JP6715330B2 - 細胞の立体構造化方法及び立体構造化システム - Google Patents

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Description

本発明は、細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムに関し、特に神経細胞を所望方向に積層培養させる細胞塊の培養方法及び培養システムに適用して好適なるものである。
脊髄損傷は重篤な運動機能障害を引き起こし、患者のQOL(Quality of Life)を大きく低下させる。脳や脊髄などの中枢神経系は、一度損傷を受けると自力での再生は一般には不可能とされている。
近年の再生医療分野では、患者の機能を改善・再生させるために神経組織の素となる細胞組織を体外で構築して移植する治療法が考案されているものの、細胞組織自体を構築する手法は未だ確立されていないのが現状である。特に機能改善・再生を目的とした神経細胞組織の構築においては、細胞の3次元構造の形成が重要とされている。
しかし、細胞の立体構造の形成は、細胞の成長方向に依存し、人為的なコントロールが困難であるため、立体構造の細胞を任意に構築する技術の開発が必要である。
従来から細胞を球状に凝集した細胞塊をひとつずつ積層させる手法が開発されているが、細胞の3次元構造化に膨大な時間がかかり、神経細胞の3次元構造化に関する研究分野の開拓が進展しにくい状況となっている。
近年、複数の細胞塊を立体構造化させる手法として、有底筒状の移植用ガイドの開口端側から供給される細胞塊を底材上に載置しておき、当該底材側を過剰量の培養液に浸すことにより、当該細胞塊を培養して細胞の立体構造体を形成する方法が提案されている(引用文献1参照)。
また細胞塊を針状体にて貫通させて蓄積し、隣り合う針状体間で細胞塊同士を接触させて3次元構造を作製する方法も提案されている(引用文献2参照)。さらにコアシェル型のファイバ状基材の表面に細胞層を被覆させて積層形成させる方法が提案されている(引用文献3参照)。
特登5769334号公報 特登4517125号公報 特開2016−77229号公報
ところで、引用文献1では、筒状の移植用ガイドを単にモールド(鋳型)としたに過ぎず、重力で均しただけでは積層方向への足場が不安定となる問題があるとともに、培地に成長因子や栄養因子を浸しておくだけでは各細胞塊を十分に成長させることが不安な面も残る。
また引用文献2では、足場となる針状体を積層された複数の細胞塊から引き抜く際に、当該各細胞塊に損傷を与える可能性が大きいという問題が残る。各細胞塊が軟骨等の比較的堅牢な細胞であれば問題ないが、神経細胞のような繊細な細胞では針の抜き出し時に細胞塊を破壊する可能性があるという問題があった。
さらに引用文献3では、機械的強度を考慮して、ファイバ基材の中空内に細胞塊を培養液と一緒に流しながら積層させる手法であるが、コア部のゲルを除去してファイバ基材の内部を中空にする工程が必要な分、効率性に欠ける問題があった。
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、安全性を確保しつつ効率的に多数の細胞塊を成長に伴い3次元方向に結合可能な細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムを提案しようとするものである。
かかる課題を解決するために本発明における細胞立体構造化方法においては、培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部内に、複数のファイバを相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めしておき、供給口から流路内に供給される培養液の液流にのせて、複数の細胞塊を当該流路内に投入し、当該各細胞塊を排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に集積しながら培養させるようにした。
このように培養液の液流にのせて流路内に供給される複数の細胞塊が、排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に付着しつつ流路方向に沿って積層されていくため、細胞塊を傷つけることなく、3次元方向に細胞塊を成長させながら結合化された細胞の立体構造体を効率良く形成することができる。
また本発明における細胞立体構造化システムにおいては、培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部と、相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めされている複数のファイバと、流路空間部の供給口から培養液を流路内に供給する液供給部とを備え、液供給部による培養液の液流にのせて複数の細胞塊が流路内に投入されながら、当該各細胞塊を排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に集積しながら培養させるようにした。
このように液供給部から筒体部の開口端に培養液を灌流させながら、当該培養液の液流にのせて流路内に複数の細胞塊を次々と供給していくことにより、これら複数の細胞塊が、排出口の近傍を成長起点として各ファイバの外表面に付着しつつ流路方向に沿って積層されていくため、細胞塊を傷つけることなく、3次元方向に細胞塊を成長させながら結合化された細胞の立体構造体を効率良く形成することができる。
さらに本発明においては、各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、外表面から中空内部又は側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて各細胞塊からの代謝老廃物を除去するようにした。
このように各ファイバに形成された多数の微細孔を通じて、当該ファイバ表面から流入される細胞塊の代謝老廃物をろ過して排出することにより、各細胞塊の成長を促進すると同時に不純物が除去される分だけ細胞の立体構造体の純度を向上させることができる。
さらに本発明においては、各ファイバは、各微細孔を通じて各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給するようにした。
このように各ファイバに形成された多数の微細孔を通じて、当該ファイバの外表面に集積している各細胞塊に成長因子や栄養因子を供給することにより、効率的に各細胞塊の成長を促進することができる。
