するように、測定および移送が行われ、細胞が、表２に示されるように、細胞保持チャンバ１〜５に分布された。
表２に示されるように、培養の２日後に、遺伝子発現パターン（例えば、k-rasの発現）が、細胞保持チャンバのそれぞれにおける細胞について測定され得る。表２に示される仮説の結果では、細胞タイプＡと細胞タイプＢの相互作用の影響が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を増加させる（細胞タイプの１つまたは両方により）。
分配チャネル（または分配チャネルのペア）に関連する細胞保持チャンバの数は変化し得るが、典型的には、１〜１５０、より多くの場合１０〜１００、および多くの場合３５〜７５の範囲である。
細胞保持チャンバの他の特性、およびそれらにおける細胞培養は、以下に述べられる。
１４．収穫
細胞は、所望の期間（例えば、１時間から４週間）の間、細胞保持チャンバで培養されることとしてもよい。典型的には、短い期間の培養が使用される（例えば、１時間から２４時間）。培養細胞が観察される間、随意に、細胞は、操作されまたはチャレンジされることとしてもよい。例えば、細胞は、分化転換に影響を与えるために、マイクロＲＮＡと接触されることとしてもよい。いくつかの実施態様では、捕捉されたまたは培養における細胞は、比色（colormetric）または蛍光分子のような、細胞外または細胞内で検出可能なシグナルの変化をもたらす成分により分析され得る。培養期間の最後に、細胞は、破棄され、生細胞として回収され、もしくは溶解され、またはそうでなければ、分析のために生存不能に作成されることとしてもよい。
１４．１．生細胞としての細胞の回収
生細胞は、多くの方法で、細胞保持チャンバから回収されることとしてもよい。１つのアプローチにおいては、細胞は、基質から酵素的に切り離され、必要であれば、その後、収集のために細胞保持チャンバの外へ流される。流路は、主要には、細胞が細胞保持チャンバに移送される路の逆であり得る。代替的には、補助出口チャネルが使用され得る。
他のアプローチでは、システムは、内容物が取り除かれることを可能にする、細胞保持チャンバをさらすために容易に分解するように構成される（例えば、マイクロピペットを用いて）。１つのアプローチでは、細胞がマイクロ流体システムの外に付着される基質を動かすことにより、接着細胞が取り除かれ得る。
１４．２．細胞成分の分析
いくつかの実施態様では、培養期間後に、細胞保持チャンバにおける細胞は、核酸、タンパク質等のような細胞成分を放出するように処理される（例えば、溶解される）。図６を参照すると、溶解溶液は、メインインプットにより、または代替的には、補助のチャネル（図示せず）により導入され得る。細胞成分は、その後、収集および分析のための「メインドレイン」へと運ばれ得る。本開示により導かれた当業者は、異なるデザインの細胞保持チャンバが使用される場合に、類似の構造をデザインすることができるであろう。
いくつかの実施態様では、細胞成分分析は、複数のチャンバにおいて、反応の構成が、細胞保持チャンバに流体的に接続されるようなマイクロ流体システムで行われる。分析は、核酸分析（例えば、増幅、細胞由来のＲＮＡまたはＤＮＡのシーケンシングまたはクローニング）、タンパク質分析、細胞固定、および細胞または細胞の組み合わせを特徴づけるためのあらゆる他の方法を含む。例示であって、制限ではないが、図８は、様々な実施態様に従って、複数のチャンバ反応構成２２０−ｃの例を示す。複数のチャンバ反応構成２２０−ｃは、様々な実施態様に従って、異なる成分または態様を含むこととしてもよい。複数のチャンバ反応構成２２０−ｃは、ＳＴＡ、ＲＴ−ＳＴＡ、ｍＲＮＡ−ＳＥＱ、前増幅、ＷＭＡ、多モードアプリケーション、タンパク質アプリケーション、サンプルプロセッサアプリケーション、ＷＴＡ、ＷＧＡ、リアルタイムＰＣＲアプリケーション、ＣＮＶ、および／またはハプロタイプを含むがこれらに制限されない異なるプロセスを実施するように構成されることとしてもよい。複数のチャンバ反応構成２２０−ｃは、アクティブな混合を含む、複数の反応ステップを実施するように構成されることとしてもよい。
複数のチャンバ反応構成２２０−ｃを通る溶液の流れを制御するために利用される、多数のバルブ５２０を複数のチャンバ反応構成２２０−ｃが含むこととしてもよい。いくつかの実施態様では、蠕動式ポンプのようなポンプ５３０は、複数のチャンバ反応構成２２０−ｃにより溶液の移送を促進するための複数のチャンバ反応構成２２０−ｃに含まれることとしてもよい。ポンプ５３０は、複数のバルブ５２０を含み、この例では、ポンプ５３０は、３つのバルブを含むこととしてもよい。１つまたはそれよりも多くのポンプ５３０は、異なる位置に配置されることとしてもよい。
複数のチャンバ反応構成２２０−ｃは、また、複数の反応チャンバ５１０を含むこととしてもよい。いくつかの実施態様では、捕捉構成２１０−ｃは、１つの反応チャンバ５１０を考慮することとしてもよい。単なる例示により、バルブ５２０−ｄ、５２０−ｅ、５２０−ｆ、および５２０−ｇは、それぞれの反応チャンバ５１０−ａ、５１０−ｂ、５１０−ｉ、および５１０−ｊ間の直接的な流れを制御するために利用されることとしてもよい。バルブ５２０−ｈ〜５２０−ｏのような追加のバルブが、異なる組み合わせで、１つまたはそれよりも多くの反応チャンバ５１０から、試薬、混合、および／または循環溶液を導入するために利用されることとしてもよい。追加のバルブ５２０−ａおよび／または５２０−ｂが、異なる捕捉構成間で流れを制御することとしてもよい。バルブ５２０−ｂは、捕捉構成２１０−ｃに、試薬のような溶液の流れを制御するために利用されることとしてもよい。複数のチャンバ反応構成２２０−ｃは、熱サイクル中に溶液を混合および／または循環するように構成されることとしてもよい。反応産生物は、いくつかの場合において、収穫構成、収穫ウェル、および／または収穫インレットとして言及され得る、エクスポート構成（図示せず）に５４０を送達することとしてもよい。
複数のチャンバ反応構成は、フレキシブルであり、核酸を単離および増幅し、タンパク質を単離し、ｃＤＮＡを作成するために、並びに幅広い種類の他の分子生物学的プロセスおよび分析ステップのために使用され得る。システムは、また、様々な公開されたまたは市場で入手可能なシステムを含むが、これらに制限されない、追加の流体循環路を含むこととしてもよい。例えば、Fluidigm BioMark(商標)HDシステムは、遺伝子発現、シングルセル遺伝子発現、シングルセルｍＲＮＡシーケンシング、ＳＮＰジェノタイピング、コピー数多型、シーケンシングのためのサンプル定量のために使用され得る。FluidigmのqdPCR 37K(商標)IFCチップが、デジタルＰＣＲのために使用されることとしてもよい。これらのおよび他の分析システムは、他の利点のうちとりわけ、より一層のオートメーションおよびより短いプロセシング時間を可能にする、本発明のシステムに組み込まれ得る（つまり、マイクロ流体チャネルにより流体的に接続される）。全ての目的のためにそれらのそれぞれが参照により明示的に組み込まれる、米国特許第７，６０４，９６５号; 米国特許出願公開第２０１２−０１１５１４３号(“Universal Probe Assay Methods”)、米国特許出願公開第２０１２−０２８８８５７号(“Multifunctional Probe-Primers”)、および米国特許出願公開第２０１３−００４５８８１号(“Probe Based Nucleic Acid Detection”);同時係属中で共同所有の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５３７６号(“Nucleic Acid Detection Using Probes”)、および同時係属中で共同所有の仮出願６１／７９９，５５９（“Simultaneous Detection Of Target Protein And Target Nucleic Acids In A Single Cell”)参照。
１５．イメージング
好ましい実施態様では、システムは、１つまたはそれよりも多くの細胞およびマイクロ流体装置の位置を結像するために統合された撮影モジュールを含む。画像を収集および処理するための方法および機器が、当該技術分野で知られる。結像モジュールは、マイクロ流体装置において１つまたはそれよりも多くの捕捉細胞を結像するように構成される、少なくとも顕微鏡またはカメラを備えることとしてもよい。いくつかの実施態様では、撮影モジュールはＣＣＤカメラを含む。
結像モジュールは、分配チャネル、細胞保持チャンバ、分配チャネルセクター、保持チャンバセクター、培養後プロセシングセクター、および分析（増幅）セクターを含む、一体型流体循環路の１つ、１つより多く、または全てのエリアを結像するように構成されることとしてもよい。
いくつかの実施態様では（例えば、検出可能に標識された細胞を結像すること）、例えば、蛍光タグで標識された細胞を検出する際に、または、例えばであって制限ではないが、蛍光シグナルが生成される増幅反応の分析のために、適切な波長で細胞および／または反応を照射することが必要である。フィルターホイールおよび他の光学素子のような要素は、当業者に知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７９０６０７２号参照。
一実施態様では、実質的に全体のマイクロ流体循環路が結像され、随意に、ユーザに表示される。他の実施態様では、分配チャネルが結像され、マニホールドを結像することなく、細胞保持チャンバが結像される。いくつかの実施態様では、ソフトウェアによる画像分析が、細胞をモニターするために使用される。
