MXPA01013423A

MXPA01013423A - Sistemas de cultivo celular y metodos para dispositivos auxiliares del organo.

Info

Publication number: MXPA01013423A
Application number: MXPA01013423A
Authority: MX
Inventors: Maury D Cosman
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2002-12-05
Also published as: ATE373079T1; JP2003503022A; EP1203075A4; IL147207A0; US6759245B1; US20030017142A1; EP1203075B1; JP4605734B2; EP1203075A1; CA2375505A1; AU5756700A; DE60036385D1; WO2000078932A1; DE60036385T2

Abstract

La invencion se caracteriza por dispositivos de cultivo celular (1) que incluyen uno o mas modulos de placa plana (2) y se basa en el descubrimiento de que si los flujos de medio liquido y fluido oxigenado se separan por una membrana impermeable al liquido, permeable al gas, y las celulas se desarrollan unidas al lado liquido de la membrana, el dispositivo puede utilizarse para cultivar celulas con transporte de oxigeno a traves de la membrana (es decir, oxigenacion directa), sin considerar la velocidad de flujo del medio liquido que pasa a traves del dispositivo. El nuevo flujo a traves de los dispositivos de cultivo celular (1) de esta manera puede utilizarse para cultivar celulas, por ejemplo, hepatocitos, con niveles elevados de funcion celular en el organo, por ejemplo, sistemas auxiliares del higado, para la produccion de celulas, para produccion de productos derivados de la celula, tales como proteinas o virus, o para sistemas para tratar liquido biologico para remover las toxinas, tales como amonio, o agregar productos sintetizados de celula, o ambos.

Description

TEMAS OH CULTIVO CELULAR Y MÉTOOOS PARA DISPOSITIVOS AUXILIARES DEL ÓRGANO.

Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas 5 Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/140, 125, presentada el 21 de Junio de 1999, la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/140,239, presentada el 21 de Junio de 1999, y la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/181 ,634, presentada el 10 de Febrero del 2000. Los contenidos de estas solicitudes se incorporan en la 0 presente para referencia en su totalidad.

Campo de la Invención La invención se refiere a sistemas y métodos para cultivar células en dispositivos auxiliares del órgano. 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Más de 43,000 americanos mueren cada año de enfermedad del hígado, haciéndola la décima causa de muerte relacionada a la enfermedad principal en los E.U. Cuando la enfermedad del hígado $ progresa al mal funcionamiento de! hígado, la mortalidad es de 80% al menos que se encuentre un órgano donador compatible. Como con otros órganos, existe una insuficiencia crítica de hígados donadores. Más de 12,000 pacientes se listan actualmente como candidatos a trasplante, pero poco menos de la mitad de ese número de hígados donadores llega a estar 5 disponible cada año. El tratamiento con un dispositivo auxiliar del hígado (LÁD) podrá reducir la mortalidad asscíada con el mal funcionamiento hígado al estabilizar los pacientes de tal forma que sean candidatos adecuados para un transplante, al soportarlos hasta que un hígado donador adecuado llegue a estar disponible, y/o al prevenir el deterioro del punto en donde se requiere un transplante de hígado. La mejora de tß salud pre-operativa de estos pacientes también podría aumentar el éxlts del transplante, reduciendo de tal modo la frecuencia de retransplantación y facilitar la demanda de los órganos donadores. En casos de mal funcionamiento hepático o repentino, el cual ooterre frecuentemente como resultado de la infección viral o toxicidad, el tratamiento con LAD podría eliminar la necesidad de un transplante al ayudar a estos individuos hasta que sus propios hígados se regeneren. El transplante de hígado actualmente es el procedimiento de transplante de órgano más caro. El desarrollo exitoso de un LAD podría proporcionar consecuentemente mayores beneficios a los E.U. en muertes y costos de cuidado de salud reducidos. Los dispositivos extracorpóreos para la ayuda del hígado temporales han sido investigados desde 1960. se han explorado dí>$ estrategias en el desarrollo de dispositivos auxiliares del hígado: (1 ) dispositivos no biológicos en base a la hemoperfusión en los sorbentes, hemodiálisis a través de las membranas permeables selectivamente, y el intercambio de plasma (Malchesky, "Non-biological liver support: historie overvievv", Artif. Organs, 18:342-347, 1994); y (2) dispositivos biológicos que incorporan células o componentes celulares (Yarmush et al. , " Assessment of artifical liver support technology", Cell Trans. , 1 :323-341 , #-"«. Los dispositivos no biológicos han mostrado solamente la eficacia limitada, confirmando que los materiales sintéticos no pueden • reemplazar el rango y nivel de funciones metabólicas complejas f^. S4 MMl almente realizadas por el hígado. Por el otro lado, un LAD biológico los hepatocitos se siembran sobre la superficie externa de las fibras vacías y sangre o plasma que circula a través del lumen de estas . fibras se propuso casi hace 25 años por Wolf y colegas (Wolf et ai. , "BMirubin coníqgati»$n by an artificial live composed of cultured cells and 10 synthetic capUlapes*, Tran. Amer. Soc, Artif. Int. Organs, 21 : 16-1975). Hoy en día, los diseños de LAD biológicos actuales utilizan la inversa de este concepto. Los diseños modernos se basan frecuentemente en proporcionar la función del hígado crítica al mantener las suspensiones de hepatocito de alta densidad en las fibras vacias, con la circulación de 15 saßgre o plasma por fuera de las fibras. En este diseño, la función del hígado extracorpórea intermitente es para proporcionarse hasta que el patente se recupere a través de la regeneración del hígado o hasta que un transplante llegue a estar disponible. Sin embargo, el diseño de fibra "F vacía se limita mediante diversos factores, incluyendo: a) transporte de 20 masa inadecuado, particularmente de oxígeno, b) falta de entendimiento de la función de hepatocito en un ambiente in vitro, c) arquitectura del tejHdo aleatorizado para mantener la viabilidad y función celular, y d) impedimentos de volumen nulo en el circuito de perfusión para el dispositivo 25 Las fibras vacías se han elegido para LADs en la base de disponibilidad lista diferente a la habilidad demostrada para mantener la función de hepatocito. La perfusión de cultivos de hepatocito de alta densidad en las fibras vacías ha mostrado una falta de convicción de áb beneficio debido, entre otras razones, a las limitaciones del transporte que 5 socavan su soporte de cultivos de alta densidad. Tales limitaciones son particularmente agudas para el oxígeno, el cual se requiere tanto para la función metabólica así como también para las etapas iniciales en detoxificación. La perfusión de plasma o medio oxigenado a través o alrededor de una red de fibras vacías se equivoca en nombrar este 10 problema debido a que estos líquidos acuosos son vehículos insuficientes para el oxígeno y las distancias asociadas para el transporte son relativamente largas. Las modificaciones al diseño de fibra vacia de núcleo (por ejemplo, el uso de una red de horno de tres series independientes de capilares que proporcionan la oxigenación integral) 15 complican significativamente la fabricación y nombran incompletamente las limitaciones de transporte subyacentes. También carecen de la habilidad para orientar los hepatocitos en una configuración laminar más organotípica. 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se caracteriza por dispositivos de cultivo celular modular comprendidos de uno o más módulos de placa plana. La invención se basa en el descubrimiento de que si los flujos de medio líquido y un fluido oxigenado se separan por una membrana impermeable 25 al líquido, permeable al gas, y las células se desarrollan cultivadas en lado >P Hi líquido de la membrana, el dispositivo puede utilizarse para cultivar células con transporte de oxígeno a través de la membrana a las células con control independiente de la velocidad de flujo del líquido que pasa a través del dispositivo. Los nuevos dispositivos de cultivo celular a través de flajo pueden utilizarse de esta manera para cultivar células, por ejemplo, hepatocitos, con altos niveles de función celular en el órgano, por ejemplo, sistemas auxiliares del hígado, para la producción de células, para producción de productos derivados de la célula, tales como proteínas o virus, o para sistemas para tratar líquidos biológicos para remover las * toxinas, tales como amonio, agregar productos sintetízaos de célula, o „ ambos. En general, la invención se caracteriza por métodos y dispositivos para el cultivo de células que proporcionan la oxigenación directa de células a través de las membranas permeables al gas, planas. Cuando el aparato se siembra con las células adecuadas y se incorpora en un dispositivo, el dispositivo puede utilizarse para tratar a un paciente con un órgano, tal como el hígado, en necesidad de asistencia funcional. La invención se caracteriza por métodos para cultivar células que incluyen: proporcionar una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, que tiene una primer superficie y una segunda superficie; sembrar células en la primer superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas; contactar las células con un medio de cultivo que contiene nutriente; proporcionar un fluido oxigenado en la segunda superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, a una presión suficiente para proporcionar la oxigenación de transmembrana en las células sembradas en la primer superficie; y cultivar las células bajo condiciones que promueven la viabilidad y función de las células. * El dispositivo puede sembrarse con hepatocitos, por ejemplo, 5 hepatocitos de porcino, equino, ovino, bovino, conejo, rata, canino, felino, o murino. Adicionalmente, el dispositivo puede sembrarse con hepatocitos humanos. El dispositivo puede sembrarse con 2 a 20 billones de hepatocitos. Los hepatocitos pueden sembrarse directamente en la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, y revestirse así con 10 colágeno. Adicionalmente, los hepatocitos pueden sembrarse directamente en la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, y • revestirse así con colágeno. Alternativamente, la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, puede revestirse con colágeno, y los hepatocitos pueden sembrarse directamente sobre la membrana revestida 15 de colágeno. Las células pueden sembrarse a través de ia membrana entera de arriba de la membrana. En una modalidad, el oxígeno contenido en el fluido oxigenado se encuentra en o arriba de la presión parcial crítica de oxígeno. En una modalidad, las células se conservan. Las células 20 pueden conservarse mediante crioconservación, almacenamiento hípotérmico, o liofilización. El material de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, puede elaborarse de, por ejemplo, poliestireno, poliolefina, polietileno, polipropileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, nylon 25 tratado hidrofóbico, poliuretano, poliéster, estireno en capas/butadieno- estireno/acetato vinil et?lo/estireno-buta«Jíeno-esti?teno, o estireno en capas-butadieno-estireno/polietileno. La primer superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, puede tratarse, por corona tratada. En otra modalidad, la primer superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas se reviste por colágeno. En una modalidad, la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado es entre aproximadamente 0% a aproximadamente 90% de oxígeno. Adicionalmente, la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado puede ser entre aproximadamente 19% a aproximadamente 60%, o 40% a aproximadamente 60%, de oxígeno. La concentración de oxígeno en este fluido oxigenado puede controlarse para promover o subregular la función celular. En una modalidad, se perfusiona el medio de cultivo que contiene nutriente. Adicionalmente, el método puede además incluir filtrar ei plasma sanguíneo. La invención también se caracteriza por un dispositivo de cultivo celular a través de flujo que incluye un alojamiento con una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, una entrada líquida y una salida líquida, y paredes, primera y segunda, para formar una cámara; $a membrana impermeable al líquido, permeable al gas, instalada entre las» paredes, primera y segunda, para separar la cámara en un compartimiento de fluido oxigenado que comprende una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, y un compartimiento líquido que comprende una entrada líquida y salida líquida; y una membrana -*ste ftweabla a qui o insta a a entre una pared y la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, para separar el compartimiento líquido en un compartimiento celular y un compartimiento de perfusión líquida, en donde la entrada de fluido oxigenado y la salida de fluido oxigenado se instalan de tal forma que el fluido oxigenado que entra en la entrada de fluido oxigenado fluye en la entrada de fluido oxigenado y a través del compartimiento de fluido oxigenado y sale del compartimiento de fluido oxigenado a través de la salida de fluido oxigenado y el alojamiento a través de la salida de fluido oxigenado, y en donde la entrada líquida y salida líquida se instalan de tal forma que el líquido que entra en la entrada líquida fluye en la entrada líquida a través del compartimiento de perfusión líquida y sale del compartimiento de perfusión líquida a través de la salida líquida y el alojamiento a través de la salida líquida. En una modalidad, en donde en uso, las células se siembran sobre la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, y ei espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, es más grande al tamaño de una célula. Además, en dwde en uso, las células pueden sembrarse ya sea sobre la membrana impermeable al líquido, permeable algas, o la membrana permeable al líquido, y el espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, es aproximadamente igual al tamaño de una célula. Adicionalmente, en donde en uso, las células pueden sembrarse sobre la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, y sobre la membrana permeable al líquido, y el espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al liquido, permeables al gas, es aproximadamente igual al tamaño de dos células adyacentes. El dispositivo puede además incluir una fibra vacía permeable al líquido instalada en el compartimiento líquido. Adicionalmente, et alojamiento puede instalarse para permitir el apilamíento de un dispositivo sobre la parte superior de otro dispositivo. La invención también incluye un sistema auxiliar del hígado incluyendo un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la invención; un primer conducto para conducir el plasma de un paciente a la entrada del alojamiento; un segundo conducto para conducir el plasma del dispositivo de cultivo celular al paciente; y una bomba para mover el plasma a través de los conductos y el dispositivo de cultivo celular. El sistema puede además incluir un separador de plasma para remover las células sanguíneas de la sangre total para proporcionar el plasma que paisa a través del dispositivo de cultivo celular. El sistema puede incluir a lcionalmente un interceptor de burbujas, para remover las burbujas del plasma en el primer conducto antes de entrar al dispositivo de cultivo celular. La invención también se caracteriza por un sistema auxiliar del hígado que incluye un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la ínv-encíón; un dispositivo de inmunoaislamiento; un primer conducto para conducir el plasma de un paciente a un dispositivo de inmunoaislamiento; un segundo conducto para conducir el plasma del paciente a un dispositivo de inmunoaislamiento al paciente; un tercer conducto para conducir el medio líquido del dispositivo de cultivo celular al dispositivo de inmunoaislamiento; y, un cuarto conducto para conducir el medio líquido del dispositivo de inmunoaislamiento al paciente; y, una bomba para mover el plasma a través de los conductos y el dispositivo de cultivo celular. La invención también incluye un método para filtrar el plasma sanguíneo. Este método incluye sembrar un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la invención con hepatocitos; introducir el plasma sanguíneo en la entrada líquida del dispositivo; suministrar un fluido oxigenado en la entrada de fluido oxigenado del dispositivo; permitir que el fluido oxigenado fluya a través del compartimiento de fluido oxigenado y - salga del dispositivo a través de ta salida de fluido oxigenado; y permitir que el plasma sanguíneo fluya a través del dispositivo y salga a través de la salida líquida, filtrando de tal modo el plasma sanguíneo. La invención también incluye un método para tratar un paciente en necesidad de sistema auxiliar del hígado. El método incluye unir el sistema auxiliar del hígado de la invención al flujo sanguíneo de un paciente y tratar al paciente. La invención también se caracteriza por un dispositivo de Cultivo celular a través de flujo que incluye un alojamiento con una entrada líquida y una salida líquida, una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, y paredes, primera y segunda, para formar una cámara; y una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, instalada entre las paredes para separar la cámara en un compartimiento de fluido oxigenado que comprende una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado y un compartimiento líquido que comprende una entrada liquida y una salida líquida, en donde la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se siembra con células, en donde la entrada líquida y salida líquida se instalan de tal forma que el líquido biológico que entra en la entrada fluido fluye en la entrada líquida y a través del co?f*partimiento líquido y sale del compartimiento líquido a través de ia s lida líquida y el alojamiento a través de la salida líquida, y en donde la entrada de fluido oxigenado y la salida de fluido oxigenado se instalan de tal forma que el fluido oxigenado que entra en la entrada de fluido oxigenado fluye en la entrada de fluido oxigenado y a través del compartimiento de fluido oxigenado y sale del compartimiento de fluido oxigenado a través de la salida de fluido oxigenado y el alojamiento a través de la salida de fluido oxigenado. La membrana impermeable al líquido, permeable al gas, puede séf porosa y no porosa. La membrana impermeable al líquido, permeable al gas, comprende poliestireno, una poliolefina, polietileno, polipropileno, ftudruro de polivinilideno, poliuretano, poli(estireno-butadieno-estireno), poli(etil vinilacetato), nylon, caucho de silicio, poli(tetrafluoroetileno), o compuestos, mezclas, o copolimeros de los mismos. La membrana impermeable al líquido, permeable al gas puede tratarse por superficie, por ejemplo, con una descarga de corona o un revestimiento de aglomerante extracelular. En una modalidad, se coloca un gel sobre las células.

