DE10326744B4

DE10326744B4 - Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen, Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE10326744B4
Application number: DE10326744A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Dr. Dr.med. Bornemann
Original assignee: Gerlach Jorg Drmed
Current assignee: Gerlach Jorg Drmed
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: DE10326744A1; US20050003524A1

Abstract

Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und zur Vermehrung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen, insbesondere für Zellen bestehend aus einem in einem wasser- und/oder keimdichten Behältnis angeordneten Körper aus einem offenporigen porösen Material, dessen Porendurchmesser im Bereich von 40 bis 1000 μm liegen, dessen Poren miteinander kommunizieren, und mindestens einem kanalförmigen Hohlgangsystem, dessen einzelne Hohlgänge sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen, insbesondere für Zellen. Das erfindungsgemäße Modul ist in einem wasser-/keimdichten Behältnis angeordnet und besteht aus einem porösen Material, dessen Poren miteinander kommunizieren, und mindestens einem unabhängigen kanalförmigen Hohlgangsysteme, dessen einzelne Hohlgänge die sich kreuzen und/oder überlagern.

Vorrichtungen für den Stoffaustausch z.B. Bioreaktoren, Zellperfusionseinrichtungen oder allgemeine Module, insbesondere im Bereich von Leberunterstützungssystemen, als alternative Methode für Tierversuche oder zur Herstellung von biologischen Zellen oder Zellprodukten sind bekannt.

Eine besonders effektive Ausgestaltung eines derartigen Moduls ist in der EP 059 034 A2 beschrieben. Das dort beschriebene Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung zum Erhalt von Mikroorganismen besteht aus einem Außengehäuse und mindestens drei darin angeordneten unabhängigen Membransystemen. Von diesen Membransystemen sind mindestens zwei unabhängige Membransysteme als Hohlfasermembrane ausgebildet und im Innenbereich des Moduls angeordnet. Diese Hohlfasermembrane bilden dabei ein dichtgepacktes räumliches Netzwerk. Die Mikroorganismen sind dabei in den Hohlräumen des Netzwerks und/oder an den Hohlfasermembranen adhäriert.

Andere Lösungen für Hohlfaser-Bioreaktoren sind bereits auch aus WO 00/75275 (Mac Donald, USA) und EP 1 185 612 (Mac Donald, USA) bekannt.

Aus der DE 42 30 194 C2 ist ein Bioreaktor bekannt, bei dem die Zellen entweder frei angeordnet sind oder an Partikeln bzw. Hohlfasern immobilisiert sind.

Aus der DE 36 33 891 A1 ist ein Bioreaktor zum kultivieren tierischer Zellen bekannt. Dieser basiert auf einer Hohlfasermembran, durch die ein geeignetes Nährmedium geführt wird.

Die EP 1 245 670 A2 beschreibt eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, die auf einer porösen Struktur basiert. Diese weist jedoch keinerlei Hohlgänge auf, die den Bioreaktor selbst durchziehen und für die Versorgung des Bioreaktors verantwortlich sind. Der Bioreaktor ist dabei in einem separaten Behältnis untergebracht.

Die EP 0 605 137 A2 und die US 4,220,725 betreffen ebenfalls Bioreaktoren, die auf einer Hohlfasermembran basieren.

Die WO 03/022985 A2 beschreibt einen Bioreaktor zur Aufzucht von Zellen, wobei die ver- und entsorgenden Strukturen in Form von separaten Hohlfaserkapillarmembranen ausgebildet sind.

Aus der DE 198 10 901 C1 ist ein Bioreaktor zur Versorgung, Vermehrung und Ernte von u.a. Mikroorganismen bekannt. Dieser Bioreaktor weist zwei voneinander unabhängige Hohlfaser-Membransysteme in einem Gehäuse auf, von denen eines das im Extrakapillarraum befindliche Zuchtgut mit Nährstoffen versorgt und das andere zur Begasung des Zuchtgutes dient.

Obwohl diese Bioreaktoren schon in Bezug auf die Substratver- und -entsorgung der Mikroorganismen ausgezeichnete Ergebnisse zeigen, ist hierbei nachteilig, dass bei längerer Betriebsdauer die Hohlfasermembrane in ihrer Funktion beeinträchtigt werden, so dass es zu einer gestörten Ver- bzw. Entsorgung der Mikroorganismen kommen kann.

Ausgehend hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen anzugeben sowie ein entsprechendes Verfahren zur Herstellung eines derartigen Moduls.

Die Aufgabe in Bezug auf das Modul wird durch die Merkmale des Patentanspruches 1, in Bezug auf das Verfahren zur Herstellung durch die Merkmale des Pa tentanspruches 27 gelöst. Die Unteransprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf. Die Nutzung ist in den Ansprüchen 39 bis 57 beschrieben.

Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, dass das Modul aus einem Körper besteht, der in einem Behältnis angeordnet ist, wobei der Körper so ausgebildet ist, dass er aus einer offenporigen Schwamm/schaumartigen porösen Struktur besteht, die Poren aufweist und dass diese Poren miteinander kommunizieren können. Die Poren weisen einen Durchmesser von 40 bis 1000 μm auf. Gleichzeitig weist dieser Körper mindestens ein kanalförmiges Hohlgangsystem auf, dessen einzelne Hohlgänge sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen, so dass sie von außen über geeignete Anström- und Ausströmkörper mit Medien ver- und entsorgt werden können.

