ES2609239T3 - Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento - Google Patents

Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento Download PDF

Info

Publication number
ES2609239T3
ES2609239T3 ES09701350.2T ES09701350T ES2609239T3 ES 2609239 T3 ES2609239 T3 ES 2609239T3 ES 09701350 T ES09701350 T ES 09701350T ES 2609239 T3 ES2609239 T3 ES 2609239T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cell culture
cell
cells
inlet
microfluidic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09701350.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Paul J. Hung
Phillip J. Lee
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EMD Millipore Corp
Original Assignee
EMD Millipore Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EMD Millipore Corp filed Critical EMD Millipore Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2609239T3 publication Critical patent/ES2609239T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0099—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor comprising robots or similar manipulators
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0457—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces passive flow or gravitation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5025—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures for parallel transport of multiple samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00148—Test cards, e.g. Biomerieux or McDonnel multiwell test cards

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Robotics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Un sistema de cultivo celular microfluidico integrado en una placa de pocillos estandar, comprendiendo el sistema de cultivo celular microfluidico: un reservorio de entrada de medio conectado fluidicamente a una pluralidad de canales de medio microfluidico; una pluralidad de areas de cultivo celular localizadas cada una en un extremo de un canal de cultivo celular; teniendo dicho canal de cultivo celular una abertura de entrada de celulas conectada fluidicamente a un reservorio de entrada de celulas / salida de medio para introducir celulas a dicha pluralidad de areas de cultivo celular y para retirar medio; un primer pocillo en comunicacion con el reservorio de entrada de medio que actua como una entrada de medio; un segundo pocillo en comunicacion con el reservorio de entrada de celulas / salida de medio que actua como una entrada de celulas / salida de medio; un tercer pocillo que actua como un pocillo de visualizacion para la pluralidad de areas de cultivo celular; una barrera de perfusion entre dichas areas de cultivo celular y dicha pluralidad de canales de medio microfluidico, conteniendo dicha barrera de perfusion una pluralidad de pasajes de perfusion; de forma que el fluido introducido en dicho reservorio de entrada de medio deba pasar a traves de dicha barrera de perfusion antes de llegar a dicho reservorio de entrada de celulas / salida de medio; en donde una pluralidad de dichos pasajes de perfusion son sustancialmente mas estrechos que las celulas que van a cultivarse.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Sistema de matriz de cultivo celular microflmdico para ensayos automatizados y metodos de funcionamiento Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional 61/037.297 presentada el 17/03/2008 y de 61/018.882 presentada el 03/01/2008.
La presente solicitud trata tecnologia relacionada con el documento U.S. 11/994.997, presentado el 11/08/2008, que es una entrada en fase nacional de PCT/US06126364, presentada el 06/07/2006 y que reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional 60/773.467 presentada el 14 de febrero de 2006 y de la solicitud de patente provisional 60/697.449 presentada el 7 de julio de 2005.
La presente solicitud trata tecnologia relacionada con la solicitud de EE.UU. 12/019.857, presentada el 25/01/2008, que reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de EE.UU. N.° 60/900.651 presentada el 8 de febrero de 2007.
La presente solicitud trata tecnologia relacionada con la solicitud de EE.UU. Numero: 11/648207, presentada el 29/12/2006, que reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de EE.UU. solicitud de patente provisional de EE.UU. N.° 60/756.399 presentada el 4 de enero de 2006.
Campo de la invencion
La invencion en diversas realizaciones se refiere a la manipulacion de micro-objetos, tales como celulas, o las particulas micro-fabricadas son perlas, usando un sistema microfluidico y particularmente se refiere a una configuracion que puede usarse con diversos sistemas de manipulacion automatizados estandar. En realizaciones particulares, la invencion implica un sistema automatizado para cultivo celular.
Antecedentes de la invencion
El cultivo celular microfluidico es una tecnologia prometedora para aplicaciones en la industria de la selection de farmacos. Los beneficios clave incluyen funcion biologica mejorada, datos basados en celulas de mayor calidad, consumo reducido de reactivos y coste mas bajo. Las preparaciones de muestras moleculares y celulares de alta calidad son importantes para diversas aplicaciones clinicas, de investigation, y otras aplicaciones. Las muestras in vitro que representan estrechamente sus caracteristicas in vivo pueden beneficiar posiblemente un amplio intervalo de aplicaciones moleculares y celulares. La manipulacion, caracterizacion, cultivo y visualization de celulas u otros materiales biologica o quimicamente activos (tales como perlas recubiertas con diversas moleculas biologicas) se ha valorado cada vez mas en los campos de descubrimiento de farmacos, diagnostico y analisis de enfermedades, y otros varios trabajos terapeuticos y experimentales.
El cultivo de celulas de mamifero es particularmente exigente, particularmente para mantener agregados solidos eficaces de celulas en cultivo. Se han hecho avances adaptando diversas tecnologias de microfabricacion y microfluidicas al cultivo celular, aunque sigue existiendo una necesidad continua de un dispositivo que pueda fabricarse economicamente y usarse para proporcionar cultivo celular eficaz.
Las publicaciones y/o los documentos de patente que tratan diversas estrategias relacionadas con el cultivo celular usando sistemas microfluidicos y actividades relacionadas incluyen las siguientes solicitudes de patente de EE.UU. y bibliografia no de patente. Un listado de estas referencias aqui no indica que las referencias constituyan estado de la tecnica.
Cytoplex, Inc. 6.653.124 "Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation". Cellomics, Inc. 6.548.263 "Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening".
Fluidigm, Inc. Solicitud publicada 20040229349 (18 de noviembre de 2004) "Microfluidic particle-analysis systems". Otras referencias I
1. T. H. Park and M. L. Shuler, Biotechnol. Prog., 2003,19, 243.
2. G. M. Walker, H. C. Zeringue and D. J. Beebe, Lab Chip, 2004, 4, 91.
3. E. Leclerc, Y. Sakai and T. Fujii, Biotechnol. Prog., 2004, 20, 750.
4. M. J. Powers, K. Domansky, M. R. Kaazempur-Mofrad, A. Kalezi, A. Capitano, A. Upadhyaya, P. Kurzawski, K. E. Wack, D. B. Stolz, R. Kamm and L. G. Griffith, Biotechnol. Bioeng., 2002, 78, 257.
5. K. Viravaidya and M. L. Shuler, Biotechnol. Prog., 2004, 20, 590.
6. Y. Kostov, P. Harms, L. Randers-Eichhorn and G. Rao, Biotechnol. Bioeng., 2001, 72, 346.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7. N. Li Jeon, H. Baskaran, S. K. Dertinger, G. M. Whitesides, L. Van der Water and M. Toner, Nat. Biotechnol., 2002, 20, 826.
8. T. Thorsen, S. J. Maerkl and S. R. Quake, Science, 2002,298, 580.
9. H. Andersson and A. van den Berg, Lab Chip, 2004, 4, 98.
Otras referencias II
10. Dove, A. (2003) Nature Biotechnology 21,859-864.
11. Entzeroth, M. (2003) Current Opinion in Pharmacology 3, 522-529.
12. Boess, F.; Kamber, M.; Romer, S.; Gasser, R.; Muller, D.; Albertini, S.; Suter, L. Toxicol Sci 2003, 73, (2), 386-402.
13. Rodriguez-Antona, C.; Donato, M. T.; Boobis, A.; Edwards, R. J.; Watts, P. S.; Castell, J. V.; Gomez-Lechon, M. J. Xenobiotica 2002, 32, (6), 505-20.
14. Cukierman, E.; Pankov, R.; Stevens, D. R.; Yamada, K. M. Science 2001,294, (5547), 1708-12.
15. Griffith, L. G.; Swartz, M. A. Nat Rev Mol Cell Biol 2006, 7, (3), 211-24.
16. Revzin, A.; Rajagopalan, P.; Tilles, A. W.; Berthiaume, F.; Yarmush, M. L.; Toner, M. Langmuir 2004, 20, (8), 2999-3005.
17. Flaim, C. J.; Chien, S.; Bhatia, S. N. Nat Methods 2005, 2, (2), 119-25.
18. Anderson, D. G.; Levenberg, S.; Langer, R. Nat Biotechnol 2004, 22, (7), 863-6.
19. Battle, T.; Stacey, G. Cell Biol Toxicol 2001, 17, (4-5), 287-99.
20. LeCluyse, E. L.; Bullock, P. L.; Parkinson, A. Advanced Drug Delivery Reviews 1996, (22),133-186.
21. Ben-Ze'ev, A.; Robinson, G. S.; Bucher, N. L.; Farmer, S. R. Proc Natl Acad Sci U S A 1988, 85, (7), 2161-5.
22. Bhatia, S. N.; Balis, U. J.; Yarmush, M. L.; Toner, M. Faseb J 1999, 13, (14), 1883-900.
23. Berthiaume, F.; Moghe, P. V.; Toner, M.; Yarmush, M. L. Faseb J 1996, 10, (13), 1471-84.
24. Stevens, M. M.; George, J. H. Science 2005, 310, (5751), 1135-8.
25. Bissell, M. J.; Rizki, A.; Mian, I. S. Curr Opin Cell Biol 2003, 15, (6), 753-62.
26. Allen, J. W.; Bhatia, S. N. Biotechnol Bioeng 2003, 82, (3), 253-62.
27. Hung, P. J.; Lee, P. J.; Sabounchi, P.; Aghdam, N.; Lin, R.; Lee, L. P. Lab Chip 2005, 5, (1), 44-8.
28. Lee, P. J.; Hung, P. J.; Rao, V. M.; Lee, L. P. Biotechnol Bioeng 2005.
29. Puhl, G.; Schaser, K. D.; Vollmar, B.; Menger, M. D.; Settmacher, U. Transplantation 2003, 75, (6), 756-61.
30. Park, J.; Berthiaume, F.; Toner, M.; Yarmush, M. L.; Tilles, A. W. Biotechnol Bioeng 2005, 90, (5), 632-44.
31. Anderson, K.; Wilkinson, R.; Grant, M. H. Int J Artif Organs 1998, 21, (6), 360-4.
32. Landry, J.; Bernier, D.; Ouellet, C.; Goyette, R.; Marceau, N. J Cell Biol 1985, 101, (3), 914-23.
33. A. Ben-Ze'ev, G. S. Robinson, N. L. Bucher, S. R. Farmer, Proc Natl Acad Sci U S A 85, 2161 (Apr, 1988).
34. J. Landry, D. Bernier, C. Ouellet, R. Goyette, N. Marceau, J Cell Biol 101, 914 (Sep, 1985).
35. S. A. Stoehr, H. C. Isom, Hepatology 38, 1125 (Nov, 2003).
36. Zhang, X, Wang, W, Yu, W, Xie, Y, Zhang, X, Zhang, Y, Ma, X. Biotechnol Prog 2005, 21, 1289-96.
37. Kelm, J, Timmins, N, Brown, C, Fussenegger, M, Nielsen, L. Biotechnology and Bioengineering. 2003, 83(2)173-180.
38. Kuns-Schughart, L, Freyer, J, Hofstaedter, F, Ebner, R. J. Biomolecular Screening. 2004, 9(4) 273-285.
Lee et al., "Microfluidic System for Automated Cell-based Assays", Journal of the Association for Laboratory Automation, Vol. 12, No. 6, 20 de noviembre de 2007, 363-367, describe un diseno de cultivo celular microfluidico adaptado para ser compatible con un formato de placa de 96 pocillos estandar.
Lee et al., "An Artificial Liver Sinusoid with a Microfluidic Endothelial-like Barrier for Primary Hepatocyte culture", Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 5, 1 de agosto de 2007, 1340-1346, describe la creacion de un sinusoide hepatico artificial biologicamente inspirado con una barrera tipo endotelial microfluidica que tiene propiedades de transporte de masa similares al acino hepatico.
El documento US 2007/0275455 describe un dispositivo microfluidico de cultivo celular con valvulas que incluye un sustrato, un microcanal a traves del que el liquido puede moverse de una estacion a otra y una microvalvula neumatica que puede cambiarse entre estados abierto y cerrado para controlar el flujo de un fluido a traves del microcanal.
El documento WO 2007/008609 describe metodos y sistemas para proporcionar manipulacion, cultivo o ensayo mejorados de las celulas en sistemas microfluidicos.
El documento WO 2005/023124 describe un aparato para manipular entidades celulares que tiene un primer sustrato que tiene una matriz de pocillos que puede contener una entidad celular y canales fluidicos abiertos a cada pocillo. Los pocillos estan estrechados para localizar la entidad celular en una localizacion dada en el pocillo y los canales fluidicos se forman sobre la superficie de otro sustrato que puede fijarse de forma separable al primer sustrato.
Trabajo y solicitudes de patente previas como se citan anteriormente que implican a al menos uno de los presentes inventores tratan diversas configuraciones, metodos y sistemas relacionados con el cultivo celular microfluidico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Sumario
La presente invencion implica diversos componentes, sistemas y metodos relacionados con sistemas de cultivo celular microflmdico relacionados, todos como se definen en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, la invencion implica novedosos sistemas de cultivo celular microflmdico y metodos que tienen ventajas con respecto a estructuras microfluidicas previamente propuestas. En otro aspecto, la invencion implica novedosas estructuras y metodos para integrar multiples sistemas de cultivo celular microflmdico a una estructura de placa de pocillos de microtitulo, tal como un formato de placa de pocillos de cultivo estandar (por ejemplo, una placa de cultivo SBS de 96 pocillos). Tambien se describen novedosos metodos de fabricacion para crear una matriz de areas de cultivo celular microflmdico adecuado para integration con una placa de pocillos. En otro aspecto, la invencion implica novedosos sistemas, metodos y componentes para un cultivo celular de alto rendimiento automatizado mejorado y/o sistema de selection usando cultivos celulares microfluidicos.
En realizaciones particulares, caracteristicas de diseno clave incluyen la elimination de tubos y conectores a las propias placas, la capacidad de mantener cultivo celular en perfusion continuo a largo plazo usando un flujo accionado por gravedad pasivo y el analisis directo sobre los pocillos de salida y/o pocillos de observation celular de la placa microfluidica.
Para fines de claridad, esta discusion se refiere a dispositivos, metodos y conceptos en terminos de ejemplos especificos. Sin embargo, la invencion y aspectos de los mismos pueden tener aplicaciones para una variedad de tipos de dispositivos y sistemas. Por tanto, se pretende que la invencion no se limite, excepto como se proporciona en las reivindicaciones y equivalentes adjuntos.
