JP6715330B2 - 細胞の立体構造化方法及び立体構造化システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムに関し、特に神経細胞を所望方向に積層培養させる細胞塊の培養方法及び培養システムに適用して好適なるものである。

脊髄損傷は重篤な運動機能障害を引き起こし、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を大きく低下させる。脳や脊髄などの中枢神経系は、一度損傷を受けると自力での再生は一般には不可能とされている。

近年の再生医療分野では、患者の機能を改善・再生させるために神経組織の素となる細胞組織を体外で構築して移植する治療法が考案されているものの、細胞組織自体を構築する手法は未だ確立されていないのが現状である。特に機能改善・再生を目的とした神経細胞組織の構築においては、細胞の３次元構造の形成が重要とされている。

しかし、細胞の立体構造の形成は、細胞の成長方向に依存し、人為的なコントロールが困難であるため、立体構造の細胞を任意に構築する技術の開発が必要である。

従来から細胞を球状に凝集した細胞塊をひとつずつ積層させる手法が開発されているが、細胞の３次元構造化に膨大な時間がかかり、神経細胞の３次元構造化に関する研究分野の開拓が進展しにくい状況となっている。

近年、複数の細胞塊を立体構造化させる手法として、有底筒状の移植用ガイドの開口端側から供給される細胞塊を底材上に載置しておき、当該底材側を過剰量の培養液に浸すことにより、当該細胞塊を培養して細胞の立体構造体を形成する方法が提案されている（引用文献１参照）。

また細胞塊を針状体にて貫通させて蓄積し、隣り合う針状体間で細胞塊同士を接触させて３次元構造を作製する方法も提案されている（引用文献２参照）。さらにコアシェル型のファイバ状基材の表面に細胞層を被覆させて積層形成させる方法が提案されている（引用文献３参照）。

特登５７６９３３４号公報 特登４５１７１２５号公報 特開２０１６−７７２２９号公報

ところで、引用文献１では、筒状の移植用ガイドを単にモールド（鋳型）としたに過ぎず、重力で均しただけでは積層方向への足場が不安定となる問題があるとともに、培地に成長因子や栄養因子を浸しておくだけでは各細胞塊を十分に成長させることが不安な面も残る。

また引用文献２では、足場となる針状体を積層された複数の細胞塊から引き抜く際に、当該各細胞塊に損傷を与える可能性が大きいという問題が残る。各細胞塊が軟骨等の比較的堅牢な細胞であれば問題ないが、神経細胞のような繊細な細胞では針の抜き出し時に細胞塊を破壊する可能性があるという問題があった。

さらに引用文献３では、機械的強度を考慮して、ファイバ基材の中空内に細胞塊を培養液と一緒に流しながら積層させる手法であるが、コア部のゲルを除去してファイバ基材の内部を中空にする工程が必要な分、効率性に欠ける問題があった。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、安全性を確保しつつ効率的に多数の細胞塊を成長に伴い３次元方向に結合可能な細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムを提案しようとするものである。

かかる課題を解決するために本発明における細胞立体構造化方法においては、培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部内に、複数のファイバを相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めしておき、供給口から流路内に供給される培養液の液流にのせて、複数の細胞塊を当該流路内に投入し、当該各細胞塊を排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に集積しながら培養させるようにした。

このように培養液の液流にのせて流路内に供給される複数の細胞塊が、排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に付着しつつ流路方向に沿って積層されていくため、細胞塊を傷つけることなく、３次元方向に細胞塊を成長させながら結合化された細胞の立体構造体を効率良く形成することができる。

また本発明における細胞立体構造化システムにおいては、培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部と、相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めされている複数のファイバと、流路空間部の供給口から培養液を流路内に供給する液供給部とを備え、液供給部による培養液の液流にのせて複数の細胞塊が流路内に投入されながら、当該各細胞塊を排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に集積しながら培養させるようにした。

このように液供給部から筒体部の開口端に培養液を灌流させながら、当該培養液の液流にのせて流路内に複数の細胞塊を次々と供給していくことにより、これら複数の細胞塊が、排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に付着しつつ流路方向に沿って積層されていくため、細胞塊を傷つけることなく、３次元方向に細胞塊を成長させながら結合化された細胞の立体構造体を効率良く形成することができる。

さらに本発明においては、各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、外表面から中空内部又は側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて各細胞塊からの代謝老廃物を除去するようにした。

このように各ファイバに形成された多数の微細孔を通じて、当該ファイバ表面から流入される細胞塊の代謝老廃物をろ過して排出することにより、各細胞塊の成長を促進すると同時に不純物が除去される分だけ細胞の立体構造体の純度を向上させることができる。

さらに本発明においては、各ファイバは、各微細孔を通じて各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給するようにした。

このように各ファイバに形成された多数の微細孔を通じて、当該ファイバの外表面に集積している各細胞塊に成長因子や栄養因子を供給することにより、効率的に各細胞塊の成長を促進することができる。

さらに本発明においては、培養液の流速度を制御するとともに、当該培養液の制御状態に合わせて流路内に投入する細胞塊の数および投入タイミングを調整するようにした。さらに培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度の少なくとも１以上を制御するようにした。

この結果、培養液を常に生理環境下に近い状態に維持しながら、培養液の液流にのせて複数の細胞塊を流路内に投入することができることから、細胞塊の成長を最適化するのに十分寄与することが可能となる。

さらに本発明においては、各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、各ファイバに対して流路方向に沿った微細な振動を付与するようにした。この結果、ファイバの外表面に接触している各細胞塊が当該ファイバに形成された各微細孔に入り込んで流路方向に対してスライド困難になるのを回避することができる。かくして成長後の細胞塊をファイバから比較的容易に取り出すことが可能となる。

さらに本発明においては、流路空間部は、いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第１ケースおよび第２ケースを、当該溝を取り囲むように環状のシール材を介在させて接合することにより、当該シール材の環内で形成される密閉空間からなるようにした。この結果、細胞培養中における外部環境からのコンタミネーション（微生物学的汚染）の発生を防止することができる。