Alternativamente, puede colocarse un gel sobre la membrana impermeable al líquido, permeable al gas. El gel puede contener células suspendidas dentro de dicho gel. La invención también se caracteriza por un método para filtrar el plasma sanguíneo que incluye sembrar un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la invención con hepatocitos, introducir el plasma sanguíneo en la entrada líquida del dispositivo; suministrar un fluido oxigenado en la entrada de fluido oxigenado del dispositivo; permitir que el j. í\máo oxigenado fluya a través del compartimiento de fluido oxigenado y • 5 sßlga del dispositivo a través de la salida de fluido oxigenado, y permitir que el plasma sanguíneo fluya a través del dispositivo y salga a través de la salida líquida, filtrando de tal modo el plasma sanguíneo. Al menos que se defina de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado 10 según se entiende comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. A pesar de que los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, se describen abajo materiales y métodos adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de 15 patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en ta presente se incorporan para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, controlarán, la presente invención incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se • pretende que sean limitantes. 20 Los nuevos dispositivos de cultivo celular a través de flujo y sistemas auxiliares del órgano proporcionan numerosas ventajas. Los nuevos dispositivos permiten que diversas células se cultiven con niveles deseables de transporte de masa de oxígeno y otros nutrientes, desperdicios, y productos benéficos, mientras se reduce potencialmente el 25 esfuerzo cortante perjudicial normalmente asociado con los niveles relativamente cortas tales como hepatocitos, pueden cultivarse por períodos largos de tiempo a velocidades de flujo de medios relativamente bajas con altos niveles de función. Como consecuencia, la oxigenación y 5 perfusión pueden controlarse independientemente. Además, estos dispositivos permiten el tratamiento directo de superficies para la promoción de unión y función celular así como también ia distribución más uniforme de células dentro de los dispositivos en la forma de cultivos laminares que estimulan la arquitectura in vivo del hígado. Estas 0 características permiten que los nuevos dispositivos de cultivo celular a través de flujo se utilicen en órgano, por ejemplo, sistemas auxiliares del lo. Los estudios clínicos han mostrado que la función det hígado adecuada puede mantenerse in vivo con tan poco como el 10% de la masa 5 celular normal que sugiere un LAD eficaz podría soportar al menos 1010 hepatocitos con aproximadamente niveles in vivo de función. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama esquemático de un sistema auxiliar del hígado. La Figura 2 es un diagrama esquemático de una modalidad de un dispositivo de cultivo celular de "dos compartimientos" de la invención 5 incluyendo una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, que sepUíra los dos compartimientos. La Figura 3 es un gráfico que muestra la presión parcial de oxígeno en el gas alimentador de dispositivo necesario para lograr ft suficiente oxigenación, bajo la oxigenación de transmembrana, para 5 balancear la velocidad de consumo de oxígeno de hepatocitos por un rango de densidades de célula (pCéiuias) y para diferentes permeabilidades de membrana en velocidades celulares y/u oxígeno de consumo de oxígeno. Las Figuras 4a a la 4f son diagramas esquemáticos de 10 modalidades de dispositivos de cultivo celular de "dos compartimientos" de # la invención incluyendo una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, que separa los dos compartimientos. Las Figuras 5a a la 5f son diagramas esquemáticos de modalidades de dispositivos de cultivo celular de "tres compartimientos" de 15 la invención que incluyen membranas permeables al liquido e impermeables al líquido, permeables al gas. Las Figuras 6a a 6c son diagramas esquemáticos de modalidades de dispositivo de cultivo celular de múltiples compartimientos que comprende al menos dos membranas impermeables al líquido, 20 permeables al gas. Las Figuras 7a y 7b son diagramas esquemáticos de modalidades del dispositivo de cultivo celular que comprende una pluralidad de compartimientos apilados. Las Figuras 8a y 8b son diagramas esquemáticos de 25 modalidades de policopias para un dispositivo de cultivo celular que comprende una pluralidad de cámaras de cultivo celular de "dos compartimientos". Las Figuras 9a y 9b son diagramas esquemáticos de vistas ? - laterales de los dispositivos de cultivo celular. 5 Las Figuras 10a y 10b son diagramas esquemáticos de los componentes de un circuido de perfusión para dispositivos de cultivo celular. La Figura 1 1 es un gráfico que compara la síntesis de urea por hepatocitos cultivados estáticamente en dispositivos que comprenden 10 recipientes de cultivo de tejido y poliestireno permeables al gas de 0.002" de espesor tratados por corona, revestidos de colágeno. * Las Figuras 12a, 12b, 12c, y 12d son gráficos que muestran los efectos de oxigenación en ta unión (12a) de células un día después de sembrarse, (12b) síntesis ofrecida y fundamental de urea, (12c) actividad 15 de detoxificación para alcoxiresorufinas, y (12d) metabolismo de lidocaína por hepatocitos cultivados estáticamente en dispositivos que comprenden una membrana permeable al gas de poliestireno revestido de colágeno, tratado por corona de 0.002" de espesor. • La Figura 13 es un gráfico que muestra el efecto de 20 oxigenación de transmembrana en las actividades de detoxificación para alcoxiresorufina por hepatocitos cultivados estáticamente en dispositivos que comprenden TYVEK® 1073. La Figura 14 es un gráfico que muestra el efecto de cambios en la velocidad de flujo volumétrico de medio en síntesis de urea por 25 hepatocitos cultivados en dispositivos perfusionados que comprenden Í - 16 - "F* -> y ff?stirenQ revestido de colágeno, tratado por corona de 0.002" de espesor. La Figura 15 es un gráfico que muestra el efecto de cambios en el volumen de medio en síntesis de urea por hepatocitos cultivados en dispositivos perfusiones que comprende poliestireno revestido de colágeno, tratado por corona de 0.002" de espesor. Las Figuras 16a y 16b son gráficos que muestran el efecto de cambios en el volumen de medio en (a) síntesis de urea, y (b) en la secreción de albúmina para hepatocitos cultivados en dispositivos perfusionados que comprenden TYVEK® 1073. La Figura 17 es un gráfico que muestra los efectos de oxigenación de transmembrana y densidad de siembra celular en ureagénesis para hepatocitos cultivados en dispositivos perfusionados que comprenden poliestireno revestido de colágeno, tratado por corona de 0.002" de espesor. La Figura 18 es un diagrama esquemático de una vista lateral de ¿dispositivo de cultivo celular en tamaño para tratar una rata. La Figura 19 es un diagrama esquemático de un par de dispositivos de cultivo celular instalados en una configuración paralela en un circuito de perfusión única.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Los nuevos dispositivos de cultivo celular permiten el cultivo de números relativamente grandes y altas densidades de células, por ejemplo, hepatocitos, en los dispositivos mientras se minimiza el volumen nulo total de líquido; permitiendo el control preciso, escalabilidad y modulapdad; y separar el flujo de medio (para el suministro de nutrientes y toxinas solubles y/o inductores; y la eliminación de desperdicios y derivados metabólícos) de la oxigenación. Los nuevos dispositivos son 5 inherentemente escalables y modulares. Los nuevos dispositivos permiten la separación de oxigenación de flujo de líquidos biológicos a través del uso de una membrana impermeable al líquido pero permeable al gas en do>nde las células crecen o se cultivan directamente. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de un sistema 10 auxiliar del hígado extracorpóreo en donde puede utilizarse los nuevos dispositivos de cultivo celular. El sistema incluye un bioreactor 1 con múltiples cartuchos 2. El bioreactor incluye una entrada de fluido oxigenado 3 para introducir un fluido oxigenado de un suministro de fluido oxigenado 4, una salida de fluido oxigenado 3', una entrada líquida 5 para 15 introducir un líquido biológico, suministrado por la bomba 6 de la unidad de inmunoaislamiento 7, en el bioreactor, y una salida líquida 5' para remover el líquido biológico del bioreactor para regresar a la unidad de inmunoaislamiento 7. La sangre de un paciente 9 fluye por medio de la • bomba 6' en una unidad de plasmaferesis 8, de la cual una parte del 20 plasma fluye así en la unidad de inmunoaislamiento 7, por medio de la bomba 6". El plasma tratado fluye desde la unidad de inmunoaislamiento 7 y se mezcla con la sangre de la unidad de plasmaferesis 8 antes de seguir de regreso en el paciente 9. Los nuevos dispositivos de cultivo celular contienen uno o más 25 cartuchos de dos compartimientos (o unidades). La Figura 2 muestra una modalidad de un cartucho de dos compartimientos que incluye una cámara 1 que tiene paredes impermeables 50 y un membrana impermeable al líquido, permeable at gas 30 que separa la cámara en dos regiones, o compartimientos, un compartimiento 10, y un segundo compartimiento 20. El primer compartimiento 10 se define por una de las paredes impermeables 50, las paredes laterales de la cámara, y la membrana impermeable al liquido, permeable al gas 30. El primer compartimiento 10 es un "compartimiento líquido" que contiene un líquido biológico 1 1 , tal como el medio de cultivo celular, una solución de sal balanceada, sangre, o plasma, y células 40. Las células 40 se cultivan sustancialmente en la membrana 30 y en contacto con el líquido biológico 1 1 . Las paredes se componen típicamente de plástico compatible a la célula tal como poliestireno y co-polímeros que son gruesos para hacerlas impermeables a líquidos y gases, metales o compuestos de los mismos tales como aluminio, acero inoxidable y otras mezclas. Estos materiales pueden utilizarse para otros componentes de dispositivo incluyendo ajustes y policopias. El segundo compartimiento 20 es un "compartimiento de fluido oxigenado" y se define por la segunda de las paredes impermeables 50, las paredes laterales de la cámara, y la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. Un fluido oxigenado 21 , típicamente un gas pero también posiblemente un líquido, capaz de llevar el oxígeno o un gas oxigenado y permitir el transporte de oxígeno a través de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, fluye a través del compartimiento 20. El oxígeno se encuentra disponible en las células en medio de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. Los fluidos oxigenados pueden ser gases o líquidos y pueden incluir aire, aire enriquecido de oxígeno, gas de oxígeno, mezclas de oxígeno y otros gases tal como dióxido de carbono, nitrógeno, argón, helio y otros gaées comúnmente encontrados en la naturaleza; líquidos tales como ftuorocarburos, líquidos perfluorados, y soluciones acuosas que contienen •hemoglobina sintética o equivalentes. A pesar de que la Figura 2 representa la cámara 1 dividida de tal forma que el compartimiento líquido 10 se encuentra arriba de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 y el compartimiento de fluido 20 se encuentra debajo de la membrana, ta cámara puede orientarse en cualquier dirección ya que la membrana divide l» cámara en dos compartimientos. Preferentemente, la altura de cada compartimiento es constante (a pesar de que no es necesariamente la misma para ambos compartimientos); sin embargo, la altura de cada compartimiento puede no ser uniforme, por ejemplo, variando a lo largo de la longitud y/o anchura del compartimiento. El fluido biológico 1 1 en el primer compartimiento (líquido) 10 suministra las células 40 con nutrientes básicos para el cultivo celular y lleva los metabolitos. El líquido biológico también suministra las células con toxinas, moléculas aminadas, y otros desperdicios biofógicos a mjetabolizarse y lleva los productos detoxificados, factores secretados^ y p eteínas. Para el cultivo in vitro de células, este líquido biológico preferentemente es un medio diseñado para el cultivo celular. El líquido gíco se suministra preferentemente a y se remueve del compartimiento interior hacia una abertura. Más preferentemente, existen al menos dos aberturas (no mostradas en la Figura 2), una abertura sirviendo como una abertura de entrada para suministrar el líquido fluido de una fuente de líquido biológico y otra abertura sirviendo como una salida para descargar o drenar el líquido biológico. Las aberturas se comunican entre el interior y el exterior del compartimiento líquido 10 por un puerto o policopia. Los puertos pueden conectarse con otros compartimientos líquidos de otras unidades o cartuchos de bioreactor en paralelo, en serie, o ambos, para crear un circuito o ciclo de flujo para la perfusión del líquido biológico. La adición de otros puertos pueden servir como ventilaciones para el desplazamiento del aire durante el llenado o como un medio para drenar el compartimiento cuando los otros puertos se unen a aquellos de otra unidad. El fluido oxigenado en el segundo compartimiento (de gas) 20 se suministra preferentemente a y se remueve del compartimiento interior a través de una abertura. Más preferentemente, existen al menos dos aberturas (no mostradas en la Figura 2), una abertura sirviendo como una abertura de entrada para suministrar el fluido oxigenado de una fuente de fluido oxigeftado 4 y otra abertura que sirve como una salida para descargar o ventilar el fluido oxigenado. Las aberturas se comunican entre el interior y e1 exterior del compartimiento de fluido oxigenado 20 por un puerto o policopia. Nuevamente, los puertos pueden conectarse con otros compartimientos de fluido oxigenado de otras unidades o cartuchos de bioreactor en paralelo, en serie, o ambos, para crear un circuito o ciclo de para ventilación a la pared del compartimiento. La membrana 30 es permeable al gas e impermeable al líquido. Las células 40 pueden unirse a cualquier superficie dentro del compartimiento líquido, pero se prefiere que la masa celular se cultive sustancialmente en la membrana y que la membrana sirva como un substrato de cultivo celular. Las células intercambian gas tal como oxígeno con el fluido oxigenado a través de la membrana. La membrana preferentemente es una configuración de hoja plana, plana, y se extiende en un plano para separar el compartimiento líquido 10 y el compartimiento de fluido oxigenado 20. La membrana es permeable al gas para permitir el transporte de oxígeno y posiblemente otros gases del fluido oxigenado a las células y de las células en el fluido oxigenado. La membrana debe ser impermeable al líquido bajo presiones encontradas en operación pero permeable al gas en el rango de aproximadamente 0.1 mL/m2/día a aproximadamente 1000 L/m2/día. La membrana debe ser capaz de ¡ esterilizarse, resistente a la perforación, desgarro, y arrugamiento, y ser capaz de manejarse durante la elaboración del dispositivo. Los materiales de la membrana de una o más capas que tienen ' las1' siguientes características, son adecuados para utilizarse en la invención: relativamente permeable al oxígeno y al menos parcialmente impermeable al agua en la ausencia de grandes diferencias de presión a lo largo de la membrana 30, relativamente no citotóxicas a las células en al menos un lado (de tal forma que la unión y función de las células no se limita por el material o que el material puede tratarse por superficie en un ad de tal forma que la unión función de las células no se limita por este lado tratado por superficie del material), y relativamente no degradante en la presencia del fluido oxigenado 21 y/o líquido biológico 1 1 . Para los materiales de doble lado, el lado que está de frente al compartimiento 5 líquido 10 debe ser relativamente no citotóxico y relativamente no degradante en la presencia del líquido biológico y el lado que está de frente al compartimiento de fluido oxigenado 20 debe ser relativamente no degradante en la presencia del fluido oxigenado. Los materiales de membrana que tienen estas características fácilmente pueden obtenerse 10 comercialmente o prepararse utilizando técnicas estándares. Los materiales de la membrana específicos para utilizarse en la invención incluyen capas únicas y compuesto multi-laminados de materiales microporosos y no porosos tales como el poliestireno no poroso, incluyendo poliestireno de 0.002 de espesor tal como POLYFLEX® 15 (de Plastics Suppliers); poliolefina microporosa; polietileno de alta densidad microporoso (HDPE), tal como TYVEK®, particularmente TYVEK® 1073 (DuPont); polipropileno microporoso; fluoruro de polivinilideno microporoso; pólicarbonato de trayecto grabado (con poros relativamente pequeños y no húmedos); nylon tratado hidrofóbico; poliuretano; poliéster W microporoso (con poros hidrofóbicos); otros polímeros inorgánicos, tales como polímeros inorgánicos microporosos y cauchos de silicona no porosos; poliestireno y polietileno co-extruido; una película co-extruida de tres capas de estireno-butadieno-estireno/acetato vinil etilo/estireno- butadieno-estireno (SBS/EVA/SBS); y una película co-extruida de dos 25 capas de estireno-butadieno-estireno/polietileno (SBS/PE).