さらに本発明においては、培養液の流速度を制御するとともに、当該培養液の制御状態に合わせて流路内に投入する細胞塊の数および投入タイミングを調整するようにした。さらに培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度の少なくとも1以上を制御するようにした。
この結果、培養液を常に生理環境下に近い状態に維持しながら、培養液の液流にのせて複数の細胞塊を流路内に投入することができることから、細胞塊の成長を最適化するのに十分寄与することが可能となる。
さらに本発明においては、各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、各ファイバに対して流路方向に沿った微細な振動を付与するようにした。この結果、ファイバの外表面に接触している各細胞塊が当該ファイバに形成された各微細孔に入り込んで流路方向に対してスライド困難になるのを回避することができる。かくして成長後の細胞塊をファイバから比較的容易に取り出すことが可能となる。
さらに本発明においては、流路空間部は、いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第1ケースおよび第2ケースを、当該溝を取り囲むように環状のシール材を介在させて接合することにより、当該シール材の環内で形成される密閉空間からなるようにした。この結果、細胞培養中における外部環境からのコンタミネーション(微生物学的汚染)の発生を防止することができる。
さらに本発明においては、各ファイバは、流路空間部における供給口側が閉塞され、かつ、排出口側が開口されている。この結果、流路空間部の供給口から培養液が入った場合、各ファイバの排出口側が陰圧となるため、培養液中の代謝物質を排出口に押し出すことが可能となる。
さらに本発明においては、各ファイバは、閉塞側と開口側との間に張力が加わるように流路空間部において支持されるようにした。この結果、各ファイバの両端が固定されて常時流路方向に沿って張力が与えられていることから、当該各ファイバに撓みが発生するのを未然に防止することができる。
本発明によれば、細胞塊を傷つけることなく安全性を確保しつつ、効率的に一度に多数の細胞塊を培養させて、成長に伴い3次元方向に結合可能な細胞立体構造化方法及び細胞立体構造化システムを実現できる。
本発明の実施形態1に係る細胞培養システムの全体構成を示す概略図である。 同実施形態1に係る立体培養モジュールを示す略線的な断面図である。 同実施形態1に係るホローファイバの機能構成を示す概念図である。 同実施形態1による細胞培養システムの動作例を表すフローチャートである。 本発明の実施形態2において用いられる細胞塊(C2C12スフェロイド)の蛍光染色後の図である。 マルチウェルプレート上に複数の細胞塊が形成された状態を表す図である。 本発明の実施形態2に係る細胞培養システムの全体構成を示す概略図である。 同実施形態2に係る立体培養モジュールにおけるハウジング内の流路空間部の略線的な断面図である。 同実施形態2における複数のホローファイバの外表面に当接する細胞塊の積層状態の説明に供する略線図である。 同実施形態2に係る立体培養モジュールの構成を示す斜視図である。 同実施形態2による複数のホローファイバの平行な位置精度保証の説明に供する略線図である。 同実施形態2による複数のホローファイバの一端側のみ陰圧にする構成を示す概念図である。 同実施形態2による細胞培養システムの動作例を表すフローチャートである。 同実施形態2におけるコンタミネーションテストの試験前後の結果を表す図である。 同実施形態2における運動性の細菌等の有無について、試験前後の結果を表す図である。 同実施形態2によるスフェロイド播種実験の24時間後の観察結果を表す図である。 図16におけるホローファイバ間の状態についての部分的拡大図である。 他の実施形態に係るファイバの構成を略線図である。
以下図面について、本発明の一実施の形態を詳述する。
(1)本発明による細胞塊及びその立体構造化方法
細胞のうち足場依存性細胞は、培養液中で浮いている状態では死滅するため、足場に付着させて増殖させる必要がある。皮膚や骨などの細胞は、培養時に足場を求めて互いに接着し合い、細胞と細胞自身が算出する細胞外基質により凝集体である細胞塊(スフェロイド)を形成する。細胞塊は、細胞が集積した直径100〜400〔μm〕程度の球状凝集塊であり、細胞塊同士も接着して融合するとさらに大きな形状となる。
細胞塊に適する細胞は、幹細胞(ES細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞等)、体細胞、腫瘍細胞などの未分化細胞又はその分化型細胞である。また骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞は、未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導が可能なため、これらの分化誘導した細胞(関節軟骨細胞、骨細胞等)も使用することができる。
本発明の細胞塊は、中胚葉系の組織を中心として、関節軟骨、骨のほか、乳房などの脂肪組織、靱帯、腱、歯、耳介、鼻などに適用することができるとともに、中胚葉系にとどまらず、肝臓、すい臓や血管、神経などほとんど全ての接着系細胞にも応用することができる。
また、細胞塊は、必ずしも単一の種類の細胞の凝集体として形成される必要はなく、細胞塊が形成される限り、複数種類の細胞種から形成されてもよい。このようなキメラ状のスフェロイドを用いて、本発明の細胞構築物を製造することもできる。
なお、培養液は、一般的なPSN(Penicillin、Streptomycin、Neomycin:いずれも抗生物質)が含有されたDMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)90〔vol%〕に10〔vol%〕のFBS(Fetal bovine serum:牛胎児血清)を添加した培養液を使用する。
本発明における細胞の立体構造化方法は、上述のような細胞塊(スフェロイド)を最適な灌流培養環境下で複数集積させつつ、成長に伴い結合させることにより、培養液の流路方向に積層させながら立体構造化させるようになされている。
(2)実施形態1
(2−1)実施形態1における細胞培養システムの全体構成
図1に示すように、実施形態1による細胞培養システム1、立体培養モジュール2の上流段に培養容器3、下流段に回収容器4が接続され、制御部5による統括制御下において、培養容器3から供給される成長因子(NGF)や栄養因子を含む培養液6を、一定の培養環境条件を維持しながら立体培養モジュール2に対して灌流させるようになされている。
