DE60036385T2

DE60036385T2 - Zellkultursysteme und verfahren für einrichtungen zur organunterstützung

Info

Publication number: DE60036385T2
Application number: DE60036385T
Authority: DE
Inventors: Maury D. Cosman; Paul A. Dimilla; Mehmet Toner; Yarmush; Ulysses J. Balis; Arno W. Tilles
Original assignee: General Hospital Corp; Organogenesis Inc
Current assignee: General Hospital Corp; Organogenesis Inc
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: JP4605734B2; EP1203075A1; IL147207A0; WO2000078932A1; EP1203075A4; CA2375505A1; US6759245B1; AU5756700A; US20030017142A1; MXPA01013423A; JP2003503022A; ATE373079T1; EP1203075B1; DE60036385D1

Description

Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität aus der US-Provisionalanmeldung Nr. 60/140125, eingereicht am 21. Juni 1999, der US-Provisionalanmeldung Nr. 60/140239, eingereicht am 21. Juni 1999, und der US-Provisionalanmeldung Nr. 60/181634, eingereicht am 10. Februar 2000. Der Inhalt dieser Anmeldungen ist hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Systeme und Verfahren zum Kultivieren von Zellen in Organ-Stützvorrichtungen.
Hintergrund der Erfindung
Über 43.000 Amerikaner sterben jedes Jahr an einer Leberkrankheit, was diese zur zehnten krankheitsbedingten Todesursache in den USA macht. Wenn eine Leberkrankheit bis zu einem Leberversagen bzw. Lebersturz fortschreitet, beträgt die Mortalität 80 Prozent, sofern kein kompatibles Spenderorgan gefunden wird. Wie bei anderen Organen gibt es einen kritischen Mangel an Spenderlebern. Über 12.000 Patienten sind derzeit als Transplantationskandidaten aufgelistet, aber weniger als die Hälfte dieser Anzahl von Spenderlebern wird jedes Jahr verfügbar. Eine Behandlung mit einer Leber-Stützvorrichtung (LAD = Liver Assist Device) würde die Mortalität in Zusammenhang mit einem Leberversagen durch Stabilisieren der Patienten verringern, so dass sie geeignete Kandidaten für eine Transplantation wären, in dem sie gestützt werden, bis eine geeignete Spenderleber verfügbar wird, und/oder indem eine Verschlechterung bis zu dem Punkt vermieden wird, bei dem eine Lebertransplantation erforderlich ist. Eine Verbesserung der präoperativen Gesundheit dieser Patienten würde auch den Erfolg einer Transplantation erhöhen, wodurch die Häufigkeit einer Re-Transplantation abnehmen würde und die Nachfrage nach Spenderorganen abnehmen würde.
In Fällen eines plötzlichen Ausfalls der Leber oder eines Lebersturzes, der oft infolge einer Virusinfektion oder von Toxizität auftritt, würde eine Behandlung mit einer LAD die Notwendigkeit einer Transplantation eliminieren, indem diese Personen so lange unterstützt werden, bis sich ihre eigenen Lebern regenerieren. Eine Lebertransplantation ist derzeit die teuerste Organtransplantationsprozedur. Die erfolgreiche Entwicklung einer LAD würde konsequenterweise den USA gewaltige Vorteile hinsichtlich einer verringerten Sterberate und geringerer Gesundheitskosten bieten.
Außerkörperliche Vorrichtungen für eine vorübergehende Leberstützung sind seit den sechziger Jahren entwickelt worden. Zwei Strategien sind bei der Entwicklung von Leberstützvorrichtungen erforscht worden: (1) nicht-biologische Vorrichtungen, die auf Hämoperfusion auf Absorptionsmitteln beruhen, eine Hämodialyse über selektiv durchlässige Membranen sowie ein Plasmaaustausch (Malchesky "Non-Biological Liver Support: Historic Overview" Artif. Organs, 18:342–347, 1994); und (2) biologische Vorrichtungen bzw. Geräte, die Zellen oder Zellkomponenten umfassen (Yarmush et al. "Assessment of Artificial Liver Support Technology", Cell Trans., 1:323–341, 1992).
Nicht-biologische Vorrichtungen haben nur eine begrenzte Wirksamkeit gezeigt, was bestätigt, dass synthetische Materialien nicht die Tragweite und das Niveau komplexer metabolischer Funktionen ersetzen können, welche normalerweise von der Leber ausgeführt werden. Andererseits wurde eine biologische LAD, bei der Hepatozyten an der Außenfläche von Hohlfasern kultiviert werden und Blut oder Plasma durch das Lumen dieser Faser zirkuliert, vor fast 25 Jahren durch Wolf und Kollegen (Wolf et al., "Bilirubin Conjugation by an Artificial Liver Composed of Cultured Cells and Synthetic Capillaries", Tran. Amer. Soc. Artif. Int. Organs, 21:16–23, 1975).
Aktuelle biologische LAD-Gestaltungen verwenden heutzutage das umgekehrte Konzept. Moderne Gestaltungen basieren oft auf der Bereitstellung einer kritischen Leberfunktion durch Unterstützen von hochdichten Hepatozyt-Suspensionen in Hohlfasern mit einer Blut- oder Plasma-Zirkulation außerhalb der Fasern. Bei dieser Gestaltung muss eine intermittierende außerkörperliche Leberfunktion bereitgestellt werden, bis der Patient durch Leberregeneration gesund wird oder bis eine Transplantation möglich wird. Die Hohlfasergestaltung ist jedoch durch mehrere Faktoren begrenzt, wie z. B.: a) ungeeigneter Massetransport, insbesondere von Sauerstoff, b) ein mangelndes Verständnis einer hepatozyten Funktion in einer in-vitro-Umgebung, (c) zufällige Gewebearchitektur zur Stützung der Lebensfähigkeit und Funktion einer Zelle, und (d) Zwänge von Leervolumen in dem Perfusionskreislauf für die Vorrichtung.
Hohlfasern wurden für LADs auf der Basis der leichten Verfügbarkeit und nicht weil sie Fähigkeiten zeigten, eine Hepatozytenfunktion zu stützen, gewählt. Eine Perfusion von hochdichten Hepatozytenkulturen in Hohlfasern hat einen nicht sehr überzeugenden Vorteil erbracht, und zwar unter anderen Gründen infolge von Transporteinschränkungen, welche ihre Stützung hochdichter Kulturen unterminieren. Solche Einschränkungen sind speziell für Sauerstoff akut, der sowohl für grundlegende metabolische Funktionen als auch für die anfänglichen Schritte bei der Entgiftung erforderlich ist. Eine Perfusion von mit Sauerstoff angereichertem Plasma oder Medium durch oder um ein Netz von Hohlfasern kann dieses Problem nicht lösen, da diese wässrigen Flüssigkeiten mangelhafte Träger für Sauerstoff sind und die Entfernungen in Verbindung mit dem Transport relativ groß sind. Modifikationen an der Hohlfaserkerngestaltung (beispielsweise die Verwendung eines gewebten Netzes von drei unabhängigen Sätzen von Kapillarien, welche für eine integrale Sauerstoffversorgung sorgen, komplizieren die Herstellung erheblich und lösen die zugrundeliegenden Transport einschränkungen nur unvollständig. Sie weisen auch nicht die Fähigkeit auf, Hepatozyten in einer organotypischeren laminaren Konfiguration zu orientieren.
Abriss der Erfindung
Nach einem Aspekt bezieht sich vorliegende Erfindung auf ein in Anspruch 1 dargelegtes Verfahren. Weitere Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 18 definiert.
Nach einem weiteren Aspekt bezeiht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung, wie sie im Anspruch 19 dargelegt ist. Weitere Ausführungsformen der Vorrichtung sind in den Ansprüchen 20 bis 28 definiert. Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung, wie sie in Anspruch 29 dargelegt ist. Weitere Ausführungsform der Vorrichtung sind in den Ansprüchen 30 bis 35 definiert.
Die neuen Durchfluss-Zellkultivierungsvorrichtungen können somit zur Kultivierung von Hepatozyten mit hohen Niveaus an Zellfunktion in einem Organ verwendet werden, z. B. in Leber-Stützsystemen zur Herstellung von Hepatozyten für die Produktion von von Hepatozyten abgeleiteten Produkten wie Proteinen oder Viren, oder für Systeme zur Behandlung biologischer Flüssigkeiten zur Beseitigung von Giftstoffen wie Ammoniak, zum Hinzufügen von synthetisierten Produkten auf Hepatozyten-Basis oder für beides.
Im allgemeinen stellt die Erfindung Verfahren und Vorrichtungen für die Kultivierung von Hepatozyten bereit, die für eine direkte Sauerstoffversorgung von Hepatozyten durch planare, gasdurchlässige Membranen sorgen. Wenn die Vorrichtung mit den geeigneten Hepatozyten geimpft und in ein Gerät aufgenommen wird, kann das Gerät zur Behandlung eines Patienten benutzt werden, bei dem ein Organ wie die Leber einer Funktionsunterstützung bedarf.
Die Vorrichtung kann mit Hepatozyten geimpft sein wie z. B. Schweine-, Pferde-, Schaf-, Rinder-, Hasen-, Ratten-, Hunde-, Katzen- oder Mäuse-Hepatozyten. Zusätzlich kann die Vorrichtung mit menschlichen Hepatozyten geimpft sein. Die Vorrichtung kann mit zwei bis zwanzig Billionen Hepatozyten geimpft sein. Hepatozyten können über die gesamte Membran von der Oberseite der Membran aus geimpft werden.
Nach einer Ausführungsform befindet sich der in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid enthaltene Sauerstoff auf oder über dem kritischen Teildruck von Sauerstoff.
Nach einer Ausführungsform sind die Hepatozyten präserviert. Die Hepatozyten können durch Cryopräservation, hypothermische Lagerung oder Liophilisation präserviert werden.
Das gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membranmaterial kann beispielsweise aus Polystyrol, Polyolefin, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polycarbonat, hydrophob behandeltem Nylon, Polyurethan, Polyester, geschichtetem Styrol-Butadien-Styrol/Ethylvinylacetat/Styrol-Butadien-Styrol oder geschichtetem Styrol-Butadien-Styrol/Polyethylen hergestellt sein.
Die erste Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran kann behandelt sein, z. B. mittels Corona-Behandlung.
Nach einer Ausführungsform liegt die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zwischen etwa 0% bis etwa 90% Sauerstoff. Außerdem kann die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zwischen etwa 19% bis etwa 60% oder 40% bis etwa 60% Sauerstoff betragen. Die Sauerstoffkonzentration in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid kann so gesteuert werden, dass sie Zellfunktionen fördert oder herunterreguliert.
Nach einer Ausführungsform wird das Nährstoffe enthaltende Kulturmedium durch Perfusion zugeführt. Zusätzlich kann das Verfahren ferner das Filtern von Blutplasma umfassen.
Nach einer Ausführungsform, bei der im Einsatz Hepatozyten direkt auf die Oberfläche der gasdurchlässigen flüssigkeitsundurchlässigen Membran aufgebracht werden, ist der Raum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurch lässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen größer als die Größe einer Zelle. Außerdem können im Einsatz Hepatozyten entweder auf die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran oder die flüssigkeitsdurchlässige Membran aufgebracht werden und der Raum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen hat etwa die Größe einer Zelle. Außerdem können im Einsatz Hepatozyten direkt auf die Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran oder auf die flüssigkeitsdurchlässige Membran aufgebracht werden, und der Raum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen ist etwa gleich der Größe zweier benachbarter Zellen.
Die Vorrichtung kann ferner eine flüssigkeitsdurchlässige Hohlfaser aufweisen, die in dem Flüssigkeitsfach angeordnet ist. Außerdem kann das Gehäuse so angeordnet sein, dass ein Stapeln einer Vorrichtung auf die andere Vorrichtung ermöglicht.
Die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran kann porös oder nichtporös sein. Die gasdurchlässige flüssigkeitsundurchlässige Membran umfasst Polystyrol, Polyolefin, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polyurethan, Polystyrol-Butadien-Styrol), Poly(ethylvinylacetat), Nylon, Silikongummi, Poly(tetrafluorethylen) oder Zusammensetzungen, Gemische oder Copolymere hiervon. Die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran kann oberflächenbehandelt sein, z. B. mittels einer Corona-Entladung oder einer Beschichtung einer extrazellulären Matrix.
Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstanden wird, zu dem diese Erfindung gehört.
Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu den hier beschriebenen sind, in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben.
Die neuen Durchfluss-Zellkultivierungsvorrichtungen bieten zahlreiche Vorteile. Die neuen Vorrichtungen ermöglichen eine Kultivierung von Hepatozyten mit erwünschten Pegeln eines Massentransports von Sauerstoffs und anderer Nährstoffe, von Abfallprodukten und nutzbaren Produkten, während sie potentiell eine schädigende Scherbelastung verringern, die normalerweise mit höheren Medienströmungsraten verbunden ist. Infolgedessen können sogar relativ scherempfindliche Hepatozyten über längere Zeiträume mit relativ niedrigen Medienströmungsraten und hohen Funktionsniveaus kultiviert werden. Infolgedessen kann eine Sauerstoffversorgung und eine Perfusion unabhängig gesteuert werden. Ferner ermöglichen diese Vorrichtungen eine direkte Oberflächenbehandlung für die Förderung eines Anhaftens und einer Funktion von Hepatozyten sowie einer gleichmäßigeren Verteilung der Hepatozyten innerhalb der Vorrichtungen in Form von laminaren Kulturen, welche die in-vitro-Architektur der Leber simuliert. Diese Merkmale ermöglichen den Einsatz der neuen Durchfluss-Zellkultiviervorrichtungen in einem Organ, z. B. in Leber-Stützsystemen.
Klinische Untersuchungen haben ergeben, dass eine angemessene Leberfunktion in vivo mit nicht mehr als 10% der normalen Zellmasse aufrechterhalten werden kann, was besagt, dass eine wirksame LAD mindestens 10¹⁰ Hepatozyten mit annähernden in-vivo-Funktionspegeln stützen würde.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen hervor.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1 ein Schemadiagramm eines außerkörperlichen Leber-Stützsystems,
2 ein schematisches Diagramm einer Ausführungsform einer "Zwei-Fach"-Zellkultiviervorrichtung der Erfindung mit einer die beiden Fächer trennenden, gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran,
3 eine graphische Darstellung, die zeigt, wie der Teildruck von Sauerstoff in der Vorrichtung notwendiges Gas einspeist, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung unter einer Transmembran-Sauerstoffanreicherung zu erreichen, um die Sauerstoff-Verbrauchsrate von Hepatozyten für einen Bereich von Zelldichten (P_cells) und für verschiedene Membranpermeabilitäten gegenüber Sauerstoff und/oder zelluläre Sauerstoffverbrauchsraten auszugleichen,
4a ein Schemadiagramm einer Ausführungsform einer Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung mit zwei Fächern, die eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran aufweisen, welche die beiden Fächer trennt,
5a bis 5d Schemadiagramme von Ausführungsformen von Zellkultivierungsvorrichtungen der Erfindung mit drei Fächern, welche separate gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige und flüssigkeitsdurchlässige Membranen aufweisen,
6a bis 6c Schemadiagramme von Ausführungsformen von einer mehrfächerigen Zellkultivierungsvorrichtung mit mindestens gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen,
7a und 7b Schemadiagramme von Ausführungsformen der Zellkultivierungsvorrichtung mit mehreren gestapelten bzw. geschichteten Fächern,
8a und 8b Schemadiagramme von Ausführungsformen einer Rohrverteilung für eine Zellkultivierungsvorrichtung mit mehreren gestapelten, zweifächerigen Zellkultivierungskammern,
9 und 9b Schemadiagramme von Seitenansichten der Zellkultivierungsvorrichtungen,
10a und 10b schematische Diagramme der Komponenten eines Perfusionskreislaufs für Zellkultiviervorrichtungen,
11 eine graphische Darstellung zum Vergleich der Synthese von Harnstoff durch Hepatozyten, die statisch in Vorrichtungen mit mit Collagen beschichteten, einer Coronabehandlung unterzogenen, 0,002''-dicken, gasdurchlässigen Polystyrol- und Gewebe-Kulturschalen,
12a, 12b, 12c und 12d graphische Darstellungen der Wirkungen einer Sauerstoffversorgung bei (12a) Anbringung von Zellen einen Tag nach der Impfung, (12b) basaler und erzwungener Synthese von Harnstoff, (12c) Entgiftungsaktivität für Alkoxyresorufine, und (12d) Metabolismus von Lidocain durch Hepatozyten, die statisch in Vorrichtungen mit einer 0,2''-dicken, coronabehandelten, collagenbeschichteten gasdurchlässigen Polystyrol-Membran kultiviert sind,
13 eine graphische Darstellung der Wirkungen einer Transmembran-Sauerstoffanreicherung bei Entgiftungsaktivitäten für Alkoxyresorufin durch Hepatozyten, die statisch in Vorrichtungen kultiviert sind, welche TYVEK^®1073 umfassen,
14 eine graphische Darstellung der Wirkung von Änderungen der volumetrischen Strömungsrate eines Mediums bei der Synthese von Harnstoff durch Hepatozyten, die in durchströmten Vorrichtungen mit 0,002'' dickem, coronabehandeltem, mit Collagen beschichtetem Polystyrol kultiviert wurden,
15 eine graphische Darstellung der Wirkung von Änderungen im Volumen eines Mediums bei der Synthese von Harnstoff durch Hepatozyten, die in durchströmten Vorrichtungen mit 0,002''-dickem, coronabehandeltem, mit Collagen beschichtetem Polystyrol kultiviert wurden,
16a und 16b graphische Darstellungen der Wirkungen von Änderungen in dem Volumen eines Mediums bei a) einer Synthese von Harnstoff, und b) bei der Sekretion von Albumin für Hepatozyten, die in durchströmten Vorrichtungen mit TYVEK^®1073 kultiviert wurden,
17 eine graphische Darstellung der Wirkungen einer Transmembran-Sauerstoff-Anreicherung und einer Zellimpfdichte bei der Harnstoffgenese für Hepatozyten, die in durchströmten Vorrichtungen mit 0,002'' dickem, coronabehandeltem, mit Collagen beschichtetem Polystyrol kultiviert wurden,
18 ein Schemadiagramm einer Seitenansicht einer Zellkultiviervorrichtung, die so bemessen ist, das für die Behandlung einer Ratte geeignet ist, und
19 ein Schemadiagramm eines Paars Zellkultiviervorrichtungen, die in einer parallelen Konfiguration in einem einzigen Perfusionskreislauf angeordnet sind.
Detaillierte Beschreibung
Die neuen Zellkultiviervorrichtungen ermöglichen die Kultivierung von relativ großen Mengen und hohen Dichten von Hepatozyten in den Vorrichtungen, während sie ein Gesamtleervolumen von Flüssigkeit minimieren, eine genaue Steuerung, Skalierbarkeit und Modularität ermöglichen und den Mediumstrom (zum Zuführen von Nährstoffen und löslichen Toxinen und/oder Induzierern sowie zur Beseitigung von Abfallstoffen und metabolischen Nebenprodukten) von einer Sauerstoffanreicherung trennen. Die neuen Vorrichtungen sind an sich skalierbar und modular. Die neuen Vorrichtungen ermöglichen eine Trennung der Sauerstoffanreicherung von den Strom biologischer Flüssigkeiten durch die Verwendung einer gasdurchlässigen, aber flüssigkeitsundurchlässigen Membran, an der die Hepatozyten direkt gezüchtet oder kultiviert werden.
1 zeigt ein Schemadiagramm eines außerkörperlichen Leber-Stützsystems, in dem die neuen Zellkultiviervorrichtungen eingesetzt werden können. Das System umfasst einen Bioreaktor 1 mit mehreren Kartuschen 2. Der Bioreaktor umfasst einen Einlass 3 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zum Einleiten eines mit Sauerstoff angereicherten Fluids von einer Zufuhrquelle 4 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Auslass 3' von mit Sauerstoff angereichertem Fluid, einen Flüssigkeitseinlass 5 zum Einleiten einer biologischen Flüssigkeit, die von einer Pumpe 6 von einer Immunoisolationseinheit 7 geliefert wird, in den Bioreaktor, und einen Flüssigkeitsauslass 5' zum Beseitigen der biologischen Flüssigkeit aus dem Bioreaktor für eine Rückführung zu der Immunoisolationseinheit 7. Blut von einem Patienten 9 fließt über eine Pumpe 6' in eine Plasmapherese-Einheit 8, von der ein Teil des Plasmas dann in die Immunoisolationseinheit 7 über eine Pumpe 6'' fließt. Behandeltes Plasma fließt aus der Immunoisolationseinheit 7 heraus und wird mit Blut aus der Plasmapherese-Einheit 8 gemischt, bevor es in den Patienten 9 zurückfließt.
Die neuen Zellkultiviervorrichtungen enthalten ein oder mehrere Kartuschen (oder Einheiten) mit zwei Fächern. 2 zeigt eine Ausführungsform einer zweifächerigen Kartusche, die eine Kammer 1 mit undurchlässigen Wänden 50 sowie eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30, welche die Kammer in zwei Bereiche oder Fächer unterteilt, ein erstes Fach 10 und ein zweites Fach 20. Das erste Fach 10 ist durch eine der undurchlässigen Wände 50, die Seitenwände der Kammer und die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 festgelegt. Das erste Fach 10 ist ein "Flüssigkeitsfach", das eine biologische Flüssigkeit 11, beispielsweise ein Zellkultivierungsmedium, eine ausgeglichene Salzlösung, Blut oder Plasma sowie Hepatozyten 40 enthält. Die Hepatozyten 40 werden im wesentlichen auf der Membran 30 und in Kontakt mit der biologischen Flüssigkeit 11 kultiviert.
Wände sind typischerweise aus zellkompatiblem Kunststoff wie Polystyrol und Copolymer, die dick sind, zusammengesetzt, um sie gegenüber Flüssigkeiten und Gasen, Metallen und Zusammensetzungen hiervon, wie z. B. Aluminium, rostfreiem Stahl und anderen Legierungen undurchlässig zu machen. Diese Materialien können für andere Vorrichtungskomponenten wie Fittings und Verteilerrohre verwendet werden.
Das zweite Fach 20 ist ein Fach für "mit Sauerstoff angereichertes Fluid" und ist durch die zweite der undurchlässigen Wände 50, die Seitenwände der Kammer sowie die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 festgelegt. Ein mit Sauerstoff angereichertes Fluid 21, typischerweise ein Gas, möglicherweise aber auch eine Flüssigkeit, die in der Lage ist, Sauerstoff oder ein mit Sauerstoff angereichertes Gas zu transportieren, und den Transport von Sauerstoff durch die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 gestattet, strömt durch das Fach 20. Sauerstoff ist für die Hepatozyten in dem Flüssigkeitsfach von dem Fach für mit Sauerstoff angereichertes Fluid über die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 verfügbar. Mit Sauerstoff angereicherte Fluide können Gas oder Flüssigkeiten sein und können Luft, mit Sauerstoff angereicherte Luft, Sauerstoffgas, Gemische von Sauerstoff und anderen Gasen, wie Kohlendioxid, Stickstoff, Argon, Helium sowie andere, für gewöhnlich in der Natur vorkommende Gase, Flüssigkeiten wie Fluorkohlenstoffe, perfluorierte Flüssigkeiten und wässrige Lösungen sein, die natürliches oder synthetisches Hämoglobin oder Äquivalente enthalten.
In 2 ist die Kammer 1 so unterteilt dargestellt, dass das Flüssigkeitsfach 10 über der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 liegt, und das Fach 22 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid unter der Membran liegt, die Kammer kann aber auch in irgendeiner anderen Richtung ausgerichtet sein, solange die Membran die Kammer in zwei Fächer unterteilt. Vorzugsweise ist die Höhe jedes Fachs konstant (obwohl nicht notwendigerweise die gleiche für beide Fächer); die Höhe jedes Fachs kann aber auch ungleichmäßig sein, z. B. entlang der Länge und/oder Breite des Fachs variierend.
Die biologische Flüssigkeit 11 in dem ersten (Flüssigkeits-)Fach 10 beliefert die Hepatozyten 40 mit Grundnährstoffen für eine Zellkultur und führt Stoffwechselprodukte ab. Die biologische Flüssigkeit liefert den Hepatozyten auch Giftstoffe, aminierte Moleküle und andere, im Metabolismus umzusetzende biologische Abfallprodukte und führt entgiftete Produkte, Sekretfaktoren und Proteine ab. Für eine in-vitro-Kultur von Hepatozyten ist diese biologische Flüssigkeit vorzugsweise ein für eine Zellkultur entworfenes Medium. Die biologische Flüssigkeit wird vorzugsweise in das Fachinnere über eine Öffnung eingeleitet und aus diesem abgeführt. Es ist vorzuziehen, dass zumindest zwei Öffnungen (in 2 nicht gezeigt) vorhanden sind, wobei eine Öffnung als Einlassöffnung zur Zufuhr biologischer Flüssigkeit von einer biologischen Flüssigkeitsquelle und eine andere Öffnung als Auslass zum Austragen oder Abziehen der biologischen Flüssigkeit dient. Die Öffnungen stellen eine Verbindung zwischen dem Inneren und Äußeren des Flüssigkeitsfachs 10 durch einen Anschluss oder einen Verteiler her. Anschlüsse können mit anderen Flüssigkeitsfächern von anderen Bioreaktoreinheiten oder mit Kartuschen parallel, in Reihe oder auf beide Weise verbunden sein, um einen Strömungskreislauf oder eine Schleife für die Perfusion der biologischen Flüssigkeit zu schaffen. Das Hinzufügen anderer Anschlüsse kann zur Be-/Entlüftung für eine Luftverdrängung während des Befüllens oder als Mittel zum Entleeren des Fachs dienen, wenn die anderen Anschlüsse an denjenigen einer anderen Einheit angebracht sind.
Das mit Sauerstoff angereicherte Fluid in dem zweiten (Gas-) Fach 20 wird vorzugsweise dem Fachinneren über eine Öffnung zugeführt und aus diesem beseitigt. Noch bevorzugter sind mindestens zwei Öffnungen vorhanden (in 2 nicht gezeigt, wobei eine Öffnung als Einlassöffnung zur Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid von einer Quelle 4 von mit mit Sauerstoff angereichertem Fluid und eine andere Öffnung als Auslass zur Austragung oder zur Abfuhr des mit Sauerstoff angereicherten Fluids dient. Die Öffnungen kommunizieren zwischen dem Innenraum und dem Äußeren des Fachs 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid durch einen Anschluss oder ein Verteilerrohr. Wiederum können die Anschlüsse mit anderen Fächern von mit Sauerstoff angereichertem Fluid, anderen Bioreaktoreinheiten oder mit Kartuschen parallel, in Reihe oder auf beide Arten verbunden sein, um einen Strömungskreislauf oder eine Strömungsschleife für das mit Sauerstoff angereicherte Fluid zu schaffen. Andere Öffnungen zum Be-/Entlüften können an der Fachwand ebenfalls hinzugefügt werden.
Die Membran 30 ist gasdurchlässig und flüssigkeitsundurchlässig. Die Hepatozyten 40 werden im wesentlichen auf der Membran kultiviert und die Membran dient als Hepatozyten-Kultivierungssubtrat. Die Hepatozyten tauschen Gas, wie z. B. Sauerstoff, mit dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid über die Membran aus. Die Membran weist vorzugsweise eine planare, flache Lagenkonfiguration auf und erstreckt sich in einer Ebene, um das Flüssigkeitsfach 10 und das Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zu trennen. Die Membran ist gasdurchlässig, um den Transport von Sauerstoff und möglicherweise anderen Gasen von dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zu den Hepatozyten und von den Hepatozyten zu dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zu ermöglichen. Die Membran muss bei im Betrieb anzutreffenden Drücken gegenüber Flüssigkeit undurchlässig sein, aber gegenüber Gas im Bereich von etwa 0,1 mL/m²/Tag bis etwa 1000 L/m²/Tag durchlässig sein. Die Membran muss auch sterilisiert werden können, gegenüber einer Durchlöcherung, einem Zerreißen und einer Fältelung widerstandsfähig sein und bei der Herstellung der Vorrichtung handhabbar sein.
Membranmaterialien aus einer oder mehreren Schichten mit den folgenden Eigenschaften sind zur Anwendung in der Erfindung geeignet: relativ durchlässig gegenüber Sauerstoff und zumindest teilweise undurchlässig gegenüber Wasser bei Abwesenheit großer Druckunterschiede über der Membran 30, relative Nicht-Zytotoxizität gegenüber Hepatozyten auf mindestens einer Seite (so dass das Anhaften und die Funktion der Hepatozyten nicht durch das Material beschränkt ist oder dass das Material auf einer Seite so oberflächenbehandelt werden kann, dass die Anbringung und Funktion der Hepatozyten nicht durch diese oberflächenbehandelte Seite des Materials begrenzt ist), und relativ nicht-abbaubar bei Vorhandensein des mit Sauerstoff angereicherten Fluids 21 und/oder einer biologischen Flüssigkeit 11. Für doppelseitige Materialien muss die dem Flüssigkeitsfach 10 zugewandte Seite relativ nicht-zytotoxisch sein und in Präsenz der biologischen Flüssigkeit relativ nicht-abbaubar sein, und die dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zugewandte Seite muss bei Vorhandensein des mit Sauerstoff angereicherten Fluids relativ nicht-abbaubar sein. Membranmaterialien mit diesen Eigenschaften sind im Handel leicht erhältlich oder können mittels Standardtechniken zubereitet werden.
Spezifische Membranmaterialien, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen einzelne Schichten und mehrschichtige Zusammensetzungen von nicht-porösen oder mikroporösen Materialien wie nicht-poröses Polystyrol, wie z. B. Polystyrol einer Dicke von 0,002'', beispielsweise POLYFEX^® (von Plastics Suppliers), mikroporöses Polyolefin, mikroporöses hochdichtes Polyethylen (HTPE), beispielsweise TYVEK^®, insbesondere TYVEK^®1073 (Dupont), mikroporöses Polypropylen, mikroporöses Polyvinylidenfluorid, Polycarbonat mit eingeätzten Spuren (relativ kleinen Poren und nicht-benetzt), hydrophob behandeltes Nylon, Polyurethan, mikroporöses Polyester (mit hydrophoben Poren), andere anorganische Polymere wie z. B. mikroporöse anorganische Polymere oder nicht-poröse Silikongummis, co-extrudiertes Polystyrol und Polyethylen, ein dreischichtiger, co-extrudierter Film von Styrol-Butadien-Styrol/Ethylvinylacetat/Styrol-Butadien-Styrol (SBS/EVA/SBS), sowie ein zweischichtiger co-extrudierter Film von Styrol-Butadien-Styrol/Polyethylen (SBS/PE).
Eine Sauerstoffversorgung der Hepatozyten 40 durch die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 erfordert, dass entweder die Membran selbst selbsttragend ist (z. B. genügend mechanische Steifigkeit aufweist, um der Schwerkraft, dem Gewicht der Membran, dem Gewicht der biologischen Flüssigkeit, falls die biologische Flüssigkeit über die Membran geleitet wird, sowie etwaigen über der Membran einwirkenden Druckunterschieden widersteht), oder dass die Membran mit einem steiferen Trägermaterial kombiniert oder auf dieses laminiert wird. Dieses Trägermaterial muss entweder ausreichend durchlässig, porös oder räumlich verteilt sein, so dass es keine zusätzlichen signifikanten Begrenzungen gegenüber einem Gastransport aufweist, insbesondere für Sauerstoff, und dass es auch die erforderlichen mechanischen Eigenschaften hat. Beispielsweise kann die Verwendung von undurchlässigen, relativ weit beabstandeten Zapfen bzw. Säulen zur Halterung der Membranen diese Anforderungen erfüllen.
