KR20120051709A - 미세유체 장치 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이크로칩이 카트리지 및 공압 매니폴드에 접하도록 하는 장치 및 방법을 제공한다. 카트리지, 마이크로칩 및 공압 매니폴드의 설계는 마이크로칩 내에 마이크로칩과 카트리지 또는 챔버 사이에 형성된 챔버 내에 자기 비드를 포획하기 위한 자력의 사용을 허용할 수 있다. mRNA 증폭 및 정제에 본 발명의 장치를 사용할 수 있다.
Description
상호 참조
본 출원은 2009년 7월 21일자에 출원된 미국 가출원 제61/227호의 출원일의 이익을 청구한다.
공동 개발의 성명
본 발명은 IntegenX, Inc.와 삼성 전자(Samsung Electronic Co., Ltd.) 사이의 합동 연구 계약에 따라 이루어졌다.
칩 상에서 분자 생물학 프로토콜을 수행하기 위한 미세유체 플랫폼이 개발되었다. 통상적으로, 미세유체 플랫폼은 경질 물질에 의한 종래 리소그래피를 이용하고 동전기적 또는 압력 기반 유체 수송에 의존하며, 이둘 둘 다 극도로 제한된 온-칩 밸빙 밸빙 및 펌핑 옵션을 제어하고 제공하기 어렵다. 다른 플랫폼은 흡수, 증발 및 화학 상용성과 관련된 문제점에 의해 성가신 소프트 리소그래피 방법을 이용한다.
따라서, 미세유체 장치에서 샘플 도입, 제조 가공 및 분석 역량의 효과적인 통합을 허용하기 위한 밸브, 펌프, 라우터, 반응기 등과 같은 미세유체 제어 메커니즘을 수행하기 위한 개선된 방법 및 장치를 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명은 카트리지; 카트리지와 유체로 접속되는, 하나 이상의 미세유체 다이어프램 밸브를 갖는 미세유체 칩; 및 지지 구조물, 카트리지와 열 접촉하는 하나 이상의 온도 제어 장치 및 미세유체 칩을 공압식으로 작동시키기 위한 공압 라인을 포함하는 기부를 포함하는 장치를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 기부는 지지 구조물 내에 위치하는 공압 플로터를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 공압 플로터가 공압 플로터를 미세유체 칩 쪽으로 누르는 스프링에 의해 지지된다. 공압 플로터가 공압 플로터와 미세유체 칩 사이의 기밀 시일을 가능하게 하는 스프링에 의해 지지된다. 몇몇 실시양태에서, 지지 구조물은 강성이다. 기부는 카트리지와 유체로 접속되는 공압 삽입물을 더 포함한다. 몇몇 경우에, 카트리지는 서미스터를 포함한다. 카트리지가 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성될 수 있다. 카트리지는 사출 성형될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 지지 구조물은 히트 싱크이다.
다른 실시양태에서, 상기 장치는 기부 상에 탑재된 공압 매니폴드를 더 포함하고, 공압 매니폴드는 압력 또는 진공을 미세유체 칩에 전달하여 다이어프램 밸브를 작동시키기 위해 미세유체 칩 상에 공압 라인 및 공압 포트와 공압 연통하는 바이어 또는 채널을 포함하고, 공압 매니폴드는 칩을 체결하여 온도 제어 장치가 또한 카트리지와 열 접촉되도록 바이어스 배치로 지지체 상에 탑재된다.
본 발명은 하나 이상의 공압식으로 작동되는 밸브 및 하나 이상의 챔버를 갖는 미세유체 칩; 및 챔버와 유체로 접속되는 하나 이상의 저장소를 포함하고 상기 저장소는 물질이 챔버로 직접 피펫팅될 수 있도록 크기로 되어 있는 카트리지를 포함하는 장치를 제공한다.
참조문헌에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모두 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 포함된 것으로 표시된 바와 동일한 정도로 참조문헌으로 본원에 포함된다.
본 발명의 새로운 특징을 특히 특허청구범위에 의해 기재한다. 본 발명의 원칙이 이용된 예시적인 실시양태가 기재된 하기 상세한 설명 및 도면을 참조하여 본 발명의 특징 및 이점을 더 잘 이해할 수 있다:
도 1은 카트리지, 미세유체 칩 및 자석을 갖는 장치를 도시한 것이다.
도 2는 알루미늄 베젤에 의해 둘러싸인 유체 매니폴드를 도시한 것이다.
도 3은 유체 매니폴드 상에 탑재된 4개의 열전기 냉각기 및 열 분배 장치의 사진을 보여주는 것이다.
도 4a는 히트 싱크, 팬 및 매니폴드에 커플링된 열전기 냉각기를 보여주는 것이다.
도 4b는 전원에 커플링된 4개의 열전기 냉각기를 보여주는 것이다.
도 5는 저장소, 칩, 공압 플로터, 공압 삽입물, 열전기 냉각기 및 알루미늄 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 6은 도 5에 도시된 시스템의 조립도를 보여주는 것이다.
도 7은 유체 매니폴드의 상면도 및 저면도를 보여주는 것이다.
도 8은 기부에 탑재된 유체 매니폴드의 사진을 보여주는 것이다.
도 9는 유체 매니폴드의 상면도를 보여주는 것이다.
도 10은 열전기 냉각기 및 공압 플로터가 구비된 기부의 측면도를 보여주는 것이다.
도 11은 사출 성형된 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성된 유체 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 12는 사출 성형된 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성된 유체 매니폴드의 여러 도면을 보여주는 것이다.
도 13은 TEC 스택, 유체 매니폴드, 미세유체 칩 및 공압 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 14는 유체 층, 엘라스토머 층 및 공압 층을 갖는 미세유체 칩을 도시한 것이다.
도 15는 마이크로스케일 온-칩 밸브(MOVe)를 도시한 것이다.
도 16은 물질의 2개의 층으로 제조된 유체 층을 도시한 것이다.
도 17은 물질의 단일 층으로 제조된 유체 층을 도시한 것이다.
도 18은 시약 및 비드 레일을 갖는 미세유체 칩의 유체 및 공압 층을 도시한 것이다.
도 19는 시약 및 비드 레일을 갖는 미세유체 칩의 유체 층을 도시한 것이다.
도 20은 펌핑 사이클의 4개의 스테이지(A, B, C, D)를 보여주는 것이다.
도 21은 피펫 팁 또는 TEC-팁 매니폴드가 없는 시스템의 사진을 보여주는 것이다.
도 22는 자석 크레들용 컷아웃이 구비된 공압 매니폴드를 보여주는 것이다.
도 23은 밸브 및 펌프의 공압 라우팅 제어를 보여주는 것이다.
도 24는 mRNA 샘플을 제조하고 분석하기 위한 반응식을 보여주는 것이다.
도 25는 mRNA를 증폭하기 위한 반응식을 도시한 것이다.
도 26은 mRNA 증폭을 수행하기 위한 스크립트를 보여주는 것이다.
도 27은 Eberwine 공정을 수행하기 위한 스크립트를 보여주는 것이다.
도 28은 0.125 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 29는 0.125/4 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 30은 0.125/40 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 31은 비드 혼합 정확성을 결정하기 위한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 32는 미세유체 칩 내에서 약 1.5 ㎍의 전체 RNA에 의한 3개의 정제 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 33은 버스 채널 컷오프를 보여주는 것이다.
도 34는 비드에 결합된 RNA의 양의 함수로서 비드의 분포를 보여주는 것이다.
도 35는 비드 분량의 함수로서 비드의 분포를 보여주는 것이다.
도 36은 다양한 실험이 어떻게 구성되는지의 표를 보여주는 것이다.
도 37은 실험 1 및 실험 2로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 38은 실험 1 및 실험 3으로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 39는 수율 및 증폭 인자를 요약한 표를 보여주는 것이다.
도 40은 실험 1 및 실험 4로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 41은 실험 1 및 실험 5로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 42는 마이크로어레이 분석 실험에 대한 실험 설계를 보여주는 것이다.
도 43은 벤치 및 칩 생성 샘플에 대한 aRNA 수율의 표를 보여주는 것이다.
도 44는 단편화 전 및 후의 샘플의 그래프 bBioanalyzer 전기영동도를 보여주는 것이다.
도 45는 4×4 비교 매트릭스에서의 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 46은 벤치 결과에 대한 칩 결과의 비교를 보여주는 것이다.
도 47은 칩 및 벤치 단편화가 구별 불가능하다는 것을 보여주는 것이다.
도 1은 카트리지, 미세유체 칩 및 자석을 갖는 장치를 도시한 것이다.
도 2는 알루미늄 베젤에 의해 둘러싸인 유체 매니폴드를 도시한 것이다.
도 3은 유체 매니폴드 상에 탑재된 4개의 열전기 냉각기 및 열 분배 장치의 사진을 보여주는 것이다.
도 4a는 히트 싱크, 팬 및 매니폴드에 커플링된 열전기 냉각기를 보여주는 것이다.
도 4b는 전원에 커플링된 4개의 열전기 냉각기를 보여주는 것이다.
도 5는 저장소, 칩, 공압 플로터, 공압 삽입물, 열전기 냉각기 및 알루미늄 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 6은 도 5에 도시된 시스템의 조립도를 보여주는 것이다.
도 7은 유체 매니폴드의 상면도 및 저면도를 보여주는 것이다.
도 8은 기부에 탑재된 유체 매니폴드의 사진을 보여주는 것이다.
도 9는 유체 매니폴드의 상면도를 보여주는 것이다.
도 10은 열전기 냉각기 및 공압 플로터가 구비된 기부의 측면도를 보여주는 것이다.
도 11은 사출 성형된 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성된 유체 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 12는 사출 성형된 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성된 유체 매니폴드의 여러 도면을 보여주는 것이다.
도 13은 TEC 스택, 유체 매니폴드, 미세유체 칩 및 공압 매니폴드의 분해도를 보여주는 것이다.
도 14는 유체 층, 엘라스토머 층 및 공압 층을 갖는 미세유체 칩을 도시한 것이다.
도 15는 마이크로스케일 온-칩 밸브(MOVe)를 도시한 것이다.
도 16은 물질의 2개의 층으로 제조된 유체 층을 도시한 것이다.
도 17은 물질의 단일 층으로 제조된 유체 층을 도시한 것이다.
도 18은 시약 및 비드 레일을 갖는 미세유체 칩의 유체 및 공압 층을 도시한 것이다.
도 19는 시약 및 비드 레일을 갖는 미세유체 칩의 유체 층을 도시한 것이다.
도 20은 펌핑 사이클의 4개의 스테이지(A, B, C, D)를 보여주는 것이다.
도 21은 피펫 팁 또는 TEC-팁 매니폴드가 없는 시스템의 사진을 보여주는 것이다.
도 22는 자석 크레들용 컷아웃이 구비된 공압 매니폴드를 보여주는 것이다.
도 23은 밸브 및 펌프의 공압 라우팅 제어를 보여주는 것이다.
도 24는 mRNA 샘플을 제조하고 분석하기 위한 반응식을 보여주는 것이다.
도 25는 mRNA를 증폭하기 위한 반응식을 도시한 것이다.
도 26은 mRNA 증폭을 수행하기 위한 스크립트를 보여주는 것이다.
도 27은 Eberwine 공정을 수행하기 위한 스크립트를 보여주는 것이다.
도 28은 0.125 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 29는 0.125/4 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 30은 0.125/40 ㎕의 SpeedBead를 사용한 RNA 정제에 대한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 31은 비드 혼합 정확성을 결정하기 위한 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 32는 미세유체 칩 내에서 약 1.5 ㎍의 전체 RNA에 의한 3개의 정제 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 33은 버스 채널 컷오프를 보여주는 것이다.
도 34는 비드에 결합된 RNA의 양의 함수로서 비드의 분포를 보여주는 것이다.
도 35는 비드 분량의 함수로서 비드의 분포를 보여주는 것이다.
도 36은 다양한 실험이 어떻게 구성되는지의 표를 보여주는 것이다.
도 37은 실험 1 및 실험 2로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 38은 실험 1 및 실험 3으로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 39는 수율 및 증폭 인자를 요약한 표를 보여주는 것이다.
도 40은 실험 1 및 실험 4로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 41은 실험 1 및 실험 5로부터의 결과를 보여주는 것이다.
도 42는 마이크로어레이 분석 실험에 대한 실험 설계를 보여주는 것이다.
도 43은 벤치 및 칩 생성 샘플에 대한 aRNA 수율의 표를 보여주는 것이다.
도 44는 단편화 전 및 후의 샘플의 그래프 bBioanalyzer 전기영동도를 보여주는 것이다.
도 45는 4×4 비교 매트릭스에서의 실험 결과를 보여주는 것이다.
도 46은 벤치 결과에 대한 칩 결과의 비교를 보여주는 것이다.
도 47은 칩 및 벤치 단편화가 구별 불가능하다는 것을 보여주는 것이다.
본 발명은 유체 및 분석물 가공을 위한 장치 및 이의 사용 방법을 제공한다. 유체 및 분석물에 대해 다양한 작용을 수행하기 위해 본 발명의 장치를 사용할 수 있다. 이러한 작용으로는 이동, 혼합, 분리, 가열, 냉각 및 분석을 들 수 있다. 상기 장치는 카트리지, 미세유체 칩 및 공압 매니폴드와 같은 복수의 부품을 포함할 수 있다. 도 1은 카트리지(101), 미세유체 칩(103) 및 공압 매니폴드(113)를 갖는 예시적인 장치를 보여준다. 유전자 발현 마이크로어레이에 의한 분석을 위해 샘플을 제조하기 위해 그리고 다른 목적을 위해 생화학 및 효소 반응을 수행하기 위해 상기 장치를 사용할 수 있다.