La oxigenación de células 40 a través de la membrana impermeable at líquido, permeable al gas 30, requiere ya sea que la membrana se soporte por sí misma (por ejemplo,, posea suficiente rigidez mecánica para superar la gravedad, el peso de la membrana, el peso del líquido biológico si el líquido biológico se orienta arriba de la membrana, y cualquiera de las diferencias de presión aplicadas a lo largo de la membrana) o que la membrana se combine con o se lamine sobre un material de soporte más rígido. Este material de soporte debe ser ya sea lo suficientemente permeable, poroso, o espacialmente distribuirse de tal forma que no presente limitaciones significativas en el transporte de gas, particularmente para el oxígeno, y también tenga las mismas propiedades mecánicas de requisito. Por ejemplo, el uso de postes impermeables relativamente, ampliamente espaciados para soportar la membrana, puede satisfacer estos requisitos. En el cultivo de algunos tipos de célula, la oxigenación es mediante el medio de cultivo celular. Sin embargo, algunos tipos de célula, tales como hepatocitos, tienen requisitos de oxígeno que son característicamente altos en comparación a los otros tipos de célula. La función de hepatocitos viables también puede depender de la tensión de oxígeno. Otra consideración que intensifica este tipo de problema en un dispositivo auxiliar del órgano o de cultivo celular es la necesidad de incorporar grandes números y altas densidades de células en el dispositivo mientras se limita el volumen del líquido biológico. La velocidad a la cual el oxígeno se consume por las células, debe balancearse por el transporte de oxígeno a las células, ya sea mediante el transporte de oxígeno a lo largo de la membrana o a través del «itqyído biológico fluyente. La cinética del consumo de oxígeno por las células se da por la velocidad de toma de oxígeno (OUR), típicamente descrito en términos de Michaelis-Menten kinetics y expresados como moles de oxígeno consumado por célula por t?empo¿ de unidad, multiplicado por el número de célula. La velocidad de transporte de oxígeno a lo largo de la membrana se da por el producto del flujo volumétrico de oxígeno por unidad de diferencia de presión parcial (expresado como volumen de ox geno por área de unidad por tiempo de unidad por diferencia de presión parcial de unidad), la diferencia de presión parcial a lo largo de la mimbran a, y el área proyectada de la membrana. La velocidad dé transporte de oxígeno a través del líquido biológico se da por la negativa del producto de la difusión de oxígeno en el fluido biotógíco, el gradiente en la concentración del oxígeno perpendicular a la membrana en lá superficie de la membrana en donde las células se cultivan, y el área proyectada de la membrana. Los niveles mínimos de oxigenación de las células mantenidas en el dispositivo de cultivo celular pueden determinarse al balancear el transporte de oxígeno en el dispositivo con la velocidad de consumo de oxígeno por las células dentro del dispositivo. Para los dispositivos operados estáticamente, es decir, sin introducir nuevo líquido biológico en el dispositivo, el único mecanismos de transporte para el oxígeno es la trainsmembrana. La velocidad de transporte de transmembrana se da por el producto del flujo de oxígeno a lo largo de la membrana y el área plana de la membrana, el flujo por sí mismo es un producto de la permeabilidad oncentración de oxígeno a lo largo de la membrana. La velocidad de consumo de oxígeno se da por el OUR. Para los dispositivos operados estáticamente, la ecuación alancea el transporte y consumo e$ en donde pO2 c es la presión parcial crítica de oxígeno para la oxigenación, R es la constante de gas, y T es la temperatura. Las presiones parciales de oxígeno mayores a este pO2 c proporcionan 10 suficiente oxigenación; presiones parciales de oxígeno debajo de este p c proporcionan oxigenación insuficiente. Esta ecuación puede tilizarse para diseñar y operar tales dispositivos de cultivo celular 1 en la ausencia de flujo del líquido biológico 1 1 . La ecuación gobernante para la oxigenación se delinea en la 15 Figura 3 para datos simulados para dispositivos que comprenden 0.002 en espesor de poliestireno, disponible como Polyflex® de Plastics Suppliers (Gelumbus, OH), para los cuales Pm se encuentra en el orden de 104 mL/m2-día-atm, y se opera a temperaturas fisiológicas (310) y para velocidades celulares de consumo de oxígeno de 1 x10"16, 5x10" 16, y 1 x10*15 ™ moles/célula-s. Estos valores para el consumo de oxígeno se basan en datos de hepatocitos de porcino primarios presentados en Balis et al., Metabolic Engineering, 1_: 1 -14 (1999) Estas curvas se moverán hacia la parte superior y a la izquierda cuando las membranas con permeabilidades» inferiores al oxígeno se utilicen, y hacia la parte inferior y a la derecha ^ cuando las membranas con permeabilidades superiores al oxígeno se utilicen En contraste, cuando la oxigenación se suministra a células en un soporte impermeable al gas a través de la capa de líquido biológico inactivo que las baña y una membrana permeable al gas en contacto con aquella capa de líquido biológico, la ecuación gobernante y que balancea el transporte y consumo de oxígeno es. en donde h es el espesor de la capa del líquido biológico, S es la solubilidad de oxígeno en el líquido biológico, y D es la difusión de oxígeno en el líquido biológico. Debido a que la resistencia de transporte al oxígeno siempre será mayor para esta configuración, asumiendo una membrana con un Pm idéntico, esta segunda configuración siempre dará co o resultado menos oxigenación para un concentración dada de oxígeno. Las ecuaciones gobernantes también dependerán de la perfusión de medio. Sin embargo, las tendencias básicas entre las dos ecuaciones gobernantes no cambiarán con dirección, velocidad de flujo volumétrico, o cualquier otra característica de perfusión Por ejemplo, siempre será posible mayor control de oxigenación, para las membranas con permeabilidades idénticas al oxígeno, para la oxigenación de transmembrana directa de células comparada a la transmembrana secuencial y después a la oxigenación de transmedio de células, sin considerar la velocidad de perfusión, siempre que la direcciona dad de oxigenación per se no efectúe las células Ahora se describirán otras diversas modalidades específicas de dispositivos de cultivo celular de dos compartimientos con una " membrana impermeable al líquido, permeable al gas. Estas modalidades Í se representan esquemáticamente en las Figuras 4a-4i • 5 La Figura 4a muestra una configuración básica alternada paira un dispositivo de cultivo celular de dos compartimientos 1 que comprende un compartimiento celular 10 que contiene un líquido biológico 1 1 ; un compartimiento de fluido oxigenado 20 que contiene un fluido oxigenado 21 ; una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 ?spn 10 superficie 41 ; células 40; y paredes impermeables, rígidas, 50. El compartimiento líquido 10 y el compartimiento de fluido oxigenado 20 se separan por la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, superficie tratada en el lado de ia membrana que está de frente al compartimiento líquido. Las células 40 se cultivan en la superficie 41 15 mientras contactan el líquido biológico 11 en el compartimiento líquido y son capaces de acceder oxígeno a través de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 de una fuente de oxígeno que suministra fluido oxigenado 21 al compartimiento de fluido oxigenado 20. *^Rf La superficie 41 puede ser ventajosa o, como con algunas 20 células que no se adhieren bien, necesariamente, para inducir ia adhesión celular y promover la función celular deseada. Esta superficie, la cual puede incluir uno o más materiales de revestimiento, se aplica a al menos una parte de la membrana y puede extenderse en el interior de la membrana del lado que está de frente al compartimiento líquido 10. Los 25 materiales de revestimiento que pueden aplicarse a la membrana incluyen, péHrÓ* no se timitan a: revestimientos biológicos tal como el colágeno y otros componentes de aglomerante extracelular, incluyendo fibronectín, preparaciones de aglomerantes biológicos extraídos, y proteogticanos, fibrina; péptidos similares y que contienen RGD; revestimientos 5 biosintéticos química o biológicamente sintetizados, y/o algunos otros materiales que inducirán la adhesión celular y/o funciones celulaßes deseadas. Un revestimiento preferido es el colágeno, más preferentemente, el colágeno tipo I. Estos revestimientos pueden absorber ya sea pasivamente a la membrana o reaccionar químicamente (tal como 10 por el injerto covalente) con la membrana. La membrana puede necesitar tratarse con uno o más revestimientos o capas de revestimientos para hacer que las células se adhieran y funcionen; estos revestimientos pueden ser idénticos o diferentes en composición y/o concentración. Todavía otro medio preferido para mejorar ta compatibilidad 15 celular a la membrana es proporcionarla con un revestimiento de colágeno. Los revestimientos, distinguidos de los geles de volumen, son esencialmente de dos dimensiones a medida que son moleculares en espesor y son secos en la superficie de la membrana mientras que los • geles de volumen tienen volumen, espesor de tres dimensiones y se 20 hidratan. Los tratamientos de superficie múltiple pueden aplicarse a la membrana en secuencia, por ejemplo, el tratamiento con descarga de corona seguido por el revestimiento de aglomerante extracelular, tal como el colágeno, preferentemente con el colágeno tipo I. Otro método para tratar la membrana 30 para mejorar la 25 adhesión celular es un tratamiento de superficie física, tal como la descarga de corona en la presencia de un gas que recubre al oxígeno (por ejemplo, aire). La descarga de corona incorpora átomos de oxígeno en la superficie expuesta de tal forma que se oxida, más hidrofílica, y algunas veces se carga. El grado de este tratamiento es de tal forma que el 5 material ahora posee una superficie de energía libre (medida en términos de dinas/cm2 por humectabilidad) y otras características químicas similares a aquellas características típicamente asociadas con recipientes de cultivo por tejido. Este tratamiento se conduce por un período de tiempo suficiente para lograr la modificación de la superficie plana expuesta a 10 este grado (o superior o inferior, dependiendo de si las células responden Bfe más favorablemente a una superficie con una diferente energía libre), pero sin comprometer significativamente las propiedades del material base subyacente por sí mismo. Los tratamientos de superficie múltiple pueden aplicarse en secuencia, por ejemplo, el tratamiento con descarga de 15 corona seguido por el revestimiento con aglomerante extracelular, tal como el colágeno, preferentemente con colágeno tipo I. El tratamiento de descarga de corona típicamente modifica solamente la química de la superficie de un material o membrana sin alterar su topografía física. La descarga de corona incluye exponer ta 20 superficie a una descarga eléctrica de alta frecuencia en la presencia de aire o de otro gas que recubre ai oxígeno, de tal forma que los átomos de oxígeno se incorporan en la superficie del material de tal forma que ahora se oxida. Este tratamiento aumenta la superficie de energía libre y la hidrofilicidad de películas metalizadas, de papel y de plástico. Los 25 sistemas para aplicar una descarga de corona a materiales se encuentran comercialmente disponibles de compañías tales como Corotec Corp. , Farmington, CT. Estos sistemas consisten de un transformador de alto voltaje y red de electrodos diseñados para aplicarse hasta niveles de kílo att de energía a la superficie en frecuencias tan altas 40 kHz. Al exponer el oxígeno a una descarga eléctrica de alto voltaje se genera ozono, el cual reacciona químicamente con la superficie para incorporar el oxígeno a la misma. Este tratamiento puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones ambientales típicamente encontradas en laboratorios químicos y biológicos. Las condiciones de operación para la descarga de corona pueden variar con el material modificándose la superficie y el grado al cual la superficie de energía libre se aumenta. En otra modalidad, las células se intercalan entre la membrana impermeable ái líquido, permeable al gas 30 y un gel de volumen que comprende componentes de aglomerante extracetular. La Figura 4b muestra un dispositivo de cultivo celular 1 que comprende un compartimiento liquido 10 que contiene un líquido biológico 1 1 ; un compartimiento de fluido oxigenado 20 que contiene un fluido oxigenado 21; una membrana impermeable al líquido, permeable at gas 30; células 40; un gel de volumen 42, y paredes impermeables, rígidas, 50. El compartimiento líquido 10 y el compartimiento de fluido oxigenado 20 se seíparan por la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 en donde las células 40 se cultivan en el lado de la membrana que está de frente al compartimiento líquido. Un gel de volumen 42 se coloca sobre las células en el lado de las células que están de frente lejos de la membrana. Las células se proporcionan con nutrientes del líquido biológico 1 1 a r al oxígeno a través de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 de una fuente de "?*^t oxígeno 4 que suministra el fluido oxigenado 21 al compartimiento de fluido oxigenado 20 5 En otra modalidad mostrada en la Figura 4c, las células se intercalan entre dos geles de volumen, tal como dos geles de colágeno de volumen 43 según se describe en la Publicación de la Solicitud de PCT No. , WO 96/34087 y en la Patente de E.U. No. 5,602,026. En particular, la Figura 4c muestra un dispositivo de cultivo celular 1 que comprende un 10 compartimiento líquido 10 que contiene un líquido biológico 1 1 ; un compartimiento de fluido oxigenado 20 que contiene un fluido oxigenad© 21 ; una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30; células 40; un gel de dos capas 43, y paredes impermeables, rígidas, 30. El compartimiento líquido 10 y el compartimiento de fluido oxigenado 20 se 15 separan por la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 en donde las células 40 se cultivan (en el lado de la membrana que está de frente al compartimiento líquido) depositada entre tas capas de un gel de dos capas 43. Las células 40 se proporcionan con nutrientes del líquido biológico 1 1 a través del gel 43, y pueden acceder al oxígeno a través de 20 la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, de una fuente de oxígeno 4 que suministra fluido oxigenado al compartimiento de fluido oxigenado 20. Otro método útil para unir las células a la membrana es al utilizar un material aglomerante La Figura 4d muestra otra modalidad de 25 un dispositivo de cultivo celular 1 que comprende un compartimiento líquido 10 que contiene liquido biológico 1 1 , un compartimiento de fluido oxigenado 20 que contiene un fluido oxigenado 21 , una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, células 40 dentro la malla o ij?í #• andamio de soporte celular 44; y paredes impermeables, rígidas, 50 Esta 5 la preferentemente es a base de colágeno, a pesar de que también puede basarse en materiales de aglomerante extracelular natural alternativos y/o polímeros sintéticos y mezclas de polímeros. El colágeno y otros componentes de aglomerante extracelular pueden formarse en una malla contraída o no contraída que comprende colágeno para suspender 10 tas células en un aglomerante. Cuando el material es colágeno, la malla con células se coloca al verter una mezcla de colágeno solubilizado por ácido, una solución neutralizante de pH, y una suspensión celular. Esta mezcla se getifíca para formar una malla de colágeno que contiene células 44. Los métodos para producir las mallas de colágeno que contienen 15 células particularmente las mallas de colágeno contraídas, se describen previamente en las Patentes de E.U. Nos. 4,485,096, 5, 106,949, y S,536,656. Alternativamente, la malla puede ser un andamio sintético, natural o poroso en donde las células se cultivan dentro del andamio y el 20 andamio entra en contacto con las células de la membrana permeable at gas. El soporte poroso se aplica primero ya sea a la membrana y las células se siembran después en el andamio poroso o se siembran primero con las células y después se aplican a la membrana. Los ejemplos de soportes porosos incluyen andamios que comprenden componentes de 25 aglomerante extracelular, tal como las esponjas de colágeno, membranas fifi- 5 I 33 de colágeno fibrilar densas, y membranas de tejido procesado. Los soportes porosos sintéticos incluyen espumas de poliuretano. Las Figuras 4e y 4f muestran dos modalidades adicionales de un dispositivo de cultivo celular 1 que comprende un compartimiento 5 líquido 10 que contiene un líquido biológico 1 1 ; un compartimiento de fluido oxigenado 20 que contiene un fluido oxigenado 21 ; una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30; células 40 dentro de una malla de soporte celular 44; una segunda capa de células 45; y paredes impermeables, rígidas, 50. La Figura 4e representa una modalidad en 10 donde la segunda capa de células 45 se encuentra en el lado de la maHa 44 que está de frente al compartimiento líquido 10. La Figura 4f representa una segunda modalidad en donde la segunda capa de células , 45 se encuentra entre la malla 44 y la membrana 30. La segunda capa de células puede ser del mismo tipo o diferente de las células dentro de la 15 malla. Una modalidad que consiste de una combinación del ajuste de células en las modalidades mostradas en las Figuras 4e y 4f también puede realizarse. Debido a que algunas células tienen propiedades funcionales o de unión que pueden afectarse adversamente por el contacto directo con 20 un líquido biológico fluyente y son sensibles a lo cortante, en algunas aplicaciones puede ser deseable colocar una membrana permeable al líquido entre el líquido biológico fluyente y las células limitar las interacciones hidrodinámicas. En este ajuste un compartimiento adicional, un compartimiento celular, que contiene las células se localiza entre el 25 compartimiento líquido y el compartimiento de fluido oxigenado. % - - 34 - La Figura 5a muestra jfa modalidad de un dispositivo de cultivo celular de tres compartimientos 1 que tiene paredes impermeables 50, una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, que separa un primer compartimiento 20 de un segundo compartimiento 15, y al 5 menos una membrana permeable al líquido 31 que separa el segundo Gompartímiertto 15 de un tercer compartimiento 16. El primer compartimiento 20 es el compartimiento de "fluido oxigenado" y se define por una de las paredes impermeables 50, las paredes laterales de la cámara, y la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. El 10 segundo compartimiento 15 es el compartimiento "celular" y se define por ias paredes laterales de la cámara, la membrana impermeable al líquido, permeabte al gas 30, y la membrana permeable al líquido 31 . El tercer compartimiento 16 es el compartimiento de "perfusión líquida" y se define por el resto de la pared impermeable 50, las paredes laterales de la 15 cámara, y la membrana permeable al líquido 31. A pesar de que la Figura 5a representa la cámara 1 dividida de tal forma que el compartimiento de perfusión líquida 16 se encuentra arriba de una o más de las membranas permeables al líquido 31 y el compartimiento de fluido oxigenado 20 se encuentra debajo de la 20 membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, la cámara puede orientarse en cualquier dirección ya que el compartimiento celular 15 interviene entre los compartimientos de fluido oxigenado y de perfusión líquida y la membrana impermeable al líquido, permeable at gas 30, se ubica entre los comportamientos celulares y de fluido oxigenado y una o 25 más membranas permeables al líquido 31 se ubican entre los compartimientos de perfusión líquida y celulares. El compartimiento de perfusión líquida 16 contiene un líquido biológico 1 1 b, tal como el medio de cultivo celular, una solución balanceada, sangre, o plasma. El compartimiento celular 15 contiene 5 ambas células 40 sustanciatmente cultivadas en la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, así como también un líquido biológico 11 a que puede ser el mismo o diferente del líquido biológico 1 1 b en el compartimiento de perfusión líquida 16. Los líquidos biológicos 1 1 a y 11 b se encuentra en contacto líquido a través de una o más de las membranas 10 permeables al líquido interventoras 31 . El líquido biológico 1 1 a suministra las células 40 con nutrientes básicos para cultivo celular, toxinas, • moléculas aminadas, y otros desperdicios biológicos para metabolizarse y lleva metabolitos de célula, productos detoxificados, factores secretados, y proteínas. Estas moléculas se transportan a lo largo de la membrana 15 permeable al líquido 31 hacia y desde el líquido biológico 1 1 a. Las células 40 en el compartimiento celular 15 no se encuentran sustancialmente en contacto con la membrana permeable al líquido 31 . La abertura rellena por el volumen de las células y el líquido • biológico 1 1 a en el compartimiento celular preferentemente es uniforme en 20 espesor pero puede ser no uniforme. Esta abertura es al menos la altura de la capa de células 40 unidas a la membrana impermeable al líquido, permeable at gas 30, de tal forma que al menos algo de líquido biológico 11a interviene entre las células 40 y la cara de la membrana permeable líquido 31 que está frente a las células. Esta abertura se mantiene por 25 uno o más espaciadores.

