JP6439918B2

JP6439918B2 - ３次元細胞構造体の製造方法

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Publication number: JP6439918B2
Application number: JP2014212945A
Authority: JP
Inventors: 昌治竹内; 進太郎岩永; 弘晃尾上; 輝興津
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Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2018-12-19
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Also published as: JP2016077229A

Description

本発明は、３次元細胞構造体及びその製造方法並びに３次元細胞構造体の培養方法に関する。

細胞培養に汎用されているプラスチック製の細胞培養ディッシュでは、培養細胞がディッシュ表面に張り付くように２次元的に伸展しながら増殖した培養物が得られる。このような培養物は個々の細胞の機能解明や増殖過程の解明などの研究目的には合致しているものの、生体内で細胞が３次元構造体である組織を形成して増殖・維持されている環境とはかけ離れていることから、より生体内環境に近い状態で細胞培養を可能にする技術が求められている。

また、近年、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から所望の組織を形成する方法の開発が進められており、幹細胞から分化させた細胞を用いて所望の３次元組織を構築するためにも３次元細胞構造体を作製する培養技術は有用である。

このような背景のもと、例えば特許文献１には、３次元ネットワークを形成する毛細血管様組織の形成方法、及び当該毛細血管様組織を備えたスフェロイドからなる血管・スフェロイド融合体が記載されている。

また、特許文献２には、スキャフォルドを用いず、成体の心臓を構成する心筋組織以外の部分に由来する筋芽細胞からなる心臓疾患に適用するためのシート状３次元構造体が記載されている。

特開２００９−２１３７１６号公報特開２０１０−２９６８０号公報

しかしながら、従来の方法では、作製した組織の厚みが増すにつれて培養液を組織の隅々にまで供給することが困難になり、組織の中央部で細胞が壊死してしまう場合があった。

そこで、本発明は、培養液を組織の隅々にまで供給することが可能な３次元細胞構造体を提供することを目的とする。本発明はまた、上記の３次元細胞構造体の製造方法及び培養方法を提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
（１）コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材。
（２）前記第１及び第２の解離性ハイドロゲルが、異なる解離条件下で解離するものである、（１）に記載のファイバ状基材。
（３）前記第１及び第２の解離性ハイドロゲルが、金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲル、酵素溶解性ハイドロゲル、温度応答性ハイドロゲル、ｐＨ応答性ハイドロゲル、光応答性ハイドロゲル及び磁場応答性ハイドロゲルからなる群より選択される、（２）に記載のファイバ状基材。
（４）（１）〜（３）のいずれか一項に記載のファイバ状基材と、前記基材の表面に被覆された細胞層とを備える、３次元細胞構造体。
（５）前記細胞層が、積層された複数種類の細胞層を備える、（４）に記載の３次元細胞構造体。
（６）ファイバ状基材と、前記基材の表面に被覆された細胞層と、を備え、前記基材の内部が中空である、３次元細胞構造体。
（７）前記細胞層が、積層された複数種類の細胞層を備える、（６）に記載の３次元細胞構造体。
（８）コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材上に細胞を被覆する工程を備える、３次元細胞構造体の製造方法。
（９）前記第１の解離性ハイドロゲルを除去し、前記基材の内部を中空にする工程を更に備える、（８）に記載の製造方法。
（１０）前記第２の解離性ハイドロゲルを除去する工程を更に備える、（９）に記載の製造方法。
（１１）前記細胞を被覆する工程が、前記基材上にファイバ状の細胞塊を巻きつけることにより行われる、（８）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法。
（１２）コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材上に細胞を被覆する工程と、前記第１の解離性ハイドロゲルを除去し、前記基材の内部を中空にする工程と、前記基材の内部に培地を供給する工程と、を備える、３次元細胞構造体の培養方法。

本発明によれば、培養液を組織の隅々にまで供給することが可能な３次元細胞構造体を提供することができる。また、上記の３次元細胞構造体の製造方法及び培養方法を提供することができる。