Ademas, es muy sabido en la tecnica que los sistemas y metodos tal como se describen en el presente documento pueden incluir una variedad de diferentes componentes y diferentes funciones en un modo modular. Diferentes realizaciones de la invencion pueden incluir diferentes mezclas de elementos y funciones y pueden agrupar diversas funciones como partes de diversos elementos. Para fines de claridad, la invencion se describe en terminos de sistemas que incluyen muchos componentes innovadores diferentes y combinaciones innovadoras de componentes innovadores y componentes conocidos. No debe hacerse inferencia para limitar la invencion a combinaciones que contienen todos los componentes innovadores enumerados en cualquier realization ilustrativa en esta memoria descriptiva.
En algunos de los dibujos y description detallados mas adelante, la presente invencion se describe en terminos de la realizacion independiente importante de un sistema de celular cultivo completo, completamente automatizado, y componentes del mismo. No debe considerarse que esto limite los diversos aspectos novedosos de la invencion que, usando las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, pueden aplicarse a varias otras situaciones. En algunos de los dibujos y descripciones mas adelante, la presente invencion se describe en terminos de varias realizaciones de ejemplos especificos que incluyen parametros especificos relacionados con dimensiones de estructuras, presiones o volumenes de liquidos, temperaturas, valores electricos, y similares. Excepto donde se proporcione asi en las reivindicaciones adjuntas, estos parametros se proporcionan como ejemplos y no limitan la invencion a otros dispositivos o sistemas con diferentes dimensiones. Para fines de proporcionar una descripcion mas esclarecedora, se dan como ejemplos etapas de fabricacion conocidas particulares, etapas de manipulation de celulas, reactivos, proceso quimico o mecanico, y otros componentes conocidos que pueden incluirse para hacer un sistema o fabricar un dispositivo segun realizaciones especificas de la invencion. Se entendera para aquellos expertos en la materia que, excepto donde se indique especificamente en el presente documento de otro modo, pueden hacerse diversas sustituciones conocidas en los procesos descritos en el presente documento.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1 es una vista desde arriba de una matriz de ejemplo de unidades de cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion. En este ejemplo, se proporcionan 32 unidades de cultivo en una placa de 96 pocillos (tal como el esquema de matriz del biorreactor microflmdico estandar de la Society for Biomolecular Screening (SBS)), con pocillos dispuestos en 12 columnas (mostradas verticalmente) por 8 filas. En este ejemplo, cada unidad de cultivo celular ocupa tres pocillos, uno para su uso como una entrada de medio, uno para su uso como una entrada de celulas/salida de medio y uno para su uso para la obtencion de imagenes de celulas (que aparece como un rectangulo oscuro en los pocillos en la figura) y/o para proporcionar pasajes de aire a un area de cultivo celular. En realizaciones especificas, cada unidad puede usarse como una celda biomimetica independiente.
La FlG. 2 es una vista desde abajo que muestra una unidad de cultivo que ocupa tres pocillos segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 3 es una vista desde abajo en primer plano que ilustra detalles de las areas de cultivo celular microflmdico descritas anteriormente segun realizaciones especificas de la invencion. En esta figura, la entrada de celulas/salida de medio esta a la izquierda, y la entrada de medio esta a la derecha.
La FIG. 4 es una micrografia en primer plano de un area de cultivo celular que ilustra dos grandes orificios de aire a la izquierda de la figura cada uno conectado a un pasaje de aire que esta dispuesto entre los bloques, teniendo cada bloque cuatro sinusoides de cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion. En
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
esta figura, la entrada de celulas/salida de medio esta a la derecha, y la entrada de medio esta a la izquierda. Tambien estan visibles en la foto estructuras de multiplexor de medio a la izquierda en cada bloque, y un multiplexor de entrada de celulas opcional a la derecha en cada bloque.
La FIG. 5 es una micrografia en primer plano de un area de cultivo celular que ilustra dos grandes orificios de aire a la izquierda de la figura cada uno conectado a un pasaje de aire que esta dispuesto entre los bloques, teniendo cada bloque ocho sinusoides de cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 6 ilustra canales de relacion de aspecto alta que rodean las areas de cultivo celular en los que los canales entre las estructuras solidas tienen aproximadamente 4 |jm de anchura y 40 |jm de alto para prevenir que las celulas crezcan fuera. Los canales en este ejemplo estan separados aproximadamente 40 jm.
La FIG. 7A ilustra una entrada de celulas/salida de medio de un area de cultivo celular modificada con una gran entrada de celulas rectangular para proporcionar carga de celulas mas facil y con un area de perfusion de la carga de celulas y un area de cultivo celular de pared solida. Las flechas de la derecha indican la direccion de carga de las celulas.
La FIG. 7B ilustra la entrada de medio/area de cultivo celular de un sistema de cultivo celular microfluidico modificado segun realizaciones especificas de la invencion. En este ejemplo, la carga de celulas es desde la derecha y el flujo de medio, como se indica por las flechas, es desde la izquierda.
La FIG. 8 es un esquema que muestra tres bloques de cuatro sinusoides de cultivo celular largos, donde los sinusoides celulares largos se extienden a traves de dos pocillos, y ademas muestra una region de entrada de celulas / region de salida de flujo rectangular, y cuatro orificios de aire que conectan con cuatro canales de aire. Las FIG. 9A-B son diagramas esquematicos simplificados que ilustran en tres dimensiones los componentes de un sistema microfluidico multicelula (por ejemplo, 3) que incluye una representacion del marco de pocillos segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 10 es una vista lateral simplificada que muestra una estructura segun realizaciones especificas de la invencion que ilustra dos pocillos que se usan en flujo de celulas y flujo de fluidos.
La FIG. 11 es una micrografia en primer plano que muestra celulas cargadas en cinco regiones sinusoides de cultivo celular con cuatro canales sinusoides intermedias segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 12 muestra cuatro micrografias en primer plano que muestran celulas cargadas en cuatro regiones de cultivo celular sinusoides diferentes dimensionadas segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 13 es un diagrama esquematico que muestra etapas de una region de cultivo vacia para realizar un ensayo celular segun realizaciones especificas de la invencion.
Las FIG. 14A-C muestran una vista desde arriba, vista lateral y vista en planta de un esquema de un colector de ejemplo segun realizaciones especificas de la invencion. En este ejemplo, las ocho lineas de tubos a la derecha son para aire comprimido, y cada una esta configurada para proporcionar presion a una columna de entrada de pocillos de celulas en una matriz microfluidica. La linea mas a la izquierda en la figura es para vacio y conecta con un anillo de vacio externo alrededor del colector. Cada columna de pocillos esta generalmente conectada a una unica linea de presion con pocillos encima de las regiones de obtencion de imagenes omitidos.
La FIG. 15 es una grafica que ilustra un ejemplo de diferencia de caudal entre un mecanismo de tension superficial y un mecanismo accionado por gravedad segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 16 es una grafica que ilustra un ejemplo del grado al que la tasa de perfusion de la gravedad es sensible a la diferencia de nivel de liquido entre los dos pocillos del reservorio superior segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 17A-B ilustra una plataforma de inclinacion que puede usarse para controlar la diferencia de altura de liquido entre los pocillos de entrada/salida en un dispositivo o sistema segun realizaciones especificas de la invencion y un ejemplo de caudal frente al angulo de inclinacion de la placa.
La FIG. 18 ilustra una vista desde arriba esquematica de un sistema de automatization de cultivo celular de ejemplo segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 19 es una fotografia de un sistema de matriz de perfusion microfluidico automatizado de ejemplo segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 20 es un diagrama de flujo que ilustra el flujo de proceso de etapas de funcionamiento tipicas.
La FIG. 21 ilustra cuatro areas de cultivo microfluidico de una placa de matriz de ejemplo preparada en el sistema de ejemplo descrito anteriormente usando hepatocitos primarios de rata.
La FIG. 22 ilustra una portion de un area de cultivo microfluidico de una placa de matriz de ejemplo preparada en el sistema de ejemplo descrito anteriormente usando hepatocitos primarios humanos.
La FIG. 23 ilustra una disposition de otro tipo de matriz de cultivo celular disenada para la automatizacion general del cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 24 ilustra un esquema de funcionamiento para realizar cultivo celular automatizado e inmunotincion sobre una matriz microfluidica con carga de celulas por gravedad como se ha descrito anteriormente. Aplicaciones de ejemplo incluyen cultivo de celulas madre y cultivo de celulas primarias con tincion por inmunofluorescencia y microscopia.
La FIG. 25 ilustra un esquema de matriz de biorreactor microfluidico estandar SBS (Society for Biomolecular Screening) de ejemplo alternativo.
Las FIG. 26A-B ilustran un ensamblaje de sistema de cultivo celular alternativo segun realizaciones especificas de la presente invencion que muestran (A) un diseno microfluidico esquematico de ejemplo para tres unidades de celula; (B) una fabrication de litografia suave de este diseno con mecanizado laser de cuatro aberturas por unidad de cultivo.
La FIG. 27 ilustra etapas de funcionamiento de un sistema menos automatizado o prototipo segun realizaciones
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
espedficas de la invencion.
La FIG. 28 ilustra un molde microflmdico fijado sobre una placa de vidrio con imanes segun realizaciones espedficas de la invencion. En realizaciones de ejemplo, cada iman usado es: 3/4" (1,9 cm) de diametro x 1/16" (0,16 cm) de espesor fabricado, por ejemplo, de un neodimio-hierro-boro (NdFeB) sinterizado con un chapado/recubrimiento de Ni-Cu-Ni (mquel) y un grado: N40 con una fuerza de traccion de: 4,0 lbs (1814 g).
La FlG. 29 ilustra una pila de moldes mantenidos juntos con pinzas magneticas (por ejemplo, pila de moldes microfluidicos auto-alineados) para formar estructuras micro-moldeadas de polimero segun realizaciones espedficas de la invencion.
La FIG. 30 es un diagrama de bloques que muestra un proceso de moldeo suave directo de ejemplo segun realizaciones espedficas de la invencion.
La FIG. 31A ilustra las dos piezas en posicion antes de montar un vidrio y recubrimiento. Debido a que la pieza superior es moldeada por inyeccion, el fondo de los pocillos puede ser plano, redondeado o conico. Una caracteristica deseada particular es que el fondo de la parte superior, que cubre las estructuras microfluidicas, debe ser plano para garantizar el moldeo uniforme a traves de la matriz. Esta parte superior puede ser tanto una parte superior patentada con pocillos como se muestra como, alternativamente, puede ser una placa multi-pocillo SBS estandar.
La FIG. 31B ilustra un ejemplo en el que el fondo de la placa superior esta quimicamente modificado por un reactivo (Silgard Primecoat) de manera que los polimeros blandos se adhieran al fondo de la parte superior despues del proceso de moldeo e ilustra una cantidad apropiada de polimero blando vertido sobre el centro del molde (normalmente algunos mililitros, dependiendo del area que vaya a cubrirse, ademas del espesor del polimero blando despues del moldeo).
La FIG. 31C ilustra un ejemplo en el que la parte superior y el molde estan intercalados entre dos piezas de superficies planas (normalmente placas de vidrio) con mecanismos de sujecion (en este caso imanes) y el mecanismo de sujecion mantiene la pieza superior y el molde juntos con marcas de alineamiento ajustadas entre si.
La FIG. 31D ilustra un ejemplo en el que despues de desprender la matriz de cultivo celular microfluidico moldeada con la pieza superior, se usa un cortador laser para crear conexiones fluidicas entre las estructuras microfluidicas y los pocillos en localizaciones espedficas (entradas/salidas de celulas/reactivos).
La FIG. 31E ilustra un ejemplo en el que la matriz de cultivo celular microfluidico esta unida a una pieza de vidrio rectangular. El vidrio y/o la matriz pueden someterse a tratamiento por plasma de oxigeno antes de la union.
La FIG. 31F ilustra un ejemplo en el que usando un dispensador de liquido, la matriz de cultivo celular microfluidico se llena con soluciones de imprimacion para mantener su quimica superficial modificada. Si parece que burbujas estan atrapadas dentro de la matriz, se usan etapas de vado adicionales para eliminar las burbujas.
La FIG. 31G ilustra un ejemplo en el que para prevenir la evaporacion de liquido, la matriz se sella con una cinta. La FIG. 31H ilustra un ejemplo en el que la matriz se ajusta opcionalmente en un marco de manera que la matriz acabada pueda tratarse como una placa de microtitulacion estandar con las dimensiones externas correctas. En el caso en el que la parte superior sea una placa de pocillos de microtitulo estandar, esta etapa puede ser innecesaria.
Las FIG. 32A-D ilustra cuatro componentes de un proceso de moldeo suave directo segun realizaciones espedficas de la invencion.
La FIG. 33A ilustra una etapa en la que una cantidad apropiada de polimero blando se vierte sobre el centro del molde (normalmente algunos mililitros, dependiendo del area que va a cubrirse, ademas del espesor del espaciador) Por ejemplo, para un molde de 6" (15,2 cm) de diametro y un espaciador de 150 micrometros, la cantidad minima requerida es n x 7,62 cm x 7,62 cm x 0,015 cm ~ 2,75 ml).
La FIG. 33B ilustra una etapa en la que la hoja acrilica se intercala entre dos piezas de las placas de vidrio de manera que los imanes presionen la hoja acrilica (con la superficie modificada por la imprimacion orientada hacia el molde) contra el molde hasta que la hoja acrilica choque con el espaciador. El polimero blando llenara entonces el espacio entre la hoja acrilica y el molde para repetir las estructuras microfluidicas. En realizaciones particulares, el mecanismo de sujecion asistido por iman mantiene las piezas juntas mientras que el polimero blando se cura a temperatura elevada (60 °C) durante al menos 2 horas.
La FIG. 33C ilustra que despues de enfriarse los compartimentos hasta aproximadamente temperatura ambiente, la hoja acrilica con el polimero blando se desprende del molde. La matriz de cultivo celular microfluidico se moldea fielmente sobre el polimero blando. Para proteger la superficie del polimero blando de contaminaciones de los siguientes procesos, puede aplicarse una cinta de proteccion de la superficie (Ultron Blue Adhesive Plastic Film 80 micrometros) encima de la superficie del elastomero por un rodillo.
La FIG. 33D ilustra que despues de la separation del molde se usa un cortador laser de CO2 (modelo VersaLaser, 25W) para crear conexiones fluidicas entre las estructuras microfluidicas y los pocillos moldeados por inyeccion (entrada de celulas y entrada de medio). Como el polimero blando usado en el proceso es permeable al gas, pueden cortarse "orificios de aire" cerca de las areas de cultivo celular para promover la difusion de aire para el mejor cultivo celular. La pieza superior circular puede cortarse a la forma rectangular en esta etapa.