結像モジュールは、プロセスを切り替えまたはスキャンすることなくマイクロ流体装置全体を結像するように構成されるＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラであることとしてもよい。一実施態様では、結像モジュールは、さらに、細胞が選択されて捕捉された後に、マイクロ流体装置でまたはその中で行われる反応から蛍光発光を結像するように構成される。結像される波長を選択するための構成は、フィルターホイールまたはフィルターキューブ構成に並べられた蛍光フィルターを含む。さらなる実施態様において、蛍光放射線のフィルタリングは、結像ソフトウェア内で、またはソフトウェアによるような、結像モジュール自体において実行される。細胞捕捉および細胞保持部位および反応部位を含む、結像されたエリアのサイズは、約３０．５×３０．５ｍｍ（９３０．２５ｍｍ２）またはそれ以上であることとしてもよい。別の実施態様では、結像されたエリアは、細胞捕捉および細胞保持部位を含んでおり、反応部位は、約９３０から約１２００ｍｍ２、または約１２００から１６００ｍｍ２、または約１６００から２０００ｍｍ２であろう。さらなる実施態様では、結像されたエリアは、約２０００から２６００ｍｍ２であろう。結像モジュールは、概して、結像されたエリアと同じまたはこれより大きい、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ結像表面のような結像表面を有するであろう。撮影モジュールの結像表面は、典型的には、１５，０００，０００から１００，０００，０００ピクセルまで、および場合によっては２００，０００，０００ピクセルまで、それぞれ約６から９ミクロンのサイズを有するであろう。いくつかの実施態様では、ピクセルは約９ミクロンのサイズである。ピクセルサイズの有用な範囲は、約３から６ミクロン、いくつかの実施態様では約５から７ミクロン、または約６から１０ミクロンのサイズである。別の実施態様では、ピクセルは、約６ミクロンのサイズである。結像領域は、さらに、約２００，０００，０００から約３００，０００，０００までのピクセルまたは約３００，０００，０００から４００，０００，０００までのピクセルを有することとしてもよい。別の実施態様では、結像領域は、約５００，０００，０００ピクセルから約７５０，０００，０００ピクセルを有するであろう。
追加の分析がシステムで発生する実施態様において（例えば、リアルタイムＰＣＲ分析）、結像モジュールが、細胞の特徴および移動を観察するために、並びにＰＣＲおよび他の反応産生物の検出ための両方に使用されることとしてもよいことが理解されるであろう。
１６．オートメーション
１６．１．コンピュータでの実行
本発明の方法は、部分的に自動化されることが考慮される。例えば、バルブ、制御ポンプ、流体の移動、および細胞のユーザのインプット作動に基づいて、結像がコンピュータにより実行され得る。システムが、使用される１つまたはそれよりも多くのコンピュ-タ処理装置モジュールおよび／または１つまたはそれよりも多くのメモリーモジュールを備えることが期待される。コンピュータの機能は、装置に統合され、またはそれから離れていることとしてもよい。
１６．２．ユーザインターフェイス
一態様では、本発明は、方法の自動化されたステップを容易に行うためにユーザインターフェイスを提供する。図９は、代表的なグラフィカルなユーザインターフェイスのバーチャルスクリーンショットを提供する。大まかに言えば、セグメント（画像またはセグメントのグラフィカルな表示）、セグメントにおける捕捉細胞（画像または細胞のグラフィカルな表示、随意に細胞の特徴の表示を含む）、および細胞保持チャンバ（画像または細胞保持チャンバのグラフィカルな表示）を示す、タッチスクリーン装置が提供される。画像は、ＣＣＤカメラを用いて産生されることとしてもよい。一実施態様では、タッチスクリーン装置は、細胞の画像およびセグメント、並びに細胞保持チャンバの表示を示す。一実施態様では、タッチスクリーン装置は、細胞の画像、並びにセグメントおよび細胞保持チャンバの表示を示す。用語「表示」は、画像およびグラフィカルな表示の両方を包含して使用される。
関心の、捕捉細胞、または同等に、捕捉細胞を含むセグメントを識別するユーザは、選択された細胞保持チャンバ（標的）に細胞を移送するためにシステムに指示する。種々のユーザのジェスチャーが使用され得る。例えば、ドラッグアンドドロップのジェスチャーを使用して、使用者は細胞またはセグメントの画像をタップし、または特定の細胞保持チャンバの表示へと指またはカーソルをドラッグする。随意に、セグメントから細胞保持チャンバへと移動する細胞の画像が、示される。他のジェスチャーが使用されることとしてもよい。例えば、ユーザが、第１の位置（セグメント）で、表示細胞（オブジェクト）でタップし、その後、宛先位置（細胞保持チャンバ）でタップすることとしてもよい。
従って、本発明は、メモリーに保存されたオブジェクトの表示が、ディスプレイ上でユーザに表示されるタイプの、コンピュータのためのグラフィカルなユーザインターフェイスにおけるオブジェクトを操作することにより細胞を移送するための方法を提供し、前記ディスプレイに表示がディスプレイされる第１の細胞を選択することと、ディスプレイ上で第１のセグメントの位置から第１の細胞保持チャンバへ第１の細胞の表示をドラッグすることと、複数の追加の細胞のそれぞれを個々に選択し、第１の細胞保持チャンバと同じまたは異なる、独立して選択された細胞保持チャンバにそれらのそれぞれを移送することとのステップを含む。さらに、本発明は、前記表示装置でのセグメントから、前記装置にディスプレイされる細胞保持チャンバ位置へ、前記ディスプレイ装置にディスプレイされた細胞の表示を選択して移動するための、ユーザ制御されたコンポーネントを含む、ディスプレイ装置を有するコンピュータのためのグラフィカルなユーザインターフェイスを提供する。
１７．装置
本発明の代表的なシステムは、図１０に示される。図１０Ａは、左側からのマイクロ流体チップ保持装置の上面の斜視図である。図１０Ｂは、右側からの装置の分解図を示す。保持装置は、試薬を供給し、適切な温度および湿度を保持し、流体の流れを制御するためにバルブを操作することにより、マイクロ流体装置を操作するように構成される。それは、前側にプラットフォーム、および後側に混合ボックスを備える（図１０Ａの左側および図１０Ｂの右側に示される）。
図１０Ｂを参照すると、装置のベースは、マイクロタイタープレートまたはチップを収受するための大きさにされかつ形作られたキャビティ、典型的には３５ｍｍ角を有するサンプルインプットウェルを有するＩＦＣキャリアである。上記キャリアは、空気圧式制御によりバルブを操作するチップでチャネルを制御するために接続されたガスケットを含むインターフェースプレートである。上記プレートは、チップを取り囲むプラットフォームで所望の温度を保持するために一体型ヒーターとして構成されたポリイミドの層であり、インプットガス混合物をその温度にするために、混合ボックスまで接続される。プラットフォーム上の上記ヒーターは、ガラスブラケットにより取り囲まれたガラス面である。ガラスは、チップから供給された湿潤気体からの凝縮を阻害するためにイリジウム・スズコートされる。ガラス表面は、チップにおける各細胞が、配置され、結像によりその形態に従って特徴づけられ得るように光学的に透明となるように構成される。図１０Ａを参照すると、混合ボックスは、培養において生存可能に細胞を維持するために適切なガス混合物または空気を収受し（典型的には、９５％Ｏ２、および５％ＣＯ２）、それはチップにおけるプラットフォームを通って混合ボックスからガス供給チャネルへと送り込まれる。ガス混合物は、チップの保持チャンバからガス供給チャネルを通る湿度のロスを防止するために、少なくとも６０％、８０％、または９０％の湿度で作られる。チップを通ったあとに、湿ったガス混合物は、チップ付近に形成されたあらゆる凝集をそれとともに、混合ボックスを通ってプラットフォームから湿り空気出口チューブの外に排出する。
１８．代表的なバルブ、検出可能な標識、細胞、マイクロ流体システム
１８．１：バルブ
様々なタイプのバルブが、マイクロメカニカルバルブ、エラストマーバルブ、ソリッドステートマイクロバルブ、およびその他を含み、当該技術分野で知られる。例えば、Felton, 2003, The New Generation of Microvalves" Analytical Chemistry 429-432参照。ポンプおよびバルブのような微小電子機械（ＭＥＭＳ）構造の製造のための２つの共通するアプローチは、（サブトラクティブな製造方法であって、これにより単一の結晶シリコンがリソグラフィによってによりパターン化されて、その後、三次元構造を形成するためにエッチングされた）シリコン系バルクマイクロマシニング、および（ポリシリコン、シリコン窒化物、二酸化ケイ素、および種々の材料のような、半導体タイプの材料の層が、順次添加され、三次元構造を作成するためにパターン化される、追加的な方法である）表面マイクロマシニングである。
一実施態様では、バルブは、一体式バルブである。好ましい実施態様では、バルブは、圧力で作動される「エラストマーバルブ」である。圧力で作動されるエラストマーバルブは、２つのマイクロチャネルが、他のチャネル（例えば、制御チャネル）に適用される作動力に対応して、チャネル（例えば、フローチャネル）の１つへと偏向されまたはチャネルの１つからリトラクト（retract）され得るエラストマーのセグメントにより分離される構成からなる。エラストマーバルブの例は、上方へと偏向されるバルブ（例えば、米国特許出願公開第２００５００７２９４６号参照）、下方へと偏向されるバルブ（例えば、米国特許第６，４０８，８７８号参照）、サイドに作動されるバルブ（例えば、米国特許出願公開第２００２０１２７７３６号の例えば段落０２１５〜０２１９）、通常は閉じられているバルブ（例えば、米国特許第６，４０８，８７８号、および米国特許第６，８９９，１３７号）等を含む。エラストマー成分を有する耐薬品性マイクロ流体バルブは、Hua et al., 2006, J Micromech Microeng 16:1433- 1443により記載されている。いくつかの実施態様では、装置は、バルブの組み合わせを有し得る（例えば、上方および下方に偏向されたバルブ）。バルブは、ガス（例えば、空気、窒素、およびアルゴン）、液体（例えば、水、シリコンオイル、および他のオイル）、塩を含む溶液、および／またはポリマー（ポリエチレングリコール、グリセロールおよび炭水化物を含むがこれらに制限されない）等を制御チャネルに注入することにより作動され得る。いくつかのバルブは、制御チャネルを真空にすることにより作動され得る。
圧力に基づく作動システムにより作動されるエラストマーバルブに加えて、エラストマーのコンポーネント、および静電的、磁気的、電解的、および電気運動的作動システムを有する一体式バルブが使用されることとしてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００２０１０９１１４号、米国特許出願公開第２００２０１２７７３６号、例えば、０１６８−０１７６、および米国特許第６，７６７，７０６号を参照。ワンウェイバルブも記載されている（例えば、Adams et al., 2005, J. Micromech. Microeng参照）。