さらに本発明においては、各ファイバは、流路空間部における供給口側が閉塞され、かつ、排出口側が開口されている。この結果、流路空間部の供給口から培養液が入った場合、各ファイバの排出口側が陰圧となるため、培養液中の代謝物質を排出口に押し出すことが可能となる。

さらに本発明においては、各ファイバは、閉塞側と開口側との間に張力が加わるように流路空間部において支持されるようにした。この結果、各ファイバの両端が固定されて常時流路方向に沿って張力が与えられていることから、当該各ファイバに撓みが発生するのを未然に防止することができる。

本発明によれば、細胞塊を傷つけることなく安全性を確保しつつ、効率的に一度に多数の細胞塊を培養させて、成長に伴い３次元方向に結合可能な細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムを実現できる。

本発明の実施形態１に係る細胞培養システムの全体構成を示す概略図である。 同実施形態１に係る立体培養モジュールを示す略線的な断面図である。 同実施形態１に係るホローファイバの機能構成を示す概念図である。 同実施形態１による細胞培養システムの動作例を表すフローチャートである。 本発明の実施形態２において用いられる細胞塊（C2C12スフェロイド）の蛍光染色後の図である。 マルチウェルプレート上に複数の細胞塊が形成された状態を表す図である。 本発明の実施形態２に係る細胞培養システムの全体構成を示す概略図である。 同実施形態２に係る立体培養モジュールにおけるハウジング内の流路空間部の略線的な断面図である。 同実施形態２における複数のホローファイバの外表面に当接する細胞塊の積層状態の説明に供する略線図である。 同実施形態２に係る立体培養モジュールの構成を示す斜視図である。 同実施形態２による複数のホローファイバの平行な位置精度保証の説明に供する略線図である。 同実施形態２による複数のホローファイバの一端側のみ陰圧にする構成を示す概念図である。 同実施形態２による細胞培養システムの動作例を表すフローチャートである。 同実施形態２におけるコンタミネーションテストの試験前後の結果を表す図である。 同実施形態２における運動性の細菌等の有無について、試験前後の結果を表す図である。 同実施形態２によるスフェロイド播種実験の２４時間後の観察結果を表す図である。 図１６におけるホローファイバ間の状態についての部分的拡大図である。 他の実施形態に係るファイバの構成を略線図である。

以下図面について、本発明の一実施の形態を詳述する。

（１）本発明による細胞塊及びその立体構造化方法
細胞のうち足場依存性細胞は、培養液中で浮いている状態では死滅するため、足場に付着させて増殖させる必要がある。皮膚や骨などの細胞は、培養時に足場を求めて互いに接着し合い、細胞と細胞自身が算出する細胞外基質により凝集体である細胞塊（スフェロイド）を形成する。細胞塊は、細胞が集積した直径100〜400〔μm〕程度の球状凝集塊であり、細胞塊同士も接着して融合するとさらに大きな形状となる。

細胞塊に適する細胞は、幹細胞（ES細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞等）、体細胞、腫瘍細胞などの未分化細胞又はその分化型細胞である。また骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞は、未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導が可能なため、これらの分化誘導した細胞（関節軟骨細胞、骨細胞等）も使用することができる。

本発明の細胞塊は、中胚葉系の組織を中心として、関節軟骨、骨のほか、乳房などの脂肪組織、靱帯、腱、歯、耳介、鼻などに適用することができるとともに、中胚葉系にとどまらず、肝臓、すい臓や血管、神経などほとんど全ての接着系細胞にも応用することができる。

また、細胞塊は、必ずしも単一の種類の細胞の凝集体として形成される必要はなく、細胞塊が形成される限り、複数種類の細胞種から形成されてもよい。このようなキメラ状のスフェロイドを用いて、本発明の細胞構築物を製造することもできる。

なお、培養液は、一般的なＰＳＮ（Penicillin、Streptomycin、Neomycin:いずれも抗生物質）が含有されたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified eagle’s medium）９０〔vol％〕に１０〔vol％〕のＦＢＳ（Fetal bovine serum：牛胎児血清）を添加した培養液を使用する。

本発明における細胞の立体構造化方法は、上述のような細胞塊（スフェロイド）を最適な灌流培養環境下で複数集積させつつ、成長に伴い結合させることにより、培養液の流路方向に積層させながら立体構造化させるようになされている。

（２）実施形態１
（２−１）実施形態１における細胞培養システムの全体構成
図１に示すように、実施形態１による細胞培養システム１、立体培養モジュール２の上流段に培養容器３、下流段に回収容器４が接続され、制御部５による統括制御下において、培養容器３から供給される成長因子（ＮＧＦ）や栄養因子を含む培養液６を、一定の培養環境条件を維持しながら立体培養モジュール２に対して灌流させるようになされている。

細胞培養システム１では、制御部５による制御下にて、培養容器３からポンプ７によって吸引された培養液６が、ＣＯ_２ガスシリンダ８、ヒータ９及び流速センサ１０を順次介して立体培養モジュール２に供給される。

立体培養モジュール２には、常に新しい培養液６が連続して供給されるとともに、所定タイミングで外部から細胞塊が順次供給される。この立体培養モジュール２は、後述するように、培養液６が培養容器３から回収容器４へと灌流される状況下で、複数の細胞塊を流路方向に積層させながら結合させることにより細胞の立体構造体を形成する。

立体培養モジュール２から排出される培養液６は、下流側の温度センサ１１及びＣＯ_２センサ１２を順次介して回収容器４に移送される。

細胞培養システム１では、立体培養モジュール２に供給する培養液６を細胞培養に最適な培養環境（生理的環境又はこれに近い環境）となるように、液温度及び溶存する二酸化炭素の濃度を制御している。

すなわち制御部５は、培養容器３からポンプ７により培養液６を吸引しながら、ＣＯ_２ガスシリンダ８を用いて当該培養液６に二酸化炭素を注入して溶存させる。その際、制御部５は、立体培養モジュール２の下流段に位置するＣＯ_２センサ１２の検知結果に基づいて、培養液６に溶存する二酸化炭素の濃度を５%前後に維持することにより、培養液６のpH域を6.8〜7.2に保つように制御する。