I. 장치 부품
A. 카트리지
본원에서 유체 매니폴드라고도 칭하는 카트리지를 다양한 목적에 사용할 수 있다. 일반적으로, 카트리지는 대규모 장치 및 미세유체 장치와 접하도록 크기가 된 포트를 가질 있다. 카트리지 또는 유체 매니폴드는 미국 특허 출원 제61/022,722호(그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 공급원으로부터 샘플, 시약 또는 고체 입자와 같은 물질을 수취하여 이것을 미세유체 칩에 전달하기 위해 카트리지를 사용할 수 있다. 물질을 카트리지 및 미세유체 칩의 일치된 개구를 통해 카트리지와 미세유체 칩 사이에 이동시킬 수 있다. 예를 들면, 피펫을 사용하여 물질을 카트리지로 이동시키고, 그 후 결국 물질을 미세유체 장치에 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, 배관이 물질을 카트리지로 이동시킬 수 있다. 또한, 카트리지는 나노리터, 마이크로리터, 밀리리터 또는 리터의 유체를 보유할 수 있는 용적을 갖는 저장소를 가질 수 있다. 저장소를 보유 챔버, 반응 챔버(예를 들면, 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것), 가열 또는 냉각을 제공하기 위한 챔버(예를 들면, 열 제어 부재를 포함하는 것 또는 열 제어 장치에 열 접촉된 것) 또는 분리 챔버(예를 들면, 상자성 비드 분리, 친화도 포획 매트릭스 또는 크로마토그래피)로서 사용할 수 있다. 임의의 유형의 챔버를 본원에 기재된 장치, 예를 들면 미국 특허 공보 제2007/0248958호(본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 장치에서 사용할 수 있다. 저장소를 사용하여 카트리지 안팎으로의 온도 제어된 유체의 이동을 위한 유입구 및 유출구를 가짐으로써 가열 또는 냉각을 제공하고, 그 후 미세유체 칩에 온도 제어를 제공할 수 있다. 대안적으로, 저장소는 히트 싱크 또는 열 공급원을 제공하는 당업자에게 공지된 임의의 다른 가열 또는 냉각 부재 또는 Peltier 부재를 하우징할 수 있다. 카트리지 저장소는 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 ㎕ 이상의 용적을 가질 수 있다.
예를 들면, 도 1은 피펫 또는 임의의 다른 대규모 장치로부터 물질을 수취하기 위해 사용할 수 있는 카트리지의 측면에 포트(115) 개구를 갖는 저장소를 갖는 카트리지(101)를 보여준다. 포트에 또한 카트리지를 유체에 업스트림으로 접속시키기 위해 배관 또는 모세관을 수취하기 위한 핏팅이 맞춰질 수 있다. 저장소는 아래로 가늘어져 미세유체 칩의 유체 층에서의 개구(105)와 접하거나 이에 나란히 배치된 카트리지 저장소 개구(117)를 형성할 수 있다. 카트리지는 피펫 팁보다 크도록 크기가 된 저장소를 가져서, 물질이 미세유체 칩으로 직접 피펫팅될 수 있다.
각각의 칩은 실리콘 감압성 접착제(레이저 컷 PSA, 비도시)를 갖는 유체 매니폴드의 바닥 표면에 부착될 수 있다. 상기 기재된 바대로, 유체 매니폴드는 유체 유입/유출 포트 및 항온처리 저장소 둘 다로서 피펫 팁을 사용하도록 설계될 수 있다. 팁은 마찰 맞춤일 수 있거나 매니폴드의 상부 표면 상에 기계 제조 홀에 채워질 수 있다. 이는 매니폴드에서 포획된 공기 사용적을 생성시킬 수 있다.
도 2는 알루미늄 베젤을 포함하는 2 피스 설계를 갖는 유체 매니폴드 시스템을 보여준다. 이것은 폴리카보네이트(PC) 매니폴드와 같은 매니폴드의 온도 유발 뒤틀림을 감소시킬 수 있다. 알루미늄 베젤 내에 하우징된 소형 PC 유체 매니폴드는 (피펫 팁 없이) 시약 웰로서 기능하는 직경이 큰 홀에 의해 변형될 수 있다. 이 큰 홀은 칩 웰에 직접 시약을 피펫팅하는 것을 허용할 수 있다. 이 피쳐는 시약 웰에서 공기 사용적을 제거할 수 있고, 원래 설계와 비교하여 필요한 프라이밍 사이클의 수를 대단히 감소시킬 수 있다. Out1/Out2이 라벨링된 홀은 피펫 팁과 접할 수 있다. 도 3은 4개의 TEC 스택이 구비된 TEC-팁 매니폴드를 포함하는 완전한 시스템의 사진이다.
도 4에 도시된 바대로, TEC-팁 매니폴드는 알루미늄 매니폴드 및 복수의 "TEC 스택"을 포함할 수 있다. 도 4a에 도시된 바대로, Peltier TEC는 열-전도성 PSA에 의해 히트 싱크 및 매니폴드에 부착될 수 있다. 팬은 히트 싱크 핀에 접착될 수 있다. 도 4b에 도시된 바대로, 4개의 직렬 접속 TEC는 H-브릿지에 접속될 수 있다. H-브릿지는 FTC100 제어장치로부터의 신호에 응답하여 TEC로 전력을 라우팅할 수 있다. 알루미늄 매니폴드는 칩 Out1 및 Out2 웰에 접속된 4개의 피펫 팁을 하우징하기 위해 이의 중심에서 드릴 뚫린 4개의 홀을 갖는다. 상기 기재된 바대로, 팁은 혼합 및 항온처리 단계를 위한 저장소로서 기능할 수 있다. TEC-팁 매니폴드의 목적은 16℃ 내지 65℃ 범위에 걸쳐 항온처리의 온도를 제어하는 것일 수 있다. 온도를 도 3 및 도 13에 도시된 바대로 알루미늄 매니폴드에 부착된 "TEC 스택"의 작용을 통해 제어할 수 있다. 도 4a에 도시된 바대로, 각각이 스택은 3개의 주요 파트: Peltier TEC, 히트 싱크 및 팬을 포함할 수 있다. 도 4b에 도시된 바대로, TEC 스택은 H-브릿지에 의해 공급된 전류에 응답하여 매니폴드를 가열 또는 냉각시킬 수 있다. H-브릿지는 FTC100 제어장치로부터의 2개의 신호(수준 및 방향)에 의해 제어될 수 있어, PID 제어 시스템이 이행된다. FTC100은 삽입된 열전대에 의해 측정된 바대로 매니폴드의 온도에 기초하여 이 신호에 대한 값을 컴퓨팅할 수 있다, 사용자 프로그래밍된 설정 값 및 PID 매개변수: P(비례), I(적분) 및 D(미분). PID 매개변수를 FTC100의 오토튠(Autotune) 기능을 이용하여 자동으로 설정할 수 있다. H-브릿지의 최소 조작 전압은 각각 3 볼트 최대에서 평가되는 4개의 TEC의 직렬 접속을 요할 수 있는 7 볼트일 수 있다. 상기 시스템을 4O℃로 냉각하고 가열하기 위해 통상적으로 8 볼트에서 조작할 수 있다. 65℃ 이상으로 가열하기 위해 더 높은 전압(12 볼트 이하)을 이용할 수 있다. 팬을 별개의 5 볼트 전력원에 의해 연속적으로 구동할 수 있다.
본원에 기재된 시스템, 장치 및 방법은 피펫 무사용일 수 있다. 저장소가 카트리지 또는 임의의 다른 부품 내에 포함되도록 설계될 수 있어서, 피펫이 필요하지 않다. 이러한 시스템의 예는 도 5 및 도 6에 도시되어 있다.
도 5는 다른 구조를 지지하고 히트 싱크로서 기능할 수 있는 알루미늄 매니폴드와 같은 기부를 포함하는 시스템을 도시한다. 열전기 커플러와 같은 열 제어장치가 기부 상에 탑재되고 예를 들면 기부와 열 접촉하여 열 교환을 허용한다.
공압 플로터와 같은 바이어를 포함하는 공압 매니폴드가 또한 기부 상에 탑재된다. 이것은 예를 들면 스프링과 바이어스되어 미세유체 칩과 가압 시일을 형성할 수 있다. 공압 삽입물이 미세유체 칩을 체결시키지 않는 측 상에 공압 매니폴드에서 바이어를 체결시킬 수 있다. 공압 삽입물은 미세유체 칩의 공압 층에 압력(양압 또는 음압)을 제공하는 공압 라인과 연통한다.
미세유체 장치는 기부 상에 탑재된다. 미세유체 장치는 미세유체 칩 및 카트리지, 예를 들면 저장소를 포함한다. 미세유체 칩은 유체 층, 공압 층 및 이들 사이에 샌드위칭된 탄성 층을 포함한다. 유체 층은 유체 층의 외면 및 유체 층의 내면에 개방된 미세유체 채널을 포함한다. 공압 층은 또한 공압 층의 외면 및 공압 층의 내면에 개방된 공압 채널을 포함한다. 유체 채널 및 공압 채널이 서로 반대인 탄성 층에 개방된 경우, 다이어프램 밸브 및 다른 미세기계가 형성될 수 있다. 공압 채널 내의 포트에 양압 또는 음압을 인가하는 것은 탄성 층을 굽게 하고 유체 채널 내의 밸브가 개폐되게 하여 액체가 통과하게 하거나, 액체가 채널을 통해 펌핑되게 한다. 이는 칩이 공압 매니폴드와 체결될 때 발생할 수 있어서 매니폴드 내의 바이어는 공압 채널 내의 포트와 공압 연통한다. 작동물질은 공기일 수 있지만, 또한 유압 유체일 수 있다. 미세유체 장치는 또한 카트리지를 포함한다.
카트리지는 저장소의 2개의 표면에 개방된 웰 및 구획을 포함한다. 카트리지의 한 측은 미세유체 칩과 체결된다. 파트 둘 다 내의 포트는 유체 연통하도록 서로 정렬된다. 이러한 방식으로, 칩은 카트리지 내의 다양한 웰 또는 구획 내의 유체를 카트리지 내의 다른 웰 또는 구획으로 지도할 수 있다. 카트리지 내의 웰 및 구획은 1 마이크로리터 내지 10 마이크로리터, 100 마이크로리터, 밀리리터, 10 밀리리터 이상인 메조유체 또는 마크로유체 규모의 용적을 가질 수 있다. 예를 들면, 저장소는 칩 상의 포트와 일치하는 카트리지 내의 웰로부터, 미세유체 칩 내의 펌프 또는 밸브를 통해, 칩 밖으로 및 저장소 상의 구획으로 액체를 펌핑함으로써 거기 위치한 반응 혼합물을 포함할 수 있는 지그재그 채널을 포함할 수 있다. 온도에서 유지되어야 하거나, 열 순환을 겪어야 하는 반응 혼합물의 경우, 지그재그 채널과 같은 이 혼합물을 보유하는 구획이 위치할 수 있어서, 미세유체 장치가 기부 상에 로딩될 때, 그 구획은 열전기 커플러와 같은 열 제어 장치와 열 접촉한다.
미세유체 장치를 예를 들면 나사, 클램프 등에 의해 제자리에 보유할 수 있다. 기부에 대해 압축할 때, 미세유체 칩은 또한 공압 매니폴드를 체결시킨다. 공압 매니폴드를 바이어스할 때, 공압 매니폴드와 미세유체 칩 사이의, 또한 저장소와 열 제어장치 사이의 타이트 핏(tight fit)을 기부 상에 공압 매니폴드를 로딩하는 데 있어서 정확한 허용 오차에 대한 필요성 없이 유지할 수 있다.
도 5 및 도 6에 도시된 바대로, 지그재그 채널을 반응 챔버로서 사용할 수 있다. 지그재그 채널은 열전기 냉각기와 같은 온도 제어 장치와 접할 수 있다. 온도 제어 장치를 사용하여 부품의 온도를 제어할 수 있다. 이것은 Peltier 장치를 이용할 수 있거나, 액체, 가스 또는 다른 물질을 가열 또는 냉각시킬 수 있다. 온도 제어 장치를, 본원에 기재된, 공압 플로터, 공압 삽입물 및 스프링을 포함할 수 있는 기부 내에 하우징할 수 있다.
도 5에 도시된 바대로, 유체 매니폴드는 2개의 파트: 저장소 및 저장소 바닥을 포함할 수 있다. 저장소는 채널 또는 홈통(trough)을 포함하는 표면을 포함할 수 있다. 저장소 바닥은 저장소 채널을 실링하도록 작용할 수 있고 부착된 칩에 접근 홀(바이어)을 제공한다. 도 7은 조립된 유체 매니폴드의 상면도 및 저면도를 보여준다. 칩은 레이저-컷 감압성 접착제에 의해 유체 매니폴드의 바닥 표면에 부착될 수 있다. 일(근위) 측 상에 칩 Out1 및 Out2 웰로부터 공급된 4개의 항온처리 채널은 또한 이의 다른(윈위) 측에서 공압 삽입물을 통해 추가의 공압 라인(또는 공압 채널)에 접속될 수 있다(도 5). 공압 삽입물은 각각 충전 또는 배출되면서 공기가(지그재그 채널일 수 있는) 항온처리 채널을 탈출 또는 진입하도록 원위 측 접속에 제공될 수 있다. 대안적으로, 이것을 사용하여 채널에 양압 또는 진공을 공급할 수 있다. 채널 단면적은 0.5 ㎜(깊이)×1 ㎜(폭)일 수 있고, 채널 길이는 대략 200 ㎜(약 100 ㎕ 용적)이다. 항온처리 채널 이외에, 유체 매니폴드는 또한 시약 저장 채널을 포함할 수 있다. 이것은 유체 매니폴드의 상면 상에 웰로부터 충전될 수 있고, 칩 유입/유출 웰로 배출될 수 있다. 이것을 최소 증발 및 응축으로 긴 시간 기간 동안 4℃에서 시약을 보유하도록 설계할 수 있다. 마지막으로, 4개의 열전대 채널은 각각의 4개의 항온처리 채널에 대해 온도 측정점을 제공할 수 있다. 도 8, 도 9 및 도 10은 시약 저장 채널이 없는 시스템의 사진을 보여준다. 도 8은 공압 플로터(칩 없음) 상에 머무르는 유체 매니폴드의 도면을 보여준다. 알루미늄 매니폴드 아래로 히트 싱크 및 팬 어셈블리를 볼 수 있다. 도 9는 도시된 (TEC의 상부에) 구리 열 분산기 플레이트 위의 항온처리 지그재그 채널 및 웰의 상면도를 보여준다. 어셈블리를 떠난 2개의 열전대 와이어를 볼 수 있다. 도 10은 알루미늄 매니폴드 및 공압 플로터를 보여준다. TEC의 상부에 구리 열 분산 플레이트 및 공압 플로터 o-링을 볼 수 있다.