Bevorzugt weist das erfindungsgemäße Modul zwei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme auf, die sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen.

Dadurch, dass nun der Körper der in dem Behältnis angeordnet ist selbst aus einem porösen Material besteht, dessen Poren untereinander kommunizieren können, ist auch eine Verbindung der Poren über deren Porenwandöffnungen zu den unabhängigen kanalförmigen Hohlgangsystemen gewährleistet. Beim erfindungsgemäßen Modul sind nun die Mikroorganismen, d.h. insbesondere die Zellen in den Poren dieses porösen Körpers fixiert. Durch die im erfindungsgemäßen Körper angeordneten unabhängigen kanalförmigen Hohlgangsysteme kann nun an jeder Stelle des Körpers eine optimale Ver- und Entsorgung der in den Poren angeordneten Mikroorganismen, insbesondere der Zellen, erfolgen. Mit der Erfindung wird somit der Zustand der na türlichen Organe nahezu identisch nachgebildet. Mit dem erfindungsgemäßen Modul steht somit erstmals ein Bioreaktor zur Verfügung, der eine optimale Substratver- und -entsorgung der Mikroorganismen an jeder Stelle des Bioreaktors selbst ermöglicht.

Ein kanalförmiges Hohlgangsystem der Erfindung ist bevorzugt so ausgebildet, dass es aus in einer Ebene angeordneten parallel zueinander verlaufenden Kanälen besteht. Besonders bevorzugt ist ein kanalförmiges Hohlgangsystem der Erfindung aus mehreren derartigen Ebenen gebildet, die in einem vorbestimmten Abstand übereinander angeordnet sind. Der Abstand der einzelnen Kanäle eines Hohlgangsystems in der Ebene und auch zwischen den einzelnen Ebenen kann im Bereich von 0,5-5 mm liegen. Der Durchmesser der einzelnen Kanäle ist bevorzugt 0,1-3 mm, bevorzugt 0,1 bis 2 mm.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass der Körper des Bioreaktors nach der Erfindung mindestens zwei derartige Hohlgangsysteme aufweist, die sich kreuzen und/oder überlagern.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht deshalb vor, dass die Hohlgangsysteme gekreuzt angeordnet sind. Erfindungsgemäß durchzieht somit ein erstes Hohlgangsystem, bevorzugt aus mehreren übereinander angeordneten Ebenen, den Körper in einer Richtung und das zweite Hohlgangsystem in einem Winkel von z.B. 30° von der anderen Richtung her. Wenn nun die Ebenen in dem vorher definierten Abstand übereinander angeordnet sind, wird sichergestellt, dass an nahezu jeder Stelle im Inneren des Körpers auch eine Substratver- und -entsorgung der in den Poren des porösen Körpers angeordneten Mikroorganismen möglich wird. Dies wird durch separate Perfusionsmediumkreisläufe außerhalb des Moduls verstärkt, wobei diese Kreisläufe jeweils über die unabhängigen Kanalsysteme den Körper perfundieren und zwischen den Kanalsystemen in der porösen Struktur des Körpers der Stoffaustausch zwischen den Kreisläufen und entlang der Zellen in den offenen Poren stattfindet. Vorteilhaft ist hier z.B. eine Kreislaufführung die zu direkter Perfusion des Körpers führt. Weiterhin vorteilhaft ist eine Gegenstromperfusion der unabhängigen Kanalsysteme welche über entstehende Druckgradienten bei einem entsprechenden Fluss zu hohen Stoffaustauschraten führt.

Die Erfindung umfasst hierbei selbstverständlich auch alle weiteren Ausführungsformen mit Bezug auf die geometrische Anordnung der Hohlgangsysteme zueinander, sofern gewährleistet ist, dass an jeder Stelle im Innern des Körpers eine nahezu identische Substratver- und -entsorgung sichergestellt ist. Die beiden Hohlgangsysteme können sich somit im Innern des Körpers in einem vorbestimmten Winkel kreuzen, sie können aber auch übereinander parallel angeordnet sein.

Weist das erfindungsgemäße Modul ein drittes unabhängiges Hohlgangsystem auf, ist diese bevorzugt ebenfalls wieder aus parallel angeordneten Hohlgängen, die in einer Ebene liegen, gebildet. Diese Hohlgangsysteme durchziehen nun ebenfalls wieder den Körper, z.B. vertikal von oben nach unten, und verweben somit die beiden ersten unabhängigen Hohlgangsysteme miteinander. Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch bei dem dritten unabhängigen Hohlgangsystem alle geometrischen Anordnungen, sofern wiederum sichergestellt ist, dass an jeder Stelle im Innern des Körpers eine nahezu identische Ver- und Entsorgung der Mikroorganismen, d.h. der Zellen, gewährleistet ist.

Beim erfindungsgemäßen Modul kann das erste unabhängige Hohlgangsystem z.B. für den Mediumzufluss dienen. Das zweite unabhängige Hohlgangsystem ist dann für die Versorgung der Mikroorganismen, z.B. mit Sauerstoff bzw. die Entsorgung mit CO₂ zuständig. Der Medienabfluss wird dann durch das dritte unabhängige Hohlgangsystem sichergestellt.

