WO2024048643A1 - エクソソームの製造方法 - Google Patents

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WO2024048643A1
WO2024048643A1 PCT/JP2023/031479 JP2023031479W WO2024048643A1 WO 2024048643 A1 WO2024048643 A1 WO 2024048643A1 JP 2023031479 W JP2023031479 W JP 2023031479W WO 2024048643 A1 WO2024048643 A1 WO 2024048643A1
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WO
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cell
cells
hydrogel
exosomes
fiber
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/031479
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English (en)
French (fr)
Inventor
真希子 村上
利哉 青野
和孝 川上
和弘 池田
Original Assignee
東洋紡株式会社
株式会社セルファイバ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing exosomes.
  • Exosomes are small particles covered with a lipid bilayer that are released from cells to the outside. Exosomes are one type of extracellular vesicles, and are said to typically have a diameter of about 50 nm to 150 nm. Note that, for example, cluster of differentiation antigens (CD) 9, CD63, and CD81 are known as markers for exosomes.
  • CD cluster of differentiation antigens
  • exosomes As the functions of exosomes, such as their involvement in information transmission between cells and between individuals, are becoming increasingly clear, research and development is underway to utilize exosomes themselves as therapeutic agents, and as carriers for drug delivery systems. Research and development is being actively carried out for its use.
  • Patent Documents 1 to 3 Research and development of methods for producing exosomes is also progressing (see Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Document 1 human bone marrow mesenchymal stem cells are attached to the inner surface of a hollow fiber membrane, and then the cells are A method is described in which a culture solution is perfused, a culture supernatant is collected, and exosomes are obtained from the culture supernatant.
  • the cell fiber includes a hollow fiber-like hydrogel and a plurality of cells encapsulated in the lumen of the hydrogel, and the cell fiber itself has the form of a three-dimensional cell tissue.
  • the cell fiber By performing operations such as weaving, winding, and bundling cell fibers, larger three-dimensional cell tissues (for example, sheet-like cell tissues) can be constructed. For this reason, cell fibers are being actively developed for the construction of three-dimensional cell tissues.
  • exosomes can be efficiently produced by using cell fibers not for constructing three-dimensional cell tissues but for producing exosomes, and have completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing exosomes that can efficiently produce exosomes.
  • the present invention includes the following configuration [1].
  • [1] a step of culturing the cells using a hollow fiber-shaped hydrogel and a cell fiber containing cells encapsulated in the lumen of the hydrogel; Collecting exosomes released by the cells. Method for producing exosomes.
  • the state in which cells are "encapsulated" in the lumen of the hydrogel refers to a state in which the cells do not come out of the hydrogel. However, this does not mean that cells do not come out of the hydrogel at all, but rather that unintended leakage of cells is allowed.
  • spherical cell clusters i.e., spherical aggregates. This tends to occur, and because nutrients and oxygen do not reach the inside of the spherical aggregates sufficiently, the cells inside the aggregates tend to die. As a result, cell proliferation rate and survival rate tend to decrease.
  • aggregates can be grown not in a spherical shape but in a string-like shape (which may also be called a rod-like shape).
  • the radial dimension of the aggregate ie, the dimension of the aggregate in the radial direction of the cell fibers
  • the present invention preferably has the following configuration [2] onwards.
  • a highly concentrated exosome-containing liquid can be obtained in order to recover exosomes accumulated in the lumen of a hydrogel. Therefore, purification of exosomes is facilitated in the sense that exosomes are highly concentrated.
  • exosomes are collected after physically destroying or cutting the hydrogel, there is no need to dissolve the hydrogel, for example, without enzymatic treatment using alginate lyase or chemical treatment. Exosomes in the lumen of the hydrogel can be collected. Therefore, the process of collecting exosomes can be simplified in the sense that it is not necessary to dissolve the hydrogel in order to collect exosomes in the lumen of the hydrogel.
  • the hydrogel may be dissolved after physically destroying or cutting the hydrogel, as described later.