El fluido biológico 1 1 a en el compartimiento celular 15 fluye muy lentamente o es estático; su flujo no se afectaí^ustancialmente por el flujo del líquido biológico 1 1 b en el compartimiento de perfusión líquida 16. El líquido biológico 1 1 a preferentemente se suministra inicialmente en el compartimiento celular 15 durante el llenado y se encuentra libre e intercambio con el líquido biológico 1 1 b a lo largo de la membrana permeable al líquido 31 . Uno o más puertos pueden servir como ventilaciones para el desplazamiento de aire durante el llenado y/o como medio para drenar el compartimiento celular 15 durante la operación. E?s-tos otros puertos también pueden policopiarse en puertos de compartimientos celulares de otras unidades de bioreactores en paralelo, en serie, o ambos para la ventilación y drenaje. El líquido biológico 1 1 b se suministra preferentemente a y se remueve del interior del compartimiento de perfusión líquida 16 a través de una abertura. Más preferentemente, existen al menos dos aberturas (no mostradas en la Figura 5a), una abertura que sirve como una abertura de entrada para suministrar el líquido biológico 1 1 b de una fuente de líquido biológico y otra abertura que sirve como una salida para descargar o drenar el líquido biológico 1 1 b. Las aberturas se comunican entre el interior y exterior del compartimiento de perfusión líquida 16 por un puerto o policopia. Los puertos pueden conectarse con otros compartimientos líquidos de perfusión líquida de otras unidades de bioreactor en paralelo, en serie, o ambos para crear un circuito o ciclo de flujo para el líquido biológico 1 1b. Lo adicional de otros puertos pueden servir como ventilaciones para el desplazamiento de aire durante el llenado o como un »> . - * , o para drenar el compartimiento e perfusión líquida 16 cuando los otros puertos se unen a aquellos de otra unidad Un fluido oxigenado 21 , típicamente como un gas pero también ' loa lemente com© un líquido capaz de llevar el oxígeno o un gas oxigenado y permitir el transporte de oxígeno a través de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, fluye a través del compartimiento de fluido oxigenado 20. El oxígeno se encuentra disponible en las células 40 en el compartimiento celular 15 por medio de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. El fluido oxigenado en el compartimiento de fluido oxigenado se suministra preferentemente a y se remueve del interior del compartimiento a través de una abertura. Más preferentemente, existen al menos dos aberturas (no mostradas en la Figura 5a), una abertura que sirve como un abertura de entrada para suministrar el fluido oxigenado de una fuente de fluido oxigenado y otra abertura que sirve como una salida para descargar o ventilar el fluido oxigenado. Las aberturas se comunican entre el interior y exterior del compartimiento de fluido oxigenado 20 por un puerto o policopia. Nuevamente, los puertos pueden conectarse con otros compartimientos de fluido oxigenado de otras unidades de bioreactor en paralelo, en serie, o ambos para crear un circuito o ciclo de flujo para el fluido oxigenado. También pueden agregarse otros puertos para la ventilación a la pared del compartimiento Ahora se describirán otras diversas modalidades específicas de dispositivos de cultivo celular de tres compartimientos con membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, separadas. Estas modalidades se representan esquemáticamente en las Figuras 5b-f. La Figura 5b muestra una modalidad en donde las células 40 se encuentran en contacto directo tanto con la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, como con la membrana permeable al líquido 31. En esta modalidad, el compartimiento celular 15 se reduce en tamaño a un volumen mínimo, específicamente el tamaño de las células 40 en el compartimiento celular, cuando la membrana permeable al líquido 31 entra en contacto con las células que crecen en la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. Otra modalidad alternativa se muestra en la Figura 5c, en donde una capa de células 40 se une a la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 y una segunda capa de células 49 se une a la membrana permeable al líquido 31 , para formar una bicapa celular o cultivo de multicapas. Esta modalidad comprende al menos dos capas de células. Pueden intervenir capas adicionales de células entre las capas de células 40 y 49. En otra modalidad mostrada en la Figura 5d, las células 40 se intercalan entre dos geles de colágeno de volumen 43. En particular, la Figura 5d muestra un dispositivo de cultivo celular que comprende un compartimiento de perfusión líquida 16 que contiene un líquido biológico 1 11), tal como el medio de cultivo celular, una solución balanceada, o plasma. El compartimiento celular 15 contiene un primer gel de colágeno de volumen 43 colocado en una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30; una o más capas de células 40 sembradas en el gel; un segundo gel de colágeno de volumen 43 colocado en las células; y una ** - 39 - .íll ! ibrana permeable al líquido 31 que contacta el segundo gel. El líqut biológico 1 1 b se encuentra en contacto líquido a través de una o más membranas permeables al líquido interventoras 31 . El líquido biológico 11b se suministra a, y remueve de, los componentes de células 4 relacionados al cultivo celular que se transportan a lo largo de los geles de colágeno de volumen 43, la membrana permeable al líquido 31 a y desde el líquido biológico 11 b. La Figura 5e ilustra otra modalidad en donde una malla de soporte celular 43 que contiene células 40 se intercala entre la membrana 10 impermeable ai líquido, permeable al gas 30 y la membrana permeable al líquido 31 . La malla de soporte celular puede ser una malla de colágeno o puede intercambiarse con un aglomerante poroso que contiene células según se describen en cualquier parte de la presente. Para las modalidades representadas en las Figuras 5b-5e, 15 puede agregarse un espaciador para mantener la altura del compartimiento celular 15. Para la modalidad de la Figura 5b, este espaciador puede omitirse si las células se siembran primero en una de las dos membranas 30 y 31 y así las membranas llegan junto con las células intercaladas entre las dos membranas. Para la modalidad de la Figura 5c, este espaciador 20 puede omitirse si cada capa celular 40 se siembra primero sobre su membrana adyacente y así las membranas sembradas por célula llegan juntas. En otra modalidad, las fibras vacías pueden utilizarse como el compartimiento de perfusión líquida 16. Una variación de esta modalidad 25 se muestra en la Figura 5f, en donde las células 40 se unen a la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, plana, y las fibras vacías 17 que se extienden en un plano arriba de las células y que contienen líquido biológico 1 1 d se ubican en el compartimiento celular 15. El líquido biológico 1 1 a en el compartimiento celular 1 5 puede ser estático o puede ftuir. El líquido biológico 1 1 d (que puede ser el mismo o diferente del líquido biológico 1 1 a) preferentemente fluye dentro de las fibras vacías 17. La?s fibras vacías 17 se elaboran de un material permeable al líquido, más como la membrana permeable al líquido 31 descrita en la presente. En esta manera, los nutrientes en el líquido biológico 1 1d pueden transportarse durante todo el dispositivo a una velocidad de flujo que es independiente de la velocidad de flujo de líquido biológico 1 1 a en el compartimiento celular (que es preferentemente bajo para reducir el esfuerzo cortante en células 40). La orientación de las fibras vacías 17 puede ser en paralelo, anti-paralelo, u ortogonal en la dirección de flujo en el óompartimiento de fluido oxigenado 20. Para separar eficazmente el líquido biológico 1 1 d en el compartimiento de perfusión líquida 16 del líquido biológico 1 1 a en el compartimiento celular 15, la membrana permeable al líquido 31 o las fibras vacías 17 tienen un tamaño de poro lo suficientemente grande para permitir el transporte de nutrientes de molécula grande, toxinas, factores, metabolitos, y proteínas secretadas, a lo largo de la membrana pero también lo suficientemente pequeño para prevenir el crecimiento celular a través de la membrana. Los materiales adecuados para la membrana permeable al líquido incluyen, pero no se limitan a: membranas celulósicas; membranas de poli(éter sulfona) y poli(sulfona) porosas; nylon no tratado poroso y otras membranas de poliamida; poliésteres porosos; vidrio poroso; acero inoxidable perforado; policarbonato (humectado con PVP, etanol, u otros agentes humectantes) poroso (es decir, trayecto grabado), cloruro de polivinilo poroso, polidimetilsiloxano perforado; y cerámicas porosas. Otros materiales de membrana que tienen estas características para utilizarse en la invención pueden seleccionarse de los materiales comercialmente disponibles o pueden prepararse utilizando técnicas estándares. El fluido de fluidos oxigenados puede ser estático, en cualquier otra dirección, o en múltiples direcciones. En relación al flujo de fluido oxigenado, el fluido de líquidos biológicos puede ser en cualquier dirección: la misma dirección lateral, contralateral, o perpendicular, o cualquier combinación de la misma. Para la máxima transferencia de masa, preferentemente las direcciones de flujo son contralaterales, por ejemplo, en direcciones opuestas para el líquido biológico y fluido oxigenado. Para las unidades o cartuchos de bioreactor conectados en paralelo, en serie, o ambos, las direcciones relativas de flujo en cada cartucho pueden ser las mismas o diferentes. El flujo de líquidos biológicos y/o fluidos oxigenados puede ser oscilante o dependiente del tiempo. También, las velocidades de flujo volumétrico de los líquidos biológicos y fluidos oxigenados son independientes entre sí. La unidad de bioreactor de la invención incluye al menos un compartimiento que contiene células y al menos un compartimiento que contiene fluido oxigenado. Los compartimientos se encuentran en un ajuste plano, plano, y tienen un plano distribuido común entre ellos. Una nltad o cartucho único (a) puede comprender un compartimiento qu contiene células y un compartimiento que contiene fluido oxigenado almacenado individualmente o junto en una configuración apilada, con las unidades separadas por una membrana impermeable, rígida. Debido a la naturaleza unitaria de los cartuchos o unidades de cultivo celular, el bioreactor es escalable con la adición del área de superficie y volumen en los compartimientos o la adición de unidades. En el caso en donde se agregan las unidades adicionajes, se prefiere que los compartimientos se comuniquen por medio de los puertos para permitir el flujo de líquido biológico o medio o fluido oxigenado entre ellos. La Figura 6a ilustra una modalidad del dispositivo de cultivo celular que comprende una unidad de bioreactor con dos membranas impermeables a líquido, permeables al gas, planas 30 y/ 38, respectivamente. Solamente t na de las membranas, 30, se siembra con las células 4H en su lado que está de frente al compartimiento líquido 10 y que contacta) et líquido biológico) 11. Esta modalidad se caracteriza por dos comportamientos de fluidf oxigenado, 20 y 28, respectivamente. Los fluidos oxigenados en los compartimientos de fluido oxigenado 20 y 28, 21 y 29, respectivamente, puedan ser los mismos o diferentes, puede ser fluyentes en las mismas o diferentes direcciones, y pueden ser fluyentes en tas mismas o diferentes velocidades de flujo. Esta modalidad permite la oxigenación directa simultánea de las células adherentes 40 a través del transporte de transmembrana de oxígeno a lo largo de la membrana 30 mientras también se proporciona la oxigenación directa adicional del líquido biológico fluyente 11 ja través del transporte de transmembrana de oxígeno a lo largo de la membrana 38, Otra modalidad del dispositivo de cultivo celular de tres compartimientos que caracteriza un líquido y dos compartimientos de fluido oxigenado se ilustra en la Figura 6b. Una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 es plana y se siembra con las células 40 en su lado que está de frente al compartimiento líquido 10 y que contacta el liquido biológico 11. El segundo compartimiento de fluido oxigenado 23 se forma por la fibra vacía colocada en un plano a través del compartimiento líquido 10 y que contacta el fluido oxigenado 29. Los fluidos oxigenados 21 (contenidos en el compartimiento de fluido oxigenado 20) y 29 pueden ser los mismos o diferentes, pueden ser fluyentes en tas mismas o diferentes direcciones, y pueden ser fluyentes ert las mismas o diferentes, ^<t^ei a} ;é)s} de) ffu o. Esta modalidad proporciona la oxigenación directa del líquido biológico fluyente 11 través) del transporte de transmernbf ana j oxígeno» lo largo de las fibras vacias 23 ademáis det la oxigenaoión directa de las células adherentes 40 a través det transsporf } d$ transmembrana de oxígeno a to largo de la membrana 30. La Figura 6c ilustra una tercer modalidad del dispositivo de cultivo celular de tres compartimientos que caracteriza un líquido y dos compartimientos de fluido oxigenado. Esta modalidad comprende u a unidad de bioreactor en donde el número de células 40 que contacta el líquido biológico fluyente 11 se aumenta al contactar el líquido biológico con una segunda capa de células 48 soportada en la segunda membrana sustancialmente plana, impermeable al líquido, permeable al gas 38. Las direcciones de flujo en el compartimiento de fluido oxigenado 20, de tratamiento de una unidad de bioreactor única sin alterar el número de 50b, respectivamente. Cada cartucho incluye un compartimiento líquido 10» a través del cual el líquido biológico 11 fluye, y un compartimiento de ItttiÉo oxigenado 20, a través del cual el fluido o ^enado 21 fluye. Los dos compartimientos de cada cartucho o unidad 2 se separan por una 5 membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30. Las células 40 se cultivan en la membrana 30 en el lado de ta membrana que está de frente al compartimiento líquido. El fluido de fluidos oxigenados y líquidos biológicos puede ser en cualquier dirección: la misma dirección lateral, contralateral, o perpendicular, o cualquier combinación de la misma. El numero de compartimientos puede variar hasta 100 o más de cada tipo de compartimiento. Además, la composición (por ejemplo, oxígeno «n pticef?taie y las velocidades de flujo volumétrico de los flujos indivíAtatesl d los fluidos oxigenados 21 pueden er idénticos o diferentes entre) lo compartimientos fluidos 20. De igual forma, (a composición (por ejemplo, S concentración de citoquinas) y las velocidades dé flujo volumétrico: de) los flujos individuales del líquido biológico 11 pueden ser idénticos* o diferentes entre los compartimientos líquidos 10. Una modalidad alternativa en donde un bioreactor 1 comprende una pluralidad de membranas impermeables al líquido, 0 permeables al gas, con células cultivadas en et lado de la membrana que está de frente hacia un líquido biológico y lejos de un fluido oxigenado, se muestra en la Figura 7b. En esta modalidad, el bioreactor 1 comprende una cámara grande que tiene una entrada y salida para el flujo del fluido oxigenado 21 a través del bioreactor 1 y una entrada y una salida para el 5 flujo del líquido biológico 11 a través del bioreactor entero 1. En esta I? J i 1 .1 modalidad, el bioreactor 1 n# Éí«t§ene cartuchos individuales pero en su lugar contiene una pluralidad de membranas impermeables al líquido, permeables al gas apiladas 30 (seis en la Figwta 7b), para crear los compartimientos celulares alternantes 10 (tres en li Figura 7b) que 5 contiene el liquido biológico 11 y los compartimientos de fluido oxigenado 20 (cuatro en la Figura 7b) que contacta el fluido oxigenado 21. Las células 40 se cultivan en el lado de cada membrana 30 que contacta él líquido biológico 11. El número de compartimientos puede variar hasta 100 o más de cada tipo de compartimiento. Según se indica para la 10 modalidad representada en la Figura 7a, las composiciones y el flujo de JF^ líquido biológico 11 y el fluido oxigenado 21 en cada líquido y et compartimiento de fluido oxigenado, respectivamente, puede ser el mismo La entrada para el fluido oxigenado al bioreactor puede) 15 conectarse en una primer policopia que distribuye el flujo de flujo oxigenado igualmente o desigualmente a cada uno de la pluralidad de compartimientos de fluido oxigenado para suministrar el oxígeno y otros gases a los compartimientos de fluido oxigenado para et intercambio de gas a lo largo de las membranas impermeables al líquido, permeables al 20 gas. Otro paso a través de los múltiples compartimientos de fluido oxigenado (en paralelo), el fluido oxigenado se colecta en una segunda policopia común en todos los compartimientos de fluido oxigenado y se dirige así fuera del bioreactor a través de una salida para el fluido I Oxigenado. De igual forma, ta entrada para el líquido biológico se conecta 25 en una policopia que distribuye el flujo de un líquido biológico igualmente a cada uno de la pluralidad de compartimientos líquidos para exponer las células en los compartimientos líquidos al líquido biológico. Después del paso a través de los múltiples compartimientos (nuevamente, en paralelo), el liquido biológico se colecta en una policopia comen y se dirige a una salida para circular en el ciclo de flujo para el líquido biológico. Las policopias para este dispositivo de cultivo celular de múltiple compartimiento preferentemente se conectan en sus compartimientos asociados por los conectores móviles. Estos conectores permiten la fácil instalación y el posible reemplazo de conexiones individuales. Alternativamente, las policopias pueden, si se desea, conectarse permanentemente a cada compartimiento asociado. Una modalidad específica de tat bioreactor de policopia se mu stra* en- la). Figura 8a, en donde et bioreactor 1 tiene una pluralidad de cartuchos apilados 2 (fres en ta Figura Sa), comprendiendo cada uno un compartimiento líquido 10, una membrana impermeable at líquido, permeable al gas 30, células 40, y un alojamiento impermeable, rigido, 50. El bioreactor 1 también comprende un compartimiento de fluido oxigenado común 222, entrada de fluido oxigenado 3; salida de fluido oxigenado 3'; entrada líquida 5; salida líquida 5'; policopia de entrada líquida 555, y policopia de salida líquida 555'. La policopia de entrada líquida 555 conduce et líquido biológico de la entrada líquida 5 al compartimiento liquido 10 de cada cartucho 2. La policopia de salida líquida 555' conduce el líquido biológico a la salida líquida 5' del compartimiento líquido 10 de I cada cartucho 2. La adición de otros puertos para cada compartimiento líquido puede servir como ventilaciones para et desplazamiento de aire durante el llenado o como un medio para drenar cada compartimiento líquido individualmente. La entrada de fluido oxigenado 3 conduce el fluido oxigenado en el compartimiento de fluido oxigenado común 222 del bioteactor 1 fuera de los cartuchos 2, en donde el fluido oxigenado contacta la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30; células 40; y un alojamiento impermeable, rígido, 50. El bioreactor 1 también comprende una entrada de fluido oxigenado 3; salida de fluido oxigenado 3'; entrada líquida 5; salida líquida 5'; policopia de entrada líquida 555, y policopia de salida líquida 555'; policopia de entrada de líquido oxigenado 333; y policopia de salida de fluido oxigenado 333'. La policopia de entrada líquida 555 conduce el líquido biológico 11 de la entrada líquida 5 al compartimiento líquido 10 de cada cartucho 2. La policopia de salida liquida 555* oonduce el líquido biológico 11 a la salida líquida 5' desde el compartimiento liquido 10 de cada cartucho 2. La adición de otros puertos para cada compartimiento líquido puede servir como ventilaciones para el desplazamiento de aire durante el llenado o como un medio para drenar cada compartimiento líquido individualmente. La policopia de entrada de fluido oxigenado 333 conduce los fluidos oxigenados de la entrada de fluido oxigenado 3 al compartimiento de fluido oxigenado 20 de cada cartucho 2. La policopia de salida de fluido oxigenado 333' conduce los fluidos oxigenados a la salida de fluido oxigenado 3' del compartimiento de fluido oxigenado 20 de cada cartucho 2. Otros puertos para ventilar los fluidos oxigenados también pueden agregarse a cada compartimiento de fluido oxigenado 20. El número de compartimientos puede variar hasta 100 o más de cada tipo de compartimiento.

Todavía en otra modalidad, las células se separan del liquido biológico fluyente por una o más membranas permeables al líquido Interventoras, de tal forma que el compartimiento liquido ahora liega a separar los compartimientos celulares y de perfusión líquida, en donde se dividen ya sea completa o incompletamente por una o más de las membranas permeables al líquido interventoras. Cualquier número de compartimientos alternantes puede emplearse y no se unen por el alojamiento de cámara según se muestra en la Figura 7b. El alojamiento de cámara se elabora de material impermeable. El bioreactor se siembra con células funcionales; más preferentemente, las células sembradas funcionan juntas para estimular fos tipos y niveles de función posible para las células en un órgano. Las células pueden crecer ya sea en et bioreactor, permanecer estable® en número, o accionarse entre modos de crecimiento y estabilidad numérica. Las células también pueden mantener ya sea su fenotipo previo o caminar el fenotipo en cultivo en el biore actor. Et bioreactor es para utilizarse como un sistema de cultivo in vitro y su fluido oxigenado y circuitos de fluido lo hacen adecuado para utilizarse como un dispositivo auxiliar del órgano para tratar un paciente en necesidad de asistencia det órgano. El dispositivo se siembra con células del órgano que se cultivan para funcionar de igual forma como en el órgano del cual se derivaron las células. Una fuente de células para el bioreactor es un órgano de mamífero. Cuando este órgano es el hígado, las células que se cultivan para utilizarse en un dispositivo auxiliar det hígado comprenden hepatocitos, las células principales del hígado que son capaces completar los requisitos funcionales típicamente asociados con el hígado cuando se Ooloca en un ambiente estructural y químico adecuado. Otras €ÜÜ s presentes en el hígado también pueden incluirse en el dispositivo, 5 tal como las células endoteliales; células Ito; células Ku fer, una oéluta similar al macrófago especializado; y fibroblastos. Un co-cultívo de he atocitos con uno o más de estos tipos de células pueden ser deseables en un LAD. Para los bioreactores que comprenden una pluralidad de unidades, cada unidad puede sembrarse con los mismos números de 10 cét?las y/o combinaciones de tipos de células o diferentes números y/o combinaciones. Dada la disponibilidad limitada de hepatocitos humanos, pueden utilizarse fuentes no humanas en fa invención. Las células) dé s mamíferos incluyendo, pero no limitándose a, f entes) dea equ§É»o> 15 canino, porcino, bovino, ovino y murino, pueden utilizarse. Los donadores de célula pueden variar en el desarrollo de edad, sexo, especie, peso, y tamaño. Las células pueden derivarse de tejidos donadores de embriones, neonatos, o individuos más viejos incluyendo adultos. Las células progenitoras embriónicas tal como las células germinales mesenquimales o 20 parenquimales pueden utilizarse en la invención e inducirse para diferenciarse en el desarrollo en el tejido deseado. Además, pueden utilizarse las mezclas de células de diferentes cepas celulares, mezclas de células genéticamente modificadas y normales, o mezclas de células de dos o más especies o fuentes de tejido. 25 Una fuente de hepatocitos para utilizarse en la invención es células de siembra. Estas transferencias de líquido pueden conducirse ya sea al drenarse a través de uno o más de los puertos para el compartimiento liquido, al remover la pared impermeable que contacta el compartimiento líquido y distribuir y aspirar el líquido directamente en et compartimiento líquido a través de la abertura creada por ta remoción de la pared impermeable anteriormente mencionada, o una combinación de la misma. Múltiples modalidades son posibles para la siembra de células. En una modalidad las células se introducen al remover primero la pared impermeable que contacta el compartimiento líquido y distribuir (con «na pipeta automatizada o manual) tas células, en una suspensión líquida o suspendida en un aglomerante de polímero sintético o natural, en la membrana impermeable at líquido, permeable at gas. En una modalidad alternativa, tas células se introducen primero al hacer seguro que al menos dos puertos para el compartimiento líquido se abran y permitan así la suspensión de células para fluir en et compartimiento líquido. Para cualquiera de estas modalidades, las células se permiten para unirse y establecer la funcionalidad en la membrana. El medio de siembra puede drenarse así (por cualquiera de los métodos descritos en el párrafo anterior para la eliminación y adición de líquidos del compartimiento líquido) y suministrarse con un líquido biológico. Para un bioreactor que contiene una pluralidad de unidades o cartuchos de cultivo, cada unidad o cartucho puede sembrarse con células ya sea junto con las otras unidades en el estado unido por una de las modalidades anteriores o sembrarse con células por separado como unidades individuales no envueltas junto con policopias y por consecuencia policopiadas así juntas en un sistema de bioreactor completo. El momento en el que las unidades sembradas ée unen juntas en esta última modalidad puede ser justo después de la siembra o después *^BF 5 de permitir más establecimiento de cultivos. Una vez que los cultivos se han llegado a establecer y el bioreactor es funcional como un dispositivo auxiliar del hígado, se utiliza tratar un paciente en necesidad de asistencia del hígado, según se muestra en la Figura 1. Según se muestra en la Figura 1 y según se 10 describe en la presente, el dispositivo auxiliar del hígado de la invención comprende un bioreactor 1 que tiene una entrada 3 y una salida 3' para el suministro de fluido oxigenado y una entrada 5 y una salida 5' para et suministro de líquido biológico. La entrada 3 para ef suministro de fluid© oxigenado en los compartimientos de fluido oxigenado se alimenta por un 15 suministro de fluido oxigenado 4. La salida de fluido oxigenado 3' se ventila preferentemente en la atmósfera o un recipiente de colección. También asociados con el suministro de fluido oxigenado 4 se encuentran los controladores para revisar la mezcla de fluido oxigenado, presión, y velocidades de flujo (no mostradas). 20 La entrada 5 y ia salida 5' para el líquido biológico se conecta en un ciclo cerrado. Es deseable, pero no necesario, tener en el ciclo para el líquido biológico una unidad de inmunoaislamiento 7 para aislar el flujo sanguíneo del paciente del bioreactor. El bioreactor 1 puede asociarse con una unidad de plasmaferesis 8 para separar el plasma del paciente 25 tratado de fa sangre para hacer la detoxificación de la sangre más efici nte. Dentro del flujo del líquido biológico se encuentran diversas btmbas 6, 6*, y 6" para asegurar el flujo de medio o líquido biológico a tfwés del bioreactor y la unidad de inmunoaislamiento y pH, temperatura, y sensores de flujo (no mostrados).