La FIG. 33E ilustra que despues de quitar la cinta de proteccion de la superficie y de opcionalmente limpiar ultrasonicamente la matriz (o se limpia con chorro de agua) para sacudir cualquier polvo creado por la etapa de corte laser y opcionalmente aplicar una nueva cinta de proteccion de la superficie, la matriz de cultivo celular microfluidico se pega a la placa moldeada por inyeccion con un adhesivo curable por ultra-violeta (UV) que
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
tambien es bio-compatible (Loctite 3301). La placa con la matriz de cultivo celular microflmdico se cura en una camara de UV durante 30 minutos. Despues de quitar la cinta de proteccion superficial, tanto un sustrato de vidrio (por ejemplo, White Float Glass) como la matriz de cultivo celular microflmdico se someten a tratamiento por plasma de oxigeno para activar la superficie y el sustrato de vidrio encierra la matriz de cultivo celular microflmdico mediante enlace covalente, como se muestra en la FIG. 33F.
La FIG. 33G ilustra que usando un dispensador de liquido, la matriz de cultivo celular microflmdico se llena con soluciones de imprimacion, ya que las burbujas pueden estar dentro de la matriz; y la matriz puede ponerse dentro de una camara de vacio para la eliminacion de burbujas y tambien puede ponerse dentro de una camara de UV/ozono (Novascan) para esterilizacion.
La FIG. 33H ilustra que para prevenir la evaporation de liquido, la matriz se sella con una cinta (Excel Scientific, AlumaSeal).
La FIG. 34 es un diagrama de bloques que muestra un dispositivo logico de ejemplo representativo en el que pueden incorporarse diversos aspectos de la presente invention.
Descripcion detallada de realizaciones especificas
1. Vision general
Definiciones
Una "particula" se refiere a celulas biologicas, tales como celulas de mamifero o bacterianas, particulas virales, o particulas liposomales u otras que pueden someterse a ensayo segun la invencion. Tales particulas tienen dimensiones minimas entre aproximadamente 50-100 nm, y puede ser de hasta 20 micrometros o mas. Cuando se usa para describir un ensayo celular segun la invencion, los terminos "particulas" y "celulas" pueden usarse indistintamente.
Un "micropocillo" se refiere a una camara de escala micrometrica capaz de acomodar una pluralidad de particulas. Un micropocillo normalmente es de forma cilindrica y tiene dimensiones de diametro y profundidad en una realization preferida de entre 100 y 1500 micrometros, y 10 y 500 micrometros, respectivamente. Cuando se usa para referirse a un micropocillo dentro del dispositivo de matriz de micropocillos de la invencion, el termino "pocillo" y "micropocillo" se usan indistintamente.
Un "microcanal" se refiere a un canal de escala micrometrica que se usa para conectar una estacion en el dispositivo de la invencion, con un micropocillo, o una estacion y una valvula asociadas al micropocillo. Un microcanal normalmente tiene una section transversal rectangular, por ejemplo, cuadrada, con dimensiones laterales y de profundidad en una realizacion preferida de entre 10 y 500 micrometros, y 10 y 500 micrometros, respectivamente. Los fluidos que circulan en los microcanales pueden presentar comportamiento microflmdico. Cuando se usa para referirse a un microcanal dentro del dispositivo de matriz de micropocillos de la invencion, el termino "microcanal" y "canal" se usan indistintamente.
Un "dispositivo microflmdico" se refiere a un dispositivo que tiene diversas estaciones o pocillos conectados por microcanales de escala micrometrica en los que los fluidos presentaran comportamiento microflmdico en su flujo a traves de los canales.
Una "matriz de micropocillos" se refiere a una matriz de dos o mas micropocillos formados sobre un sustrato.
Un "dispositivo" es un termino ampliamente usado en la materia y engloba un amplio intervalo de significados. Por ejemplo, a su nivel mas basico y menos elaborado, "dispositivo" puede significar simplemente un sustrato con caracteristicas tales como canales, camaras y puertos. A niveles de elaboration cada vez mayores, el "dispositivo" puede comprender ademas un sustrato que encierra dichas caracteristicas, u otras capas que tienen caracteristicas microfluidicas que funcionan en sintonia o independientemente. A su nivel mas elaborado, el "dispositivo" puede comprender un sustrato completamente funcional emparejado con un objeto que facilita la interaction entre el mundo externo y las caracteristicas microfluidicas del sustrato. Un objeto tal puede llamarse de diversas maneras un reservorio, recinto, carcasa, o termino similar, como se trata mas adelante. Como se usa en el presente documento, el termino "dispositivo" se refiere a cualquiera de estas realizaciones o niveles de elaboracion que el contexto puede indicar.
Sistemas microfluidicos proporcionan una poderosa herramienta para realizar experimentos biologicos. Recientemente, microfluidicos basados en elastomeros han ganado especialmente popularidad debido a su transparencia optica, permeabilidad a los gases y metodos de fabrication simples. Sin embargo, la interfaz con los usuarios finales requiere una laboriosa perforation de orificios a traves del elastomero, y etapas adicionales de conexion de tubos y bomba de jeringa.
La presente invencion implica microfluidicos basados en elastomeros integrados en placas de pocillos estandar, con especial atencion a aplicaciones de cultivo de hepatocitos. La invencion implica ademas metodos de fabricacion de tales placas y componentes y un sistema para automatizar el cultivo celular usando tales placas. Ventajas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
realizaciones espedficas incluyen el uso de un formato de placa de microtitulacion estandar, cultivo celular libre de tubos y un microentorno de dgado biomimetico.
Un sistema segun realizaciones espedficas de la invencion (por ejemplo, usando placas estandar de 96 pocillos) puede funcionar usando tecnicas y equipos convencionales para manipular placas de microtitulacion estandar, como se conoce bien en la tecnica. Por ejemplo, la dispensacion de liquido se logra con mecanica de pipeta estandar, y el cultivo y analisis celular pueden hacerse compatibles con estufas de incubacion y lectores de placas existentes.
Segun realizaciones adicionales de la invencion, un sistema de carga de celulas novedoso usa un colector neumatico y presion neumatica para poner las celulas en el area de microcultivo. Con la adicion de este sistema de carga de celulas, el cultivo celular microfluidico y el analisis pueden automatizarse completamente usando otro equipo automatizado que existe para manipular placas de titulo estandar.
En realizaciones adicionales, la configuracion de cultivo de flujo accionado por gravedad utiliza la diferencia de nivel de medio entre el pocillo de entrada y de salida, ademas de manipular las resistencias fluidicas para lograr el caudal deseable en el regimen de nl/min. Esto proporciona la ventaja significativa de ser capaz de hacer circular "pasivamente" el medio de cultivo durante largos periodos de tiempo (hasta 4 dias) sin el uso de bombas o tubos externos voluminosos.
En realizaciones adicionales, la invencion implica un sistema microfluidico para permitir el control del entorno del cultivo celular para la microscopia de lapso de tiempo a largo plazo de celulas adherentes. Como continua la tendencia hacia "biologia de sistemas", sera cada vez mas importante estudiar el comportamiento dinamico en celulas vivas individuales, ademas de para mejorar la funcionalidad y economia de la seleccion de celulas vivas de alto rendimiento. Segun realizaciones espedficas de la invencion, la invencion proporciona una camara de flujo microfluidico multiplexada que permite experimentacion de microscopia de lapso de tiempo, entre otros ensayos. La camara microfluidica usa una barrera endotelial artificial para separar celulas de canales de flujo. Al dispositivo se le da la forma de una placa de pocillos estandar, que permite que muestras de liquido y de celulas sean directamente pipeteadas en los reservorios de entrada apropiados usando equipo estandar. Entonces se usa un controlador de flujo neumatico a medida para cargar las celulas en las regiones de cultivo, ademas de para cambiar entre diferentes soluciones de exposicion. Puede usarse una interfaz de software digital para permitir que un usuario programe entradas espedficas (pulsos, rampas, etc.) con el tiempo para exponer las celulas a funciones complejas durante la obtencion de imagenes de lapso de tiempo.
Respuestas dinamicas en celulas vivas son la base de fenomenos tales como el procesamiento de senales biologicas, regulacion de la expresion genica, diferenciacion y division celular. En realizaciones espedficas, la invencion implica un sistema capaz de controlar el microentorno celular en un formato multiplexado compatible con los actuales metodos de cultivo celular. La respuesta de la celula puede cuantificarse usando microscopia de fluorescencia de alto aumento para derivar information cinetica con resolution sub-celular. Esta capacidad tiene amplias aplicaciones en la biologia de sistemas celulares donde los experimentos de respuesta dinamica de una sola celula no son actualmente practicos.
2. Sistema y matriz de cultivo microfluidico
La solicitud citada anteriormente (documento U.S. 11/994.997) trato una variedad de diferentes configuraciones de cultivo celular y tecnicas de fabrication. Porciones del funcionamiento de las areas de cultivo celular y materiales son utiles como antecedentes para la presente discusion. En algunos ejemplos en el presente documento, una o mas areas de microcultivo estan conectadas a un canal de medio o reactivo mediante una rejilla de pasajes fluidicos (o entradas o conductos de difusion), en el que la rejilla comprende una pluralidad de pasajes de alta resistencia microfluidica de intersection. En un ejemplo tratado, los pasajes en la rejilla tienen aproximadamente 1 a 4 |jm de altura, 25 a 50 jm de longitud y 5 a 10 jm de anchura, permitiendo la rejilla una difusion mas uniforme entre canales de medio o reactivo y el area de cultivo y permitiendo fabricacion mas facil y difusion mas uniforme. La anterior solicitud trato ademas que la relation de resistencia fluidica alta entre la microcamara y los pasajes de perfusion/difusion o rejilla (por ejemplo, relaciones en el intervalo de aproximadamente 10:1, 20:1 a 30:1) ofrece muchas ventajas para el cultivo celular tales como: (1) exclusion por tamano de celulas; (2) localization de celulas dentro de una microcamara; (3) promotion de un entorno flmdico uniforme para el crecimiento celular; (4) capacidad para configurar matrices de microcamaras o areas de cultivo; (4) facilidad de fabricacion, y (5) manipulation de reactivos sin una amplia red de valvulas. Se ilustraron ejemplos en los que una barrera de perfusion tipo rejilla puede ser mucho mas corta que el area de cultivo o puede estar cerca de o a la misma altura, segun realizaciones espedficas de la invencion, y adicionalmente en los que se ilustraron diversas configuraciones para los dispositivos de cultivo. La solicitud tambien trato un dibujo de CAD de un biorreactor microfluidico de 96 unidades propuesto en el que cada pocillo era un tamano estandar SBS (3,5 mm de diametro) con el fin de ser compatible con los sistemas de manipulacion de liquidos roboticos y lectores de placas existentes. La solicitud tambien trato varias configuraciones diferentes para un sinusoide artificial, usando tanto pasajes cortados como rejillas y con un diseno de perfusion alrededor del flujo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La FIG. 1 es una vista desde arriba de una matriz de ejemplo de unidades de cultivo celular segun realizaciones espedficas de la invencion. En este ejemplo, se proporcionan 32 unidades de cultivo en una placa de 96 pocillos (tal como el esquema de matriz del biorreactor microfluidico estandar de la Society for Biomolecular Screening (SBS)), con pocillos dispuestos en 12 columnas (mostradas verticalmente) por 8 filas. En este ejemplo, cada unidad de cultivo celular ocupa tres pocillos, uno para su uso como una entrada de medio, uno para su uso como una entrada de celulas/salida de medio y uno para su uso para la obtencion de imagenes de celulas (que aparece como un rectangulo oscuro en los pocillos en la figura) y/o para proporcionar pasajes de aire a un area de cultivo celular. En realizaciones especificas, cada unidad puede usarse como una celda biomimetica independiente.
La FIG. 2 es una vista desde abajo que muestra una unidad de cultivo que ocupa tres pocillos segun realizaciones especificas de la invencion. En este ejemplo, la porcion de cultivo celular visible en el pocillo central se divide en cuatro bloques, teniendo cada bloque cuatro canales de cultivo celular separados rodeados por canales de medio usados para el pasaje fluidico de medio. En realizaciones particulares, estos cuatro canales de cultivo celular separados pueden denominarse sinusoides o sinusoides artificiales, independientemente de si el extremo lejano de las areas tiene una forma redondeada. La separacion en cuatro bloques facilita la difusion de aire a traves del material que define la estructura de canales microfluidicos (tal como el elastomero de silicona polidimetilsiloxano (PDMS)) en las areas de cultivo. Se muestran seis orificios de aire para facilitar el pasaje de aire.
La FIG. 3 es una vista desde abajo en primer plano que ilustra detalles de las areas de cultivo celular microfluidico descritas anteriormente segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 4 es una micrografia en primer plano de un area de cultivo celular que ilustra dos grandes orificios de aire a la izquierda de la figura cada uno conectado a un pasaje de aire que esta dispuesto entre los bloques, teniendo cada bloque cuatro sinusoides de cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 5 es una micrografia en primer plano de un area de cultivo celular que ilustra dos grandes orificios de aire a la izquierda de la figura cada uno conectado a un pasaje de aire que esta dispuesto entre los bloques, teniendo cada bloque ocho sinusoides de cultivo celular segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 6 ilustra canales de relacion de aspecto alta que rodean las areas de cultivo celular en los que los canales entre las estructuras solidas tienen aproximadamente 4 |jm de anchura y 40 |jm de alto para prevenir que las celulas crezcan fuera. Los canales en este ejemplo estan separados aproximadamente 40 jm.
La FIG. 7A ilustra una entrada de celulas/salida de medio de un area de cultivo celular modificada con una gran entrada de celulas rectangular para proporcionar carga de celulas mas facil y con un area de perfusion de la carga de celulas y un area de cultivo celular de pared solida.