Bei der Kultivierung einiger Zelltypen erfolgt eine Sauerstoffversorgung durch das Zellkulturmedium. Hepatozyten haben jedoch Sauerstoffanforderungen, die charakteristisch hoch im Vergleich zu anderen Zelltypen sind. Die Funktion von arbeitsfähigen Hepatozyten kann auch von einer Sauerstoffspannung abhängen. Eine weitere Erwägung, welche diese Art von Problem bei einer Zellkultivierung oder einer Organstützvorrichtung intensiviert, ist die Notwendigkeit, relative hohe Anzahlen und hohe Dichten von Zellen in die Vorrichtung einzugliedern, während das Volumen der biologischen Flüssigkeit beschränkt wird.
Die Rate, mit der Sauerstoff von den Zellen verbraucht wird, muss durch den Transport von Sauerstoff zu den Zellen entweder durch einen Transport von Sauerstoff über die Membran oder durch die strömende biologische Flüssigkeit ausgeglichen werden. Die Kinetik des Sauerstoffverbrauchs durch die Zellen ist durch die Sauerstoffaufnahmerate (OUR = Oxygen Uptake Rate) gegeben, die typischerweise in den Begriffen einer Michaelis-Menten-Kinetik beschrieben wird und als verbrauchte Sauerstoffmole pro Zelle pro Zeiteinheit, multipliziert mit der Zellenzahl, ausgedrückt wird. Die Transportrate von Sauerstoff über die Membran ist durch das Produkt der volumetrischen Strömung von Sauerstoff pro Einheit eines Teildruckunterschieds gegeben (ausgedrückt als Volumen von Sauerstoff pro Einheitsfläche pro Zeiteinheit pro Einheit eines partiellen Druckunterschieds), den partiellen Druckunterschied über der Membran und die von der Membran vorstehende Fläche gegeben. Die Sauerstofftransportrate durch die biologische Flüssigkeit ist durch den Negativwert des Produkts, die Diffundierbarkeit von Sauerstoff in dem biologischen Fluid, den Gradienten in der Konzentration von Sauerstoff senkrecht zu der Membran an der Oberfläche der Membran, auf der die Hepatozyten kultiviert werden, und die vorstehende Fläche der Membran gegeben. Minimalpegel einer Sauerstoffanreicherung von Hepatozyten, die in der Zellkultivierungsvorrichtung gehalten werden, kann durch Ausgleichen des Transports von Sauerstoff in die Vorrichtung mit der Sauerstoffverbrauchsrate durch Hepatozyten innerhalb der Vorrichtung bestimmt werden. Für statisch betriebene Vorrichtungen, d. h. ohne Einleiten neuer biologischer Flüssigkeit in die Vorrichtung, ist der einzige Transportmechanismus für Sauerstoff transmembran. Die Rate eines transmembranen Transports ist gegeben durch das Produkt des Sauerstoffflusses über der Membran und der planaren Fläche der Membran, wobei der Fluss selbst ein Produkt der Permeabilität der Membran P_m und des Konzentrationsunterschieds von Sauerstoff über die Membran hinweg ist. Die Verbrauchsrate von Sauerstoff ist durch OUR gegeben.
Für Vorrichtungen, die statisch betrieben werden, lautet die gültige Gleichung, die den Transport und den Verbrauch abgleicht:
wobei pO_2,c der kritische Teildruck von Sauerstoff zur Sauerstoffversorgung ist, R die Gaskonstante ist, und T die Temperatur ist. Teildrücke von Sauerstoff, die größer als dieses pO_2,c sind, liefern eine ausreichende Sauerstoffversorgung; Teildrücke von Sauerstoff, die unter diesem pO_2,c liegen, liefern eine ungenügende Sauerstoffversorgung. Diese Gleichung kann dazu verwendet werden, solche Zellkultiviervorrichtungen ohne Strömung der biologischen Flüssigkeit 11 zu gestalten und zu betreiben.
Die für eine Sauerstoffversorgung gültige Gleichung ist in 3 für simulierte Daten für Vorrichtungen mit Polystyrol von 0,002'' Dicke, erhältlich als POLYFLEX^® von Plastics Suppliers (Columbus, OH) aufgezeichnet, wobei P_m in der Größenordnung von 10⁴ ml/m²/Tag-atm ist, und die bei physiologischen Temperaturen (310 K) und Zellverbrauchsraten von Sauerstoff von 1 × 10^–16, 5 × 10^–16 und 1 × 10^–15 mol/Zellen betrieben werden. Diese Werte des Sauerstoffverbrauchs basieren auf Daten für Primär-Schweine-Hepatozyten, die in Balis et. al., Metabolic Engineering, 1:1–14 (1999) dargestellt sind. Diese Kurven verschieben sich nach oben und links, wenn Membranen mit geringeren Permeablitäten gegenüber Sauerstoff verwendet werden, und nach unten und rechts, wenn Membranen mit höherer Permeabilität gegenüber Sauerstoff eingesetzt werden.
Wenn hingegen eine Sauerstoffversorgung bei Zellen auf einem gasundurchlässigen Träger durch die Schicht einer biologischen Flüssigkeit im Ruhezustand vorgenommen wird, in der einem Bad unterzogen werden, und einer gasdurchlässigen Membran in Kontakt mit dieser Schicht biologischer Flüssigkeit, ist die gültige Gleichung zum Ausgleich von Transport und Verbrauch von Sauerstoff:
wobei h die Dicke der Schicht der biologischen Flüssigkeit ist, S die Löslichkeit von Sauerstoff in der biologischen Flüssigkeit ist, und T die Diffundierbarkeit von Sauerstoff in der biologischen Flüssigkeit ist.
Da der Transportwiderstand gegenüber Sauerstoff für diese Konfiguration immer größer sein wird, ergibt dies unter der Annahme einer Membran mit einem identischen P_m diese zweite Konfiguration immer eine geringere Sauerstoffversorgung für eine gegebene Sauerstoffkonzentration.
Die gültigen Gleichungen hängen auch von der Perfusion des Mediums ab. Die grundlegenden Trends zwischen den beiden gültigen Gleichungen verändern sich jedoch nicht hinsichtlich der Richtung, der volumetrischen Strömungsrate oder irgendeiner anderen Perfusionseigenschaft.
Beispielsweise ist immer eine stärkere Steuerung der Sauerstoffanreicherung für Membranen mit identischen Permeabilitäten gegenüber Sauerstoff möglich, für eine direkte Transmembran-Sauerstoffversorgung von Zellen gegenüber einer sequentiellen Transmembran- und dann Transmedium-Sauerstoffversorgung von Zellen, ungeachtet der Perfusionsrate, und vorausgesetzt, dass die Direktionalität der Sauerstoffversorgung per se die Zellen nicht beeinflusst.
Verschiedene andere spezifische Ausführungsformen von Zweifächer-Zellkultivierungsvorrichtungen mit einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran werden im folgenden beschrieben. Diese Ausführungsformen sind schematisch in 4a dargestellt.
4a zeigt eine alternative Basiskonfiguration für eine zweifächerige Zellkultivierungsvorrichtung 1 mit einem Zellfach 10, das eine biologische Flüssigkeit 11 enthält, einem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, das ein mit Sauerstoff angereichertes Fluid 21 enthält, einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 mit einer Oberfläche 41, Hepatozyten 40 und starren, undurchlässigen Wänden 50. Das Flüssigkeitsfach 10 und das Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid sind durch die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 getrennt, die auf der Seite der Membran, welche dem Flüssigkeitsfach zugewandt ist, oberflächenbehandelt ist. Die Hepatozyten 40 werden auf der Oberfläche 41 kultiviert, während sie die biologische Flüssigkeit 11 in dem Flüssigkeitsfach kontaktieren, und können über die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 auf Sauerstoff aus einer Sauerstoffquelle zugreifen, welche dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid ein mit Sauerstoff angereichertes Fluid 21 liefern.
Die Oberfläche 41 kann von Vorteil oder bei einigen Hepatozyten, die nicht gut anhaften, notwendig sein, um eine Zellhaftung zu induzieren und eine gewünschte Zellfunktion zu fördern. Diese Oberfläche, die ein oder mehrere Beschichtungsmaterial(ien) aufweisen kann, wird bei mindestens einem Teil der Membran angewandt und kann sich ins Innere der Membran von der dem Flüssigkeitsfach 10 zugewandten Seite erstrecken. Beschichtungsmaterialien, die auf die Membran aufgebracht werden können, umfassen biologische Beschichtungen wie Collagen, und andere, extrazelluläre Matrixkomponenten, wie Fibronectin, Zubereitungen von extrahierten biologischen Matrizen und Proteoglykans, Fibrin, RGD enthaltende und ähnliche Peptide, biosynthetische Beschichtungen, die chemisch oder biologisch synthetisiert sind, und/oder einige andere Materialien, die eine Zellhaftung und/oder gewünschte Zellfunktionen induzieren, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Eine bevorzugte Beschichtung ist Collagen, bevorzugter Collagen vom Typ I. Diese Beschichtungen können entweder passiv an der Membran adsorbieren oder chemisch mit der Membran reagieren (wie z. B. durch kovalentes Pfropfen). Die Membran kann eine Behandlung mit einer oder mehreren Beschichtungen oder Beschichtungslagen benötigen, damit die Zellen anhaften und funktionieren. Diese Beschichtungslagen können in der Zusammensetzung und/oder Konzentration identisch oder ungleich sein.
Ein weiteres bevorzugtes Mittel zum Verbessern der Kompatibilität der Zelle mit der Membran besteht darin, sie mit einer Collagenbeschichtung zu versehen. Beschichtungen, die sich von voluminösen Gelen unterscheiden, sind im wesentlichen zweidimensional, da sie von molekularer Dicke sind und auf der Membranoberfläche trocken sind, während voluminöse Gele eine voluminöse dreidimensionale Dicke aufweisen und hydriert sind. Mehrfach-Oberflächenbehandlungen können der Reihe nach an der Membran vorgenommen werden, beispielsweise eine Behandlung mit Corona-Entladung, gefolgt von einer Beschichtung mit einer extrazellulären Matrix wie Collagen, vorzugsweise mit Collagen vom Typ I.
Ein weiteres Verfahren zur Behandlung der Membran 30 zu Verbesserung der Zellhaftung ist eine physikalische Oberflächenbehandlung, wie z. B. eine Corona-Entladung bei Vorhandensein eines Sauerstoff enthaltenden Gases (z. B. Luft). Die Corona-Entladung gliedert Sauerstoffatome in die freiliegende Oberfläche ein, so dass sie oxidiert wird, hydrophiler wird und manchmal geladen wird. Das Ausmaß dieser Behandlung ist derart, dass das Material nun eine oberflächenfreie Energie besitzt (gemessen in dynes/cm² hinsichtlich der Benetzbarkeit) und andere chemische Eigenschaften ähnlich denjenigen Eigenschaften, die typischerweise Gewebekulturschalen zugeordnet werden. Diese Behandlung wird für eine ausreichende Zeitperiode durchgeführt, um eine Modifikation der freiliegenden planaren Oberfläche bis zu diesem Ausmaß zu erreichen (oder mehr oder weniger, je nachdem, ob die Zellen günstiger auf eine Oberfläche mit einer unterschiedlichen freien Energie ansprechen oder nicht), aber ohne signifikante Beeinträchtigung der Eigenschaften des darunterliegenden Basismaterials selbst. Mehrfach-Oberflächenbehandlungen können der Reihe nach angewandt werden, beispielsweise eine Behandlung mit Corona-Entladung, gefolgt von einer Beschichtung mit einer extrazellulären Matrix wie Collagen, vorzugsweise Collagen vom Typ I.
Eine Behandlung durch Corona-Entladung modifiziert typischerweise nur die Oberflächenchemie eines Materials oder einer Membran, ohne ihre physikalische Topographie zu verändern. Eine Corona-Entladung umfasst das Aussetzen der Oberfläche gegenüber einer hochfrequenten elektrischen Entladung bei Präsenz von Luft oder einem anderen Sauerstoff enthaltenden Gas, so das Sauerstoffatome in die Oberfläche des Materials so eingegliedert werden, dass es nun oxidiert wird. Diese Behandlung erhöht die oberflächenfreie Energie und die hydrophile Eigenschaft von Kunststoff, Papier und metallisierten Schichten. Systeme zur Anwendung einer Corona-Entladung an Materialien sind im Handel von Firmen wie Corotec Corp., Farmington, CT erhältlich. Diese Systeme bestehen aus einem Hochspannungstransformator, und einem Netz von Elektroden, die so ausgelegt sind, dass sie bis zu Kilowatt-Energiepegel an die Oberfläche bei Frequenzen von nicht weniger als 40 kHz anlegen. Das Aussetzen von Sauerstoff gegenüber einer elektrischen Hochspannungsentladung erzeugt Ozon, welches chemisch mit der Oberfläche reagiert, um dieser Sauerstoff einzugliedern. Diese Behandlung kann bei Zimmertemperatur unter Umgebungsbedingungen durchgeführt werden, die typischerweise in chemischen und biologischen Labors herrschen. Betriebsbedingungen für die Corona-Entladung können mit dem Material, dessen Oberfläche modifiziert wird, und dem Ausmaß, bis zu dem die oberflächenfreie Energie zu erhöhen ist, variieren.
Da einige Zellen Haftungs- oder Funktionseigenschaften aufweisen, die durch einen direkten Kontakt mit einer strömenden biologischen Flüssigkeit nachteilig beeinflusst werden können und die gegenüber Scherbeanspruchung empfindlich sind, kann es bei einigen Anwendungen erwünscht sein, eine flüssigkeitsdurchlässige Membran zwischen die fließende biologische Flüssigkeit und die Zellen einzubringen, um hydrodynamische Interaktionen zu begrenzen. Bei dieser Anordnung befindet sich ein zusätzliches Fach, ein Zellfach, das die Zellen enthält, zwischen dem Flüssigkeitsfach und dem Fach für mit Sauerstoff angereichertes Fluid.
5a zeigt eine Ausführungsform einer dreifächerigen Zellkultivierungsvorrichtung 1 mit undurchlässigen Wänden 50, einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30, die ein erstes Fach 20 von einem zweiten Fach 15 trennt und mindestens einer flüssigkeitsdurchlässigen Membran, die das zweite Fach 15 von einem dritten Fach 16 trennt. Das erste Fach 20 ist das Fach für "mit Sauerstoff angereichertes Fluid", und ist durch eine der undurchlässigen Wände 50, die Seitenwände der Kammer und die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 festgelegt. Das zweite Fach 15 ist das "Zell"fach und ist durch die Seitenwände der Kammer, die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran und die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 festgelegt. Das dritte Fach 16 ist das "Flüssigkeitsperfusions"fach, und ist durch die restliche undurchlässige Wand 50, die Seitenwände der Kammer und die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 festgelegt.
5a stellt zwar die Kammer 1 dar, die so unterteilt ist, dass das Flüssigkeitsperfusionsfach 16 sich über der einen oder den mehreren flüssigkeitsdurchlässigen Membranen 31 befindet und das Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid unter der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 gelegen ist, die Kammer kann aber auch in einer beliebigen Richtung ausgerichtet sein, solange das Zellfach 15 zwischen die Flüssigkeitsperfusionsfächer und die Fächer für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zu liegen kommt und die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 sich zwischen den Fächern für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und Zellen befindet, und eine oder mehrere flüssigkeitsundurchlässige Membran(en) 31 sich zwischen dem Zellfach und dem Flüssigkeitsperfusionsfach befinden.
Das Flüssigkeitsperfusionsfach 16 enthält eine biologische Flüssigkeit 11b, wie z. B. eine Zellkulturmedium, eine ausgeglichene Lösung, Blut oder Plasma. Das Zellfach 15 enthält sowohl Hepatozyten 40, die im wesentlichen auf der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 kultiviert werden, als auch eine biologische Flüssigkeit 11a, die gleich der biologischen Flüssigkeit 11b in dem Flüssigkeitsperfusionsfach 16 oder unterschiedlich zu dieser sein kann. Die biologischen Flüssigkeiten 11a und 11b stehen in Flüssigkeitskontakt durch die dazwischenliegenden) eine oder mehrere flüssigkeitsdurchlässigen Membranen) 31. Die biologische Flüssigkeit 11a versorgt die Hepatozyten 40 mit Grundnährstoffen für die Zellkultur, mit Toxinen, aminierten Molekülen und anderen biologischen Abfallprodukten, die einem Stoffwechsel zu unterziehen sind, und transportiert Zell-Stoffwechselprodukte, entgiftete Produkte, Absonderungsfaktoren und Proteine weg. Diese Moleküle werden über die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 zu und von der biologischen Flüssigkeit 11a transportiert.
Die Hepatozyten 40 in dem Zellfach 15 stehen im wesentlichen nicht in Kontakt mit der flüssigkeitsdurchlässigen Membran 31. Der von dem Volumen der Zellen und der biologischen Flüssigkeit 11a in dem Zellfach gefüllte Zwischenraum ist vorzugsweise gleichmäßig in der Dicke, kann aber auch ungleichmäßig sein. Dieser Spalt bzw. Zwischenraum hat mindestens die Höhe der Schicht von Hepatozyten 40, die an der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 angebracht sind, so dass sich mindestens etwas biologische Flüssigkeit 11a zwischen den Hepatozyten 40 und der den Zellen zugewandten Seite der flüssigkeitsdurchlässigen Membran 31 befindet. Dieser Zwischenraum wird durch einen oder mehrere Abstandhalter aufrechterhalten.
Die biologische Flüssigkeit 11a im Zellfach 15 strömt sehr langsam oder ist statisch; ihre Strömung wird im wesentlichen nicht durch die Strömung der biologischen Flüssigkeit 11b in dem Flüssigkeitsperfusionsfach 16 beeinflusst. Die biologische Flüssigkeit 11a wird vorzugsweise anfänglich dem Zellfach 15 während des Auffüllvorgangs zugeführt und kann sich frei mit der biologischen Flüssigkeit 11b über die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 austauschen. Ein oder mehrere Anschluss/Anschlüsse kann/können als Be-/Entlüftungsöffnungen zur Luftaustragung während des Auffüllens dienen und/oder als Mittel zur Drainage des Zellfachs 15 während des Betriebs. Diese anderen Anschlüsse können auch zu Anschlüssen von Zellfächern anderer Bioreaktoreinheiten parallel, in Reihe oder auf beide Weisen zur Be-/Entlüftung und zur Drainage verzweigt sein.
Die biologische Flüssigkeit 11b wird vorzugsweise dem Inneren des Flüssigkeitsperfusionsfachs 16 über eine Öffnung zugeführt und aus diesem entfernt. Bevorzugt sind zumindest zwei Öffnungen (in 5a nicht gezeigt) vorhanden, wobei eine Öffnung als Einlassöffnung zur Zufuhr biologischer Flüssigkeit 11b von einer Quelle biologischer Flüssigkeit und die andere Öffnung als Auslass zum Austragen oder Abführen der biologischen Flüssigkeit 11b dient. Die Öffnungen kommunizieren zwischen dem Inneren und Äußeren des Flüssigkeitsperfusionsfachs 16 durch einen Anschluss oder ein Verteilerrohr. Anschlüsse können mit anderen Flüssigkeits perfusionsfächern anderer Bioreaktoreinheiten parallel, in Reihe oder auf beide Weisen verbunden sein, um einen Strömungskreislauf oder eine Strömungsschleife für die biologische Flüssigkeit 11b zu erzeugen. Das Hinzufügen weiterer Öffnungen bzw. Anschlüsse kann als Be-/Entlüftung für eine Luftbewegung während des Auffüllens oder als Mittel zur Drainage des Flüssigkeitsperfusionsfachs 16 dienen, wenn die anderen Anschlüsse an diejenigen einer anderen Einheit angeschlossen sind.
Als mit Sauerstoff versorgtes bzw. angereichertes Fluid 21 strömt typischerweise ein Gas, möglicherweise aber auch eine Flüssigkeit, die Sauerstoff mitführen kann, oder ein mit Sauerstoff angereichertes Gas, welches den Transport von Sauerstoff durch die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 gestattet, durch das Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid. Sauerstoff ist für die Hepatozyten 40 in dem Zellfach 15 über die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 verfügbar. Das mit Sauerstoff angereicherte Fluid in dem Fach für mit Sauerstoff angereichertes Fluid wird vorzugsweise dem Fachinnenraum über eine Öffnung zugeführt und aus diesem entfernt. Noch bevorzugter sind mindestens zwei Öffnungen vorhanden (in 5a nicht gezeigt), wobei eine Öffnung als Einlassöffnung zum Zuführen von mit Sauerstoff angereichertem Fluid von einer Quelle für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und eine andere Öffnung als Auslass zur Austragung oder Entlüftung von mit Sauerstoff angereichertem Fluid dient. Die Öffnungen kommunizieren zwischen dem Inneren und Äußeren des Fachs 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid durch einen Anschluss oder ein Verteilerrohr. Wiederum können Anschlüsse mit anderen Fächern für mit Sauerstoff angereichertes Fluid von anderen Bioreaktoreinheiten parallel, in Reihe oder auf beide Weisen verbunden sein, um einen Strömungskreislauf oder eine Strömungsschleife für das mit Sauerstoff angereicherte Fluid zu erzeugen. Es können auch weitere Öffnungen zur Be-/Entlüftung an der Fachwand hinzugefügt werden.
Verschiedene andere spezifische Ausführungsformen der dreifächerigen Zellkultivierungsvorrichtungen mit separaten gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen werden nun beschrieben. Diese Ausführungsformen sind schematisch in 5b bis 5f dargestellt. 5b zeigt eine Ausführungsform, bei der die Hepatozyten 40 in direktem Kontakt sowohl mit der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 als auch der flüssigkeitsdurchlässigen Membran 31 stehen. Bei dieser Ausführungsform ist das Zellfach 15 in der Größe auf ein Minimalvolumen reduziert, d. h. auf die Größe der Hepatozyten 40 in dem Zellfach, wenn die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 die auf der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 wachsenden Zellen kontaktiert.
Eine weitere alternative Ausführungsform ist in 5c gezeigt, in der eine Schicht von Hepatozyten 40 an der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 angebracht ist und eine zweite Schicht aus Zellen 49 an der flüssigkeitsdurchlässigen Membran 31 angebracht ist, um eine Zelldoppelschicht oder eine mehrschichtige Kultur zu bilden. Diese Ausführungsform umfasst mindestens zwei Zellschichten. Zusätzliche Schichten von Zellen können zwischen den Schichten der Zellen 40 und 41 eingebracht werden.
Für die in 5b bis c dargestellten Ausführungsformen kann ein Abstandhalter hinzugefügt werden, um die Höhe des Zellfachs 15 beizubehalten. Für die Ausführungsform der 5b kann dieser Abstandhalter wegfallen, falls die Zellen zunächst auf eine der beiden Membranen 30 und 31 aufgeimpft werden und dann die Membranen mit den zwischen den beiden Membranen eingeschlossenen Zellen zusammengebracht werden. Für die Ausführungsform von 5c kann dieser Abstandhalter wegfallen, falls jede Zellschicht 40 zuerst auf ihre benachbarte Membran aufgeimpft wird und dann mit mit Zellen geimpften Membranen zusammengebracht werden.
In einer weiteren Ausführungsform können Hohlfasern für das Flüssigkeitsperfusionsfach 16 verwendet werden. Eine Variation dieser Ausführungsform ist in 5d gezeigt, in der Zellen 40 an der planaren, gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 angebracht sind, und Hohlfasern 17, die sich in einer Ebene über den Zellen erstrecken und biologische Flüssigkeit 11d enthalten, sich in dem Zellfach 15 befinden. Biologische Flüssigkeit 11a in einem Zellfach 15 kann statisch sein oder kann strömen. Biologische Flüssigkeit 11d (die gleich der biologischen Flüssigkeit 11a oder unterschiedlich zu dieser sein kann) strömt vorzugsweise in den Hohlfasern 17. Die Hohlfasern 17 sind aus flüssigkeitsdurchlässigem Material ähnlich der hier beschriebenen, flüssigkeitsdurchlässigen Membran 31 gefertigt. Auf diese Weise können Nährstoffe in der biologischen Flüssigkeit 11d über die gesamte Vorrichtung mit einer Strömungsrate transportiert werden, die unabhängig von der Strömungsrate der biologischen Flüssigkeit 11a in dem Zellfach ist (die vorzugsweise niedrig ist, um eine Scherbelastung an den Zellen 40 zu verringern). Die Ausrichtung der Hohlfasern 17 kann parallel, nicht-parallel oder orthogonal zu der Strömungsrichtung in dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid sein.
Um die biologische Flüssigkeit 11d wirksam in dem Flüssigkeitsperfusionsfach 16 von der biologischen Flüssigkeit 11a in dem Zellfach 15 zu trennen, haben die flüssigkeitsdurchlässige Membran 31 oder die Hohlfasern 17 eine Porengröße, die groß genug ist, um den Transport von großmolekularen Nährstoffen, Toxinen, Faktoren, Metaboliten und abgesonderten Proteinen über die Membran zu gestatten, aber klein genug, um ein Zellwachstum durch die Membran zu verhindern. Geeignete Materialien für die flüssigkeitsdurchlässige Membran umfassen zellulöse Membranen, poröse Poly(sulfon) und Poly(ethersulfon)-Membranen, poröse unbehandelte Nylon- und andere Polyamid-Membranen, poröse Polyester, poröses Glas, durchlöcherten rostfreien Stahl, poröses (d. h., mit eingeätzten Spuren versehenes) Polycarbonat (benetzt mit PVP, Äthanol oder anderen Benetzungsmitteln), poröses Polyvinylchlorid, durchlöchertes Polydimethylsiloxan und poröse Keramikstoffe. Andere Membranmaterialien mit diesen Eigenschaften zur Verwendung bei der Erfindung können aus im Handel erhältlichen Materialien ausgewählt werden oder können mittels Standardtechniken zubereitet werden.
Die Strömung von mit Sauerstoff angereicherten Fluiden kann statisch, in irgendeiner Richtung oder in mehreren Richtungen sein. In Bezug auf die Strömung von mit Sauerstoff angereichertem Fluid kann die Strömung von biologischen Flüssigkeiten in irgendeiner Richtung, der gleichen lateralen Richtung, kontralateral oder senkrecht oder in irgendeiner Kombination hiervon stattfinden. Für einen maximalen Massetransfer sind vorzugsweise die Strömungsrichtungen kontralateral, z. B. in entgegengesetzten Richtungen, für die biologische Flüssigkeit und das mit Sauerstoff angereicherte Fluid. Für Bioreaktoreinheiten oder Kartuschen, die parallel, in Reihe oder auf beide Weisen verbunden sind, können die relativen Strömungsrichtungen in jeder Kartusche gleich oder unterschiedlich sein. Die Strömung biologischer Flüssigkeiten und/oder mit Sauerstoff angereicherter Fluide kann oszillierend oder zeitabhängig sein. Ferner sind die volumetrischen Strömungsraten der biologischen Flüssigkeiten und der mit Sauerstoff angereicherten Fluide unabhängig voneinander.
Die Bioreaktoreinheit der Erfindung umfasst mindestens ein Fach, das Hepatozyten gemäß der Erfindung enthält, und mindestens ein Fach, das mit Sauerstoff angereichertes Fluid enthält. Die Fächer weisen eine flache, planare Anordnung auf und haben eine gemeinsame, untereinander geteilte Ebene zwischen sich. Eine einzelne Einheit oder Kartusche kann ein Fach umfassen, welches Hepatozyten enthält, und ein Fach, das mit Sauerstoff angereichertes Fluid enthält, die einzeln oder zusammen in einer gestapelten bzw. geschichteten Konfiguration untergebracht sind, wobei die Einheiten durch ein starres undurchlässiges Element voneinander getrennt sind. Wegen der einheitlichen Natur der Zellkulturkartuschen oder -einheiten ist der Bioreaktor skalierbar hinsichtlich der Hinzufügung von Oberflächenbereich und Volumen zu den Fächern oder der Hinzufügung von Einheiten. Wenn zusätzliche Einheiten hinzukommen, wird bevorzugt, dass die Fächer über die Anschlüsse kommunizieren, um ein Strömen biologischer Flüssigkeit oder von Medium oder von mit Sauerstoff angereichertem Fluid zwischen ihnen zu ermöglichen.
6a stellt eine Ausführungsform der Zellkultiviervorrichtung dar, die eine Bioreaktoreinheit mit zwei planaren, gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen 30 bzw. 38 aufweist. Nur eine der Membranen 30 wird mit Hepatozyten 40 auf ihrer dem Flüssigkeitsfach 10 zugewandten und die biologische Flüssigkeit 11 kontaktierenden Seite geimpft. Diese Ausführungsform weist zwei Fächer 20 bzw. 28 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid auf. Die mit Sauerstoff angereicherten Fluide in den Fächern 20 und 28 bzw. 21 und 29 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid können gleich oder unterschiedlich sein, sie können in der gleichen oder in unterschiedlichen Richtungen strömen und sie können mit den gleichen oder unterschiedlichen Strömungsraten strömen. Diese Ausführungsform gestattet eine gleichzeitige direkte Sauerstoffversorgung von anhaftenden Hepatozyten 40 durch Transmembran-Transport von Sauerstoff über die Membran 30, während sie auch eine zusätzliche direkte Sauerstoffversorgung der strömenden biologischen Flüssigkeit 11 durch Transmembran-Transport von Sauerstoff über die Membran 38 vorsieht.
Eine weitere Ausführungsform der dreifächerigen Zellkultivierungsvorrichtung, die ein Flüssigkeitsfach und zwei Fächer für mit Sauerstoff angereichertes Fluid aufweist, ist in 6b dargestellt. Eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 ist planar und ist mit Zellen 40 auf ihrer dem Flüssigkeitsfach 10 zugewandten und mit der biologischen Flüssigkeit in Kontakt stehenden Seite geimpft. Das zweite Fach 23 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid wird durch eine Hohlfaser gebildet, die in einer Ebene durch das Flüssigkeitsfach 10 angeordnet ist und das mit Sauerstoff angereicherte Fluid 29 enthält. Die mit Sauerstoff angereicherten Fluide 21 und 29 (die in dem Fach für mit Sauerstoff angereichertes Fluid enthalten sind) können gleich oder unterschiedlich sein, sie können in der gleichen oder in unterschiedlichen Richtungen strömen und sie können mit der gleichen oder unterschiedlichen Strömungsraten strömen. Diese Ausführungsform sieht eine direkte Sauerstoffversorgung der strömenden biologischen Flüssigkeit 11 durch Transmembran-Transport von Sauerstoff über die Hohlfasern 23 zusätzlich zu der direkten Sauerstoffversorgung von anhaftenden Hepatozyten 40 durch Transmembran-Transport von Sauerstoff über die Membran 30 vor.