카트리지는 당업자에게 공지된 임의의 물질로 구성될 수 있다. 예를 들면, 카트리지는 가소제, 유리 또는 금속으로 구성될 수 있다. 가소성 물질은 당업자에게 공지된 임의의 가소제, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리(비닐클로라이드), 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리비닐디엔 클로라이드, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC) 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 카트리지를 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 소프트-리소그래피, 하드-리소그래피, 밀링, 엠보싱, 삭마, 드릴링, 에칭, 사출 성형 또는 임의의 이들의 조합을 이용하여 형성할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 평활한 유체 매니폴드 또는 평활한 부품을 사출 성형에 의해 형성할 수 있다. 추가로, 어셈블리에 접착제 및 열 결합 방법을 이용할 수 있다. 평활한 표면 및/또는 사이클릭 올레핀 공중합체과 같은 특정 유형의 물질의 사용은 가열 단계 동안 방울 형성을 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 낮은 액체 및/또는 가스 흡착 또는 흡수를 갖는 물질을 선택할 수 있다. 다른 실시양태에서, 강직성 또는 저온 의존적 기계적 변형을 나타내는 물질을 선택할 수 있다.
도 11에 도시된 바대로, 유체 매니폴드는 3개의 피스: 캡, 채널 매니폴드 및 바닥(비도시)를 포함할 수 있다. 사출 성형 제작은 평활한 채널 표면을 제공할 수 있다. 어셈블리에 접착제 및 열 결합 방법을 이용할 수 있다. 이 시스템의 예비 평가는 이것이 대략 95℃까지 방울을 포함하지 않고 남아 있다는 것을 나타낸다. 도 11의 왼편 부분은 향상된 기계적 안정성을 위해 알루미늄 베젤을 갖는 변형 유체 저장소를 보여준다. 도 11의 오른편 부분은 3 피스 유체 매니폴드를 보여준다. 사출 성형된 COC 채널 매니폴드 및 기계 제조 폴리카보네이트 캡(유입/유출 웰 보유)을 볼 수 있다.
도 12는 보다 자세히 유체 매니폴드의 구조를 보여준다. 열전대는 FTC100 온도 제어장치 및 관련 플라잉 리드(flying lead)에 대한 직접 배선에 대한 요건을 제거할 수 있는 소형 서미스터로 대체될 수 있다. 대신에, 유체 매니폴드의 바닥 표면 상의 접촉 패드 및 알루미늄 매니폴드 내의 매칭 포고 핀을 통해 전기 접속이 이루어질 수 있다. 도 12의 왼편 부분은 바닥 실링 채널 매니폴드를 명확히 볼 수 있는 3 피스 구조의 분해도를 보여준다. 도 12의 중간 및 오른편 부분은 상면도 및 저면도를 보여준다. 캡 내의 웰 및 채널 매니폴드의 바닥 표면 상의 피쳐를 명확히 볼 수 있다.
B. 미세유체 칩
몇몇 경우에, 미세유체 칩은 유체 흐름의 제어를 위한 다이어프램 밸브를 갖는다. 유체 흐름을 제어하는 다이어프램 밸브를 갖는 미세유체 장치가 미국 특허 제7,445,926호, 미국 특허 공보 제2006/0073484호, 제2006/0073484호, 제2007/0248958호 및 제2008/0014576호 및 PCT 공보 제WO 2008/115626호(본원에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨)에 기재되어 있다. 공압 매니폴드를 통해 마이크로칩의 공압 층에 양압 또는 음압을 인가함으로써 밸브를 제어할 수 있다.
일 실시양태에서, 마이크로칩은 "MOVe" 칩이다. 이 칩은 3개의 기능성 층 - 미세유체 채널을 포함하는 유체 층; 공압 채널을 포함하는 공압 층 및 2개의 다른 층 사이에 샌드위칭된 액츄에이션 층을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 유체 층은 2개의 층으로 이루어진다. 1개의 층은 외면으로부터 유체 채널로 통과하는 미세유체 채널 및 바이어 또는 홀을 제공하는 홈을 포함할 수 있다. 제2 층은 액츄에이션 층과 접촉하는 표면으로부터 다른 층에서 공압 채널과 접촉하는 표면으로 통과하는 바이어를 포함할 수 있다. 서로 접촉될 때, 채널을 유체 매니폴드와 접속시키기 위해 넓어지거나 채널을 액츄에이션 층과 접속시키기 위해 개방된 바이어 및 내부 채널을 포함하는 단일 유체 층으로부터의 이 2개의 층은 밸브, 챔버 또는 다른 기능성 아이템을 형성한다. 액츄에이션 층은 통상적으로 진공 또는 압력이 발휘될 때 변형될 수 있는 엘라스토머 물질로 형성된다. 유체 채널 또는 공압 채널이 개방되거나, 그렇지 않으면 액츄에이션 층과 접촉하는 지점에서, 밸브와 같은 기능성 장치가 형성될 수 있다. 이 밸브는 도 15에 단면으로 도시되어 있다. 유체 층 및 공압 층 둘 다 포트로서 채널을 외면에 접속시키는 포트를 포함할 수 있다. 이 포트는 카트리지 또는 공압 매니폴드와 같은 유체 매니폴드를 체결시키도록 채택될 수 있다.
도 1에 도시된 바대로, 미세유체 칩(103)은 카트리지(101)와 접할 수 있다. 미세유체 칩은 카트리지(101)의 개구(117)에 일치된 개구를 갖는 챔버(105)를 가질 수 있다. 다양한 목적에 챔버를 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응 챔버, 혼합 챔버 또는 포획 챔버로서 챔버를 사용할 수 있다. 자기 입자, 예컨대 자기 비드, 상자성 비드, 고상 추출 물질, 모노리스 또는 크로마토그래피 매트릭스를 포획하기 위해 챔버를 사용할 수 있다.
카트리지 저장소(107) 및/또는 미세유체 챔버(105) 내의 자기 입자가 미세유체 챔버(105)의 표면에 대해 포획되도록 자기 부품(109)을 위치시킬 수 있다. 자기 부품은 영구 자석 및/또는 전기자석을 사용하여 자기장 및/또는 전자기장을 생성할 수 있다. 영구 자석을 사용하는 경우, 미세유체 챔버에 자기장을 인가하기 위해 미세유체 칩의 근처에 자석을 놓아 자석을 하나 이상의 방향에서 작동시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 도 1에 도시된 방향(111)으로 자석을 작동시킨다.
대안적으로, 임의의 다양한 장치가 미세유체 칩과 접할 수 있다. 예를 들면, 검출기, 분리 장치(예를 들면 가스 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 질량 분광기 등), 광원 또는 온도 제어 장치가 미세유체 칩에 바로 위치할 수 있거나 미세유체 칩과 함께 사용할 수 있다. 상기 장치는 저항, 커패시턴스, 발광 또는 온도를 검출함으로써 분석물의 검출을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 상기 장치는 광이 미세유체 칩의 영역 또는 면적에 도입되게 할 수 있다.
미세유체 장치를 자기 입자의 포획에 구성된 복수의 챔버에 의해 설계할 수 있다. 자기장이 모든 챔버에 동시에 인가되거나, 다른 챔버에 독립적으로 각각의 또는 몇몇 챔버에 인가될 수 있도록 복수의 챔버 및 자기 부품을 배치할 수 있다. 챔버 및 자기 부품의 배치는 더 신속한 또는 더 효과적인 자기 입자의 회수를 촉진할 수 있다. 특히, 배치는 복수의 챔버에서 자기 입자의 회수를 촉진할 수 있다.
도 14에 도시된 바대로, 미세유체 칩(103)은 유체 층(203), 엘라스토머 층(205) 및 공압 층(207)으로 형성될 수 있다. 유체 층은 피쳐, 예컨대 챔버(105), 또한 채널, 밸브 및 포트를 포함할 수 있다. 채널은 챔버 및/또는 포트 사이의 유체의 이동에 사용되는 미세유체 채널일 수 있다. 밸브는 미세유체 장치에서 사용되는 임의의 유형의 밸브일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 밸브는 본원에서 미세유체 다이어프램 밸브라고도 칭하는 마이크로스케일 온-칩 밸브(MOVe)를 포함한다. 일련의 3개의 MOVe는 MOVe 펌프를 형성할 수 있다. 공압을 이용하여 MOVe 및 MOVe 펌프를 작동시킬 수 있다. 공압 공급원은 미세유체 칩에 내부 또는 외부일 수 있다.
MOVe 다이어프램 밸브가 도 15에 도시되어 있다. 폐쇄 MOVe의 단면도가 도 15a에 도시되어 있다. 개방 MOVe의 단면도가 도 15b에 도시되어 있다. 도 15c는 MOVe의 탑-다운 도면을 보여준다. 유체 층으로부터 기원하는 채널(251)이 하나 이상의 바이어(257)에 의해 엘라스토머 층과 접할 수 있다. 채널은 엘라스토머 층(259)이 시트(255)와 접촉할 때 채널을 통한 흐름을 방해하는 하나 이상의 시트(255)를 가질 수 있다. 엘라스토머 층은 통상 시트와 접촉하거나 또는 통상 시트와 접촉하지 않는다. 유체 채널(251)에 비해 공압 챔버(253)에서 압력을 증가 또는 감소시키기 위해 공압 라인(261)을 통한 양압 또는 음압의 인가는 엘라스토머 층을 변형시켜, 엘라스토머 층이 시트에 밀려지거나 시트로부터 당겨질 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, MOVe는 시트를 갖지 않고, 유체 채널을 통한 유체 흐름이 양압 또는 음압의 인가 하에 방해되지 않는다. 인가될 수 있는 진공은 극히 높은 진공, 중간 진공, 낮은 진공, 하우스 진공 및 5 psi, 10 psi, 15 psi, 25 psi, 30 psi, 40 psi, 45 psi 및 50 psi와 같은 압력을 포함한다.
3개의 MOVe는 직렬로 유입 밸브로서의 제1 MOVe, 펌핑 밸브로서의 제2 MOVe 및 유출 밸브로서의 제3 MOVe의 사용을 통해 펌프를 형성할 수 있다. 유체를 MOVe의 순차 개방 및 폐쇄에 의해 일련의 MOVe를 통해 이동시킬 수 있다. 유입 밸브로 공급되는 유체의 경우, 예시적인 순서는, 모두 3개의 MOVe가 폐쇄되는 스타트로부터 시작하여, (a) 유입 밸브를 개방하는 것, (b) 펌핑 밸브를 개방하는 것, (c) 유입 밸브를 폐쇄하고 유출 밸브를 개방하는 것, (d) 펌핑 밸브를 폐쇄하는 것 및 (e) 유출 밸브를 폐쇄하는 것을 포함할 수 있다.
유체 층(203)은 물질의 하나 이상의 층으로 구성될 수 있다. 도 16에 도시된 바대로, 유체 층(203)은 물질의 2개의 층으로 구성될 수 있다. 채널(301, 303, 305)이 물질의 2개의 층 사이의 계면에서 형성될 수 있고, 챔버(105)가 물질의 1개의 층의 일부의 완전 제거에 의해 형성될 수 있다. 채널은 곡선 및 한 측 상에(301), 직사각형(303) 또는 원형(305)과 같은 임의의 형상을 가질 수 있다. 채널은 오직 1개의 층(301, 303)에 체류하거나 층 둘 다(305)에 체류하여 형성될 수 있다. 채널 및 챔버는 도시된 채널 및 챔버을 횡단하는 유체 채널에 의해 접속될 수 있다. 다차원 마이크로칩이 또한 복수의 유체 층 사이에 유체 채널 및 접속이 이루어지는 본 발명의 범위 내에 있다.
물질의 제2 층의 두께(307)는 임의의 두께일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 제2 층은 외부 자기 부품으로부터 제2 층을 거쳐 인가되는 챔버(105) 내의 자기장의 감소를 최소화하거나 열 전달의 감소를 최소화하는 두께를 갖는다.
도 17에 도시된 바대로, 유체 층(203)은 물질의 단일 층으로 구성될 수 있다. 단일 층은 이후 엘라스토머 층과 접하여, 채널(305, 303) 및 챔버(305)가 유체 층과 엘라스토머 층(205) 사이에 형성된다.
미세유체 칩은 당업자에게 공지된 임의의 물질로부터 구성될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 유체 및 공압 층은 유리로부터 구성되고 엘라스토머 층은 PDMS로부터 형성된다. 대안적인 실시양태에서, 엘라스토머는 Teflon, 실리콘 또는 다른 막과 같은 변형성 물질의 박막으로 대체될 수 있다. 유체 및 공압 층의 피쳐를 당업자에게 공지된 임의의 미세제작 기술, 예컨대 패턴 형성, 에칭, 밀링, 성형, 레이저 삭마, 기판 침착, 화학 증기 침착 또는 임의의 이들의 조합을 이용하여 형성할 수 있다.