また制御部５は、立体培養モジュール２の下流段に位置する温度センサ１１の検知結果に基づいて、培養容器３から吸引した培養液６の温度が３７℃を維持するようにヒータ９を制御する。

さらに制御部５は、立体培養モジュール２に供給する培養液６の流速度を所望状態を維持するように、ポンプ７を駆動制御する。

このようにして細胞培養システム１では、生理的環境に近い環境状態において、培養容器３から常に新しい培養液６を立体培養モジュール２に供給して灌流させることができる。

（２−２）実施形態１による立体培養モジュールの構成
図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、立体培養モジュール２は、培養液６の供給路に接続される開口端２０Ａから内壁面２０Ｂで囲まれる空間を流路とするシリンダ（筒体部）２０を有し、当該シリンダ２０の内壁面２０Ｂには流路方向に沿って複数の溝部２０Ｃが形成されている。

このシリンダ２０の内部空間には、複数のホローファイバ２１の一端を着脱自在に保持する平面プレート２２が、培養液６の流路方向に対してその表面が垂直関係を保つように位置決めされて収容されている。

平面プレート２２は、シリンダ２０内において流路の断面形状（流路幅）内に収まる形状及びサイズとなるように設計されており、複数のホローファイバ２１の一端に対応する嵌合穴（図示せず）がそれぞれ貫通形成されている。

複数のホローファイバ２１の他端は、貫通保持プレート２３により着脱自在に保持されている。貫通保持プレート２３は、平面プレート２２の各嵌合穴に対応して複数の貫通穴が形成されている。また貫通保持プレート２３は、平面プレート２２と同様にシリンダ２０内において流路の断面形状内に収まる形状及びサイズとなるように設計されている。

立体培養モジュール２のシリンダ２０内に平面プレート２２及び貫通保持プレート２３を位置決めした際、当該シリンダ２０の開口端２０Ａから流路に供給される培養液６は、貫通保持プレート２３及び平面プレート２２の存在が抵抗となることなく、複数の溝部２０Ｃを通じて下流段に流出させることができる。その際、複数のホローファイバ２１には、それぞれ貫通保持プレート２３の各貫通穴を介して培養液６が供給され、平面プレート２２の各嵌合穴を通じて流路の下流段に流出させることができる。

これら複数のホローファイバ２１は、一端が平面プレート２２に、かつ他端が貫通保持プレート２３に挟まれるように固定保持された状態で一体となってシリンダ２０の内部空間に収容される。

その際、複数のホローファイバ２１は、貫通保持プレート２３の各貫通穴及び対応する平面プレート２２の各嵌合穴を介して、対応する中空内部がシリンダ２０の内部空間と連通接続されることから、シリンダ２０の開口端２０Ａから供給される培養液は、各ホローファイバ２１の中空内部を通じてシリンダ２０の内部空間（流路）に排出される。

図３に示すように、各ホローファイバ２１は、直径が0.3〔mm〕〜３〔mm〕程度の化学繊維で成形された線状の中空糸膜からなり、ファイバ表面（外表面）２１Ａには多数の孔幅が0.01〔μm〕〜数〔μm〕のスリット状の超微細孔２１Ｈが貫通形成されている。

これにより各ホローファイバ２１に形成された多数の超微細孔２１Ｈを通じて、培養液中の成長因子（ＮＧＦ）や栄養因子をファイバ表面２１Ａに染み出すことができる一方、当該ファイバ表面２１Ａから流入される細胞塊の老廃物や不純物質等をろ過して排出することができる。

なお、複数のホローファイバ２１の配列状態は、シリンダ２０の内部空間内で特にパターン配列の有無は問わず、ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積される細胞塊に対して成長因子や栄養因子を実用上十分に供給することが可能な間隔を保つことができれば、自由に設定することができる。

すなわち細胞の立体構造体を形成する過程において、各ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積している細胞塊群が未だ成長途上の段階であっても、当該細胞塊群から各ホローファイバ２１を引き抜いても培養させ続ければ、その後の成長に伴い、各ホローファイバ２１が存在した空間を埋めるように細胞塊同士が結合されるためである。

（２−３）実施形態１による細胞立体構造化方法
図４に実施形態１による細胞培養システム１の動作例を表すフローチャートを示す。まず立体培養モジュール２について、貫通保持プレート２３及び平面プレート２２の間に固定保持された複数のホローファイバ２１をシリンダ２０の内部空間（流路上）に収容しておく。

続いて細胞培養システム１において、制御部５は、ポンプ７を制御して、培養容器３内の培養液６を一定の培養環境条件を保ちながら立体培養モジュール２のシリンダ２０の開口端２０Ａから供給しながら灌流させる（ステップＳＰ１）。

シリンダ２０内の流路に常に新しい培養液６が供給される状態で、当該シリンダ２０の開口端２０Ａから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液６の液流にのせて投入する（ステップＳＰ２）。

シリンダ２０内部に投入される複数の細胞塊は、平面プレート２２の表面にランダムに当接しながら各ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積し始める（ステップＳＰ３）。続いて複数の細胞塊は、培養液６の液流にのってさらにシリンダ２０内に投入されると、平面プレート２２の表面に既に集積している細胞塊に当接しながら各ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積しつつ、かつ流路方向に積層し続ける。

その際、各ホローファイバ２１の中空内部から多数の超微細孔を介して成長因子又は栄養因子が外表面２１Ａに集積している各細胞塊に供給されると同時に、当該各細胞塊から多数の超微細孔２１Ｈを介して代謝物質や老廃物がろ過されて中空内部に排出される。

このように立体培養モジュール２において、複数の細胞塊が各ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積しながら隣り合う細胞塊同士で成長して結合するのみならず、流路方向に沿って積層している細胞塊同士も成長して結合する（ステップＳＰ４）。

やがて立体培養モジュール２に細胞塊を投入終了後、シリンダ２０の内部空間には平面プレート２２を成長起点として多数の細胞塊が３次元方向に相互結合してなる立体構造体が形成される。