Die vorstehend näher beschriebenen kanalförmigen Hohlgangsysteme durchziehen den porösen Körper des erfindungsgemäßen Moduls. Die Poren des porösen Körpers des erfindungsgemäßen Moduls sind dabei in ihrer Dimensionierung so gewählt, dass sie mindestens die Größe einer Zelle besitzen. Die Poren des porösen Körpers weisen deshalb einen Durchmesser von 40-1000 μm auf. Wesentlich beim erfindungsgemäßen Körper ist nun, dass diese Poren untereinander über Hohlräume in Verbindung stehen, so dass ein optimaler Zu- und Abfluss der Medien erfolgen kann. Die Poren sind dabei untereinander über ca. 10 – 100 μm große, bevorzugt 50 – 100 μm große, Hohlräume verbunden. Durch diese Ausgestaltung ist es nun gewährleistet, dass die zuzuführenden Medien über das unabhängige Hohlgangsystem an jede Stelle des porösen Körpers gelangen, genauso wie die abzuführenden Medien von jeder Stelle des Hohlkörpers über die Poren und dessen Verbindungen zu den Kanälen des Hohlgangsystemes abgeführt werden. Der erfindungsgemäße poröse Körper kann deshalb auch als offenporige Schaum-/Schwammstruktur bezeichnet werden.

Über die Poren ist damit eine Mediumperfusion, ein Einspülen der Zellen, die Migration von Zellen sowie der Stoffaustausch möglich. Mit diesem Bioreaktor wird somit eine Vorrichtung beschrieben, die die or gantypische Reorganisierung von biologischen Zellen erlaubt.

Im Vergleich zum Stand der Technik werden so die Vorteile der Funktionen von Mehrkompartment-Hohlfaserbioreaktoren durch die verschiedenen Kanalsysteme der Erfindung erhalten, während die Nachteile des Membranwandverstopfens mittels der vergleichsweise groben offenporigen Körperstruktur aufgehoben werden.

Der im Behältnis angeordnete erfindungsgemäße poröse Körper kann jede beliebige geometrische Form aufweisen. Im wesentlichen kommt es darauf an, dass der poröse Körper ein Volumen besitzt, das geeignet ist um eine für den jeweiligen Anwendungsfall genügende Menge an Zellen bzw. Mikroorganismen aufzunehmen. Der poröse Körper besitzt deshalb bevorzugt ein Volumen von 0,5 ml bis 101.

Die geometrische Form kann an und für sich beliebig sein. Bevorzugt ist es jedoch wenn eine Blockform gewählt wird, da somit auch eine einfache Führung der Hohlgangsysteme von einer Seite des Blocks zur anderen möglich ist. Von den Blockformen sind insbesondere rechteckige Hohlblockformen bevorzugt.

Der poröse Körper in Blockform kann dabei einstückig ausgebildet sein oder aber der poröse Körper in Blockform ist durch einen Verbund von mehreren übereinander liegenden scheibenförmigen Einzelschichten gebildet, die ihrerseits durch das Behältnis gehalten werden.

In Bezug auf die vorstehend genannte zweite Alternative, die scheibenförmige Ausbildung, ist es vorteil haft, wenn die scheibenförmigen Einzelschichten in mindestens einer der Flächen von kanalförmigen Vertiefungen durchzogen sind. Diese kanalförmigen Vertiefungen sind auf der Oberfläche angeordnet und so ausgebildet, dass sie durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein kanalförmiges Hohlgangsystem bilden. Die Vertiefungen sind deshalb als Halbkanäle ausgebildet, so dass durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein voller Kanal entsteht. Der Vorteil dieser Ausgestaltung besteht darin, dass es verfahrenstechnisch sehr einfach ist in die Einzelscheiben entsprechende Vertiefungen einzubringen. Die Einzelscheiben können dabei vorteilhafterweise noch in der Art weitergebildet werden, dass sie von der Stirnseite aus gesehen das zweite kanalförmige Hohlgangsystem in Form von durchzogenen Kanälen aufweisen. Somit wird durch Aufbau dieser Einzelschichten und deren Verbund ein poröser Körper realisiert, der bereits zwei unabhängige Hohlgangsysteme besitzt. Das eine Hohlgangsystem wird durch die Vertiefungen in den Einzelschichten in der Fläche gebildet, wohingegen das zweite Hohlgangsystem durch die in der Einzelscheibe bereits eingebrachten kanalförmigen Hohlgänge resultiert.

Der poröse Körper, wie vorstehend beschrieben, ist gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Behältnis angeordnet. Die Anordnung aus wasser-/keimdichten Behältnis und porösem Körper ist so ausgebildet, dass die kanalförmigen Hohlgänge eines Systems in mindestens einem Anström- und Ausströmkörper münden. Dieser Anströmkörper bzw. Ausströmkörper ist so ausgestaltet, dass er durch das Behältnis hindurch geführt ist, so dass eine Ver- und Entsorgung des im Behältnis angeordneten Hohlkörpers von außen sichergestellt ist. Grundsätzlich sind hierfür zwei verschiedene Ausführungsformen möglich. So ist es zum einen möglich, dass der Anström- und Ausströmkörper Bestandteil des Behältnisses selbst ist und durch Anordnung des Körpers in dem Behältnis die Verbindungen realisiert werden und andererseits kann aber auch der Anström- und Ausströmkörper mit dem Körper aus porösem Material verbunden sein. In diesem Fall umschließt dann das wasser-/keimdichte Behältnis diese Anordnung.