細胞培養システム1では、制御部5による制御下にて、培養容器3からポンプ7によって吸引された培養液6が、COガスシリンダ8、ヒータ9及び流速センサ10を順次介して立体培養モジュール2に供給される。
立体培養モジュール2には、常に新しい培養液6が連続して供給されるとともに、所定タイミングで外部から細胞塊が順次供給される。この立体培養モジュール2は、後述するように、培養液6が培養容器3から回収容器4へと灌流される状況下で、複数の細胞塊を流路方向に積層させながら結合させることにより細胞の立体構造体を形成する。
立体培養モジュール2から排出される培養液6は、下流側の温度センサ11及びCOセンサ12を順次介して回収容器4に移送される。
細胞培養システム1では、立体培養モジュール2に供給する培養液6を細胞培養に最適な培養環境(生理的環境又はこれに近い環境)となるように、液温度及び溶存する二酸化炭素の濃度を制御している。
すなわち制御部5は、培養容器3からポンプ7により培養液6を吸引しながら、COガスシリンダ8を用いて当該培養液6に二酸化炭素を注入して溶存させる。その際、制御部5は、立体培養モジュール2の下流段に位置するCOセンサ12の検知結果に基づいて、培養液6に溶存する二酸化炭素の濃度を5%前後に維持することにより、培養液6のpH域を6.8〜7.2に保つように制御する。
また制御部5は、立体培養モジュール2の下流段に位置する温度センサ11の検知結果に基づいて、培養容器3から吸引した培養液6の温度が37℃を維持するようにヒータ9を制御する。
さらに制御部5は、立体培養モジュール2に供給する培養液6の流速度を所望状態を維持するように、ポンプ7を駆動制御する。
このようにして細胞培養システム1では、生理的環境に近い環境状態において、培養容器3から常に新しい培養液6を立体培養モジュール2に供給して灌流させることができる。
(2−2)実施形態1による立体培養モジュールの構成
図2(A)及び(B)に示すように、立体培養モジュール2は、培養液6の供給路に接続される開口端20Aから内壁面20Bで囲まれる空間を流路とするシリンダ(筒体部)20を有し、当該シリンダ20の内壁面20Bには流路方向に沿って複数の溝部20Cが形成されている。
このシリンダ20の内部空間には、複数のホローファイバ21の一端を着脱自在に保持する平面プレート22が、培養液6の流路方向に対してその表面が垂直関係を保つように位置決めされて収容されている。
平面プレート22は、シリンダ20内において流路の断面形状(流路幅)内に収まる形状及びサイズとなるように設計されており、複数のホローファイバ21の一端に対応する嵌合穴(図示せず)がそれぞれ貫通形成されている。
複数のホローファイバ21の他端は、貫通保持プレート23により着脱自在に保持されている。貫通保持プレート23は、平面プレート22の各嵌合穴に対応して複数の貫通穴が形成されている。また貫通保持プレート23は、平面プレート22と同様にシリンダ20内において流路の断面形状内に収まる形状及びサイズとなるように設計されている。
立体培養モジュール2のシリンダ20内に平面プレート22及び貫通保持プレート23を位置決めした際、当該シリンダ20の開口端20Aから流路に供給される培養液6は、貫通保持プレート23及び平面プレート22の存在が抵抗となることなく、複数の溝部20Cを通じて下流段に流出させることができる。その際、複数のホローファイバ21には、それぞれ貫通保持プレート23の各貫通穴を介して培養液6が供給され、平面プレート22の各嵌合穴を通じて流路の下流段に流出させることができる。
これら複数のホローファイバ21は、一端が平面プレート22に、かつ他端が貫通保持プレート23に挟まれるように固定保持された状態で一体となってシリンダ20の内部空間に収容される。
その際、複数のホローファイバ21は、貫通保持プレート23の各貫通穴及び対応する平面プレート22の各嵌合穴を介して、対応する中空内部がシリンダ20の内部空間と連通接続されることから、シリンダ20の開口端20Aから供給される培養液は、各ホローファイバ21の中空内部を通じてシリンダ20の内部空間(流路)に排出される。
図3に示すように、各ホローファイバ21は、直径が0.3〔mm〕〜3〔mm〕程度の化学繊維で成形された線状の中空糸膜からなり、ファイバ表面(外表面)21Aには多数の孔幅が0.01〔μm〕〜数〔μm〕のスリット状の超微細孔21Hが貫通形成されている。
これにより各ホローファイバ21に形成された多数の超微細孔21Hを通じて、培養液中の成長因子(NGF)や栄養因子をファイバ表面21Aに染み出すことができる一方、当該ファイバ表面21Aから流入される細胞塊の老廃物や不純物質等をろ過して排出することができる。
なお、複数のホローファイバ21の配列状態は、シリンダ20の内部空間内で特にパターン配列の有無は問わず、ホローファイバ21の外表面21Aに集積される細胞塊に対して成長因子や栄養因子を実用上十分に供給することが可能な間隔を保つことができれば、自由に設定することができる。
すなわち細胞の立体構造体を形成する過程において、各ホローファイバ21の外表面21Aに集積している細胞塊群が未だ成長途上の段階であっても、当該細胞塊群から各ホローファイバ21を引き抜いても培養させ続ければ、その後の成長に伴い、各ホローファイバ21が存在した空間を埋めるように細胞塊同士が結合されるためである。
(2−3)実施形態1による細胞立体構造化方法
図4に実施形態1による細胞培養システム1の動作例を表すフローチャートを示す。まず立体培養モジュール2について、貫通保持プレート23及び平面プレート22の間に固定保持された複数のホローファイバ21をシリンダ20の内部空間(流路上)に収容しておく。
続いて細胞培養システム1において、制御部5は、ポンプ7を制御して、培養容器3内の培養液6を一定の培養環境条件を保ちながら立体培養モジュール2のシリンダ20の開口端20Aから供給しながら灌流させる(ステップSP1)。
シリンダ20内の流路に常に新しい培養液6が供給される状態で、当該シリンダ20の開口端20Aから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液6の液流にのせて投入する(ステップSP2)。
シリンダ20内部に投入される複数の細胞塊は、平面プレート22の表面にランダムに当接しながら各ホローファイバ21の外表面21Aに集積し始める(ステップSP3)。続いて複数の細胞塊は、培養液6の液流にのってさらにシリンダ20内に投入されると、平面プレート22の表面に既に集積している細胞塊に当接しながら各ホローファイバ21の外表面21Aに集積しつつ、かつ流路方向に積層し続ける。