  • any of [1] to [8], wherein the hollow fiber-like hydrogel has an inner diameter of 1000 ⁇ m or less, 750 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 450 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, 350 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 250 ⁇ m or less, or 200 ⁇ m or less.
  • the length of the scale bar is 200 ⁇ m. This is a micrograph of a portion of a cell fiber immediately after fabrication.
  • the length of the scale bar is 200 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 12 in Comparative Example 1.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 12 in Comparative Example 2.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 12 in Comparative Example 3.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 12 in Example 1.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 12 in Example 3.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 15 in Comparative Example 1.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 15 in Comparative Example 2.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 15 in Comparative Example 3.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 15 in Example 1.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m. It is a micrograph taken on Day 15 in Example 2.
  • the length of the scale bar is 500 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cell fiber that can be used in this embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of a cell fiber that can be used in this embodiment.
  • the method for producing exosomes of this embodiment includes a step of culturing cells using a hollow fiber-like hydrogel and cell fibers containing cells encapsulated in the lumen of the hydrogel (hereinafter referred to as “cultivation step”). ) and a step of collecting exosomes released by cells (hereinafter sometimes referred to as the “recovery step”).
  • the method for producing exosomes of this embodiment may include a step of preparing cell fibers (hereinafter sometimes referred to as "preparation step") prior to the culturing step.
  • a hollow fiber-like hydrogel and a cell fiber containing cells encapsulated in the lumen of the hydrogel are prepared.
  • cell fibers may be produced using a microfluidic device, or frozen cell fibers may be thawed.
  • the cell fiber 10 has a fiber shape.
  • the cell fiber 10 includes a hollow fiber-shaped hydrogel 14 and a plurality of cells 12 encapsulated in the lumen of the hydrogel 14.
  • R1 in FIG. 12 is the diameter (outer diameter) of the cell fiber 10.
  • R1 is the cross-sectional shape of the cell fiber 10 (that is, the shape formed by the outer surface of the hydrogel 14 in the cross section when the cell fiber 10 is cut in a plane including the radial direction of the cell fiber 10).
  • This is the diameter (outer diameter) of the cell fiber 10 when it is circular.
  • R2 in FIG. 12 is the inner diameter of the hydrogel 14.
  • R2 is the inner diameter of the hydrogel when the cross-sectional shape of the hydrogel 14 is circular.
  • the cell fiber has a fiber shape.
  • the length of the cell fiber may be, for example, 1 cm or more, 10 cm or more, 1 m or more, or 10 m or more.
  • the length of the cell fiber may be, for example, 1000 m or less, 500 m or less, 200 m or less, or 100 m or less.
  • the cross-sectional shape of the cell fiber i.e., the shape formed by the outer surface of the hydrogel in the cross section when the cell fiber is cut in a plane including the radial direction of the cell fiber
  • the cross-sectional shape of the cell fiber is circular (for example, ellipse, perfect circle, etc.), polygonal, etc.
  • An example is a rectangular shape.
  • a circular shape is preferable.
  • the cross-sectional shape is circular, the hydrogel can have a cylindrical shape.
  • the diameter of the cell fiber may be, for example, 10 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 150 ⁇ m or more, 200 ⁇ m or more, or 250 ⁇ m or more. good.
  • the diameter (outer diameter) of the cell fiber may be, for example, 2000 ⁇ m or less, 1500 ⁇ m or less, 1000 ⁇ m or less, or 500 ⁇ m or less.
  • the cell fiber includes a hollow fiber-like hydrogel and a plurality of cells encapsulated in the lumen of the hydrogel.
  • the lumen of the hydrogel extends in the length direction of the cell fibers. At both ends of the cell fiber (specifically, at both lengthwise ends), the lumen of the hydrogel is closed by the hydrogel. That is, the hydrogel does not have openings at either end.
  • the layer constituted by the hydrogel may have a single-layer structure or a multi-layer structure.
  • the hydrogel layer may be composed of the same type of material (for example, as long as they are alginate gels, they may be composed of the same type of material), and among them, At least one layer may be composed of different materials.