Das Gehäuse weist in einer weiteren Ausgestaltung noch verschiedene Zugänge auf. Ein erster Zugang dient dabei dazu, um die Mikroorganismen in das Modul einzufüllen. Weitere Zugänge dienen beispielsweise zur Druck-, pH- und Temperaturmessung oder zum Einführen von optischen Sonden zur Mikroskopie oder zur Messung mittels Fluoreszenzlichtverfahren im Innenbereich des Moduls.

Das Behältnis kann dabei in Form eines Gehäuses oder einer Folie ausgebildet sein. Bevorzugt ist die Ausführungsform des Gehäuses, wobei hier wiederum ganz besonders bevorzugt ein Spritzprozessgehäuse verwendet wird. Bei den Materialien für das Spritzprozessgehäuse sind alle an und für sich aus dem Stand der Technik bekannten Materialien möglich. Vorteilhaft beim erfindungsgemäßen Modul ist, dass das Behältnis und die Anschlüsse auch aus einem resorbierbaren bzw. biologisch abbaubaren Material gefertigt werden können, so dass es möglich ist, das Modul als Implantat zu verwenden. Eine weitere Variante des Gehäuses erlaubt das sterile öffnen des Gehäuses, um einzelne Anteile der zellbesiedelten porösen Körperstruktur im inneren, z.B. einzelne der vorgenannten Scheiben, für medizinische Implantationszwecke zu entnehmen.

Als Material für den porösen Körper, der die vorstehend definierten Dimensionen in Bezug auf die Poren und auf die Verbindung der Poren aufweist, kann an und für sich jedes aus dem Stand der Technik bekannte Material verwendet werden, das zu einer schaum- bzw. schwammartigen Struktur führt. Es kann auch hier, wie vorstehend beim Behältnis erwähnt, ein Material verwendet werden, das biologisch abbaubar ist.

Bevorzugt besteht das poröse Material aus einem gesinterten Keramikpulver. Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung von Hydroxylapatit. Hydroxylapatit gehört zur Gruppe der Kalziumphosphate, worunter keramische Werkstoffe mit unterschiedlichen Anteilen von Kalzium und Phosphor verstanden werden. Hydroxylapatit ist eine Verbindung, die sowohl natürlich vorkommt, wie auch synthetisch hergestellt werden kann. Der medizinische Einsatz von Hydroxylapatit als Knochenersatzwerkstoff ist bereits im Stand der Technik bekannt. Die Motivation für den klinischen Einsatz von Hydroxylapatit ist es, einen Werkstoff mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung wie die mineralische Phase des Knochens anzuwenden. Hydroxylapatit kommt als natürliche Komponente im mineralischen Anteil des Knochens mit 60 – 70 % vor. Hydroxylapatitpulver wird nach dem Stand der Technik entsprechend, beispielsweise über Fällungsmethoden aus einer wässrigen Lösung, beispielsweise durch Zugabe von Ammoniumphosphat in einer Kalziumnitratlösung bei alkalischem PH hergestellt. Zur Verbindung der Pulverteilchen kann bei Temperaturen um 12.000°C eine Sinterung erfolgen, wobei Wintermantel (Wintermantel et al.: Biokompatibler Werkstoff und Bauweise: Implantate für Medizin und Umwelt Berlin/Springer 1998: 256-257) beschreibt, dass für die Herstellung von po rösen Festkörpern aus Hydroxylapatit, beispielsweise offenporigen schaumartigen Strukturen, das Hydroxylapatitpulver mit organischen Zusätzen oder Schaumbildnern vermischt wird, die anschließend wieder bei hohen Temperaturen ausgebrannt werden. Bevorzugt werden dabei Schaumbildner eingesetzt, die während der Temperaturerhöhung zu einem aufbrechen der Zwischenwände der Schaumblasen führen.

Eine Alternative zur Verwendung von Schaumbildnern ist die direkte Beschichtung der Oberflächen von offenporigen Schwammstrukturen, z.B. von synthetischen- oder Naturschwämmen, wobei die vorgenannten Strukturen beim Sinterungsprozess verdampfen.

Es ist auch möglich, den Körper aus einer eine Keramikpulver und Additiva enthaltenen aufgeschäumten Suspension zu bilden, der vor dem Sintern zwischen eine Kapillarmembranbioreaktorkonstruktion eingeschäumt wurde.

Das wie vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Modul ist grundsätzlich zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistungen und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen aller Art geeignet. Besonders bevorzugt ist es für Zellen. Bei den Zellen können Zelllinien, immortalisierte Zellen, Stammzellen, Zellen eines Organs und/oder Ko-Kulturen verschiedener Zellen eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Herstellen des vorstehend beschriebenen Moduls.

Erfindungsgemäß wird dazu in einem ersten Schritt ein poröser Körper hergestellt, dessen Poren miteinander kommunizieren können und der mindestens ein unabhängiges kanalförmige Hohlgangsysteme aufweist, dessen Hohlgänge den Körper durchziehen. In einem zweiten Schritt wird dann dieser Körper in ein wasser-/keimdichtes Behältnis eingebracht.