その際、各ホローファイバ21の中空内部から多数の超微細孔を介して成長因子又は栄養因子が外表面21Aに集積している各細胞塊に供給されると同時に、当該各細胞塊から多数の超微細孔21Hを介して代謝物質や老廃物がろ過されて中空内部に排出される。
このように立体培養モジュール2において、複数の細胞塊が各ホローファイバ21の外表面21Aに集積しながら隣り合う細胞塊同士で成長して結合するのみならず、流路方向に沿って積層している細胞塊同士も成長して結合する(ステップSP4)。
やがて立体培養モジュール2に細胞塊を投入終了後、シリンダ20の内部空間には平面プレート22を成長起点として多数の細胞塊が3次元方向に相互結合してなる立体構造体が形成される。
立体培養モジュール2において、シリンダ20から複数のホローファイバ21を平面プレート22及び貫通保持プレート23とともに取り出した後、当該平面プレート22から全てのホローファイバ21をプッシュプル動作(ファイバ方向への往復動作)で引き抜くことにより、平面プレート22の表面には細胞の立体構造体のみ残存する(ステップSP5)。
なお細胞の立体構造体は、各細胞塊が成長途上の段階で各ホローファイバ21から引き抜くようにすれば、当該各ホローファイバ21の残存空間も隣接し合う細胞塊同士で成長して結合させることも可能となる。
(3)実施形態2
(3−1)実施形態2における細胞培養システムの全体構成
実施形態2においては、細胞塊を比較的容易に形成するため、マウス筋芽細胞
を利用する。C2C12細胞は、分化の際に筋繊維を形成する天然の融合能を有するため、分化誘導に先立って互いに付着し合うことが期待される。
細胞塊を作製するために、100〔μl〕の細胞懸濁液(10〔%〕牛胎児血清を添加したDME/RPMI1640 1/1中に10〜10〔cells/ml〕)を96ウェルプレート(MS-9096V/住友ベークライト製)の各ウェルに入れ、一晩放置した。その結果、一次形成されたC2C12スフェロイドの直径は、懸濁液中の初期細胞量に依存して100〜400〔μm〕の間で変化した。
本発明では約300〔μm〕のサイズの細胞塊を使用する。細胞生存率を保証するためにCalcein AMで蛍光染色したC2C12の細胞塊を図5に示す。図6に示すマルチウェルプレート上で予め細胞から細胞塊を形成し、後述する細胞培養システム100(図7)への播種を行う。
図7に示すように、実施形態2による細胞培養システム100は、立体培養モジュール101の上流段に貯蔵容器102、下流段に回収容器103が接続され、制御部104による統括制御下、新鮮な培養液が収容されている培養容器105から供給される培養液106を貯蔵容器102をバッファとして一定の培養環境条件を維持しながら立体培養モジュール101に対して灌流させるようになされている。
細胞培養システム100では、制御部104による制御下にて、培養容器105から供給用ポンプ107によって吸引された培養液6が、貯蔵容器102に一旦貯蔵された後、循環用ポンプ108によって立体培養モジュール101に供給される。
立体培養モジュール101には、貯蔵容器102から常に新しい培養液106が連続して供給されるとともに、所定タイミングで外部から細胞塊が順次供給される。この立体培養モジュール101は、後述するように、培養液106が培養容器105から貯蔵容器102を経て回収容器103へと灌流される状況下で、複数の細胞塊を流路方向に積層させながら結合させることにより細胞の立体構造体を形成する。
立体培養モジュール101から排出される培養液106は、回収容器103に移送される。この立体培養モジュール101の下流段は、回収容器103及び貯蔵容器102の両方に接続されており、それぞれストップバルブ109,110の開閉動作に応じていずれかの容器102,103に培養液が移送される。
なお、細胞は代謝活動によって酸素を消費するため、培養液中の酸素濃度を下げないことが重要である。このため培養容器105、貯蔵容器102、立体培養モジュール101及び回収容器103を、それぞれシリコーンチューブ(図示せず)を介して接続することにより、シリコーンチューブ内に流れる培養液106がシリコーンゴムの高い気体透過性によって酸素が外気との平衡状態に向かうため、酸素濃度を一定に保った培養液を常に細胞塊にすることができる。
細胞培養システム100では、立体培養モジュール101に供給する培養液106を細胞培養に最適な培養環境(生理的環境又はこれに近い環境)となるように、液温度及び溶存する二酸化炭素の濃度を制御している。
すなわち制御部104は、培養容器105から供給用ポンプ107により培養液106を吸引しながら、COガスシリンダ(図示せず)を用いて当該培養液106に二酸化炭素を注入して溶存させる。その際、制御部104は、立体培養モジュール101の下流段に位置するCOセンサ(図示せず)の検知結果に基づいて、培養液106に溶存する二酸化炭素の濃度を5%前後に維持することにより、培養液106のpH域を6.8〜7.2に保つように制御する。
また制御部104は、立体培養モジュール101の下流段に位置する温度センサ(図示せず)の検知結果に基づいて、培養容器105から吸引した培養液106の温度が37℃を維持するようにヒータ(図示せず)を制御する。
さらに制御部104は、貯蔵容器102から立体培養モジュール101に供給する培養液106の流速度を所望状態に維持するように、循環用ポンプ108を駆動制御する。この循環用ポンプ108は、流量を可変に制御するためにPWM(Pulse Width Modulation)制御が行われる。そのためのパラメータ値として、貯蔵容器102の容量を100〔ml〕、シリコーンチューブの直径を2〔mm〕、ホローファイバ130(図8及び図9)の直径を0.5〔mm〕、ホローファイバ130の数を4本とする。循環速度の要件を満たすために、循環用ポンプ108の吐出流量の初期値を8〔ml/min〕とする。
このようにして細胞培養システム100では、生理的環境に近い環境状態において、培養容器105から常に新しい培養液106を立体培養モジュール101に供給して灌流させることができる。
この細胞培養システム100は、立体培養モジュール101において細胞塊同士を結合させ組織化を図るために、多数の細胞塊を立体的に収容する必要がある。また作製後の移植適用を考慮し、細胞塊の播種、培養、組織回収のすべてが可能な構造を有している。
また細胞培養システム100では、立体培養モジュール101において細胞の増殖及び成長に対応するために、広い速度変動で栄養及び酸素を供給する必要がある。そこで、培養液106の循環量を制御して、細胞塊から老廃物を排出し、新鮮な栄養を供給するための構造を有している。