EJEMPLOS La invención se describe además en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. Los ejemplos 1 , 2, y 14 describen nuevos dispositivos de cultivo celular. Los ejemplos 3 a 8 describen ensayos utilizados pava medir la función hepatocelular. Los ejemplos 9 a 14 demuestran ciertas modalidades de la invención. Etemolo 1: Dispositivo de Cultivo Celular - Aiuste Estático La habilidad det nuevo dispositivo de cultivo celular para soportar la función de hepatocitos in vitro se evaluó al construir un dispositivo de escala de laboratorio 1 en base a esta configuración. Et dispositivo, según se representa en las Figura 9a y 9b, comprende una instalación de alojamientos superiores 60 e inferiores 70, una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, una estructura 35, una ventana 75 para el alojamiento inferior, una serie de anillos O 80, 85, 90, y 95, una cubierta 100, una capa 110, y tornillos y ajustes auxiliares 120, 150, 180, 210 y 215. La membrana utilizada típicamente fue ya sea Polyflex® (Plástic Suppliers, Inc., Columbus, OH), una película de 0.6 2" de espesor de poliestireno, o TYVEK® 1073 (E.l. du Pont de Nemours and Co., Inc., Wilmington, DE), una membrana no horneada microporOsia compuestos de poliolefina USP Clase VI, a pesar de que también se utilizaron otros materiales en algunos estudios. La membrana se epoxió en una cara de la estructura 35, un anillo de aluminio de 0.0625" de 5 es#esor con un agujero axisimétrico de 2.122" de diámetro, para formar una instalación de membrana/estructura 400 antes de utilizarse. Una serie de cuatro tornillos de cabezas de armazón de acero inoxidable #10-32x1/2"simétricamente espaciados 120 enclavijados junto a los- alojamientos de policarbonato inferiores 70 (0.315" de espesor) y 10 superiores 60 (0.750° de espesor) de 4° diámetro para intercalar la instalación de membrana/estructura 400, con at membrana/instalación • orientada con la membrana 30 que está de frente al alojamiento superior. A través de los agujeros 63 en la estructura 35 se permitió la inserción de los tornillos 120 a través de los agujeros de claridad escariados 62 en el 15 alojamiento inferior 70 en los agujeros tapados en ef alojamiento superior 60. Un sello apretado por el líquido se formó entre (a cara superior de la instalación de membrana/estructura y la cara inferior det alojamiento superior utilizando un anillo O #039 80 se fijó en una ranura axisimétrica ^F. en el alojamiento superior De igual forma, un sello apretado por gas se 20 formó entre la cara inferior de la instalación de membrana/estructura y la cara superior del alojamiento inferior utilizando un segundo anillo O #039 85 se fijó en una ranura axisimétrica en el alojamiento inferior. Con estos componentes, el diámetro mínimo de la membrana fue de 2.9" para igualar el diámetro exterior de los anillos O, a pesar de que las membranas con 25 diámetros más grandes pueden utilizarse al cortar las secciones de la - 50 - | f . membrana pam prevenir la interferencia con la trayectoria de los tornillos. Una cámara 30 de 0.062" de profundidad» 2.1-4* de diámetro ax*S*raélrieo para f$s debajo de la membrana, se formó al asegurar una ventan de p«licarbonato 75 de 0.125" de espesor, 2.330" de diámetro en V "* uß agujero continuo axisimétrico en el alojamiento superior 70. Dos canales 120 conectados a los agujeros tapados 140 se fijaron con ajustes de t»esgris OD de tuvo #10-32x1/8" con anillos O íntegros para proporcionar los puertos para el acceso extemo de esta cámara. Podría proporcionarse el soporte mecánico adicional de la membrana al colocar en su cámara un blo?q?e 160 de 0.06" de espesor, 2.0" de diámetro, altamente poroso. Se utilizaron dos métodos para formar una cámara de 2.125" l diámetro 10) que sostiene tas células de baño 40 del liquido 11 unidas a la membrana 30 en un agujero continuo de 2.125" de diámetro axisimétrico en ef alojamiento superior 60. En un método (representado en la Figura 15 9a) una cámara 170 de 0.750" de profundidad, utilizada cuando se siembran las células en la membrana, se formó por la colocación de una cubierta de poticarbonato 100 de 4.216" de diámetro sobre la cara superior def alojamiento superior. Esta cubierta, la cual se pretendió que permitiera el transporte aséptico del dispositivo instalado después de la siembra con células y el apilamiento de múltiples dispositivos, tuvo bordes 14P. de 0.25" de altura a lo largo del perímetro de sus caras, tanto superior como inferior, para prevenir el derrame de líquido fuera de la cámara y la penetración de contaminantes externos en la cámara. En el segundo método (representado en la Figura 9b) Una 25 cámara 10 de 0.062" de profundidad, utilizada después de ta remoción de un líquido que contiene la teMpetifetóti para sembrar células, se formó al asegurar una capa de policarbonato 110 de 4.000" de diámetro en «1 íipt|ero continuo ert O» alojamiento superior 60. Un s iio apretado por el ti ßdo entre la capa y el alojamiento superior se formó utilizando un artillo Of 90 #020 y cuatro tornillos de cabezas de armazón 180 de acero inoxidable #10-32x1 /2"simétricamente espaciados los cuales se sujetaron en ios agujeros tapados en la cara superior del alojamiento superior. Dos canales 190 conectados a los agujeros tapados 200, se fijaron con ajustes de cierre luer hembra 210 de acero inoxidable 316 #10-32x1/4" con anillos O ?d #006, proporcionaron puertos para el acceso externo a estas oá aras. Estos puertos se enchufaron por cultivos estáticos utilizando clavijas 21S de cierre luer macho de acero inoxidable 316. Todas las etapas de instalación, ai menos qué se establezca dé otra forma, se condujeron en un gabinete de seguridad biológica y ocurrió después de esterilizar todas las partes (a diferencia de la instalación de membrana/estructura 400 y los ajustes 150 para el alojamiento inferior 10) at esterilizarse en et autoclave u otro tratamiento probado (por ejemplo, irradiación gama o exposición a un gas oxidizante tat como el óxido de etileno, ácido peracético, y/o peróxido de hidrógeno). Todos los materiales se manejaron ya sea con pinzas o guantes estériles dentro det gabinete. Algunas de las membranas se utilizaron sin esterilización por relativamente duraciones cortas de 1 a 3 días o menos; otras membranas se epoxiaron primero sobre estructuras y se irradiaron por gama antes de la instalación (por ejemplo, Polyfle ®) o se irradiaron por gama sin estructuras antes de la instalación (por ejemplo, TYVEK® 1073). Las etapas iniciales en la instalación consistieron de acoplamiento de los alojamientos superiores 60 e inferiores 70, los anillos O #í>39 80 y 85, ía instalación de ta membrana/estructura 400, los ajustes 5 roscados 150 y 210, y los anillos O #006 95 y la sujeción de los cuatros tornillos 120 que sostienen estas partes juntas. En seguida, los ajustes se apretaron y las clavijas 25 para los ajustes para el alojamiento superior se fifaron. La cubierta 100 se instaló así y el dispositivo 1 se almacenó bajo condiciones asépticas hasta utilizarse. 10 Los hepatocitos 'primarios 40 en medio completo (Williams E medio complementado con 4.5 g/L de glucosa, 0.5 U/mL de insulina de bovino, 7 ng/mL de glugagon, 75 µg/mL de hidrocortisona, 10 mM de HIPES, 20 ng/ml de EGF, 20 mM de glutamina, 10 IU de penicilina, y 10 µg de estreptomicina) con 1% de suero de becerro recién nacido (NB€S) 15 se obtuvieron de donadores de porcino con el siguiente procedimiento. Los hepatocitos se aislaron de hígados de cerdos cruzados de Yorkshire/Hampshire, obtenidos de EM Parsons (Hadtey, MA), pesando 8.3+3.0 kg. La heparina (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ) se administró intravenosamente a 0.5 mg/kg y los donadores se anestesiaron con una 20 mezcla de Telazol (7-10 mg/kg, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, LA) y. tompun (5 mg/kg, Miles, Inc., Shawnee, Misión, KS). El plano de anestesia se mantuvo con gas de isoflurano. Todos los procedimientos se realizaron en función con las directrices ACUC. Las células 40 se aislaron utilizando una modificación del 25 método Seglen que se ha descrito anteriormente (P Selgen, Preparation of * r iFßlated rate liver celts, In Utetttod in Celt Biology (DM Prescott, eí ai,,) Vol. 13, Acádémic Press (New York, NY), 1976). Brevemente, el higaH|> t qgjesto se canutó y se perfusionó in situ con Anillos Laclados (Baxter, tt^ffield, IL) a 20 mL/min antes de la extirpación. El hígado se calenté y ^ 5 &ffustonó rápidamente con 0.2% de EDTA a 37°C. Esto se siguió por ia p«rtusión de 1 mg/mL graduados (Life Technologies, Grand Island, NY) a 3 *C hasta que la digestión pareció completa (digestión media 22 + 4 min). Se detuvo más digestión con ta adición de solución de salina regulada ie ftawk fría (Bio Whíttaker, Walkerville, MD) complementado con 10% de 1H NB€S (Cyclone, Logan UT). El tejido no extractado y la vesícula biliar se extrajeron y et resto del tejido paso secuencialmente a través de ias cribas de acero Inoxidable de 200 y 100 mtcrones (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), respectivamente. La suspensión celular se lavó dos veces y la pastilla celular se volvió a suspender en el medio de cultivo. La viabilidad 15 sf determinó por fa exclusión de Trypan azul. Las cétutas se sembraron así en la membrana. En algunos estudios, la membrana 30 se pre-revistió con una solución estéril de 4 L volumen de 40 µg/mL de colágeno Tipo I en agua por 45 minutos, ^FW eguida por la aspiración de esta solución y enjuague con un volumen ü igual de salina regulada por fosfato estéril (PBS), a antes de sembrar las oéJutas. Una suspensión de células en el medio 11 se suspendió igualmente al arremolinar el recibidor que contiene las células y al triturar l suspensión múltiples veces con una pipeta estéril antes de la siembra- Para la mayoría de los estudios se sembraron las células en una densidad 25 inicial de 2x106 células por dispositivo 1. Sin embargo, en algunos * - 60 - estudios, se eliminaron la r cüns l ded más altas (ver Ejemplo 13). La cubierta 100 en el dispositivo 1 se removió, 4 mL de la suspensión celular ^petaron en la membrana 30, el dispositivo se aguó cuidadosamente paiS distribuir el líquido igualmente en la superficie de la membrana, y ta ^ 5 cubierta se reemplazó. El dispositivo sembrado por célula se transfirió a una incubadora (mantenida a 37°C y 85% de humedad relativa) en donde la cámara de gas 20 se conectó, a través de uno de los puertos 150 en el alojamiento inferior 70, a un tanque de gas 4 suministrando 10% de CO2 y un concentración de oxígeno variando desde 0 hasta 90% en 2-5 psi y no 10 mes de 1.0 mL/min. Después de aproximadamente 18-24 horas, et dispositivo se » removió de la incubadora, se colocó detrás en el gabinete de seguridad . biológica, ta cubierta 100 se removió, y el medio se aspiró utilizando una pipeta estéril de Pasteur. La capa 110 con anillo O 90 #020 asociado 15 s# colocó así en el agujero continuo en ef atojamiento superior 60 y éé aseguró en el tugar utilizando los cuatro tornillos 180. Aproximadamente 2.7 mL de medio fresco 11 se introdujo en la cámara líquida 10 al re ojver fas clavijas de cierre luer 215, transfiriéndose en el medio a una velocidad de 1.5 mL/min con los puertos orientados vertícalmente (de tat forma que 20 todas las burbujas de aire se removieron de la cámara), y cerrando los puertos at reinstalar las clavijas de cierre luer. El dispositivo se transfirió así de regreso a la incubadora y se reconectó como arriba en el suministro de fluido oxigenado 4. Los dispositivos se mostraron subsecuentemente mediante la desconexión del suministro de fluido oxigenado, la 25 transferencia de la incubadora a un gabinete de seguridad biológica, la remoción de las clavijas de cierre tuer, y el drenaje del contenido líquido en una vía de colección pequeña. Este procedimiento dio cerno resultado un dispositivo 1 que permitió el cultivo de las células 40 en la membrana 30 oon la oxigenación de transmembrana directa y la perfusión indirecta. Eiemolo 2: Dispositivo de Cultivo Celular - Ajuste Perfusionado Et aparato del Ejemplo 1 también se adaptó para estudiar la función de hepatocitos in vitro bajo la perfusión de ciclo cerrado de medio. El aparato se instaló y se manejó según se describe en el Ejemplo 1 a través de fa instalación de ta capa 110. Un circuito de flujo simple, según se representa en las Figuras 10a y 10b, se instaló asépticamente al dispositivo en un gabinete de seguridad biológica. Los componentes para este circuito (ilustrado esquemáticamente en la Figura 5a) comprendieron un dispositivo sembrado por célula 1 (con capa instalada 110 según se describe en ef Ejemplo 1), un recipiente 220, una bomba 230, tubos de conexión 300 y 305, y ajustes de cierre tuer 215 y 3 5. Todos los componentes se esterilizaron por autoclave (o tratamiento equivalente) antes de la instalación excepto el dispositivo sembrado por célula (el cual se había manejado asépticamente). Antes de conectar el dispositivo sembrado por célula, se removieron las clavijas de cierre luer macho 215 de los ajustes de cierre luer 210. La Figura 10b representa el recipiente, el cual funcionó también como un interceptor de burbujas, comprendiendo un parte superior 240 y parte inferior 250 de poticarbonato (cada 2.00" en diámetro y 0.500" de espesor), un tubo 260 de policarbonato de 3.00" de alto x 0.75*-ID x 1.00"-OD, un par de anillos O 270, #0.19, 3 tornillos metálicos y cerrojos 280, y 5 ajustes de cierre luer hembra 210 de acero inoxidable 316 #10-32x1/4" con anillos O 95 #006. Los anillos O 270 se colocaron en ranuras asimétricas de 0.785 D x 0.965"-OD x 0.052" de profundidad en la parte superior de muescas de 0.75"-ID x 1.00"-OD x 0.062" de profundidad (para alinear el tubo) en las caras, superiores e inferiores, de la parte inferior y la parte superior, respectivamente. Los sellos apretados por liquido se formaron entre et tubo y la parte superior y la parte inferior, respectivamente, al colocar el tubo en estas ranuras después de ta instalación de los anillos O 270 y ta sujeción de los 3 tornillos y cerrojos simétricamente espaciados 260. Los pares de tos ajustes de cierre tuer 290 se instalaron en agujeros tapados 295 en la circunferencia de la parte inferior y la parte superior. Un quinto ajuste de cierre luer 210 se instaló en un agujero tapado 285 en ta cara superior de la parte superior. Un circuito de ciclo cerrado para perfusión se formó at establecer dos series de conexiones utilizando aproximadamente 8" de largo de Tygon LFL L/S tamaño #13 de tubo (300 y 305, respectivamente) con cierre luer macho x 1/16"-!D apernado ajustes 315 de acero inoxidable 316 en ambos extremos. Una longitud de tubo 300 conectó uno de los ajustes de cierre luer 210 en la parte inferior del recipiente 220 a uno de tos ajustes de cierre luer 210 en el dispositivo sembrado por célula 1 ; este tubo funcionó como un paso de flujo para introducir el medio de flujo 11 en el dispositivo sembrado por célula. Una segunda longitud de tubo 305 conectó uno de los ajustes de cierre luer 210 en la parte superior del recipiente al resto del ajuste de cierre tuer 210 en el dispositivo sembrado por célula; este tubo funcionó como un paso de flujo para remover el medio dispositivo sembrado por célula. Una clavija de cierre luer 215 de acero inoxidable 316 se instaló en el resto del ajuste sobre ta parte inferior del recipiente. Esta clavija se removió cuando el medio en el recipiente se mostró o el recipiente se drenó. Un volumen de perfusato 11 , variando típicamente de 10-20 mL, se agregó así al recipiente 220 a través del ajuste de cierre luer 210 en ta cara superior de la parte superior 240 del recipiente. Durante esta adición, los ajustes de cierre luer 210 no conectados en la circunferencia de la parte superior del recipiente se desconectaron para permitir la ventilación. Las clavijas de cierre luer 215 se instalaron así en el resto de los ajustes de cierre luer 210 antes de la transferencia del circuito instalado det gabinete de seguridad biológica a la incubadora. En ta incubadora, et tubo 300 se cargó en ta cabeza de una bomba 230 (típicamente una bomba pertestáitica que comprende una cabeza de bomba Ole-Parmer Easy-Load con alojamiento PSF y el rotor de acero inoxidable Cole-Parmer regulado por un controlador de Cole-Palmer). El dispositiv/o 1 se reconectó al suministro de fluido oxigenado 4 según se describe en el Ejemplo 1. La bomba se suministró de energía así en la velocidad de lujo volumétrico deseado (variando entre 0 y 12 mL/min pero típicamente 0.1- 1.5 mL/min), y el líquido 11 en el recipiente volvió a circular a través del tubo 300 y la cabeza de bomba, en el dispositivo sembrado por célula 1 , a través del tubo 305, y de regreso en el recipiente. Durante este procedimiento el dispositivo se inclinó para facilitar la remoción de burbujas de aire. Dos métodos de más operación del circuito de perfusión se «mp?ementaron. En un método (Método de Perfusión I) el medio 11 se intercambió completamente para el medio fresco después de cada 24-72 horas de operación; en el segundo método (Método de Perfusión II) et medio nunca sé intercambió pero si se introdujo inicialmente como un volumen lo suficientemente grande para soportar tas células por un periodo de uno a más días. Para el Método de Perfusión I, la bomba 230 se detuvo primero, el suministro de fluido oxigenado 4 se desconectó, y el circuito de perfusión se transfirió en un gabinete de seguridad biológica. If medio restante en el recipiente 220 se drenó al remover la clavija de cierre luer 215 del ajuste de cierre luer 210 en la parte inferior 250 del recipiente no conectado at tubo 300 e inclinar después et recipiente. El circuito se volvió a configurar así temporalmente al desunir ef tubo 305 del afuste de cierre luer 210 en la parte superior 240 del recipiente. Después de remover la clavija de cierre luer 215 del ajuste de cierre luer en fa Oa a superior de la parte superior del recipiente, el recipiente se rellenó con el volumen de medio agregado inicialmente y la bomba se activó. La bomba se operó en esta configuración de ciclo abierto (calculado como ta diferencia entre el volumen agregado inicialmente y el volumen drenado) en la velocidad de flujo volumétrico. La bomba se detuvo así y el circuito se reconfiguró en la configuración de ciclo cerrado original antes de la transferencia de regreso a la incubadora, la reconexión al suministro de fluido oxigenado, y la reactivación de la bomba. Para el Método de Perfusión II, la bomba 230 se detuvo, el I suministro de fluido oxigenado 4 se desconectó, el tubo 300 no se cargó de la bomba, y el circuito de perfusión sin la bomba regresó al gabinete de * 4 - 65 sefwridad biológica sin vaciar el dispositivo del liquido. Toda la mue ttsa de fdO µL se removió con una pipeta estéril dei puerto 210 ppra mostrarse en M recipiente 200 (después de desconectar la clavija de cierre luer 1^ para el puerto para ventilación). Ei circuito de perfusión se regresó asi a 5 la Incubadora, la sección adecuada del tubo reinstalado en la cabeza de bomba, la bomba se encendió, y el suministro de fluido oxigenado se retoñeció at dispositivo. A pesar de que el circuito de perfusión anterior tuvo una configuración de circuito cerrado, anticipamos formas de ia modalidad 1 descrita en este Ejemplo 2 con una configuración de ciclo abierto en donde tartrayectoria de flujo es de un recipiente de suministre, a través de una ^W ftfihba, a través del dispositivo, y en un recipiente de colección. La instalación y operación de este circuito de ciclo abierto sigue los procedimientos generales descritos anteriormente. 15 Los procedimientos y operaciones descritas (os) anteriormente^ dieron como resultado un dispositivo que se operó para estudios ín íro en una manera que estimula et uso de LAD para el tratamiento extracorporeal de humano y sujetos animales que experimentan la función del hígado Oftmprometido. 2 CJemplo 3: Actividad de Detoxificación Hepatocelular En Base a la nversión de Atcoxiresorufina a Resorufina Las isoenzimas de citocroma P450 (CYP450) son monooxigenasas de función mezclada de Fase 1 las cuales, junto con las enzimas conjugadas de Fase II complementarias catalizan la 25 biotransformación de xenobióticos así como también los lipofilos proporciones del índice de estimulación para un dispositivo que contiene un soporte de cultivo celular permeable al gas prebéndese en el índice de estimulación para células del mismo donador y día después de la siembra pero sembrado en recipientes de cultivo por tejido de 60 mm de diámetro equivalentemente de tamaño. Este ensayo se realizó típicamente en et primer dia después de la siembra pero también se realizó ocasionalmente hasta siete o más días después de la siembra. En este ensayo, la conversión de alcoxiresorufina a resorufina corresponde a un aumento en fluorescencia, de tal forma que el índice de estimulación y la actividad de detoxificación corresponden al nivel de la actividad P45T de una serie particular de isoenzimas y ta intensidad de la respuesta de detoxifícación de hepatocitos cultivados. füemola 4: Actividad de tsoenzt as Henatocelulares F450 En Base as l^t ?fttfW F DtazQp m El metabolismo del fármaco diazepam proporcionó un método alternativo para evaluar la actividad de isoenzimas P450 en hepatocitos soportados en el dispositivo 1 det Ejemplo 1. La claridad de diazepam y su biotransformación a nordiazepam y temazepam se evaluaron utilizando un método similar a aquel de Jáuregui ef al. (HO Jáuregui, SF Ng, KL Gann, DJ WaxmanXenobiotic induction de P-450 PB-4 (IIB1) y P-450c (IA1) y asociado a actividades de monooxigenasa en cultivos primarios de hepatocitos de rata, Xenobiotica 21 :1091-1106, 1991). En este método el medio agregado al dispositivo del Ejemplo 1 en el primer día después de la 1 siembra después de la instalación de la capa 110 se complementó con 70 µM de diazepam (Sigma). Una muestra de 750 µM se colectó después de la incubación por 24 horas y se congeló hasta la extracción; una muestra det medio complementado por diazepam antes de la adición al dispositivo también se colectó y se congeló. La extracción de fase sólida se realizó con cartuchos Oasis (Waters Corp., Milford, MA) y una policopia de exitacción Waters. Los cartuchos se prepararon secuencialmente con el primer metanol y después el agua desmineralizada de osmosis inversa (RODI). Las muestras se cargaron en la columna y se lavaron con 5% de metanol en RODI, se eluyeron fuera de la columna con metanol, y se evaporaron y reconstituyeron con 250 µL de una fase móvil de 65% de metanot/35% de 0.01 M de acetato de amonio en pH 6.0. El HPLC de fase inversa se condujo a una velocidad de flujo de 1.Ó mL/min en una columna de Waters MRero-Bondpak C18 a 24.5°C. La elución se midió mediante la absorbencia óptica a 254 nm. El diazepam eluido en aproximadamente 11 minutos; fos mefabotitos de nordiazepam y temazepam eloidos en 10 y 8 minutos, respectivamente. Los datos se expresaron como porcentaje dßf diazepam inicial clarificado y como porcentajes del diazepam inicial Convertido a nordiazepam o temazepam. En este ensayo, altos porcentajes de diazepam inicial clarificado y convertido a nordiazepam y temazepam corresponden a la actividad de isoenzima P450 alta. Mientras más altos estos porcentajes, más grande la actividad de P450. Ejemplo 5: Actividad de Detoxificación Hepatocelular En Bas al Metabolismo de Lidocaína I El metabolismo del fármaco de lidocaína proporcionó otro método para evaluar la actividad de detoxificación de hepatocitos soportados en el dispositivo 1 del Ejemplo 1. La claridad de lidocaína sé evaluó utilizando un método similar a aquel de Nyber et al. (SL Nyberg, HJ Mann, R. Remmel, W-S Hu, FB Cerra, Phar acokinetic análisis verifies P4S0 function during in vitro and in vivo application of a bioartíficial liver, 5 ASAIO J39:M252-256, 1993). En este método el medio agregado al dispositivo del Ejemplo 1 en el primer día después de la siembra después de la cubierta se complementó con 740 µM de lidocaína (Paddock Laboratories Inc., Minneapolis, MN). Una muestra de 600 µL se colectó después de la incubación por 24 horas y se congeló hasta la extracción; 10 una muestra del medio complementado por lidocaína antes de la adición del dispositivo también se colectó y se congeló. La extracción de fase # sólida se realizó con cartuchos Oasis (Waters Corp.) y una policopia de extracción Waters. Los cartuchos se prepararen de 99% de MeOH i°é de H€l y 0.5 M de Bórax. Las muestras se cargaron en la columna y se 15 lavaron con 0.5 M de Bórax, se eluyeron con MeOH/HCI y después se evaporaron y se reconstituyeron con 250 µl de fase móvil de 85% (50 m de NH4HPO4 + 10 mM de ácido hexanosulfónico, pH 3.0)/15% de acetonitrilo. El HPLC de fase inversa se condujo a una velocidad de flujo f r de 1 mL/min en una columna Microsorb C8 (Rainin instrument Co., 20 Woburn, MA) a temperatura ambiente. La elución se midió mediante la absorbencia óptica a 214 nm. La lidocaína se eluyó en aproximadamente 37 minutos; MEGX, el mayor metabolito, se eluyó en 27 minutos. Los datos se expresaron como porcentaje de la lidocaína inicial clarificada. En este ensayos, altos porcentajes de tidocaína inicial 25 clarificada y convertida en metabolitos corresponden a la actividad de isoenzima P450 alta. Mientras más altos estos porcentajes, más grande ta actividad de P450. gie olo 6: Ureaaenesis Hepatocelular de Medio En Base A la Síntesis de Urea La síntesis de urea se determinó por cualquiera de los dos métodos para el dispositivo 1 de los Ejemplos 1 y 2: Método 1 : La claridad de amonio, sus sales, y componentes aminados en el medio, a través de la desaminación y ureagenesis, se cree que es una función crítica de hepatocitos in vivo y una función deseada de estas células como parte de un LAD. La desaminación da como resultado la fOttnación de urea, la cual in vivo se clarifica por ef sistema renal. La síntesis de urea se midió con los dispositivos 1 de tos Ejemplos 1 y 2 utilizando un método eolorimétríco para ta determinación de nitrógeno, disponible como Equipo #640-B de Sigma Diagnostics (St. Louis, MO). Las muestras se colectaron periódicamente después de ta siembra de células en dispositivos y se trataron con ureasa para hidrotizar la urea a NH3 y CO2. El NH3 resultante reaccionó así con hipoctorito y fenol en la presencia del catalizador, nitroprusido de sodio, para formar indofenol. La absorbencia óptica de la solución resultante de indofenol se midió a 570 nm y se convirtió en concentración de urea en la muestra original utilizando una curva estándar. Los datos se expresaron como cantidad de urea producida por dispositivo por día al multiplicar las concentraciones en volumen de medio 11 en el dispositivo y dividir por el número de días desde el muestreo.