他のマイクロバルブは、電磁気的作動（電磁ソレノイドのプランジャ）、圧電効果（ディスク、カンチレバーおよびスタック（cantilever and stack）タイプ）、空気圧式およびサーモ空気圧式システム、静電的アクチュエータ、並びにバイメタルのビームによるマイクロバルブ（Shoji et al. 1994, J. Micromech. Microeng. 4(4): 157-171, Dec. 1994参照）、ｐＨの変化に対応して膨張または収縮する（およびこれにより閉じるまたは開く）、ハイドロゲルに基づくバルブ（Beebe et al. Nature 404(6778): 588-90, 6 Apr. 2000）、電気化学的に生成されたバブルを含むマイクロ流体バルブ（Hua et al. Anal Chem. 74(24): 6392-6, 15 Dec. 2002）、ＵＶ光により作動されるポリマーモノリスに基づくバルブ（Hasselbrink et al. Anal Chem. 74(19): 4913-8, 1 Oct. 2002）、静電気により（米国特許第５，４１７，２３５号および第５，４５２，８７８号）または材料の熱座屈により（米国特許第５，７８５，２９５号）制御されるマイクロバルブを含む。
１８．３：検出可能な標識
細胞をモニタリングし、評価し、結像し、および他の光学手段によりプロセシングするために、適切な検出可能な標識が、例えば、制限されることなく、有色化、蛍光、発光、またはリン光であることとしてもよい。細胞表面に接合されもしくは結合され、または細胞内に組み込まれることとしてもよい。いくつかの実施態様では、抗体、レクチン、リガンド、基質、または反応産生物を構成し、またはこれらに接合される。また、個々の細胞（または細胞単位）は、装置で処理される他の細胞からそれらを区別する、形態学的特徴に従って追跡されまたはモニタリングされることとしてもよい。
１８．４：細胞
本発明のマイクロ流体装置は、典型的には、２倍体および有核の両方である真核細胞の通過を許容するようなサイズにされおよび形にされたチャネルおよびチャンバを有する。本発明の実施の際にあらゆる制限を暗示することなく、このような細胞は、脊椎動物、哺乳類、飼い慣らされた動物、マウス、霊長類、またはヒト由来であることとしてもよい。それは、アストロサイト、ニューロン、シュワン細胞、上皮細胞、内皮細胞、脂肪細胞、腎細胞、外分泌細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、オドントサイト（odontocyte）、膵島細胞、心細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、腎細胞、肝細胞、クッパー細胞（Kuppfer cell）、下垂体細胞、粘液細胞、ホルモン分泌細胞、ケラチノサイト、基底細胞、pneumal細胞、周皮細胞、または髄細胞であることとしてもよい。それは、赤血球、細網赤血球、巨核細胞、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、好酸球、好中球、好塩基球、マスト細胞、リンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞のような血液に関連する細胞であることとしてもよい。それは、様々な種類の癌もしくは癌幹細胞、白血病もしくはリンパ腫細胞、またはハイブリドーマであることとしてもよい。それは、多分化能もしくは組織特異的な幹細胞、前駆細胞、卵母細胞、または生殖細胞であることとしてもよい。代替的には、それは、実質細胞、厚角組織（collenchymal）細胞、厚壁組織（Sclerenchymal）細胞、厚膜（sclerid）細胞、分裂組織的細胞、木部細胞、または表皮細胞のような植物細胞であることとしてもよい。代替的には、それは、原生生物のような単細胞生物または酵母のような真菌類であることとしてもよい。処理されまたは培養された細胞は、ともに同じタイプまたはあらゆる組み合わせにおける複数の異なるタイプであることとしてもよい。
一倍体細胞、バクテリアのような原核生物、血小板のような無核細胞、および非生存粒子、並びに他のエンティティのプロセシングも考慮される。いくつかの実施態様では、マイクロ流体装置およびそのチャネルは、このような細胞および粒子を個々に処理するようにおよび通過を可能にするように調整されかつ構成される。他の実施態様では、マイクロ流体装置およびそのチャネルは、バルクにおけるそのような細胞および粒子を処理するように調整されかつ構成される。
いくつかの実施態様では、細胞は、配偶子ではなく、卵子ではなく、精子ではない。
いくつかの実施態様では、細胞保持チャンバで培養された細胞の組み合わせは、配偶子を含まない。
いくつかの実施態様では、細胞保持チャンバで培養された細胞の組み合わせは、卵細胞および精子の両方を含まない。
１８．５：マイクロ流体システム
本発明の装置は、チャネルからの様々な材料または材料の組み合わせから構成され得、バルブおよび他のマイクロ流体コンポーネントが製造され得る。チップが作成され得る材料は、制限されることなく、エラストマー、シリコン、ガラス、金属、ポリマー、セラミック、無機材料、および／またはこれらの材料の組み合わせを含む。
マイクロ流体装置の製造で使用される方法は、使用される材料により変化し、ソフトリソグラフィ法、マイクロアセンブリ、バルクミクロ機械加工方法、表面マイクロ機械加工方法、標準的なリソグラフィ法、ウェットエッチング、反応イオンエッチング、プラズマエッチング、ステレオリソグラフィーおよびレーザー化学的三次元ライティング法、モジュールアッセンブリ法、レプリカ成形法、射出成型法、熱成形法、レーザーアブレーション法、複数の方法の組み合わせ、並びに当該技術分野で知られるまたは将来的に開発される他の方法を含む。種々の代表的な製造方法は、Fiorini and Chiu, 2005, "Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application" Biotechniques 38:429-46; Beebe et al., 2000, "Microfluidic tectonics: a comprehensive construction platform for microfluidic systems." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13488-13493; Rossier et al., 2002, "Plasma etched polymer microelectrochemical systems" Lab Chip 2:145-150; Becker et al., 2002, "Polymer microfluidic devices" Talanta 56:267-287; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21:12-26;米国特許第6,767,706号、例えば、セクション6.8 "Microfabrication of a Silicon Device"; Terry et al., 1979, A Gas Chromatography Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer, IEEE Trans. on Electron Devices, v. ED-26, pp. 1880-1886; Berg et al., 1994, Micro Total Analysis Systems, New York, Kluwer; Webster et al., 1996, Monolithic Capillary Gel Electrophoresis Stage with On-Chip Detector in International Conference On Micro Electromechanical Systems, MEMS 96, pp. 491496;およびMastrangelo et al., 1989, Vacuum-Sealed Silicon Micromachined Incandescent Light Source, in Intl. Electron Devices Meeting,IDEM 89, pp. 503-506に記載される。
いくつかの実施態様では、装置は、エラストマーの材料を用いて製造される。エラストマー材料を用いる製造方法は、エラストマー材料、このような材料を用いて作成される装置の製造方法、および装置およびこれらのコンポーネントのデザインのための方法が詳細に記載されているため、本明細書では簡潔に記載されるのみとする（例えば、Unger et al., 2000, Science 288:113-16;米国特許第６，９６０，４３７号（マイクロ流体装置を利用する核酸増幅）；第６，８９９，１３７号（微細加工エラストマーのバルブおよびポンプシステム）；第６，７６７，７０６号（一体型活性フラックスマイクロ流体装置および方法）；第６，７５２，９２２号（マイクロ流体クロマトグラフィ）；第６，４０８，８７８号（微細加工エラストマーバルブおよびポンプシステム）；第６，６４５，４３２号（３次元配列チャネルネットワークを含む、マイクロ流体システム）；米国特許出願公開第２００４／０１１５８３８号；第２００５００７２９４６号；第２００５００００９００号；第２００２０１２７７３６号；第２００２０１０９１１４号；第２００４０１１５８３８号；第２００３０１３８８２９号；第２００２０１６４８１６号；第２００２０１２７７３６号；および第２００２０１０９１１４号；国際出願公開第２００５／０８４１９１号；第０５０３０８２２Ａ２号；および第０１／０１０２５号；Quake and Scherer, 2000, "From micro to nanofabrication with soft materials" Science 290: 1536-40; Xia et al., 1998, "Soft lithography" Angewandte Chemie47 International Edition 37:551-575; Unger et al., 2000, "Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography" Science 288:113-116; Thorsen et al., 2002, "Microfluidic large-scale integration" Science 298:580-584; Chou et al., 2000, "Microfabricated Rotary Pump" Biomedical Microdevices 3:323-330; Liu et al., 2003, "Solving the "world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix" Analytical Chemistry 75, 4718-23," Hong et al, 2004, "A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture" Nature Biotechnology 22:435- 39; Fiorini and Chiu, 2005, "Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application" Biotechniques 38:429-46; Beebe et al., 2000, "Microfluidic tectonics: a comprehensive construction platform for microfluidic systems." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13488-13493; Rolland et al., 2004, "Solvent-resistant photocurable "liquid Teflon" for microfluidic device fabrication" J. Amer. Chem. Soc. 126:2322-2323; Rossier et al., 2002, "Plasma etched polymer microelectrochemical systems" Lab Chip 2:145-150; Becker et al., 2002, "Polymer microfluidic devices" Talanta 56:267-287; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21:12-26; Terry et al., 1979, A Gas Chromatography Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer, IEEE Trans. on Electron Devices, v. ED-26, pp. 1880-1886; Berg et al., 1994, Micro Total Analysis Systems, New York, Kluwer; Webster et al., 1996, Monolithic Capillary Gel Electrophoresis Stage with On-Chip Detector in International Conference On Micro Electromechanical Systems, MEMS 96, pp. 491496;およびMastrangelo et al., 1989, Vacuum-Sealed Silicon Micromachined IncandescentLight Source, in Intl. Electron Devices Meeting, IDEM 89, pp. 503-506、並びに本明細書で挙げられる、および学術文献および特許文献でみられる他の参考文献を参照。概して、本明細書に記載される異なるマイクロ流体装置は、ＰＤＭＳのようなエラストマー材料を用いる種々の製造方法を利用して作成されることとしてもよく、マイクロ流体装置およびそれらのコンポーネントの設計のための方法は、全ての目的のために参照により全てが組み込まれる、学術文献および特許文献に詳細に記載されている、（例えば、Unger et al., 2000, Science 288:113-16;米国特許第６，９６０，４３７号（マイクロ流体装置を利用する核酸増幅）；第６，８９９，１３７号（微細加工エラストマーのバルブおよびポンプシステム）；第６，７６７，７０６号（一体型活性フラックスマイクロ流体装置および方法）；第６，７５２，９２２号（マイクロ流体クロマトグラフィ）；第６，４０８，８７８号（微細加工エラストマーバルブおよびポンプシステム）；第６，６４５，４３２号（３次元配列チャネルネットワークを含む、マイクロ流体システム）；米国特許出願公開第２００４／０１１５８３８号；第２００５／００７２９４６号；第２００５／００００９００号；第２００２／０１２７７３６号；第２００２／０１０９１１４号；第２００４／０１１５８３８号；第２００３／０１３８８２９号；第２００２／０１６４８１６号；第２００２／０１２７７３６号；および第２００２／０１０９１１４号；国際出願公開第２００５／０８４１９１号；第０５／０３０８２２Ａ２号；および第０１／０１０２５号；Quake and Scherer, 2000, "From micro to nanofabrication with soft materials" Science 290: 1536-40; Unger et al., 2000, "Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography" Science 288:113-116; Thorsen et al., 2002, "Microfluidic large-scale integration" Science 298:580-584; Chou et al., 2000, "Microfabricated Rotary Pump" Biomedical Microdevices 3:323-330; Liu et al., 2003, "Solving the "world-to-chip" interface problem with a microfluidic matrix" Analytical Chemistry 75, 4718-23," Hong et al, 2004, "A nanoliter-scale nucleic acid processor with parallel architecture" Nature Biotechnology 22:435- 39参照。
マイクロ流体チャネルのある一定の特徴は、それらの機能とともに変化するであろう。例えば、細胞が移送されるチャネルは、研究される細胞のタイプのために適切な寸法を有するであろう。溶液（例えば、細胞培地）が移送されるチャネルは、典型的には、より小さな寸法を有する。バルブを作動させるある一定のエラストマーのマイクロ流体装置で使用される制御チャネルは、変化する寸法を有することとしてもよい。よって、チャネルの寸法は、広く変化し得るが、典型的には、２ｍｍ以下、概して１ｍｍ以下、場合によっては０．５ｍｍ以下、および場合によっては０．３ｍｍ以下の少なくとも１つの断面の寸法（例えば、高さ、幅、または直径）を含む。チャネルは、しばしば、０．０５から１０００ミクロン、場合によっては０．２から５００ミクロン、および場合によっては１０から２５０ミクロンの範囲で少なくとも１つの断面の寸法を有する。チャネルは、例えば、スクェアのチャネル、円のチャネル、ラウンド状のチャネル、矩形のチャネル等のような、流体および／または細胞移送を可能にするあらゆる適切な断面の形状を有することとしてもよい。代表的な態様では、フローチャネルは矩形であり、約０．０５から１０００ミクロン、場合によっては０．２から５００ミクロン、および場合によっては１０から２５０ミクロンの範囲の幅を有する。代表的な態様では、チャネルは、０．０１から１０００ミクロン、場合によっては０．０５から５００ミクロン、場合によっては０．２から２５０ミクロン、および場合によっては１から１００ミクロンの深さを有する。代表的な態様では、フローチャネルは、約０．１：１から１００：１、より好ましくは１：１から５０：１、より好ましくは２：１から２０：１、および最も好ましくは３：１から１５：１、並びにしばしば約１０：１の範囲の幅対深さの比率を有する。
本発明のマイクロ流体装置は、他の装置コンポーネント（例えば、カラムまたはリアクタ）または装置自体の中におよび外へ、フローチャネルを通る流体の移送のための１つまたはそれよりも多くの一体的なポンプを含むこととしてもよい。適切なポンプは、電気的、静電的、磁気的、機械的、シリンジ、空気圧式、または蠕動であり得る。好ましくは、米国特許第６，４０８，８７８号に記載されるもののような蠕動式ポンプが使用される。代替的には、ポンプはチップに対して外部にあり得る。また、ポンプは、バルブを作動させるための制御チャネルにより流体（例えば、水）を移送するために使用される。また、ポンプは、例えば、ベントチャネルで真空に引くために使用される。
また、他のマイクロ流体コンポーネントは、例えば、制御チャネル、ガードチャネル、ベントチャネル、流体リザーバ、混合リアクタ、ロータリーミキサ、分離モジュール（例えば、分離カラム）、ソーティング領域、ポンプ、ポート、バイアス、ノズル、モニタリングシステム、レンズ、センサー、温度制御システム、熱源、光源、導波管等を含む、チップ内に一体型であり得る。
本明細書に記載される実施例および実施態様は説明的な目的のみのものであって、これに照らして様々な修飾または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および権限並びに添付の請求の範囲の領域内に含まれることが理解される。さらに、本明細書に挙げられる全ての他の刊行物、特許、特許出願が、全ての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (124)

  1. 細胞分析のための方法であって、少なくとも２ラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送を行うことが含まれ、各ラウンドは、
    ａ）複数の個々の細胞および／または細胞単位が含まれる溶液を、第１のマイクロ流体チャネルに流すこと、
    ｂ）前記チャネルを複数の隣接するセグメント（Ｓ）に分配することであり、それによって、少なくとも１つの前記セグメントにおいて、少なくとも１つの前記細胞を捕捉することであり、そこでは、
    ｉ）１またはそれよりも多くの前記セグメントは単一の捕捉細胞および／または単一の捕捉細胞単位を含み、および
    ｃ）１またはそれよりも多くの前記単一の捕捉細胞および／または細胞単位の少なくとも１つの特徴を測定すること、および
    ｄ）各前記捕捉細胞または単位を測定された前記特徴に基づいて、特定の細胞保持チャンバに独立して移送することであり、それによって、各特定のデスティネーションチャンバについて、そこに移送された前記細胞（複数の細胞）の前記特徴（複数の特徴）が分かること、
    を含む、方法。
  2. 少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ラウンドの細胞捕捉、特徴付け、および移送が行われる、請求項１の方法。