  • the hydrogel has an inner diameter and an outer diameter
  • the inner diameter of the hydrogel is preferably 1000 ⁇ m or less, more preferably 750 ⁇ m or less, further preferably 500 ⁇ m or less, and even more preferably 450 ⁇ m or less. , more preferably 400 ⁇ m or less, even more preferably 350 ⁇ m or less, even more preferably 300 ⁇ m or less.
  • the inner diameter may be, for example, 250 ⁇ m or less, or 200 ⁇ m or less.
  • the inner diameter of the hydrogel may be, for example, 5 ⁇ m or more, 25 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, or 75 ⁇ m or more.
  • the description of the outer diameter of the hydrogel will be omitted since it may overlap with the description of the diameter of the cell fibers.
  • the thickness of the hydrogel is preferably 40 ⁇ m or more, more preferably 60 ⁇ m or more, and even more preferably 80 ⁇ m or more.
  • the thickness of the hydrogel layer is preferably 150 ⁇ m or less, more preferably 130 ⁇ m or less, and even more preferably 120 ⁇ m or less from the viewpoint of cell culture efficiency due to permeation of medium components.
  • hydrogel examples include alginate gel and agarose gel.
  • a hydrogel can be composed of one or more of these.
  • alginate gel is preferred because cell fibers can be produced using a microfluidic device.
  • alginate gel examples include calcium alginate gel, magnesium alginate gel, strontium alginate gel, barium alginate gel, and the like. It is known that aqueous solutions of monovalent metal salts of alginic acid (e.g., sodium alginate aqueous solution, potassium alginate aqueous solution) and ammonium alginate aqueous solutions are gelled by divalent metal ions. An alginate gel can be formed. Examples of divalent metal ions include calcium ions, magnesium ions, strontium ions, and barium ions.
  • hydrogel may contain components other than the hydrogel.
  • Examples of cells encapsulated in the lumen of the hydrogel include cells collected from living organisms.
  • the living organism is a mammal (eg, human, hamster, mouse, rat, dog, African green monkey, etc.).
  • Cells collected from humans may, for example, be mononuclear cells isolated from human peripheral blood, i.e., human peripheral blood mononuclear cells, or activated lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells (e.g. T cells).
  • the cells encapsulated in the lumen of the hydrogel include ES cells and iPS cells that have pluripotency, various types of stem cells that have pluripotency (e.g., hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, etc.), and pluripotent stem cells.
  • stem cells having a single nature for example, hepatic stem cells, reproductive stem cells, etc. can also be exemplified.
  • differentiated cells such as muscle cells such as skeletal muscle cells and cardiomyocytes, nerve cells such as cerebral cortical cells, fibroblasts, epithelial cells, hepatocytes, pancreatic ⁇ cells, skin cells, and immune cells (such as antibody-producing cells) (lymphocytes such as) can also be exemplified.
  • the cells encapsulated in the hydrogel may be cell lines.
  • cell lines include cell lines derived from mammals (eg, humans, hamsters, mice, rats, dogs, African green monkeys, etc.).
  • mammalian-derived cell lines include CHO cells (Chinese hamster ovary-derived cells) and HEK293 cells.
  • HEK293 cells examples include HEK293F cells, HEK293S cells, HEK293T cells, and HEK293H cells.
  • Other examples of cells include cells such as yeast and algae.
  • the cells may be encapsulated in the lumen of the hydrogel in the form of microorganisms such as bacteria.
  • the cell density per mL of culture solution may be, for example, 2 or more cells, 1 x 10 cells or more, 1 x 10 cells or more, or 1 x 10 cells or more.
  • the number may be 1 ⁇ 10 4 or more, or 1 ⁇ 10 5 or more. That is, the cell density in the lumen of the hydrogel may be 2 cells/mL or more, 1 ⁇ 10 cells/mL or more, 1 ⁇ 10 2 cells/mL or more, and 1 ⁇ It may be 10 3 cells/mL or more, 1 ⁇ 10 4 cells/mL or more, or 1 ⁇ 10 5 cells/mL or more.