La FIG. 7B ilustra la entrada de medio/area de cultivo celular de un sistema de cultivo celular microfluidico modificado segun realizaciones especificas de la invencion. En este ejemplo, la carga de celulas es desde la derecha y el flujo de medio, como se indica por las flechas, es desde la izquierda. Otra diferencia en el diseno modificado es que los pasajes de perfusion estan ausentes en una porcion del canal de cultivo celular (o sinusoide artificial). Esto se ha encontrado para localizar mas facilmente celulas en el extremo del canal de cultivo celular en el area de cultivo celular. Opcionalmente, una porcion del canal de cultivo celular cerca de la salida de fluido tiene pasajes de perfusion para garantizar el flujo de fluidos despues de que las celulas se hayan agregado en el extremo del cultivo. El diseno mejorado proporciona carga de celulas mas facil y un area de cultivo celular mas larga y canales de cultivo celular para cultivar mas celulas y flujo mas uniforme de nutrientes. Se ha descubierto que durante el funcionamiento, las celulas se localizan/pegan a las areas del canal de cultivo que estan inmediatamente a continuacion de los pasajes de perfusion. El segmento del canal de cultivo celular entre la principal region del area de cultivo y el otro conjunto de pasajes de perfusion cerca de la entrada de celulas carece de celulas, debido a que el perfil de flujo las saca, particularmente durante la carga de celulas. Asi, este diseno modificado previene que las celulas se extiendan en los canales de "flujo" despues de algunos dias y detengan el flujo. En el diseno modificado, el flujo sigue sin obstaculos ya que las celulas no pueden extenderse pasado el segmento de canal de cultivo celular largo (donde no hay pasajes de perfusion). En un sistema de ejemplo, hasta aproximadamente 2.500 celulas de higado pueden cultivarse en cada area como se muestra en la FIG. 7 y la FIG. 8.
La FIG. 8 es un esquema que muestra tres bloques de cuatro sinusoides de cultivo celular largos, donde los sinusoides celulares largos se extienden a traves de dos pocillos, y ademas muestra una region de entrada de celulas / region de salida de flujo rectangular, y cuatro orificios de aire que conectan con cuatro canales de aire.
Las FIG. 9A-B son diagramas esquematicos simplificados que ilustran en tres dimensiones los componentes de un sistema microfluidico multicelula (por ejemplo, 3) que incluye una representacion del marco de pocillos segun realizaciones especificas de la invencion.
La FIG. 10 es una vista lateral simplificada que muestra una estructura segun realizaciones especificas de la invencion que ilustra dos pocillos que se usan en flujo de celulas y flujo de fluidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
La FIG. 11 es una micrografia en primer plano que muestra celulas cargadas en cinco regiones sinusoides de cultivo celular con cuatro canales sinusoides intermedias segun realizaciones espedficas de la invencion.
La FIG. 12 muestra cuatro micrografias en primer plano que muestran celulas cargadas en cuatro regiones de cultivo celular sinusoides diferentes dimensionadas segun realizaciones espedficas de la invencion.
Asi, la presente invencion segun realizaciones espedficas de la invencion proporciona varias configuraciones microfluidicas mejoradas novedosas. En un primer aspecto, se usan tres pocillos para cada sistema de cultivo celular por lo demas independiente. En un segundo aspecto, se proporcionan sinusoides artificiales con barreras epiteliales artificiales con solo una entrada fluidica (opcionalmente compartida o multiplexada) y una salida fluidica (opcionalmente compartida o multiplexada), donde la salida de medio tambien funciona como entrada celular. En un tercer aspecto, sinusoides artificiales con barreras epiteliales artificiales con solo una entrada fluidica y una salida fluidica se dividen en bloques con canales de aire proporcionados entre los bloques. En un cuarto aspecto, se proporcionan orificios de aire en la camara de pocillos encima del area de cultivo celular de una matriz de cultivo celular microfluidico, donde la salida de medio tambien funciona de entrada celular. En un quinto aspecto, se proporcionan una estructura de entrada de medio multiplexada y estructura de entrada celular multiplexada para conectar entradas y salidas con bloques de sinusoides artificiales. En un sexto aspecto, se proporcionan una estructura de entrada de medio multiplexada y estructura de entrada celular compartida mas grande para conectar entradas y salidas con bloques de sinusoides artificiales. En un septimo aspecto, se configuran sinusoides artificiales con porciones no abiertas de una barrera epitelial para localizar mejor celulas, y con entradas de perfusion que rodean un area de cultivo celular y opcionalmente tambien presentes cerca de un area de entrada de celulas del sinusoide. En un octavo aspecto, se proporcionan camaras de sinusoides artificiales mas largas.
Como se trata en cualquier parte, pueden hacerse diversas modificaciones al area de cultivo de celulas como se ha descrito anteriormente. Son posibles diversas configuraciones para la barrera epitelial, tales como una estructura de pasaje tipo rejilla. Otras variaciones seran sugeridas para aquellos expertos en la materia que tienen las ensenanzas proporcionadas en el presente documento.
Las estructuras desveladas anteriormente tambien pueden adaptarse a sistemas usando mas o menos pocillos sobre una placa de pocillos de microtitulo estandar, tales como aquellas descritas en documentos citados y en otros ejemplos en el presente documento.
La Tabla 1 ilustra un ejemplo de enfermedades, afecciones o estados que pueden evaluarse o para los que pueden _________probarse farmacos u otras terapias segun realizaciones espedficas de la presente invencion._________
Clasificacion de enfermedad
Enfermedad
Enfermedad cardiovascular
Aterosclerosis; Angina inestable; Infarto de miocardio; Reestenosis despues de angioplastia u otra intervencion percutanea; Insuficiencia cardiaca congestiva; Miocarditis; Endocarditis; Disfuncion endotelial; Cardiomiopatia
Enfermedad endocrina
Diabetes mellitus I y II; Tiroiditis; Enfermedad de Addison
Enfermedad infecciosa
Hepatitis A, B, C, D, E; Malaria; Tuberculosis; VIH; Pneumocystis carinii; Giardia; Toxoplasmosis; Enfermedad de Lyme; Fiebre maculosa de las Montanas Rocosas; Citomegalovirus; Virus de Epstein-Barr; Virus del herpes simple; Colitis por Clostridium difficile; Meningitis (todos los organismos); Neumonia (todos los organismos); Infeccion de las vias urinarias (todos los organismos); Diarrea infecciosa (todos los organismos)
Anaioaenesis
Angiogenesis patologica; Angiogenesis fisiologica; Angiogenesis inducida por el tratamiento
Enfermedad inflamatoria/reumatica
Artritis reumatoide; Lupus eritematoso sistemico; Enfermedad de Sjogren; sindrome de CREST; Esclerodermia; Espondilitis anquilosante; Crohn; Colitis ulcerosa; Colangitis esclerosante primaria; Apendicitis; Diverticulitis; Esclerosis biliar primaria; Granulomatosis de Wegener; Poliarteritis nodosa; Enfermedad de Whipple; Psoriasis; Poliangeitis microscopica; Enfermedad de Takayasu; Enfermedad de Kawasaki; Hepatitis autoinmune; Asma; Enfermedad de Churg-Strauss; Enfermedad de Beurger; Enfermedad de Raynaud; Colecistitis; Sarcoidosis; Asbestosis; Neumoconiosis
Rechazo de trasplante
Corazon; Pulmon; Higado; Pancreas; Intestino; Medula osea; Celula madre; Enfermedad de injerto contra huesped; Vasculopatia del trasplante
Leucemia v linfoma
3. Funcionamiento de dispositivo de ejemplo
La FIG. 13 es un diagrama esquematico que muestra etapas de una region de cultivo vada para realizar un ensayo celular segun realizaciones espedficas de la invencion. Diversos aspectos novedosos segun realizaciones espedficas de la invencion simplifican estas etapas y les permiten ser automatizados.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Carga de celulas
La carga de celulas en realizaciones espedficas de la invencion puede utilizar el flujo de tension superficial rapido entre la entrada de celulas y la salida de flujo. En este metodo, el reservorio de entrada de celulas (superior e inferior) es aspirado de su solucion de imprimacion. Entonces, se aspira el reservorio superior de entrada de flujo. Se dispensa una cantidad (por ejemplo, cinco microlitros) de suspension de celulas (por ejemplo, linea de celulas cancerosas humanas HeLa tripsinada, 5x105 celulas/ml) en el reservorio inferior de entrada de celulas. Se aspira el reservorio inferior de entrada de flujo, haciendo que el liquido circule desde la entrada de celulas hasta la entrada de flujo mediante la tension superficial/fuerza capilar. La carga de celulas en diversas configuraciones puede completarse en aproximadamente 2-5 minutos. El reservorio de carga de celulas se lava entonces con medio (por ejemplo, medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM) y se llena con, por ejemplo, 50-100 microlitros de medio limpio. En este estado, la placa se coloca en un entorno de cultivo controlado durante un periodo (por ejemplo, estufa de incubacion a 37 °C, 5 % de CO2 durante 2-4 horas) para permitir la union de celulas.
Mientras que tal carga es eficaz para algunos dispositivos de cultivo celular microfluidico, en una realizacion actualmente preferida, un colector neumatico patentado, como se describe en cualquier parte en el presente documento, se encaja a la placa y se aplica presion neumatica al area de entrada de celulas para carga de celulas mas eficaz. Para sistemas de celulas particulares, se ha encontrado que el diseno del area de cultivo celular global puede hacerse mas eficaz cuando no es necesario permitir la carga de celulas pasiva.
Las FIG. 14A-C muestran una vista desde arriba, vista lateral y vista en planta de un esquema de un colector de ejemplo segun realizaciones espedficas de la invencion. En este ejemplo, las ocho lineas de tubos a la derecha son para aire comprimido, y cada una esta configurada para proporcionar presion a una columna de entrada de pocillos de celulas en una matriz microfluidica. La linea mas a la izquierda en la figura es para vado y conecta con un anillo de vado externo alrededor del colector. Cada columna de pocillos esta generalmente conectada a una unica linea de presion con pocillos encima de las regiones de obtencion de imagenes omitidos. El colector esta dispuesto encima de una placa de pocillos estandar. Una junta de goma se encuentra entre la placa y el colector, con orificios que coinciden con el colector (no mostrados). La linea de vado crea un vado en las cavidades entre los pocillos, manteniendo juntos la placa y el colector. Se aplica presion a los pocillos para conducir el liquido dentro de los canales microfluidicos (no mostrados). Se usa una presion tipica de 1 psi, por tanto, a la intensidad del vado es suficiente para mantener una junta estanca al aire. En un ejemplo hay 9 iineas de tubos al controlador de presion: 8 lineas son para aire comprimido y 1 linea es para vado (mas a la izquierda). En realizaciones espedficas de ejemplo, cada columna esta conectada a una unica linea de presion. Se omiten las columnas encima de las regiones de obtencion de imagenes de celulas.
Se ha encontrado que la carga de celulas presurizada en un sistema segun realizaciones espedficas de la invencion es particularmente eficaz en la preparacion de cultivos de celulas de agregacion (por ejemplo, tumor solido, higado, musculo, etc.). La carga de celulas presurizada tambien permite que estructuras con regiones de cultivo alargadas, por ejemplo, como se muestra en las FIG. 7 y FIG. 8, sean eficazmente cargadas. Durante el uso de un colector presurizado para la carga de celulas y el flujo pasivo para las funciones de perfusion se permite que la invencion utilice un diseno de dos entradas bastante simple, sin la necesidad de pocillos de entrada y/o valvulas adicionales como se usa en otros disenos.
Flujo de fluidos y funcionamiento: Gravedad y flujo de tension superficial
El formato del diseno de la placa microfluidica permite dos modalidades de flujo faciles para la automatizacion, que dependen del grado de dispensacion/aspiracion. El primero es el flujo mediado por tension superficial. En este caso, cuando el reservorio inferior se aspira en uno cualquiera de los pocillos, la fuerza capilar de la interfase fluido/aire junto con las superficies humedecidas (vidrio, silicona, acrilico) extraera rapidamente liquido del pocillo opuesto hasta que se llene el reservorio inferior (o en equilibrio con el reservorio inferior opuesto). Este efecto es util para flujos microfluidicos ya que solo es evidente cuando el diametro del reservorio es pequeno y los volumenes de flujo son pequenos. En un diseno de matriz de ejemplo, los pocillos del reservorio inferior tienen 1-2 mm de diametro, y con un volumen de flujo total de aproximadamente 3-5 microlitros. Como el volumen del canal microfluidico es solo 0,2 microlitros, este mecanismo es muy apto para la carga de celulas y exposiciones de celula.
El segundo mecanismo es la perfusion accionada por gravedad, que es muy apta para flujos a plazo mas largo, ya que esto depende de la diferencia de nivel de liquido y no de las dimensiones del reservorio. Segun realizaciones espedficas de la invencion, esto puede llevarse a cabo anadiendo mas liquido a un reservorio (normalmente llenando cerca de la parte superior del reservorio superior). La resistencia fluidica a traves de los canales microfluidicos determinara cuanto tiempo (por ejemplo, 24 horas) para alcanzar el equilibrio entre los pocillos y asi determinar como de frecuentemente deben rellenarse los pocillos.
La FIG. 15 muestra la diferencia de caudal entre el mecanismo de tension superficial y el mecanismo accionado por gravedad. Para el flujo de tension superficial, en un ejemplo, se dispensaron 5 microlitros en el reservorio inferior, seguido de aspiracion del reservorio inferior opuesto. Para el flujo de gravedad, se uso una diferencia de nivel de liquido de 2,5 mm, con ambos pocillos llenados en la porcion de deposito superior.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Cambio del caudal por gravedad mediante el nivel de liquido
La velocidad de perfusion por gravedad tambien es sensible a la diferencia de nivel de liquido entre los dos pocillos del reservorio superior como se ilustra en la FIG. 16. Este hecho permite que un dispensador / aspirador automatizado controle y mantenga un caudal de perfusion dado durante un intervalo de 10 veces durante el cultivo. Aqui, se produjeron diferentes diferencias de nivel de liquido dispensando volumenes y se midieron para caudal volumetrico.
Control de la velocidad de perfusion por gravedad mediante el angulo de inclinacion de la placa
Segun realizaciones especificas de la invencion, la diferencia de altura de liquido entre los pocillos de entrada/salida a traves de la placa tambien puede controlarse con precision usando una plataforma de inclinacion mecanica. En esta implementacion, es posible mantener un caudal constante con el tiempo, ademas de flujo hacia adelante y hacia atras con diferentes tiempos directos e inversos (es decir, circulacion sanguinea). En el ejemplo ilustrado en la FIG. 17, tanto los reservorios de entrada como de salida se llenaron con 50 microlitros de solucion. Sobre una superficie plana, no hay flujo a traves de los canales, y a medida que aumenta el angulo, asi lo hace el caudal. La foto muestra una plataforma de inclinacion controlada prototipo, que consiste en una plataforma mecanica y un interruptor electronico.