  3. ステップｂ）において、少なくとも３０％の前記セグメントは１を超えない前記細胞しか含まない、請求項１の方法。
  4. 大部分の前記セグメントが１以下の前記細胞を含む、請求項３の方法。
  5. １つまたはそれよりも多くの前記セグメントは何らの前記細胞も含まない、請求項１の方法。
  6. 分配される前記第１のマイクロ流体チャネルの一部分に流される個々の細胞または細胞単位の数は、前記分配の結果として産生される前記セグメントの数よりも少ない、請求項１の方法。
  7. 方法は、２つまたはそれよりも多くの分配チャネルを含む装置において行われ、前記細胞は、任意の分配チャネルの任意の前記セグメントから任意の前記細胞保持チャンバへと移送される、請求項１の方法。
  8. ２つの分配チャネルがある、請求項７の方法。
  9. 前記第１のマイクロ流体チャネルの内腔は実質フィーチャーレスである、請求項１の方法。
  10. 測定された前記特徴は、前記細胞のサイズ、形態、または細胞外抗原の、または細胞内抗原の存在もしくは不存在である、請求項１から９のいずれかの方法。
  11. 測定された前記特徴は、細胞挙動である、請求項１から９のいずれかの方法。
  12. 測定された前記特徴は、物理的、化学的、または生物学的チャレンジに対する前記細胞による反応である、請求項１から９のいずれかの方法。
  13. 前記細胞は、バルク流体流により移送される、請求項１の方法。
  14. コンパウンドマニホールドシステムは、任意の前記セグメントから任意の前記細胞保持チャンバへと前記細胞を移送するために使用される、請求項１３の方法。
  15. 前記セグメントから前記細胞保持チャンバに移送された前記各細胞は、同じコネクタチャネルにより移送される（例えば、流れる）、請求項１の方法。
  16. 前記セグメントのそれぞれは、共通の第２のマイクロ流体チャネルと流体的に接続し、前記捕捉細胞は、特定の前記細胞保持チャンバへの移送において、前記第２のマイクロ流体チャネルにより移送される、請求項１の方法。
  17. 少なくとも１０の個々の前記細胞または細胞単位が前記セグメントから前記細胞保持チャンバへ移送され、および／または少なくとも１０の前記細胞保持チャンバが前記細胞により占められる、請求項１の方法。
  18. 前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも５つの前記セグメントと少なくとも５つの前記細胞保持チャンバを接続する、請求項１６または１７の方法。
  19. 前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも１０の前記セグメントと少なくとも１０の前記細胞保持チャンバを接続する、請求項１８の方法。
  20. 前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも１０の前記セグメントと少なくとも１０の前記細胞保持チャンバを接続する、請求項１９の方法。
  21. 前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも２０の前記セグメントと少なくとも２０の前記細胞保持チャンバを接続する、請求項２０の方法。
  22. 前記コンパウンドマニホールドが、少なくとも１０の前記セグメントと少なくとも１０から１００の前記細胞保持チャンバ接続する、請求項２１の方法。
  23. 前記コンパウンドマニホールドは、少なくとも５０の前記セグメントと少なくとも５０から１００の前記細胞保持チャンバを接続する、請求項２２の方法。
  24. 前記細胞保持チャンバの数に対する前記セグメントの数の割合は、１より大きい、請求項１の方法。
  25. 前記セグメントの数が、前記細胞保持チャンバの数よりも、約１０％、約２０％、約５０％、約７５％、約１００％、または約２００％数が多い、請求項２４の方法。
  26. 複数の前記細胞が、同じ前記細胞保持チャンバに個々に移送され、それにより、細胞の規定された組み合わせを含む前記細胞保持チャンバが産生される、前記請求項１の方法。
  27. ２、３、または４の前記細胞は、同じ前記細胞保持チャンバに個々に移送される、請求項２６の方法。
  28. それぞれ個々に移送された前記細胞は、分配の異なるラウンドにおいて捕捉される、請求項２７の方法。
  29. 前記第１のマイクロ流体チャネルに流される前記細胞は真核細胞である、請求項１の方法。
  30. 前記細胞は動物細胞である、請求項２９の方法。
  31. 前記細胞はヒトのものである、請求項３０の方法。
  32. 前記細胞は植物細胞である、請求項２９の方法。
  33. ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位を含む前記溶液は、２つの異なる真核生物種由来の細胞を含む、請求項１の方法。
  34. ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位を含む前記溶液は、同じ種の２つの異なる個体または標本由来の細胞を含む、請求項１の方法。
  35. ａ）において、複数の個々の前記細胞または細胞単位は、レア細胞および他の細胞を含み、ステップｄ）において前記細胞保持チャンバへ移送される少なくとも１つの細胞は、レア細胞であり、前記他の細胞対前記レア細胞の前記溶液における割合は、１００：１より大きく、場合によっては１０００：１より大きく、場合によっては１０，０００：１より大きく、および場合によっては、１００，０００：１より大きい、請求項１の方法。
  36. 前記レア細胞は、幹細胞、腫瘍細胞、随意に、循環性腫瘍細胞、循環性内皮細胞、または胎生細胞である、請求項３５の方法。
  37. 前記細胞は前記細胞保持チャンバで培養される、請求項１の方法。
  38. 前記細胞は約１時間から約４週間の間培養される、請求項３７の方法。
  39. 前記細胞は約１時間から約２４時間の間培養される、請求項３８の方法。
  40. 前記細胞は後代を産生するために分裂する、請求項３７から３９の方法。
  41. 前記細胞は培養中に観察される、請求項３９の方法。
  42. 前記細胞は培養中にチャレンジされる、請求項３９の方法。
  43. 前記チャレンジには前記細胞を薬剤にさらすことが含まれる、請求項４２の方法。
  44. 前記薬剤は、薬物、試験薬剤、タンパク質、核酸、または小分子である、請求項４３の方法。
  45. 第１の細胞または細胞の組み合わせは、少なくとも１時間の間培養され、次いで、装置において、細胞捕捉、特徴付け、および移送により得られる１またはそれよりも多くの追加の細胞が、前記細胞保持チャンバ内に導入される、請求項３７の方法。
  46. 培養期間後に、生細胞は前記細胞保持チャンバから集められる、請求項３７の方法。
  47. 培養期間後に、前記細胞保持チャンバにおける前記細胞がインサイツで固定される、請求項３７の方法。
  48. 試薬、溶液、または物理的刺激は、１つまたはそれよりも多くの前記細胞保持チャンバにおける前記細胞または細胞群に適用され、前記細胞または細胞群の溶解をもたらす、請求項３７の方法。
  49. 溶解された前記細胞から放出された高分子は、少なくとも１つの前記細胞保持チャンバの外に移送される、請求項４８の方法。
  50. 前記高分子が収集される、請求項４９の方法。
  51. 溶解された前記細胞から放出される前記高分子は、前記細胞保持チャンバから対応するマイクロ流体チャンバへと移送され、前記対応するマイクロ流体チャンバは、前記細胞保持チャンバと流体的に接続し、他の前記細胞保持チャンバとは流体的に接続しない、請求項４９の方法。
  52. 前記高分子は核酸であり、随意に前記核酸は増幅され（随意に逆転写され）、および随意に前記核酸または対応する増幅産物はマイクロ流体システムにおいてアッセイされ、前記ステップは生じすべて前記流体循環路内で生じ、随意に前記アッセイは、遺伝的特徴または遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質発現パターンを測定した、請求項５０または５１の方法。
  53. 生細胞を収受し、かつ、維持するために構成されるマイクロ流体装置におけるチャンバであって、
    有核の真核細胞が前記インプットチャネルを経て、前記チャンバ中へと無傷で通ることができるように構成されたインプットチャネルと、
    有核の真核細胞を含まない流体が前記チャンバを出ることができるように構成された複数の４つまたはそれよりも多くのドレインチャネルと、
    前記チャンバを供給チャネルから分離するガス透過性膜であり、ガス状混合物を、前記チャンバへと運ぶために前記供給チャネルは構成され、およびガスが前記チャンバと前記供給チャネルとの間で交換されるように構成される前記ガス透過性膜と
    を備える、チャンバ。
  54. 前記チャンバまたは前記インプットチャネルは、前記チャンバで前記細胞を保持しかつ処理するための１つまたはそれよりも多くの試薬を含む流体を供給するように構成される、試薬チャネルに接続される、請求項５３のチャンバ。
  55. 前記試薬チャネルは、細胞栄養物を含む流体の供給に接続される、請求項５４のチャンバ。
  56. 前記試薬チャネルは、前記チャンバへの前記流体の送達の際に、前記細胞を溶解する流体の供給に接続される、請求項５４のチャンバ。
  57. 前記インプットチャネルが前記チャンバに向かってテーパ状であることにより、前記チャンバの中心に向かって前記細胞を方向づける、請求項５３のチャンバ。
  58. 前記ドレインチャネルは、前記流体が前記インプットチャネルから前記チャンバへと流れて、前記ドレインチャネル向かって前記チャンバにおける前記細胞を引き出すことなく、前記ドレインチャネルを出るように、前記チャンバの周りに分布される、請求項５３のチャンバ。
  59. 前記チャンバは、実質的に円または卵円形状の周囲を有し、前記ドレインチャネルは、前記周囲の１８０度以上にわたって分布される、請求項５８のチャンバ。
  60. １０またはそれよりも多くの前記ドレインチャネルを含む、請求項５３のチャンバ。
  61. 前記ドレインチャネルは、ドレイン開口を通じて前記チャンバに接続し、前記インプットチャネルは、インプット開口を通じて前記チャネルに接続し、前記ドレイン開口の前記直径は、前記インプット開口の前記直径の２０％以下であることにより、前記ドレインチャネル内の無傷な前記細胞の通過を阻害する、請求項５３のチャンバ。
  62. 前記ドレインチャネルは、ビーズまたはフィルターを含むことにより、前記ドレインチャネル内の無傷な前記細胞の通過を阻害する、請求項５３のチャンバ。
  63. 少なくとも３つの前記真核細胞を収容するのに十分な大きさである、請求項５３のチャンバ。