  • the cell fiber may further contain a hydrogel (hereinafter sometimes referred to as "lumen hydrogel") in the lumen of the hydrogel (that is, a hollow fiber-like hydrogel). That is, in the cell fiber, a lumen hydrogel may be encapsulated in the hydrogel together with the cells. In this case, the cells may be present in the luminal hydrogel. That is, the cells may exist in a state where they are embedded in the lumen hydrogel.
  • the description of the materials constituting the lumen hydrogel is omitted because it overlaps with the description of the hydrogel described above. Therefore, the above description of the hydrogel can also be treated as a description of the lumen hydrogel.
  • the lumen hydrogel may be composed of alginate gel, or may be composed of a gel other than alginate gel.
  • the hydrogel ie., hollow fiber hydrogel
  • the lumen hydrogel is also composed of alginate gel.
  • the divalent metal ions for gelling these may be the same or different, it is preferable that they be the same, that is, common.
  • the cell fiber may further include an extracellular matrix encapsulated in the lumen of the hydrogel. That is, in the cell fiber, the extracellular matrix may be encapsulated in the hydrogel together with the cells.
  • the extracellular matrix include alginic acid, collagen, hyaluronic acid, proteoglycan, and carrageenan.
  • cell fiber may further include other members.
  • other members include carbon nanofibers, beads (eg, beads coated with antibodies), and microchips.
  • the lumen of the cell fiber may or may not be divided into a plurality of chambers (that is, two or more chambers).
  • the prepared cell fiber can be in a state in which cells do not fill the lumen of the hydrogel in a cross section when the cell fiber is cut along a plane including the radial direction of the cell fiber.
  • a state in which cells do not fill the lumen of the hydrogel means a state in which cells do not fill the lumen of the hydrogel in all cross sections.
  • Cultivation process In the culturing process, cells are cultured using cell fibers.
  • the medium can be appropriately selected depending on the cells.
  • a medium for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification ( ⁇ MEM), Roswell Park Memorial Ins titutemedia (RPMI) 1640.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • ⁇ MEM Minimum Essential Medium Eagle
  • RPMI Roswell Park Memorial Ins titutemedia
  • KBM 501 human lymphocyte activation culture medium
  • additives such as fetal calf serum (FCS), antibiotics, and cell growth factors may be added to the medium as necessary.
  • An example of the culturing method is a method in which cell fibers are immersed in a medium.
  • a culture container containing cell fibers immersed in a medium may be left standing in a culture apparatus such as a CO 2 incubator, or may be cultured with shaking.
  • the medium may or may not be perfused. Among these, it is preferable not to perfuse the medium.
  • the medium can be replaced as appropriate. It is preferable to use a xeno-free medium in the final medium exchange before the recovery step described below. At that time, additives for activating cells may be added.
  • cells may or may not fill the lumen of the hydrogel in a cross section when the cell fiber is cut along a plane that includes the radial direction of the cell fiber.
  • a state in which cells fill the lumen of the hydrogel in its cross section is preferable.
  • the number of recoverable exosomes can be further increased.
  • "Being in that state i.e., a state where cells fill the lumen of the hydrogel in that cross section
  • culture may be continued.
  • a hydrogel that can have a negative charge in the medium, such as alginate gel. This is because since exosomes are negatively charged, electrostatic repulsion can be generated between the exosomes and the hydrogel. Note that the permeability of exosomes is considered to be related not only to electrostatic repulsion but also to the pore size of the hydrogel (that is, the pore size of the pores that the hydrogel may have).
  • the pore size of the alginic acid gel can be adjusted, for example, by the weight average molecular weight of alginic acid or the composition ratio of mannuronic acid to guluronic acid (i.e., M/G ratio).
  • M/G ratio the weight average molecular weight of alginic acid or the composition ratio of mannuronic acid to guluronic acid
  • the weight average molecular weight of alginic acid may be, for example, 300,000 or more, 500,000 or more, 1,000,000 or more, or 1,500,000 or more.