細胞ファイバ３００の製造過程の１実施形態を説明する模式図である。コアシェル型のファイバ状基材４００の製造過程の１実施形態を説明する模式図である。（ａ）、（ｂ）は、細胞ファイバを巻きつけた直後の３次元細胞構造体の顕微鏡写真である。（ｃ）は、細胞ファイバを巻きつけた後２日間培養後の３次元細胞構造体の顕微鏡写真である。（ａ）は、第１の細胞を被覆した３次元細胞構造体に、更に第２の細胞を被覆する過程を示す写真である。（ｂ）は、３次元細胞構造体のクリオスタット切片を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）は、ファイバ状基材のコア部がゾル化する前の状態を示す写真である。図５（ｂ）は、ファイバ状基材のコア部分に青色のインクが流れる状態を示す写真である。

［３次元細胞構造体］
１実施形態において、本発明は、ファイバ状基材と、前記基材の表面に被覆された細胞層と、を備え、前記基材が、コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材である、３次元細胞構造体を提供する。

血管が存在しない状態で維持することができる３次元細胞構造体の細胞層の厚さは、最大で２００μｍ程度であるといわれている。そこで、３次元細胞構造体の細胞層が厚くなるほど、３次元細胞構造体の形成後早い段階で培養液の供給を開始して、細胞に栄養分や酸素等を供給する必要がある。培養液の供給方法として、例えば、基材の表面に細胞層を被覆した後に、基材を除去することにより形成された中空部分を通じて培養液を供給することが考えられる。しかしながら、基材がコアシェル型の基材でない場合には、基材の表面に被覆された細胞を一定時間以上培養し、細胞同士が密着して結合するまで、基材を除去することができない。さもないと、３次元細胞構造体の３次元構造が壊れてしまう。

これに対し、本実施形態の３次元細胞構造体によれば、第１の解離性ハイドロゲルを除去することにより、ファイバ状基材の内部を中空にすることができる。そして、この中空部分に培養液を送液することにより、培養液を組織の隅々にまで供給することができる。また、中空部分への培養液の供給は、細胞同士が密着して結合するのを待たずに開始しても、ファイバ状基材のシェル部分が機械的強度を維持することができるため、３次元細胞構造体の３次元構造が破壊されることがない。

このため、本実施形態の３次元細胞構造体によれば、３次元細胞構造体の形成後早い段階で培養液の供給を開始することができる。そこで、組織の中央部で細胞を壊死させることなく、細胞層の厚みの大きな３次元細胞構造体を提供することができる。つまり、本実施形態の３次元細胞構造体により、容易に高細胞密度の組織を得ることができる。

細胞層の厚みの大きな３次元細胞構造体を形成する方法として、予め内部が中空であるファイバ状基材の表面上に細胞層を被覆することも考えられる。しかしながら、発明者らは、このようなファイバ状基材は、十分な機械的強度を有しておらず、細胞層を被覆する段階で基材がつぶれたり、基材が壊れてしまう傾向にあることを見出した。

また、中空糸膜を基材に使用して、その表面に細胞層を被覆することも考えられる。中空糸膜は十分な機械的強度を有しているが、３次元細胞構造体を形成した後に、中空糸膜を除去することができない。このため、３次元細胞構造体の適用が制限されてしまう場合がある。

これに対し、本実施形態の３次元細胞構造体は、細胞層を被覆するのに十分な強度を有しており、かつ、必要に応じてファイバ状基材の内部を中空にし、培養液を供給することができる。更に、必要に応じて、一度中空にしたファイバ状基材の内部に再び解離性ハイドロゲルを導入して硬化させることにより、再度細胞を被覆する等の処理を行うことが可能である。

例えば、一度作製した複数の３次元細胞構造体同士を束ねることにより、より大きく複雑な３次元細胞構造体を作製することができる。これにより、理論的には、培養液からの細胞の距離を２００μｍ以内に維持したまま、大きさの制限なく、大きな３次元細胞構造体を作製することができる。