立体培養モジュール２において、シリンダ２０から複数のホローファイバ２１を平面プレート２２及び貫通保持プレート２３とともに取り出した後、当該平面プレート２２から全てのホローファイバ２１をプッシュプル動作（ファイバ方向への往復動作）で引き抜くことにより、平面プレート２２の表面には細胞の立体構造体のみ残存する（ステップＳＰ５）。

なお細胞の立体構造体は、各細胞塊が成長途上の段階で各ホローファイバ２１から引き抜くようにすれば、当該各ホローファイバ２１の残存空間も隣接し合う細胞塊同士で成長して結合させることも可能となる。

（３）実施形態２
（３−１）実施形態２における細胞培養システムの全体構成
実施形態２においては、細胞塊を比較的容易に形成するため、マウス筋芽細胞
を利用する。C2C12細胞は、分化の際に筋繊維を形成する天然の融合能を有するため、分化誘導に先立って互いに付着し合うことが期待される。

細胞塊を作製するために、100〔μｌ〕の細胞懸濁液（10〔％〕牛胎児血清を添加したDME/RPMI1640 1/1中に10^４〜10^５〔cells/ml〕）を96ウェルプレート（MS-9096V/住友ベークライト製）の各ウェルに入れ、一晩放置した。その結果、一次形成されたC2C12スフェロイドの直径は、懸濁液中の初期細胞量に依存して100〜400〔μｍ〕の間で変化した。

本発明では約300〔μｍ〕のサイズの細胞塊を使用する。細胞生存率を保証するためにCalcein AMで蛍光染色したC2C12の細胞塊を図５に示す。図６に示すマルチウェルプレート上で予め細胞から細胞塊を形成し、後述する細胞培養システム１００（図７）への播種を行う。

図７に示すように、実施形態２による細胞培養システム１００は、立体培養モジュール１０１の上流段に貯蔵容器１０２、下流段に回収容器１０３が接続され、制御部１０４による統括制御下、新鮮な培養液が収容されている培養容器１０５から供給される培養液１０６を貯蔵容器１０２をバッファとして一定の培養環境条件を維持しながら立体培養モジュール１０１に対して灌流させるようになされている。

細胞培養システム１００では、制御部１０４による制御下にて、培養容器１０５から供給用ポンプ１０７によって吸引された培養液６が、貯蔵容器１０２に一旦貯蔵された後、循環用ポンプ１０８によって立体培養モジュール１０１に供給される。

立体培養モジュール１０１には、貯蔵容器１０２から常に新しい培養液１０６が連続して供給されるとともに、所定タイミングで外部から細胞塊が順次供給される。この立体培養モジュール１０１は、後述するように、培養液１０６が培養容器１０５から貯蔵容器１０２を経て回収容器１０３へと灌流される状況下で、複数の細胞塊を流路方向に積層させながら結合させることにより細胞の立体構造体を形成する。

立体培養モジュール１０１から排出される培養液１０６は、回収容器１０３に移送される。この立体培養モジュール１０１の下流段は、回収容器１０３及び貯蔵容器１０２の両方に接続されており、それぞれストップバルブ１０９，１１０の開閉動作に応じていずれかの容器１０２，１０３に培養液が移送される。

なお、細胞は代謝活動によって酸素を消費するため、培養液中の酸素濃度を下げないことが重要である。このため培養容器１０５、貯蔵容器１０２、立体培養モジュール１０１及び回収容器１０３を、それぞれシリコーンチューブ（図示せず）を介して接続することにより、シリコーンチューブ内に流れる培養液１０６がシリコーンゴムの高い気体透過性によって酸素が外気との平衡状態に向かうため、酸素濃度を一定に保った培養液を常に細胞塊にすることができる。

細胞培養システム１００では、立体培養モジュール１０１に供給する培養液１０６を細胞培養に最適な培養環境（生理的環境又はこれに近い環境）となるように、液温度及び溶存する二酸化炭素の濃度を制御している。

すなわち制御部１０４は、培養容器１０５から供給用ポンプ１０７により培養液１０６を吸引しながら、ＣＯ_２ガスシリンダ（図示せず）を用いて当該培養液１０６に二酸化炭素を注入して溶存させる。その際、制御部１０４は、立体培養モジュール１０１の下流段に位置するＣＯ_２センサ（図示せず）の検知結果に基づいて、培養液１０６に溶存する二酸化炭素の濃度を５％前後に維持することにより、培養液１０６のｐＨ域を6.8〜7.2に保つように制御する。

また制御部１０４は、立体培養モジュール１０１の下流段に位置する温度センサ（図示せず）の検知結果に基づいて、培養容器１０５から吸引した培養液１０６の温度が３７℃を維持するようにヒータ（図示せず）を制御する。

さらに制御部１０４は、貯蔵容器１０２から立体培養モジュール１０１に供給する培養液１０６の流速度を所望状態に維持するように、循環用ポンプ１０８を駆動制御する。この循環用ポンプ１０８は、流量を可変に制御するためにＰＷＭ（Pulse Width Modulation）制御が行われる。そのためのパラメータ値として、貯蔵容器１０２の容量を100〔ml〕、シリコーンチューブの直径を２〔mm〕、ホローファイバ１３０（図８及び図９）の直径を0.5〔mm〕、ホローファイバ１３０の数を４本とする。循環速度の要件を満たすために、循環用ポンプ１０８の吐出流量の初期値を８〔ml/min〕とする。

このようにして細胞培養システム１００では、生理的環境に近い環境状態において、培養容器１０５から常に新しい培養液１０６を立体培養モジュール１０１に供給して灌流させることができる。

この細胞培養システム１００は、立体培養モジュール１０１において細胞塊同士を結合させ組織化を図るために、多数の細胞塊を立体的に収容する必要がある。また作製後の移植適用を考慮し、細胞塊の播種、培養、組織回収のすべてが可能な構造を有している。

また細胞培養システム１００では、立体培養モジュール１０１において細胞の増殖及び成長に対応するために、広い速度変動で栄養及び酸素を供給する必要がある。そこで、培養液１０６の循環量を制御して、細胞塊から老廃物を排出し、新鮮な栄養を供給するための構造を有している。