En este ensayo, los cultivos de hepatocito se ofrecieron d n i cloruro de amonio y ornitina a fin de aumentar ta producción de urea. La síntesis de urea es parte del proceso de desaminación y ureagenesís. Oe aHaaawr . 5 a*»erdo con lo anterior, aumentos en la síntesis de urea, particularmente en respuesta al ofrecimiento con amonio exógeno, representan capacidad funcional aumentada para desaminar el medio. Después del ofrecimiento, el medio de los cultivos se probó para medir la cantidad de urea producida. Una solución concentrada de 1 M de cloruro de amonio (NH4OI; 10 fttgRiß #A*0171) se preparó al agregar 1.07 g de NH4CI a 1© mL de RODI. La solución se almacenó a 4*C hasta utilizarse. Una solución concentrada ^P de 0.2 M de ortinína (Sigma #0-6503 se preparó al agreda» 0.34 g en 10 mi de ODI. Esta solución también se almacené a 4°€ hasta utilizarse. Las placas de cultivo se enjuagaron así con IX de satina regulada de fosfato (PBS). A cada placa se agregó 10 µL de cada cloruro de amonio y ornifina para cada 1 mL de 1% de medio William (complementado con lo siguiente: 4.5 g/L de glucosa, 0.5 U/mL de insulina de. bovino, 7 ng/mL de glucagon, 7.5 µg/mL de hidrocortisona, 10 mM de W6PES, 20 ng/mL de EGF, 20 mM de glutamina, 10 IU de penicilina, y 10 ^ 2 §t§ de streptomícina y 1% de suero de becerro recién nacido (NBCS)), es decir, 40 µL se agregaron a medida que 4 mL de medio William se utiliza para cultivar hepatocitos de porcino en placas de cultivo de 60 mm. Las placas con medio de cultivo regular no tratadas con cloruro de amonio y o nitina se incluyeron como controles. Las placas se regresaron a ta 25 incubadora por 24 horas. Después de la incubación, 2 mL de medio se . . 72 - • ¡ réÉm>vió de placas y se transfirió en tubos de prueba marcados zo dame te (Falcon #2064) y los tubos se almacenaron a 20°C, La cantidad de urea presente en las muestras congeladas $e determinó utilizando un equipo (Sigma, equipo #535) de Nitrógeno de Urta ~ B W S de Sangre (BON). 40 µL de muestras congeladas se agregaron con 3.0 L del reactivo de ácido BUN y 2.0 mL del reactivo de color BUN en 100 m de tubos de vidrio de borosilicato eliminabtes. Los tubos se incubaron a 100°C por 10 minutos y después a temperatura ambiente por 3-5 minutos. Los tubos enfriados se mezclaron una vez bien utilizando el agitado tO Vértex. Las soluciones resultantes se mostraron coiorimétricamente en placas dé 96 cavidades en triplicado a 546 nm. Las absorbencias ópticas se convirtieron en concentraciones de urea utilizando una curva estándar y datos ex resados como cantidad de urea producida por dispositivo por $1$ al multiplicar las concentraciones por el volumen de medio 11 e el 15 dispositivo y dividir por el número de días desde el muestreo. En este ensayo, tas velocidades altas de la formación de urea corresponden a los niveles altos esperados de desamínación y claridad de amonio, funciones objetivas clínicamente deseadas. Mientras más grande la velocidad de urea sintetizada, más grande el nivet esperado de 20 desaminación. Efeniplo 7: Síntesis v Secreción de Proteínas Hepatocelulafes en Base,..a1a Secreción de Albúmina La síntesis y secreción de proteínas de suero, incluyendo albúmina, se cree que es una función crítica de hepatocitos in vivo y en un 25 LAD. La albúmina se utiliza como un marcador de ta actividad secretora de hepatocitos. La secreción de albúmina se midió utilizando una ELI competitiva estándar con muestras para el dispositivo 1 de los Ejemplos 1 y 2. Las muestras se colectaron periódicamente después de sembrar las células 40 en dispositivos 1 y se congelaron hasta que se analizaron por ELISA. Para las cavidades individuales de ELISA en placas de 96 cavidades se revistieron durante la noche con 200 µg/mL de albúmina de porcino (Accurate Chemical, Westbury, NY). Siguiendo una etapa de lavado con Tween 20 (Pierce, Rockford, IL), 50 µL de una muestra o estándar (Agudo) en cavidades individuales de una placa de múltiples cavidades se incubó con una peroxidasa de rábano picante conjugada de anticuerpo de albúmina de anti-puerco de cabra (Bethyl Labs., RÉ##lg©mery, TX) por 90 minutos. El color se produjo por adición de diftldroclorUro de -fen i lenodiamina (Pierce) y (a reacción se detuvo at agregar H2SO4. La absorbencia óptica de cavidades individuales se midió a 490 nm ufilizando un lector de placa Molecular Devices SpectraMax 250 Con el software SofíMax Pro y se convirtió en ta concentración de albúmina en la muestra original utilizando una curva estándar. Los datos se expresaron como cantidad de albúmina producida por dispositivo por día al multiplicar las concentraciones por el volumen de medio en el dispositivo y dividir por el número de días desde el muestreo. En este ensayo, las velocidades más altas de secreción de albúmina son marcas de la función clínicamente deseada por hepatocitos diferenciados. Ejemplo 8: Determinación de Masa Celular Adherente en Base a ta Medida de la Proteína Hepatocelular Total La masa celular de hepatocito y la unión se determinó dispositivo 1 de los Ejemplos 1 y 2 en base a una cantidad de proteína asociada utilizando un Equipo de Ensayo de Proteína BCA (Pierce, catalogo no. 23225). Los reactivos de ensayo se prepararon de acuerdo a ^ las instrucciones contenidas en la presente. El reactivo A se preparó como 1 L de reactivo base con carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, reactivo de detección BCA, y tartrato de sodio en 0.2 N de NaOH. El reactivo B se preparó como una solución de 4% de sulfato de cobre de 25 mL. La Albúmina de Suero de Bovino (BSA, Pierce, Cat. NO. 23209) se 10 utilizó como estándares en 2 mg/mL en 0.9% de cloruro de sodio y 0.05% de azida de sodio. Los dispositivos 1 se removieron de la incubadora, las Capas 110 se removieron, y el medio 11 se aspiró de los cultivos. El medio e re mplazó con la salina regulada por fosfato (PBS) y los cultivos d 15 congelaron a 0°C por 24 horas. Los cultivos se descongelaron asi y se desecharon de las membranas impermeables at líquido, permeables at gas 30 en tubos de prueba adecuadamente marcados. Una solución de reactivo de trabajo se preparó al combinar 50 partes de reactivo A con 1 parte de reactivo B. Una serie de estándares 20 de proteína se preparó al diluir en serie 0 a 2 mg/mL de la solución concentrada de BSA en el mismo diluyente. En seguida, 10 µL de cada muestra o estándar y 200 mL del reactivo de trabajo fueron secuencialmente, se agregó a las cavidades individuales de placas de 96 cavidades. Las muestras se mezclaron por 30 segundos al agitarse 25 suavemente para cubrir e incubar a 37°C por 30 minutos. Las cavidades 7S - se valoraron después colorimétricamen^^j 560 nm, Las concentraciones de proteína para desconocidos seideterminaron de una curva estándar. Eiemplo 9: Comparación de Membranas Permeables al Gas Alternativas nata HepatocHos en Dispositivos de Cultivo Celular 5 El aparato del Ejemplo 1 se utilizó para evaluar el potencial de diferentes membranas impermeables al líquido, permeables al gas como soportes para hepatocitos en cultivo. Los hepatocitos pierden su funcionalidad si no se siembran sobre un soporte sólido siguiente at aislamiento de un donador. Además, el nivet de función que pueden lograr 10 en cultivo puede depender críticamente en las propiedades det soporte de cultivo, incluyendo si se reviste con una capa o get de colágeno o sustancias que promueven ta adhesión y función. Las membranas evaluadas incluyeron Pófyflex® (una película de 0.002" no porosa de poliestireno elaborada por Plastics Suppliers, Inc., 15 Columbus, OH), Breath-Easy™ (una película no porosa de poliuretano elaborado por Diversified Biotech, Boston, MA), una película co-extruída de tres capas de estireno-butadieno-estireno/acetato vinil etilo/estireno- butadieno-estireno (SBS/EVA/SBS, una película no porosa suministrada por BASF, Alemania a Baxter Healthcare Corporation, Niveles, Bélgica), 20 una película co-extruida de dos capas de estireno-butadieno- estireno/potietioeno (SBS/PE, elaborado por Cypress Cryovac/Sealed Air Corp., Rochester, NY), lámina de poliéster no poroso (elaborado por Perfecseal Inc., Filadelfia, PA), HDPE en la forma de TYVEK® 1073 (una membrana no horneada microporosa compuesta de potiotefina de USP 25 Ciase VI y elaborada por E.l. du Pont de Nemours y Co, Inc., Wilmington, DI), lámina de polietiteno (üínneapolís, MN) con un tamaño de poro medio de 1.7 µm según se determina por una prueba de punto de burbujas), Pelysep® (lámina de polipropileno microporoso elaborado por Micron Se arations, Westborougfb, ^^^ MA), poli(tetraffuoreetileno) microporoso {PIPÉ) e Hydrulon® (nylon hidrofobizado microporoso 6, 6) (ambos elaborados por Pall Corporation, ert Washington, NY), y policarbonato de trayecto grabado (elaborado por - 1 Micron Separations). Las membranas con dos diferentes tamaños de poro se examinaron para el PTFE microporoso, Hydrulon, y policarbonato de 10 trayecto grabado. Cada una de las membranas probadas podria esperarse que tengan suficiente permeabilidad al oxígeno y dióxido de carbono para (C ar la oxigenacióm dé) transme brana directa e hepafoeifosi i é rentes. Además, cada una de estas membranas podrían esperarse) 15 que sean impermeables af agua para las diferencias de presión a lo largo de la membrana esperada para la oxigenación y perfusión en un dispositivo de cultivo celular o sistema auxiliar del hígado. Cada una de estas modalidades se evaluó sin revestirse con ef colágeno tipo I antes de la siembra de células en una densidad de 2x106 20 hepatocitos por dispositivo. Un suministro de fluido oxigenado con 19% de 2, 10% de CO2, y balance N2 se utilizó. Los datos para la actividad de detoxificación por métodos de conversión de alcoxiresorufina a resorufina (Ejemplo 3) para células de donador 54 (poliuretano, PTFE, y nylon hidrofobizado), donador 61 (HDPE), donador 76 (policarbonato de trayecto 25 grabado), donador 80 (SBS/EVA/SBS, PS/PE, y PE), donador 84 ( ?fléster), y donador 89 (potiestireno) un día 1 después de la iembra i ?ß presentan en la Tabla 1. Tabla 1 actividad de Detoxificación para Hepatocitos en Cultivos Estáticos en ^positivos de Cultivo Celular para diferentes Membranas Impermeables al Líquido, Permeables al Gas Membrana Permeable at Gas Actividad de Detpxificación Material (Fuente) Tamaño de Poro BROD EROD Poliestireno (Polyflexß>, Plastics No poroso 1.44 1.11 Suppliers} *Fr Los niveles más altos de actividad de detoxífícación para ía transformación de BROD a resorufina se observaron por las células cultivadas en dispositivos que comprenden Polyflex® o la membrana de 25 peliéster. La membrana de polietileno microporoso soportó niveles el dispositivo sembrado por célula 1. Los niveles más altos de la actividad dé detoxificación para la biotransformación de EROD a resorufina se observaron por las células cultivadas en dispositivos que comprenden Polyftex®, la membrana de poliéster, o Hydrulon®. Al aumentar el tamaño del poro se reduce la actividad de detoxificación para ambas alcoxiresorufinas en policarbonato de trayecto grabado pero se tuvieron efectos relativamente menores para el nylon microporoso PTFE e hidrofobizado 6,6. En general, la actividad de detoxificación fue más 0 dependiente del tipo de membrana para BROD que para EROD. Además, las actividades de detoxificación total más altas se observaron por los dispositivos sembrados por célula que comprenden poliestireno y poliéster no porosos. Estos resultados demuestran como el cambiar la composición 5 química y estructura física de una membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 puede afectar la habilidad de los hepatocitos 40 cultivados en un dispositivo 1 para realizar la detoxificación. El aparato del Ejemplo 1 también se utilizó para comparaí el potencial de ureagenesis de hepatocitos cultivados en un dispositivo 1 que 0 comprende Polyflex® con hepatocitos 40 cultivados en recipientes de cultivo por tejido de 60 mm de diámetro equivalentemente de tamaño. Los recipientes de cultivo por tejido presentan a las células una superficie efectivamente impermeable al gas, incluyendo oxígeno, en relación a Polyflex®: Polyflex® tiene una permeabilidad al oxígeno en el orden de 5 2.0x104 mL/m -día-atm, considerando que la permeabilidad al oxígeno de í * »1 los recipientes de cultivo por tejido se encuentra debajo de la habifiétáj estado de las técnicas de la materia para medir. Para este estudio 2x106 hepatocitos del donador 93 se sembraron ya sea en un dispositivo 1 con Polyflex® o en un recipiente de 5 cultivo por tejido. El dispositivo se suministró con un gas alimentado de 19% de O2, 10% de CO2, y balance de NH2. Los datos para la síntesis de urea, en términos tanto del nivel básico (símbolos abiertos utilizados en el Ejemplo 6, Método 2 sin adición de amonio exógeno y ornitina) y en respuesta al intervalo con 20 mM de amonio exógeno (símbolos cerrados 10 en base al Ejemplo 6, Método 2 con adición de amonio exógeno y ornitina), se presenta en la Figura 11 para dispositivos (cuadros) y recipientes de cultivo por tejido (círculos). El nivel básico de síntesis de urea para dispositivos durante el curso de 11 días de cultivo es indistinguible del nivel básico de hepatocitos mantenido en recipientes de cultivo por tejido 15 durante este período de tiempo. Además, la síntesis de urea en respuesta al intervalo con amonio es la misma o más grande en los dispositivos que en los recipientes de cultivo por tejido. Estos resultados demuestran que no solamente pueden lograrse niveles más altos de detoxificación en los hepatocitos de cultivo en una membrana permeable al gas tal como 20 Polyflex® sino también la ureagenesis, particularmente en respuesta al amonio exógeno, puede mejorarse al cultivar los hepatocíto adherentes en la membrana permeable al gas en un dispositivo. Ejemplo 10: Efecto del Tratamiento de Superficie de las Membranas Permeables al Gas en Hepatocitos en Dispositivos de Cultivo Celular 25 El efecto de modificación de la superficie de las membranas mi m* impermeables al líquido, permeables al gas 30 también se* ¿§? t> utilizando el aparato del Ejemplo 1. La modificación específica (por ejemplo, mediante el revestimiento o unión covalente de moléculas específicas) y la modificación no específica (por ejemplo, al tratar la superficie con un proceso físico o químico oxidizante) altera las propiedades adhesivas celulares de las superficies y la habilidad de estas superficies para promover la función celular. Estos tratamientos modifican solamente la superficie de la membrana de soporte celular y no las propiedades del volumen de la membrana. 10 Evaluamos los efectos de dos tratamientos independientes 41 , aplicados antes de sembrar las células 40, para controlar la función de hepatocitos cultivados en las membranas impermeables al líquido, permeables al gas 30 en un dispositivo 1. Un tratamiento comprendió revestir la superficie de la membrana con una solución estéril de 1.1 15 mg/mL de colágeno Tipo I por 45 minutos, seguido por el enjuague con salina regulada por fosfato estéril. El revestimiento resultante fue en el orden de una a unas pocas moléculas de espesor de colágeno. Este tipo de tratamiento mejora la adhesión de varios tipos de células a varías superficies de otra forma menos adhesivas. El segundo tratamiento 20 comprendió la exposición del lado de soporte celular de las membranas a una descarga de corona para oxidizar esta superficie. El tratamiento de recipientes de poliestireno con una descarga de corona oxidiza la superficie de soporte celular, de tal forma que el nivel de dina (tensión de superficie crítica) es de 40-50 dinas/cm, y promueve la unión celular para 25 varios tipos de células. Este tratamiento modifica solamente una capa de superficie más delgada de la superficie, de menos espesor que aproximadamente 1 micrón, sin aumentar el espesor de la membrana o depositar cantidades macroscópicas de material sobre la membrana. Este tratamiento se aplicó tanto para las membranas de Polyflex® no porosas (poliestireno) como TYVEK® 1073 porosas (HDPE no horneado) de tal forma que sus niveles de dinas (tensiones de superficie crítica) llegan a ser aproximadamente de 45 dinas/cm. La tabla 2 presenta datos para la actividad de detoxificación por métodos de conversión de alcoxiresorufina a resorufina (Ejemplo 3) para células, sembradas en 2x106 de hepatocitos por dispositivo 1 , de donador 61 (HDPE), donador 76 (policarbonato de trayecto grabado), donador 80 (SBS/EVA/SBS, PS/PE, y PE), y donador 89 (poliestireno) en día 1 después de la siembra de los dispositivos suministrados con 19% de O2, 10% de CO2, y balance N2, Los cambios en la detoxificación en respuesta al tratamiento de superficie 41 dependieron de la especificidad de detoxificación (BROD o EROD) así como también el tipo de membrana. Para algunas membranas (por ejemplo, HDPE y policarbonato de trayecto grabado con poros de 1 micrón de diámetro), el revestimiento con colágeno mejoró ambas especificidades de detoxificación. Para otras membranas (por ejemplo, poliestireno, polietileno/poliestireno co-extruido, policarbonato de trayecto grabado con poros de 0.1 de micrón de diámetro), el revestimiento con colágeno mejoró solamente una especificidad de detoxificación con cambios menores en la especificidad alternativa. Las membranas restantes experimentaron menores reducciones en la detoxificación en el tratamiento con colágeno.