また、巻き付ける細胞ファイバの中にあらかじめ血管内皮細胞を入れておくことによって、培養しながら細胞層の内部に毛細血管網を作製することができる。そして、このようにして作製した毛細血管網を通じて培養液を供給することができる。したがって、巻き付けた細胞層内部に毛細血管網の構築がなされた後、新たな細胞層を巻き付けることによって、理論的には、培養液からの距離を２００μｍ以内に維持したまま、大きさの制限なく、大きな３次元細胞構造体を作製することができる。この場合、細胞層の厚さは、例えば４００μｍ以上であってもよく、例えば１ｍｍ以上であってもよく、例えば２ｍｍ以上であってもよい。

また、３次元細胞構造体の表面に、最初に被覆した細胞と異なる種類の細胞層を被覆することにより、積層された複数種類の細胞層を備える３次元細胞構造体を得ることもできる。

本実施形態の３次元細胞構造体において、第１及び第２の解離性ハイドロゲルは、異なる解離条件下で解離するものであることが好ましい。このような解離性ハイドロゲルとしては、金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲル、酵素溶解性ハイドロゲル、温度応答性ハイドロゲル、ｐＨ応答性ハイドロゲル、光応答性ハイドロゲル及び磁場応答性ハイドロゲル等が挙げられる。

金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲルは、金属イオンを除去することにより解離させることができる。金属イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられる。また、酵素溶解性ハイドロゲルは、酵素を作用させることによりゲルを構成している分子を分解して溶解することができる。また、温度応答性ハイドロゲルは、相転移温度を超えて温度を変化させることにより、ゾル化及びゲル化の状態を変化させることができる。また、ｐＨ応答性ハイドロゲルは、ｐＨを変化させることにより解離させることができる。また、光応答性ハイドロゲルは、例えばある波長の光を照射することにより解離させることができる。また、磁場応答性ハイドロゲルは、例えば磁場を変化させることにより解離させることができる。

第１及び第２の解離性ハイドロゲルがこのようなものであると、それぞれのハイドロゲルを選択的に解離させ、除去することができる。金属イオンの存在下でゲル化するハイドロゲルとしては、二価ないしは三価の金属イオンの存在下でゲル化するアルギン酸ゲル、カルシウムイオンやカリウムイオンの存在下でゲル化するカラギーナンゲル、ナトリウムイオンの存在下でゲル化するアクリル酸系合成ゲル等が挙げられる。酵素溶解性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、キトサンゲル、セルロース系ゲル、コラーゲンゲル、フィブリンゲル等が挙げられる。温度応答性ハイドロゲルとしては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をポリエチレングリコールで架橋した温度応答性ハイドロゲル（市販名：メビオールゲル）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレンオキシドのトリブロック共重合体（市販名：プルロニック、ポロキサマー）等が挙げられる。ｐＨ応答性ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、キトサンゲル、カルボキシメチルセルロースゲル、アクリル酸系合成ゲル等が挙げられる。光応答性ハイドロゲルとしては、骨格にアゾベンゼンとシクロデキストリンを組み合わせた合成ゲル、フマル酸アミドをスペーサーとした超分子からなるゲル、ニトロベンジル基を介して架橋されたないしは結合されているゲル等が挙げられる。磁場応答性ハイドロゲルとしては、磁性粒子を含有させた架橋ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）からなるゲル等が挙げられる。

１実施形態において、本発明は、ファイバ状基材と、前記基材の表面に被覆された細胞層と、を備え、前記基材の内部が中空である、３次元細胞構造体を提供する。

本実施形態の３次元細胞構造体は、上記の３次元細胞構造体において、第１の解離性ハイドロゲルを除去することにより、ファイバ状基材の内部を中空にしたものに相当する。本実施形態の３次元細胞構造体によれば、ファイバ状基材の内部の中空部分に培養液を送液することにより、培養液を組織の隅々にまで供給することができる。