さらに細胞培養システム１００では、細胞培養時に微生物学的汚染（コンタミネーション）の発生が、予想される最も頻度の高い問題である。コンタミネーションが起きた場合、培養液のｐＨや栄養分の低下に起因し、アポトーシス（細胞死）の可能性が高まるおそれがある。このため細胞培養システム１００は、培養する細胞の保護や結果の信頼性を保証するためにも、コンタミネーションの発生を防ぐ材質及び構造を有する。

（３−２）実施形態２による立体培養モジュールの構成
本発明による細胞培養システム１００においては、立体培養モジュール１０１を密閉構造にしてコンタミネーションを防止するのみならず、容易かつ迅速な分解を可能にして細胞塊を取り出し得る構造に形成されている。コンタミネーションを防止するためには、立体培養モジュール１０１内の流路空間を密閉構造にすることが望ましいが、例えばエポキシ樹脂を用いてホローファイバを含む流路空間を完全密封した場合には、培養後の細胞塊を取り出すためには、モジュール自体を切断しなければならない。

このように培養した細胞組織の移植を考慮すると、密閉構造だけでなく、容易かつ迅速な分解を可能とする立体培養モジュールを開発する必要がある。そこで、密閉性と、培養組織の取り出しやすさを両立するために、Ｏリング等のシール材を用いた立体培養モジュール１０１を提案する。

図８に示すように、立体培養モジュール１０１は、全体が透明な部材からなるハウジング１２０（第１ケース１２０Ａ及び第２ケース１２０Ｂ）内に流路空間部１２１が密閉空間として形成された構成からなる。

流路空間部１２１は、いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第１ケース１２０Ａおよび第２ケース１２０Ｂを、当該溝を取り囲むように環状のシール材であるＯリング１２２を介在させて接合することにより、当該Ｏリング１２２の環内で形成される密閉空間からなる。

Ｏリング１２２の特徴として、構造が簡単であり容易に取り外しが行える点、広い温度範囲に対応できる点、流体に対するシール機能が高い点が挙げられる。容器設計の際には、Ｏリング嵌め込み用の溝とボルトＢＴ１〜ＢＴ８とナットＮＴ１〜ＮＴ８による締め付けが可能な形状が求められる。

ハウジング１２０（第１ケース１２０Ａ及び第２ケース１２０Ｂ）の材質は、細胞の形態変化の観察やコンタミネーションの有無などを確認するために、光学的に透明な素材であることと、滅菌に必要な熱処理に耐えうる耐熱性を有することが必要である。

また、ホローファイバの栄養及び酸素を共有する効果は、物質の拡散則に従い距離に比例して減少するため、ホローファイバは、培養組織の内部に配置することが重要である。そのため図８及び図９（ａ）、（ｂ）に示すように、複数のホローファイバ１３０と当該各ホローファイバ１３０を取り巻く複数の細胞塊とが同距離に配置され、これら細胞塊を上方向（ファイバ長手方向）に積層し得るように、ハウジング１２０内に流路空間部１２１が形成されている。

ホローファイバ１３０を介して培養液の循環を行うためには、ハウジング１２０と接続するための培養液１０６の供給口と排出口を設ける必要がある。

ただし、ホローファイバ１３０は柔らかく、曲がりやすい性質をもつため、細胞塊が積層された状態で撓んでしまった場合、栄養と酸素が一部の細胞に十分供給されない可能性がある。したがって、ホローファイバ１３０を組織の積層方向と平行に配置し、両端に張力をかける構造にすることにより、ホローファイバ１３０の撓みを防止する設計を行う。

またホローファイバ１３０から細胞塊までの距離が500〔μｍ〕以上となる条件では、細胞の生存率が下がってしまうため、壊死を避けるようにホローファイバ１３０を配置する必要がある。そこで、本発明による立体培養モジュール１０１では、ホローファイバ１３０からの最大距離が約300〔μｍ〕となるようにホローファイバ１３０を配置し、ハウジング１２０内の流路空間部（スタックエリア）１２１の幅を２〔ｍｍ〕に設定した（図８）。

また、細胞の成長と増殖に応じて十分な栄養と酸素を供給し、細胞から老廃物を除去するために、立体培養モジュール１０１に供給する培養液１０６の循環速度を可変に制御する必要がある。循環用ポンプ１０８の最適な速度設定には細胞株の特性、培地の緩衝能、血清の添加などを考慮する必要があるが、最低でも１日あたりの供給培地量を１タンク培地量とすると、生存細胞数と培養の生存率が著しく向上することが確認されている。

また、循環速度の上限は培養細胞株の物理的なせん断応力に対する感受性の高低に制約される。ホローファイバ１３０を用いて灌流培養を行うときの哺乳類細胞が受ける物理的せん断ストレスについて評価が行われており、せん断速度が3000〔1/sec〕以下であれば細胞生存率の低下は起きない。

せん断速度の大きさＳは、流量をＱ、ホローファイバ１３０の半径をｒ、流速の平均をＶ_ａｖ、ホローファイバ１３０の直径をＤとすると、次式（１）のように表される。

ここでホローファイバ１３０をＮ本使うとき、流速の平均Ｖ_ａｖは、次式（２）のように表される。

上述の式（１）及び式（２）から次式（３）が導かれる。

以上の結果を用いて、細胞培養システム１００では、細胞の受けるせん断速度Ｓが3000〔1/sec〕以下で、供給培地量を１タンク培地量以上となるように循環速度を決定する必要がある。

さらに立体培養モジュール１０１は、図１０に示すように、ハウジング１２０（第１ケース１２０Ａ及び第２ケース１２０Ｂ）に形成された流路空間部１２１には、貯蔵容器１０２とシリコーンチューブを介して接続するための供給口１２１Ｓと、回収容器１０３とシリコーンチューブを介して接続するための排出口１２１Ｄとを有し、供給口１２１Ｓを介して細胞塊を播種とすることが可能である。