6c veranschaulicht eine dritte Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung mit drei Fächern, die ein Flüssigkeitsfach und zwei Fächer für mit Sauerstoff angereichertes Fluid aufweisen. Diese Ausführungsform umfasst eine Bioreaktoreinheit, bei der die Anzahl von Hepatozyten 40, welche mit der strömenden biologischen Flüssigkeit 11 in Kontakt kommen, durch Kontaktnahme der biologischen Flüssigkeit mit einer zweiten Schicht von Zellen 48 erhöht wird, welche auf der zweiten gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen, im wesentlichen planaren Membran 38 getragen werden. Die Strömungsrichtungen in dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, in dem Fach 28 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und in dem Flüssigkeitsfach 10 können die gleiche Lateralrichtung aufweisen, kontralateral oder senkrecht oder irgendeine Kombination hiervon sein; eines oder beide mit Sauerstoff angereicherten Fluide 21 und 29 können statisch sein. Die beiden Schichten von Hepatozyten 40 und 48 können die gleiche oder unterschiedliche Dichten aufweisen und können gleiche oder auch unterschiedliche Zelltypen sein. Diese Ausführungsform ermöglicht eine Steigerung der Behandlungskapazität einer einzelnen Bioreaktoreinheit ohne Ändern der Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran oder Ändern des Volumens einer durch das System durchströmenden biologischen Flüssigkeit.
Die Hepatozyten 40 in den in 6a und 6c dargestellten Ausführungsformen stehen im wesentlichen nur in Kontakt mit einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30. Der von dem Volumen der Zellen und der biologischen Flüssigkeit 11 in dem Flüssigkeitsfach gefüllte Zwischenraum ist vorzugsweise in der Dicke gleichmäßig, kann aber auch ungleichmäßig sein. Dieser Zwischenraum hat mindestens die Höhe der Schicht von Hepatozyten 40, die an der Membran 30 angebracht ist, so dass sich zumindest etwas biologische Flüssigkeit 11 zwischen den Zellen und der Seite der flüssigkeitsdurchlässigen Membran, welche den Zellen zugewandt ist, befindet. Es besteht kein absolutes Limit bei der Höhe dieses Zwischenraums für diese Erfindung. Dieser Zwischenraum kann durch einen Abstandhalter aufrechterhalten werden.
Eine Ausführungsform eines Bioreaktors mit mehreren aufeinandergestapelten Kartuschen ist in 7a dargestellt, wobei der Bioreaktor 1 drei aufeinandergestapelte Kartuschen 2 gemäß der Erfindung aufweist (siehe auch 1). Jede Kartusche 2 umfasst ein Gehäuse mit oberen und unteren Wänden 50a bzw. 50b. Jede Kartusche umfasst ein Flüssigkeitsfach 10, durch das die biologische Flüssigkeit 11 strömt, und ein Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, durch welche das mit Sauerstoff angereicherte Fluid 21 strömt. Die beiden Fächer jeder Kartusche oder Einheit 2 sind durch eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 getrennt. Die Hepatozyten 40 werden auf der Membran 30 auf der dem Flüssigkeitsfach zugewandten Seite der Membran kultiviert. Die Strömung des mit Sauerstoff angereicherten Fluids und biologischer Flüssigkeiten kann in irgendeiner Richtung stattfinden, der gleichen lateralen Richtung, kontralateral oder senkrecht oder irgendeiner Kombination hiervon. Die Anzahl von Fächern kann bis zu 100 oder mehr für jeden Fachtyp variieren. Ferner können die Zusammensetzung (z. B. Prozentsatz an Sauerstoff) und die volumetrischen Strömungsraten der einzelnen Strömungen des mit Sauerstoff angereicherten Fluids 21 unter den Fächern 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid identisch sein oder sich unterscheiden. Auf ähnliche Weise können die Zusammensetzung (z. B. Konzentration von Zytokinen) und die volumetrischen Strömungsraten der einzelnen Strömungen biologischer Flüssigkeit 11 unter den Flüssigkeitsfächern 10 identisch sein oder sich unterscheiden.
Eine alternative Ausführungsform, bei der ein Bioreaktor 1 mehrere aufeinandergestapelte, gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membranen aufweist, wobei Zellen auf der Seite der Membran kultiviert werden, die einer biologischen Flüssigkeit zugewandt ist und von einem mit Sauerstoff angereicherten Fluid weggewandt ist, ist in 7b gezeigt. Bei dieser Ausführungsform umfasst der Bioreaktor 1 eine große Kammer mit einem Einlass und einem Auslass für die Strömung des mit Sauerstoff angereicherten Fluids 21 durch den Bioreaktor 1 sowie einen Einlass und einen Auslass zur Strömung der biologischen Flüssigkeit 11 durch den gesamten Bioreaktor 1. Bei dieser Ausführungsform enthält der Bioreaktor 1 keine einzelnen Kartuschen, sondern enthält stattdessen mehrere aufeinandergestapelte gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membranen 30 (in 7b sind es sechs), um alternative Zellfächer 10 zu schaffen (drei in 7b), die biologische Flüssigkeit 11 enthalten, und Fächer 20 (vier in 7b) für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, die mit Sauerstoff angereichertes Fluid 21 enthalten. Hepatozyten 40 werden auf der Seite jeder Membran 30 kultiviert, die mit der biologischen Flüssigkeit 11 in Kontakt steht. Die Anzahl von Fächern kann bis zu 100 oder mehr für jeden Fachtyp variieren. Wie für die in 7a dargestellte Ausführungsform angedeutet wurde, können die Zusammensetzungen und die Strömungen der biologischen Flüssigkeit 11 und des mit Sauerstoff angereicherten Fluids in jedem Flüssigkeitsfach und jedem Fach für mit Sauerstoff angereichertes Fluid jeweils gleich oder unterschiedlich sein.
Der Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zu dem Bioreaktor kann mit einem ersten Verteilerrohr verbunden sein, welches die Strömung von mit Sauerstoff angereichertem Fluid gleichmäßig oder ungleichmäßig auf jedes der mehreren Fächer für mit Sauerstoff angereichertes Fluid verteilt, um Sauerstoff und andere Gase den Fächern für mit Sauerstoff angereichertes Fluid für einen Gasaustausch über die gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen zu liefern. Nach dem Durchlauf durch die Vielzahl von Fächern für mit Sauerstoff angereichertes Fluid (parallel) wird mit Sauerstoff angereichertes Fluid mit einem zweiten Verteilerrohr gesammelt, welches allen Fächern für mit Sauerstoff angereichertes Fluid gemeinsam ist, und dann aus dem Bioreaktor durch einen Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid hinausgeleitet. Auf ähnliche Weise ist der Einlass für biologische Flüssigkeit mit einem Verteilerrohr verbunden, welches die Strömung einer biologischen Flüssigkeit gleichmäßig auf jedes der mehreren Flüssigkeitsfächer verteilt, um Zellen in den Flüssigkeitsfächern der biologischen Flüssigkeit auszusetzen. Nach dem Durchlauf durch die mehreren Fächer (wiederum parallel) wird die biologische Flüssigkeit in einem gemeinsamen Sammelrohr gesammelt und wird zu einem Auslass geleitet, um in der Strömungsschleife für die biologische Flüssigkeit zu zirkulieren.
Die Verteilerrohre für diese Multifach-Zellkultiviervorrichtungen sind vorzugsweise mit den ihnen zugeordneten Fächern durch abnehmbare bzw. lösbare Verbinder verbunden. Diese Verbinder ermöglichen eine einfache Installation und einen möglichen Austausch von einzelnen Verbindungen. Alternativ können die Verteilerrohre, falls gewünscht, permanent mit jedem zugeordneten Fach verbunden sein.
Eine spezifische Ausführungsform eines solchen mit Verteilerrohren versehenen Bioreaktors 1 ist in 8a gezeigt, in der der Bioreaktor 1 mehrere aufeinandergestapelte Kartuschen 2 aufweist (drei in 8a), von denen jede ein Flüssigkeitsfach 10, eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30, Hepatozyten 40 sowie eine starres, undurchlässiges Gehäuse 50 aufweist. Der Bioreaktor 1 umfasst auch einen gemeinsames Fach 222 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Einlass 3 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Auslass 3' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Flüssigkeitseinlass 5, einen Flüssigkeitsauslass 5', einen Flüssigkeitseinlassverteiler 555 und einen Flüssigkeitsauslassverteiler 555'. Der Flüssigkeitseinlassverteiler 555 leitet biologische Flüssigkeit von dem Flüssigkeitseinlass 5 zu dem Flüssigkeitsfach 10 jeder Kartusche 2. Der Flüssigkeitsauslassverteiler 555' leitet biologische Flüssigkeit zu dem Flüssigkeitsauslass 5' von dem Flüssigkeitsfach 10 in jeder Kartusche 2. Die Hinzufügung anderer Öffnungen bzw. Anschlüsse für jedes Flüssigkeitsfach kann als Belüftung für eine Luftbewegung beim Auffüllen oder als Mittel zur individuellen Drainage jedes Flüssigkeitsfachs dienen. Der Einlass 3 von mit Sauerstoff angereichertem Fluid leitet mit Sauerstoff angereichertes Fluid in das gemeinsame Fach 222 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid des Bioreaktors 1 außerhalb der Kartuschen 2, wo das mit Sauerstoff angereicherte Fluid die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30 kontaktiert. Das mit Sauerstoff angereicherte Fluid wird aus dem Bioreaktor über den Auslass 3' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid geleitet. Andere Anschlüsse zum Belüften von mit Sauerstoff angereicherten Fluiden können ebenfalls an der undurchlässigen Wand 505 des Bioreaktors 1 hinzugefügt werden. Die Anzahl von Fächern kann bis zu 100 oder mehr bei jedem Fachtyp variieren.
8b zeigt eine alternative Konfiguration, bei der ein Bioreaktor 1 mehrere aufeinandergestapelte Kartuschen 2 (drei in dieser Figur) aufweist, von denen jede ein Flüssigkeitsfach 10, ein Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30, Hepatozyten 40 und ein starres, undurchlässiges Gehäuse 50 umfasst. Der Bioreaktor 1 weist auch einen Einlass 3 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Auslass 3' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, einen Flüssigkeitseinlass 5, einen Flüssigkeitsauslass 5', einen Flüssigkeitseinlassverteiler 555 und einen Flüssigkeitsauslassverteiler 555', einen Einlassverteiler 333 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und einen Auslassverteiler 333' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid auf. Der Flüssigkeitseinlassverteiler 555 leitet biologische Flüssigkeit 11 von dem Flüssigkeitseinlass 5 zu dem Flüssigkeitsfach 10 jeder Kartusche 2. Der Flüssigkeitsauslassverteiler 555' leitet biologische Flüssigkeit 11 zu dem Flüssigkeitsauslass 5' von dem Flüssigkeitsfach 10 jeder Kartusche 2. Die Hinzufügung anderer Anschlüsse für jedes Flüssigkeitsfach kann als Belüftung für eine Luftbewegung beim Auffüllen oder als Mittel zur individuellen Drainage jedes Flüssigkeitsfachs dienen. Der Einlassverteiler 333 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid leitet mit Sauerstoff angereicherte Fluide von dem Einlass 3 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid zu dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid jeder Kartusche 2. Der Auslassverteiler 333' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid leitet mit Sauerstoff angereicherte Fluide zu dem Auslass 3' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid von dem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid jeder Kartusche 2. Andere Anschlüsse zum Belüften von mit Sauerstoff angereicherten Fluiden können ebenfalls jedem Fach 20 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid hinzugefügt werden. Die Anzahl von Fächern kann bis zu 100 oder mehr bei jedem Fachtyp variieren.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Hepatozyten von der strömenden biologischen Flüssigkeit durch eine oder mehrere dazwischenliegende flüssigkeitsdurchlässige Membranen getrennt, so dass das Flüssigkeitsfach nun zu separaten Flüssigkeitsperfusions- und Zellfächern wird, die entweder vollständig oder unvollständig von der einen oder den mehreren dazwischenliegenden flüssigkeitsdurchlässigen Membranen unterteilt sind. Eine beliebige Anzahl alternierender Fächer kann angewandt werden, und sie sind nicht durch das Kammergehäuse, wie es in 7b gezeigt ist, begrenzt. Das Kammergehäuse ist aus undurchlässigem Material gefertigt.
Der Bioreaktor wird mit funktionalen Hepatozyten geimpft; es wird bevorzugt, die geimpften Hepatozyten zusammen funktionieren zu lassen, um die Funktionstypen und Funktionsniveaus für Zellen in einem Organ zu simulieren. Zellen können entweder in dem Bioreaktor wachsen, in der Anzahl stabil bleiben oder zwischen Wachstumsmoden und numerischer Stabilität umschalten. Zellen können auch entweder ihren vorhergehenden Phänotyp beibehalten oder ihren Phänotyp bei der der Kultivierung im Bioreaktor ändern. Der Bioreaktor ist als ein in-vitro-Kultursystem anzuwenden, und seine Kreisläufe für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und für Flüssigkeit machen ihn geeignet zur Verwendung als Organstützvorrichtung, um einen Patienten, der einer Organunterstützung bedarf, zu behandeln. Die Vorrichtung wird mit Organzellen geimpft, die so kultiviert werden, dass sie ähnlich wie in dem Organ, aus dem die Zellen abgeleitet wurden, funktionieren.
Eine Quelle von Zellen für den Bioreaktor ist ein Säugetierorgan. Wenn dieses Organ die Leber ist, umfassen die Zellen, die zur Verwendung in einer Leberstützvorrichtung kultiviert werden, Hepatozyten, die Hauptzellen der Leber, die in der Lage sind, die funktionalen Anforderungen zu erfüllen, die typischerweise der Leber zugeordnet sind, wenn sie in eine geeignete chemische und strukturelle Umgebung platziert werden. Andere in der Leber vorhandene Zellen können ebenfalls in die Vorrichtung aufgenommen werden, wie z. B. Endothelzellen, Ito-Zellen, Kupfer-Zellen, eine spezialisierte makrophagartige Zelle und Fibroblasten. Eine gemeinsame Kultivierung von Hepatozyten mit einem oder mehreren dieser oder anderer Zelltypen kann bei einem LAD erwünscht sein. Für Bioreaktoren mit mehreren Einheiten kann jede Einheit mit der gleichen Anzahl von Zellen und/oder Kombinationen von Zelltypen oder unterschiedlichen Anzahlen und/oder Kombinationen geimpft werden.
Wegen der begrenzten Verfügbarkeit menschlicher Hepatozyten können nicht-menschliche Quellen bei der Erfindung verwendet werden. Zellen von anderen Säugetieren, die Pferde-, Hunde-, Schweine-, Rind-, Schaf- und Mäuse-Quellen umfassen, jedoch nicht hierauf beschränkt sind, können verwendet werden. Zellspender können in der Entwicklung und im Alter, in Geschlecht, in Spezies, im Gewicht und in der Größe variieren. Zellen können aus Spendergeweben von Embryos, Neugeborenen oder älteren Individuen einschließlich Erwachsenen abgeleitet werden. Embryonische Progenitor-Zellen, wie z. B. Parenchym- oder Mesenchym-Stammzellen können in der Erfindung verwendet werden und zur Differenzierung indiziert werden, um sich zu dem gewünschten Gewebe zu entwickeln. Außerdem können Mischungen von Zellen aus verschiedenen Zellsträngen, Mischungen von normalen und genetisch modifizierten Zellen oder Mischungen von Zellen aus zwei oder mehreren Spezies oder Gewebequellen angewandt werden.
Eine Quelle von Hepatozyten zur Verwendung in der Erfindung ist die Schweineleber. Die besten aktuellen Schätzungen der Anzahl lebensfähiger Hepatozyten für jede klinische LAD belaufen sich auf etwa 10¹⁰ Zellen, was grob gerechnet die Anzahl von Zellen aus einer kleinen Schweineleber ist (20 lb). Eine alternative Quelle von Zellen besteht in der Kultivierung von Zellen, die voran aus einem Säugetierorgan erhalten wurden, oder aber durch Kultivieren von Zellen, die vorher so kultiviert wurden, dass sie als eine Zelllinie existieren. Zellen zur Anwendung bei der Erfindung können normal oder genetisch durch spontane, chemische oder virale Transfektion genetisch behandelt sein. Sich neu kombinierende oder genetisch behandelte Zellen können für Unsterblichkeit, verringerte Allogenizität oder differenzierte Hepatozytenfunktion geschaffen werden. Prozeduren zum genetischen Erstellen von Zellen sind allgemein im Stand der Technik bekannt und in Sambrook et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY (1989) beschrieben.
Hepatozyten werden aus frischem behandeltem Gewebe aus Zellen geimpft, die vorher in-vitro kultiviert wurden, die aus dem cryopräservierten Gewebe aufgetaut werden, oder aus irgendeiner Kombination hiervon. Vor dem Impfen werden die Zellen in einem Impfmedium in Suspension gehalten. Bei den neuartigen Methoden und Vorrichtungen werden die Zellen auf die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran, wie sie definiert wurde, geimpft. Vor dem Impfen von Zellen wird die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran nach Wunsch behandelt, und aus dem Flüssigkeitsfach wird der Großteil, aber nicht notwendigerweise die Gesamtheit seines flüssigen Inhalts abgezogen. Es ist auch möglich, einen Teil des flüssigen Inhalts auszutauschen, z. B. mit einer biologischen Flüssigkeit, bevor die Zellen geimpft werden. Diese Flüssigkeitstransfers können entweder durch Drainage über einen oder mehrere der Anschlüsse für das Flüssigkeitsfach erfolgen, durch Entfernen der undurchlässigen Wand, welche das Flüssigkeitsfach kontaktiert, und Abgeben und Ansaugen von Flüssigkeit direkt in das Flüssigkeitsfach durch die Öffnung, die durch das Entfernen der oben erwähnten undurchlässigen Wand geschaffen wird, oder durch eine Kombination hiervon.
Zum Impfen von Zellen sind eine Vielzahl von Ausführungsformen möglich. Bei einer Ausführungsform werden die Zellen eingeleitet, indem zunächst die undurchlässige Wand, welche das Flüssigkeitsfach kontaktiert, entfernt wird und Zellen in einer Flüssigkeitssuspension oder suspendiert in einer natürlichen oder synthetischen Polymermatrix auf die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran aufgebracht werden (mit einer manuellen oder automatisierten Pipette). In einer alternativen Ausführungsform werden die Zellen eingeleitet, indem zuerst sichergestellt wird, dass mindestens zwei Anschlüsse für das Flüssigkeitsfach geöffnet sind, und dann die Suspension von Zellen in das Flüssigkeitsfach strömen gelassen wird. Für jede dieser Ausführungsformen wird den Zellen ermöglicht, sich an der Membran anzusiedeln und ihre Funktionalität herzustellen. Das Saat- bzw. Impfmedium kann dann abgezogen werden (durch irgendeines der im obigen Paragraphen zum Entfernen und Hinzufügen von Flüssigkeiten in das/aus dem Flüssigkeitsfach beschriebenen Verfahren), und mit einer biologischen Flüssigkeit wieder aufgefüllt werden.
Für einen Bioreaktor, der mehrere Kultureinheiten oder Kassetten enthält, kann jede Einheit oder jede Kassette mit Zellen entweder zusammen mit den anderen Einheiten in zusammengebautem Zustand durch eine der obigen Ausführungsformen geimpft werden, oder separat als einzelne, nicht in Verteilerrohren gebündelte Einheiten mit Zellen geimpft werden, und im Anschluss daran durch Zusammenführen der Verteilerrohre zu einem kompletten Bioreaktorsystem werden. Die Zeit, zu der geimpfte Einheiten in dieser letzteren Ausführungsform zusammengefügt werden, kann bald nach dem Impfvorgang oder nach dem Erstellen weiterer Kulturen sein.
Wenn Kulturen erstellt worden sind und der Bioreaktor als Leberstützvorrichtung fungiert, wird er zu Behandlung eines Patienten, der eine Leberunterstützung braucht, benutzt, wie 1 zeigt. Gemäß 1, und wie hier beschrieben ist, umfasst die Leberstützvorrichtung einen Bioreaktor 1 mit einem Einlass 3 und einem Auslass 3' zur Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid und einen Einlass 5 und einen Auslass 5' für die Zufuhr von biologischer Flüssigkeit. Der Einlass 3 für die Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid zu den Fächern von mit Sauerstoff angereichertem Fluid wird durch eine Zufuhr 4 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid versorgt. Der Auslass 3' für mit Sauerstoff angereichertes Fluid wird vorzugsweise zur Atmosphäre oder einem Sammelgefäß hin entlüftet. Mit der Zufuhr 4 für mit Sauerstoff angereichertes Fluid sind auch Controller verbunden, um das Gemisch von mit Sauerstoff angereichertem Fluid, den Druck, die Strömungsraten zu überwachen (nicht gezeigt).
Der Einlass 5 und der Auslass 5' für die biologische Flüssigkeit sind in einer geschlossenen Schleife verbunden. Es ist erwünscht, aber nicht notwendig, in der Schleife für die biologische Flüssigkeit eine Immunoisoliereinheit 7 zu haben, um die Blutströmung des Patienten vom Bioreaktor zu isolieren. Der Bioreaktor 1 kann mit einer Plasmaphereseeinheit 8 assoziiert werden, um das behandelte Plasma des Patienten von Blut zu trennen, um eine Blutentgiftung wirksamer zu machen. Innerhalb der Strömung der biologischen Flüssigkeit befinden sich verschiedene Pumpen 6, 6' und 6'', um die Strömung von Medium oder biologischer Flüssigkeit durch den Bioreaktor und die Immunoisoliereinheit zu gewährleisten und den (geeigneten) pH, die Temperatur und Strömungssensoren (nicht gezeigt) bereitzustellen.
Beispiele
Die Erfindung wird ferner in den folgenden Beispielen beschrieben.
Die Beispiele 1, 2 und 14 beschreiben neue Zellkultivierungsvorrichtungen. Die Beispiele 3 bis 8 beschreiben Proben, die zur Messung einer hepatozellulären Funktion verwendet werden. Die Beispiele 9 bis 14 demonstrieren bestimmte Ausführungsformen der Erfindung.
Beispiel 1: Zellkultivierungsvorrichtung – Statische Anordnung
Die Fähigkeit der neuen Zellkultivierungsvorrichtung, die Funktion von Hepatozyten in-vitro zu unterstützen, wurde durch Aufbau einer labormäßigen Vorrichtung 1, basierend auf dieser Konfiguration ermittelt. Die Vorrichtung, wie sie in 9a und 9b dargestellt ist, umfasste eine Anordnung von oberen 60 und unteren 70 Gehäusen, eine gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran 30, einen Rahmen 35, ein Fenster 75 für das untere Gehäuse, einen Satz O-Ringe 80, 85, 90 und 95, eine Abdeckung 100, eine Kappe 110 und zugehörige Schrauben und Fittings 120, 150, 180, 210 und 215. Die verwendete Membran war typischerweise entweder Polyflex^® (Plastics Suppliers, Inc., Columbus, OH), ein 0,002'' dicker Film aus Polystyrol oder TYVEK^® 1073 (e. i. Dupont de Nemours und Co. Inc., Wilmington, DE), eine mikroporöse, nicht-gewebte Membran, bestehend aus UST Klasse VI Polyolefin, obwohl auch andere Materialien in einigen Untersuchungen eingesetzt wurden. Die Membran wurde auf einer Seite des Rahmens 35 epoxybehandelt, ein 0,0625'' dicker Aluminiumring mit einem achssymmetrischen Durchgangsloch von 2,122, um vor der Anwendung eine Membran-/Rahmenanordnung 400 zu bilden.
Ein Satz aus vier symmetrisch beabstandeten Flachrumpfkopfschrauben 120 aus rostfreiem Stahl #10–32 × 1/2'' schraubten die gegenüberliegenden oberen 60 (0,75'' dick) und unteren 70 (0,315'' dick) Polycarbonatgehäuse von 4'' Durchmesser zusammen, um die Membran-/Rahmenanordnung 400 sandwichartig festzuhalten, wobei die Membran-/Rahmenanordnung mit der dem oberen Gehäuse zugewandten Membran 30 ausgerichtet war. Durchgangslöcher 63 in dem Rahmen 35 gestatteten ein Einsetzen der Schrauben 120 durch gegengebohrte Abstandslöcher 62 in dem unteren Gehäuse 70 in Gewindelöcher in dem oberen Gehäuse 60. Eine flüssigkeitsdichte Dichtung wurde zwischen der Oberseite der Membran-/Rahmenanordnung und der Unterseite des oberen Gehäuses mittels eines O-Rings 80 von #039, der in einer achssymmetrischen Nut im oberen Gehäuse saß, gebildet. Auf ähnliche Weise wurde eine gasdichte Dichtung zwischen der Unterseite der Membran-/Rahmenanordnung und der Oberseite des unteren Gehäuses mittels eines zweiten O-Rings 85 von #039, der in einer achssymmetrischen Nut im unteren Gehäuse saß, gebildet. Mit diesen Komponenten betrug der Minimaldurchmesser der Membran 2,9'' und passte zum Außendurchmesser der O-Ringe, obwohl Membranen mit größeren Durchmessern verwendet werden könnten, indem Teile der Membran weggeschnitten werden, um eine Interferenz mit dem Schraubweg zu vermeiden.
Eine achssymmetrische 0,062'' tiefe Kammer 30 von 2,125'' Durchmesser unter der Membran wurde durch Befestigen eines 0,125'' dicken Polycarbonat-Fensters 75 von 2,330'' Durchmesser in einem achssymmetrischen Durchgangsloch im unteren Gehäuse 70 gebildet. Zwei Kanäle 130, die mit Gewindelöchern 140 verbunden waren, welche mit Legris-Fittings mit einem OD #10–32 × 1/8''-Rohr mit integralen O-Ringen ausgestattet waren, um Anschlüsse für einen externen Zugang zu dieser Kammer bereitzustellen. Zusätzliche mechanische Stützen der Membran könnten vorgesehen werden, indem in dieser Kammer ein hochporöser, 0.06'' dicker Block 160 von 2,0'' Durchmesser angeordnet wird.
Es wurden zwei Verfahren eingesetzt, um eine Kammer 10 von 2,125'' Durchmesser zu bilden, die Badezellen 40 der Flüssigkeit 11 enthielten, welche an der Membran 30 in einem achssymmetrischen Durchgangsloch von 2,125'' Durchmesser im oberen Gehäuse 60 angebracht waren. Bei einem Verfahren (in 9a dargestellt) wurde eine 0,750'' tiefe Kammer 170, die beim Impfen von Zellen auf die Membran benutzt wurde, durch Anbringen einer Polycarbonatabdeckung 100 von 4,216'' Durchmesser auf die Oberseite des oberen Gehäuses gebildet. Diese Abdeckung, die dazu vorgesehen war, einen aseptischen Transport der zusammengebauten Vorrichtung nach dem Impfen mit Zellen sowie das Stapeln mehrerer Vorrichtungen zu ermöglichen, hatte 0,25'' hohe Ränder 105 um dem Umfang seiner Ober- und Unterseiten, um ein Verschütten von Flüssigkeit aus der Kammer und ein Eindringen von äußeren Verunreinigungen in die Kammer zu vermeiden.
In dem zweiten Verfahren (in 9b dargestellt) wurde eine 0,062'' tiefe Kammer 10, die nach der Beseitigung der die Suspension zum Impfen von Zellen enthaltenden Flüssigkeit benutzt wurde, durch Befestigen einer Polycarbonatkappe 110 von 4,000'' Durchmesser in dem Durchgangsloch in dem oberen Gehäuse 60 gebildet. Eine flüssigkeitsdichte Dichtung zwischen der Kappe und dem oberen Gehäuse wurde mittels eines #020 O-Rings 90 und vier symmetrisch beabstandeten Flachkopfschrauben 180 von #10–32 × 1/2'' gebildet, die in Gewindelöchern an der Oberseite des oberen Gehäuses befestigt wurden. Zwei Kanäle 190, die mit den Gewindelöchern 200 verbunden waren, und die mit weiblichen Luer- Verschlussfittings 210 mit #006-O-Ringen 95 von #10–32 × 1/4'' 316 ausgestattet waren, stellten Anschlüsse zum externen Zugang zu diesen Kammern bereit. Diese Anschlüsse wurden für statische Kulturen mittels männlichen Luer-Verschlussstopfen 215 aus 316er rostfreiem Stahl verstopft.
Alle Montageschritte wurden, sofern nicht anders angegeben, in einem biologischen Sicherheitsfach ausführt und erfolgten nach Sterilisierung aller Teile (außer der Membran-/Rahmenanordnung 400 und den Fittings 150 für das untere Gehäuse 110) durch Autoklaven oder eine andere bewährte Behandlung (z. B. Gammabestrahlung oder Aussetzen gegenüber einem oxidierenden Gas, wie Ethylenoxid, Per-Essigsäure und/oder Wasserstoffperoxid). Alle Materialien wurden entweder mit sterilen Zangen oder mit Handschuhen in dem Fach behandelt. Einige Membranen wurde ohne Sterilisierung für relativ kurze Zeitdauern von 1 bis 3 Tagen oder weniger verwendet; andere Membranen wurden entweder auf Rahmen epoxybehandelt und vor der Installation mit Gammastrahlen bestrahlt (z. B. Polyflex^®) oder ohne Rahmen vor der Installation mit Gammastrahlen bestrahlt (z. B. TYVEK^® 1073).
Die Anfangsschritte bei der Montage bestanden aus dem Zusammenpassen der oberen 60 und unteren 70 Gehäuse, der #039-O-Ringe 80 und 85, der Membran-/Rahmenanordnung 400, der Gewindefittings 115 und 210 sowie der #006-O-Ringe 95 und Festziehen der diese Teile zusammenhaltenden vier Schrauben 120. Als nächstes wurden die Fittings angezogen und Stopfen 215 für die Fittings für das obere Gehäuse befestigt. Die Abdeckung 100 wurde dann installiert, und die Vorrichtung 1 unter aseptischen Bedingungen bis zum Einsatz gelagert.
Primär-Hepatozyten 40 in einem kompletten Medium (Williams-E-Medium, ergänzt durch 4,5 g/L Glukose, 0,5 U/nN Rinderinsulin, 7 ng/nL Glukagon, 7,5 μg/mL Glukagon, 7,5 μg/mL Hydrocortison, 10 mM HEPES, 20 nh/mL EGF, 20 mM Glutamin, 10 IU Penicillin und 10 g Streptomycin) mit 1%igem Serum eines neugeborenen Kalbs (NBCS) wurden aus Schweinespendern mit der folgenden Prozedur erhalten.
Hepatozyten wurden aus Lebern von gekreuzten Yorkshire/Hampshire Schweinen isoliert, bezogen von EM Parsons (Hadley, MA) und wogen 8,3 ± 3,0 kg. Heparin (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ) wurde intravenös bei 0,5 mg pro kg verabreicht, und Spender mit einem Gemisch aus Telazol (7–10 mg/kg, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, LA) und Rompun (5 mg/kg, Miles, Inc., Shawnee, Mission, KS) anästhesiert. Die Anästhesie-Ebene wurde mit Isofluran-Gas aufrechterhalten. Alle Prozeduren wurden übereinstimmend mit ACUC-Richtlinien durchgeführt.
Zellen 40 wurden mittels einer Modifikation der Seglen-Methode isoliert, die vorher beschrieben wurde (P. Seglen, Preparation of Isolated Rat Liver Cells, in Method in Cell Biology (DM. Prescott et. al.), Volumen. 13, Academic Press (New York, NY), 1976). Kurz ausgedrückt wurde die freigelegte Leber in situ kanüliert und mit kaltem Lactated Ringers (Baxter, Deerfield, IL) mit 20 mL/min vor der Exzision durchspült. Die Leber wurde rasch erwärmt, und mit 0,2% EDTA bei 37°C durchspült. Diesem folgte eine Durchspülung von 1 mg/mL Collegians (Life Technologies, Grand Island, NY) bei 37°C, bis eine Verdauung vollständig erschien (mittlere Verdauung 22 + 4 min). Eine weitere Verdauung wurde mit dem Zusatz von kalter gepuffter Hank'scher Salzlösung (Bio Whittaker, Walkerville, MD), mit einem Zusatz von 10% NBCS (Cyclone, Logan, UT) gestoppt. Unverdautes Gewebe und eine Gallenblase wurden exzisiert, und der Rest des Gewebes passierte der Reihe nach durch jeweils 200 und 100 Mikron feine Siebe aus rostfreiem Stahl (Fisher Scientific, Pittsburg, PA). Die Zellsuspension wurde zwei Mal gewaschen und das Zell-Pellet nochmals in einem Kulturmedium in Suspension gebracht. Die Überlebensfähigkeit wurde durch eine Trypan Blue Exclusion bestimmt.