また、内部が中空の状態の３次元細胞構造体は、機械的強度が不足しており、更に細胞を被覆することが困難な場合がある。このような場合には、一度中空にしたファイバ状基材の内部に再び解離性ハイドロゲルを導入して硬化させるとよい。これにより、ファイバ状基材の機械的強度が高まり、再度細胞を被覆する等の処理を行うことが可能になる。ここで、最初に被覆した細胞と異なる種類の細胞層を被覆することにより、積層された複数種類の細胞層を備える３次元細胞構造体を得ることもできる。

［３次元細胞構造体の製造方法］
１実施形態において、本発明は、コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材上に細胞を被覆する工程を備える、３次元細胞構造体の製造方法を提供する。

本実施形態の３次元細胞構造体の製造方法において、細胞を被覆する工程は、コアシェル型のファイバ状基材にファイバ状の細胞塊を巻きつけることにより行ってもよい。この方法によれば、短時間に高細胞密度の組織を容易に作製することができる。また、複数の種類の細胞を被覆することにより、複雑な機能及び構造を有する３次元細胞構造体を作製することもできる。

（細胞ファイバの作製）
まず、ファイバ状の細胞塊（以下、「細胞ファイバ」という場合がある。）の作製方法について説明する。細胞ファイバの作製方法は特に限定されないが、例えば、図１に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅ）１００を用いることにより簡便に作製することができる。２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置１００は、例えば、Wonje Jeong, et al., Hydrodynamic microfabrication via "on the fly" photopolymerization of microscale fibers and tubes, Lab Chip, 2004, 4, 576-580 のＦｉｇ．１にも具体的に説明されている。

図１は、細胞ファイバ３００の製造過程の１実施形態を説明する模式図である。一例として、コア部の材料にコラーゲン溶液を用い、シェル部の材料に架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を用いた場合について説明する。

まず、マイクロ流体装置１００の導入口１１０から、細胞１１５を含むコラーゲン溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置１００の導入口１２０から、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置１００の導入口１３０から、塩化カルシウム溶液を導入して射出する。すると、シェル部のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、シェル部２２０がアルギン酸ゲルである細胞ファイバ２００を製造することができる。また、細胞ファイバ２００を３７℃程度で数分から１時間程度加熱することにより、コア部２１０の細胞１１５を含むコラーゲン溶液をゲル化させることができる。

導入口１１０及び１２０における溶液の射出速度は特に限定されないが、マイクロ流体装置１００の口径が５０μｍ〜２ｍｍ程度である場合には、１０〜５００μＬ／分程度であってもよい。導入口１１０及び１２０における溶液の射出速度を調節することにより、コア部の直径及びシェル部の被覆厚みを適宜調節できる。導入口１３０における溶液の射出速度は特に限定されないが、例えば１〜１０ｍＬ／分程度であってもよい。

細胞ファイバ２００の外径は特に限定されず、例えば１０μｍ〜２ｍｍ、例えば２００μｍ〜２ｍｍ、例えば５０μｍ〜１ｍｍ程度であってもよい。細胞ファイバ２００の長さは特に限定されず、数ｍｍ〜数ｍ程度であってもよい。細胞ファイバ２００の断面形状としては、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。

細胞ファイバ２００を培養液中で培養することにより、細胞を増殖させることができる。細胞ファイバ２００は、培養液を適切に交換することにより、数か月培養することもできる。

コア部２１０には、細胞１１５の維持、増殖又は機能発現等に適した各種の成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）等を含有させてもよい。成長因子を含有させる場合には、成長因子の種類に応じて適宜の濃度を選択することができる。

細胞ファイバ２００のシェル部２２０を形成する第２の解離性ハイドロゲルを選択的に解離させることにより、シェル部２２０を除去し、ファイバ状の細胞塊（細胞ファイバ３００）を得ることができる。