またＯリング１２２とボルトＢＴ１〜ＢＴ８及びナットＮＴ１〜ＮＴ８の締め付けによってハウジング１２０内の流路空間部１２１を密閉可能であり、ボルトＢＴ１〜ＢＴ８の締め付けを緩めれば中の細胞塊をすぐに取り出すことが可能である。ハウジング１２０（第１ケース１２０Ａ及び第２ケース１２０Ｂ）の素材は透明なポリカーボネートの板を用いており、耐熱性と透明性が高く、オートクレープ滅菌の適用と内部の観察が可能である。

ホローファイバ１３０は直径0.5〔ｍｍ〕、細孔径0.1〔μｍ〕ポリスルフォン製のものを４本用いる。２枚の固定プレート１３１，１３２は等間隔で直径0.6〔ｍｍ〕の貫通穴を有しており、ホローファイバ１３０を両方のプレート１３１，１３２に通すことで平行な位置精度を保証することができる（図１１）。

流路空間部１２１の上下のスペースに複数のホローファイバ１３０を保持するための固定プレート１３１，１３２を２枚嵌め込むと、各ホローファイバ１３０の両端に微小な張力がかかるように長さが設定されており、シリコーンＳＮによって両端を固定して撓みの発生を防止している。

また図１２に示すように、複数のホローファイバ１３０の各端部の片側はシリコーンＳＮで閉塞させ、もう片方を開口することにより、供給口１２１Ｓから培養液１０６が入った場合、排出側の端部が陰圧となるため、培養液１０６中の代謝物質（老廃物）を排出口１２１Ｄに押し出すことが可能である。

立体培養モジュール１０１に細胞塊を播種することにより、上述した図９（ａ）及び（ｂ）に示すように細胞塊が積層していき、組織を形成することができる。

なお、細胞培養システム１００においては、制御部１０４を構成する全ての部品は、保護水準IP67の防水ボックス（図示せず）の中へ入れて密閉することにより、外気に接触しない構造となっている。ボックスカバーを取り付けた後にアルコールでボックスの外側全面を殺菌することで、オートクレーブ滅菌ができない電気系部品に起因するコンタミネーションのリスクを低減している。制御部１０４以外の部品は全てオートクレーブで高圧蒸気滅菌（標準的に水の飽和蒸気圧が２気圧となる121〔℃〕で20分間滅菌）可能である。制御部１０４に接続する全てのケーブルはIP68防水ケーブルコネクタを介して制御部１０４の外側と内側で接続され、密閉性を保ったまま、電源の供給とアクチュエータの駆動を行うことが可能となっている。

医療現場における滅菌保証のガイドラインに基づき、洗浄度と乾燥の確認（項目１）、物理的適合性（項目２）、浸透性（項目３）の評価項目を確認する。項目１について、全ての器具は新品であり、十分洗浄・乾燥させたものを用いている。項目２について、材料選定の段階で耐熱限界温度がオートクレーブの最高温度である121〔℃〕より高いものを用いており、温度と圧力の変化について、オートクレーブ滅菌を行う前後で変形や破損及び融解が起こらないことを確認した。

項目３について、培養液１０６に触れる部品はシリコーンチューブで接続した状態でオートクレーブ滅菌を行う。シリコーンゴムは気体透過において特に水蒸気の透過性が高いことが大きな特徴であり、細菌などは混入できない密閉系を実現しながら接続している全ての部品に極めて効率的に蒸気を浸透させることができる。

（３−３）実施形態２による細胞立体構造化方法
図１３に実施形態２による細胞培養システム１００の動作例を表すフローチャートを示す。まず立体培養モジュール１０１について、２枚の固定プレート１３１，１３２の間に固定保持された複数のホローファイバ１３０をハウジング１２０の流路空間部１２１に収容しておく。

すなわち複数のホローファイバ１３０を２枚の固定プレート１３１，１３２とともに流路空間部１２１の上下のスペースに嵌め込んだ後、第１ケース１２０Ａ及び第２ケース１２０ＢをＯリング１２２を介在させて接合することにより、当該Ｏリング１２２の環内で形成される密閉空間内に収容させることができる。

続いて細胞培養システム１００において、制御部１０４は、供給用ポンプ１０７及び循環用ポンプ１０８を制御して、培養容器１０５内の培養液１０６を貯蔵容器１０２を介して一定の培養環境条件を保ちながら立体培養モジュール１０１のハウジング１２０における流路空間部１２１の供給口１２１Ｓから供給しながら灌流させる（ステップＳＰ１０）。

貯蔵容器１０２から流路空間部１２１に常に新しい培養液１０６が供給される状態で、当該流路空間部１２１の供給口１２１Ｓから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液１０６の液流にのせて投入する（ステップＳＰ１１）。

流路空間部１２１内に投入される複数の細胞塊は、排出口１２１Ｄの近傍における固定プレート１３２の表面にランダムに当接しながら各ホローファイバ１３０の外表面に集積し始める（ステップＳＰ１２）。続いて複数の細胞塊は、培養液１０６の液流にのってさらに流路空間部１２１内に投入されると、既に集積している細胞塊に当接しながら各ホローファイバ１３０の外表面に集積しつつ、かつ流路方向に積層し続ける。

その際、各ホローファイバ１３０の中空内部から多数の超微細孔を介して成長因子又は栄養因子が外表面に集積している各細胞塊に供給されると同時に、当該各細胞塊から多数の超微細孔を介して代謝物質や老廃物がろ過されて中空内部に排出される。

このように立体培養モジュール１０１において、複数の細胞塊が各ホローファイバ１３０の外表面に集積しながら隣り合う細胞塊同士で成長して結合するのみならず、流路方向に沿って積層している細胞塊同士も成長して結合する（ステップＳＰ１３）。

やがて立体培養モジュール１０１に細胞塊を投入終了後、ハウジング１２１の流路空間部１２１には排出口１２１Ｄの近傍を成長起点として多数の細胞塊が３次元方向に相互結合してなる立体構造体が形成される。