En un sistema de ejemplo, el cultivo celular de perfusion puede iniciarse llenando el reservorio de entrada de flujo con 200-300 microlitros de medio fresco (por ejemplo, DMEM complementado con 10 % de suero bovino fetal) y aspirando el reservorio superior de entrada de celulas. La diferencia de nivel de liquido entre los pocillos de entrada de flujo y de entrada de celulas producira entonces un flujo accionado por gravedad continuo a traves de las celulas unidas. Para el cultivo sostenido, el pocillo de entrada de flujo se rellena y el pocillo de entrada de celulas se aspira durante un periodo dependiendo de la resistencia fluidica y los volumenes de reservorio (por ejemplo, cada 24 horas).
Ensayo celular y/u observacion
Puede realizarse un ensayo celular directamente sobre el cultivo celular microfluidico usando kits de reactivos opticamente basados estandar (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia, luminiscencia, etc.). Por ejemplo, se ha mostrado un ensayo de viabilidad celular que utiliza la conversion de un sustrato a una molecula fluorescente por celulas vivas (reactivo Cell Titer Blue por Promega Corporation). El reactivo se dispensa en el reservorio de entrada de flujo y se expone a las celulas mediante perfusion por gravedad durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 21 horas). Para introduccion mas rapida de un reactivo u otro fluido, el nuevo fluido puede anadirse al reservorio de entrada de flujo, seguido de aspiracion del reservorio de entrada de celulas.
Pueden recogerse datos directamente sobre las celulas/liquido en la placa microfluidica, tal como poniendo la placa en un lector de placas de fluorescencia estandar (por ejemplo, modelo Synergy 2 de Biotek Instruments). En algunas reacciones, el sustrato puede difundir en el medio de salida y, por tanto, ser facilmente detectado en el reservorio de entrada de celulas. Para los ensayos de obtencion de imagenes de celulas, la placa puede ponerse sobre un microscopio de barrido o sistema de alto contenido. Por ejemplo, puede usarse una estacion de microscopio invertido Olympus IX71 automatizado para capturar la viabilidad de celulas de higado cultivadas con una lente de objetivo 20X.
Llenando/aspirando repetidamente los pocillos, las celulas pueden mantenerse durante largos periodos de tiempo con esfuerzo minirno (por ejemplo, en comparacion con "biorreactores" estandar que requieren una amplia preparacion esteril de grandes reservorios de fluido que no pueden ser facilmente intercambiados durante el funcionamiento).
4. Sistemas automatizados
La FIG. 18 ilustra una vista desde arriba esquematica de un sistema de automatizacion de cultivo celular de ejemplo segun realizaciones especificas de la invencion. Debido a que las placas se disenan para ser manipuladas usando instrumentos conformes a SBS, pueden usarse diversas maquinas "disponibles para venta" para crear un sistema automatizado. Este esquema muestra un ejemplo de como esto se lleva a cabo. Un brazo robotico (manipulador de placas) mueve las placas microfluidicas de estacion a estacion. Una estufa de incubacion automatizada guarda las placas a la temperatura y entorno de gas apropiados durante la perfusion a largo plazo mediante flujo de gravedad. El pipeteador dispensa los liquidos (medios, farmacos, reactivos de ensayo, etc.) a los pocillos de entrada y saca liquido de los pocillos de salida. Se usa un lector de placas para el ensayo. El cargador de celulas se usa opcionalmente para introducir las celulas a las matrices microfluidicas al principio del experimento. El cargador de celulas en particular no esta generalmente "disponible para venta" y funciona aplicando presion neumatica a pocillos especificados de la placa de matriz para inducir el flujo. Esta disponible software informatico estandar o a medida para integrar funciones.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La FIG. 19 es una fotografia de un sistema de matriz de perfusion microflmdico automatizado de ejemplo segun realizaciones espedficas de la invencion. El proceso basico incluye: 1) retirar la placa de la estufa de incubacion, 2) retirar liquido de los pocillos de salida mediante el pipeteador, 3) mover una placa de almacenamiento de medios/farmaco de las "pilas de placas", 4) transferir Kquido de la placa de medio/farmaco a la placa microfluidica mediante el pipeteador, 5) poner la placa microfluidica en la estufa de incubacion, 6) repetir para cada placa, 7) repetir despues del intervalo de tiempo especificado (por ejemplo, 24 horas).
La FIG. 20 es un diagrama de flujo que ilustra el flujo de proceso de etapas de funcionamiento tipicas. Esta figura ilustra, como un ejemplo, etapas de proceso automatizadas e indica un dispositivo automatizado que se usa para realizar una etapa tal. Se usa un pipeteador automatizado estandar para un recubrimiento superficial opcional, para anadir celulas en suspension, para anadir medios o farmacos o reactivos, y para cambiar medios. Los pipeteadores automatizados conocidos pueden administrar o extraer individualmente fluidos de pocillos especificados. En una realizacion especifica, se usa un cargador de celulas patentado para presurizar los pocillos de entrada de celulas para la carga de celulas. Despues de un periodo en una estufa de incubacion disenado para la union de celulas optima, el cargador de celulas puede usarse otra vez para lavar fluido y celulas no unidas de las areas de cultivo microflmdico. Se usan uno o mas dispositivos de lectura o de analisis para ensayar las celulas.
La FIG. 21 ilustra cuatro areas de cultivo microflmdico de una placa de matriz de ejemplo preparada en el sistema de ejemplo descrito anteriormente usando hepatocitos primarios de rata. Las celulas se cultivaron durante 1 semana con medio cambiado a una tasa de 150 ul por unidad, dos veces al dia. Las celulas se ensayaron al final de 7 dias para viabilidad usando CellTiter Blue Kit de Promega, y se leyeron en un lector de placas de fluorescencia automatizado (Biotek Synergy). En esta figura, un area de cultivo microflmdico de ejemplo usa paredes epiteliales de flujo a traves de la rejilla.
La FIG. 22 ilustra una porcion de un area de cultivo microflmdico de una placa de matriz de ejemplo preparada en el sistema de ejemplo descrito anteriormente usando hepatocitos primarios humanos. Las celulas se cultivaron en la matriz microfluidica segun realizaciones espedficas de la invencion, que muestran (a) contraste de fases de hepatocitos humanos recien preparados cultivados en el dispositivo microflmdico durante 13 dias. (b) Viabilidad de hepatocitos humanos cultivados en el dispositivo microflmdico y en una placa de 96 pocillos medida por el ensayo CellTiter Blue (Promega, Inc.). (c) Actividad de P450 CYP3A4 de hepatocitos cultivados en el dispositivo microflmdico y placa de 96 pocillos medida mediante el ensayo P450-Glow (Promega, Inc.).
La FIG. 23 ilustra una disposicion de otro tipo de matriz de cultivo celular disenada para la automatization general del cultivo celular segun realizaciones espedficas de la invencion. En este diseno, cada unidad de cultivo consiste en 4 posiciones de pocillos. El primer pocillo es para el medio de perfusion, el segundo pocillo es para la entrada de celulas, el tercer pocillo es para la obtencion de imagenes de la camara microfluidica, y el cuarto pocillo es la salida. Una barrera de celula / barrera de perfusion localiza celulas en el area de celulas y mejora el transporte de nutrientes durante el cultivo de perfusion continuo. La baja resistencia fluidica de la trayectoria de entrada de celulas a la salida permite que las celulas sean rapidamente cargadas mediante metodos de gravedad o tension superficial sin un mecanismo de carga de celulas externo. La alta resistencia fluidica de los canales de entrada de perfusion permite la perfusion continua a largo plazo de medio mediante flujo de gravedad sin ningun mecanismo de bomba externo.
La FIG. 24 ilustra un esquema de funcionamiento para realizar cultivo celular automatizado e inmunotincion sobre una matriz microfluidica con carga de celulas por gravedad como se ha descrito anteriormente. Aplicaciones de ejemplo incluyen cultivo de celulas madre y cultivo de celulas primarias con tincion por inmunofluorescencia y microscopia.
La FIG. 25 ilustra un esquema de matriz de biorreactor microflmdico estandar SBS (Society for Biomolecular Screening) de ejemplo alternativo. Se lleno una matriz de cultivo celular microflmdico de 16 unidades con colorantes coloreados de manera que los canales microfluidicos fueran visibles. En este ejemplo, cada unidad ocupa cinco pocillos, que de izquierda a derecha son entrada de medio, entrada de celulas, salida de celulas, obtencion de imagenes de celulas y salida de medio.
Las FIG. 26A-B ilustran un ensamblaje de sistema de cultivo celular alternativo segun realizaciones espedficas de la presente invencion que muestran (A) un diseno microflmdico esquematico de ejemplo para tres unidades de celula; (B) una fabrication de litografia suave de este diseno con mecanizado laser de cuatro aberturas por unidad de cultivo. Este diseno esta unido a una microplaca con pocillos para recibir medio y celulas como se describe en el presente documento.
La FIG. 27 ilustra etapas de funcionamiento de un sistema menos automatizado o prototipo segun realizaciones espedficas de la invencion. La placa de 96 pocillos estandar permite que el sistema microflmdico funcione usando tecnicas y equipo convencionales. Por ejemplo, la dispensation de liquido se logra con mecanica de pipeta estandar, y el cultivo celular y analisis es compatible con estufas de incubacion y lectores de placas existentes. Puede usarse un sistema de carga de celulas construido a medida para cargar las celulas usando presion del aire como se ha descrito anteriormente. La configuration de cultivo de flujo accionado por gravedad utiliza la diferencia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de nivel de medio entre el pocillo de entrada y salida, ademas de manipular las resistencias flmdicas para lograr el caudal deseable en el regimen de nl/min. Esto proporciona la ventaja significativa de ser capaz de hacer circular "pasivamente" el medio de cultivo durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, hasta 4 d^as) sin el uso de bombas externas voluminosas.
TECNICAS DE FABRICACION
5. Ejemplo 1
La FIG. 30 es un diagrama de bloques que ilustra dos componentes de un proceso de moldeo suave directo. Los dos componentes ilustrados son: (1) Una pieza superior moldeada por inyeccion hecha de acrilico que contiene al menos marcas de alineamiento (para ensamblarse con el molde microfluidico) y estructuras de pocillo que cumplen generalmente con los formatos de placa de microtitulacion estandar (alternativamente, puede usarse una placa de pocillos estandar). (2) Un molde microfluidico fabricado usando tecnologias de semiconductor sobre una oblea de silicio de 6" (15,2 cm) que contiene las matrices de cultivo celular microfluidico hechas de epoxi o metales electrochapados, ademas de marcas de alineamiento de manera que las estructuras de pocillo se alineen con las estructuras microfluidicas durante el proceso de moldeo. Una pieza superior moldeada por inyeccion se hace de acrilico o cualquier material adecuado similar y contiene estructuras de pocillo que cumplen preferentemente con los formatos de placas de microtitulacion estandar como se tratara mas en el presente documento. A la derecha se muestra un molde microfluidico fabricado usando cualquier tecnologia de semiconductores y/o microfabricacion conocida sobre, por ejemplo, una oblea de 6" (15,2 cm) de silicio. El molde contiene una impresion de las matrices de cultivo celular microfluidico y puede incluir componentes hechos de epoxi o metales electrochapados, ademas de marcas de alineamiento de manera que las estructuras de pocillo se alineen con las estructuras microfluidicas durante el proceso de moldeo. Generalmente, antes del procesamiento adicional, el molde se recubre con fluoropolimero para reducir la friccion estatica del polimero blando al molde.
Debido a que la parte superior que contiene las estructuras de pocillo se moldea por inyeccion, el fondo de los pocillos puede ser plano, redondo o conico. Una caracteristica deseada particular es que el fondo de la parte superior, que cubre las estructuras microfluidicas, es tan plano como para ayudar practicamente al moldeo uniforme a traves de la matriz. Segun realizaciones especificas de la invencion, el fondo de la parte superior puede modificarse quimica o mecanicamente o de otro modo o imprimarse por un reactivo (tal como Silgard Primecoat) o una superficie abrasiva (arenado) o laser de manera que los polimeros blandos se adhieran al fondo de la parte superior despues del proceso de moldeo. Este tratamiento de la superficie se indica por la linea gruesa.
La FIG. 31B ilustra un ejemplo en el que una cantidad apropiada de polimero blando se vierte sobre el centro del molde (normalmente algunos mililitros, dependiendo del area que vaya a cubrirse, ademas del espesor del polimero blando despues del moldeo). La parte superior y el molde se intercalan entre dos piezas de superficies planas (normalmente placas de vidrio) con mecanismos de sujecion (en este caso, imanes).
La FIG. 31C ilustra un ejemplo en el que el mecanismo de sujecion mantiene la pieza superior y el molde juntos con marcas de alineamiento ajustadas entre si. El polimero blando se cura entonces, por ejemplo, por temperatura o luz UV o de otro modo de manera que la matriz de cultivo celular microfluidico se moldee fielmente sobre el polimero blando. Como un ejemplo, una temperatura elevada (normalmente 60 °C) durante al menos 2 horas.
La FIG. 31D ilustra un ejemplo en el que despues de desprender la matriz de cultivo celular microfluidico moldeada con la pieza superior, se usa un cortador laser para crear conexiones fluidicas entre las estructuras microfluidicas y los pocillos en localizaciones especificas (entradas/salidas de celulas/reactivos). La pieza superior circular se recorta a la forma rectangular en esta etapa (observese que en esta imagen la estructura esta invertida). Antes de encerrar el fondo de la matriz de cultivo celular microfluidico, la pieza moldeada se limpia ultrasonicamente para sacudir cualquier polvo creado por la etapa de corte laser. Puede recortarse una pieza superior a una forma rectangular en esta etapa. La seccion transversal mostrada es a traves de cada una de las conexiones fluidicas para fines de ilustracion, aunque el laser solo hace orificios en el material y no corta los pocillos. En este estado, antes de encerrar el fondo de la matriz de cultivo celular microfluidico, la pieza moldeada se limpia preferentemente ultrasonicamente o de otro modo para soplar cualquier polvo creado por la etapa de corte laser.
La FIG. 31E ilustra un ejemplo en el que la matriz de cultivo celular microfluidico se somete a tratamiento por plasma de oxigeno y esta unida a una pieza de vidrio rectangular.
La FIG. 31F ilustra un ejemplo en el que usando un dispensador de liquido, la matriz de cultivo celular microfluidico se llena con soluciones de imprimacion para mantener su quimica superficial modificada. Si parece que burbujas estan atrapadas dentro de la matriz, puede usarse colocacion en una camara de vacio para eliminar las burbujas.