シェル部２２０がアルギン酸ゲルである場合には、ＥＤＴＡ等のキレート剤を適宜の濃度で作用させてカルシウムイオンを除去させることにより、シェル部のみを解離させることができる。アルギン酸ゲルを解離させる方法としては、キレート剤の他にも、クエン酸等の弱酸、アルギン酸リアーゼ等の酵素等を作用させる方法が挙げられる。

アルギン酸リアーゼを使用する場合の濃度としては、例えば０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ程度が挙げられる。例えば、細胞ファイバ３００をアルギン酸リアーゼ溶液に浸漬し、シェーカーで揺動させながら、３７℃で１０分から数時間程度処理することによりシェル部のみを解離することができる。

このようにして得られた細胞ファイバ３００は、ピンセット等を用いて容易に操作することができる。細胞ファイバ３００を、コアシェル型のファイバ状基材に巻きつけることにより、細胞を被覆することができる。

（コアシェル型のファイバ状基材）
続いて、コアシェル型のファイバ状基材の作製方法について説明する。コアシェル型のファイバ状基材の作製方法は特に限定されないが、例えば、上述したマイクロ流体装置１００を用いることにより簡便に作製することができる。

図２は、コアシェル型のファイバ状基材４００の製造過程の１実施形態を説明する模式図である。一例として、コア部の溶液に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をポリエチレングリコールで架橋した温度応答性ハイドロゲル（市販名：メビオールゲル）を用い、シェル部の溶液として架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を用いた場合について説明する。

メビオールゲルは、２２〜２５℃に相転移温度を有し、低温側でゾル（液体）状態、高温側でゲル状態になる温度応答性ハイドロゲルである。相転移は可逆的であり速やかに進行する。

まず、マイクロ流体装置１００の導入口１１０から、メビオールゲルを導入して射出する。また、マイクロ流体装置１００の導入口１２０から、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出する。また、マイクロ流体装置１００の導入口１３０から、塩化カルシウム溶液を導入して射出する。導入口１１０、１２０及び１３０における溶液の射出速度は上述したものと同様である。この結果、シェル部のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、シェル部４２０がアルギン酸ゲルであるファイバ状基材４００を製造することができる。

また、ファイバ状基材４００を、例えば３７℃に設定したインキュベーター等の相転移温度以上の温度環境下に置くとことにより、コア部４１０のメビオールゲルを速やかにゲル化させることができる。コア部４１０がゲル化した状態において、ファイバ状基材４００は十分な機械的強度を示す。このため、細胞ファイバ３００を巻きつける方法等により、ファイバ状基材４００上に細胞を被覆することができる。

ファイバ状基材４００の外径は、特に限定されず、例えば１０μｍ〜２ｍｍ、例えば２００μｍ〜２ｍｍ、例えば５０μｍ〜１ｍｍ程度であってもよい。ファイバ状基材４００の長さは特に限定されず、数ｍｍ〜数ｍ程度であってもよい。ファイバ状基材４００の断面形状としては、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。

（３次元細胞構造体のファイバ状基材のコア部の除去）
本実施形態の３次元細胞構造体の製造方法は、ファイバ状基材４００のコア部を構成する解離性ハイドロゲルを除去する工程を更に備えることにより、ファイバ状基材４００の内部が中空である３次元細胞構造体を製造することができる。

例えば、コア部４１０が上記のメビオールゲルである場合、３次元細胞構造体を、相転移温度以下の定温環境下に数秒間置くことにより、コア部４１０をゾル化させることができる。コア部４１０をゾル化させた後、ファイバ状基材４００の一端から培養液等を送液することにより、コア部４１０を押し流して培養液等に置換することができる。

本明細書において、ファイバ状基材の内部が中空であるとは、ファイバ状基材のコア部がゲル化していない状態であることを意味する。この状態において、例えば、ファイバ状基材の内部に空気を導入すれば、ファイバ状基材のコア部分を空洞にすることができる。また、培養液等の流体を導入すれば、ファイバ状基材のコア部分を当該流体に置換することができる。