立体培養モジュール１０１において、ハウジング１２０の流路空間部１２１内から複数のホローファイバ２１を２枚の固定プレート１３１，１３２とともに取り出した後、当該固定プレート１３１，１３２から全てのホローファイバ１３０をプッシュプル動作（ファイバ方向への往復動作）で引き抜くことにより、細胞の立体構造体を抽出する（ステップＳＰ１４）。

なお細胞の立体構造体は、各細胞塊が成長途上の段階で各ホローファイバ１３０から引き抜くようにすれば、当該各ホローファイバ１３０の残存空間も隣接し合う細胞塊同士で成長して結合させることも可能となる。

（３−４）実施形態２による実験結果
細胞培養システム１００においては、まず細胞培養を行う前段階として、安全に細胞に適用できるか検証するため、培養液を連続的に循環させた際のコンタミネーションの有無を確認する。

細胞培養システム１００において、貯蔵容器１０２と立体培養モジュール１０１との間で細胞を含まない状態で培養液１０６のみを５日間循環させる。実験は実際の細胞培養環境であるＣＯ_２インキュベータ内（室温37℃、ＣＯ_２濃度５％、湿度＞95％）のもとで行う。実験操作は全て無菌環境であるクリーンベンチ内で行う。コンタミネーションの検出方法として以下の項目を２４時間ごとに確認する。

項目１として、培養液１０６の色が、赤から黄色に変化するか否かを確認する。項目２として、培養液１０６の濁り具合が、乳白色の濁りが見えるか否かを確認する。項目３として、顕微鏡による観察にて、細菌の運動の様子が見えるか否かを確認する。位相差顕微鏡で確認する際には、回収容器１０３から少量の培養液を採取し、ディッシュに移してから観察を行う。

上述の実験結果として、コンタミネーションテストにおける実験前後（120分経過前後）の観察結果として図１４（ａ）及び（ｂ）により、実験前後で培地の色が変わっておらず、培養液１０６が濁っていないことが確認された。また、図１５（ａ）及び（ｂ）により、実験前後で運動性の細菌等がいないことが確認された。

続いて細胞培養システム１００に細胞塊を播種した際に意図される細胞塊の積層や細胞の成長が見られるかを確認する。循環用の培養液１０６は、DMEM（Gibco）＋10％FBSを50〔ml〕用いる。作製したC2C12スフェロイドを循環用ポンプ１０８で吸引し、固定プレート１３２から剥離する。吸引された細胞塊はシリコーンチューブ内に格納される。培養した細胞を全て有効利用するため、固定プレート１３２のウェル内に細胞塊が残っていないことを顕微鏡で確認する。

シリコーンチューブを立体培養モジュール１０１の流路空間部１２１の供給口１２１Ｓに接続し、循環用ポンプ１０８を逆回転させてシリコーンチューブ内の細胞塊を流路空間部１２１に播種する。その後、細胞培養システム１００をインキュベータ（図示せず）内に設置し、培養液１０６の循環を開始する。２４時間後に立体培養モジュール１０１内部を顕微鏡によって確認する。

上述の細胞塊播種実験の２４時間後の立体培養モジュール１０１内部の観察結果を図１６（ａ）及び（ｂ）に示す。黒く見える部分はホローファイバ１３０であり、細胞塊を白色の点線で囲んでいる。図１６（ｂ）の中央拡大図である図１７に示すように、実験開始時（図１７（ａ））と２４時間経過した後（図１７（ｂ））の変化を表している。図１６（ｂ）から細胞塊が流路空間部１２１の全体に積層しているのが確認できる。また図１７（ｂ）から細胞塊同士が成長して部分的に融合し、形状が球体から変形している様子が確認できる。

（５）他の実施の形態
本実施形態１においては、立体培養モジュール２として、線状からなる複数のホローファイバ２１の外表面２１Ａに平面プレート２２を成長起点として細胞塊群を成長に伴い３次元方向に結合させて略円柱形状の立体構造体を形成する場合について述べたが、本発明はこれに限らず、所望の立体形状に合わせて複数のホローファイバの形状及び湾曲状態など自由に設計するようにしても良い。

なお筒体部であるシリンダ２０は、細胞の立体構造体の外郭を規制することになるが、当該立体構造体の形状をガイドする鋳型ではない。細胞の立体構造体は、各ホローファイバ２１の外表面２１Ａに集積しながら流路方向にも積層して互いに隣接し合う同士で成長して結合することにより、３次元方向における全体のサイズ及び形状が特定される。

例えば、平面プレート２２及び貫通保持プレート２３の間に挟まれる複数のホローファイバ２１を、培養液６の流路の中心部は直線形状にするとともに、外側になるにつれて外方に張り出すような湾曲形状とすることにより、形成される細胞の立体構造体は全体として中央が膨らんだ臓器形状とすることが可能となる。

また本実施形態１においては、立体培養モジュール２を構成する複数のファイバとして、線状の中空糸膜からなる中空内部をもつホローファイバ２１を適用する場合について述べたが、本発明は中空構造に限らず、例えば図１８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、長手方向に沿って側溝が形成されたファイバを適用するようにしても良い。図１８（Ａ）は１本のファイバ３０に単一の溝３０Ａを形成した場合を示し、図１８（Ｂ）は１本のファイバ３１に３つの溝３１Ａ〜３１Ｃを形成した場合を示す。これらファイバ３０、３１も、側溝以外の壁面部に多数のスリット状の超微細孔を有し、当該各超微細孔を介して側溝内部とシリンダ２０の内部空間とで物質交換し得れば良い。

上述したように各ホローファイバ２１は、直線線状に限定されず、外表面に細胞塊を集積させた細胞塊を損傷することなく抜き取りことが可能であれば、断面形状は中空又は側溝を有している限り、所望形状及び所望サイズに湾曲や屈曲させるなど自由に設計するようにしても良い。シリンダ２０も培養液６の流路である限り、断面形状及びサイズは、平面プレート２２の挿入を妨げることなく培養液６を灌流可能である限り自由に設計しても良い。