La FIG. 31G ilustra un ejemplo en el que para prevenir la evaporacion de liquido, la matriz se sella con una cinta. La FIG. 31H ilustra un ejemplo en el que la matriz se ajusta en un marco de manera que la matriz acabada pueda tratarse como una placa de microtitulacion estandar con las dimensiones externas correctas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
6. Ejemplo 2
Las FIG. 32A-C ilustran tres componentes de un proceso de moldeo suave directo. En la figura, (A) muestra una pieza superior moldeada por inyeccion que incluye estructuras de pocillo que cumplen con formatos de placa de microtitulacion estandar. Como se trata anteriormente, en vez de la pieza superior moldeada por inyeccion mostrada, puede usarse una placa de microtitulacion estandar como parte superior que incluye estructuras de pocillo que cumplen con los formatos de placa de microtitulacion estandar, (B) Ilustra una hoja circular acrilica de 1,5 mm de espesor (6" (15,2 cm) de diametro), y (C) ilustra un molde microfluidico fabricado sobre una oblea de silicio de 6" (15,2 cm) que contiene unidades de cultivo celular microfluidico (en este ejemplo 8 x 4 unidades) en una matriz hecha de epoxi, silicio grabado o metales electrochapados, ademas de un espaciador para controlar el espesor minirno del polimero blando despues del moldeo. El molde esta recubierto con fluoropolimero para reducir la friccion estatica del polimero blando al molde. Como se muestra en la figura, el molde microfluidico esta pegado a un vidrio de sosa-cal de 1 mm de espesor (7" x 7" (17,8 x 17,8 cm)) con cuatro imanes (por ejemplo, 15 mm de diametro y 1,5 mm de espesor) pegados a las cuatro esquinas del vidrio. La otra pieza del vidrio de sosa-cal de 1 mm de espesor (7" x 7" (17,8 x 17,8 cm)) con imanes complementarios se prepara de modo similar (FIG. 32D) con los imanes de polaridad opuestos pegados sobre las cuatro esquinas de manera que los imanes se auto-alineen sobre los imanes en la FIG. 32C. Una cara de la hoja acrilica se modifica quimicamente por un reactivo (por ejemplo, Silgard Primecoat) para inducir la fuerte adhesion entre el acrilico y el polimero blando (por ejemplo, Silgard 184) que van a usarse durante el proceso de moldeo.
La FIG. 33A ilustra una etapa en la que una cantidad apropiada de polimero blando se vierte sobre el centro del molde (normalmente algunos mililitros, dependiendo del area que va a cubrirse, ademas del espesor del espaciador) Por ejemplo, para un molde de 6" (15,2 cm) de diametro y un espaciador de 150 micrometros, la cantidad minima requerida es n x 7,62 cm x 7,62 cm x 0,015 cm ~ 2,75 ml).
La FIG. 33B ilustra una etapa en la que la hoja acrilica se intercala entre dos piezas de las placas de vidrio de manera que los imanes presionen la hoja acrilica (con la superficie modificada por la imprimacion orientada hacia el molde) contra el molde hasta que la hoja acrilica choque con el espaciador. El polimero blando llenara entonces el espacio entre la hoja acrilica y el molde para repetir las estructuras microfluidicas. En realizaciones particulares, el mecanismo de sujecion asistido por iman mantiene las piezas juntas mientras que el polimero blando se cura a temperatura elevada (60 °C) durante al menos 2 horas.
Despues de enfriarse los compartimentos hasta aproximadamente temperatura ambiente, la hoja acrilica con el polimero blando se desprende del molde y una matriz de cultivo celular microfluidico como se describe en el presente documento se moldea fielmente sobre el polimero blando.
Para proteger la superficie del polimero blando de contaminaciones de los siguientes procesos, una cinta de proteccion de la superficie (por ejemplo, Ultron Blue Adhesive Plastic Film 80 micrometros) se aplica opcionalmente a la parte superior de la superficie del elastomero por un rodillo.
La FIG. 33D ilustra una etapa en la que se usa un cortador laser de CO2 (modelo VersaLaser, 25W) para crear conexiones fluidicas entre las estructuras microfluidicas y los pocillos moldeados por inyeccion (entrada de celulas y entrada de medio). Como el polimero blando usado en el proceso es permeable al gas, se cortan "orificios de aire" cerca de las areas de cultivo celular para promover la difusion de aire para el mejor cultivo celular. La pieza superior circular puede cortarse a la forma rectangular en esta etapa. Se quita la cinta de proteccion de la superficie y la matriz se limpia ultrasonicamente (o se limpia con chorro de agua) para sacudir cualquier polvo creado por la etapa de corte laser y opcionalmente se aplica una nueva cinta de proteccion de la superficie. En la FIG. 33E, la matriz de cultivo celular microfluidico se pega a la placa moldeada por inyeccion o una placa de pocillos estandar con un pegamento curable por ultravioleta (UV) que tambien es bio-compatible (Loctite 3301). La placa con la matriz de cultivo celular microfluidico se cura en una camara de UV durante 30 minutos. Despues de quitar la cinta de proteccion superficial, tanto un sustrato de vidrio (por ejemplo, White Float Glass) como la matriz de cultivo celular microfluidico se someten a tratamiento por plasma de oxigeno para activar la superficie. El sustrato de vidrio encierra la matriz de cultivo celular microfluidico mediante enlace covalente, como se muestra en la FIG. 33F. Usando un dispensador de liquido, la matriz de cultivo celular microfluidico se llena con soluciones de imprimacion como se muestra en la FIG. 33G. Debido a que pueden estar presentes burbujas dentro de la matriz; la matriz generalmente se pone dentro de una camara de vacio para la eliminacion de burbujas. La placa tambien puede colocarse dentro de una camara de UV/ozono (Novascan) para la esterilizacion. Para prevenir la evaporacion de liquido, la matriz se sella con una cinta (por ejemplo, Excel Scientific, AlumaSeal) como se muestra en la FIG. 33H.
SISTEMAS INTEGRADOS
Sistemas integrados para la recogida y analisis de datos celulares y otros datos, ademas de para la compilacion, almacenamiento y acceso a las bases de datos de la invencion, normalmente incluyen un ordenador digital con software que incluye un conjunto de instrucciones para la busqueda de secuencias y/o analisis, y, opcionalmente, uno o mas de software de control de muestras de alto rendimiento, software de analisis de imagenes, software de interpretacion de datos recogidos, un armazon de control robotico para transferir soluciones de una fuente a un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
destino (tal como un dispositivo de deteccion) unido funcionalmente al ordenador digital, un dispositivo de entrada (por ejemplo, un teclado de ordenador) para entrar los datos del sujeto al ordenador digital, o para controlar las funciones de analisis o transferencia de muestras de alta resolucion por el armazon de control robotico. Opcionalmente, el sistema integrado comprende ademas valvulas, gradientes de concentracion, multiplexores flmdicos y/u otras estructuras microfluidicas para conectarse con una microcamara, como se describe.
Pueden emplearse recursos de hardware computacional facilmente disponibles que usan sistemas funcionales estandar y modificarse segun las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, un PC (Intel x86 o Pentium chip-compatible DOS,™ OS2,™ WINDOWS,™ WINDOWS NT,™ WINDOWS95,™ WINDOWS98,™ LINUX, o incluso Macintosh, Sun o PCs seran suficientes) para su uso en los sistemas integrados de la invencion. La tecnica actual en la tecnologia de software es adecuada para permitir la implementacion de los metodos ensenados en el presente documento en un sistema de ordenador. Asi, en realizaciones especificas, la presente invencion puede comprender un conjunto de instrucciones logicas (instrucciones codificadas tanto por software como por hardware) para realizar uno o mas de los metodos que se ensenan en el presente documento. Por ejemplo, un experto puede construir el software para proporcionar los datos y/o el analisis estadistico, usando un lenguaje de programacion estandar tal como Visual Basic, Fortran, Basic, Java, o similares. Tal software tambien puede construirse utilizando una variedad de lenguajes de programacion estadistica, kit de herramientas, o bibliotecas.
La FIG. 34 muestra un aparato de information (o dispositivo digital) 700 que puede entenderse como un aparato logico que puede leer instrucciones de medios 717 y/o puerto de red 719, que puede opcionalmente conectarse a servidor 720 que tiene medios fijos 722. El aparato 700 puede usar a partir de aqui aquellas instrucciones para el servidor directo o logica de cliente, como se entiende en la materia, para incorporar aspectos de la invencion. Un tipo de aparato logico que puede incorporar la invencion es un sistema de ordenador como se ilustra en 700, que contiene CPU 707, dispositivos de entrada opcionales 709 y 711, unidades de disco 715 y monitor opcional 705. Los medios fijos 717, o medios fijos 722 mediante puerto 719, pueden usarse para programar un sistema tal y pueden representar un medio optico o magnetico tipo disco, cinta magnetica, memoria dinamica o estatica en estado solido, etc. En realizaciones especificas, la invencion puede incorporarse en parte como software grabado en estos medios fijos. El puerto de comunicacion 719 tambien puede usarse para recibir inicialmente instrucciones que se usan para programar un sistema tal y puede representar cualquier tipo de conexion de comunicacion.
Pueden usarse diversos metodos y algoritmos de programacion, que incluyen algoritmos geneticos y redes neurales, para realizar aspectos de la recogida de datos, correlation y funciones de almacenamiento, ademas de otras funciones deseables, como se describen en el presente documento. Ademas, los sistemas digitales o analogicos, tales como los sistemas de ordenador, digitales o analogicos, pueden controlar diversas otras funciones tales como la presentation y/o control de archivos de entrada y salida. El software para realizar los metodos de analisis electrico de la invencion tambien esta incluido en los sistemas de ordenador.
Otras realizaciones
Aunque la presente invencion se ha descrito en terminos de diversas realizaciones especificas, no se pretende que la invencion se limite a estas realizaciones. Para los expertos en la materia seran obvias las modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.
Se entiende que los ejemplos y las realizaciones que se describen en el presente documento son con fines ilustrativos y que a la luz de los mismos, seran sugeridos diversas modificaciones o cambios por las ensenanzas expuestas en el presente documento para personas expertas en la materia dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema de cultivo celular microflmdico integrado en una placa de pocillos estandar, comprendiendo el sistema de cultivo celular microflmdico:
    un reservorio de entrada de medio conectado flmdicamente a una pluralidad de canales de medio microflmdico; una pluralidad de areas de cultivo celular localizadas cada una en un extremo de un canal de cultivo celular; teniendo dicho canal de cultivo celular una abertura de entrada de celulas conectada fluidicamente a un reservorio de entrada de celulas / salida de medio para introducir celulas a dicha pluralidad de areas de cultivo celular y para retirar medio;
    un primer pocillo en comunicacion con el reservorio de entrada de medio que actua como una entrada de medio;
    un segundo pocillo en comunicacion con el reservorio de entrada de celulas / salida de medio que actua como una entrada de celulas / salida de medio;
    un tercer pocillo que actua como un pocillo de visualizacion para la pluralidad de areas de cultivo celular;
    una barrera de perfusion entre dichas areas de cultivo celular y dicha pluralidad de canales de medio microflmdico, conteniendo dicha barrera de perfusion una pluralidad de pasajes de perfusion; de forma que el fluido introducido en dicho reservorio de entrada de medio deba pasar a traves de dicha barrera de perfusion antes de llegar a dicho reservorio de entrada de celulas / salida de medio;
    en donde una pluralidad de dichos pasajes de perfusion son sustancialmente mas estrechos que las celulas que van a cultivarse.
  2. 2. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente la placa de pocillos estandar puede ser manipulada por equipo robotico que permite el cultivo celular automatizado y el analisis, siendo dicho equipo robotico en parte un equipo disenado para su uso con placas de pocillos estandar, siendo la placa de pocillos estandar ademas capaz de ser neumaticamente acoplada a un colector neumatico, proporcionando dicho colector presion neumatica para conducir las celulas a dichas areas de cultivo celular.
  3. 3. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente dichos canales de cultivo celular incluyen una primera porcion cerca de dicha entrada de celulas que contiene paredes de barreras solidas sin pasajes de perfusion, para prevenir asi la adhesion celular.
  4. 4. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente dichos canales de cultivo celular incluyen una primera porcion cerca de dicha entrada de celulas que contiene paredes de barreras solidas sin pasajes de perfusion, para prevenir asi la adhesion celular e incluyen una segunda porcion mas cerca a dicha entrada de celulas que dicha primera porcion, teniendo dicha segunda porcion una pluralidad de pasajes de perfusion para facilitar el flujo de medio fuera de dicha region de cultivo celular.
  5. 5. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente:
    dichas areas de cultivo celular estan separadas en al menos tres bloques, conteniendo cada bloque al menos dos areas de cultivo celular; teniendo cada bloque un canal de aire adyacente al mismo.
  6. 6. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente:
    el dispositivo esta configurado de tal manera que las celulas son introducidas en dichas areas de cultivo celular usando presion neumatica y, a continuation, las celulas son mantenidas mediante perfusion de medio usando un flujo de fluidos pasivo accionado por gravedad.
  7. 7. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende:
    una abertura fluidica grande conectada directamente a dichos canales de cultivo celular para permitir un flujo de celulas mas facil.
  8. 8. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende:
    un multiplexor fluidico que conecta dicho reservorio de entrada de medio a dichos canales de medio microflmdico;
    y en el que, adicionalmente, una pluralidad de dichos canales de cultivo celular comprenden un area de cultivo celular con pasajes de perfusion hacia dichos canales de medio y una porcion de canal de celulas sin perfusion para localizar mejor las celulas introducidas a presion neumatica y una porcion de salida con pasajes de perfusion cerca de una entrada de dicho canal de cultivo celular.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  9. 9. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que adicionalmente:
    dichas areas de cultivo celular son areas alargadas mimeticas de un sinusoide hepatico; dichas areas de cultivo celular se cargan con celulas procedentes de dicho reservorio de entrada de celulas; despues de la carga y la sedimentacion de las celulas, el medio se carga desde dicha entrada de medio y se retira de dicho reservorio de entrada de celulas / salida de medio.
  10. 10. Un metodo de cultivo de celulas usando el sistema de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
    poner las celulas en un pocillo de una placa de pocillos estandar, estando dicho pocillo reservorio de entrada de celulas / salida de medio;
    poner medio en un pocillo diferente de dicha placa de pocillos estandar, estando comunicacion con el reservorio de entrada de medio; permitir que dichas celulas se cultiven durante un tiempo apropiado; observar y/o ensayar las celulas y o los medios en dicha placa de pocillos estandar.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 10 que adicionalmente comprende:
    conectar dicha placa de pocillos estandar con un colector neumatico para proporcionar presion de aire para conducir dichas celulas a dichas areas de cultivo celular, proporcionando dicho colector neumatico suficiente presion para formar agregados de celulas en dichas areas de cultivo celular.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11 en el que adicionalmente dicho colector neumatico conecta con dicha placa de pocillos usando una junta de vacio.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 11 que adicionalmente comprende:
    usar una pipeta para introducir y/o retirar fluidos de dichos reservorios, perfundiendo dichos fluidos pasivamente a traves de dichas areas de cultivo celular como resultado de la gravedad y/o de niveles de fluido diferenciales; y o de tensiones superficiales.