Die Zellen wurden dann auf die Membran geimpft. In einigen Untersuchungen wurde die Membran 30 mit einer sterilen Lösung von 4 mL Volumen von 40 μg/mL-Type I Collagen in Wasser über 45 Minuten vorbeschichtet, gefolgt von einer Ansaugung dieser Lösung und einer Durchspülung mit einem gleichen Volumen von steriler, mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) vor dem Impfen der Zellen. Eine Suspension von Zellen in diesem Medium 11 wurde gleichmäßig durch Verquirlen des Empfängers, der die Zellen enthielt, und durch Zermahlen der Suspension mehrere Male mit einer sterilen Pipette vor dem Impfvorgang suspendiert. Bei den meisten Untersuchungen wurden Zellen mit einer Anfangsdichte von 2 × 106 Zellen pro Vorrichtung 1 geimpft. Bei einigen Untersuchungen aber wurden höhere Dichten untersucht (siehe Beispiel 13). Die Abdeckung 100 der Vorrichtung 1 wurde entfernt, 4 mL der Zellsuspension auf die Membran 30 pipettiert, die Vorrichtung vorsichtig geschüttelt, um die Flüssigkeit gleichmäßig auf der Oberfläche der Membran zu verteilen, und die Abdeckung wieder angebracht. Die mit Zellen geimpfte Vorrichtung wurde in einen Inkubator eingebracht (der bei 37°C und 85% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurde), wo die Gaskammer 20 über einen der Anschlüsse 150 in dem unteren Gehäuse 70 mit einem Gastank 4 verbunden war, der 10% CO₂ und eine Konzentration von Sauerstoff, die von 0 bis 90% bei 2–5 psi reichte und nicht mehr als 1,0 mL/min betrug.
Nach etwa 18–24 Stunden wurde die Vorrichtung aus dem Inkubator entfernt, wieder zurück in das biologische Sicherheitsfach verbracht, die Abdeckung 100 entfernt und das Medium 11 mittels einer sterilen Pasteur-Pipette angesaugt. Die Kappe 110 mit dem zugehörigen #020-O-Ring 90 wurde dann auf das Durchgangsloch im oberen Gehäuse 60 aufgebracht und an Ort und Stelle mittels vier Schrauben 180 befestigt. Etwa 2,7 mL frischen Mediums 11 wurde in die Flüssigkeitskammer 10 durch Entfernen der Luer-Verschlussstopfen 215, Übertragung im Medium mit einer Rate von 1,5 mL/min bei vertikal ausgerichteten Anschlüssen (so dass alle Luftblasen aus der Kammer entweichen konnten) und Schließen der Anschlüsse durch Wiederanbringung der Luer-Verschlussstopfen eingeleitet. Die Vorrichtung wurde dann wieder in den Inkubator verbracht und wie oben angegeben wieder mit der Zufuhr 4 von mit Sauerstoff angereichertem Fluid verbunden. Die Vorrichtungen wurden anschließend einer Probe unterzogen durch Trennen von der Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid, einer Übertragung aus dem Inkubator in ein biologisches Sicherheitsfach, ein Entfernen der Luer-Verschlussstopfen und einer Drainage des flüssigen Inhalts in kleine Sammelbehälter. Diese Prozedur ergab eine Vorrichtung 1, die eine Kultivierung von Zellen 40 auf der Membran 30 mit einer direkten Transmembran-Sauerstoffversorgung und einer unabhängigen Perfusion ermöglichte.
Beispiel 2: Zellkultivierungsvorrichtung – Durchspülte Anordnung
Die Vorrichtung von Beispiel 1 wurde auch zur Untersuchung der Funktion von Hepatozyten in vitro unter einer Mediumdurchspülung mit geschlossener Schleife angewandt. Die Vorrichtung wurde zusammengebaut und wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Installation der Kappe 110 behandelt. Ein einfacher Strömungskreislauf, wie er in 10a und 10b dargestellt ist, wurde aseptisch an der Vorrichtung in einem biologischen Sicherheitsfach anmontiert. Komponenten für diesen Kreislauf (schematisch in 5a dargestellt) umfassten eine mit Zellen geimpfte Vorrichtung 1 (mit installierter Kappe 110, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde), einem Behälter 220, einer Pumpe 230, Verbindungsrohrstücken 300 und 305 und Luer-Verschlussfittings 310, 215 und 315. Alle Komponenten wurden durch Autoklaven-Behandlung (oder eine äquivalente Behandlung) vor dem Zusammenbau außer der mit Zellen geimpften Vorrichtung (die vorher aseptisch behandelt wurde) sterilisiert. Vor dem Verbinden der mit Zellen geimpften Vorrichtung wurden die männlichen Luer-Verschlussstopfen 215 aus den Luer-Verschlussfittings 210 entfernt. 10b stellt den Behälter dar, der auch als Blasenauffangteil fungierte, mit einer Polycarbonat-Oberseite 240 und einem Boden 250 (jede 2,00'' im Durchmesser und 0,500'' dick), ein 3,00''-großes × 0,75''-ID × 1,00''-OD Polycarbonatrohr 260, ein Paar #019-O-Ringe 270, drei Metallschrauben und Bolzen 280 sowie fünf #10-32 × 1/4'' weibliche Luer-Verschlussfittings aus 316er rostfreiem Stahl mit #006-O-ringen 95. Die O-Ringe 270 saßen in 0,785''-ID × 0,065''-OD × 0,0052''-tiefen achssymmetrischen Nuten am Boden von 0,75''-ID × 1,00''-ÖD × 0,062''-tiefen Ausnehmungen (um das Rohr auszurichten) in den oberen und unteren Flächen der Unterseite bzw. der Oberseite. Flüssigkeitsdichte Dichtungen wurden zwischen dem Rohr und der Oberseite bzw. Unterseite gebildet, indem das Rohr in diese Nuten nach Anbringung der O-Ringe 270 eingesetzt wurde und die drei symmetrisch beabstandeten Schrauben und Bolzen 260 festgezogen wurden. Paare von Luer-Verschlussfittings 290 wurden in Gewindelöchern 295 am Umfang der Unterseite und Oberseite installiert. Ein fünftes Luer-Verschlussfitting 210 wurde in einem Gewindeloch 285 an der oberen Fläche der Oberseite installiert.
Ein Kreislauf mit geschlossener Schleife zur Durchspülung wurde durch Erstellen zweier Sätze von Verbindungen gebildet, mittels eines etwa 18''-lange Tygon LFL L/S Größe #13 Rohrstücks (300 bzw. 305) mit männlichen Luer-Verschlüssen × 1/16''-ÏD gezackten Fittings 315 aus rostfreiem Stahl an beiden Enden. Eine Länge des Rohrstücks 300 verband eines der Luer-Verschlussfittings 210 an der Unterseite des Behälters 220 mit einem der Luer-Verschlussfittings 210 an der mit Zellen geimpften Vorrichtung 1; dieses Rohrstück fungierte als Strömungsdurchgang zum Einleiten strömenden Mediums 11 in die mit Zellen geimpfte Vorrichtung. Eine zweite Rohrstücklänge 305 verband eines der Luer-Verschlussfittings 210 an der Oberseite des Behälters mit dem restlichen Luer-Verschlussfitting 210 an der mit Zellen geimpften Vorrichtung; diese Rohrleitung funktionierte als Strömungsdurchgang, um Medium aus der mit Zellen geimpften Vorrichtung zu entfernen. Ein Luer-Verschlussstopfen 215 aus rostfreiem 315er Stahl wurde an dem restlichen Fitting am Boden des Behälters installiert. Dieser Stopfen wurde entfernt, wenn Medium in dem Behälter einer Probe unterzogen wurde oder der Behälter entleert wurde.
Ein Perfusat-Volumen 11, das typischerweise zwischen 10 und 20 mL betrug, wurde dann dem Behälter 220 über das Luer-Verschlussfitting an der oberen Fläche der Oberseite 240 des Behälters hinzugefügt. Bei dieser Hinzufügung wurden die nicht-verbundenen Luer-Verschlussfittings 210 am Umfang der Oberseite des Behälters geöffnet, um eine Belüftung zu ermöglichen. Luer-Verschlussstopfen 215 wurden dann an dem restlichen Luer-Verschlussfitting 210 vor dem Transfer des zusammengebauten Kreislaufs von dem biologischen Sicherheitskabinett zu dem Inkubator installiert. In dem Inkubator wurde die Rohrleitung 300 in den Kopf einer Pumpe 230 eingebracht (typischerweise eine peristaltische Pumpe mit einem Cole-Palmer-Easy-Load-Pumpenkopf mit PSF-Gehäuse und einem Cole-Palmer-Rotor aus rostfreiem Stahl, geregelt von einem Cole-Palmer-Controller). Die Vorrichtung wurde wieder mit der Zufuhr 4 von mit Sauerstoff angereichertem Fluid verbunden, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Pumpe wurde dann auf die gewünschte volumetrische Strömungsrate (die zwischen 0 und 12 mL/min lag, aber typischerweise zwischen 0,1 und 1,5 mL/min) hochgefahren, und die Flüssigkeit 11 in dem Behälter durch die Rohrleitung 300 und den Pumpenkopf in die mit Zellen geimpfte Vorrichtung 1 über die Rohrleitung 305 zurück in den Behälter rezirkuliert. Bei dieser Prozedur kann die Vorrichtung gekippt bzw. schräg gestellt werden, um ein Entfernen von Luftblasen zu erleichtert.
Zwei Verfahren zum weiteren Betrieb des Perfusionskreislaufs wurden implementiert. Bei einem Verfahren (Perfusionsverfahren I) wurde das Medium 11 nach jeweils 24–72 Betriebsstunden vollständig gegen ein frisches Medium ausgetauscht. Bei dem zweiten Verfahren (Perfusionsverfahren Immunoisolationseinheit 7) wurde das Medium nie ausgetauscht, sondern wurde anfänglich als ein Volumen eingeleitet, das groß genug war, um die Zellen für einen Zeitraum von einem bis vielen Tag(en) zu unterstützen. Für das Perfusionsverfahren I wurde die Pumpe 230 zunächst angehalten, die Zufuhr 4 von mit Sauerstoff angereichertem Fluid getrennt und der Perfusionskreislauf in ein biologisches Sicherheitsfach übertragen. Das in dem Behälter 220 verbleibende Medium wurde durch Entfernen des Luer-Verschlussstopfens 215 aus dem Luer-Verschlussfitting 210 am Boden 250 des Behälters, der nicht mit der Rohrleitung 300 verbunden war, abgezogen, und dann wurde der Behälter gekippt. Der Kreislauf wurde dann vorübergehend durch Loslösen der Rohrleitung 305 von dem Luer-Verschlussfitting 210 an der Oberseite 240 des Behälters rekonfiguriert. Nach Entfernen des Luer-Verschlussstopfens aus dem Luer-Verschlussfitting an der oberen Oberfläche der Oberseite des Behälters wurde der Behälter mit dem Medium-Volumen wieder aufgefüllt, das ursprünglich hinzugefügt worden war, und die Pumpe neu gestartet. Die Pumpe wurde in dieser Konfiguration mit offener Schleife für eine Zeitdauer betrieben, die gleich dem Verhältnis des nach Drainage des Kreislaufs zurückgehaltenen Volumens (berechnet als Differenz zwischen dem ursprünglich hinzugefügten Volumen und dem abgezogenen Volumen) zu der volumetrischen Strömungsrate betrieben. Die Pumpe wurde dann angehalten und der Kreislauf zu der ursprünglichen Konfiguration mit geschlossener Schleife vor der Rückübertragung zu dem Inkubator rekonfiguriert, die Verbindung zu der Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid wiederhergestellt und die Pumpe neu gestartet.
Für das Perfusionsverfahren II wurde die Pumpe 230 angehalten, die Zufuhr 4 von mit Sauerstoff angereichertem Fluid getrennt, die Rohrleitung 300 von der Pumpe gelöst und der Perfusionskreislauf ohne die Pumpe zu dem biologischen Sicherheitsfach ohne Entleeren der Flüssigkeit aus der Vorrichtung zurückgeführt. Eine 750 μL-Probe wurde mit einer sterilen Pipette aus der Öffnung 210 zum Probenehmen aus dem Behälter 220 entnommen (nach Beseitigen des Luer-Verschlussstopfens 215 an der Öffnung zur Belüftung). Der Perfusionskreislauf wurde dann zum Inkubator zurückgeführt, der geeignete Rohrleitungsabschnitt wieder am Pumpenkopf installiert, die Pumpe eingeschaltet und die Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid wieder mit der Vorrichtung verbunden.
Obwohl der obige Perfusionskreislauf eine Konfiguration mit geschlossener Schleife aufwies, wird hier schon auf Formen der Ausführungsform hingewiesen, die in diesem Beispiel 2 beschrieben sind, mit einer Konfiguration mit offener Schleife, bei der der Strömungsweg von einem Zuführbehälter über eine Pumpe und die Vorrichtung in den Sammelbehälter führt. Die Montage und der Betrieb dieses Kreislaufs mit offener Schleife folgt den oben beschriebenen allgemeinen Prozeduren.
Die Prozeduren und Arbeitsgänge, wie sie oben beschrieben wurden, ergaben eine Vorrichtung, die für in-vitro-Untersuchungen auf eine Weise betrieben wurde, welche die Anwendung eines LAD zur extrakorporalen Behandlung von menschlichen und tierischen Subjekten simulierte, welche eine beeinträchtigte Leberfunktion aufwiesen.
Beispiel 3: Hepatozelluläre Entgiftungsaktivität basierend auf der Umwandlung von Alkoxyresorufin in Resorufin
Cytochrom P450 (CYP450)-Isozyme sind Phase-I-Mischfunktions-Monooxygenasen, die zusammen mit komplemtären Phase-II-Konjugativenzymen die Bioumwandlung von xenobiotischen Stoffen sowie von endogenen Lipophilen in lösliche Zusammensetzungen katalysieren, die einfacher von dem Nierensystem gereinigt werden. Als Monooxygenasen erfordert die Funktion von CYP450-Isozymen das Vorhandensein molekularen Sauerstoffs. Demgemäß wird angenommen, dass die Aktivität von CYP450-Isozymen von der Verfügbarkeit von Sauerstoff abhängt.
Die O-Dealkylation von nicht-fluoreszierenden Alkoxyresorufinethern zu fluoreszierendem Resorufin bietet ein Werkzeug zur Untersuchung der Aktivitäten von CYP450-Isozymen. Beispielsweise hat es die Dealkylation der Phenoxazonether-Benzyloxyresorufin (BROD) und Ethoxyresorufin (EROD) Forschern jeweils die Untersuchung der Aktivität der einzelnen Isozyme CYP-IIB2 und IA1 ermöglicht. Um eine CYP450-Aktivität in statischen Kulturen zu messen, wurde ein standardmäßiges komplettes Medium 11 mit 1% NBCS in der mit Zellen geimpften Vorrichtung 1 von Beispiel 1 gegen ein komplettes Medium ausgetauscht, dem Serum fehlte, das aber 5 μM von BROD oder EROD (Molecular Probes, Eugene, OR) und 80 μM Dicumarol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Dicumarol wurde in die Inkubation einbezogen, um einen cytosolischen Abbau von Resorufin, dem Produkt der Dealkylation von Alkoxyresorufin durch CYP450-Isozyme durch anschließende Phase-II-Reaktionen zu begrenzen.
Proben wurden nach einer Inkubation über drei Stunden gesammelt und in einem Turner-450-Fluorometer bei einer Anregung und Emission von Wellenlänge von 540 nm bzw. 585 nm analysiert. Die Daten wurden als Stimulationsindizes zugeordnet (Verhältnisse von Fluoreszenz bei Proben nach einer Biotransformation über drei Stunden zu einer Fluoreszenz in Teilproben bzw. Aliquots von gleichem Volumen vor Hinzufügung zu der mit Zellen geimpften Vorrichtung 1). Die Daten wurden als Verhältnisse des Stimulationsindex für eine Vorrichtung ausgedrückt, die einen gasdurchlässigen Zellkultivierungsträger enthielt, der auf den Stimulationsindex für Zellen von dem gleichen Spender und den ersten Tag nach der Impfung (day post seeding) getestet, aber in gleich bemessenen Gewebekulturschalen von 60 mm Durchmesser angesetzt. Diese Probe wurde typischerweise am ersten Tag nach der Impfung von Zellen durchgeführt, wurde aber auch gelegentlich bis zu sieben oder mehr Tage nach der Impfung durchgeführt.
Bei dieser Probe entspricht eine Umwandlung von Alkoxyresorufin zu Resorufin einer Zunahme der Fluoreszenz, so dass der Stimulationsindex und die Entgiftungsaktivität dem Niveau einer P450-Aktivität eines speziellen Satzes von Isozymen und der Intensität der Entgiftungsreaktion von kultivierten Hepatozyten entspricht.
Beispiel 4: Aktivität von hepatozellulären P450-Isozymen basierend auf einer Beseitigung von Diazepam
Der Metabolismus der Arznei Diazepam bot eine alternative Methode zur Ermittlung der Aktivität von P450-Isozymen in unterstützten Hepatozyten in der Vorrichtung 1 von Beispiel 1. Die Beseitigung von Diazepam und seine Biotransformation zu Nordiazepam und Temazepam wurden mittels eines Verfahrens ähnlich dem von Jauregui et. al. (HO Jauregui, SF Ng, K Gann. DJ Waxman Xenobiotic induction of P-450 PB-4 (IIB1) und P450c (IA1) und zugeordnete Monooxygenase-Aktivitäten in Primärkulturen von Ratten-Hepatozyten, Xenobiotica 21;1091–1106, 1991) ermittelt. Bei diesem Verfahren wurde das Medium, welches der Vorrichtung aus Beispiel 1 an dem ersten Tag nach der Impfung nach Installation der Kappe 110 zugesetzt wurde, mit 70 μM Diazepam (Sigma) ergänzt. Eine 750 μL-Probe wurde nach der Inkubation über 24 Stunden gesammelt und bis zur Extraktion eingefroren; eine Probe des Mediums mit Diazepam-Zusatz wurde vor dem Einbringen in die Vorrichtung ebenfalls gesammelt und eingefroren. Es wurde eine Feststoff-Phasenextraktion mit Oasis-Kartuschen (Waters Corp., Milford, MA) und einem Waters-Extraktionsverteilerrohr durchgeführt. Die Kartuschen wurden anschließend mit zunächst Methanol und dann durch Umkehrosmose entionisiertem Wasser (RODI) gefüllt. Die Proben wurden auf die Säule geladen und mit 5% Methanol in RODI gewaschen, aus der Säule mit Methanol eluiert und verdampft und mit 250 μL einer mobilen Phase von 65% Methanol/35% 0,01 M Ammoniumacetat bei einem pH von 6,0 rekonstituiert. Ein Umkehrphasen-HPLC wurde mit einer Strömungsrate von 1,0 mL/min an einer Waters-Micro-Bondpak C18-Säule bei 24,5°C durchgeführt. Die Elution wurde durch optische Absorbanz bei 254 nm gemessen. Diazepam eluierte in annähernd 11 Minuten; die Metaboliten Nordiazepam und Temazepan eluierten in jeweils 10 und 8 Minuten. Die Daten wurden als Prozentsatz des anfänglich beseitigten Diazepams und als Prozentsätze des anfänglichen Diazepams, umgewandelt in Nordiazepam oder Temazepam, ausgedrückt.
Bei dieser Probeanordnung entsprechen hohe Prozentsätze des anfänglichen Diazepam, das geklärt und zu Nordiazepam und Temazepan umgewandelt wurde, einer hohen P450-Isozymaktivität. Je höher diese Prozentsätze sind, um so stärker ist die P450-Aktivität.
Beispiel 5: Hepatozelluläre Entgiftungsaktivität basierend auf einem Metabolismus von Lidocain
sDer Metabolismus der Arznei Lidocain bot ein weiteres Verfahren zur Ermittlung der Entgiftungsaktivität von unterstützten Hepatozyten in der Vorrichtung 1 von Beispiel 1. Das Beseitigen von Lidocain wurde mittels eines Verfahrens ähnlich dem von Nyberg et. al. (SL Nyberg, HJ Mann, R Remmel, W-S Hu, FB Cerra, Pharmacokinetic analysis verifies P450-function during in vitro and in vivo application of a bioartificial liver, ASAIO J 39: M252-256, 1993) ermittelt. Bei diesem Verfahren wurde der Vorrichtung aus Beispiel 1 am ersten Tag nach der Impfung und nach Versehen mit einer Kappe zugegebene Medium mit 740 μM Lidocain (Paddock Laboratories Inc., Minneapolis, MN) zugesetzt. Eine 600 μL-Probe wurde nach einer Inkubation über 24 Stunden gesammelt und bis zur Extraktion eingefroren; eine Probe des mit Lidocain ergänzten Mediums vor dem Einbringen in die Vorrichtung wurde ebenfalls gesammelt und eingefroren. Eine Feststoffphasenextraktion wurde mit Oasis-Kartuschen (Waters Corp.) und einem Waters-Extraktionsverteilerrohr durchgeführt. Die Kartuschen wurden mit 99% MeOH, 1% HCl und 0,5 M Borax aufgefüllt. Proben wurden auf die Säule geladen und mit 0,5 M Borax gewaschen, mit MeOH/HCl eluiert und dann verdampft und mit 250 μl einer mobilen Phase von 85% (50 mM NH₄HPO₄ + 10 mM Hexanschwefelsäure, pH 3,0)/15% Acetonitril rekonstituiert. Eine Umkehrphasen-HPLC wurde mit einer Strömungsrate von 1 mL/min an einer Microsorb C8-Säule (Rainin Instrument Co., Woburn, MA) bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Elution wurde durch optische Absorbanz mit 214 nm gemessen. Lidocain eluierte in etwa 37 Minuten; MEGX, der Hauptmetabolit, eluierte in 27 Minuten. Daten wurden als Prozentsatz des beseitigten anfänglichen Lidocains ausgedrückt.
Bei dieser Probenahme entsprachen Prozentsätze des beseitigten und in Metaboliten umgewandelten anfänglichen Lidocains einer hohen P450-Isozymaktivität. Je höher dieser Prozentsatz war, umso stärker war die P450-Aktivität.
Beispiel 6: Hepatozelluläre Ureagenese eines auf einer Harnstoffsynthese basierenden Mediums
Eine Harnstoffsynthese wurde durch eine der zwei Methoden für Vorrichtung 1 der Beispiele 1 und 2 bestimmt.
Verfahren 1:
Das Beseitigen von Ammoniak, seinen Salzen und aminierten Komponenten in dem Medium durch Deaminierung und Ureagenese wird als eine kritische Funktion von Hepatozyten in vivo und eine gewünschte Funktion dieser Zellen als Teil einer LAD angesehen. Eine Deaminierung resultiert in der Bildung von Harnstoff, der in vivo durch das Nierensystem beseitigt wird. Die Synthese von Harnstoff wurde mit der Vorrichtung 1 aus den Beispielen 1 und 2 mittels einer colorimetrischen Methode für die Bestimmung von Stickstoff gemessen, erhältlich als Kit #640-B von Sigma Diagnostics (St. Louis, MO). Proben wurden periodisch nach dem Impfen von Zellen in den Vorrichtungen gesammelt und mit Urease behandelt, um Harnstoff zu NH₃ und CO₂ zu hydrolisieren. Das resultierende NH₃ wurde dann mit Hydrochlorid und Phenol bei Vorhandensein des Katalysators, Natrium-Nitroprussid, zur Reaktion gebracht, um Indophenol zu bilden. Die optische Absorbanz der resultierenden Lösung von Indophenol wurde bei 570 nm gemessen und in eine Konzentration von Harnstoff in der ursprünglichen Probe mittels einer Standardkurve umgewandelt. Die Daten wurden als pro Vorrichtung pro Tag produzierte Harnstoffmenge durch Multiplizieren der Konzentrationen mit dem Volumen des Mediums 11 in der Vorrichtung und Teilen durch die Anzahl von Tagen seit Probebeginn ausgedrückt.
Verfahren 2:
Bei dieser Probe wurden Hepatozyten-Kulturen mit Ammoniumchorid und Ornithin beaufschlagt, um die Harnstoffproduktion zu verstärken. Die Synthese von Harnstoff ist Teil des Prozesses der Deaminierung und der Ureagenese. Demgemäß stellen Steigerungen bei der Synthese von Harnstoff, insbesondere in Reaktion auf eine Beaufschlagung mit exogenem Ammoniak, eine erhöhte funktionelle Kapazität zur Deaminierung von Medien dar. Nach der Beaufschlagung wurde das Medium aus den Kulturen getestet, um die erzeugte Harnstoffmenge zu messen.
Eine Grundlösung von 1 M Ammoniumchlorid (NH₄Cl; Sigma #A-0171) wurde durch Zugabe von 1,07 g NH₄Cl zu 10 mL von RODI zubereitet. Die Lösung wurde bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Eine Grundlösung von 0,2 M Ornithin (Sigma #O-6503) wurde durch Zugabe von 0,34 g zu 10 mL von RODI zubereitet. Diese Lösung wurde bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
Kultivierschalen wurden dann mit gepufferter IX-Phosphat-Saltzlösung (PBS) gespült. Jeder Schale wurden 10 mL Ammoniumchlorid und Ornithin für jeden mL von William's 1%-Medium hinzugefügt (ergänzt mit folgendem: 4,5 g/L Glukose, 0,5 U/mL Rinderinsulin, 7 ng/mL Glucagon, 7,5 μg/mL Hydrocortison, 10 mM HEPES, 20 ng/mL EGF, 20 mM Glutamin, 10 IU Penicillin und 10 μg Streptomycin sowie 1%-Serum eines neugeborenen Kalbs (NBCS)), d. h. 40 mL wurden bei Verwendung von 4 mL des William'schen Mediums hinzugefügt, um Schweine-Hepatozyten in Kultivierschalen von 60 mm zu kultivieren. Schalen mit einem nicht mit Ammoniumchlorid und Ornithin behandelten regulären Kulturmedium wurden zur Kontrolle mit aufgenommen. Die Schalen wurden für 24 Stunden in den Inkubator zurückgegeben. Nach der Inkubation wurden 2 mL des Mediums von den Schalen entfernt und in angemessen etikettierte Teströhrchen (Falcon #2054) übertragen und die Röhrchen bei –20°C gelagert.
Die in gefrorenen Proben vorhandene Harnstoffmenge wurde mittels eines Blut-Harnstoff-Stickstoff-(BUN)Kits (Sigma, Kit #535) bestimmt. Aufgetaute 40 mL-Proben wurden 3,0 mL des BUN-Säurereagens hinzugefügt, sowie 2,0 mL des BUN-Farbreagens zu 100 mm wegwerfbaren Borosilikat-Glasröhrchen. Die Röhrchen wurden bei 100°C 10 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur 3–5 Minuten lang inkubiert. Die abgekühlten Röhrchen wurden mittels des Vortex-Shakers gut durchmischt. Die sich ergebenden Lösungen wurden colorimetrisch in 96-Well-Schalen dreifach bei 546 nm einer Probe unterzogen. Optische Absorbanzen bzw. Dichten wurden in Konzentrationen von Harnstoff mittels einer Standardkurve umgewandelt, und die Daten als pro Vorrichtung pro Tag erzeugte Harnstoffmenge ausgedrückt, indem Konzentrationen mit dem Volumen des Mediums 11 in der Vorrichtung multipliziert und durch die Anzahl von Tagen seit Beginn der Probenahme geteilt wurden.
Bei dieser Probeanordnung entsprechen hohe Harnstoffbildungsraten den erwarteten hohen Niveaus einer Deaminierung und einer Beseitigung von Ammoniak, was klinisch erwünschte Zielfunktionen sind. Je höher die Rate synthetisierten Harnstoffs ist, umso stärker ist das erwartete Deaminierungsniveau.
Beispiel 7: Synthese und Sekretion von hepatozellulären Proteinen basierend auf einer Sekretion von Albumin
Die Synthese und Sekretion von Serumproteinen, wie z. B. Albumin, wird für ein kritische Funktion von Hepatozyten in vivo und bei einer LAD gehalten. Albumin wird als Markierer der Sekretaktivität von Hepatozyten benutzt. Die Sekretion von Albumin wurde mittels eines standardmäßigen kompetitiven ELISA mit Proben für die Vorrichtung 1 der Beispiele 1 und 2 gemessen. Die Proben wurde periodisch nach Impfen der Zellen 40 in den Vorrichtungen 1 gesammelt und bis zur Analyse durch ELISA eingefroren. Für ELISAs wurden einzelne Wells in 96-Well-Platten über Nacht mit 200 μg/mL Schweine-Albumin beschichtet (Accurate Chemical, Westburg, NY). Im Gefolge eines Waschschritts mit Tween 20 (Pierce, Rockford, IL) wurden 50 μL einer Probe oder Standard (Accurate) in einzelnen Wells einer Multiwell-Platte mit einem Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Schwein-Albumin-Antikörper (Bethyl Labs, Montgomery, TX) 90 Minuten lang inkubiert. Farbe wurde durch Zusetzen von O-Phenylenediamin-Dihydrochlorid (Pierce) erzeugt, und die Reaktion durch Beigabe von H₂SO₄ gestoppt. Die optische Absorptionsfähigkeit einzelner Wells wurde bei 490 nm mittels eines Molecular Devices SprectraMax 250-Plattenlesers mit SoftMax-Pro-Software gemessen und in die Konzentration von Albumin in der ursprünglichen Probe mittels einer Standardkurve umgewandelt. Die Daten wurden als pro Vorrichtung pro Tag erzeugte Albumin-Menge durch Multiplizieren der Konzentrationen mit dem Volumen des Mediums in der Vorrichtung und Dividieren durch die Anzahl der Tage seit Beginn der Probe ausgedrückt.
Bei dieser Probeanordnung sind höhere Raten einer Albumin-Sekretion Hinweise für eine klinisch erwünschte Funktion durch differenzierte Hepatozyten.
Beispiel 8: Bestimmung einer anhaftenden Zellmasse basierend auf einer Messung des gesamten hepatozellulären Proteins
Die Hepatozyten-Zellmasse und deren Anhaften wurde für die Vorrichtung 1 der Beispiele 1 und 2, basierend auf der Menge von damit verbundenem Protein mittels eines BCA-Protein-Probesatzes (Pierce, Katalognr. 23225) bestimmt. Probereagensien wurden entsprechend den hier enthaltenen Instruktionen zubereitet. Das Reagens A wurde als 1 L eines basischen Reagens mit Natriumcarbonat, Natriumbicarobonat, BCA-Erfassungsreagens und Natriumtartrat in 0,2 N NaOH zubereitet. Das Reagens B wurde als 25 mL von 4% Kupfersulfatlösung zubereitet. Rinderserum-Albumin (BAS, Pierce, Katalognr. 23209) wurde als Standard mit 2 mg/mL in 9,9% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid verwendet.
Die Vorrichtungen 1 wurden aus dem Inkubator entfernt, die Kappen 110 abgenommen und das Medium 11 aus den Kulturen angesaugt. Das Medium wurde durch gepufferte Phosphatsalzlösung (PBS) ersetzt und die Kulturen bei 0°C 24 Stunden lang eingefroren. Die Kulturen wurden dann aufgetaut und von den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen 30 in angemessen etikettierte Teströhrchen abgeschabt.
Eine Lösung von Arbeitsreagens wurde durch Kombinieren von 50 Teilen von Reagens A mit 1 Teil Reagens B zubereitet. Ein Satz von Protein-Standards wurde durch serielles Diluiieren von 0 bis 2 mg/mL der Grund-BSA-Lösung in dem gleichen Diluierungsmittel zubereitet. Als nächstes wurden 10 μL jeder Probe oder jeder Standards und 200 mL des Arbeitsreagens sequentiell den einzelnen Wells der 96-Well-Platten hinzugefügt. Die Proben wurden 20 Sekunden lang durch sanftes Schütteln gemischt, bevor sie abgedeckt und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert wurden. Die Wells wurden dann mit 560 nm colorimetrisch ausgewertet. Proteinkonzentrationen für Unbekannte wurden aus einer Standardkurve bestimmt.
Beispiel 9: Vergleich von alternativen gasdurchlässigen Membranen für Hepatozyten in Zellkultivierungsvorrichtungen
Die Vorrichtung von Beispiel 1 wurde dazu benutzt, das Potential verschiedener gasdurchlässiger, flüssigkeitsundurchlässiger Membranen als Träger für Hepatozyten in der Kultur einzuschätzen. Hepatozyten verlieren ihre Funktionalität, wenn sie nicht nach der Isolierung von einem Spender auf einen festen Träger geimpft werden. Ferner kann das Niveau ihrer Funktion, das in der Kultur erreichen, kritisch von den Eigenschaften des Kulturträgers abhängen, beispielsweise ob er mit einer Schicht oder mit einem Gel von Collagen oder mit Substanzen beschichtet ist, welche ein Anhaften und die Funktion fördern.
Die bewerteten Membranen umfassten Polyflex^® (eine nicht-poröse 0,002''-dicke Schicht aus Polystyrol, hergestellt von Plastics Suppliers, Inc., Columbus, OH), Breathe-Easy^TM (eine nicht-poröse Schicht aus Polyurethan, hergestellt durch Diversified Biotech, Boston, MA), eine dreischichtige co extrudierte Schicht aus Styrol-Butadien-Styrol/Ethylphenylacetat/Styrol-Butadien-Styrol (SBS/EVA/SBS, ein nicht-poröser Film, geliefert von BASF, Deutschland an Baxter Healthcare Corporation, Nivelles, Belgien), ein zweischichtiger co-extrudierter Film von Styrol-Butadien-Styrol/Polyethylen (SBS/PE, hergestellt von Cypress Cryovac/Sealed Air Corp., Rochester, NY), eine nicht-poröse Polyesterlage (hergestellt von Perfecseal Inc., Philadelphia, PA), HDPE in der Form von TYVEK^® 1073 (eine mikroporöse nicht-gewebte Membran, bestehend aus USP Class VI Polyolefin und hergestellt von E.I. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, DE), eine mikroporöse Polyethylen-(PE)Lage (erhältlich von 3M, Inc., Minneapolis, MN) mit einer mittleren Porengröße von 1,7 μm, bestimmt durch einen Blasenpunkt-Test), PolySep^® (eine mikroporöse Polypropylen-Lage, hergestellt von Micron Separations, Westborough, MA), mikroporöses Poly(tetrafluorethylen) (PTFE) und Hydrulon^® (mikroporöses, hydrophob gemachtes Nylon 6,6) (beide hergestellt von Pall Corporation, Port Washington, NY), sowie Polycarbonat mit eingeätzten Spuren, hergestellt von Micron Separations). Membranen mit zwei unterschiedlichen Porengrößen wurden für das mikroporöse PTFE, Hydrulon und Polycarbonat mit eingeätzten Spuren überprüft.
Jede der getesteten Membranen hatte erwartungsgemäß eine ausreichende Permeabilität gegenüber Sauerstoff und Kohlendioxid, um eine direkte Transmembran-Sauerstoffversorgung von anhaftenden Hepatozyten zu unterstützen. Ferner nahm man bei jeder dieser Membranen an, dass sie wasserundurchlässig für die Druckunterschiede über der Membran waren, die für eine Sauerstoffversorgung und Perfusion in einer Zellkultivierungsvorrichtung oder in einem Organ-Stützsystem zu erwarten sind.