また本実施形態１においては、細胞培養システム１にて制御部５は、温度センサ１１及びＣＯ_２センサ１２から得られた培養液６の温度及び二酸化炭素濃度に基づいて、ポンプ７及びＣＯ_２ガスシリンダ８を制御することにより、当該培養液６の温度及び二酸化炭素濃度を生理的環境に近い環境状態を保つようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、これに加えて酸素濃度及び窒素濃度も検知して制御するようにしても良い。

さらに本実施形態１においては、シリンダ２０の開口端２０Ａから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液６の液流にのせて投入するようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、制御部５による培養液６の制御状態に合わせてシリンダ２０の流路内に投入する細胞塊の数および投入タイミングを調整する細胞投入調整部（図示せず）をさらに設けることにより、自動化を図るようにしても良い。

さらに本実施形態１及び２において、培養液６、１０６に含まれる成長因子や栄養因子は、特に限定はされないが、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）及びインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）等を挙げることができる。培養しようとする細胞塊の種類に応じて他の成長因子や栄養因子を用いることも可能である。

本実施形態２においては、立体培養モジュール１０１として、線状からなる４本のホローファイバ１３０の外表面に流路空間部１２１の排出口１２１Ｄの近傍における固定プレート１３２を成長起点として細胞塊群を成長に伴い３次元方向に結合させて略円柱形状の立体構造体を形成する場合について述べたが、本発明はこれに限らず、排出口１２１Ｄの近傍であれば固定プレート１３２の表面に当接しなくても流路上で自然に密接し合いことで成長起点とするようにしてもよい。

さらに本実施形態２においては、複数のホローファイバ１３０を流路空間部１２１内に固定した場合について述べたが、本発明はこれに限らず、制御部１０４の制御下にて、各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、各ホローファイバ１３０に対して流路方向又は逆方向に沿って交互に微細な振動を付与する振動付与部（図示せず）をさらに備えるようにしてもよい。この結果、各ホローファイバ１３０の外表面に接触している各細胞塊が当該ホローファイバ１３０に形成された各微細孔に入り込んで流路方向に対してスライド困難になるのを回避することができる。かくして成長後の細胞塊をホローファイバ１３０から比較的容易に取り出すことが可能となる。

１、１００……細胞培養システム、２，１０１……立体培養モジュール、３，１０５……培養容器、４，１０３……回収容器、５，１０４……制御部、６，１０６……培養液、７……ポンプ、８……ＣＯ_２ガスシリンダ、９……ヒータ、１０……流速センサ、１１……温度センサ、１２……ＣＯ_２センサ、２０……シリンダ、２０Ａ……開口端、２０Ｂ……内壁面、２０Ｃ……溝、２１……ホローファイバ、２１Ａ……ファイバ表面、２１Ｈ……超微細孔、２２……平面プレート、２３……貫通保持プレート、３０，３１……ファイバ、１０２……貯蔵容器、１０７……供給用ポンプ、１０８……循環用ポンプ、１２０……ハウジング、１２０Ａ……第１ケース、１２０Ｂ……第２ケース、１２１……流路空間部、１２１Ｓ……供給口、１２１Ｄ……排出口、１２２……Ｏリング、１３０……ホローファイバ、１３１，１３２……固定プレート。

Claims (16)

1. 培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部内に、複数のファイバを相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めしておき、
   前記供給口から前記流路内に供給される前記培養液の液流にのせて、複数の細胞塊を当該流路内に投入し、当該各細胞塊を前記排出口の近傍を成長起点として前記各ファイバの外表面に集積しながら培養させる
   ことを特徴とする細胞の立体的培養方法。
2. 前記各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、前記外表面から前記中空内部又は前記側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて前記各細胞塊からの代謝老廃物を除去する
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞の立体的培養方法。
3. 前記各ファイバは、前記各微細孔を通じて前記各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給する
   ことを特徴とする請求項２に記載の細胞の立体的培養方法。
4. 前記培養液の流速度を制御するとともに、当該培養液の制御状態に合わせて前記流路内に投入する前記細胞塊の数および投入タイミングを調整する
   ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
5. 前記培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度の少なくとも1以上を制御する
   ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
6. 前記各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、前記各ファイバに対して流路方向に沿った微細な振動を付与する
   ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
7. 培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部と、
   相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めされている複数のファイバと、
   前記流路空間部の前記供給口から前記培養液を前記流路内に供給する液供給部と
   を備え、前記液供給部による前記培養液の液流にのせて複数の細胞塊が前記流路内に投入されながら、当該各細胞塊を前記排出口の近傍を成長起点として前記各ファイバの外表面に集積しながら培養させる
   ことを特徴とする細胞の立体的培養システム。
8. 前記流路空間部は、
   いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第１ケースおよび第２ケースを、当該溝を取り囲むように環状のシール材を介在させて接合することにより、当該シール材の環内で形成される密閉空間からなる
   ことを特徴とする請求項７に記載の細胞の立体的培養システム。
9. 前記各ファイバは、
   前記流路空間部における前記供給口側が閉塞され、かつ、前記排出口側が開口されている
   ことを特徴とする請求項８に記載の細胞の立体的培養システム。
10. 前記各ファイバは、
    前記閉塞側と前記開口側との間に張力が加わるように前記流路空間部において支持される
    ことを特徴とする請求項８又は９に記載の細胞の立体的培養システム。
11. 前記各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、前記外表面から前記中空内部又は前記側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて前記各細胞塊からの代謝老廃物を除去する
    ことを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
12. 前記各ファイバは、前記各微細孔を通じて前記各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給する
    ことを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
13. 前記培養液の流速度を制御する制御部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項７乃至１２のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
14. 前記制御部は、前記培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度のうち少なくとも１以上を制御する
    ことを特徴とする請求項１３に記載の立体的培養システム。
15. 前記制御部による前記培養液の制御状態に合わせて前記流路内に投入する前記細胞塊の数および投入タイミングを調整する細胞投入調整部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の立体的培養システム。
16. 前記制御部の制御下にて、前記各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、前記各ファイバに対して流路方向又は逆方向に沿って交互に微細な振動を付与する振動付与部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。