さらに細胞培養システム100では、細胞培養時に微生物学的汚染(コンタミネーション)の発生が、予想される最も頻度の高い問題である。コンタミネーションが起きた場合、培養液のpHや栄養分の低下に起因し、アポトーシス(細胞死)の可能性が高まるおそれがある。このため細胞培養システム100は、培養する細胞の保護や結果の信頼性を保証するためにも、コンタミネーションの発生を防ぐ材質及び構造を有する。
(3−2)実施形態2による立体培養モジュールの構成
本発明による細胞培養システム100においては、立体培養モジュール101を密閉構造にしてコンタミネーションを防止するのみならず、容易かつ迅速な分解を可能にして細胞塊を取り出し得る構造に形成されている。コンタミネーションを防止するためには、立体培養モジュール101内の流路空間を密閉構造にすることが望ましいが、例えばエポキシ樹脂を用いてホローファイバを含む流路空間を完全密封した場合には、培養後の細胞塊を取り出すためには、モジュール自体を切断しなければならない。
このように培養した細胞組織の移植を考慮すると、密閉構造だけでなく、容易かつ迅速な分解を可能とする立体培養モジュールを開発する必要がある。そこで、密閉性と、培養組織の取り出しやすさを両立するために、Oリング等のシール材を用いた立体培養モジュール101を提案する。
図8に示すように、立体培養モジュール101は、全体が透明な部材からなるハウジング120(第1ケース120A及び第2ケース120B)内に流路空間部121が密閉空間として形成された構成からなる。
流路空間部121は、いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第1ケース120Aおよび第2ケース120Bを、当該溝を取り囲むように環状のシール材であるOリング122を介在させて接合することにより、当該Oリング122の環内で形成される密閉空間からなる。
Oリング122の特徴として、構造が簡単であり容易に取り外しが行える点、広い温度範囲に対応できる点、流体に対するシール機能が高い点が挙げられる。容器設計の際には、Oリング嵌め込み用の溝とボルトBT1〜BT8とナットNT1〜NT8による締め付けが可能な形状が求められる。
ハウジング120(第1ケース120A及び第2ケース120B)の材質は、細胞の形態変化の観察やコンタミネーションの有無などを確認するために、光学的に透明な素材であることと、滅菌に必要な熱処理に耐えうる耐熱性を有することが必要である。
また、ホローファイバの栄養及び酸素を共有する効果は、物質の拡散則に従い距離に比例して減少するため、ホローファイバは、培養組織の内部に配置することが重要である。そのため図8及び図9(a)、(b)に示すように、複数のホローファイバ130と当該各ホローファイバ130を取り巻く複数の細胞塊とが同距離に配置され、これら細胞塊を上方向(ファイバ長手方向)に積層し得るように、ハウジング120内に流路空間部121が形成されている。
ホローファイバ130を介して培養液の循環を行うためには、ハウジング120と接続するための培養液106の供給口と排出口を設ける必要がある。
ただし、ホローファイバ130は柔らかく、曲がりやすい性質をもつため、細胞塊が積層された状態で撓んでしまった場合、栄養と酸素が一部の細胞に十分供給されない可能性がある。したがって、ホローファイバ130を組織の積層方向と平行に配置し、両端に張力をかける構造にすることにより、ホローファイバ130の撓みを防止する設計を行う。
またホローファイバ130から細胞塊までの距離が500〔μm〕以上となる条件では、細胞の生存率が下がってしまうため、壊死を避けるようにホローファイバ130を配置する必要がある。そこで、本発明による立体培養モジュール101では、ホローファイバ130からの最大距離が約300〔μm〕となるようにホローファイバ130を配置し、ハウジング120内の流路空間部(スタックエリア)121の幅を2〔mm〕に設定した(図8)。
また、細胞の成長と増殖に応じて十分な栄養と酸素を供給し、細胞から老廃物を除去するために、立体培養モジュール101に供給する培養液106の循環速度を可変に制御する必要がある。循環用ポンプ108の最適な速度設定には細胞株の特性、培地の緩衝能、血清の添加などを考慮する必要があるが、最低でも1日あたりの供給培地量を1タンク培地量とすると、生存細胞数と培養の生存率が著しく向上することが確認されている。
また、循環速度の上限は培養細胞株の物理的なせん断応力に対する感受性の高低に制約される。ホローファイバ130を用いて灌流培養を行うときの哺乳類細胞が受ける物理的せん断ストレスについて評価が行われており、せん断速度が3000〔1/sec〕以下であれば細胞生存率の低下は起きない。
せん断速度の大きさSは、流量をQ、ホローファイバ130の半径をr、流速の平均をVav、ホローファイバ130の直径をDとすると、次式(1)のように表される。
ここでホローファイバ130をN本使うとき、流速の平均Vavは、次式(2)のように表される。
上述の式(1)及び式(2)から次式(3)が導かれる。
以上の結果を用いて、細胞培養システム100では、細胞の受けるせん断速度Sが3000〔1/sec〕以下で、供給培地量を1タンク培地量以上となるように循環速度を決定する必要がある。
さらに立体培養モジュール101は、図10に示すように、ハウジング120(第1ケース120A及び第2ケース120B)に形成された流路空間部121には、貯蔵容器102とシリコーンチューブを介して接続するための供給口121Sと、回収容器103とシリコーンチューブを介して接続するための排出口121Dとを有し、供給口121Sを介して細胞塊を播種とすることが可能である。
またOリング122とボルトBT1〜BT8及びナットNT1〜NT8の締め付けによってハウジング120内の流路空間部121を密閉可能であり、ボルトBT1〜BT8の締め付けを緩めれば中の細胞塊をすぐに取り出すことが可能である。ハウジング120(第1ケース120A及び第2ケース120B)の素材は透明なポリカーボネートの板を用いており、耐熱性と透明性が高く、オートクレープ滅菌の適用と内部の観察が可能である。
ホローファイバ130は直径0.5〔mm〕、細孔径0.1〔μm〕ポリスルフォン製のものを4本用いる。2枚の固定プレート131,132は等間隔で直径0.6〔mm〕の貫通穴を有しており、ホローファイバ130を両方のプレート131,132に通すことで平行な位置精度を保証することができる(図11)。