도 18 및 도 19는 미세유체 칩의 다이아그램을 보여준다. 미세유체 칩은 유리-PDMS-유리 샌드위치를 포함하는 3개 층 칩이다. 도 18을 참조하면, 유체 피쳐가 에칭되고 상부 유리 층에 드릴링될 수 있고, 공압 피쳐가 에칭되고 바닥 유리 층에 드릴링될 수 있다. 점선은 공압 층 피쳐일 수 있고 실선은 유체 층 피쳐일 수 있다. 도 19를 참조하면, 칩은 4개의 섹션: 시약 레일, 비드 레일, 프로세서 1 및 프로세서 2를 갖는다. 2개의 레일 및 2개의 프로세서 동일한(거울상) 기하학일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 시약 또는 비드 레일이 프로세서 둘 다에 공급되도록 칩이 구성된다. 프로세서로의 레일 접근을 밸브 Vr 및 Vb에 의해 제어할 수 있다. 시약 가공(효소 반응) 동안, Vr을 개방하고 Vb를 폐쇄할 수 있다. 비드 기반 클린업 동안, 반대 상황이 적용되고, 즉 Vr을 폐쇄할 수 있고 Vb를 개방할 수 있다. 각각의 레일은 각각 4개의 상이한 유입 웰 및 1개의 폐기물 웰, 바이어 밸브 Vr1-4 및 VrW에 접근할 수 있다. 각각의 프로세서는 샘플 유입 웰(샘플), 2개의 유출 중간 프로세싱 웰(Out1, Out2) 및 2개의 용출액 유출 웰 E11 및 E12를 가질 수 있다. 프로세서는 또한 2개의 펌프(Pump, BPump)를 가질 수 있고, 이것 둘 다 유체 전달을 작동시킬 수 있다. 통상의 펌핑 작동에 Pump를 사용할 수 있고, 주로 비드 수집 저장소로서 BPump를 사용할 수 있다. 미세유체 칩에 대한 제작 매개변수는 75 ㎛ 채널 깊이, 250 ㎛(최종) 유체 채널 폭일 수 있다. 하기 기재된 바대로, BPump의 공압 층은 500 ㎛의 깊이로 밀링될 수 있다. Pump 및 BPump 펌프 스트로크 용적은 각각 대략 0.5 ㎕ 및 1 ㎕일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 칩은 공압 및 유체 매니폴드와 함께 기능한다. 공압 매니폴드는 칩의 바닥 표면에 공압 웰과 일치되어, 이것을 컴퓨터 제어 솔레노이드 밸브를 통해 진공 또는 양압 공급원에 접속시킬 수 있다. 공압 매니폴드는 또한 BPump 밑에 자석을 위치시킬 수 있다. 유체 매니폴드는 칩의 상부 표면에 유체 웰로의 유입/유출 포트를 일치시킬 수 있다. 그러나, 웰 Out1 및 Out2를 중간 프로세싱에 사용할 수 있고, 이것은 대신에 유체 매니폴드 내의 반응 혼합/항온처리 저장소에 접속할 수 있다.
밸브 및 펌프를 사용하여 유체 매니폴드, 미세유체 칩 및 공압 매니폴드를 비롯한 본원에 기재된 부품 내의 물질을 이동시킬 수 있다. 도 20은 어떻게 시약 1 및 샘플을 포함하는 반응이 4-사이클 펌핑에 의해 Out1에서 조립될 수 있는지를 보여준다. 모든 밸브를 초기에 폐쇄할 수 있다는 것을 가정하라. 사이클 A에서, 밸브 Vr1 및 Vr을 개방하여, Pump가 다운-스트로크(Pump에 인가된 진공)에 의해 Ras1R 웰로부터 시약 1을 인출하도록 허용할 수 있다. Ras1R 내 시약을 Pump로 인출할 수 있다. 사이클 B에서, 밸브 Vr1 및 Vr을 폐쇄하고 밸브 V2를 개방하여, Pump가 업-스트로크(Pump에 인가된 양압)에 의해 Out1 저장소로 이의 내용물을 배출하도록 허용할 수 있다. Pump 내 시약을 Out1 저장소로 배출할 수 있다. 사이클 C에서, 샘플 내 RNA를 Pump로 인출할 수 있다. 사이클 D에서, RNA를 Out1 저장소로 배출할 수 있다. 사이클 C 및 사이클 D를 유사하게 조작하고; 유일한 차이는 Pump가 사이클 C에서 샘플로부터 충전된다는 것이다. 사이클 A, 사이클 B, 사이클 C, 사이클 D를 충분한 용적이 Out1로 밀리기까지 반복한다. 시약 1-대-샘플 혼합비를 사이클 AB:사이클 CD의 비에 의해 측정할 수 있다는 것에 유의한다. 상기 기재된 공정에서, 혼합비는 1:1이지만, 이것은 원칙적으로 임의의 정수비일 수 있다. 마지막으로, Vr1에 대해 적절한 밸브를 치환함으로써 유사한 절차를 이용하여 임의의 시약(Ras1-4)을 샘플과 혼합할 수 있다. 복수의 부품 계면의 생성 및 칩 웰 내의 유체 흐름 및 펌핑과 관련된 난류에 의해 혼합을 촉진할 수 있다. Out1 저장소 내의 시약 및 RNA의 순차 적층으로 인한 복수의 계면에서의 컨벡션 및 확산으로 혼합이 발생할 수 있다.
C.
공압
매니폴드
공압 매니폴드를 사용하여 미세유체 칩의 공압 라인을 외부 압력 공급원에 일치시킬 수 있다. 공압 매니폴드는 미세유체 칩의 공압 층 상의 포트와 정렬된 포트 및 외부 압력 공급원에 접속하는 배관에 접속될 수 있는 포트를 가질 수 있다. 포트는 포트 사이의 액체 또는 가스 또는 다른 물질의 유체 연통을 허용하는 하나 이상의 채널에 의해 접속될 수 있다.
공압 매니폴드는 칩의 임의의 표면 상의 미세유체 칩과 접할 수 있다. 공압 매니폴드는 카트리지로서 미세유체 칩의 동일한 또는 상이한 측 상에 있을 수 있다. 도 1에 도시된 바대로, 공압 매니폴드(113)는 카트리지에 반대인 미세유체 칩의 표면 상에 위치할 수 있다. 또한, 공압 매니폴드를 이것이 미세유체 칩의 표면의 일부를 오직 점유하도록 설계할 수 있다. 공압 매니폴드의 위치, 설계 및/또는 형상은 다른 부품의 미세유체 칩으로의 접근을 허용할 수 있다. 공압 매니폴드는 다른 부품이 미세유체 칩에 인접 또는 근접 배치되도록 허용하는 컷아웃 또는 환상 공간을 가질 수 있다. 이것은 예를 들면 자기 부품(109)이 미세유체 칩 내에 챔버 근처에 위치하도록 허용할 수 있다.
공압 매니폴드 또는 본원에 기재된 임의의 다른 부품은 당업자에게 공지된 임의의 물질로 구성될 수 있다. 예를 들면, 카트리지는 가소제, 유리 또는 금속으로 구성될 수 있다. 금속으로는 알루미늄, 구리, 금, 스테인리스 강철, 철, 청동 또는 이들의 임의의 합금을 들 수 있다. 물질은 고전도성 물질일 수 있다. 예를 들면, 물질은 높은 열, 전기 또는 광학 전도율을 가질 수 있다. 가소성 물질은 당업자에게 공지된 임의의 가소제, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리(비닐클로라이드), 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리비닐디엔 클로라이드, 사이클릭 올레핀 공중합체 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 공압 매니폴드를 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 소프트-리소그래피, 종래 리소그래피, 밀링, 성형, 드릴링, 에칭 또는 임의의 이들의 조합을 이용하여 형성할 수 있다.
도 13은 시스템의 전체 체계를 보여준다. 마이크로 유체 칩을 폴리카보네이트(PC) 공압 매니폴드와 유체 매니폴드 사이에 샌드위칭할 수 있다. 이 시스템에서, 피펫 팁(비도시)은 유체 매니폴드의 상부에 삽입될 수 있고 둘 다 유체 유입/유출 포트 및 항온처리 저장소 둘 다로서 작용할 수 있다. 알루미늄 TEC-팁 매니폴드는 (Out1 및 Out2의 경우) 항온처리 저장소로서 작용하는 4개의 피펫 팁을 둘러싸고 부착된 Peltier 열전기 냉각기(TEC)에 의해 이의 온도를 제어할 수 있다. 도 13이 2개의 TEC 스택을 보여주지만, 4개의 TEC 스택을 사용할 수 있다는 것에 유의한다. 다른 2개의 TEC 스택을 팁 매니폴드의 반대 측 상에 유사한 위치로 부착할 수 있다. 도 21은 피펫 팁 또는 TEC-팁 매니폴드가 없는 시스템의 사진을 보여준다. 상기 시스템은 2개의 매니폴드를 정렬시키고 공압 매니폴드 상에 보유된 o-링을 압축하도록 작용하는 볼트 및 나비 나사에 의해 조립될 수 있다.
공압 매니폴드를 칩 바닥 표면을 따라 공압 웰에 접속시킬 수 있다. 기밀 접속을 매니폴드의 상부 표면 상의 오목부에 접착된 o-링에 의해 확립할 수 있다. 이후, 각각의 공압 칩 웰을, 접착 금속 캐뉼라(비도시)를 갖는 매니폴드 내 관통 홀을 통해, 2위치 솔레노이드 밸브에서 기원하는 공압 라인에 접속시킬 수 있다. 하기 기재된 바대로, 컴퓨터 제어 솔레노이드 밸브는 각각의 공압 웰에 대한 진공 또는 양압을 선택할 수 있다. 공압 매니폴드는 또한 칩 BPump와 접하는 2개의 자석을 보유할 수 있다. 도 22는 (Delrin) 자석 크레들 보유 각진 소형 막대 자석에 대한 컷아웃을 갖는 공압 매니폴드를 보여준다. 자석의 각진 위치를 BPump의 중심선을 따라 자장을 맞추도록 선택할 수 있다.
밸브 및 펌프의 제어를 위한 공압 라우팅이 도 23에 도시되어 있다. 각각의 솔레노이드 블록은 각각의 블록 상의 유출구 1-8에 진공 또는 양압을 라우팅하는 8개의 2위치 솔레노이드를 보유한다. 솔레노이드 유출구를 배관에 의해 표시된 칩 웰에 접속시킬 수 있다. 솔레노이드 라벨을 사용하여 개별 솔레노이드를 DevLink 코드로 어드레싱한다. 시약 및 비드 레일 밸브를 동일하게 라벨링하여, 이 밸브를 동시에 조작할 수 있다는 것을 나타낸다는 것에 유의한다. 대안적으로, 이 밸브를 독립적으로 조작할 수 있다. 그러나, 칩 내에서, 프로세서로의 접근을 밸브 라벨링된 시약 및 비드의 2개의 쌍에 의해 게이팅할 수 있다. 동일한 라벨을 공유하는 다른 밸브 및 펌프를 차이 없이 동시에 조작할 수 있다. 따라서, 2개의 칩 프로세서를 동시에 및 병렬로 조작할 수 있다. 대안적으로, 2개의 칩 프로세서를 독립적으로 조작되도록 구성할 수 있다. 적절한 밸브, 채널, 공압 및 제어 구성을 선택함으로써 대안 구성을 설계할 수 있다.
진공 및 양압을 소형 이중-헤드 Hargrave 격막 펌프에 의해 생성시킬 수 있다. 이 펌프는 약 21 in. Hg의 진공 및 약 25 PSI 이하의 양압을 생성시킬 수 있다. 칩을 최대 진공 및 15 PSI 양압에서 운전할 수 있다. 점성 물질의 수송을 위해, 펌프 막 전이 시간의 증가는 펌핑 성능을 개선할 수 있다. 공압 라인 드라이빙 칩 펌프에서 조정 가능한 구멍을 삽입함으로써 펌프 전이 시간을 조정할 수 있다. 일련의 정밀 구멍을 Bird Precision으로부터 구입할 수 있다(http://birdprecision.com).
게다가, 하기 완전히 기재된 바대로, Hargrave 펌프의 진공 측과 직렬 접속된 KNF UN86 펌프에 의해 생성될 수 있는 더 높은 진공 수준(28 in. Hg)에 의해 BPump 성능을 개선할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 기부는 지지 구조물, 공압 플로터, 하나 이상의 공압 삽입물 및 하나 이상의 온도 제어 장치를 포함할 수 있는 하나 이상의 공압 매니폴드를 포함할 수 있다. 시스템의 분해도가 도 5에 도시되어 있다. 상기 시스템은 유체 매니폴드(저장소 및 저장소 바닥), 미세유체 칩(061 칩), 플로터, 삽입물, 열전기 냉각기(TEC)를 포함하고, 지지 구조물(알루미늄 매니폴드)이 도 5에 도시되어 있다. 도 5의 조립도가 도 6에 도시되어 있다.
TEC에 대한 히트 싱크 용량을, 시스템의 기부 판으로서 작용하는 대형 알루미늄 매니폴드에 직접 이것을 탑재시킴으로써, 증가시킬 수 있다. TEC의 상부(작업) 표면은 시스템이 완전히 조립될 때 지그재그 항온처리 채널 바로 밑의 저장소 바닥과 접촉한다. 4개의 나비 나사(비도시)를 조임으로써 이 계면에 중간 힘을 가할 수 있다.