  64. 少なくとも１０の前記真核細胞を収容するのに十分な大きさである、請求項６３のチャンバ。
  65. 最も狭い直径で少なくとも５０ミクロン（μｍ）にわたる、請求項５３のチャンバ。
  66. 最も狭い直径で少なくとも２００ミクロンにわたる、請求項５３のチャンバ。
  67. 凸状の下面を含む、請求項５３のチャンバ。
  68. 細胞接着を促進する物質によりコートされた下面を含む、請求項５３のチャンバ。
  69. 前記物質は細胞外マトリクスである、請求項６８のチャンバ。
  70. 前記物質はフィブロネクチンである、請求項６８のチャンバ。
  71. 前記チャンバ、前記インプットチャネル、および前記ドレインチャネルが、流体で満たされている、請求項５３から７０のいずれかのチャンバ。
  72. 少なくとも２つの前記真核細胞を含む、請求項５３から７１のいずれかのチャンバ。
  73. 複数の４またはそれよりも多くの請求項５３から７１のいずれかに記載のチャンバであって、各々はその独自の独立インプットチャネルを有し、各々の前記インプットチャネルは、共通のソース由来の細胞を供給するために構成される、複数のチャンバ。
  74. 前記独立インプットチャネルのそれぞれは、他の前記独立インプットチャネルのバルブと独立した操作がなされるバルブを有する、請求項７３の複数のチャンバ。
  75. 前記独立インプットチャネルは、第１のマルチプレクサの一部であり、前記共通のソースは、前記第１のマルチプレクサを第２のマルチプレクサと接続する接続チャネルであり、前記第２のマルチプレクサは、複数の異なるソースから前記接続チャネルに前記細胞を送達するように構成される、請求項７３の複数のチャンバ。
  76. 前記異なるソースは、共通の分配チャネルの分配された領域である、請求項７５の複数のチャンバ。
  77. 培養において細胞を保持する方法であって、前記細胞を請求項５３から７０のいずれかに記載の前記チャンバにデリバーすることと、栄養培地を、前記インプットチャネルまたは別個の試薬チャネルを通して前記チャンバ内に供給することと、ガスを前記供給チャネルを通して前記ガス透過膜に供給することとを含む、方法。
  78. 細胞混合物から前記チャンバへとデリバーされた前記細胞を個々に選択することをさらに含む、請求項７７の方法。
  79. 請求項５３から７０のいずれかに記載の前記チャンバに存在する１またはそれよりも多くの細胞由来の細胞内成分を抽出する方法であって、前記チャンバ内で細胞溶解を生じさせる流体をデリバーすることにより前記細胞を溶解することと、前記チャンバから溶解物の産生物を回収することとを含む、方法。
  80. 前記産生物が、前記ドレインチャネルにより回収される、請求項７９の方法。
  81. 前記産生物には、核酸が含まれる、請求項７９の方法。
  82. さらに、前記産生物を化学的または生化学的反応に供することが含まれる、請求項７９の方法。
  83. マイクロ流体装置におけるチャネルおよびバルブの配置であって、
    （ａ）インプットマルチプレクサであり、
    （ｉ）複数の４またはそれよりも多くのインプットチャネルと、
    （ｉｉ）該インプットチャネルのいずれか１つにおける流体が、他の前記インプットチャネルにおける流体と独立して流れることができるように、前記インプットチャネルを制御するために構成され、かつ、配置される複数のインプットバルブと、
    （ｉｉｉ）前記インプットチャネルのいずれか１またはそれよりも多くを通して流れる流体を収受するために、および単一の接続チャネルを通して前記流体を送るために構成され、かつ、配置される、１またはそれよりも多くのコンバイニングチャネルと、を含むもの、
    （ｂ）前記接続チャネルと、
    （ｃ）アウトプットマルチプレクサであり、
    （ｉ）複数の４またはそれよりも多くのアウトプットチャネルと、
    （ｉｉ）該アウトプットチャネルのいずれか１つにおける流体が、他の前記アウトプットチャネルにおける流体と独立して流れることができるように、前記アウトプットチャネルを制御するために構成され、かつ、配置される複数のアウトプットバルブと、
    （ｉｉｉ）前記アウトプットバルブの操作に応じて、前記接続チャネルを通して流れる流体を収受するために、および前記アウトプットチャネルのいずれか１またはそれよりも多くを通して前記流体を送るために構成され、かつ、配置される、１またはそれよりも多くの分配チャネルを含むもの
    を備える、配置。
  84. １つまたはそれよりも多くの前記コンバイニングチャネルがマニホールドである、請求項８３の配置。
  85. 前記インプットチャネルのいずれか１つから前記コンバイニングチャネルを通り前記接続チャネルまでの経路長が同じである、請求項８３または８４の配置。
  86. １つまたはそれよりも多くの前記分配チャネルがマニホールドである、請求項８３または８４の配置。
  87. 前記接続チャネルから、前記分配チャネルを通って、前記アウトプットチャネルのいずれか１つまでの経路長が同じである、請求項８３または８４の配置。
  88. 真核細胞が、前記インプットチャネルのいずれか１つからまたはこれを通って、前記コンバイニングチャネルを通って、前記接続チャネルを通って、前記分配チャネルを通って、前記アウトプットチャネルのいずれか１つを通って、無傷で通過するように構成される、請求項８３または８４の配置。
  89. 前記インプットチャネルのそれぞれが、分配チャネルに接続して、その異なる領域からの流体を収受するように構成される、請求項８３または８４の配置。
  90. 前記インプットバルブが、前記分配チャネルと前記コンバイニングチャネル間に配置される、請求項８９の配置。
  91. 前記分配チャネルは、前記インプットバルブと前記分配チャネル間に配置される、請求項８９の配置。
  92. 複数の前記アウトプットチャネルは、それぞれ、独立した保持チャンバに接続する、請求項８３の配置。
  93. 前記保持チャンバは細胞培養のために構成される、請求項９２の配置。
  94. インプットマニホールドにおけるチャネル、前記接続チャネル、アウトプットマニホールドにおけるチャネルが、流体により全て満たされる、請求項９１または９３の配置。
  95. マイクロ流体装置を支持し、かつ、操作するために構成された器具であって、
    （ａ）プラットフォームであり、
    （ｉ）前記マイクロ流体装置を収受し、かつ、支持するために形作られ、かつ、大きさに作られるキャビティと、
    （ｉｉ）細胞が前記キャビティにおける装置により処理されるとき、前記細胞がガラス窓を通して結像されるように、前記キャビティに位置付けされる前記ガラス窓と、
    （ｉｉｉ）密閉し、前記キャビティにおいて前記マイクロ流体装置におけるチャネルを制御するために、および空気圧により前記装置においてバルブを操作するために構成される複数の開口が含まれる、インターフェースプレートと、
    （ｉｖ）前記プラットフォームの平面において前記キャビティを取り囲み、細胞培養のために適切な温度で、前記キャビティにおいて前記マイクロ流体装置を維持するために構成される一体的な加熱部材とを含むもの、
    （ｂ）混合ボックスであり、
    （ｉ）ガス混合物を収受するために構成されるインレットと、
    （ｉｉ）前記ガス混合物を湿らせるために構成される加湿器と、
    （ｉｉｉ）前記ガス混合物を細胞培養のために適切な温度へと加熱するために構成されるヒーターとを含むもの、
    （ｃ）前記混合ボックスにおいて前記ヒーターにより加熱されたガスが、前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置内へと前記プラットフォームを通過するように構成される導管と
    を備える、器具。
  96. （ｄ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置からの使用されたガスが、前記混合ボックスへと戻り、これを通って外に出るように構成された導管と、
    （ｅ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置からの使用された液体が、前記混合ボックスへと戻り、これを通って外に出るように構成された導管と、
    をさらに備える、請求項９５の器具。
  97. 前記プラットフォームは、
    （ｖ）前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置内へとおよび／または前記マイクロ流体装置の外へと通過するガス混合物の湿度を測定するように構成された湿度センサをさらに備える、請求項９５または９６の器具。
  98. 前記混合ボックスは、
    （ｖｉ）ガス混合物のソースに、前記インレットを接続するように構成されたルアーロックコネクタと、
    （ｖ）電気ソケットをさらに備える、請求項９５または９６の器具。
  99. 前記一体的な加熱部材は、前記キャビティにおける前記マイクロ流体装置および前記混合ボックスにおけるガス混合物を同時に加熱するように、前記プラットフォームから前記混合ボックスへと通過する、請求項９５または９６の器具。
  100. 前記一体的な加熱部材はポリアミドを含む、請求項９５または９６の器具。
  101. 前記ガラス窓は、凝縮を阻害するコーティングによりコートされる、請求項９５または９６の器具。
  102. 前記コーティングは、イリジウムおよびスズを含む、請求項１０１の器具。
  103. 前記キャビティで前記マイクロ流体装置とともに支持器具を備える、請求項９５に記載のマイクロ流体システム。
  104. 前記マイクロ流体装置が、上記記載されまたは請求された装置である、請求項１０３のマイクロ流体システム。
  105. 前記マイクロ流体装置において細胞を培養するための栄養培地の供給およびガス混合物の供給をさらに含む、請求項１０３のマイクロ流体システム。
  106. 前記マイクロ流体装置における細胞の画像をとるように構成された結像装置をさらに備える、請求項１０３のマイクロ流体システム。
  107. 前記マイクロ流体装置の操作を制御するように構成され、かつ、プログラムされるコンピュ-タ処理装置をさらに備える、請求項１０３のマイクロ流体システム。
  108. 前記コンピュ-タ処理装置は専用プロセッサである、請求項１０７のマイクロ流体システム。
  109. 前記コンピュ-タ処理装置は、前記マイクロ流体装置の操作を制御するためにコード化されるａｐｐを含む、ポータブルコンピュータシステムにおけるプロセッサである、請求項１０７のマイクロ流体システム。
  110. 前記コンピュ-タ処理装置が、前記マイクロ流体装置における細胞の画像を表示するために構成されかつプログラムされる、請求項１０７から請求項１０９のいずれかのマイクロ流体システム。