流路空間部121の上下のスペースに複数のホローファイバ130を保持するための固定プレート131,132を2枚嵌め込むと、各ホローファイバ130の両端に微小な張力がかかるように長さが設定されており、シリコーンSNによって両端を固定して撓みの発生を防止している。
また図12に示すように、複数のホローファイバ130の各端部の片側はシリコーンSNで閉塞させ、もう片方を開口することにより、供給口121Sから培養液106が入った場合、排出側の端部が陰圧となるため、培養液106中の代謝物質(老廃物)を排出口121Dに押し出すことが可能である。
立体培養モジュール101に細胞塊を播種することにより、上述した図9(a)及び(b)に示すように細胞塊が積層していき、組織を形成することができる。
なお、細胞培養システム100においては、制御部104を構成する全ての部品は、保護水準IP67の防水ボックス(図示せず)の中へ入れて密閉することにより、外気に接触しない構造となっている。ボックスカバーを取り付けた後にアルコールでボックスの外側全面を殺菌することで、オートクレーブ滅菌ができない電気系部品に起因するコンタミネーションのリスクを低減している。制御部104以外の部品は全てオートクレーブで高圧蒸気滅菌(標準的に水の飽和蒸気圧が2気圧となる121〔℃〕で20分間滅菌)可能である。制御部104に接続する全てのケーブルはIP68防水ケーブルコネクタを介して制御部104の外側と内側で接続され、密閉性を保ったまま、電源の供給とアクチュエータの駆動を行うことが可能となっている。
医療現場における滅菌保証のガイドラインに基づき、洗浄度と乾燥の確認(項目1)、物理的適合性(項目2)、浸透性(項目3)の評価項目を確認する。項目1について、全ての器具は新品であり、十分洗浄・乾燥させたものを用いている。項目2について、材料選定の段階で耐熱限界温度がオートクレーブの最高温度である121〔℃〕より高いものを用いており、温度と圧力の変化について、オートクレーブ滅菌を行う前後で変形や破損及び融解が起こらないことを確認した。
項目3について、培養液106に触れる部品はシリコーンチューブで接続した状態でオートクレーブ滅菌を行う。シリコーンゴムは気体透過において特に水蒸気の透過性が高いことが大きな特徴であり、細菌などは混入できない密閉系を実現しながら接続している全ての部品に極めて効率的に蒸気を浸透させることができる。
(3−3)実施形態2による細胞立体構造化方法
図13に実施形態2による細胞培養システム100の動作例を表すフローチャートを示す。まず立体培養モジュール101について、2枚の固定プレート131,132の間に固定保持された複数のホローファイバ130をハウジング120の流路空間部121に収容しておく。
すなわち複数のホローファイバ130を2枚の固定プレート131,132とともに流路空間部121の上下のスペースに嵌め込んだ後、第1ケース120A及び第2ケース120BをOリング122を介在させて接合することにより、当該Oリング122の環内で形成される密閉空間内に収容させることができる。
続いて細胞培養システム100において、制御部104は、供給用ポンプ107及び循環用ポンプ108を制御して、培養容器105内の培養液106を貯蔵容器102を介して一定の培養環境条件を保ちながら立体培養モジュール101のハウジング120における流路空間部121の供給口121Sから供給しながら灌流させる(ステップSP10)。
貯蔵容器102から流路空間部121に常に新しい培養液106が供給される状態で、当該流路空間部121の供給口121Sから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液106の液流にのせて投入する(ステップSP11)。
流路空間部121内に投入される複数の細胞塊は、排出口121Dの近傍における固定プレート132の表面にランダムに当接しながら各ホローファイバ130の外表面に集積し始める(ステップSP12)。続いて複数の細胞塊は、培養液106の液流にのってさらに流路空間部121内に投入されると、既に集積している細胞塊に当接しながら各ホローファイバ130の外表面に集積しつつ、かつ流路方向に積層し続ける。
その際、各ホローファイバ130の中空内部から多数の超微細孔を介して成長因子又は栄養因子が外表面に集積している各細胞塊に供給されると同時に、当該各細胞塊から多数の超微細孔を介して代謝物質や老廃物がろ過されて中空内部に排出される。
このように立体培養モジュール101において、複数の細胞塊が各ホローファイバ130の外表面に集積しながら隣り合う細胞塊同士で成長して結合するのみならず、流路方向に沿って積層している細胞塊同士も成長して結合する(ステップSP13)。
やがて立体培養モジュール101に細胞塊を投入終了後、ハウジング121の流路空間部121には排出口121Dの近傍を成長起点として多数の細胞塊が3次元方向に相互結合してなる立体構造体が形成される。
立体培養モジュール101において、ハウジング120の流路空間部121内から複数のホローファイバ21を2枚の固定プレート131,132とともに取り出した後、当該固定プレート131,132から全てのホローファイバ130をプッシュプル動作(ファイバ方向への往復動作)で引き抜くことにより、細胞の立体構造体を抽出する(ステップSP14)。
なお細胞の立体構造体は、各細胞塊が成長途上の段階で各ホローファイバ130から引き抜くようにすれば、当該各ホローファイバ130の残存空間も隣接し合う細胞塊同士で成長して結合させることも可能となる。
(3−4)実施形態2による実験結果
細胞培養システム100においては、まず細胞培養を行う前段階として、安全に細胞に適用できるか検証するため、培養液を連続的に循環させた際のコンタミネーションの有無を確認する。
細胞培養システム100において、貯蔵容器102と立体培養モジュール101との間で細胞を含まない状態で培養液106のみを5日間循環させる。実験は実際の細胞培養環境であるCOインキュベータ内(室温37℃、CO濃度5%、湿度>95%)のもとで行う。実験操作は全て無菌環境であるクリーンベンチ内で行う。コンタミネーションの検出方法として以下の項目を24時間ごとに確認する。
項目1として、培養液106の色が、赤から黄色に変化するか否かを確認する。項目2として、培養液106の濁り具合が、乳白色の濁りが見えるか否かを確認する。項目3として、顕微鏡による観察にて、細菌の運動の様子が見えるか否かを確認する。位相差顕微鏡で確認する際には、回収容器103から少量の培養液を採取し、ディッシュに移してから観察を行う。
上述の実験結果として、コンタミネーションテストにおける実験前後(120分経過前後)の観察結果として図14(a)及び(b)により、実験前後で培地の色が変わっておらず、培養液106が濁っていないことが確認された。また、図15(a)及び(b)により、実験前後で運動性の細菌等がいないことが確認された。