  14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que adicionalmente dichas etapas se realizan mediante un equipo robotico completamente automatizado y en el que, adicionalmente, dicha combinacion de carga de celulas neumatica y de perfusion pasiva permite el cultivo automatico simultaneo de un gran numero de placas usando un colector neumatico y un pipeteador automatizado debido a que las placas no necesitan unirse a ningun equipo durante el flujo de fluidos de perfusion.
    en comunicacion con el dicho dicho pocillo en
ES09701350.2T 2008-01-03 2009-01-05 Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento Active ES2609239T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1888208P 2008-01-03 2008-01-03
US18882P 2008-01-03
US3729708P 2008-03-17 2008-03-17
US37297P 2008-03-17
PCT/US2009/030168 WO2009089189A2 (en) 2008-01-03 2009-01-05 Cell culture array system for automated assays and methods of operation and manufacture thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2609239T3 true ES2609239T3 (es) 2017-04-19

Family

ID=40853733

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16185733T Active ES2882661T3 (es) 2008-01-03 2009-01-05 Sistema de matriz de cultivo celular para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento y de fabricación del mismo
ES09701350.2T Active ES2609239T3 (es) 2008-01-03 2009-01-05 Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16185733T Active ES2882661T3 (es) 2008-01-03 2009-01-05 Sistema de matriz de cultivo celular para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento y de fabricación del mismo

Country Status (4)

Country Link
US (2) US9376658B2 (es)
EP (2) EP3173787B1 (es)
ES (2) ES2882661T3 (es)
WO (1) WO2009089189A2 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9388374B2 (en) 2005-07-07 2016-07-12 Emd Millipore Corporation Microfluidic cell culture systems
US8257964B2 (en) 2006-01-04 2012-09-04 Cell ASIC Microwell cell-culture device and fabrication method
ES2865180T3 (es) 2005-07-07 2021-10-15 Univ California Aparato para formación de cultivo celular
US9637715B2 (en) * 2005-07-07 2017-05-02 Emd Millipore Corporation Cell culture and invasion assay method and system
US9354156B2 (en) 2007-02-08 2016-05-31 Emd Millipore Corporation Microfluidic particle analysis method, device and system
JP5244801B2 (ja) * 2006-09-22 2013-07-24 アーエルエス アウトメーテッド ラブ ソルーションズ ゲーエムベーハー 細胞及び／又は細胞コロニーの自動化した除去のための方法及び装置
EP3173787B1 (en) 2008-01-03 2021-06-02 EMD Millipore Corporation Cell culture array system for automated assays and methods of operation and manufacture thereof
ES2672201T3 (es) 2008-07-16 2018-06-13 Children's Medical Center Corporation Dispositivo de imitación de órganos con microcanales y métodos de uso
US20110004304A1 (en) * 2009-03-20 2011-01-06 Tao Sarah L Culturing retinal cells and tissues
US9353342B2 (en) 2010-01-21 2016-05-31 Emd Millipore Corporation Cell culture and gradient migration assay methods and devices
US9261496B2 (en) 2010-09-29 2016-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Device for high throughput investigations of multi-cellular interactions
US10114020B2 (en) * 2010-10-11 2018-10-30 Mbio Diagnostics, Inc. System and device for analyzing a fluidic sample
US10526572B2 (en) 2011-04-01 2020-01-07 EMD Millipore Corporaticn Cell culture and invasion assay method and system
JP6232383B2 (ja) 2011-12-03 2017-11-15 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン マイクロ流体の細胞培養のためのマイクロインキュベーションシステムおよび方法
WO2013086486A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
US9739714B2 (en) 2012-10-29 2017-08-22 Mbio Diagnostics, Inc. Particle identification system, cartridge and associated methods
US9932550B2 (en) 2012-11-27 2018-04-03 Cfd Research Corporation Multi-chambered cell culture device to model organ microphysiology
CN105164246B (zh) 2013-03-15 2018-09-25 富鲁达公司 用于分析定义的多细胞组合的方法和设备
WO2015006751A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for cell culture device interconnection and fluidic device interconnection
WO2016149661A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Massively parallel on-chip coalescence of microemulsions
US11674952B2 (en) 2016-02-24 2023-06-13 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for Huntington's Disease and uses thereof
WO2017181258A1 (en) * 2016-04-21 2017-10-26 Duane Hewitt Continuous flow system
CA3045155C (en) * 2017-01-19 2022-11-22 Essen Instruments, Inc. D/B/A Essen Bioscience, Inc. Methods and apparatus for perfusion and environmental control of microplate labware
WO2019040423A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Northwestern University MULTIPLE ROOM FLUID PLATFORM
US11911764B2 (en) 2018-02-21 2024-02-27 Nexcelom Bioscience Llc System and method for cell imaging, analysis and measurement
US10775395B2 (en) * 2018-10-18 2020-09-15 Arctoris Limited System and method of performing a biological experiment with adaptive cybernetic control of procedural conditions
US11273445B2 (en) * 2018-11-05 2022-03-15 Daegu Gyeongbuk Institute Of Science And Technology Biomimetic chip device
FR3094012B1 (fr) 2019-03-20 2022-08-12 Cherry Biotech Sas Procédé d'enrichissement en gaz et simultanément de déplacement d’un fluide et dispositif pour le contrôle de l'environnement cellulaire sur une plaque de culture cellulaire multipuits correspondant.
CN110729200A (zh) * 2019-09-24 2020-01-24 杭州臻镭微波技术有限公司 一种控制散热器流量的三维异构模组制作方法
US11807842B2 (en) * 2019-09-30 2023-11-07 Biopico Systems Inc Fluidic array systems and testing for cells, organoids, and organ cultures
EP4051777A4 (en) * 2019-10-30 2024-06-12 Agilent Technologies, Inc. METHOD AND APPARATUS FOR WELL PLATES FOR CELL CULTURE
EP3907275A1 (en) 2020-05-08 2021-11-10 Technische Universität Wien Microfluidic device
WO2022155257A1 (en) * 2021-01-12 2022-07-21 Berkeley Lights, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cellular therapeutics manufacture
CN112938465A (zh) * 2021-01-21 2021-06-11 珠海市运泰利自动化设备有限公司 保压上下料系统的控制方法
US20230095466A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 3D Systems, Inc. Manifolds, systems and methods for conducting biological studies under flow

Family Cites Families (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1985708A (en) 1932-08-02 1934-12-25 Oscar U Zerk Shackle mechanism
US3915679A (en) 1973-04-16 1975-10-28 Pall Corp Vortex air cleaner array
US4055613A (en) 1974-10-23 1977-10-25 Akrosil Corporation Production of three-dimensional designs
GB1539263A (en) 1976-11-19 1979-01-31 Toray Industries Apparatus and methods for growing cells
DE3409501A1 (de) 1984-03-15 1985-10-24 Sandoz-Patent-GmbH, 7850 Lörrach Verfahren zur kultivierung von zellen
US4748124A (en) 1984-10-30 1988-05-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized cell-culture device and method
US4661455A (en) 1986-01-16 1987-04-28 Dorr-Oliver Incorporated Membrane cell culturing device
US4734373A (en) 1986-06-24 1988-03-29 Bartal Arie H Apparatus for enhancing cell growth, preservation and transport
US5786215A (en) 1987-05-20 1998-07-28 Baxter International Inc. Method for culturing animal cells
US5153131A (en) 1990-12-11 1992-10-06 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration High aspect reactor vessel and method of use
US5416022A (en) 1988-08-10 1995-05-16 Cellex Biosciences, Inc. Cell culture apparatus
US5079168A (en) 1988-08-10 1992-01-07 Endotronics, Inc. Cell culture apparatus
EP0402718B1 (en) 1989-06-03 1994-11-02 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Control of cell arrangement
FR2660323B1 (fr) 1990-03-30 1992-07-24 Bertin & Cie Dispositif de culture cellulaire.
SE470347B (sv) 1990-05-10 1994-01-31 Pharmacia Lkb Biotech Mikrostruktur för vätskeflödessystem och förfarande för tillverkning av ett sådant system
US5310676A (en) 1991-11-15 1994-05-10 A/S Nunc Cell cultivating device
DE4206585C2 (de) 1992-03-03 1994-11-24 Augustinus Dr Med Bader Vorrichtung zur Massenkultur von Zellen
US5637469A (en) * 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems
US5330908A (en) 1992-12-23 1994-07-19 The United States Of America As Represented By The Administrator, National Aeronautics And Space Administration High density cell culture system
US5424209A (en) 1993-03-19 1995-06-13 Kearney; George P. Automated cell culture and testing system
US5462874A (en) 1993-06-23 1995-10-31 Wolf; Martin L. Dialyzed multiple well tissue culture plate
US5686301A (en) 1993-09-02 1997-11-11 Heraeus Instruments Gmbh Culture vessel for cell cultures
US5702941A (en) 1993-09-09 1997-12-30 Synthecon, Inc. Gas permeable bioreactor and method of use
US5763279A (en) 1993-09-09 1998-06-09 Synthecon, Inc. Gas permeable bioreactor and method of use
US5437998A (en) 1993-09-09 1995-08-01 Synthecon, Inc. Gas permeable bioreactor and method of use
US5451524A (en) 1994-02-01 1995-09-19 The Gillette Company In vitro chamber for human organ tissue samples
US5882918A (en) 1995-08-08 1999-03-16 Genespan Corporation Cell culture incubator
US5793440A (en) 1994-03-18 1998-08-11 Sony Corporation Key signal processing apparatus for video signal processing
US5565353A (en) 1994-06-22 1996-10-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Perfusable culture device
US5714384A (en) 1994-06-28 1998-02-03 Wilson; John R. Compartmentalized tissue culture bag
US5693537A (en) 1994-06-28 1997-12-02 Wilson; John R. Compartmentalized tissue culture flask
GB9413029D0 (en) 1994-06-29 1994-08-17 Common Services Agency Stem cell immobilisation
US6297046B1 (en) 1994-10-28 2001-10-02 Baxter International Inc. Multilayer gas-permeable container for the culture of adherent and non-adherent cells
DE19537774C2 (de) 1994-11-18 1996-09-19 Heraeus Instr Gmbh Verfahren zur Zellkultivierung und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
US5641644A (en) 1994-12-09 1997-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for the precise positioning of cells
EP0725134A3 (en) 1995-02-03 1998-05-13 NPBI Nederlands Produktielaboratorium voor Bloedtransfusieapparatuur en Infusievloeistoffen B.V. Flexible bioreactor for therapeutic cells
CA2175626C (en) 1995-05-18 1999-08-03 Timothy A. Stevens Tissue culture flask
US6228635B1 (en) 1995-06-07 2001-05-08 Aastrom Bioscience, Inc. Portable cell growth cassette for use in maintaining and growing biological cells
US6238908B1 (en) 1995-06-07 2001-05-29 Aastrom Biosciences, Inc. Apparatus and method for maintaining and growth biological cells
US6096532A (en) 1995-06-07 2000-08-01 Aastrom Biosciences, Inc. Processor apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5602028A (en) 1995-06-30 1997-02-11 The University Of British Columbia System for growing multi-layered cell cultures
US5627070A (en) 1995-07-26 1997-05-06 Celltherapy, Inc. Cell growing device for in vitro cell population expansion
US5686304A (en) 1995-12-15 1997-11-11 Avecor Cardiovascular, Inc. Cell culture apparatus and method
EP0885395B1 (de) 1996-03-05 2001-07-11 Syngenta Participations AG Testsystem für chemische stoffe oder stoffgemische
US5942443A (en) * 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
WO1998000231A1 (en) * 1996-06-28 1998-01-08 Caliper Technologies Corporation High-throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US6039897A (en) 1996-08-28 2000-03-21 University Of Washington Multiple patterned structures on a single substrate fabricated by elastomeric micro-molding techniques
US5801054A (en) 1996-09-19 1998-09-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Cell culture vessel with self-maintained atmosphere
KR100351531B1 (ko) * 1997-04-25 2002-09-11 캘리퍼 테크놀로지스 코포레이션 기하형상이 개선된 채널을 채용하는 미소 유체 장치
US5932315A (en) 1997-04-30 1999-08-03 Hewlett-Packard Company Microfluidic structure assembly with mating microfeatures
DE19719751A1 (de) 1997-05-10 1998-11-12 Augustinus Dr Med Bader Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen
US6548263B1 (en) 1997-05-29 2003-04-15 Cellomics, Inc. Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening
US7160687B1 (en) 1997-05-29 2007-01-09 Cellomics, Inc. Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening
US6107085A (en) 1997-07-11 2000-08-22 Corning Incorporated Self contained cell growth system
JP3761676B2 (ja) 1997-07-11 2006-03-29 株式会社メニコン 細胞培養用容器
US5876675A (en) * 1997-08-05 1999-03-02 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems
US6190913B1 (en) 1997-08-12 2001-02-20 Vijay Singh Method for culturing cells using wave-induced agitation
US6794184B1 (en) 1998-01-19 2004-09-21 Ulrich Mohr Culturing device and method for culturing cells or tissue components
US6167910B1 (en) * 1998-01-20 2001-01-02 Caliper Technologies Corp. Multi-layer microfluidic devices
US6857449B1 (en) * 1998-01-20 2005-02-22 Caliper Life Sciences, Inc. Multi-layer microfluidic devices
US6251343B1 (en) * 1998-02-24 2001-06-26 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems incorporating cover layers
US6756019B1 (en) * 1998-02-24 2004-06-29 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems incorporating cover layers
DE69903800T2 (de) 1998-03-18 2003-10-02 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Vaskularisierte perfundierte anordnungen für mikrogewebe und mikroorgane
US20040202579A1 (en) 1998-05-08 2004-10-14 Anders Larsson Microfluidic device
US6518035B1 (en) 1998-06-02 2003-02-11 Rosetta Inpharmatics, Inc. Targeted methods of drug screening using co-culture methods
US7155344B1 (en) * 1998-07-27 2006-12-26 Caliper Life Sciences, Inc. Distributed database for analytical instruments
GB9817995D0 (en) * 1998-08-19 1998-10-14 Griffith John D A surgical sewing device
DE69907249T2 (de) 1998-10-08 2004-01-29 Astrazeneca Ab Mikrofabrizierter zellinjektor
US6637463B1 (en) * 1998-10-13 2003-10-28 Biomicro Systems, Inc. Multi-channel microfluidic system design with balanced fluid flow distribution
GB9912641D0 (en) 1999-05-28 1999-07-28 Ashby Scient Ltd Textured and porous silicone rubber
US6548299B1 (en) 1999-11-12 2003-04-15 Mark J. Pykett Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
US6632655B1 (en) 1999-02-23 2003-10-14 Caliper Technologies Corp. Manipulation of microparticles in microfluidic systems
US6585939B1 (en) 1999-02-26 2003-07-01 Orchid Biosciences, Inc. Microstructures for use in biological assays and reactions
US6455310B1 (en) 1999-03-23 2002-09-24 Biocrystal Ltd. Cell culture apparatus and method for culturing cells
US6410309B1 (en) 1999-03-23 2002-06-25 Biocrystal Ltd Cell culture apparatus and methods of use
GB9907665D0 (en) 1999-04-01 1999-05-26 Cambridge Molecular Tech Fluidic devices
MXPA01013423A (es) 1999-06-21 2002-12-05 Gen Hospital Corp Sistemas de cultivo celular y metodos para dispositivos auxiliares del organo.