  111. 細胞集団のプロセシングにおける、前述のようなマイクロ流体装置での分配チャネルの使用。
  112. 細胞集団のプロセシングにおける、アウトプットマルチプレクサに接続されるインプットマルチプレクサの、前述のようなマイクロ流体装置での使用。
  113. 細胞集団のプロセシングにおける、前述のようなマイクロ流体装置での複数の保持チャンバの使用。
  114. 細胞集団のプロセシングにおける、前述のようなマイクロ流体装置のための支持器具の使用。
  115. 前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を分離しかつソーティングすることを含む、請求項１１１の使用。
  116. 前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を別個に培養することを含む、請求項１１１の使用。
  117. 前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を、前記細胞群から分離された他の個々の細胞または細胞単位と、分け、かつ、組み合わせることを含む、請求項１１１の使用。
  118. 前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位の内容物を別個に収集すること、および各細胞の内容物を化学的反応に供することを含む、請求項１１１の使用。
  119. 前記化学的反応が分析の一部である、請求項１１１の使用。
  120. 前記プロセシングは、前記細胞群から個々の細胞または細胞単位を別個に結像することを含む、請求項１１１の使用。
  121. 細胞の集団の特性を測定する方法であって、厳密にＮの細胞からの高分子を含む無細胞組成物を提供することであり、Ｎ＝２の場合、前記Ｎの細胞は、少なくとも２時間共に培養されていることと、前記高分子にて分析ステップを行うこととを含む、方法。
  122. 前記高分子は核酸であり、前記分析ステップには、増幅、転写、逆転写、クローニング、またはシーケンシングが含まれる、請求項１２１の方法。
  123. 前記高分子はタンパク質であり、前記分析ステップには、タンパク質を抗体と組み合わせることが含まれる、請求項１２１の方法。
  124. Ｎ＝３、４、５、６、７、８、または１０以下であることを除外する、請求項１２１、１２２、または１２３に記載の方法。
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WO (1) WO2014144789A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020530102A (ja) * 2018-01-24 2020-10-15 イラミーナ インコーポレーテッド 流体の貯蔵
JP2022050698A (ja) * 2016-09-16 2022-03-30 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 微粒子分注装置、微粒子解析装置、及び反応検出装置、並びにそれらを用いる方法

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
SG11201609055RA (en) 2014-05-08 2016-11-29 Fluidigm Corp Integrated single cell sequencing
CA2965273C (en) 2014-10-27 2021-08-17 Universidade De Aveiro Equipment for chromatic discrimination and counting of organisms
US9996920B2 (en) * 2014-12-09 2018-06-12 Berkeley Lights, Inc. Automated detection and repositioning of micro-objects in microfluidic devices
US10751715B1 (en) * 2015-04-22 2020-08-25 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic reporter cell assay methods and kits thereof
EP3344755A4 (en) 2015-08-31 2019-05-22 I Peace, Inc. PREPARATION SYSTEM FOR PLURIPOTENTE STEM CELLS AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF INDUCED PLURIPOTENTAL STEM CELLS
US20170160187A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-08 Tdk Corporation Laser Scanner Particle Counter and Imager
US11285478B2 (en) 2016-04-04 2022-03-29 Combinati Incorporated Microfluidic siphoning array for nucleic acid quantification
CN110177621B (zh) * 2016-11-17 2022-07-08 康比纳提公司 用于核酸分析和定量的方法和系统
WO2018102201A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 EMULATE, Inc. In vitro epithelial models comprising lamina propria-derived cells
US11579073B2 (en) * 2017-02-07 2023-02-14 Nodexus Inc. Microfluidic system with combined electrical and optical detection for high accuracy particle sorting and methods thereof
KR101897250B1 (ko) * 2017-07-11 2018-09-10 광주과학기술원 항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩
CA3074461A1 (en) * 2017-08-29 2019-03-07 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
GB2585148B (en) * 2018-02-07 2023-03-29 Emulate Inc Gas mixer and pressurizer apparatus
CN111615630B (zh) * 2018-02-16 2023-09-15 阿斯特瑞格诊断公司 微流体装置
JP7075500B2 (ja) * 2018-04-03 2022-05-25 ヒューレット－パッカード デベロップメント カンパニー エル．ピー． 異なるサイズの細胞を移送するための微小流体チャネル
US20210284942A1 (en) * 2018-06-21 2021-09-16 Astraveus Microfluidic device and method for processing particles
WO2020129462A1 (ja) * 2018-12-21 2020-06-25 ソニー株式会社 粒子確認方法、粒子捕捉用チップ、及び粒子分析システム
CN114556258A (zh) * 2019-04-24 2022-05-27 班努生物科技公司 用于分选和富集感兴趣的靶细胞的定位辅助的阴性颗粒排斥（panr）
CN115279495A (zh) * 2019-12-04 2022-11-01 阿斯特拉维斯公司 用于加工颗粒的微流控设备和方法
EP4153356A1 (en) * 2020-05-18 2023-03-29 National University of Singapore Microfluidic device and liquid control system therefor
EP4175568A1 (en) * 2020-07-06 2023-05-10 Cornell University Methods and devices for automated microfluidic oocyte denudation
US11498067B2 (en) * 2020-10-23 2022-11-15 City University Of Hong Kong Apparatus and a method for patterning biological cells

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4119955C2 (de) 1991-06-18 2000-05-31 Danfoss As Miniatur-Betätigungselement
US5417235A (en) 1993-07-28 1995-05-23 Regents Of The University Of Michigan Integrated microvalve structures with monolithic microflow controller
BR9710054A (pt) 1996-06-28 2000-01-11 Caliper Techn Corp Aparelhos para separar compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e para detectar ummefeito de um composto de teste sobre um sistema bioquìmico, processos de determinação de se uma amostra contém um composto capaz de afetar um sistema bioquìmico, de separação de uma pluralidade de compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e usos de um sistema microfluido e de um substrato de ensaio.