（３次元細胞構造体のファイバ状基材のシェル部の除去）
本実施形態の３次元細胞構造体の製造方法は、ファイバ状基材４００のシェル部４２０を構成する解離性ハイドロゲルを除去する工程を更に備えることにより、３次元細胞構造体からファイバ状基材４００を除去した３次元細胞構造体を製造することができる。

本実施形態の製造方法により、例えば、所望の３次元細胞構造体を製造した後、ファイバ状基材を完全に除去して細胞のみから形成された組織を得ることができる。このような組織は、例えば生体に移植する場合等に有用であると考えられる。

［３次元細胞構造体の培養方法］
１実施形態において、本発明は、コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材上に細胞を被覆する工程と、前記第１の解離性ハイドロゲルを除去し、前記基材の内部を中空にする工程と、前記基材の内部に培地を供給する工程と、を備える、３次元細胞構造体の培養方法を提供する。

本実施形態の培養方法によれば、ファイバ状基材上に細胞を被覆して３次元細胞構造体を形成した後、細胞同士が密着して結合するのを待つことなく、中空部分への培養液の供給を開始することができる。細胞同士が密着して結合していなくても、ファイバ状基材のシェル部分が機械的強度を維持することができるため、３次元細胞構造体の３次元構造を破壊することなく、培養液の供給を行うことができる。

この結果、組織の中央部で細胞を壊死させることなく、細胞層の厚みの大きな３次元細胞構造体を提供することができる。つまり、本実施形態の培養方法により、容易に高細胞密度の組織を得ることができる。

培養液の供給方法としては、例えば、ファイバ状基材の末端にシリコン製のチューブを接続し、ペリスタリックポンプ等を用いてチューブ内部の培養液を循環させる方法等が挙げられる。ファイバ状基材の末端にシリコン製のチューブを接続する方法としては、例えば、ファイバ状基材の末端に、光架橋性ゼラチン等の生体接着剤を用いて、サーフロー（テルモ社製留置針）の一端を接着し、他端をシリコン製のチューブに接続する方法等が挙げられる。

以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（細胞ファイバの作製）
図１に模式的に示す製造過程にしたがって、細胞ファイバを作製した。細胞としては、マウス繊維芽細胞３Ｔ３、ラット骨格筋細胞Ｌ６及びウシ血管内皮細胞ＨＨを用いた。マイクロ流体装置１００の導入口１１０から、細胞密度１×１０^８個／ｍＬの各細胞を含むコラーゲン溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）を流速２５μＬ／分で導入し、導入口１２０から、１．５ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウムを流速７５μＬ／分で導入し、導入口１３０から１００ｍＭ塩化カルシウムを含む３％スクロース溶液を流速３６００μＬ／分で導入して射出することにより、コア部直径約１００μｍ、外径約２００μｍの細胞ファイバを得た。

得られた各細胞ファイバを１日間培養液中で培養した後、５０ｍＭのＥＤＴＡを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に浸漬し、３７℃で１０秒間処理することにより、シェル部分のアルギン酸ゲルを除去した細胞ファイバを作製した。この細胞ファイバは、ファイバ状の形状を維持しており、培養液中にてピンセットで取り扱うのに十分な機械的強度を有していた。

［実験例２］
（コアシェル型のファイバ状基材の作製）
図２に模式的に示す製造過程にしたがって、コア部が温度応答性ハイドロゲルであり、シェル部がアルギン酸ゲルである、コアシェル型のファイバ状基材を作製した。マイクロ流体装置１００の導入口１１０から、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をポリエチレングリコールで架橋した温度応答性ハイドロゲル（市販名：メビオールゲル、濃度１０ｗ/ｖ％）を流速１００μＬ／分で導入し、導入口１２０から、１．５ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウムを流速２００μＬ／分で導入し、導入口１３０から１００ｍＭ塩化カルシウムを含む３％スクロース溶液を流速１０００μＬ／分で導入して射出することにより、コア部直径約２５０μｍ、外径約４５０μｍのコアシェル型のファイバ状基材を得た。