다른 특징은 자석을 보유하고 칩의 바닥에 공압 계면을 제공하기 위한 소형 공압 플로터의 사용이다. 공압 플로터는 이전 공압 매니폴드와 동일한 목적을 제공할 수 있지만, 이것은 알루미늄 매니폴드 상에 탑재된 스프링에 올라간다. 스프링 힘은 칩의 바닥 표면에 기밀 접속을 제공하는 o-링을 압축하도록 작용할 수 있다.
마이크로칩에 공압 플로터를 탑재 또는 압축하기 위한 스프링의 사용은 시스템의 어셈블리를 촉진하고 고저항 부품의 제조의 필요성을 감소시킬 수 있다. 지지 구조물에 열전기 냉각기 및 공압 플로터를 탑재한 지지 구조물을 이용하는 시스템의 경우, 열전기 냉각기는 카트리지와 접해야 하고 공압 플로터는 미세유체 칩과 접해야 한다. 또한, 칩은 카트리지와 접한다. 칩, 카트리지, 지지 구조물, 열전기 냉각기 및 공압 플로터가 각각 장치마다 두께가 변할 수 있으므로, 스프링은 각각의 부품을 높은 저항 또는 높은 정확성 또는 정확도로 제조할 필요성 없이 부품 쌍 둘 다의 적절한 접함을 허용할 수 있다. 이것은 각각의 부품의 제조 시간 및 시스템의 어셈블리에 대한 시간을 감소시킬 수 있다. 각각의 부품의 제조 시간은 약 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 24, 36 또는 48 시간 또는 이 이하 또는 이 미만일 수 있다. 시스템의 어셈블리에 대한 시간은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15 또는 24 시간 또는 이 이하 또는 이 미만일 수 있다.
Ⅱ. 용도
A.
mRNA
증폭
유전자 발현 마이크로어레이는 세포 메신저 RNA(mRNA) 수준을 모니터링할 수 있다. 메신저 RNA는 통상적으로 오직 1~3%의 전체 세포 RNA를 구성할 수 있다. 세포 RNA의 대부분은 리보솜 RNA(rRNA)일 수 있고, mRNA가 마이크로어레이 프로브에 대한 하이브리드화와 경쟁함으로써 이 분자는 mRNA 분석을 방해할 수 있다. LAMP, TLAD(Eberwine) 및 MDA와 같은 본원에 기재된 장치에 의해 임의의 mRNA 증폭 방법을 수행할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 장치를 사용하여 등온 mRNA 증폭 방법을 수행할 수 있다. 다른 실시양태에서, PCR 또는 사이클 서열분석을 성취하기 위해 열 사이클링을 수행할 수 있다. 메신저 RNA 증폭 절차는 증폭에 대해 폴리아데닐화(폴리 A+) mRNA를 특이적으로 표적하여, 실제로 rRNA 간섭을 제거할 수 있다. 이 특징은 비효율적이고, 시간 소모적이고, 고가인 공정일 수 있는 전체 RNA로부터 mRNA를 예비 정제해야 하는 임의의 필요성을 제거할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 하이브리드화에 이용될 수 있는 표적 RNA(즉, 증폭된 mRNA 또는 aRNA)의 양을 크게 증가시킴으로써, mRNA 증폭은 훨씬 더 적은 샘플(더 적은 수의 세포)이 분석되게 할 수 있다. 마이크로어레이 분석에 필요한 비교적 다량(통상적으로 15 ㎍)의 표적 RNA를 흔히 얻기 어려울 수 있으므로, 이는, 물론, 일반적으로 유용하다. 더욱이, 이것은 몇몇 세포를 포함하는 샘플, 예를 들면, 세침 흡인(FNA) 또는 레이저 포획 현미해부(LCM)로부터 유도된 샘플을 분석하는 많은 중요한 임상 진단 분야와 관련될 수 있다.
도 24a에서 볼 수 있는 것처럼, 전체 마이크로어레이 샘플 제조 공정을 28S/18S 비를 정량하고 RNA 통합수(RIN)를 생성하기 위해 Agilent Bioanalyzer에 의해 마이크로칩 모세관 전기영동에 의해 규명할 수 있는 전체 세포 RNA로 시작할 수 있다. 전체 RNA가 충분한 품질을 갖는 경우, mRNA를 증폭할 수 있고, 그 후 증폭된 RNA(aRNA)를 단편화하고 마이크로어레이로 하이브리드화할 수 있다. 본원에 기재된 방법, 장치 및 시스템은 마이크로칩 기반 시스템에서 mRNA 증폭 공정의 수행을 허용할 수 있다. mRNA 증폭 화학은 Ambion Message Amp Ⅲ 키트에서 수행되는 Eberwine mRNA 증폭을 이용할 수 있다. 이 공정은 도 24b에 도시되어 있고, 이는 증폭 공정이 2개의 다단계 성분: Eberwine 효소 반응 및 Solid Phase Reversible Immobilization(SPRI) aRNA 클린업을 포함할 수 있다는 것을 보여준다. 이 공정은 본원에서 자세히 기재되어 있다.
상대 mRNA 풍부도 수준을 변경시키는 임의의 공정은 가능하게는 정확한 유전자 발현 프로파일링을 방해할 수 있다. Eberwine 증폭 절차의 중요한 양태는 이것이 PCR과 같은 지수 증폭 방법보다 mRNA 인구를 덜 편향시킬 수 있는 선형 증폭 반응을 이용할 수 있다는 것이다.
원래 Eberwine 프로토콜은 Ambion과 같은 상업 판매자에 의해 간소화되고 간략화될 수 있다. 도 25에 도시된 바대로, Ambion 절차는 3개의 2중(2 성분) 첨가 이후 RNA 정제 공정을 포함한다. 각각의 2중 첨가에 도 25에 도시된 바대로 특정 온도에서 항온처리(들)가 후행할 수 있다. 초기 역전사(RT) 반응은 3종의 유입물(프라이머, 전체 RNA 및 역전사효소[RT] 혼합물)을 가질 수 있지만; 전체 RNA 및 프라이머를 편리하게 예비 혼합할 수 있다. 이 제1 반응을 위한 통상적인 용적은 5 ㎕ RNA + 프라이머 5 ㎕ RT 혼합물일 수 있다. 오로지 mRNA가 올리고 dT 프라이머로 하이브리드화하고 DNA로 전사된다. 제2 가닥 반응을 20 ㎕ Second-Strand Mix 첨가에 의해 개시할 수 있고, 최종 T7 증폭 반응을 30 ㎕ T7 Mix 첨가에 의해 개시할 수 있다. 비오틴 라벨링 리보뉴클레오타이드의 혼입에 의해 합성된 RNA를 이 단계에서 라벨링할 수 있다. 혼합물은 표시된 효소와 함께 완충제(Tris), 1가 및 2가 염(KCl, NaCl, MgCl2), 뉴클레오타이드 및 DTT를 포함한다. 통상적으로, 효소를 사용 전 농축 혼합물과 예비 혼합할 수 있다. 역전사, DNA 중합 및 RNA 중합을 포함하는 3개의 순차 효소 반응을 이용하여 공정을 수행할 수 있다. 3개의 단계를 중간 클린업 단계 없이 수행할 수 있다. DNA 중합 또는 제2 가닥 합성 후에 열사 단계가 포함될 수 있다(단계 2).
합성 후, aRNA를 정제하여 효소, 완충제, 염, 비혼입 뉴클레오타이드, 피로포스페이트 등을 제거할 수 있다. 정제는 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl) 또는 티오시아네이트(GuSCN)와 같은 카오트로픽 염의 존재 하에 aRNA와 실리카 막 또는 비드의 회합을 이용하는 상업용 키트에 의존할 수 있다. 결합 후, 실리카를 70% 에탄올(EtOH)로 세척하고, 건조시키고, aRNA를 물로 용리한다.
상기 기재된 바대로, Eberwine mRNA 증폭 절차는 3개의 2진 가산의 캐스케이드일 수 있다. Eberwine 순서를 실행하기 위해, 도 19에 도시된 바대로 Ras1R이 RT 혼합물을 포함하고, Ras2R이 제2 가닥(2S) 혼합물을 포함하고, Ras3R이 T7 혼합물을 포함한다는 것을 가정한다. Message Amp Ⅲ에 대해 도 25에 도시된 바대로, 2X 용적의 2S 혼합물을 RT 반응에 첨가하고, 1X 용적의 T7 혼합물을 2S 반응에 첨가한다. 이는 2S 혼합물 첨가에 대해 2:1 펌핑 비(AB:CD) 및 T7 혼합물 첨가에 대해 1:1 비를 요한다.
4-사이클 펌핑은 Out1 저장소에서 샘플로부터 전체 RNA의 1:1 혼합물 및 Ras1R로부터 2X RT 혼합물과의 제1(RT) 반응을 조립한다는 것을 가정한다. 적절한 항온처리 기간 후, 제2 가닥 반응은 (샘플로부터 보다는) Out1로부터 인출하고, (Ras1R로부터 보다는) Ras2R로부터 인출함으로써 Out2 저장소에서 조립될 수 있다. 즉, 사이클 A에서, Vr2는 Vr1보다 개방되고; 사이클 B에서, V3은 V2보다 개방되며; 사이클 C에서, V2는 V1보다 개방되고; 사이클 D에서, V3은 V2 대신에 개방된다. 필요한 2:1 혼합비를 얻기 위해, Out1로부터 인출된 매 사이클에 대해, Ras2R로부터 2개의 사이클을 인출한다는 것에 유의한다.
다른 적절한 항온처리 기간 후, 제3 (T7) 반응을 유사한 공정으로 (Ras3R 및 Out2(1:1 비)로부터 인출된) Out1에 접속된 저장소에서 조립할 수 있다. 따라서 최종 T7 반응이 Out1 저장소에 상주한다. 적절한 항온처리 기간 후, aRNA가 정제 준비된다.
이 단계의 각각을 본원에 기재된 장치에서 수행할 수 있다. 예를 들면, 시약 및 샘플을 카트리지 내 포트를 통해 공급하고 그 후 미세유체 칩에 전달한다. 온-칩 밸브를 사용하여 시약 및 샘플을 카트리지 내 챔버 및 저장소에, 채널을 통해 미세유체 칩에 펌핑한다. 내부 또는 외부 가열 및 냉각 장치를 사용하여 온도 제어를 성취할 수 있다. 반응 생성물을 추가의 취급을 위해 카트리지의 생성물 유출 포트로 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 장치를 사용하여 반응 생성물을 정제 또는 분리할 수 있다.
B. 분리 및 클린업
본원에 기재된 장치를 사용하여 다양한 분리를 수행할 수 있다. 이 분리로는 크로마토그래피, 친화도, 정전기, 소수성, 이온 교환, 자기, 항력 기반 및 밀도 기반 분리를 들 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 물질을 비드와 같은 고상 물질에 결합시키기 위해 친화도 또는 이온 교환 상호작용을 이용한다. 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 비드를 유체 용액으로부터 분리할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 분리 및 클린업은 고상 가역적 부동화(SPRI)를 포함할 수 있다. SPRI는 구아니디늄 기반 정제 화학물질 및 자기 비드 기반 화학물질을 비롯한 다양한 화학물질을 사용할 수 있다. 구아니디늄 완충제는 결정 미립자 형성이 되기 쉬운 독성의 근사 포화 용액일 수 있다. 구아니디늄 완충제는 실리카(유리) 표면에 대한 결합을 촉진할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 화학물질은 카복실화 중합체에 의해 커버될 수 있는 자기 비드와 핵산의 PEG/염 유도 회합을 포함한다(deAngelis et al., Nucl. Acids Res. 23, 4742). 통상적으로, 2X 완충제 중의 비드(20% PEG8000, 2.5 M NaCl)는 RNA와 1:1 비로 합해진다. 간단한 항온처리 기간 후, RNA-비드 착체를 자석으로 포획하고, 비드를 70% EtOH로 세척하고, 간단히 건조시키고, RNA를 적은 용적의 물 중에 용리한다. 카복실화 중합체 이중 셀 자기 비드(SpeedBead)는 Seradyne로부터 구입 가능하다(http://www.seradyn.com/micro/particle-overview.aspx).
자기 분리를 사용하여 상자성 비드 및 자기장을 이용하는 기계적으로 단순화된 포맷을 이용하여 물질을 단일 단계로 포획 및 농축할 수 있다. 비드를 사용하여 특정한 표적 항원, 단백질, 탄수화물, 독소, 핵산, 세포, 바이러스 및 포자를 포획하고, 농축하고, 그 후 정제할 수 있다. 비드는 표적에 결합하는 특정한 친화도 시약, 통상적으로 항체, 압타머 또는 DNA를 가질 수 있다. 대안적으로, 정전기 또는 이온 쌍 또는 염-브릿지 상호작용이 표적에 결합할 수 있다. 비드는 외부 자기장의 존재 하에 자석일 수 있는 상자성 비드일 수 있다. 대안적으로, 비드는 영구 자석을 포함할 수 있다. 비드를 에어로졸, 액체, 체액, 추출물 또는 식품과 같은 복잡한 샘플에 첨가할 수 있다. DNA와 같은 표적 물질의 결합 후(또는 전), 비드를 자기장의 인가에 의해 포획할 수 있다. 비결합 또는 느슨하게 결합된 물질을 상용성 완충제로 세척함으로써 제거하고, 이는 원래 샘플 내의 다른 원치않는 물질로부터의 표적을 정제한다. 비드는 소형(nm 내지 ㎛)일 수 있고 다양의 표적을 결합시킬 수 있다. 비드를 자력에 의해 농축할 때, 이것은 단지 nL-㎕ 용적의 비드 층을 형성하여, 이것이 정제되는 동시에 표적을 농축시킬 수 있다. 정제 및 농축된 표적이 편리하게 수송되고, 변성되거나, 용리되거나, 분석되면서, 추가의 샘플 제조 또는 분석을 위해 온-비드되거나, 비드가 용리된다.