US5785295A (en) 1996-08-27 1998-07-28 Industrial Technology Research Institute Thermally buckling control microvalve
AU746892B2 (en) 1997-04-04 2002-05-02 Caliper Life Sciences, Inc. Closed-loop biochemical analyzers
US6899137B2 (en) 1999-06-28 2005-05-31 California Institute Of Technology Microfabricated elastomeric valve and pump systems
ATE290166T1 (de) 1999-06-28 2005-03-15 California Inst Of Techn Elastisches mikropumpen- oder mikroventilsystem
US6645432B1 (en) 2000-05-25 2003-11-11 President & Fellows Of Harvard College Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channel networks
US7351376B1 (en) 2000-06-05 2008-04-01 California Institute Of Technology Integrated active flux microfluidic devices and methods
WO2002029106A2 (en) 2000-10-03 2002-04-11 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods of use
US7232109B2 (en) 2000-11-06 2007-06-19 California Institute Of Technology Electrostatic valves for microfluidic devices
AU2002230524A1 (en) 2000-11-16 2002-05-27 California Institute Of Technology Apparatus and methods for conducting assays and high throughput screening
US6752922B2 (en) 2001-04-06 2004-06-22 Fluidigm Corporation Microfluidic chromatography
US20020164816A1 (en) 2001-04-06 2002-11-07 California Institute Of Technology Microfluidic sample separation device
EP1384022A4 (en) 2001-04-06 2004-08-04 California Inst Of Techn AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID USING MICROFLUIDIC DEVICES
US7075162B2 (en) 2001-08-30 2006-07-11 Fluidigm Corporation Electrostatic/electrostrictive actuation of elastomer structures using compliant electrodes
CA2467587A1 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
CA2480728A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US7312085B2 (en) * 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
JP2005538727A (ja) 2002-09-16 2005-12-22 サイトノーム インコーポレーテッド 粒子を分類するための方法及び装置
US8220494B2 (en) 2002-09-25 2012-07-17 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
AU2003282875A1 (en) 2002-09-25 2004-04-19 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
WO2004040001A2 (en) 2002-10-02 2004-05-13 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
AU2003297214A1 (en) * 2002-12-16 2004-07-22 Cytodiscovery, Inc. Microfluidic system with integrated permeable membrane
US7604965B2 (en) 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
WO2005030822A2 (en) 2003-09-23 2005-04-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Photocurable perfluoropolyethers for use as novel materials in microfluidic devices
CA2555912A1 (en) 2004-02-13 2005-09-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Functional materials and novel methods for the fabrication of microfluidic devices
EP2701194B1 (en) 2004-06-07 2018-08-29 Fluidigm Corporation Method and apparatus for imaging a microfluidic device under temperature control
US20080264863A1 (en) 2004-12-03 2008-10-30 California Institute Of Technology Microfluidic Sieve Valves
EP1915618A4 (en) * 2005-06-02 2009-09-30 Fluidigm Corp ANALYSIS USING MICROFLUIDIC SEPARATION DEVICES
ES2609239T3 (es) 2008-01-03 2017-04-19 Emd Millipore Corporation Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento
US9329170B2 (en) 2009-01-20 2016-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets
JP5923035B2 (ja) * 2009-03-24 2016-05-24 バイオセプト インコーポレイティッド 細胞の捕捉および解析のデバイスおよび方法
US20120100538A1 (en) 2009-03-24 2012-04-26 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
US9353406B2 (en) 2010-10-22 2016-05-31 Fluidigm Corporation Universal probe assay methods
US20120288857A1 (en) 2011-02-03 2012-11-15 Fluidigm Corporation Multifunctional probe-primers
CN108342453A (zh) 2011-05-09 2018-07-31 富鲁达公司 基于探针的核酸检测
WO2012162779A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 The University Of British Columbia Microfluidic cell trap and assay apparatus for high-throughput analysis
WO2012178166A1 (en) * 2011-06-24 2012-12-27 Arryx, Inc. Method and apparatus for fractionating genetically distinct cells and cellular components
SG10201608159XA (en) 2012-02-29 2016-11-29 Fluidigm Corp Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022050698A (ja) * 2016-09-16 2022-03-30 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 微粒子分注装置、微粒子解析装置、及び反応検出装置、並びにそれらを用いる方法
JP2020530102A (ja) * 2018-01-24 2020-10-15 イラミーナ インコーポレーテッド 流体の貯蔵
US10953399B2 (en) 2018-01-24 2021-03-23 Illumina, Inc. Fluid caching
US11291998B2 (en) 2018-01-24 2022-04-05 Illumina, Inc. Fluid caching
JP7073416B2 (ja) 2018-01-24 2022-05-23 イラミーナ インコーポレーテッド 流体の貯蔵
JP2022119806A (ja) * 2018-01-24 2022-08-17 イラミーナ インコーポレーテッド 流体の貯蔵
JP7198381B2 (ja) 2018-01-24 2022-12-28 イラミーナ インコーポレーテッド 流体の貯蔵

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