Jede dieser Membranen wurde ohne Beschichtung mit Collagen vom Typ I vor dem Impfen von Zellen bei einer Dichte von 2 × 10⁶ Hepatozyten pro Vorrichtung ausgewertet. Eine Zufuhr von mit Sauerstoff angereichertem Fluid mit 19% O₂, 10% CO₂ und N₂ als Ausgleich wurde eingesetzt. Daten für eine Entgiftungsaktivität durch Verfahren der Umwandlung von Alkoxyresorufin in Resorufin (Beispiel 3) für Zellen von einem Spender 54 (Polyurethan, PTFE und hydrophobiertes Nylon), einem Spender 61 (HDPE), einem Spender 76 (Polycarbonat mit eingeätzten Spuren), einem Spender 80 (SBS/EVA/SBS, PS/PE und PE), einem Spender 85 (Polyester) und einem Spender 89 (Polystyrol) am Tag 1 nach dem Impfvorgang sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Entgiftungsaktivität für Hepatozyten in statischen Kulturen bei Zellkultivierungsvorrichtungen für verschiedene gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membranen

Gasdurchlässige Membran		Entgiftungsaktivität
Material (Quelle)	Porengröße	BROD	EROD
Polystyrol (Polyflex®, Plastics Suppliers)	nicht-porös	1,44	1,11
Polyurethan (Breate Easy^TM, Diversified Biotech)	nicht-porös	0,33	0,84
SBS/EVA/SBS (BASF)	nicht-porös	-	0,65
Co-extrudiertes Polyethylen/Polystyrol(Cryovac)	nicht-porös	-	0,72
Polyester (Perfecseal)	nicht-porös	1,10	1,68
HDPE (TYVEK^® 1073, Dupont)	4,2 μm	0,22	0,81
Polyethylen (3M)	< 10 μm	0,77	0,95
Polypropylen PolySep^®, Micron Separations)	0,45 μm	0,48	0,74
PTFE (Pall)	0,1 μm	0,38	0,87
PTFE (Pall)	1 μm	0,47	0,93
Gasdurchlässige Membran		Entgiftungsaktivität
Material (Quelle)	Porengröße	BROD	EROD
hydrophobiertes Nylon 6,6 (Hydrulon^®, Pall)	0,2 μm	0,35	1,38
Polycarbonat mit eingeätzten Spuren (Micron Separations)	0,1 μm	0,45	0,91
Polycarbonat mit eingeätzten Spuren (Micron Separations)	1 μm	0,24	0,48