In Bezug auf den porösen Körper kann dieser wie bereits vorstehend schon beschrieben, entweder einstückig hergestellt werden oder durch Verbund einer scheibenweisen Anordnung.

Für den Fall, dass ein einstückiger poröser Körper hergestellt wird, z.B. wie eingangs beschrieben mittels eines Aufschäum- und Sinterprozesses mit Hydroxylapatit, werden dann in einem zweiten Schritt in diesem porösen Körper die kanalförmigen Hohlgänge eingebracht. Grundsätzlich sind hierfür alle Verfahren geeignet mit denen kanalförmige Hohlgänge realisiert werden können. Zu nennen sind hier die Lasertechnologie wie auch Bohren oder Fräsen.

Die zweite Alternative zur Herstellung des porösen Körpers besteht ja darin, dass zuerst die Einzelschichten ebenfalls wiederum z.B. aus Hydroxylapatit hergestellt werden und dass dann in diese Einzelschichten in der Fläche kanalförmige Vertiefungen eingebracht werden. Dieses Einbringen der kanalförmigen Vertiefungen in die Fläche der scheibenförmigen Einzelschichten kann schon beim Herstellen der Einzelschichten durch einen entsprechenden Formungsprozess erfolgen. Diese scheibenförmigen Einzelschichten können dann wieder durch Lasern oder durch bohren mit dem zweiten unabhängigen Kanalsystem versehen werden. Dazu werden die scheibenförmigen Einzelschichten von den Stirnseiten her gesehen mittels Laser oder Bohrer durchbohrt.

Für die zweite Alternative für den scheibenförmigen Aufbau muss dann gewährleistet sein, dass die Einzelscheiben zu einem Verbund zusammengehalten werden. Dies kann einerseits durch Einspannen in eine gesonderte Vorrichtung erfolgen, andererseits ist dies aber auch möglich, dass das Behältnis in Form eines Gehäuses ausgebildet ist und somit den Verbund zusammenhält. Insbesondere diese zweite Variante bietet verfahrenstechnische Vorteile.

Alternativ können im Falle der Verwendung von beschichteten offenporigen schwammartigen Strukturen, z.B. mit Hydroxyapatitsuspension, die Kanäle bereits vor dem Sinterungsprozess eingebracht worden sein.

Der wie vorstehend beschrieben hergestellte poröse Körper wird dann ja in einem weiteren Schritt in das Behältnis eingebracht. Bevorzugt ist es hierbei, wenn das Behältnis in Form eines Gehäuses aus Spritzguss ausgebildet ist. In Bezug auf die Anström- und Abströmkörper muss dabei lediglich sichergestellt werden, dass für ein unabhängiges Hohlgangsystem mindestens ein Anström- und Abströmkörper vorhanden ist.

Die weiteren Schritte dienen der Vorbereitung der Kultur von Zellen in den offenporigen schaumartigen Strukturen des Moduls. Hierzu kann eine Reinigung, z. B. mit wässrigen Medien, erfolgen. Üblicherweise sollte eine Sterilisation erfolgen. Auch eine Beschichtung mit Biomatrix, z. B. Collagen, entspricht dem Stand der Technik. Unter Verwendung Biomatrix produzierender Zellen in Ko-Kultur im Körper ist jedoch eine Beschichtung mit Fremdbiomatrix vermeidbar. Nachdem die Parenchym- und Nichtparenchymzellen des Organs, z.B. mit Kulturmedium, eingeschwemmt wurden, kann eine organtypische Kultur im Körper erfolgen.

In einigen Körperorganen werden Zellen produziert, die anschließend über den Blutweg ausgespült werden. So zum Beispiel die Stammzellen des Knochenmarks. Analog kann ein Ausspülen produzierbare Zellen, beispielsweise von Immunzellen oder von Blutzellen und/oder Stammzellen, aus dem Modul zur Zellgewinnung erfolgen.

Eine Gewinnung von Zellen kann durch Ausspülen mit Kulturmedien, ggf. nach enzymatischer Biomatrixverdauung beispielsweise mit Collagenase/Trypsin erfolgen.

In Bezug auf die stoffliche Komponente wird auf die vorstehenden Ausführungsformen bei der Beschreibung des Moduls verwiesen.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Modules.

Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Modul zum Erhalt, zur Vermehrung und/oder zur Nutzung von einzelnen Zellen und verschiedene Zellarten (Ko-Kulturen) eines Organs oder auch von Zelllinien oder immortalisierten Zellen geeignet. Die Nutzung des Bioreaktors kann dabei in der industriellen Produktion von diagnostischen/therapeutischen Substanzen durch Zellen liegen oder aber auch in der Produktion von Zellen für die industrielle Nutzung wie auch für die therapeutische Transplantation. Das erfindungsgemäße Modul kann auch zur Nutzung der Zellleistungen für einen Patienten im Sinne eines exra-korporalen hybriden Organs für die Organunterstützung eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Modul zur Bildung von implantierbaren Organtransplantaten dienen. Das Modul ist auch als Laborsystem zum Ersatz oder zur Ergänzung von Tierversuchen in der Forschung und Pharmakologie geeignet. Eine weitere Nutzungsmöglichkeit liegt in der Schaffung eines Zellsystems für die Virusvermehrung, z.B. von HIV-Viren, Hepatitis B/C-Viren. Das Modul kann auch zur Vaccinherstellung dienen. Die Vorrichtung erlaubt insbesondere die Reorganisation und den Erhalt von Stammzellen und dessen Wachstum und Differenzierung zu Organgewebe.