Tabla 2 Efecto del Tratamiento de Superficie de las Membranas Permeables al Gas en la Actividad de Detoxificación para Hepatocitos en Cultivos Estáticos en Dispositivos de Cultivo Celular Me mbrana i Permea! ble al Gas Actividad de Resorufina Material Tratamiento de Superficie C olágeno Corona BROD EROD re ¡vestido tratada Poliestireno No No 1 .44 1 .1 1 Sí No 2.04 0.94 No Sí 1 .64 1 .08 Sí Sí 1 .51 1 .60 10 SBS/EVA/SBS No No - 0.65 Sí No 0.45 • Polietileno/poliestirenc I coNo No 0.72 extruido Sí No • 0.79 HDPE No No 0.22 0.81 Sí No 0.32 0.99 No Sí 0.60 1 .00 15 Polietileno No No 0.77 0.95 Si- No 0.54 0.86 Policarbonato (0.1 µm de No No 0.45 0.91 poros) Sí No 0.31 1 .23 Policarbonato (0.1 µm de No No 0.24 0.48 f poros) Sí No 0.59 0.91 20 El tratamiento de superficie con la descarga de corona en la ausencia de revestimiento con colágeno mejoró significativamente la actividad de detoxificación tanto de poliestireno como HDPE. El tratamiento secuencial por la descarga de corona seguido por el revestimiento con colágeno mejoró además la actividad de detoxificación 25 total de poliestireno. Esta combinación, cuando se aplicó a Polyflex®, «i p pt#dujo el sistema con la á^WW más grande de deioxífícación Los hepa ocito ultivados ff rt dispositivo 1 que comprende la descarga de corona tratada, el Pll ex® revestido de colágeno también soportó la actividad de detoxificación sostenida sobre la evolución de tin cultivo. Para estas evaluaciones la actividad de H toxlficación basada en ia b?stransfor ación de BROD y EROD (Ejemplo 3) se midió en días «no, tres, y siete después de la siembra. Los valores para BROD se redujeron ligeramente (de 1.51 en el día uno a 1.47 en el día 3 a 1.20 en el día siete), considerando que los valores para EROD se aumentaron del día uno al día tres (1.60 a 4.25) antes de reducir el día siete (0.87). Todos estos valores para la actividad de detoxificación fueron más altos que para otras membranas. Estos resultados demuestran la utilidad de modificar las membranas impermeables al líquido, permeables al gas 30 con uno o más tratamientos de superficie 41 , en donde solamente la superficie de la membrana expuesta a la células 40 (y no la permeabilidad de gas de la membrana) se modifica, a fin de lograr los aumentos deseados en la función de hepatocito en un dispositivo de cultivo celular 1. Ejemplo 1 1 : Efecto de Oxigenación en Hepatocitos en Dispositivos de Cultivo Celular No Perfusionados El aparato del Ejemplo 1 se utilizó para comparar el efecto de varias composiciones de gas en las funciones de cultivos de hepatocito estáticos La presión parcial de oxígeno a la cual las células, y en particular los hepatocitos, se exponen pueden influencia significativamente su función. La oxigenación de transmembrana directa de células ad erentes puede lograrse en el dispositivo 1 al alimentar un gas con concentración deseada de oxígeno en un lado de una membrana permeable at gas y cultivar tas células en el lado opuesto. Este modo de oxigenación ofrece la resistencia reducida en el transporte de oxígeno a &- 5 células comparadas a la oxigenación a través de la saturación del medio con oxígeno. Además, la oxigenación de transmembrana directa desacopla eficazmente la oxigenación y la perfusión de células. Para este Ejemplo, la oxigenación de hepatocitos adherentes en cultivos estáticos se controló al establecer la concentración de oxígeno 10 en el gas alimentado al dispositivo 1 y contactado con la membrana de soporte celular impermeable al líquido, permeable al gas 30. Dos diferentes membranas se examinaron; poliestíreno (Polyflex®) revestido por colágeno, tratado por corona de descarga y no revestido, HDPE no horneado (TYVEK® 1073). Las composiciones de gas probadas 15 comprendieron 10% de CO2, con 0%, 19%, 40%, 60%, 65%, o 90% de O_, y balance N2. El dióxido de carbono se incluyó para mantener un pH fisiológico en base al utilizado de un regulador de base de bicarbonato estándar. Las Figuras 12a-d muestran datos para la unión de células un 20 día después de la siembra (Ejemplo 6), para ureagenesis (Ejemplo 5), para ta actividad de detoxificación en base a la biotransformación de alcoxiresorufínas (Ejemplo 3), y la actividad de detoxificación en base al metabolismo de lidocaína (Ejemplo 5) para hepatocitos 40 cultivados estáticamente en dispositivos 1 que contienen poliestirepo revestido por 25 colágeno, tratado de corona de 0.002" de espesor. Los datos se obtuvieron para 2x106 de hepatocitos sembrados de donadores 100 y 101 y se expresaron en relación a los dispositivos alimentados de 19% de O2. La unión un día después de la siembra (Figura 12a), medida como la cantidad de la proteína total asociada con las células adherentes, se dobló con un ^^P^ 5 aumento en concentración de O2 en el gas alimentado a 60%. Los datos para la síntesis de urea, en términos tanto del nivel básico (símbolos abiertos) como en respuesta al intervalo con 20 mM de amonio exógeno (símbolos cerrados), se presentan en la Figura 12b para dispositivos 1 en los días, dos (cuadros) y cinco (círculos) después de la 10 siembra. Los niveles básicos son relativamente independientes de la concentración de O2 en el gas alimentado. A la inversa, las velocidades ^W intercaladas de síntesis de urea aumentaron con concentración de O2 en el día dos después de la siembra pero se redujeron con la concentración de O2 en el día cinco después de la siembra. 15 Los datos para la actividad de detoxificación en base a la conversión de BROD (cuadros) y EROD (círculos) a resorufina se presenta en la Figura 12c para los días uno (símbolos cerrados) y cuatro (símbolos abiertos) después de la siembra. En el día uno después de la siembra las actividades de mayor detoxificación se observaron para una concentración 20 intermedia de O2 de 40%. En el día cuatro después de la siembra la actividad de detoxificación para BROD fue independiente de la concentración de O2, pero la actividad de detoxificacíón para EROD se redujo monotónicamente con la concentración de O2 en este día en cultivo. Las tendencias complementarias se observaron para las 25 cantidades de metabolitos de lidocaína (Figura 12d). En el día dos después de la siembra (cuadros cerrados) la cantidad de metablitos se aumentó ligeramente con la concentración en aumento de O2, pero en el día cinco después de la siembra (círculos cerrados) la cantidad de metabolitos para lidocaína se redujo agudamente con ia concentración en ^ÍP 5 aumento de O2. Estos resultados demuestran que al controlar la concentración de oxígeno alimentado en un dispositivo 1 que comprende Polyftex® revestido por colágeno, tratado por descarga, controlando de tal modo el grado de oxigenación de cultivos estáticos de hepatocitos 40, pueden 10 utilizarse para controlar un amplio rango de funciones de hepatocítos. Además, al seleccionar la concentración de oxígeno y variarlo durante F diferentes días en cultivo, pueden promoverse o subregulares diferentes funciones. Tipos similares de datos se obtuvieron para hepatocitos 40 15 cultivados estáticamente en dispositivos 1 que comprende TYVEK® 1073 como ia membrana/soporte celular impermeable al líquido, permeable al gas 30. Los hepatocitos en este sistema se sembraron a una densidad de 2x106 células por dispositivo y se evaluaron para el efecto de oxigenación en su actividad de detoxificación por métodos de conversión de 20 alcoxiresorufina a resorufina (Ejemplo 3) en el día 1 después de la siembra para células del donador 73 y la claridad de diazepam (Ejemplo 4) en los días 2 y 4 después de la siembra para células del donador 78, la ureagenesis se base en los niveles básicos de síntesis de urea (Ejemplo 5) para el día 3 después de la siembra para células del donador 76, y la 25 síntesis y secreción de albúmina (Ejemplo 6) para las células del donador 74. Se colectaron los datos para estos ensayos de diferentes donadores de porcino y se resumen en la Figura 13 y las Tablas 3 y 4. La Figura 13 muestra que las actividades de mayor detoxificación para BROD (cuadros cerrados) y EROD (cuadros abiertos) ™ i- ' se observaron para la oxigenación de transmembrana con 65% de O2. La exposición a concentraciones más altas o bajas de O2 dieron como resultado la actividad de detoxificación inferior: exposición a 0% de O2 de células asfixiadas, exposición a 19% y 40% de O2 fue limitante para la actividad de detoxificación, y la exposición a 90% de O2 fue hiperóxica y 10 nociva para las células. De igual forma, la Tabla 3 muestra que tos porcentajes más altos de diazepam se aclararon y metabolizaron en nordiozepam y temazepam por un aumento en oxigenación a 40% de 19%. Tabla 4 Secreción de Albúmina para Hepatocitos en Cultivos Estáticos en 15 Dispositivos de Cultivo Celular como Función de Oxigenación % de O2 en el Velocidad de Secreción de Albúmina (µg/día) Dispositivo de Día 3 Día 6 Día 8 Día 10 ©as Alimentado después de después de después de después de la siembra la siembra la siembra la siembra 19 0.186 0.342 2.699 3.443 40 0.076 0.075 0.227 0.254 65 0.063 0.052 0.082 0.082 90 0.055 0.023 2.98 0.567 20 Eiemolo 12: Efecto de Perfusión en Heoatocitos ; en Dispositivos de Cultivo Celular El aparato del Ejemplo 2 se utilizó para comparar el efecto de perfusionar los cultivos de hepatocito en diferentes velocidades de flujo 25 volumétrico en dispositivos de escala de laboratorio que comprenden Polyflex® revestido por colágeno, tratado por descarga de corona. L í dispositivos 1 del donador 96, cargados con 10 mL de medio co i ^ß como perfusato, y alimentados de gas que contiene 19% de O2, 10% de CO2, y balance N2. La Figura 14 presenta los datos tanto para los niveles básicos de síntesis de urea (símbolos abiertos) como velocidades de síntesis de urea en respuesta al intervalo con 20 mM de amonio exógeno (símbolos cerrados) para dispositivos perfusionados en 1.5 de mL/min (cuadros) y en 0.1 mL/min (círculos). Los datos se expresan como porcentajes de controles estáticos. Los aumentos relativos en la síntesis de urea, esperados para reflejar la mayor desaminación, se observaron casi cada día en cultivo examinado para ambas velocidades de flujo volumétricas y para ambos niveles de intervalo de amonio y básicos de urea. Ninguna velocidad de flujo volumétrico se prefirió para ambas ureagénesis de intervalo y básicas mayores. Los datos para los dispositivos se sembraron con 4x106 de hepatocitos de donadores 108 y 109, se operaron bajo condiciones similares pero con las velocidades de flujo volumétrico más altas hasta 12 mL/min, de igual forma no mostraron ningún efecto de velocidad de flujo en la ureagenesis. Estos resultados demuestran que los dispositivos 1 pueden operarse exitosamente con un rango de velocidades de flujo volumétrico sin efectos nocivos de la función de hepatocito. El aparato del Ejemplo 2 también se utilizó para comparar el efecto de perfusionar los cultivos de hepatocito en una velocidad de flujo volumétrico constante — pero con diferentes volúmenes de perfusato en el crecimiento celular y ureagenesis en dispositivos que comprenden ¡lfc^._^Mi_--..«--a-ia--l---^ Poifflex® revestido por colágeno, tratado por corona de descarga. ¡ Para estudios del crecimiento celular y ureagenesis, les dispositivos 1 se sembraron con 2x10° hepatocitos def donador 96, cargados en circuitos de perfusión con 10 mL de medio completo co o 5 perfusato, y alimentados de gas que contiene 19% de O2, 10% de CO2, y balance N2. La Tabla 5 presenta los datos para el crecimiento de células, medido como masa celular por la determinación de la proteína total asociada con los hepatocitos adherentes, para los dispositivos cubiertos y tapados. Los datos para la densidad celular se expresa como porcentaje 10 de masa celular observada para cultivos en recipientes de cultivo por tejido. El dispositivo cubierto estático y el dispositivo tapado ^ perfusionados en 0.1 mL/min mostraron aumentos en la masa celular en relación a los recipientes de cultivo por tejido en el día tres después de ta siembra. Todas las configuraciones muestran aumentos excesivos en la 15 masa celular por el día noveno después de la siembra. Estos resultados demuestran que la perfusión no se nociva para el crecimiento de cultivos. Tabla 5 Efecto de la Configuración del Dispositivo y la Perfusión en el Crecimiento de Hepatocitos en los Dispositivos de Cultivo Celular 20 Sistema Densidad Celular (% de TC de control) Configuración Volumen /elocidad de Día 3 Día 9 Perfusión (mL/min) Dispositivo 1 con 4 Estática 189 706 cubierta 100 Dispositivo 1 con 3 Estática 79 774 cubierta 110 Dispositivo 1 con 10 0.1 127 933 25 cubierta 1 10 Dispositivo 1 con 10 1.5 91 706 de urea para dispositivos n cos per us ona os en 1.5 mL/min con 10 (cuadros) o 20 mL (círculos) de perfusato. Los datos nuevamente se 5 expresan como porcentajes de controles estáticos, LOS aumentos relativos en la síntesis básica de urea, esperada para feíilejfór la desanimación mayor, se observaron para cada día en el cultivo examinado por los tres sistemas. Los aumentos relativos más grandes se observaron por los dispositivos perfusionados con 20 mL a con 10 mL. Estos resultados 10 demuestran que al controlar el volumen de perfusato puede ser un mediq eficaz para controtar la función de hepatocito, y en particular de la ureagenesis. El aparato del Ejemplo 2, se utilizó además para comparar el efector de perfusionar los cultivos de hepatocitos en 1.5 mL/min con 15 diferentes volúmenes de perfusato en dispositivos 1 que comprenden TYVEK® 1073 como la membrana/soporte de cultivo celular impermeable al líquido, permeable al gas 30. En estos estudios, los dispositivos se sembraron con 2x106 hepatocitos, cargados ya sea con 10 o 20 mL de ^? medio completo como perfusato, y de gas alimentado que contiene 40% de 20 G_, 10% de CO2, y balance N2. Los hepatocitos se evaluaron para la síntesis de urea (Ejemplo 6, Método 1) y la síntesis y secreción ds albúmina (Ejemplo 7) para las células del donador 75 para los días 1-13 después de la siembra. Los datos se presentan en las Figuras 16a y 16b. Para casi todos los puntos examinados, la síntesis de urea y 25 secreción de albúmina fue mayor con 20 mL de perfusato que con 10 mL <** de erf?sato. Estos resultados demuestran que los niveles mayores »lé ureagenesís y secreción de albúmina ipueden obtenerse utilizando la perfusión y al aumentar el volumen de perfusato, Este ejemplo muestra la utilidad de perfusión con la oxigenación de transmembrana directa para la función mejorada Ejemplo 13: Efecto de la Densidad de Siembra Celular en Hepatocitos en Dispositivos de Cultivo Celular Perfusionados La eficacia, práctica, y utilidad económica de un dispositivo de cultivo celular puede influenciarse por la densidad de células que pueden soportarse en el dispositivo: el soporte de densidades mayores de células frecuentemente se asocia con costos más bajos y el potencial para construir dispositivos y unidades más pequeñas. Además se desea típicamente que los aumentos en la densidad celular no den como resultado una pérdida significativa de función en una base por célula Para nombrar estos tejidos, el aparato del Ejemplo 2 también se utilizó para comparar el efecto de perfusionar los cultivos de hepatocito sembrados en diferentes densidades iniciales de células en la ureagénesis en dispositivos que comprenden Polyflex® revestido por colágeno, tratado por corona. Los dispositivos 1 se sembraron con hepatocitos 40 ya sea 4x106, 8x106, o 12x106 del donador 109, cargados en circuitos de perfusión con 10 mL de medio completo como perfusato 11 , gas alimentado 4 que contiene 19% de O2, 10% de CO2, y balance N2, y se perfusionó del Día 1 al Día 2 del cultivo a 1.5 mL/min. La ureagenesis se determinó en base al Método 2 del Ejemplo 6. La Tabla 6 muestra que la velocidad de síntesis de urea se aumentó linealmente con la densidad de siembra inicial: la velocidad de ureagenesis por célula sembrada, varió de Í8 a 106 a*f i i hasta aumentar el número de células sei?fjitedias por dispositivo de 4x10ß a 8x106 a 12x106. Estos resultados que la invención permitir la escala lineal de la función hepatocelular con el número de célula. Tabla 6 Ureagenesis para Hepatocitos en Dispositivos de Cultivo Celular Prefusionado como Función de Densidad de Siembra Celular Células sembradas por Ureagenesis dispositivo Total Por célula sembrada (µg/dis/día) (pg/cétuta sembrada/día 4x10e 390 98 8x106 845 106 12x106 1019 85 La posible utilidad de manipular la oxigenación en la función de alta densidad, los cultivos prefusionados también se examino utilizando el aparato del Ejemplo 2. Los dispositivos 1 que comprenden Polyflex® revestido por colágeno, tratado por descarga de corona, se sembraron ya sea con 4x106, 8x10ß, o 12x106 hepatocitos 40 de los donadores 105, 109, y 110, cargados en circuitos de perfusión con 10 mL de medio completo como perfusato 1 1 , gas alimentado 4 que contiene 10% de CO2 con entre 0 y 90% de O2 (y balance N2) y perfusionados del Día 1 al Día 2 de cultivo a 1.5 mL/min. La ureagenesis se determinó nuevamente en base al Método 2 del Ejemplo 6. La Figura 17 representa los datos para estos estudios señalados como porcentaje de 19% de controles O2. Para los cultivos de densidad inferior (por ejemplo, cuadros cerrados por 4x106 células sembradas inicialmente), la síntesis de urea en respuesta al intervalo con 20 mM de amonio exógeno fue mayor bajo condiciones de reducción de oxigenación comparada al 19% de O2. Además, para esta densidad : inferior la oxigenación en aumento redujo la ureagenesis. En contrasta, para los cultivos de densidad más alta (por ejemplo, diamantes cerrados para células 8x106 y triángulos cerrados para 12x106 células) la velocidad de ureagenesis fue mayor por un grado intermedio de oxigenación con 60% de O2. Estos resultados demuestran que la manipulación de oxigenación puede utilizarse como un medio más para controlar el funcionamiento y función de hepatocitos soportados en los nuevos dispositivos de cultivo celular y que el nivel óptimo de oxigenación puede depender de la densidad de células soportadas. Eiemplo 14: Escala de Funcionamiento con el Tamaño del Dispositivo de Cultivo Celular La eficacia, práctica, y utilidad económica de un dispositivo de cultivo celular además puede influirse por la habilidad para reducir el tamaño total del dispositivo sin la pérdida de la función de área por unidad. Por ejemplo, típicamente se desea tener 10 veces la función total en un dispositivo 1 sembrado con 10 veces como varias células pero también 10 veces el área proyectada de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, de tal forma que la densidad de las células no cambia. Esta necesidad se dicta por la inhabilidad para aumentar la densidad de las células sembradas sin unión sin pérdida de función en una base por célula. La presente invención permite al menos dos métodos para aumentar el tamaño de dispositivo sin perder la función en una base por área: aumentar el tamaño dffgaílmftMt única o unidades de acoplamiento múltiple juntas en paralelo, en serie, o ambas. El primer método incluye utilizar dispositivos con unidades que son más granes en tama o absoluto,, el segundo método incluye utilizar unidades modulares. La sujetabilidad del tamaño de dispositivo absoluto en escala con unidades únicas se examinó al comparar el funcionamiento del aparato del Ejemplo 2 con una versión más grande del dispositivo 1 que utiliza el circuito de perfusión del Ejemplo 2. Este dispositivo más grande se representa esquemáticamente en la Figura 18 y se midió con cinco veGes el área proyectada de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30 según el dispositivo del Ejemplo 1. Esta medición permitió al dispositivo aplicarse para tratar las ratas con pérdida del hígado; de aquí en adelante se señaló el dispositivo de "escala de rata" para distinguirla del dispositivo de "escala de lab" o "escala de laboratorio" representada en ta Figura 4. El dispositivo de la escala de rata comprende una serie de partes de aluminio, incluyendo los alojamientos de parte superior 60 y parte inferior 70, una estructura 35, una capa 110, además de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas 30, tres obturadores de silicona (Specialty Silicone Products, Inc. , Balston Spa, NY) 85, 80, y 90, y tornillos y ajustes ancilares 120, 180, 181 , y 210. Una instalación de membrana/estructura 400 se elaboró y se esterilizó por la irradiación gama según se describe a detalle en el Ejemplo 1. El dispositivo de escala de rata 1 también se instaló y se manejó (incluyendo la siembra de las células 40) según se describe a detalle en el Ejemplo 1 para el dispositivo de la escala de laboratorio con la siguiente «f ¿eiórt. el dispositivo de #$ ftfif 1 1 de rata se sembró con células s pen id s en $ j L dé mefio a diferencia e 4 mL de medio. Los números de células en fa suspensión se ajustaron é* tal forma que las densidades de siembra (por área de unidad) fueron similares para las dos escalas. il" Para este estudio, la ureagenesis en los dispositivos de escala de rata se compararon para cultivos de hepatofüy, obtenidos del donador 101 perfusionado con 20 mL de medio completo 11 en esfuerzos cortantes hidrodinámicos similares para el Día 1 al Día 2 después de la siembra. Ambos dispositivos fueron de gas alimentado 4 que contiene 19% de O2. 