식품, 체액 및 다른 매트릭스에서의 미생물의 검출을 비롯한 많은 용도에 분리를 널리 사용한다. 상자성 비드를 혼합하고 용이하게 제작할 수 있고, 마이크로스케일 및 미세유체 분야에 적용 가능하다. 이 기술은 마크로스케일-내지-마이크로스케일 계면에 대한 훌륭한 해결책을 제공하고: 비드를 마크로스케일에서 샘플을 정제할 수 있고 그 후 미세유체 또는 나노유체 플랫폼에 도입하기 위해 나노스케일(수 100의 nL)로 농축한다. 자기 분리를 실시간 PCR, 전기화학발광, 자력 차별, 자기영동, 모세관 전기영동, 장 흐름 분리 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 분리 방법 전에 업스트림 정제 단계로서 사용할 수 있다.
본 발명의 장치는 자기 비드의 사용을 수용할 수 있다. 예를 들면, 비드 또는 비드 슬러리를 카트리지의 포트에 공급할 수 있다. 펌핑, 자기장 또는 외부 혼합기를 사용하여 비드를 카트리지 내에 용액 중에 혼합 또는 현탁시킬 수 있다. 그 후, 비드를 미세유체 장치 또는 카트리지 내의 원하는 챔버 또는 저장소로 펌핑할 수 있다. 비드를 자기장을 이용하여 챔버 내에 포획할 수 있다. 용액 중의 비드를 자기장을 통해 이동하는 용액으로서 포획할 수 있거나, 비드를 고인 용액 내에 포획할 수 있다.
RNA 정제는 시약 레일보다는 비드 레일의 조작을 포함할 수 있다. 따라서, 칩 조작의 이 단계 동안, 밸브 Vr은 폐쇄된 채 남아있고 Vb는 개방된다. 상기 기재된 바대로, 4-사이클 펌핑을 이용하여 Ras1B로부터의 2X 비드 슬러리(도 19)를 Out 1 저장소로부터 Out2 저장소로의 aRNA와 혼합할 수 있다. 간단한 항온처리 기간 후, 다음 단계는 BPump에서의 RNA-비드 착체의 수집이다. 이를 위해, 우선 BPump 막이 500 ㎛ 깊이 공압 공동으로 아래로 당겨진 채 남아있다고 가정한다. 그 후, (도 20에서의 사이클 AB 또는 사이클 CD와 유사한) 2-사이클 펌핑을 비드 결합 혼합물을 Out2 저장소로부터, BPump를 통해, E11로 펌핑할 수 있다. RNA-비드 착체가 (공압 매니폴드 내에서) 칩 바로 밑에 위치한 자석에 의해 주요 흐름 경로 밖으로 당겨지면서, 이것이 BPump 내 포획된다. 포획 후, 비드를 100% EtOH로 세척하고, (비어있는) Ras4B로부터 (2-사이클) 공기 펌핑에 의해 건조시킨다.
RNA 용리는 Ras3B로부터 물 및 (처음에 BPump에 포획된) 비드의 "파괴적 혼합"에 의존할 수 있다. 이것을 Ras3B로부터 Out1 저장소로의 물을 (2-사이클) 펌핑하는 BPump 막의 사용을 통해 성취할 수 있다. BPump 막 상에 침착된 충전 비드 층은 신속히 파괴되고, BPump 막이 왕복 운동하면서 물과 혼합될 수 있다. 마지막으로, 비드 및 방출 aRNA를 BPump를 통해 E12로 다시 펌핑할 수 있다. 비드를 BPump 내에 재포획하고, (물 중에) aRNA가 E12 중에 있게 된다.
Ⅲ.
실시예
A.
RNA
정제용 스크립트
본원에 기재된 시스템, 장치 및 방법을 조작하고/하거나 자동화하기 위해 스크립트를 작성할 수 있다. 다음은 RNA 정제를 수행하기 위한 스크립트의 예이다.
도 26(왼쪽)에 도시된 바대로, 스크립트를 11개의 코드 청크로 조직화한다. 각각의 청크는 오른쪽에 나타낸 실시간 매개변수와 관련된다. RNA 정제가 손실되는 4지점을 적색으로 표시하였다. 청크를 밑에 기재하였다. 달리 기재되지 않는 한, 펌프 사이클은 칩 펌프(Pump)에 의해 실행된다. 칩 펌프는 0.5 ㎕/스트로크 이동시키고, BPump는 1 ㎕/스트로크 이동시킨다.
1. BPump_Initialization. BPump 막이 물을 그 후 EtOH를 펌핑하면서, BPump 챔버를 세정한다(# BPump Cleaner = 10). 스크립트에서 BPump는 EtOH로 채워진 채로 있고, 방울이 없으며, 후에 비드-RNA 혼합을 수용할 준비가 된다.
2. Prime_For_Mixing. RNA(Out1) 및 2XBB(Ras1B)를 프라이밍한다(각각, # Out1 RNA Prime = 12 및 # Ras1B 2XBB Prime = 4). 프라이밍은 매니폴드 사용적 내 임의의 공기를 제거하고, 후속 혼합이 정확하도록 보장한다.
3. Mix_Out2. Out2(전체 용적 2O ㎕) 내에서 8단계 펌핑 혼합 RNA(l0 ㎕) 및 2XBB(lO ㎕)의 20회 사이클. # Binding Rxn Mixer = 23 사이클이라는 것에 유의한다. 이는 BBufLoadMod = 10으로 기재한 바대로(0회 사이클, 10회 사이클 및 20회 사이클에서) 10회 사이클 간격에서 Ras1B로부터 2XBB를 재프라이밍하기 위해 3회 사이클이 사용되기 때문이다. 혼합을 완료한 후, 100 초 결합 반응 항온처리를 프라이밍한다(Binding Reaction Inc = 100000).
4. Load_BPump. BPump로의 RNA-비드 결합 반응의 이동 동안 BPump로의 공기 방울의 도입을 최소화하기 위해, Out2를 우선 프라이밍하여 임의의 축적 공기를 제거한다(# Out2 Mix Prime = 2). 20 ㎕ 중 1 ㎕(5%) 이하가 프라이밍에 의도적으로 손실되면서, 이것을 (처음에) RNA의 손실로 프로그래밍한다. Out2 프라이밍 후, 결합 반응을 BPump를 통해 폐기물 포트 W로 펌핑한다. 혼합물이 BPump를 횡단하면서, RNA-비드 착체가 BPump 밑에 위치한 자석에 포획된다. 비드 포획을 최대화하기 위해, 추가의 체류 시간(BeadDwell = 2500)을 각각의 펌프 사이클에 도입한다. 다시 BPump로의 공기 방울의 도입을 회피하기 위해 # Binding Rxn Loader = 39가 의도적으로 Out2 뒤로 0.5 ㎕를 잔류시킨다(제2 프로그래밍된 손실, 2.5%)는 것에 유의한다. 마지막으로, 이동 동안, 0회 사이클, 15회 사이클 및 30회 사이클에서 주기적 Out2 재프라이밍에 의해 3×2.5%의 추가의(제3 프로그래밍된) 손실이 발생한다(MixLoadMod = 15). 전체 프로그래밍된 최대 손실은 따라서 이때 5+2.5+7.5 = 15%이다.
5. Wash_BPump. Wash 프라이밍(Ras2B EtOH Prime = 5) 후, 축적된 RNA-비드 층을 100% EtOH로 세척한다(Ras2B Wash = 50). 세척된 비드 층을 건조시키기 위한 공기 펌핑을 위해 사이클의 나머지를 비축하면서, 오직 약 12.5 ㎕의 100% EtOH가 Ras2B 피펫 팁으로 로딩된다는 것에 유의한다.
6. PreElute_Empty_Out2. Out2가 용리 물질을 유지시키기 위해 다음에 사용되므로, 이것을 사용 전 세정해야 한다. 이 공정에서의 제1 단계는 Out2로부터의 임의의 잔류하는 RNA-비드 결합 혼합물의 제거이다. 10회 펌프 사이클을 이때 스크립트로 하드와이어한다.
7. PreElute_Prime_Elution. 용리물(물)을 프라이밍하여(Ras3B Water Prime = 2), 임의의 공기 방울을 제거하고 프로세서 채널을 세척한다.
8. PreElute_Out2_Rinse_Cycle. 이 단계는 Out2를 물 25 ㎕로 충전하고(# Out2 Rinse = 50), 그 후 이것을 비운다.
9. PreElute_Prime_Elution. 용리물(물)을 프라이밍하여(Ras3B Water Prime = 2), 임의의 공기 방울을 제거하고 프로세서 채널을 세척한다.
10. Shuttle_Elute_1. 세척되고 건조된 비드 층을 파괴하고 BPump 막 펌핑에 의해 용리수로 동원한다. 따라서, 이 스크립트에서 BPump 사이클의 수는 15 ㎕로 설정된 용리 용적을 결정짓는다(BPump Out2 Mobilizer = 15). 비드/RNA/물 혼합물을 Out2로 펌핑한다.
11. Shuttle_Elute_2. 이 최종 단계에서, 비드 및 용리된 RNA를 BPump 내에 비드를 재수집함으로써 분리한다. 제1 하위단계에서, 프로세서 채널을 물로 재프라이밍하여(Ras3B Water Prime = 2), 임의의 공기 방을 또는 빗나간 비드를 제거한다. 다음에, Out2를 프라이밍하여(Out2 Mix Prime = 2), BPump로의 공기 방울의 이동을 최소화한다. 15 ㎕ 중 1 ㎕(6.7%) 이하가 희생되면서, 이는 4번째 프로그래밍된 RNA 손실이다. 따라서, 모두 프로그래밍된 손실 후 수율은 85%의 93.3%인 79% 만큼 낮을 수 있다. 마지막으로, 비드/RNA/물 혼합물을 BPump를 통해 용리 포트 E로 펌핑한다(BPump_E12Elute = 30). 비드 포획을 최소화하기 위해, 체류 시간(EluteDwell = 1500)을 각각의 펌프 사이클에 도입한다.
B. 효소 반응을 수행하기 위한 방법
본원에 기재된 시스템, 장치 및 방법을 조작하고/하거나 자동화하기 위해 스크립트를 작성할 수 있다. 다음은 본원에 기재된 효소 반응을 수행하기 위한 스크립트의 예이다.
도 27에 도시된 바대로, 3 단계 Eberwine 화학에 대한 스크립트를 각각 역전사(RT), 제2 가닥(SS) 합성 및 인 비트로 전사(IVT)에 대해 3개 섹션으로 조직화한다. 각각의 섹션은 통상 3개 단계: (ⅰ) 완충제 프라이밍, (ⅱ) 반응 혼합 및 (ⅲ) Fluorinert 삽입을 갖는다. 프라이밍은 공기를 제거하여 혼합 용액의 정확한 용적 제어를 보장한다. 혼합 후, Fluorinert 삽입은 반응 혼합물을 TEC-팁 매니폴드와의 최상의 접촉을 위해 피펫 팁으로 끌어올리고, 또한 연장된 항온처리 동안 증발을 제거한다. Fluorinert 대신에 임의의 불활성 유체를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Fluorinert 77을 사용한다. 저점도의 불활성 유체를 선택할 수 있다. 광유를 수동으로 반응 혼합물의 상부 표면에 적층하여 상부 표면으로부터 증발을 제거한다. 효소 반응 스크립트의 자세한 사항은 하기 기재되어 있다. 이 스크립트에서, 모두 펌프 사이클이 칩 펌프(Pump)에 의해 수행된다는 것에 유의한다. 칩-대-칩 펌프 속도는 스트로크마다 0.55 ㎕로부터 0.7O ㎕로 변한다. Fluorinert 또는 광유와 같은 적층 액체의 사용은 실험의 신뢰도 또는 재현 가능성을 개선할 수 있다. 예를 들면, 반복 실험은 서로 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3% 또는 5% 내에 있는 결과를 가질 수 있다. 반복 실험에 걸친 평균 값의 %로서의 표준 편차는 약 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3% 또는 5% 또는 그 이하 또는 그 미만일 수 있다. 결과는 증폭 수율, 특정한 표준 또는 집합체에 대한 어레이 하이브리드화 또는 임의의 다른 관련 결과일 수 있다.
1. Prime_for_RT. RNA(샘플) 및 RT 반응 완충제(Ras1R)를 연속하여 프라이밍한다(# Sample RNA = 2 및 # Ras1R RT Buffer = 1). 각각의 프라이밍 사이클은 프라이밍 폐기물을 각각 RasWB 및 RasWR로 지시하는 2개의 펌프 스트로크로 이루어진다는 것에 유의한다. 새로운 0 프라이밍 매니폴드 시스템은 공기 사용적을 제거하기 위해 오직 1 또는 2의 스트로크의 프라이밍이 필요하다는 것을 보장한다.
2. Mix_RT_Rxn. 10 ㎕ RT 반응물을 5 ㎕ 전체 RNA 및 5 ㎕ Ambion 완충제(첨가된 효소)로부터 혼합한다. RNA(샘플) 및 RT 반응 완충제(Ras1R)를 1:1 비로 Out1에 혼합한다. 1O ㎕에 대해 10회 사이클과 반대로 # RT Rxn Mixing = 14라는 것에 유의한다. 하기 기재된 바대로, 이것은 효소 반응 실행 동안 가능한 손실을 보상하는 것이다.
3. Fluorinert_Out1. Fluorinert를 우선 프라이밍하고(# Ras4R Fluorinert Prime = 5), 그 후 Out1로 펌핑한다(# Ras4R Fluorinert Insert = 30).
반응물을 이제 42℃에서 2 시간 동안 항온처리한다.