Die Erfindung wird nachfolgend durch die 1 bis 4 näher beschrieben.
1 zeigt im schematischen Aufbau ein erfindungsgemäßes Modul.
2 zeigt schematisch verschiedene Möglichkeiten zur Prozessführung.
3 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der zusätzlich noch Hohlfaserkapillarmembrane verwendet werden.
4 zeigt ebenfalls schematisch die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Moduls.
1 zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen Moduls 1, wobei der poröse Körper in Form eines quaderförmigen Blockes vorliegt. Der quaderförmige Block kann dabei, wie in der 1a dargestellt, aus Einzelscheiben 2, 3, 4, aufgebaut sein oder wie 1b zeigt aus einem einheitlichen Block gebildet sein. In der Ausführungsform nach 1 ist der Block 5 aus Hydroxylapatit gebildet und weist drei unabhängige Hohlgangsysteme auf. Die Hohlgangsysteme nach der 1 sind in Form von einzelnen Ebenen gebildet, d.h. die jeweils einzelnen Ebenen bestehen aus parallelen einzelnen Kanälen. Ein Hohlgangsystem und ein zweites Hohlgangsystem liegen dabei in einer Ebene und kreuzen sich im 90°-Winkel. Die entsprechenden Ebenen sind übereinander angeordnet. Das dritte Hohlgangsystem durchzieht nun den porösen Körper vertikal von oben nach unten und verwebt somit die beiden ersten unabhängigen Hohlgangsysteme miteinander. In eines der Systeme sind Oxygenierungshohlfasermembranen 15 eingefädelt. Alternativ kann hierin auch eine Perfusion mit sauerstofftrangenden Substanzen wie Hämoglobin oder Erythrozyten erfolgen. Ein erstes System ist somit für den Sauerstoffein- und -auslass mittels der Oxygenierungsmembran 15 verantwortlich, das zweite unabhängige Hohlgangsystem für den Mediumeingang und das dritte unabhängige System, das vertikal zu den beiden vorstehend genannten angeordnet ist, für den Mediumauslass. Die letztgenannten zwei Systeme können auch im Gegenstromverfahren perfundiert werden. Die Hohlgangsysteme sind dabei so angeordnet, dass im Inneren des Moduls nahezu an jeder Stelle identische Bedingungen des Stoffaustausches vorliegen.
Das erfindungsgemäße Modul nach der Ausführungsform nach 1 besitzt als Behältnis ein Gehäuse 6, das bevorzugt aus Spritzguss gefertigt ist. Die entsprechenden Ausström- und Anströmkörper sind dabei Bestandteil des Gehäuses.
Beispiele für Prozessführungen der unabhängigen Hohlgangsysteme sind in den 2a–2c dargestellt. Die Pfeile stellen symbolisch den Mediumfluss dar und sind nicht gleichbedeutend mit den Hohlgangsystemen. 2a zeigt die Nutzung mit nur einem Hohlgangsystem in das eine Oxygenierungshohlfasermembran eingefädelt ist. Das eine Hohlgangsystem wird für den Medium- (bzw. Blut) eintransport verwendet und es findet ein Stoffaustausch zu und von den Poren per Diffusion statt. Der nach unten zeigende Pfeil (10) beschreibt die Diffusionsrichtung des Mediums (bzw. des Blutplasmas). In das Hohlgangsystem ist zusätzlich eine Oxygenierungshohlfaser eingefädelt (nicht dargestellt), welche Analog zu den 1 und 3 eine dezentrale Sauerstoffversorgung innerhalb des Hohlgangsystems ermöglicht. In 2b wird durch die Pfeile der Stoffaustausch über zwei unabhängige Hohlgangsysteme (nicht abgebildet) dargestellt, wobei das Erste dem Mediumantransport und das Zweite dem Mediumabtransport dient und der Stoffaustausch zu und von den Poren per Perfusion stattfindet. Der nach unten weisende Pfeil (11) stellt den Mediumtransport in das zweite Hohlgangsystem dar. Analog zu 2a ist in das erste Hohlgangsystem zusätzlich eine Oxygenierungshohlfaser eingefädelt (nicht dargestellt), welche eine dezentrale Sauerstoffversorgung innerhalb dieses mediumzuführenden Hohlgangsystems ermöglicht. 