続いて細胞培養システム100に細胞塊を播種した際に意図される細胞塊の積層や細胞の成長が見られるかを確認する。循環用の培養液106は、DMEM(Gibco)+10%FBSを50〔ml〕用いる。作製したC2C12スフェロイドを循環用ポンプ108で吸引し、固定プレート132から剥離する。吸引された細胞塊はシリコーンチューブ内に格納される。培養した細胞を全て有効利用するため、固定プレート132のウェル内に細胞塊が残っていないことを顕微鏡で確認する。
シリコーンチューブを立体培養モジュール101の流路空間部121の供給口121Sに接続し、循環用ポンプ108を逆回転させてシリコーンチューブ内の細胞塊を流路空間部121に播種する。その後、細胞培養システム100をインキュベータ(図示せず)内に設置し、培養液106の循環を開始する。24時間後に立体培養モジュール101内部を顕微鏡によって確認する。
上述の細胞塊播種実験の24時間後の立体培養モジュール101内部の観察結果を図16(a)及び(b)に示す。黒く見える部分はホローファイバ130であり、細胞塊を白色の点線で囲んでいる。図16(b)の中央拡大図である図17に示すように、実験開始時(図17(a))と24時間経過した後(図17(b))の変化を表している。図16(b)から細胞塊が流路空間部121の全体に積層しているのが確認できる。また図17(b)から細胞塊同士が成長して部分的に融合し、形状が球体から変形している様子が確認できる。
(5)他の実施の形態
本実施形態1においては、立体培養モジュール2として、線状からなる複数のホローファイバ21の外表面21Aに平面プレート22を成長起点として細胞塊群を成長に伴い3次元方向に結合させて略円柱形状の立体構造体を形成する場合について述べたが、本発明はこれに限らず、所望の立体形状に合わせて複数のホローファイバの形状及び湾曲状態など自由に設計するようにしても良い。
なお筒体部であるシリンダ20は、細胞の立体構造体の外郭を規制することになるが、当該立体構造体の形状をガイドする鋳型ではない。細胞の立体構造体は、各ホローファイバ21の外表面21Aに集積しながら流路方向にも積層して互いに隣接し合う同士で成長して結合することにより、3次元方向における全体のサイズ及び形状が特定される。
例えば、平面プレート22及び貫通保持プレート23の間に挟まれる複数のホローファイバ21を、培養液6の流路の中心部は直線形状にするとともに、外側になるにつれて外方に張り出すような湾曲形状とすることにより、形成される細胞の立体構造体は全体として中央が膨らんだ臓器形状とすることが可能となる。
また本実施形態1においては、立体培養モジュール2を構成する複数のファイバとして、線状の中空糸膜からなる中空内部をもつホローファイバ21を適用する場合について述べたが、本発明は中空構造に限らず、例えば図18(A)及び(B)に示すように、長手方向に沿って側溝が形成されたファイバを適用するようにしても良い。図18(A)は1本のファイバ30に単一の溝30Aを形成した場合を示し、図18(B)は1本のファイバ31に3つの溝31A〜31Cを形成した場合を示す。これらファイバ30、31も、側溝以外の壁面部に多数のスリット状の超微細孔を有し、当該各超微細孔を介して側溝内部とシリンダ20の内部空間とで物質交換し得れば良い。
上述したように各ホローファイバ21は、直線線状に限定されず、外表面に細胞塊を集積させた細胞塊を損傷することなく抜き取りことが可能であれば、断面形状は中空又は側溝を有している限り、所望形状及び所望サイズに湾曲や屈曲させるなど自由に設計するようにしても良い。シリンダ20も培養液6の流路である限り、断面形状及びサイズは、平面プレート22の挿入を妨げることなく培養液6を灌流可能である限り自由に設計しても良い。
また本実施形態1においては、細胞培養システム1にて制御部5は、温度センサ11及びCOセンサ12から得られた培養液6の温度及び二酸化炭素濃度に基づいて、ポンプ7及びCOガスシリンダ8を制御することにより、当該培養液6の温度及び二酸化炭素濃度を生理的環境に近い環境状態を保つようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、これに加えて酸素濃度及び窒素濃度も検知して制御するようにしても良い。
さらに本実施形態1においては、シリンダ20の開口端20Aから複数の細胞塊を所望タイミングで培養液6の液流にのせて投入するようにした場合について述べたが、本発明はこれに限らず、制御部5による培養液6の制御状態に合わせてシリンダ20の流路内に投入する細胞塊の数および投入タイミングを調整する細胞投入調整部(図示せず)をさらに設けることにより、自動化を図るようにしても良い。
さらに本実施形態1及び2において、培養液6、106に含まれる成長因子や栄養因子は、特に限定はされないが、例えば、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、肝細胞成長因子(HGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、神経栄養因子(NGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)及びインシュリン様成長因子(IGF)等を挙げることができる。培養しようとする細胞塊の種類に応じて他の成長因子や栄養因子を用いることも可能である。
本実施形態2においては、立体培養モジュール101として、線状からなる4本のホローファイバ130の外表面に流路空間部121の排出口121Dの近傍における固定プレート132を成長起点として細胞塊群を成長に伴い3次元方向に結合させて略円柱形状の立体構造体を形成する場合について述べたが、本発明はこれに限らず、排出口121Dの近傍であれば固定プレート132の表面に当接しなくても流路上で自然に密接し合いことで成長起点とするようにしてもよい。
さらに本実施形態2においては、複数のホローファイバ130を流路空間部121内に固定した場合について述べたが、本発明はこれに限らず、制御部104の制御下にて、各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、各ホローファイバ130に対して流路方向又は逆方向に沿って交互に微細な振動を付与する振動付与部(図示せず)をさらに備えるようにしてもよい。この結果、各ホローファイバ130の外表面に接触している各細胞塊が当該ホローファイバ130に形成された各微細孔に入り込んで流路方向に対してスライド困難になるのを回避することができる。かくして成長後の細胞塊をホローファイバ130から比較的容易に取り出すことが可能となる。