Höchste Niveaus einer Entwicklungsaktivität für die Biotransformation von BROD in Resorufin wurden für Zellen beobachtet, die in Vorrichtungen mit Polyflex^® oder der Polyester-Membran kultiviert wurden. Die mikroporöse Polyethylen-Membran unterstützte mittlere Niveaus einer Entgiftungsaktivität bei der Umwandlung von BROD in der mit Zellen geimpften Vorrichtung 1. Höchste Niveaus einer Entgiftungsaktivität für die Biotransformation von EROD in Resorufin wurden für Zellen beobachtet, die in Vorrichtungen kultiviert wurden, welche Polyflex^®, die Polyester-Membran oder Hydrulon^® aufwiesen. Eine zunehmende Porengröße minderte die Entgiftungsaktivität für beide Alkoxyresorufine auf Polycarbonat mit eingeätzten Spuren, hatte aber relativ geringe Auswirkungen für mikroporöses PTFE und hydrophobiertes Nylon 6,6. Im allgemein hing eine Entgiftungsaktivität bei BROD stärker von dem Membrantyp ab als bei EROD. Ferner wurden die höchsten Gesamt-Entgiftungsaktivitäten bei mit Zellen geimpften Vorrichtungen beobachtet, welche nicht-poröses Polystyrol oder Polyester aufwiesen.
Diese Ergebnisse zeigen, wie eine Veränderung der chemischen Zusammensetzung und der physikalischen Struktur einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 die Fähigkeit von in einer Vorrichtung 1 kultivierten Hepatozyten 40 zur Entgiftung beeinflussen können.
Die Vorrichtung des Beispiels 1 wurde auch dazu benutzt, das Ureagenese-Potential von Hepatozyten, die in einer Vorrichtung 1 mit Polyflex^® kultiviert wurden, gegenüber Hepatozyten 40, die in äquivalent dimensionierten Gewebekulturschalen von 60 mm Durchmesser kultiviert wurden, zu vergleichen. Die Gewebekulturschalten präsentieren Zellen einer Oberfläche, die effektiv undurchlässig gegenüber Gas ist, einschließlich Sauerstoff, in Bezug auf Polyflex^®:
Polyflex^® hat eine Permeabilität gegenüber Sauerstoff von der Größenordnung von 2,0 × 10⁴ mL/m²-Tag-atm, wogegen die Durchlässigkeit gegenüber Sauerstoff von Gewebekulturschalen unter der Fähigkeit von Messtechniken aus dem Stand der Technik liegt.
Für diese Untersuchung wurden 2 × 10⁶ Hepatozyten von einem Spender 93 in eine Vorrichtung 1 mit Polyflex^® oder in eine Gewebekulturschale geimpft. Die Vorrichtung wurde mit einer Gaszufuhr von 10% O₂, 10% CO₂ und N₂ zum Ausgleich versorgt. Daten für die Synthese von Harnstoff hinsichtlich des basalen Pegels (offene Symbole, basierend auf Beispiel 6, Verfahren 2, ohne Zugabe von exogenem Ammonium und Ornithin) und in Reaktion auf eine Beaufschlagung von 20 mM exogenem Ammonium (geschlossene Symbole, basierend auf Beispiel 6, Verfahren 2, mit Zugabe von exogenem Ammonium und Ornithin) sind in 11 für Vorrichtungen (Quadrate) und Gewebekulturschalen (Kreise) dargestellt. Die Basalpegel einer Synthese von Harnstoff für Vorrichtungen über den Verlauf von 11 Tagen einer Kultivierung ist nicht unterscheidbar von dem Basalpegel für Hepatozyten, die in Gewebekulturschalen über diesen Zeitraum gehalten werden. Ferner ist die Harnstoffsynthese in Reaktion auf eine Beaufschlagung mit Ammoniak gleich oder größer in den Vorrichtungen als in den Gewebekulturschalen. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur höhere Entgiftungsniveaus bei einer Kultivierung von Hepatozyten auf einer gasdurchlässigen Membran, wie Polyflex^®, erreicht werden können, sondern auch eine Ureagenese, insbesondere in Reaktion auf exogenes Ammonium, durch Kultivieren von auf einer gasdurchlässigen Membran in einer Vorrichtung haftenden Hepatozyten verbessert werden kann.
Beispiel 10: Wirkung einer Oberflächenbehandlung von gasdurchlässigen Membranen auf Hepatozyten in Zellkultivierungsvorrichtungen
Die Wirkung einer Modifikation der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen 30 wurde auch mittels der Vorrichtung von Beispiel 1 ermittelt. Eine spezifische Modifikation (z. B. durch Beschichten oder kovalentes Anbringen spezifischer Moleküle) und eine nichtspezifische Modifikation (z. B. durch Behandeln der Oberfläche mit einer oxidierenden Chemikalie oder einem physikalischen Prozess) verändert die Zellhaftungseigenschaften von Oberflächen und die Fähigkeit dieser Oberflächen, eine Zellfunktion zu fördern. Die Behandlungen modifizieren nur die Oberfläche der zelltragenden Membran und nicht die Masse-Eigenschaften der Membran.
Wir ermittelten die Wirkungen von zwei unabhängigen Behandlungen 41, die vor der Impfung mit Zellen 40 angewandt wurden, um die Funktion von auf gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen 30 in einer Vorrichtung 1 kultivierten Hepatozyten zu steuern. Eine Behandlung umfasste das Beschichten der Oberfläche der Membran mit einer sterilen Lösung von 1,1 mg/mL Collagen Typ I über 45 Minuten, gefolgt von einer Durchspülung mit einer sterilen, phosphatgepufferten Salzlösung. Die resultierende Beschichtung war in der Größenordnung von einem bis einigen Molekülen Collagen dick. Die Art der Behandlung verbessert die Haftung vieler Arten von Zellen an vielen andernfalls weniger haftfähigen Oberflächen. Die zweite Behandlung umfasste das Aussetzen der zelltragenden Seite der Membranen gegenüber einer Corona-Entladung, um diese Oberfläche zu oxidieren. Die Behandlung von Polystyrol-Schalen mit einer Corona-Behandlung oxidiert die zelltragende Oberfläche, so dass der Dyne-Pegel (kritische Oberflächenspannung) 40–50 dyne/cm beträgt und eine Zellhaften für vielen Zelltypen fördert. Diese Behandlung modifiziert nur eine dünne, oberflächennahe Schicht der Oberfläche mit einer Dicke von weniger als etwa 1 Mikron, ohne die Dicke der Membran zu erhöhen und makroskopische Materialmengen auf der Membran abzulagern. Diese Behandlung wurde sowohl an den nicht-porösen Polyflex^® (Polystyrol)-Membranen als auch an porösen TYVEK^® 1073 (nicht-gewebtes HDPE)-Membranen vorgenommen, so dass ihre Dyne-Pegel (kritische Oberflächenspannungen) etwa 45 dyne/cm betrugen.