2c stellt die Situation wie in 2b dar. Die beiden unabhängigen Hohlgangsysteme sind hier jedoch parallel im gleichen Winkel angeordnet. Die Mediumversorgung findet hier im Gegenstromverfahren zwischen den beiden unabhängigen Hohlgangsystemen statt, wodurch bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten ein verbesserter Stoffaustausch möglich wird. Wiederum ist Analog zu 2a in das erste Hohlgangsystem zusätzlich eine Oxygenierungshohlfaser eingefädelt (nicht dargestellt), welche eine dezentrale Sauerstoffversorgung innerhalb dieses Hohlgangsystems ermöglicht.
3 zeigt eine weitere Ausgestaltung der Erfindung mit Darstellung dreier unabhängiger Hohlgangsysteme. Diese Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass in das erste der drei unabhängigen Hohlgangsysteme 12, 13, 14, eine Oxygenierungshohlfaser 15 eingelegt ist. Diese Vorgehensweise kann dann vorteilhaft sein, wenn Sauerstoff z. B. durch ein Hohlgangsystem dezentral zugeführt werden muss und eine möglichst gleichförmige Verteilung des Sauerstoffs sichergestellt werden soll. Dazu wird dann in ein Hohlgangsystem eine entsprechende Oxygenierungshohlfaser eingelegt/ eingefädelt, die so dimensioniert und ausgelegt ist, dass sie spezifisch für Sauerstoff durchgängig ist.
Dadurch wird eine dezentrale, gleichmäßige und homogene Verteilung des Sauerstoffs in dem Hohlkörper gewährleistet.
Zwischen dem ersten unabhängigen System 12 und dem zweiten 13, findet analog zu 2b ein Stoffaustausch im Perfusionsverfahren statt (symbolisiert durch Pfeile). Zusätzlich ist ein drittes unabhängiges Hohlgangsystem (14) dargestellt, welches beispielsweise einer Zelldrainage dienen kann, oder im Falle der Nutzung mit Leberzellen einer Gallendrainage.
3 zeigt eine Ausgestaltung, wie sie für Leberzellkulturen vorteilhaft eingesetzt werden kann, da die physiologische Situation von Leberarterien (hier analog Funktion der Membran 15), Portalvenen (hier analog 12), Lebervenen (hier analog 13) und Gallenwegen (hier analog 14) imitiert ist.
4 zeigt nun schematisch in den 4a und 4b wie die Zellansiedlung in dem erfindungsgemäßen Modul stattfindet. 4 zeigt nur ausschnittsweise ein Segment aus dem porösen Hohlkörper. In den offenen Poren zwischen den Hohlgangsystemen sind Zellen 16 immobilisiert, die durch ein erstes unabhängiges Hohlgangsystem analog zu 2b mit Medium angeströmt werden, das Medium perfundiert die Zellen über die offenporige Struktur und verlässt Diese über das zweite unabhängige Hohlgangsystem. Im Beispielsfall ist im ersten System 17 (bzw. 12 in 3) auch noch eine Oxygenierungshohlfaser 18 (bzw. 15 in 3) integriert (analog zu 2), um die Zellen mit Sauerstoff zu versorgen. Die Pfeile zeigen dann den Strömungsweg des Mediums vom ersten unabhängigen Hohlgangsystem über die offenen Poren zum zweiten System. 4a zeigt einen Anschnitt durch den Körper in der Ebene parallel zu den Oxygenierungshohlfasern, 4b zeigt den gleichen Körper in einer Betrachtungsebene quer zur 4a bzw. zur Oxygenierungshohlfaser.