1、100……細胞培養システム、2,101……立体培養モジュール、3,105……培養容器、4,103……回収容器、5,104……制御部、6,106……培養液、7……ポンプ、8……COガスシリンダ、9……ヒータ、10……流速センサ、11……温度センサ、12……COセンサ、20……シリンダ、20A……開口端、20B……内壁面、20C……溝、21……ホローファイバ、21A……ファイバ表面、21H……超微細孔、22……平面プレート、23……貫通保持プレート、30,31……ファイバ、102……貯蔵容器、107……供給用ポンプ、108……循環用ポンプ、120……ハウジング、120A……第1ケース、120B……第2ケース、121……流路空間部、121S……供給口、121D……排出口、122……Oリング、130……ホローファイバ、131,132……固定プレート。

Claims (16)

  1. 培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部内に、複数のファイバを相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めしておき、
    前記供給口から前記流路内に供給される前記培養液の液流にのせて、複数の細胞塊を当該流路内に投入し、当該各細胞塊を前記排出口の近傍を成長起点として前記各ファイバの外表面に集積しながら培養させる
    ことを特徴とする細胞の立体的培養方法。
  2. 前記各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、前記外表面から前記中空内部又は前記側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて前記各細胞塊からの代謝老廃物を除去する
    ことを特徴とする請求項1に記載の細胞の立体的培養方法。
  3. 前記各ファイバは、前記各微細孔を通じて前記各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給する
    ことを特徴とする請求項2に記載の細胞の立体的培養方法。
  4. 前記培養液の流速度を制御するとともに、当該培養液の制御状態に合わせて前記流路内に投入する前記細胞塊の数および投入タイミングを調整する
    ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
  5. 前記培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度の少なくとも1以上を制御する
    ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
  6. 前記各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、前記各ファイバに対して流路方向に沿った微細な振動を付与する
    ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養方法。
  7. 培養液の供給口から排出口まで内壁面で囲まれる空間を流路とする流路空間部と、
    相互に所定間隔を保ちながらそれぞれ長手方向が当該流路方向に沿うように位置決めされている複数のファイバと、
    前記流路空間部の前記供給口から前記培養液を前記流路内に供給する液供給部と
    を備え、前記液供給部による前記培養液の液流にのせて複数の細胞塊が前記流路内に投入されながら、当該各細胞塊を前記排出口の近傍を成長起点として前記各ファイバの外表面に集積しながら培養させる
    ことを特徴とする細胞の立体的培養システム。
  8. 前記流路空間部は、
    いずれか一方または両方の対向面に所定形状の溝が形成された第1ケースおよび第2ケースを、当該溝を取り囲むように環状のシール材を介在させて接合することにより、当該シール材の環内で形成される密閉空間からなる
    ことを特徴とする請求項7に記載の細胞の立体的培養システム。
  9. 前記各ファイバは、
    前記流路空間部における前記供給口側が閉塞され、かつ、前記排出口側が開口されている
    ことを特徴とする請求項8に記載の細胞の立体的培養システム。
  10. 前記各ファイバは、
    前記閉塞側と前記開口側との間に張力が加わるように前記流路空間部において支持される
    ことを特徴とする請求項8又は9に記載の細胞の立体的培養システム。
  11. 前記各ファイバは、中空又は長手方向に沿って側溝が形成されており、前記外表面から前記中空内部又は前記側溝内部に連通する複数の微細孔を有し、当該各微細孔を通じて前記各細胞塊からの代謝老廃物を除去する
    ことを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
  12. 前記各ファイバは、前記各微細孔を通じて前記各細胞塊に対して成長因子および栄養因子のいずれか一方または両方を供給する
    ことを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
  13. 前記培養液の流速度を制御する制御部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項7乃至12のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム。
  14. 前記制御部は、前記培養液の温度、二酸化炭素濃度、酸素濃度及び窒素濃度のうち少なくとも1以上を制御する
    ことを特徴とする請求項13に記載の立体的培養システム。
  15. 前記制御部による前記培養液の制御状態に合わせて前記流路内に投入する前記細胞塊の数および投入タイミングを調整する細胞投入調整部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項13又は14に記載の立体的培養システム。
  16. 前記制御部の制御下にて、前記各細胞塊の成長過程に合わせた所定タイミングで、前記各ファイバに対して流路方向又は逆方向に沿って交互に微細な振動を付与する振動付与部をさらに備える
    ことを特徴とする請求項13乃至15のいずれか一項に記載の細胞の立体的培養システム
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