［実験例３］
（３次元細胞構造体の作製１）
培養液中で、実験例２で作製したファイバ状基材に、実験例１で作製した３Ｔ３細胞の細胞ファイバを、ピンセットを用いて巻きつけて被覆し、３次元細胞構造体を作製した。図３（ａ）、図３（ｂ）は、細胞ファイバを巻きつけた直後の３次元細胞構造体の顕微鏡写真である。１日で細胞密度１×１０^８個／ｃｍ^３の厚い組織を形成することができた。続いて、得られた３次元細胞構造体を培養液中で培養した。図３（ｃ）は、細胞ファイバを巻きつけた後２日間培養後の３次元細胞構造体の顕微鏡写真である。図３（ｃ）では、細胞同士が強固に結合し、一体的な組織が形成されていることが示された。

［実験例４］
（３次元細胞構造体の作製２）
実験例１で作製した３Ｔ３細胞の細胞ファイバの一部を、セルトラッカーオレンジ（インビトロジェン社）を用いて、オレンジ色の蛍光色素で染色した。また、実験例１で作製した細胞ファイバの残りの一部を、セルトラッカーグリーン（インビトロジェン社）を用いて、緑色の蛍光色素で染色した。続いて、実験例２で作製したファイバ状基材２本それぞれに、上記のオレンジ色に染色した細胞ファイバを巻きつけて被覆し、３次元細胞構造体を作製した（第１の細胞層による被覆）。続いて、これらの３次元細胞構造体２本を束ねて、上記の緑色に染色した細胞ファイバを巻きつけて被覆し、３次元細胞構造体を作製した（第２の細胞層による被覆）。図４（ａ）は、上記の第２の細胞を被覆する過程を示す写真である。

続いて、この３次元細胞構造体を２日間培養後、固定してクリオスタット切片を作製し、蛍光顕微鏡で観察した。図４（ｂ）は、３次元細胞構造体のクリオスタット切片を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。その結果、上記第１の細胞層及び上記第２の細胞層は、階層的な構造を維持していることが示された。本実験例の方法により、細胞密度が高く、複雑な階層構造を有する３次元細胞構造体を迅速に作製できることが示された。

［実験例５］
（コアシェル型のファイバ状基材のコア部の解離）
実験例２で作製したファイバ状基材のコア部を選択的に解離させ、ファイバ基材の内部に中空部分を形成した。

図５（ａ）は、ファイバ状基材のコア部がゾル化する前の状態を示す写真である。続いて、ファイバ状基材を４℃の環境下に３０秒間放置した。これにより、ファイバ状基材のコア部のメビオールゲルがゾル化した。ファイバ状基材にシリコン製のチューブを接続し、青色のインクを送液した結果、ファイバ状基材のコア部分に青色のインクが流れる様子が観察された。図５（ｂ）は、ファイバ状基材のコア部分に青色のインクが流れる状態を示す写真である。この結果から、ファイバ状基材のコア部を選択的に解離させ、除去できることが示された。

１００…マイクロ流体装置、１１０，１２０，１３０…導入口、１１５…細胞、２１０，４１０…コア部、２２０，４２０…シェル部、２００，３００…細胞ファイバ、４００…ファイバ状基材。

Claims

コア部を形成する第１の解離性ハイドロゲルと、シェル部を形成する第２の解離性ハイドロゲルと、を有するコアシェル型のファイバ状基材上に細胞を被覆する工程と、
前記第１の解離性ハイドロゲルを除去し、前記基材の内部を中空にする工程と、
前記第２の解離性ハイドロゲルを除去する工程と、を備える、３次元細胞構造体の製造方法。
前記細胞を被覆する工程が、前記基材上にファイバ状の細胞塊を巻きつけることにより行われる、請求項１に記載の製造方法。