Claims

Modul zur Züchtung und zur Nutzung der Stoffwechselleistung und zur Vermehrung und/oder zum Erhalt von Mikroorganismen, insbesondere für Zellen bestehend aus einem in einem wasser- und/oder keimdichten Behältnis angeordneten Körper aus einem offenporigen porösen Material, dessen Porendurchmesser im Bereich von 40 bis 1000 μm liegen, dessen Poren miteinander kommunizieren, und mindestens einem kanalförmigen Hohlgangsystem, dessen einzelne Hohlgänge sich kreuzen und/oder überlagern und den Körper durchziehen.
Modul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens zwei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme aufweist.
Modul nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein kanalförmiges Hohlgangsystem aus mindestens in einer Ebene angeordneten parallel verlaufenden einzelnen Kanälen besteht.
Modul nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hohlgangsystem aus mehreren übereinander angeordneten Ebenen die jeweils aus parallel angeordneten einzelnen Kanälen bestehen, gebildet ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass drei unabhängige kanalförmige Hohlgangsysteme vorhanden sind.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass vier unabhängige Hohlgangsysteme vorhanden sind.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser eines einzelnen Kanals des kanalförmigen Hohlgangsystems 0,1-3 mm beträgt.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand der einzelnen in einer Ebene angeordneten parallel zueinander verlaufenden Kanäle eines Hohlgangsystems in der Ebene und/oder zwischen den Ebenen 0, 5 – 5 mm beträgt .
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren untereinander über 10-300 μm große Porenwandöffnungen miteinander verbunden sind.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper Blockform besitzt.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper einstückig ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Körper ein Verbund von mehreren übereinanderliegenden scheibenförmigen Einzelschichten ist, der durch das Behältnis gehalten wird.
Modul nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten in mindestens einer Fläche von kanalförmigen Ver tiefungen durchzogen sind, die so angeordnet und dimensioniert sind, dass durch Verbund mit der nächstliegenden Einzelschicht ein kanalförmiges Hohlgangsystem entsteht.
Modul nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten von der Stirnseite aus von einem kanalförmigen Hohlgangsystem durchzogen sind.
Modul nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten von einer Fläche zur anderen Fläche von Hohlgängen durchzogen sind.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die kanalförmigen Hohlgänge eines Systems in mindestens jeweils einen Anström- und Ausströmkörper münden.
Modul nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Anström- und Ausströmkörper mit dem Körper aus porösem Material verbunden ist.
Modul nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Anström- und Ausströmkörper Bestandteil des Behältnisses ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einem biologisch abbaubaren Material besteht.
Modul nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des porösen Material aus einem gesinterten Keramikpulver bestehen.
Modul nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einer ein Keramikpul ver und Additiva enthaltenden aufgeschäumten Suspension gebildet worden ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis ein Gehäuse ist und dieses aus Spritzguss gefertigt ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis eine Folie ist.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Behältnis aus einem biologisch abbaubaren Material besteht.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass in den offenen Poren Zelllinien, Stammzellen, Zellen eines Organs und/oder Ko-Kulturen verschiedener Zellen immobilisiert sind, mit Ausnahme von embryonalen Stammzellen.
Modul nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem kanalförmigen Hohlgangsystem Hohlfasermembrane zur Oxygenierung, Dialyse und/oder als separates Co-Kultur-Kompartement eingeführt sind.
Verfahren zur Herstellung eines Moduls nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 26 mit folgenden Schritten – Herstellen eines Körpers aus porösem Material, dessen Poren miteinander kommunizieren können und der von mindestens einem unabhängigen ka nalförmigen Hohlgangsystemen durchzogen ist, – Einbringen des Körpers in ein wasser- und/oder keimdichtes Behältnis, – Sterilisieren – Zellbesiedeln.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein einstückiger poröser Körper hergestellt und dass in einem zweiten Schritt in diesen porösen Körper die kanalförmigen Hohlgänge eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die kanalförmigen Hohlgänge mittels Laser, Bohren und/oder Fräsen eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Hohlgangsystem Hohlfasermembrane eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper durch einen Verbund von scheibenförmigen Einzelschichten hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass in die scheibenförmigen Einzelschichten in der Fläche kanalförmige Vertiefungen eingebracht werden, die die Fläche durchziehen.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die scheibenförmigen Einzelschichten von der Stirnseite mit einem kanalförmigen Hohlgangsystem versehen werden und dass von einer Fläche zur gegenüberliegenden Fläche Hohlgänge eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Hohlgänge mittels Bohren, Lasern oder Fräsen eingebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Zusammenbau der Einzelscheiben in eines der Hohlgangsysteme Hohlfasermembrane eingebracht bzw. eingeführt werden.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 27 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper aus einem biologisch abbaubaren Material hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der poröse Körper durch Sintern von aufgeschäumtem Keramikpulver mit Additiven hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass als Keramikpulver Hydroxyapatit eingesetzt wird.
Verwendung des Moduls nach einem der Ansprüche 1 bis 26 in der zellbasierten Therapie, in der regenerativen Medizin, in der Zellbiologie und/oder in der Vaccinentwicklung bzw. zur Vaccinherstellung.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 zur Anzucht, zum Erhalt, zur Differenzierung, zur Vermehrung und/oder zur Nutzung einzelner Zellarten und/oder verschiedener Zellarten (Ko-Kulturen) eines Organs mit Ausnahme von embryonalen Stammzellen.
Verwendung nach Anspruch 40 für Stammzellen.
Verwendung nach Anspruch 40 für humane Zellen.
Verwendung nach Anspruch 40 für adulte Stammzellen.
Verwendung nach Anspruch 40 zur Produktion von Zellen.
Verwendung nach Anspruch 40 zur Produktion von Progenitorzellen für die Zelltransplantation.
Verwendung nach Anspruch 40 zur Produktion gentechnologisch-modifizierter Zellen, immortaler Zellen, Zelllinien und/oder transgener Zellen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 zur Produktion von Substanzen durch Zellen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 zur Differenzierung von organtypischen Zellen aus Stammzellen, mit Ausnahme von embryonalen Stammzellen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 zur Bildung von organtypischen Strukturen aus adulten Stammzellen, Knochenmarkzellen oder embryonalen Zellen, mit Ausnahme von embryonalen Stammzellen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als extra-korporales hybrides Organ zur Organunterstützung.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als implantierbares Organtransplantat.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als Laborsystem zum Ersatz und/oder Ergänzung von Tierversuchen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als in vitro Viruskultur und Virusvermehrungssystem.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 zur Erzeugung von zellulären Stoffwechselprodukten, bekannten oder unbekannten Mediatoren, Hormonen, Differenzierungsfaktoren, Signalmolekülen, Wachstumsfaktoren, Sensibilisierungsfaktoren, Cytokinen, Proteinen, Antikörpern, Impfstoffen und/oder zur Erzeugung von organspezifischen Biomatrixsubstanzen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als hybrides Immunsystem zur Herstellung von immunkompetenten Zellen und Vaccinen, Progenitorzellen für Organe und Blutbestandteile.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als hybrides Blutzellsystem (Knochenmark) zur Herstellung von Blutbestandteilen.
Verwendung des Moduls nach Anspruch 39 als hybrides Stammzellsystem zur Herstellung von Progenitorzellen für Organe, insbesondere für die Transplantation von Reparaturzellen, mit Ausnahme von embryonalen Stammzellen.