WO2000078920A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 The General Hospital Corporation Methods and devices for cell culturing and organ assist systems
TWI233449B (en) 1999-07-01 2005-06-01 Ind Tech Res Inst High efficient cell-cultivating device
US6495104B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-17 Caliper Technologies Corp. Indicator components for microfluidic systems
US6837985B2 (en) 1999-09-20 2005-01-04 Aeromet Technologies, Inc. External counter electrode
DE19947496C2 (de) 1999-10-01 2003-05-22 Agilent Technologies Inc Mikrofluidischer Mikrochip
DE19948087B4 (de) 1999-10-06 2008-04-17 Evotec Ag Verfahren zur Herstellung eines Reaktionssubstrats
FR2803852B1 (fr) 2000-01-17 2004-11-05 Farzin Sarem Dispositif de culture cellulaire et tissulaire a circulation de fluide de culture controlee
DE60132185T2 (de) * 2000-02-23 2009-01-02 Caliper Life Sciences, Inc., Mountain View Mehrfach-reservoir-drucksteuersystem
US6593136B1 (en) 2000-03-20 2003-07-15 Geo-Centers, Inc. Culturing cells in a chamber in a stack of chambers
US7867763B2 (en) * 2004-01-25 2011-01-11 Fluidigm Corporation Integrated chip carriers with thermocycler interfaces and methods of using the same
US7323143B2 (en) 2000-05-25 2008-01-29 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic systems including three-dimensionally arrayed channel networks
US6569675B2 (en) 2000-06-16 2003-05-27 Corning Incorporated Cell cultivating flask and method for using the cell cultivating flask
DE60013585T2 (de) 2000-07-19 2005-09-15 Technodop Ltd. (Société de Droit Irlandais) Kulturraum und Bioreaktor zur ausserkörperlichen Tierzellenkultur
JP4273643B2 (ja) 2000-08-08 2009-06-03 味の素株式会社 好気性培養における培養装置及び消泡制御方法
DE10046175A1 (de) 2000-09-19 2002-03-28 Augustinus Bader Verfahren und Vorrichtung zum Züchten und/oder Behandeln von Zellen
US20020039785A1 (en) 2000-10-04 2002-04-04 Schroeder Kirk S. Cell-culture vessel
WO2002028532A2 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Protasis Corporation Microfluidic substrate assembly and method for making same
US7514046B2 (en) * 2000-10-31 2009-04-07 Caliper Life Sciences, Inc. Methods and systems for processing microscale devices for reuse
US7211209B2 (en) 2000-11-08 2007-05-01 Surface Logix, Inc. Method of making device for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time
US6653124B1 (en) 2000-11-10 2003-11-25 Cytoplex Biosciences Inc. Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation
US6555365B2 (en) 2000-12-07 2003-04-29 Biocrystal, Ltd. Microincubator comprising a cell culture apparatus and a transparent heater
US20020108860A1 (en) * 2001-01-15 2002-08-15 Staats Sau Lan Tang Fabrication of polymeric microfluidic devices
US6403369B1 (en) 2001-01-19 2002-06-11 Gary W. Wood Cell culture vessel
US20020110905A1 (en) 2001-02-15 2002-08-15 Emilio Barbera-Guillem Perfusion system for cultured cells
EP1248108B1 (en) 2001-03-29 2011-08-31 Canon Kabushiki Kaisha method of cellular screening and substrates suitable for it
US6960437B2 (en) * 2001-04-06 2005-11-01 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
US6811752B2 (en) 2001-05-15 2004-11-02 Biocrystal, Ltd. Device having microchambers and microfluidics
DE60125598T2 (de) 2001-06-08 2007-10-04 Centre National De La Recherche Scientifique Methode zur herstellung einer mikroflüssigkeitsstruktur, insbesondere eines "biochips", und damit erzeugte struktur
US6670171B2 (en) 2001-07-09 2003-12-30 Wheaton Usa, Inc. Disposable vessel
US6673595B2 (en) 2001-08-27 2004-01-06 Biocrystal, Ltd Automated cell management system for growth and manipulation of cultured cells
AU2002360499A1 (en) 2001-12-05 2003-06-17 University Of Washington Microfluidic device and surface decoration process for solid phase affinity binding assays
EP1465979A4 (en) 2001-12-21 2007-11-14 Organogenesis Inc CHAMBER WITH ADJUSTABLE VOLUME FOR CELL CULTURE AND ORGAN SUPPORT
US7033823B2 (en) 2002-01-31 2006-04-25 Cesco Bioengineering, Inc. Cell-cultivating device
US20030215941A1 (en) 2002-03-12 2003-11-20 Stewart Campbell Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
US7223371B2 (en) 2002-03-14 2007-05-29 Micronics, Inc. Microfluidic channel network device
AU2003216002A1 (en) 2002-03-31 2003-10-13 Gyros Ab Efficient mmicrofluidic devices
CA2480728A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
US7312085B2 (en) 2002-04-01 2007-12-25 Fluidigm Corporation Microfluidic particle-analysis systems
WO2003085080A1 (en) 2002-04-04 2003-10-16 Corebiotech Co., Ltd. Cell culture plate and system using the same
US20060199260A1 (en) * 2002-05-01 2006-09-07 Zhiyu Zhang Microbioreactor for continuous cell culture
US7229820B2 (en) 2002-06-13 2007-06-12 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Apparatus and method for culturing and preserving tissue constructs
WO2004006840A2 (en) 2002-07-12 2004-01-22 The Regents Of The University Of California Three dimensional cell patterned bioploymer scaffolds and method of making the same
US20040029266A1 (en) 2002-08-09 2004-02-12 Emilio Barbera-Guillem Cell and tissue culture device
US8129179B2 (en) * 2002-08-27 2012-03-06 Vanderbilt University Bioreactors with an array of chambers and a common feed line
US7790443B2 (en) * 2002-08-27 2010-09-07 Vanderbilt University Bioreactors with substance injection capacity
AU2003275140A1 (en) 2002-09-23 2004-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Theree-dimensional construct for the design and fabrication of physiological fluidic networks
US8220494B2 (en) 2002-09-25 2012-07-17 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
US7141386B2 (en) 2002-10-31 2006-11-28 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Cell culture device
AU2003291093A1 (en) 2002-11-19 2004-06-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multilayered microcultures
US20050266582A1 (en) 2002-12-16 2005-12-01 Modlin Douglas N Microfluidic system with integrated permeable membrane
WO2004059299A1 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Cytodiscovery, Inc. Microfluidic system with integrated permeable membrane
US7416884B2 (en) 2003-02-26 2008-08-26 Georgia Tech Research Corporation Bioreactor and methods for tissue growth and conditioning
EP1624054A4 (en) 2003-05-14 2007-05-30 Japan Tissue Eng Co Ltd CELL CULTURE PROCESS AND CULTURE PRODUCED TISSUE
KR20060036908A (ko) 2003-05-22 2006-05-02 폴 코포레이션 세포 배양 장치 및 시스템
US6969166B2 (en) 2003-05-29 2005-11-29 3M Innovative Properties Company Method for modifying the surface of a substrate
US20050032208A1 (en) 2003-06-18 2005-02-10 Oh Steve Kah Weng Materials and methods to produce stem cells
GB0321158D0 (en) * 2003-09-10 2003-10-08 Central Research Lab Ltd Apparatus and method for handling cells,embryos or oocytes
EP3943591A1 (en) 2003-10-08 2022-01-26 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Cell culture methods and devices utilizing gas permeable materials
US7799560B2 (en) 2003-11-10 2010-09-21 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Compartmentalized device for cell culture, cell processing, and sample dialysis
EP1702052A4 (en) * 2003-12-19 2009-02-18 Univ Waterloo CELL CELL AND METHOD AND APPARATUS FOR CELL CULTURE
CA2852122A1 (en) 2004-01-02 2005-07-28 Advanced Cell Technology, Inc. Novel culture systems for ex vivo development
JP2007537759A (ja) 2004-05-19 2007-12-27 マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー 灌流三次元細胞／組織疾患モデル
EP1815244A4 (en) * 2004-11-11 2009-07-22 Agency Science Tech & Res DEVICE FOR CULTURING CELLS
US7022518B1 (en) 2005-01-31 2006-04-04 Glen Feye Apparatus and method for co-culturing of cells
CN101208422A (zh) 2005-02-23 2008-06-25 威廉·A·库克澳大利亚股份有限公司 培养装置
ES2865180T3 (es) * 2005-07-07 2021-10-15 Univ California Aparato para formación de cultivo celular
US9637715B2 (en) * 2005-07-07 2017-05-02 Emd Millipore Corporation Cell culture and invasion assay method and system
US9354156B2 (en) 2007-02-08 2016-05-31 Emd Millipore Corporation Microfluidic particle analysis method, device and system
US9388374B2 (en) * 2005-07-07 2016-07-12 Emd Millipore Corporation Microfluidic cell culture systems
US8257964B2 (en) * 2006-01-04 2012-09-04 Cell ASIC Microwell cell-culture device and fabrication method
US7855070B2 (en) * 2005-07-08 2010-12-21 Georgia Tech Research Corporation Centimeter-scale, integrated diagnostics incubator for biological culturing
US7195934B2 (en) 2005-07-11 2007-03-27 Applied Materials, Inc. Method and system for deposition tuning in an epitaxial film growth apparatus
US7745209B2 (en) 2005-07-26 2010-06-29 Corning Incorporated Multilayered cell culture apparatus
US20070090166A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Shuichi Takayama Microfluidic cell culture device
US20070084706A1 (en) 2005-10-18 2007-04-19 Shuichi Takayama Microfluidic cell culture device and method for using same
US20080038713A1 (en) 2005-11-02 2008-02-14 Affymetrix, Inc. System and Method for Biological Assay
ES2393758T3 (es) 2006-03-15 2012-12-27 Micronics, Inc. Ensayos integrados de ácidos nucleicos
US8293524B2 (en) 2006-03-31 2012-10-23 Fluxion Biosciences Inc. Methods and apparatus for the manipulation of particle suspensions and testing thereof
US20100151571A1 (en) 2006-07-07 2010-06-17 Georgia Tech Research Corporation Centimeter-scale, integrated diagnostics incubator for biological culturing
US9023642B2 (en) 2006-07-07 2015-05-05 The University Of Houston System Method and apparatus for a miniature bioreactor system for long-term cell culture
EP2092052B1 (en) 2006-12-07 2020-09-23 Wilson Wolf Manufacturing Corporation Highly efficient gas permeable devices for culturing cells
US8377685B2 (en) * 2007-11-07 2013-02-19 Bellbrook Labs, Llc Microfluidic device having stable static gradient for analyzing chemotaxis
EP3173787B1 (en) 2008-01-03 2021-06-02 EMD Millipore Corporation Cell culture array system for automated assays and methods of operation and manufacture thereof
US8921122B2 (en) 2008-02-11 2014-12-30 The General Hospital Corporation System and method for quantitative assessment of biological migration behavior
US9157550B2 (en) 2009-01-05 2015-10-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microfluidic systems and methods
US8368882B2 (en) 2009-01-30 2013-02-05 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for detecting a signal and applying thermal energy to a signal transmission element
KR20120051709A (ko) 2009-07-21 2012-05-22 인터젠엑스 인크. 미세유체 장치 및 이의 용도
US9353342B2 (en) * 2010-01-21 2016-05-31 Emd Millipore Corporation Cell culture and gradient migration assay methods and devices
CN201803927U (zh) 2010-05-06 2011-04-20 重庆医科大学 用于检测细胞迁移的琼脂糖凝胶微流动腔装置
WO2012024646A2 (en) 2010-08-19 2012-02-23 The Johns Hopkins University Cell culture system and method of use thereof
US9261496B2 (en) 2010-09-29 2016-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Device for high throughput investigations of multi-cellular interactions
US10526572B2 (en) 2011-04-01 2020-01-07 EMD Millipore Corporaticn Cell culture and invasion assay method and system
JP6232383B2 (ja) * 2011-12-03 2017-11-15 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン マイクロ流体の細胞培養のためのマイクロインキュベーションシステムおよび方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2882661T3 (es) 2021-12-02
EP3173787A1 (en) 2017-05-31
EP2245453A2 (en) 2010-11-03
US9376658B2 (en) 2016-06-28
US20090203126A1 (en) 2009-08-13
EP2245453B1 (en) 2016-10-05
EP2245453A4 (en) 2013-11-20
WO2009089189A3 (en) 2009-09-24
US20160289623A1 (en) 2016-10-06
WO2009089189A2 (en) 2009-07-16
EP3173787B1 (en) 2021-06-02
US10138453B2 (en) 2018-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2609239T3 (es) Sistema de matriz de cultivo celular microfluídico para ensayos automatizados y métodos de funcionamiento
US9388374B2 (en) Microfluidic cell culture systems
US11034925B2 (en) Cell culture and invasion assay method and system
US9637715B2 (en) Cell culture and invasion assay method and system
US10190085B2 (en) Micro-incubation systems for microfluidic cell culture and methods
Bruzewicz et al. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip
US8617879B2 (en) Apparatus for cell or tissue culture
JP5490803B2 (ja) 懸滴プレートおよび同懸滴プレートを使用する方法
US11149242B2 (en) Methods and apparatus for perfusion and environment control of microplate lab ware
US20140363838A1 (en) Microperfusion imaging platform
JP2020513763A5 (es)