Tabelle 2 stellt Daten für die Entgiftungsaktivität durch Umwandlungsverfahren von Alkoxyresorufin zu Resorufin (Beispiel 3) für Zellen dar, die mit 2 × 10⁶ Hepatozyten pro Vorrichtung 1 geimpft wurden, und zwar von einem Spender 61 (HDPE), einem Spender 76 (Polycarbonat mit eingeätzten Spuren), einem Spender 80 (SBS/EVA/SBS, PS/PE und PE) sowie einem Spender 89 (Polystyrol) am Tag 1 nach dem Impfvorgang für Vorrichtungen, die mit 19% O₂, 10% CO₂ und N₂ als Ausgleich versorgt wurden. Änderungen in der Entgiftung in Reaktion auf eine Oberflächenbehandlung 41 hingen von Spezifizität der Entgiftung (BROD oder EROD) sowie vom Membranentyp ab. Für einige Membranen (z. B. HDPE und Polycarbonat mit eingeätzten Spuren mit Poren von 1 Mikron Durchmesser) verbesserte eine Beschichtung mit Collagen beide Spezifizitäten der Entgiftung. Für andere Membranen (z. B. Polystyrol, co-extrudiertes Polyethylen/Polystyrol, Polycarbonat mit eingeätzten Spuren mit Poren von 0,1 Mikron Durchmesser) verbesserte eine Beschichtung mit Collagen nur eine Spezifizität der Entgiftung, mit geringfügigen Änderungen bei der anderen Spezifizität. Bei den restlichen Membranen wurden kleinere Verringerungen der Entgiftungserscheinung bei einer Behandlung mit Collagen festgestellt. Tabelle 2 Wirkung einer Oberflächenbehandlung von gasdurchlässigen Membranen auf die Entgiftungsaktivität für Hepatozyten in statischen Kulturen in Zellkultivierungsvorrichtungen

Gasdurchlässige Membran			Resorufin-Aktivifinität
Material	Oberflächen behandlung		BROD	EROD
Material	mit Collagen beschichtet	Corona-Behandlung	BROD	EROD
Poystyrol	Nein	Nein	1,44	1,11
	Ja	Nein	2,04	0,94
	Nein	Ja	1,64	1,08
	Ja	Ja	1,51	1,60
SBS/EVA/SBS	Nein	Nein	-	0,65
SBS/EVA/SBS	Ja	Nein	-	0,45
Polyethylen/Polystyrol Co-extrudiertes	Nein	Nein	-	0,72
	Ja	Nein	-	0,79
	Nein	Nein	0,22	0,81
HDPE	Ja	Nein	0,32	0,99
HDPE	Nein	Ja	0,60	1,00
Polyethylen	Nein	Nein	0,77	0,95
Polyethylen	Ja	Nein	0,54	0,86
Polycarbonat (Poren von 0,1 μm)	Nein	Nein	0,45	0,91
Polycarbonat (Poren von 0,1 μm)	Ja	Nein	0,31	1,23
Polycarbonat (Poren von 1 μm)	Nein	Nein	0,24	0,48
Polycarbonat (Poren von 1 μm)	Ja	Nein	0,59	0,91

Eine Oberflächenbehandlung mit Corona-Entladung ohne Beschichtung mit Collagen verbesserte signifikant die Entgiftungsaktivität bei Polystyrol und auch bei HDPE. Eine sequentielle Behandlung durch Corona-Behandlung, gefolgt von einer Beschichtung mit Collagen, verbesserte die Gesamt-Entgiftungsaktivität von Polystyrol noch mehr. Die Kombination, wenn sie auf Polyflex^® angewandt wurde, ergab das System mit der größeren Entgiftungsaktivität.
Die Kultivierung von Hepatozyten in einer Vorrichtung 1 mit durch Corona-Entladung behandeltem, mit Collagen beschichtetem Polyflex^® unterstützte auch eine nachhaltige Entgiftungsaktivität im Verlauf der Evolution einer Kultur. Für diese Auswertungen wurde eine Entgiftungsaktivität basierend auf der Biotransformation von BROD und EROD (Beispiel 3) an den Tagen eins, drei und sieben nach dem Impfvorgang gemessen. Die Werte für BROD nahmen geringfügig (von 1,51 am Tag eins auf 1,47 am Tag drei und 1,20 am Tag sieben) ab, während die Werte für EROD vom Tag eins bis zum Tag drei zunahmen (von 1,60 auf 4,25), bevor sie am Tag sieben abnahmen (0,87). Alle diese Werte für die Entgiftungsaktivität waren höher als bei anderen Membranen.
Die Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit der Modifizierung von gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membranen 30 mit einer oder mehreren Oberflächenbehandlungen 41, bei denen nur die Oberfläche der den Zellen 40 ausgesetzten Membran (und nicht die Gasdurchlässigkeit der Membran) modifiziert wird, um erwünschte Zunahmen bei der Hepatozyten-Funktion in einer Zellkultivierungsvorrichtung 1 zu erreichen.
Beispiel 11: Wirkung einer Sauerstoffanreicherung bei Hepatozyten in nicht-durchspülten Zellkultivierungsvorrichtungen
Die Vorrichtung von Beispiel 1 wurde dazu verwendet, die Wirkung von verschiedenen Gaszusammensetzungen auf die Funktionen statischer Hepatozyten-Kulturen zu vergleichen. Der Teildruck von Sauerstoff, dem Zellen und insbesondere Hepatozyten ausgesetzt sind, kann ihre Funktion signifikant beeinflussen. Eine direkte Transmembran-Sauerstoffversorgung von anhaftenden Zellen kann in der Vorrichtung 1 durch Einspeisen eines Gases mit einer gewünschten Konzentration von Sauerstoff auf eine Seite einer gasdurchlässigen Membran und durch Kultivieren von Zellen auf der gegenüberliegenden Seite erreicht werden. Diese Art einer Sauerstoffanreicherung bietet einen geringeren Widerstand gegenüber dem Transport von Sauerstoff zu den Zellen im Vergleich zu einer Sauerstoffversorgung durch Sättigung eines Mediums mit Sauerstoff. Ferner entkoppelt eine direkte Transmembran-Sauerstoffversorgung wirksam die Sauerstoffversorgung und die Perfusion der Zellen.
Für dieses Beispiel wurde eine Sauerstoffversorgung anhaftender Hepatozyten in statischen Kulturen durch Einstellen der Konzentration von Sauerstoff in dem der Vorrichtung 1 zugeführten Gas und Kontaktnahme mit der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen, zelttragenden Membran 30 gesteuert. Zwei verschiedene Membranen wurden geprüft: eine durch Corona-Entladung behandelte, mit Collagen beschichtete Polystyrol(Polyflex^®)-Membran und eine unbeschichtete, nicht-gewebte HDPE(TYVEK^® 1073)-Membran. Die getesteten Gaszusammensetzungen umfassten 10% CO₂ mit 0%, 19%, 40%, 60%, 65% oder 90% O₂ und N₂ zum Ausgleich. Kohlendioxid wurde mit einbezogen, um einen physiologischen pH basierend auf der Anwendung eines Standard-Puffers auf Bicarbonat-Basis aufrechtzuerhalten.
Die 12a–d zeigen Daten für die Anbringung von Zellen einen Tag nach dem Impfvorgang (Beispiel 6) für eine Ureagenese (Beispiel 5) für eine Entgiftungsaktivität, basierend auf einer Biotransformation von Alkoxyresorufinen (Beispiel 3) und für eine Entgiftungsaktivität basierend auf dem Metabolismus von Lidocain (Beispiel 5) für Hepatozyten 40, die statisch in Vorrichtungen 1 kultiviert wurden, welche 0,002''-dickes, Corona-behandeltes, collagenbeschichtetes Polystyrol enthielten. Daten wurden für 2 × 10⁶ Hepatozyten erhalten, die von den Spendern 100 und 101 geimpft wurden, und wurden in Bezug auf Vorrichtungen ausgedrückt, die mit 19% O₂ gespeist wurden. Das Anhaften einen Tag nach dem Impfvorgang (12a), gemessen als die Menge von Gesamtprotein in Zusammenhang mit den anhaftenden Zellen, verdoppelte sich mit einer Zunahme der Konzentration von O₂ in dem Speisegas auf 60%.
Daten für die Harnstoffsynthese sind hinsichtlich des basalen Pegels (offene Symbole) und hinsichtlich der Reaktion auf eine Beaufschlagung mit 20 mM exogenem Ammoniak (geschlossene Symbole) in 12b für Vorrichtungen 1 am Tag zwei (Quadrate) und fünf (Kreise) nach dem Impfvorgang dargestellt. Basalpegel sind relativ unabhängig von der Konzentration von O₂ in dem Speisegas. Umgekehrt erhöhten sich die Beaufschlagungsraten bei einer Harnstoffsynthese mit einer Konzentration von O₂ am Tag zwei nach dem Impfvorgang, nahmen aber mit einer Konzentration von O₂ am Tag fünf nach dem Impfvorgang ab.
Daten für eine Entgiftungsaktivität basierend auf der Umwandlung von BROD (Quadrate) und EROD (Kreise) zu Resorufin sind in 12c für den Tag eins (geschlossene Symbole) und vier (offene Symbole) nach dem Impfvorgang dargestellt. Am Tag eins nach dem Impfvorgang wurden die größten Entgiftungsaktivitäten für eine mittlere Konzentration von O₂ von 40% beobachtet. Am Tag vier nach dem Impfvorgang war eine Entgiftungsaktivität für BROD unabhängig von der O₂-Konzentration, aber eine Entgiftungsaktivität für EROD nahm monoton mit der O₂-Konzentration an diesem Tag der Kultivierung ab.
Komplementäre Trends wurden für die Mengen an Metaboliten von Lidocain beobachtet (12d). Am Tag zwei nach dem Impfvorgang (geschlossene Quadrate) stieg die Metaboliten-Menge geringfügig mit zunehmender O₂-Konzentration an, aber am Tag fünf nach dem Impfvorgang (geschlossene Kreise) fiel die Metaboliten-Menge für Lidocain bei einer zunehmenden O₂-Konzentration stark ab.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Steuerung der Konzentration von einer Vorrichtung 1, die durch Corona-Entladung behandeltes, mit Collagen beschichtetes Polyflex^® enthielt, eingespeistem Sauerstoff, wodurch das Ausmaß der Sauerstoffversorgung statischer Kulturen der Hepatozyten 40 gesteuert wurde, dazu eingesetzt werden kann, einen breiten Bereich von Funktionen von Hepatozyten zu steuern. Ferner können durch Auswahl der Konzentration von Sauerstoff und dessen Variierung über verschiedene Tage in der Kultur verschiedene Funktionen entweder gefördert oder heruntergeregelt werden.
Ähnliche Datentypen wurden für Hepatozyten 40 erhalten, die statisch in Vorrichtungen 1, die TYVEK^® 1073 als gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran (Zellträger) 30 enthielten, kultiviert wurden. Hepatozyten in diesem System wurden mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Vorrichtung geimpft und hinsichtlich der Auswirkung einer Sauerstoffanreicherung oder ihrer Entgiftungsaktivität durch Umwandlungsverfahren von Alkoxyresorufin zu Resorufin (Beispiel 3) am Tag eins nach dem Impfvorgang für Zellen von einem Spender 73 ausgewertet, und eine Beseitigung von Diazepam (Beispiel 4) an den Tagen 2 und 4 nach dem Impfvorgang für Zellen von einem Spender 78, eine Ureagenese basierend auf Basalpegel einer Harnstoffsynthese (Beispiel 5) für den Tag 3 nach dem Impfvorgang für Zellen von einem Spender 76, sowie eine Synthese und Sekretion von Albumin (Beispiel 6) für Zellen von einem Spender 74 evaluiert. Für diese Schalen wurden Daten aus verschiedenen Schweinespendern gesammelt und 13 und den Tabellen 3 und 4 zusammengefasst.

13 zeigt, dass die stärksten Entgiftungsaktivitäten für BROD (geschlossene Quadrate) und EROD (offene Quadrate) für eine Transmembran-Sauerstoffversorgung mit 65% O₂ beobachtet wurden. Ein Ausgesetztsein gegenüber höheren oder niedrigeren Konzentrationen von O₂ ergaben eine schwächere Entgiftungsaktivität: ein Ausgesetztsein gegenüber 0% O₂ erstickte die Zellen, ein Ausgesetztsein gegenüber 19% und 40% O₂ war begrenzend für die Entgiftungsaktivität, und ein Ausgesetztsein gegenüber 90% O₂ war hypertoxisch und zellschädigend. Auf ähnliche Weise zeigt Tabelle 3, dass bei einer Zunahme der Sauerstoffversorgung von 19% auf 40% höhere Prozentsätze von Diazepam abgeführt wurden und zu Nordiazepam und Temazepan metabolisierten. Tabelle 4 Sekretion von Albumin für Hepatozyten in statischen Kulturen bei Zellkultivierungsvorrichtungen als Funktion der Sauerstoffversorgung

% O₂ in Vorrichtung Speisegas	Albumin-Sekretionsrate (μg/Tag)
	Tag 3 nach Impfung	Tag 6 nach Impfung	Tag 8 nach Impfung	Tag 10 nach Impfung
19	0,186	0,342	2,699	3,443
40	0,076	0,075	0,227	0,254
65	0,063	0,052	0,082	0,082
90	0,055	0,023	2,98	0,567

Beispiel 12: Wirkung einer Perfusion bei Hepatozyten in Zellkultivierungsvorrichtungen
Die Anordnung von Beispiel 2 wurde verwendet, um die Wirkung einer Perfusion von Hepatozyten-Kulturen mit verschiedenen volumetrischen Strömungsraten in labormäßigen Vorrichtungen mit durch Corona-Entladung behandeltem, mit Collagen beschichtetem Polyflex^® zu vergleichen. Die Vorrichtungen 1 wurden mit 2 × 10⁶ Hepatozyten von einem Spender 96 geimpft, geladen mit 10 mL vollständigen Mediums als Perfusat, und mit Gas gespeist, das 19% O₂, 10% CO₂ und N₂ zum Ausgleich enthielt. 14 stellt Daten für beide basale Pegel einer Harnstoffsynthese (offene Symbole) sowie Raten einer Harnstoffsynthese in Reaktion auf eine Beaufschlagung mit 20 mM exogenem Ammoniak (geschlossene Symbole) für Vorrichtungen dar, die mit 1,5 mL/min (Quadrate) sowie mit 0,1 mL/min (Kreise) durchspült wurden. Daten sind als Prozentsätze einer statischen Kontrolle ausgedrückt. Relative Zunahmen bei der Synthese von Harnstoff, von denen erwartet wurde, dass sie eine stärkere Deaminierung reflektieren, wurden an beinahe jedem Tag in der sowohl hinsichtlich der volumetrischen Strömungsraten als auch der basalen und mit Ammoniak beaufschlagten Harnstoffpegel untersuchten Kultur beobachtet. Es wurde keine der volumetrischen Strömungsraten für eine größere basale und (mit Ammoniak) provozierte Ureagenese bevorzugt. Daten für Vorrichtungen, die mit 4 × 10⁶ Hepatozyten von Spendern 108 und 109 geimpft wurden, arbeiteten unter ähnlichen Bedingungen, aber mit höheren volumetrischen Strömungsraten von bis zu 12 mL/min, zeigten aber auch keine Wirkung der Strömungsrate auf eine Ureagenese. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Vorrichtungen 1 erfolgreich mit einem Bereich volumetrischer Strömungsraten betrieben werden können, ohne nachteilige Auswirkungen auf die Hepatozyt-Funktion zu haben.
Die Vorrichtung von Beispiel 2 wurde auch dazu verwendet, die Wirkung der Perfusion von Hepatozyten-Kulturen mit einer konstanten volumetrischen Strömungsrate, aber mit unterschiedlichen Volumen von Perfusat, auf das Zellwachstum und auf eine Ureagenese in Vorrichtungen zu vergleichen, die durch Corona-Entladung behandeltes, mit Collagen beschichtetes Polyflex^® aufwiesen.

Für Untersuchungen des Zellwachstums und der Ureagenese wurde die Vorrichtungen 1 mit 2 × 10⁶ Hepatozyten von einem Spender 96 geimpft, in Perusionskreisläufe mit 10 mL eines vollständigen Mediums als Perfusat geladen und mit Gas gespeist, das 19% O₂, 10% CO₂ und N₂ zum Ausgleich enthielt. Die Tabelle 5 stellt Daten für das Zellwachstum dar, gemessen als Zellmasse, durch Bestimmung des Gesamt-Proteins in Zusammenhang mit anhaftenden Hepatozyten für bedeckte und mit Kappen versehene Vorrichtungen. Daten für die Zelldichte werden als Prozentsatz der beobachteten Zellmasse für Kulturen in Gewebekulturschalen ausgedrückt. Die statische bedeckte Vorrichtung und die mit Kappen versehene Vorrichtung, durchspült mit 0,1 mL/min, zeigen Zunahmen in der Zellmasse im Vergleich zu Gewebekulturschalen am Tag drei nach der Impfung. Alle Konfigurationen zeigen erhebliche Zunahmen der Zellmasse am Tag neun nach dem Impfvorgang. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Perfusion das Wachstum der Kulturen nicht beeinträchtigt. Tabelle 5 Wirkung der Vorrichtungskonfiguration und der Perfusion auf das Wachstum von Hepatozyten in Zellkultivierungsvorrichtungen

System			Zelldichte (%-TC Steuerung)
Konfiguration	Volume (mL)	Perfusionsrate (mL/min)	Tag 3	Tag 9
Vorrichtung 1 mit Abdeckung 100	4	statisch	189	706
Vorrichtung 1 mit Kappe 10	3	statisch	79	774
Vorrichtung 1 mit Kappe 100	10	0,1	127	933
Vorrichtung 1 mit Kappe 110	10	1,5	91	706