4. Prime_for_2ndStrand. RT 생성물(Out1) 및 Second Strand Buffer(Ras2R)를 연속적으로 프라이밍한다(# RT Product = 31 및 # Ras2R Buffer = 2). 각각의 Ras2R 프라이밍 사이클은 프라이밍 폐기물을 각각 RasWB 및 RasWR로 지시하는 2개의 펌프 스트로크를 갖는다. Ambion 키트가 과량 Second-Strand Buffer을 제공하므로, Ras2R가 (Ras1R과 비교하여) 더 많이 프라이밍되어 칩 채널의 추가의 퍼징을 제공한다는 것에 유의한다. 각각의 RT 생성물(Out1) 프라이밍 사이클은 RasWB로 지시된 오직 1개의 펌프 스트로크를 갖는다. (Fluorinert를 삽입하기 위한 30개 스트로크보다 1개 많은) 31개의 스트로크가 Fluorinert 스페이서를 완전히 제거하기 위해 사용된다는 것에 유의한다. 이것은 잠재적으로 몇몇 RT 생성물의 손실을 야기하고, 이것이 왜 본 발명자들이 과량 RT 반응 혼합물로 시작하는지의 이유이다.
5. Mix_2ndStrand_Rxn. 30 ㎕ SS 반응물을 1O ㎕ RT 반응 생성물 및 2O ㎕ Second-Strand Buffer(첨가된 효소)로부터 혼합한다. RT 생성물(Out1) 및 Second-Strand Buffer(Ras2R)을 Out2로 23회 사이클로 혼합한다(# Second Strand Mixing = 23). 각각의 혼합 사이클은 Second-Strand Buffer의 2개의 펌프 스트로크 및 RT 생성물의 1개의 펌프 스트로크로 이루어진다(혼합비 2:1).
6. Fluorinert_Out2. Fluorinert을 우선 프라이밍하고(# Ras4R Fluorinert Prime = 5), 그 후 Out2로 삽입한다(# Ras4R Fluorinert Insert = 25).
반응을 이제 16℃에서 1 시간 동안 및 65℃에서 1O 분 동안(열사) 항온처리한다.
7. PreIVT_Empty_Out1. Out1이 완전히 비우도록 보장하기 위해, (스크립트로 하드와이어링된) 10회 펌프 사이클은 Out1을 RasW로 비운다.
8. PreIVT_Out1_Rinse cycle. Out1을 1O ㎕ 물로 충전하고(# Out1 Rinse = 20), 그 후 RasW로 비운다.
9. Prime_for_IVT. Second-Strand 생성물(Out2) 및 IVT 완충제(Ras3R)를 연속하여 프라이밍한다(# Second Strand Product = 26 및 # Ras3R 완충제 = 3). 각각의 Ras3R 프라이밍은 각각 RasWB 및 RasWR로의 2개의 펌프 스트로크를 갖는다. Ambion 키트는 과량 Second-Strand Buffer를 제공하여, Ras3R을 몇 회 더 프라이밍하여 칩 채널의 추가의 퍼징을 제공한다. 각각의 RT 생성물(Out1) 프라이밍은 RasWB로 프라이밍 폐기물을 지시하는 오직 1개의 펌프 스트로크를 갖는다. Fluorinert 스페이서를 완전히 제거하기 위해 # Second Strand Product Prime = 26이라는 것에 유의한다.
10. Mix_IVT_Rxn. 60 ㎕ IVT 반응물을 3O ㎕ Second-Strand 반응 생성물 및 3O ㎕(첨가된 효소) IVT 완충제로부터 64회 사이클로 Out1에서 혼입한다(# IVT Rxn Mixing = 64). 혼합비는 1:1이다.
11. Fluorinert_Out1. Fluorinert를 우선 프라이밍하고(# Ras4R Fluorinert Prime = 5), 그 후 Out1로 삽입한다(# Ras4R Fluorinert Insert =20).
반응물을 이제 40℃에서 20 시간 동안 항온처리한다.
C.
SPRI
화학을 이용한
RNA
의 회수
본 발명자들은 Seradyne로부터 SpeedBead를 얻었고, 본 발명자들의 결합 완충제를 생성시켰다. 본 발명자들은 20% PEG 8000, 2.5 M NaCl(2X 농도)을 포함하는 DeAngelis 등의 완충제(Nucl. Acids Res. (1995) 23, 4742-4743)를 사용하였다. (0.125 ㎕ SpeedBead를 사용한 RNA 정제를 보여주는) 도 28에 도시된 바대로, SpeedBead 및 DeAngelis 완충제에 의한 벤치 실험은 적어도 50 ㎍의 전체 RNA가 0.25 ㎕ 충전 비드 층에 의해 매우 높은 효율로 정제된다는 것을 보여준다. (0.125/4 ㎕를 사용한 RNA 정제를 보여주는) 도 29에 도시된 바대로, ¼ 양의 SpeedBead(13 ㎍×4 = 52 ㎍)로 동일 결과를 얻었다. 그리고 놀랍게도, (0.125/40 ㎕를 사용한 RNA 정제를 보여주는) 도 30에 도시된 바대로, 1OX 더 적은 SpeedBead(0.125/40 ㎕)에 의해서도, 회수가 감소하더라도 (13 ㎍×40 = 520 ㎍에 동일한) 13 ㎍ RNA까지의 포화의 신호가 없었다. 흥미롭게도, 도 30의 실험에서, 상당량의 RNA가 상청액에서 회수되지 않았고, 이것은 비드 포화라기보다 비드 손실이 아마도 감소한 RNA 회수에 원인이 된다는 것을 나타낸다. 이 결과는 칩 내의 0.125 ㎕ 충전 비드 층이 높은 효율로 100 ㎍ 이상의 RNA를 정제할 수 있다는 것을 나타낸다.
D. 미세유체
RNA
회수
RNA 및 2XBB의 혼합의 정확성(실제로 물에 의한 2XBB의 희석)을 우선 규명한다. 이 실험은 SpeedBead 농도를 400 nm에서의 흡광도에 의해 민감하게 모니터링할 수 있다는 본 발명자들의 관찰에 의존한다(도 31, 왼쪽). 도 31(오른쪽)은 4개의 실험에 대한 혼합 오차(%)가 대략 ± 15%라는 것을 보여준다. 도 31은 비드 혼합 정확성을 보여준다. 도 31 왼쪽은 A400로의 비드 농도 관련 표준 곡선을 보여준다. 도 31 중간은 본 발명의 칩 상에 Mix_Out2 코드 청크에 의한 2XBB 중의 1.25% 비드의 1:1 희석 후 최종 비드 농도를 보여준다. 도 31 오른쪽은 혼합 오차(%)를 보여준다. 이의 대부분은 아마도 2XBB의 비교적 높은 점도에 의해 야기되는 펌프 충전 부정확성에 기인할 것이다. 이 혼합비로의 RNA 정제 효율의 민감성은 현재 규명되지 않았다.
도 32는 스크립트를 운전하는 칩 내에 대략 1.5 ㎍의 전체 RNA에 의한 3개의 정제 실험의 결과를 보여준다. 도 32는 정제 수율 및 순도를 보여준다. 도 32 왼쪽은 1.6 ㎍의 RNA를 사용한 실험 1을 보여준다. 도 32 중간은 1.7 ㎍의 RNA를 사용한 실험 2를 보여준다. 도 32 오른쪽은 1.7 ㎍의 RNA를 사용한 실험 3을 보여주고 # Binding Rxn Loader를 41로 증가시켰다. 이 결과는 또한 도 32 표에 요약되어 있다. 평균 정제 효율은 상기 기재된 프로그래밍된 RNA 손실(예상 수율은 79% 만큼 낮음)보다 대략 10~20% 낮은 61.3% 내지 69.8%이었다. 프로그래밍된 손실 이외에, 불량한 RNA-비드 회합, 벽에 접착하는 RNA 또는 비드 등으로 인해 추가의 손실이 발생할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명자들이 일관하여 관찰한 하나의 중요한 손실은 비드 결합 혼합물의 BPump로의 이동(상기 단계 4) 동안 칩을 유체 매니폴드에 부착시키는 접착층에 의해 형성된 사용적에서의 비드의 축적이다. 본 발명자들은 10% 이하의 비드가 이 사용적 내에 부동화된다는 것이 가능하다고 추측한다. 이러한 추가의 손실을 고려하여, 예상 정제 효율은 대략 70%에서 운전되어야 한다.
정제 효율과 관련하여, # Binding Rxn Loader가 39로부터 41로 증가한 실험 3이 3개의 실험 중에서 최고 평균 및 최저 CV를 갖는다는 것은 가능하게는 주목할 가치가 있다. 이는 BPump로의 공기 주입의 문제점이 과대평가되었다는 것을 나타낸다.
상기 기재된 실험을 비교적 소량의 RNA(< 5 ㎍) 및 적은 정제 용적(2O ㎕)으로 수행한다. Message Amp Ⅲ aRNA(15 ㎍) 및 액체 용적(12O ㎕) 수준에 의한 실험에서, 비드 포획 효율에 대한 추가의 효과가 관찰되었다. 이 효과의 결과는 비드 포획 및 RNA 정제 효율(하기 기재된 바대로 약 50%)을 감소시켰다. 현재, 본 발명자들은 Message Amp Ⅲ 조건 하에 비드 포획 및 RNA 정제 효율에 영향을 미치는 5가지 주요 인자가 존재한다고 믿는다.
1. 막 변형. BPump에서의 효율적인 비드 포획이 500 ㎛ 밀링된 공압 층의 바닥으로의 PDMS 막의 변형에 의존한다. 변형에 영향을 미치는 주요 인자는 막 모듈러스(가요성), 막 두께 및 진공 수준이다. 상이한 PDMS 두께 및 화학에 의한 실험은 증가된 막 가요성이 변형, 비드 수집 효율 및 RNA 정제 효율을 개선시킬 수 있으면서, 또한 밸브 압력 조작 마진을 감소시킨다는 보여준다. 도 33에 도시된 바대로, 이것은, 밸브가 폐쇄되었을 때, 증가된 가요성이 막이 밸브 동공으로 변형되도록 하여, "버스" 채널 내의 흐름을 차단하기 때문이다. 밸브 폐쇄 (양압) 압력을 감소시킴으로써 이러한 바람직하지 않은 거동이 감소할 수 있지만, 이는 밸브 누수 현상을 증가시키는 경향이 있어서, 일반적으로 칩 성능을 열화시킨다. 도 33은 버스 채널 컷 오프를 보여준다. 3개의 밸브 상태에서의 PDMS 막(적색) 변형. 도 33a는 개방 밸브를 보여준다. 막은 공압 층으로 당겨진다. 도 33b는 폐쇄 밸브를 보여준다. 정상 조작시, 막은 밸브 시트를 실링하여, 밸브를 폐쇄한다. 버스 채널을 통한 흐름이 지연된다. 도 33c는 버스 채널 컷오프를 보여준다. 증가된 가요성으로, 막은 밸브 동공으로 변형되어, 버스 채널 내의 흐름을 차단한다. 대안적으로, 밸브 동공 및 유입/유출 채널이 결코 중첩되지 않도록 보장함으로써 버스 채널 없이 칩을 설계할 수 있다. 이것은 간단한 변화이지만, 이는 설계 융통성을 감소시킨다. 다행스럽게도, 증가된 진공 수준은 밸브 폐쇄 현상에 영향을 미치는 일 없이 공압 공동으로의 막 변형을 개선시킬 수 있다. 프로젝트를 통해 사용된 Hargrave 펌프에 의해 생성된 비교적 낮은 진공 압력(18~21 in Hg)은 KNF UN86과 같은 더 강한 펌프에 의해 개선될 수 있다. 28 in Hg을 초과하는 진공 수준을 성취하여, 개선된 비드 포획 및 RNA 정제 효율을 발생시킨다.
2. 자기장. 자기장 강도 및 비드 포획 효율은 더 큰 자석에 의해 증가될 수 있다. 그러나, 조심스런 장 형성 및 자기 차폐가 이행되지 않는 경우, 칩을 통한 표유 전자계가 원치 않는 위치에서 비드를 포획하는 경향이 있어서, 칩 조작 효율을 감소시킬 수 있다.
3. 완충제 점도. 본 발명자들은 일상적으로 비드 수집 효율이 물에서 가장 높고, Bead Binding Buffer에서 가장 낮다는 것을 관찰하였다. 이 차이에 대한 원인은 10% PEG8000의 존재로 인한 완충제의 높은 점도일 수 있다.
4. 펌핑 용적. 본 발명자들은 또한 비드 포획 효율이 펌핑 용적에 의해 영향을 받는다는 것을 관찰하였다. 이는 아마도, 일정한 분량의 비드의 경우, 증가된 펌핑 용적이 비드 상에 전체 수력학적 항력을 더 증가시키고, 따라서 BPump로부터의 비드 손실이 더 크기 때문이다.