10% de CO2, y balance N2. La ureagenesis se determinó a base del Método 2 del Ejemplo 6. La tabla 7 muestra que al ajustar el número de células sembradas en cada dispositivo, se obtuvieron densidades similares de células. Además, la velocidad de síntesis de urea fue aproximadamente cinco veces más en el dispositivo de escala de rata (con aproximadamente 5 veces como varias células) comparadas al dispositivo de la escala de laboratorio, de tal forma que la velocidad de ureagenes s por área de unidad fue similar en los dos dispositivos. Tabla 7 Escala de Ureagenesis con Tamaño del Dispositivo de Cultivo Celular Escala de Área Células Sembradas Ureagenesis Dispositivo (cm2) Total Densidad (µg/día) (µg/cm2-día) (células/cm2) Lab 23 2.0x10° 8.7x10" 87 3.8 Rat 100 9.6x107 9.3x104 450 4.3 96 - 4 a _Hf* Estos resultados demuestran que l tawenüón permite- -Ja escala lineal el tamaño dé la membrana impermeable La sujetabilidad del tamaño de dispositivo de escala con u?na 5 pluralidad de unidades modulares se examinó al comparar el funcionamiento det aparato del Ejemplo 2 con un sistema modular igual a es aparato. La Figura 19 ilustra la configuración de tal sistema modular en donde dos dispositivos 1 se colocan en paralelo en un circuito de perfusión único. Las bombas 230 manejan ambos dispositivos a la misma velocidad de flujo volumétrico de un recipiente único 220, de tal forma que los dos dispositivos comparte el mismo volumen de perfusato 1 1 , Ambos dispositivos también se alimentan del mismo gas 21 de la mima fuente 4. con tal sistema el número de células utilizado para tratar un perfúmate puede aumentarse sin cambiar la densidad de células en el sistema o* el 15 tamaño de cualquier unidad individual. Para este estudio, los dispositivos 1 se sembraron con 8x10$ hepatocitos 40 del donador 110, cargados ya sea como dispositivos únicos o acoplados en dispositivos paralelos en circuitos de perfusión con 20 L de medio completo como el perfusato 1 1 , y alimentados de gas 4 que ^ 20 contiene 19% de O2, 10% de CO2, y balance N2. La perfusión se condujo de tal forma que cada dispositivo—ya sea como único o acoplado en paralelo — recibió 1.5 mL/min de medio completo con 20 mM de amonio exógeno del Día 1 al Día 2 en 1.5 mL/min. La ureagenesis se determinó en base al Método 2 del Ejemplo 6. La tabla 8 muestra que al doblar el 25 número de células sembradas en el sistema con un par de dispositivos se F"J? dobla la velocidad de ureagenesís para et sistema, de ta| forma quál u? ßgenesís por unidad es constante. Estos resultados demuestran que la función total del sistema se escala línealmente con el número de unidades modulares en el sistema, de tal forma que al aumentar el tamaño del sistema a través de la adición de dispositivos operados en paralelo se aumenta el funcionamiento total del sistema. Tabla 8 Escala de Ureagenesis con Modularidad del Dispositivo de Cultivo Celular Número Área Células Sembradas Ureagenesis de Total Total Densidad (µg/día) (µg/unidad/día) Unidades (cm2) (células/cm2) Única 23 8.0x106 3.5x105 9.5x102 9.5x102 Par en 46 1.6x107 3.5x105 2.1 x103 1.0X103 paralelo Otras Modalidades Se entiende que mientras la invención se ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma, la precedente descripción se pretende que ilustra y no limite el alcance de la invención» la cual se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDIO iOtliS 1. Un método para cultivar células, comprendiendo el método: proporcionar una membrana impermeable al líquido, permeable 5 at gas, que tiene una primer superficie y una segunda superficie; sembrar las células en la primer superficie de la membrana Impermeable al líquido, permeable al gas; contactar las células con un medio de cultivo que contiene nutriente; 10 proporcionar un fluido oxigenado en la segunda superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable at gas, a una presión F suficiente para proporcionar la oxigenación de transmembrana en las células sembradas en la primer superficie; y cultivar las células bajo condiciones que promueven la 15 viabilidad y función de las células. 2. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el oxígeno contenido en el fluido oxigenado se encuentra en o arriba de la presión parcial crítica de oxígeno. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado 20 porque las células son hepatocitos. 4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque el dispositivo se siembra con 2 a 20 billones de hepatocitos. 5. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque el dispositivo se siembra con hepatocitos de porcino, equino, ovino, 25 bovino, conejo, rata, canino, felino, o murino. 6. El caracterizado porque el dispositivo 7. Et método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células se conservan. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque las células se conservan mediante críoconservadén, almacenamiento hípotérmico, o liofilización. 9. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el material de membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se selecciona del grupo que consiste de poliestireno, poliolefína, polietileno, polipropileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, nylon tratado hidrofóbico, poliuretano, poliéster, estireno en capas-butadieno-estireno/acetato de vinil etilo/estireno-butadieno-estireno, y estireno en capas-butadieno-estireno/polietileno. 10. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la primer superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se trata por corona. 1 1 . El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la primer superficie de la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se reviste por colágeno. 12. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado es entre aproximadamente 0% a aproximadamente 90% de oxígeno. 13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado es erftre .* e 60% de oxígeno. 14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado es entre aproximadamente 40% a aproximadamente 60% de oxígeno. 5 15. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la concentración de oxígeno en el fluido oxigenado se controla para promover o subregular la función celular. 17. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el método comprende además filtrar el plasma sanguíneo. 10 18. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque las células se siembran a lo largo de le membrana entera de arriba de la membrana. 19. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque los hepatocitos se siembran directamente en la membrana 15 impermeable al liquido, permeable al gas y se reviste así con colágeno. 20. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se reviste con colágeno, y los hepatocitos se siembran directamente en la membrana revestida de colágeno. ^WF 20 21 . Un dispositivo de cultivo celular a través de flujo que comprende: un alojamiento con una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, una entrada líquida y una salida líquida, y paredes, primera y segunda, para forma una cámara; 25 una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, v - instalada entre las un compartimiento fluido oxigenado y liquido que comprende una entrada líquida y una salida líquida; y u membrana impermeabl 1 al líquido instalada entre U«a pared y la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, para separar el compartimiento íiitíído en un compartimiento celular y un compartimiento de perfusión líquida, en donde la entrada de fluiÉo oxigenado y la salida de fluido oxigenado se instalan de tal forma que el fluido oxigenado que entra en la entrada de fluido oxigenado fluye en la entrada de fluido oxigenado y a través del compartimiento de fluido oxigenado y safe del compartimiento de fluido oxigenado a través de ta salida de fluido oxigenado y el alojamiento a través de la salida de fluido oxigenado, y en donde la entrada líquida y salida líquida se instalan de tal forma que el líquido que entra en la entrada líquida fluye en la entrada líquida y a través del compartimiento de perfusión líquida y sales del compartimiento de perfusión-líquida a través de la salida líquida y ei alojamiento a través de la salida líquida. 22 El dispositivo según la reivindicación 21 , donde en uso, las células se siembran sobre la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, y el espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, es mayor al tamaño de la célula 23 El dispositivo según la reivindicación 21 , donde en uso, las células se siembran ya sea sobre la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, o la membrana permeable al líquido, y el espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, es aproximadamente igual al tamaño de una célula. ^ 5 24. El dispositivo según la reivindicación 21 , donde en uso, las células se siembran en la membrana impermeable al líquido, permeable * a as, y sobre la membrana permeable al líquido, y el espacio entre las membranas permeables al líquido e impermeables al líquido, permeables al gas, es aproximadamente igual al tamaño de dos células adyacentes. 10 25. El dispositivo según la reivindicación 21 , comprendiendo además una fibra vacía permeable al líquido instalada en el compartimiento líquido. 26. El dispositivo según la reivindicación 21 , caracterizado porque el alojamiento se coloca para permitir el apilamiento de un 15 dispositivo en la parte superior de otro dispositivo. 27. Un sistema auxiliar del hígado, que comprende: un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la reivindicación 21 ; un primer conducto para conducir el plasma de un paciente a 20 la entrada del alojamiento; un segundo conducto para conducir el plasma del dispositivo de cultivo celular al paciente; y una bomba para mover el plasma a través de los conductos y el dispositivo de cultivo celular 25 28. El sistema según la reivindicación 27, comprendiendo flemas un separador de plasma para remover las células sanguíneas de ia sangre total para proporcionar el plasma que pasa a través del dispositivo de cultivo celular. 29. El sistema según la reivindicación 27, comprendiendo 5 además un interceptor de burbujas, para remover las burbujas del plasma en el primer conducto antes de entrar al dispositivo de cultivo celular. 30. Un sistema auxiliar del hígado, que comprende un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la reivindicación 21 ; 10 un dispositivo de inmunoaislamiento; un primer conducto para conducir el plasma de un paciente a un dispositivo de inmunoaislamiento; un segundo conducto para conducir el plasma del dispositivo e inmunoaislamiento al paciente; 15 un tercer conducto para conducir el medio líquido del dispositivo de cultivo celular al dispositivo de inmunoaislamiento; y un cuarto conducto para conducir el medio líquido del dispositivo de inmunoaislamiento al paciente; y, una bomba para mover el plasma a través de los conductos y ^fKF 20 el dispositivo de cultivo celular. 31 . Un método para filtrar el plasma sanguíneo, comprendiendo el método: sembrar un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la reivindicación 21 con hepatocitos; 25 introducir el plasma sanguíneo en la entrada líquida del dispositivo; suministrar un fluido oxigenado en el entrada de fluido oxigenado del dispositivo, permitir que el fluido oxigenado fluya a través del compartimiento del fluido oxigenado y salga del dispositivo a través de la salida del fluido oxigenado; y permitir que el plasma sanguíneo fluya a través del dispositivo y salga a través de la salida líquida, filtrando de tal modo el plasma sanguíneo. 32. Un método para tratar un paciente en necesidad de un auxiliar del hígado, comprendiendo el método unir el sistema auxiliar del hígado de la reivindicación 27 al flujo sanguíneo de un paciente y tratar al paciente. 33. Un dispositivo de cultivo celular a través de flujo que comprende: un alojamiento con una entrada líquida y una salida líquida, una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, y paredes, primera y segunda, para formar una cámara; y una membrana impermeable al líquido, permeable al gas, instalada entre las paredes para separar la cámara en un compartimiento de fluido oxigenado que comprende una entrada de fluido oxigenado y una salida de fluido oxigenado, y un compartimiento líquido que comprende una entrada líquida y salida líquida, en donde la membrana impermeable al liquido, permeable al gas, se siembra con células, en donde la entrada líquida y la salida líquida se instalan de tal forma que el fluido entra en la entrada fluida fluye en la entrada líquida y a través lael compartimiento líquido y sale el compartimiento líquido a través de la salida líquida y el alojamiento a • 5 través de la salida líquida, y en donde la entrada de fluido oxigenado y la salida de fluido oxigenado se instalan de tal forma que el fluido oxigenado que entra en la entrada de fluido oxigenado fluye en la entrada de fluido oxigenado y a través del compartimiento de fluido oxigenado y sale del compartimiento fluido oxigenado a través de la salida de fluido oxigenado y 10 el alojamiento a través de la salida de fluido oxigenado. 34. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado w porque la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, es porosa y no porosa. 35. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado 15 porque la membrana impermeable al líquido, permeable at gas, comprende poliestireno, una poliolefina, polietileno, polipropileno, fluoruro de polivinilídeno, poliuretano, poli(estireno-butadieno-estireno), poli(et¡! vinllacetato), nylon, caucho de silicio, poli(tetrafluoroetileno), o F compuestos, mezclas, o copolímeros de los mismos. 20 36. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado porque la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se trata por superficie. 37. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado porque la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se trata por 25 superficie con una descarga de corona. 38. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado porque la membrana impermeable al líquido, permeable al gas, se trata por superficie con un revestimiento de aglomerante extracelular. 39. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado ^ß^ 5 porque un gel se coloca en las células. 40. El dispositivo según la reivindicación 33, caracterizado pfrque un gel se coloca en la membrana impermeable al líquido, permeable al gas. 41 . El dispositivo según la reivindicación 39, caracterizado 10 porque el gel contiene células suspendidas dentro de dicho gel. 42. El dispositivo según la reivindicación 40, caracterizado porque el gel contiene células suspendidas dentro de dicho gel. 43. Un sistema auxiliar del hígado, que comprende: un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la 15 reivindicación 33; un primer conducto para conducir el plasma de un paciente a la entrada det alojamiento; un segundo conducto para conducir el plasma del dispositivo A de cultivo celular al paciente; y 20 una bomba para mover el plasma a través de los conductos y dispositivo de cultivo celular. 44. Un método para filtrar ei plasma sanguíneo, comprendiendo el método sembrar un dispositivo de cultivo celular a través de flujo de la 25 reivindicación 33 con hepatocitos; * ¡ I introducir el l^Élpa, sanguíneo en la entrada líquida del *oÉlivo; suministrar un fluido oxigenado en la entrada de fMdo oxigenado del dispositivo, 5 permitir que el tfuido oxigenado fluya a través del compartimiento de fluido oxigenado y salga del dispositivo a través de la salida de fluido oxigenado; y permitir que el plasma sanguíneo fluya a través del dispositivo y salga a través de la salida líquida, filtrando de tal modo el plasma 10 sanguíneo. f?