15 stellt Daten für Basalpegel einer Harnstoffsynthese für einzelne Vorrichtungen dar, die mit 1,5 mL/min mit 10 mL (Quadrate) oder 20 mL (Kreise) von Perfusat durchspült werden. Die Daten werden wieder als Prozentsätze von statischen Steuerungen ausgedrückt. Relativzunahmen in der basalen Harnstoffsynthese, von denen erwartet wurde, dass sie eine größere Deaminierung reflektieren, wurden an jedem Tag in der untersuchten Kultur für alle drei Systeme beobachtet. Größere Relativzunahmen wurden für Vorrichtungen beobachtet, die mit 20 mL statt mit 10 mL durchspült wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Steuerung des Perfusatvolumens ein wirksames Mittel sein kann, um eine Hepatozyt-Funktion und insbesondere eine Ureagenese zu steuern.
Die Vorrichtung von Beispiel 2 wurde ferner dazu verwendet, die Wirkung einer Perfusion von Hepatozyten- Kulturen mit 1,5 mL/min mit unterschiedlichen Perfusat-Volumen in Vorrichtungen 1 zu vergleichen, die TYVEK^® 1073 als die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran/Zellkulturträger 30 aufwiesen. Bei diesen Untersuchungen wurden die Vorrichtungen mit 2 × 10⁶ Hepatozyten geimpft, geladen entweder mit 10 oder 20 mL vollständigen Mediums als Perfusat, und es wurde Gas mit 40% O₂, 10% CO₂ und N₂ zum Ausgleich zugeführt. Die Hepatozyten wurden hinsichtlich der Harnstoffsynthese (Beispiel 6, Verfahren 1) und der Synthese und Sekretion von Albumin (Beispiel 7) für Zellen von einem Spender 75 für die Tage 1–13 nach dem Impfvorgang ausgewertet. Die Daten sind in den 16a und 16b dargestellt.
Für fast alle überprüften Zeitpunkte war die Harnstoffsynthese und die Sekretion von Albumin größer bei 20 mL Perfusat als bei 10 mL Perfusat. Diese Ergebnisse zeigen, dass höhere Pegel von Ureagenese und Albumin-Sekretion mittels einer Perfusion und einer Erhöhung des Perfusat-Volumens erzielt werden können. Dieses Beispiel zeigt die Nützlichkeit einer Perfusion bei einer direkten Transmembran-Sauerstoffversorgung für eine verbesserte Funktion.
Beispiel 13: Wirkung einer Zellimpfdichte bei Hepatozyten in durchspülten Zellkultivierungsvorrichtungen
Die wirtschaftliche Effizienz, die Praktizierbarkeit und Nützlichkeit einer Zellkultivierungsvorrichtung kann durch die Dichte der Zellen, die in der Vorrichtung unterstützt werden können, beeinflusst werden: eine Unterstützung größerer Zelldichten ist häufig mit geringeren Kosten verbunden, sowie mit dem Potential, kleinere Vorrichtungen und Einheiten aufzubauen. Ferner ist typischerweise erwünscht, dass Zunahmen der Zelldichte keinen erheblichen Funktionsverlust auf einer Pro-Zell-Basis ergeben.
Um diese Probleme anzugehen, wurde die Vorrichtung von Beispiel 2 auch dazu eingesetzt, die Wirkung einer Perfusion von Hepatozyten-Kulturen zu vergleichen, die mit unterschiedlichen Anfangszelldichten bei einer Ureagenese in Vorrichtungen geimpft wurden, die ein durch Corona-Entladung behandeltes, mit Collagen beschichtetes Polyflex^® aufwiesen.
Die Vorrichtungen 1 wurden entweder mit 4 × 10⁶, 8 × 10⁶ oder 12 × 10⁶ Hepatozyten 40 von einem Spender 109 geimpft, in Perfusions-Kreisläufe mit 10 mL eines vollständigen Mediums als Perfusat 11 geladen, mit Gas 4, das 19% O₂, 10% CO₂ und zum Ausgleich N₂ enthielt, gespeist, und vom Tag 1 bis zum Tag 2 der Kultivierung mit 1,5 mL/min durchspült. Eine Ureagenese wurde basierend auf dem Verfahren 2 des Beispiels 6 bestimmt. Die Tabelle 6 zeigt, dass die Harnstoffsyntheserate annähernd linear mit der anfänglichen Saatdichte bzw. Impfdichte zunahm; die Rate der Ureagenese pro geimpfter Zelle variierte von 98 auf 106 und auf 85 bei Erhöhung der Anzahl von geimpften Zellen pro Vorrichtung von 10 × 10⁶ auf 8 × 10⁶ auf 12 × 10⁶. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Erfindung eine lineare Skalierung der hepatozellulären Funktion mit der Zellenzahl ermöglicht. Tabelle 6 Ureagenese für Hepatozyten in durchspülten Zellkultivierungsvorrichtungen als Funktion der Zellimpfdichte

Pro Vorrichtung geimpfte Zellen Ureagenese

Total (μg/Vorr./Tag) Pro Zelle geimpft (pg/Zelle geimpft/Tag)

4 × 10⁶ 390 98

8 × 10⁶ 845 106

12 × 10⁶ 1019 85
Hinsichtlich der möglichen Nützlichkeit einer Manipulierung der Sauerstoffversorgung bei der Funktion einer höheren Dichte wurden durchspülte Kulturen auch mittels der Vorrichtung von Beispiel 2 überprüft. Die Vorrichtungen 1, die durch Corona-Entladung behandeltes, mit Collagen beschichtetes Polyflex^® aufwiesen, wurden entweder mit 4 × 10⁶ oder 8 × 10⁶ oder 12 × 10⁶ Hepatozyten 40 von Spendern 105, 109 und 110 geimpft, in Perfusionskreisläufe mit 10 mL eines vollständigen Mediums als Perfusat 11 geladen und mit Gas 4, das 10% CO₂ sowie zwischen 0 und 90% O₂ (und zum Ausgleich N₂) enthielt, gespeist und vom Tag 1 bis zum Tag 2 der Kultivierung mit 1,5 mL/min durchspült. Eine Ureagenese wurde wieder basierend auf dem Verfahren 2 des Beispiels 6 bestimmt. 17 stellt Daten für diese Untersuchungen dar, die als Steuerdaten mit einem Prozentsatz von 19% O₂ aufgetragen sind. Für Kulturen mit niedrigerer Dichte (z. B. geschlossene Quadrate für anfänglich geimpfte 4 × 10⁶ Zellen) war die Harnstoffsynthese in Reaktion auf eine Beaufschlagung mit 20 mL exogenem Ammoniak am größten unter Bedingungen der Reduktion einer Sauerstoffversorgung im Vergleich zu 19% O₂. Ferner minderte bei dieser niedrigen Dichte eine gesteigerte Sauerstoffversorgung die Ureagenese. Hingegen wurden bei Kulturen mit höheren Dichten (z. B. geschlossene Diamanten für 8 × 10⁶ Zellen und geschlossene Dreiecke für 12 × 10⁶ Zellen) die Rate der Ureagenese am größten für ein mittleres Maß der Sauerstoffversorgung mit 60% O₂.
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Manipulation der Sauerstoffversorgung als weiteres Mittel einer Steuerung der Performance und der Funktion von Hepatozyten verwendet werden kann, die in neuen Zellkultivierungsvorrichtungen unterstützt werden, und dass das optimale Niveau einer Sauerstoffversorgung von der Dichte der unterstützten Zellen abhängen kann.
Beispiel 14: Skalieren der Performance mit der Größe der Zellkultivierungsvorrichtung
Die wirtschaftliche Effizienz, die praktische Einsatzfähigkeit und die Nützlichkeit einer Zellkultivierungsvorrichtung kann ferner durch die Fähigkeit beeinflusst sein, die Gesamtgröße der Vorrichtung ohne Verlust der Flächenfunktion pro Einheit zu steigern. Beispielsweise wird typischerweise gewünscht, über das Zehnfache der Gesamtfunktion in einer Vorrichtung 1 zu verfügen, die mit zehn Mal so vielen Zellen geimpft ist, aber auch mit der zehnfachen projizierten Fläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30, so dass die Impfdichte der Zellen sich nicht ändert. Diese Notwendigkeit ist gegeben durch die Unfähigkeit, die Dichte der geimpften Zellen grenzenlos zu erhöhen, und zwar ohne Funktionsverlust auf einer Pro-Zell-Basis. Die vorliegende Erfindung ermöglicht mindestens zwei Verfahren für die Erhöhung der Vorrichtungsgröße ohne Funktionsverlust auf einer Pro-Flächen-Basis: Erhöhen der Größe einer einzelnen Einheit oder Koppeln mehrerer Einheiten miteinander parallel, in Reihe oder auf beide Weisen. Das erste Verfahren beinhaltet die Anwendung von Vorrichtungen mit Einheiten, die in der absoluten Größe größer sind, und das zweite Verfahren beinhaltet die Verwendung modularer Einheiten.
Die Machbarkeit einer Skalierung einer absoluten Vorrichtungsgröße mit einzelnen Einheiten wurde durch Vergleich der Leistung der Vorrichtung von Beispiel 2 mit einer größeren Version der Vorrichtung 1 unter der Verwendung des Perfusionskreislaufs von Beispiel 2 überprüft. Diese größere Vorrichtung ist schematisch in 18 dargestellt und wurde mit der fünffachen Größe der projizierten Fläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30 gegenüber der Vorrichtung von Beispiel 1 bemessen. Diese Bemessung ermöglichte dieser Vorrichtung, zur Behandlung von Ratten mit einem Leberschaden angewendet zu werden, woraus sich die "Ratten-Skala"-Vorrichtung im Unterschied zu der "Labor-Skala"-Vorrichtung, die in 4 dargestellt ist, ergab.
Die Ratten-Skala-Vorrichtung umfasste einen Satz Aluminiumteile mit oberen 60 und unteren 70 Gehäusen, einen Rahmen 35 und eine Kappe 110, zusätzlich zu der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 30, drei Silikondichtungen (Specialty Silicone Products, Inc., Balston Spa, NY) 85, 80 und 90, sowie zugehörige Schrauben und Fittings 120, 180, 181 und 210. Eine Membran-/Rahmen- Anordnung 400 wurde aufgebaut und durch Gammastrahlung sterilisiert, wie im Detail in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ratten-Skala-Vorrichtung 1 wurde auch für die Labor-Skala-Vorrichtung zusammengebaut und gehandhabt (einschließlich des Impfens von Zellen 40), wie im Detail in Beispiel 1 beschrieben ist, mit der folgenden Ausnahme: Die Ratten-Skala-Vorrichtung wurde mit Zellen geimpft, die in 33 mL Medium statt in 4 mL Medium suspendierten. Die Anzahl der Zellen in der Suspension wurde so eingestellt, dass die Impfdichten (pro Flächeneinheit) ähnlich für die zwei Skalen waren.

Für diese Untersuchung wurde eine Ureagenese in den Labor-Vorrichtungen und Ratten-Skalen-Vorrichtungen für Hepatozyten-Kulturen verglichen, die von einem Spender 101 erhalten wurden, durchspült mit 20 mL vollständigen Mediums 11 und unter ähnlichen hydrodynamischen Scherbelastungen für Tag 1 bis Tag 2 nach dem Impfvorgang. Beide Vorrichtungen wurden mit Gas 4 gespeist, das 19% O₂, 10% CO₂ und zum Ausgleich N₂ enthielt. Eine Ureagenese wurde basierend auf dem Verfahren 2 des Beispiels 6 bestimmt. Die Tabelle 7 zeigt, dass durch Einstellen bzw. Anpassen der Anzahl von bei jeder Vorrichtung geimpften Zellen ähnliche Zelldichten erhalten werden. Ferner betrug die Harnstoffsyntheserate etwa das Fünffache bei der Ratten-Skalen-Vorrichtung (mit annähernd fünf Mal so vielen Zellen) im Vergleich zu der Labor-Skalen-Vorrichtung, so dass die Rate der Ureagenese pro Flächeneinheit in den zwei Vorrichtungen ähnlich war. Tabelle 7 Skalieren der Ureagenese mit der Größe der Zellkultivierungsvorrichtung

Vorrichtungs skala	Fläche (cm²)	Geimpfte Zellen			Ureagenese
		Gesamt	Dichte (Zellen/cm²)	(μg/Tag)	(μg/cm²-Tag)
Labor	23	2,0 × 10⁶	8,7 × 10⁴	87	3,8
Ratte	100	9,6 × 10⁷	9,3 × 10⁴	450	4,3

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Erfindung eine lineare Skalierung der hepatozellulären Funktion mit der Größe der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran 309 ermöglicht.
Die Machbarkeit der Skalierung der Vorrichtungsgröße mit mehreren modularen Einheiten wurde durch Vergleichen der Leistung der Vorrichtung von Beispiel 2 mit einem modularen System ähnlich dieser Vorrichtung untersucht. 19 veranschaulicht die Konfiguration eines solchen modularen Systems, in dem zwei Vorrichtungen 1 parallel in einem einzigen Perfusionskreislauf angeordnet sind. Pumpen 230 treiben die beiden Vorrichtungen mit der gleichen volumetrischen Strömungsrate aus einem einzigen Behälter 220 an, so dass sich beide Vorrichtungen das gleiche Perfusatvolumen 11 teilen. Beide Vorrichtungen werden auch mit dem gleichen Gas 21 von der gleichen Quelle 4 versorgt.
Bei einem solchen System kann die Anzahl von Zellen, die zur Behandlung eines Perfusat angesetzt werden, erhöht werden, ohne die Zelldichte in dem System oder die Größe irgendeiner einzelnen Einheit zu ändern.

Für diese Untersuchung wurden die Vorrichtungen 1 mit 8 × 10⁶ Hepatozyten 40 von einem Spender 110 geimpft, die entweder als Einzelvorrichtungen oder als paarige parallele Vorrichtungen in Perfusionskreisläufen mit 20 mL vollständigen Mediums als Perfusat 11 geladen wurden und mit einem Gas 4 versorgt wurden, das 19% O₂, 10 CO₂ und N₂ zum Ausgleich enthielt. Eine Perfusion wurde so durchgeführt, dass jede Vorrichtung – ob einzeln oder parallel gepaart – 1,5 mL/min vollständigen Mediums mit 20 mM exogenem Ammoniak vom Tag 1 bis zum Tag 2 mit 1,5 mL/min aufnahm. Eine Ureagenese wurde basierend auf dem Verfahren 2 von Beispiel 6 bestimmt. Die Tabelle 8 zeigt, dass eine Verdoppelung der Anzahl der in das System A geimpfter Zellen bei einem Paar Vorrichtungen die Rate der Ureagenese für das System verdoppelt, so dass die Ureagenese-Rate pro Einheit konstant ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtfunktion des Systems linear mit der Anzahl der modularen Einheiten in dem System zunimmt, so dass eine Vergrößerung des Systems durch Hinzufügung von parallel betriebenen Vorrichtungen die Gesamtleistung des Systems erhöht. Tabelle 8 Skalieren der Ureagenese mit Modularität der Zellkultivierungsvorrichtung

Anzahl von Einheiten	Gesamtfläche (cm²)	Geimpfte Zellen			Ureagenese
		Gesamt	Dichte (Zellen/cm²)	(μg/Tag)	(μg/Einheit/Tag)
Einzeln	23	8,0 × 10⁶	3,5 × 10⁵	9,5 × 10²	9,5 × 10²
Paralles Paar	46	1,6 × 10⁷	3,5 × 10⁵	2,1 × 10³	1,0 × 10³

Claims

Verfahren zum Kultivieren von Hepatozyten, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran mit einer ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche, Ansetzen einer Kultur von Hepatozyten auf der ersten Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran, wobei die Hepatozyten direkt auf der Membran oder direkt auf einem Beschichtungsmaterial von Molekülstärke auf der Oberfläche der Membran angesetzt werden, in Kontakt bringen der Hepatozyten direkt mit einem Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium, Liefern eines mit Sauerstoff angereicherten Fluids zu der zweiten Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran mit einem ausreichenden Druck, um eine Transmembran-Sauerstoffversorgung zu den auf der ersten Oberfläche angesetzten Hepatozyten bereitzustellen, und Kultivieren der Hepatozyten unter Bedingungen, welche die Lebensfähigkeit und Funktion der Hepatozyten fördern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid enthaltene Sauerstoff auf oder über dem kritischen Partialdruck von Sauerstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten in einer mit zwei bis zwanzig Billionen Hepatozyten angesetzten Vorrichtung kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten Schweine-, Pferde-, Schaf-, Rinder-, Hasen-, Ratten-, Hunde-, Katzen- oder Mäuse-Hepatozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten Human-Hepatozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Kultur angesetzten Hepatozyten konservierte Hepatozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die konservierten Hepatozyten cryo-konservierte, hypothermisch gelagerte oder lyophilisierte Hepatozyten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Material der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran aus der aus Polystyrol, Polyolefin, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylinfluorid, Polycarbonat, hydrophob behandeltem Nylon, Polyurethan, Polyester, geschichtetem Styrol-Butadien-Styrol/Ethylvinylacetat/Styrol-Butadien-Styrol und geschichtetem Styrol-Butadien-Styrol/Polyethylen gebildeten Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran coronabehandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran mit einer Beschichtung von Molekülstärke aus Collagen beschichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zwischen etwa 0 Prozent bis etwa 90 Prozent bei einem Druck von 2 bis 5 psi beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereicherten Fluid zwischen etwa 19 Prozent bis etwa 60 Prozent bei einem Druck von 2 bis 5 psi beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereichertem Fluid zwischen etwa 40 Prozent bis etwa 60 Prozent bei einem Druck von 2 bis 5 psi beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Konzentration von Sauerstoff in dem mit Sauerstoff angereichertem Fluid so gesteuert wird, dass sie eine Zellfunktion fördert oder herunterreguliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nährstoff enthaltende Kulturmedium künstlich durchblutet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nährstoff enthaltende Kulturmedium Blutplasma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten über der gesamten Membran von oben her angesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hepatozyten direkt auf der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran angesetzt werden.
Durchfluss-Zellkultivierungs-Vorrichtung mit: einem Gehäuse mit einem Einlass für mit Sauerstoff angereichertem Fluid und einem Auslass für mit Sauerstoff angereichertem Fluid, einem Flüssigkeitseinlass und einem Flüssigkeitsauslass und ersten und zweiten Wänden, um eine Kammer zu bilden, einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran, die zwischen den ersten und zweiten Wänden angeordnet ist, um die Kammer in einen Bereich für mit Sauerstoff angereichertes Fluid mit einem Eingang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und einem Ausgang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und in einen Bereich für Flüssigkeit mit einem Flüssigkeitseingang und einem Flüssigkeitsausgang aufzuteilen, um einer flüssigkeitsdurchlässigen Membran, die zwischen einer Wand und der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran angeordnet ist, um den Bereich für Flüssigkeit in einen Zellbereich und einen Flüssigkeits-Perfusionsbereich zu unterteilen, wobei Hepatozyten direkt auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran oder direkt auf einem Beschichtungsmaterial von Molekülstärke auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran angesetzt werden bzw. sind, wobei der Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und der Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid so angeordnet sind, dass mit Sauerstoff angereichertes Fluid, das in den Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid eintritt, in den Eingang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und durch den Bereich für das mit Sauerstoff angereicherte Fluid strömt, und aus dem Bereich für das mit Sauerstoff angereicherte Fluid durch den Ausgang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und aus dem Gehäuse durch den Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid austritt, und wobei der Flüssigkeitseinlass und der Flüssigkeitsauslass so angeordnet sind, dass in den Flüssigkeitseinlass eintretende Flüssigkeit in den Flüssigkeitseingang und durch den Flüssigkeits-Perfusionsbereich strömt, und aus dem Flüssigkeits-Perfusionsbereich durch den Flüssigkeitsausgang und aus dem Gehäuse durch den Flüssigkeitsauslass austritt.
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei die Hepatozyten direkt auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran angesetzt werden bzw. sind, und der Zwischenraum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen größer ist als die Größe einer Zelle.
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei der Zwischenraum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und flüssigkeitsdurchlässigen Membranen etwa gleich der Größe einer Zelle ist.
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei die Hepatozyten direkt auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran und auf der flüssigkeitsdurchlässigen Membran angesetzt werden bzw. sind, und der Zwischenraum zwischen den gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen und den flüssigkeitsdurchlässigen Membranen etwa gleich der Größe zweier benachbarter Zellen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 19, ferner mit einer flüssigkeitsdurchlässigen Hohlfaser, die in dem Flüssigkeitsfach angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei das Gehäuse so angeordnet ist, dass es ein Stapeln einer Vorrichtung auf einer anderen Vorrichtung ermöglicht.
Durchfluss-Zellkultivier-Vorrichtung nach Anspruch 19, ferner mit: einer ersten Leitung zum Leiten von Plasma von einem Patienten zu dem Gehäuseeinlass, einer zweiten Leitung zum Leiten von Plasma von der Zellkultivierungs-Vorrichtung zu dem Patienten, und einer Pumpe zum Bewegen von Plasma durch die Leitungen und die Zellkultivierungs-Vorrichtung.
Vorrichtung nach Anspruch 25, ferner mit einer Plasma-Trenneinrichtung zum Entfernen von Blutzellen aus Vollblut, um Plasma bereitzustellen, das durch die Zellkultivierungs-Vorrichtung geschickt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 25, ferner mit einer Blasenfalle, um Blasen aus dem Plasma in der ersten Leitung vor dem Einleiten in die Zellkultivierungs-Vorrichtung zu entfernen.
Durchfluss-Zellkultivierungs-Vorrichtung nach Anspruch 19, ferner mit: einer Immun-Isoliervorrichtung, einer ersten Leitung zum Leiten von Plasma von einem Patienten zu einer Immun-Isoliervorrichtung, einer zweiten Leitung zum Leiten von Plasma von der Immun-Isoliervorrichtung zu dem Patienten, einer dritten Leitung zum Leiten von flüssigen Medien von der Zellkultivierungs-Vorrichtung zu der Immun-Isoliervorrichtung, und einer vierten Leitung zum Leiten von flüssigem Medium von der Immun-Isoliervorrichtung zu dem Patienten, und einer Pumpe zum Bewegen von Plasma durch die Leitungen und die Zellkultivierungs-Vorrichtung.
Durchfluss-Zellkultivierungs-Vorrichtung nach Anspruch 19, mit: einem Gehäuse mit einem Flüssigkeitseinlass und einem Flüssigkeitsauslass, einem Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und einem Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid, sowie ersten und zweiten Wänden, um eine Kammer zu bilden, und einer gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran, die zwischen den Wänden angeordnet ist, um die Kammer in einen Bereich für mit Sauerstoff angereichertes Fluid mit einem Eingang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und Ausgang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und einen Bereich für Flüssigkeit mit einem Flüssigkeitseingang und einem Flüssigkeitsausgang zu unterteilen, um wobei Hepatozyten direkt auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran oder direkt auf einem Beschichtungsmaterial von Molekülstärke auf der Oberfläche der gasdurchlässigen, flüssigkeitsundurchlässigen Membran angesetzt werden bzw. sind, wobei der Flüssigkeitseinlass und der Flüssigkeits auslass so angeordnet sind, dass biologische Flüssigkeit, die in den Flüssigkeitseinlass eintritt, in den Flüssigkeitseingang durch den Flüssigkeitsbereich strömt und aus dem Flüssigkeitsbereich durch den Flüssigkeitsausgang und aus dem Gehäuse durch den Flüssigkeitsauslass austritt, und wobei der Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und der Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid so angeordnet sind, dass mit Sauerstoff angereichertes Fluid, das in den Einlass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid eintritt, in den Eingang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und durch den Bereich für mit Sauerstoff angereichertes Fluid strömt, und aus dem Bereich für mit Sauerstoff angereichertes Fluid durch den Ausgang für mit Sauerstoff angereichertes Fluid und aus dem Gehäuse durch den Auslass für mit Sauerstoff angereichertes Fluid austritt.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran porös oder nicht-porös ist.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran Polystyrol, ein Polyolefin, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenfluorid, Polyurethan, Poly-(Styrol-Butadien-Styrol), Poly-(Ethylvinylacetat), Nylon, Silikongummi, Poly-(Tetrafluorethylen) oder Verbindungen, Gemische oder Copolymere hiervon umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran oberflächenbehandelt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran mit einer Coronaentladung oberflächenbehandelt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei die gasdurchlässige, flüssigkeitsundurchlässige Membran mit einer Beschichtung einer extrazellulären Matrix oberflächenbehandelt ist.
Durchfluss-Zellkultivierungs-Vorrichtung nach Anspruch 29, ferner mit: einer ersten Leitung zum Leiten von Plasma von einem Patienten zu dem Gehäuseeinlass, einer zweiten Leitung zum Leiten von Plasma von der Zellkultivierungs-Vorrichtung zu dem Patienten, und einer Pumpe zum Bewegen von Plasma durch die Leitungen und die Zellkultivierungs-Vorrichtung.