5. RNA 분량. 본 발명자들은 최근에 본 발명의 칩 내에서 비교적 다량의 RNA의 정제와 관련한 흥미롭고 예상치 못한 현상을 관찰하였다. 도 34에 도시된 바대로, 비드의 분포는 이에 결합된 RNA의 양의 강한 함수이고, 증가하는 양의 RNA와 비드와의 회합은 점진적으로 더 확산된(덜 농축된) 비드 수집 패턴을 생성시킨다. 도 34는 비드 수집 및 정제 효율에 대한 RNA 효과를 보여준다. 랫트 간 전체 RNA의 표시 분량이 0.125 ㎕ SpeedBead에서 포획되고 RNA가 정량을 위해 정제된다. 확산 비드 수집 패턴은 수력학적 항력으로 인한 증가된 비드 손실과 관련된다. 예상된 바대로, RNA 정제 수율이 2 ㎍에서의 거의 90%로부터 40 ㎍에서의 약 70%로 감소한다. 이 현상은 벤치 제어 실험에서 명확하지 않다(도 28, 도 29 및 도 30). 이 현상은 RNA의 정전기 반발로 인한 것일 수 있다. 그러나, 1X Bead Binding Buffer의 높은 염 농도(1.25 M NaCl)는 이러한 이온 효과를 상당히 차폐시킬 수 있다. 다른 가능성은 RNA 회합이 비드를 "접착성"으로 만들어, 비드가 (예를 들면) PDMS 막에 접하면서 이것이 이 막에 접착하도록 한다는 것이다. 그 후, 이것은 막의 더 깊은 부분으로 "떨어짐"으로써 비드가 농축되는 것을 방지한다. 도 35(왼쪽)에 도시된 바대로, 0.5X 및 2X 비드가 또한 농축되지 못하면서, 비드 분포가 비드 분량에 강하게 의존하는 것으로 보이지 않는다. 그러나, 놀랍게도 도 35(오른쪽)에 도시된 바대로, 0.5X 및 2X 비드가 덜 정제된 RNA를 생성시키면서, RNA 정제 효율은 비드 분량의 강한 함수인 것으로 보인다. 1X 비드가 최적인 것으로 밝혀졌다는 것이 아마도 놀랍다. 도 35는 비드 분량의 함수로서의 RNA 효과를 보여준다. 랫트 간 전체 RNA의 40 ㎍이 표시된 비드 분량에서 포획되었다. 1X 비드가 0.125 ㎕ SpeedBead이다. 이 비드 분량을 관찰에 기초하여 프로젝트에서 초기에 선택하고, 이것은 BPump에서 효과적으로 포획될 수 있는 최대 양이라는 것을 제시한다. 따라서, 이러한 관찰은 2X 비드에서 감소한 것이 RNA 정제 효율 BPump 과부하로 인한 것일 수 있다는 것을 제시한다. 0.5X 비드에서의 감소된 RNA 정제 효율은 칩 내의 증가된 비특정한 비드 손실로 인할 수 있고/있거나, 증가된 비드 분산은 증가된 정전기 반발 또는 점착성으로 인할 수 있다.
E. 효소 반응
Ambion Message Amp Ⅲ 반응을 도 36에 도시된 바대로 각각의 반응 단계 온-칩 후에 순차적으로 및 점진적으로 확인한다.
실험 1(+K, 모두 오프-칩)은 표준 Message Amp Ⅲ kit 키트에 대해 양성 대조군으로서 작용한다. 그 후, 증가한 수의 단계가 온-칩 수행되는 실험 2~5의 생성물을 실험 1과 비교한다. aRNA 분량 및 품질을 흡광도, 겔 전기영동 및 모세관 전기영동(Agilent BioAnalyzer)에 의해 모니터링하고, 이들은 또한 aRNA 크기 분포를 규명하기 위해서도 사용된다. Strategene Universal Human Reference(UHR) RNA를 출발 물질로서 사용한다.
실험 2: 역전사(RT) 반응. 온-칩 RT 반응의 결과가 도 37에 도시되어 있다. 칩 및 벤치 Bioanalyzer 크기 분포가 유사하게 보이고, 놀랍게도, 칩 기반 RT로부터의 수율은 벤치 대조군보다 더 높았다. 이는 칩 기반 반응에 대한 무심코 연장된 RT 항온처리 시간에 기인할 수 있다.
도 37은 실험 1(벤치 양성 대조군, K+) 및 실험 2(칩, RT)를 보여준다. BioAnalyzer 및 UV 흡광도 규명. 벤치 양성 대조군 및 칩 기반 RT 반응에 대략 415 ng의 UHRR을 사용한다. 항온처리는 다음과 같다: 42℃/30 m(RT), 16℃/60 m(SS), 65℃/10 m(Kill) 및 4O℃/120 m(IVT). 반응 시간이 Message Amp Ⅲ보다 짧다는 것에 유의한다. 각각의 샘플을 BioAnalyzer에서 2회 운전한다.
실험 3: Second-Strand(SS) 반응. 온-칩 RT 및 SS 반응의 결과가 도 38에 도시되어 있다. 칩 및 벤치 크기 분포 및 수율이 유사하게 보인다.
도 38은 실험 1(벤치 양성 대조군, K+) 및 실험 3(칩 SS)을 보여준다. BioAnalyzer, UV 흡광도 및 아가로스 겔 규명. 벤치 양성 대조군 및 칩 기반 RT 반응에 대략 415 ng의 UHRR을 사용한다. 항온처리는 다음과 같다: 42℃/30 m(RT), 16℃/60 m(SS), 65℃/10 m(Kill) 및 40℃/120 m(IVT). 반응 시간이 Message Amp Ⅲ보다 짧다는 것에 유의한다. 각각의 샘플을 BioAnalyzer에서 2회 운전한다. 겔 상의 A3 레인은 aRNA 벤치 음성 대조군이고, RNA 레인은 UHRR 출발 물질이다.
실험 4: 인-비트로 전사(IVT) 반응. 온-칩 RT, SS 및 IVT 반응의 결과가 도 40에 도시되어 있다. 칩 및 벤치 크기 분포 및 수율이 유사하게 보인다. 도 40은 실험 1(벤치 양성 대조군, K+) 및 실험 4(IVT)를 보여준다. BioAnalyzer, UV 흡광도 및 아가로스 겔 규명. 벤치 양성 대조군 및 칩 기반 RT 반응에 대략 230 ng의 UHRR을 사용한다. 항온처리는 다음과 같다: 42℃/30 m(RT), 16℃/60 m(SS), 65℃/10 m(Kill) 및 40℃/120 m(IVT). 반응 시간이 Message Amp Ⅲ보다 짧다는 것에 유의한다. 각각의 샘플을 BioAnalyzer에서 2회 운전한다. 겔 상의 A3 레인은 aRNA 벤치 음성 대조군이고, RNA 레인은 UHRR 출발 물질이다.
실험 5: 정제. 온-칩 RT, SS, IVT 반응 및 정제의 결과가 도 41에 도시되어 있다. 칩 및 벤치 크기 분포가 유사하게 보이지만, 칩 수율은 벤치의 오직 약 50%이다. 이는 아마도 비드 손실로 인한 비효율적인 칩 기반 정제에 기인할 수 있다.
도 41은 실험 1(벤치 양성 대조군, K+) 및 실험 5(RNA 정제)를 보여준다. BioAnalyzer, UV 흡광도 및 아가로스 겔 규명. 벤치 양성 대조군 및 칩 기반 RT 반응에 대략 310 ng의 UHRR을 사용한다. 항온처리는 다음과 같다: 42℃/30 m(RT), 16℃/60 m(SS), 65℃/10 m(Kill) 및 40℃/120 m(IVT). Message Amp Ⅲ보다 짧다는 것에 유의한다. 수율 및 증폭 인자는 도 39에 도시된 표에 요약되어 있다. 일반적으로, 증폭 인자 및 유입량은 예상된 바대로 반비례한다. 전체적으로, 데이터는 효소 반응이 breadboard 시스템에서 효과적으로 수행된다는 것을 보여준다.
F.
마이크로어레이
분석
벤치 및 칩 생성 aRNA를 Affymetrix Ul 33 Plus 2.0 전체 게놈 마이크로어레이에서 비교한다. 실험을 Microarry Quality Control(MAQC) 연구의 라인을 따라 설계하여, 그 결과를 산업 표준과 비교한다. MAQC와 일치하게, 증폭된 RNA를 2개의 상이한 RNA 유입으로부터 생성하였다: Stratagene UHRR 및 Ambion Human Brain Reference RNA(HBRR). 실험의 설계가 도 42에 도시되어 있다. 벤치 또는 칩 합성 후, 모든 aRNA를 94℃에서 30 분 동안 Ambion Message Amp Ⅲ 시약으로 단편화하고, 드라이 아이스에서 발현 분석으로 운송한다.
도 42. 마이크로어레이 실험 설계. 3개의 샘플의 4개의 세트를 생성한다: 벤치(B) UHRR 및 HBRR 및 칩(C) UHRR 및 HBRR. 비교를 위해 Affy 및 TaqMan MAQC 데이터를 사용한다. 결과를 평균 UHRR 및 HBRR 데이터의 로그비(Ir)로서 나타냈다.
도 43에 도시된 표 A 및 표 B는 벤치 및 칩 생성 샘플에 대한 aRNA 수율을 보여준다. 도 44는 단편화 전 및 후 샘플의 BioAnalyzer 전기영동도를 보여준다. 중요한 실험 결과가 도 45에 요약되어 있고, 이것은 도 42에 정의된 4개의 로그비 샘플을 비교한 4×4 매트릭스를 보여준다.
도 44는 UHRR 및 HBRR aRNA 전기영동도를 보여준다. 도 44 상부는 단편화 전을 보여준다. 도 44 하부는 단편화 후를 보여준다.
상기 기재된 바대로, 이 실험의 1차 목적은 벤치 및 칩 aRNA를 비교하는 것이다. 도 45 및 도 46에서의 결과는 명확히 이 2개의 샘플이 매우 높게 상관된다는 것이다(Pearson 상관 계수 = 0.99712). 데이터는 또한 MAQC Affymetrix 샘플이 벤치(0.87036) 또는 칩(0.86823)의 샘플 중 어느 것보다 MAQC TaqMan(0.92431)에 더 높게 상관된다는 것을 보여주는 것으로 보인다. 그러나, 추가의 부트스트랩 재샘플링 분석은 이 차이가 통계적으로 유의하지 않다는 것을 보여준다.
도 45는 마이크로어레이 결과 4×4 비교 매트릭스를 보여준다. 4개의 데이터 세트: MAQC TaqMan(lr_TAQ_1), MAQC Affymetrix(lr_atx_1), 벤치(lr-벤치) 및 칩(lr 칩)를 비교한다. 각각의 매트릭스 엔트리는 3개의 성분(상부-대-하부): Pearson 상관 계수, 확률 > |r| 및 관찰 수를 갖는다. 확률 > |r|은 상응하는 연관이 0인 가능성이다. 관찰 수(469)는 TaqMan 및 Affymetrix 데이터 세트 둘 다에서 검출된 MAQC 연구에서의 다양한 트랜스크립트이다.
도 46은 칩 대 벤치 비교를 보여준다. 도 46 왼쪽은 Over 468 MAQC-Common Transcript를 보여준다. 도 46 오른쪽은 Over 20,689 Common Transcript를 보여준다.
G.
단편화
또한, 본 발명자들은 또한 최근에 Ambion Message Amp Ⅲ 화학을 이용하여 시스템 상에서 마이크로어레이 작업흐름도(도 24a)의 단편화 단계를 수행하였다. 간단히 말하면, E12로부터 정제된 aRNA를 Ras4B로부터 Out2로 단편화 완충제(4:1 비)와 혼합한다. 그 후, Fluorinert를 혼합물 뒤로 펌핑하고, 광유를 상부에 적층한다. 그 후, 혼합물을 94℃에서 35 분 동안 항온처리하고, 피펫 팁으로부터 제거하고, 분석한다. 도 31에서의 결과는 칩 및 벤치 단편화가 구별 불가능하다는 것을 나타낸다.
도 47은 온-칩 단편화를 보여준다. 도 47 왼쪽은 단편화 전 aRNA를 보여준다. 도 47 오른쪽은 단편화 후 aRNA를 보여준다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 기재되어 있지만, 이것은 그 실시양태가 오직 예의 방식으로만 제공된다는 것이 당업자에게 명확하다. 다양한 변형, 변경 및 치환이 본 발명으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 일어날 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행시 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 특허청구범위가 본 발명의 범위를 한정하고, 이 특허청구범위 내의 방법 및 구조 및 이의 등가물이 이에 의해 포함된다는 것으로 의도된다.
Claims (12)
- (a) 카트리지;
(b) 카트리지와 유체로 접속되는, 하나 이상의 미세유체 다이어프램 밸브를 갖는 미세유체 칩; 및
(c) 지지 구조물, 카트리지와 열 접촉하는 하나 이상의 온도 제어 장치 및 미세유체 칩을 공압식으로 작동시키기 위한 공압 라인을 포함하는 기부
를 포함하는 장치. - 제1항에 있어서, 기부는 지지 구조물 내에 위치하는 공압 플로터를 더 포함하는 것인 장치.
- 제2항에 있어서, 공압 플로터가 공압 플로터를 미세유체 칩 쪽으로 누르는 스프링에 의해 지지되는 것인 장치.
- 제2항에 있어서, 공압 플로터가 공압 플로터와 미세유체 칩 사이의 기밀 시일을 가능하게 하는 스프링에 의해 지지되는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 지지 구조물은 강성인 장치.
- 제1항에 있어서, 기부는 카트리지와 유체로 접속되는 공압 삽입물을 더 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 카트리지는 서미스터를 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 카트리지가 사이클릭 올레핀 공중합체로부터 형성된 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 카트리지가 사출 성형된 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 지지 구조물은 히트 싱크인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 장치는 기부 상에 탑재된 공압 매니폴드를 더 포함하고, 공압 매니폴드는 압력 또는 진공을 미세유체 칩에 전달하여 다이어프램 밸브를 작동시키기 위해 미세유체 칩 상에 공압 라인 및 공압 포트와 공압 연통하는 바이어 또는 채널을 포함하고, 공압 매니폴드는 칩을 체결하여 온도 제어 장치가 또한 카트리지와 열 접촉되도록 바이어스 배치로 지지체 상에 탑재되는 것인 장치.
- (a) 하나 이상의 공압식으로 작동되는 밸브 및 하나 이상의 챔버를 갖는 미세유체 칩; 및
(b) 챔버와 유체로 접속되는 하나 이상의 저장소를 포함하고 상기 저장소는 물질이 챔버로 직접 피펫팅될 수 있도록 하는 크기로 되어 있는 카트리지
를 포함하는 장치.
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2010
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