  • the weight average molecular weight of alginic acid may be, for example, 2.5 million or less, 2.1 million or less, or 1.6 million or less.
  • the M/G ratio the richer the guluronic acid and the smaller the pore size.
  • the M/G ratio may be 1.8 or less, 1.0 or less, or 0.8 or less.
  • the number of days for culturing may be, for example, 1 day or more, 3 days or more, 5 days or more, 7 days or more, or 9 days or more. , may be 11 days or more, or may be 12 days or more.
  • the number of culture days may be, for example, 70 days or less, 50 days or less, 30 days or less, 20 days or less, 17 days or less.
  • the period may be 15 days or less.
  • the number of culture days means the number of days counted from the day after the day on which the cell fibers were prepared (for example, the day on which the cell fibers were produced or the day on which the frozen cell fibers were thawed) as the first day.
  • the number of days of culture is preferably 50 days or less, more preferably 30 days or less, and even more preferably 20 days or less.
  • exosomes released by cells within the cell fibers are collected.
  • exosomes may be collected from the culture supernatant of cell fibers, or from the fluid in the lumen of cell fibers (ie, exosome-containing fluid).
  • exosomes may be collected from both.
  • the recovery step it is preferable to recover at least the exosomes accumulated in the lumen of the hydrogel. That is, it is preferable to collect at least a liquid containing exosomes accumulated in the lumen of the hydrogel (ie, a liquid containing high concentration of exosomes). According to this, purification of exosomes becomes easy in the sense that exosomes are highly concentrated.
  • the number of exosomes in the fluid in the lumen of the cell fibers is preferably 1.5 times or more, and preferably 2.0 times or more, the number of exosomes in the culture supernatant.
  • the number of exosomes in the fluid in the lumen of the cell fibers may be 2.5 times or more, or 3.0 times or more, the number of exosomes in the culture supernatant.
  • the method for collecting exosomes accumulated in the lumen of the hydrogel is not particularly limited.
  • An example of the procedure is to obtain a liquid and, if necessary, centrifuge the exosome-containing liquid in order to precipitate cells.
  • the cell fibers may be separated by, for example, being picked up, or the culture supernatant may be drawn out.
  • An example of centrifugation conditions is about 300G.
  • the cell fiber hydrogel may be dissolved in order to obtain a liquid containing exosomes accumulated in the lumen of the hydrogel.
  • the method for dissolving the hydrogel can be appropriately selected depending on the type of hydrogel.
  • lysing agents such as chelating agents, weak acids, enzymes can be used, for example.
  • Ethylenediaminetetraacetic acid can be exemplified as a chelating agent.
  • weak acids include organic carboxylic acids such as citric acid.
  • An example of the enzyme is alginate lyase.
  • the hollow fiber-shaped hydrogel may be physically destroyed or cut.
  • Physically breaking or cutting the hydrogel in the form of hollow fibers may involve partially breaking the hydrogel or cutting the hydrogel into multiple parts. Destruction or cutting of the hydrogel can be performed by piercing the hydrogel with a needle or cutting the hydrogel with a cutter or scissors.
  • Physical destruction of the hydrogel is preferably performed by cutting the hydrogel into multiple fragments.
  • the physically disrupted or cut hydrogel is left undisturbed or moved in a solution, such as a medium.
  • the exosomes accumulated in the lumen of the hollow fiber-shaped hydrogel come out of the hydrogel. Thereby, at least the exosomes accumulated in the lumen of the hydrogel can be recovered.
  • the hydrogel is preferably cut, for example, 10 or more times, 30 or more times, or 50 or more times using a cutting means such as scissors or a cutter. Further, it is preferable that most of the cut cell fibers (small pieces), for example, 80% or more of the plurality of small pieces, be divided into sizes of, for example, 5 cm or less, 3 cm or less, or 1 cm or less. This allows exosomes to be efficiently expelled from inside the hydrogel that makes up the cell fibers.
  • hydrogel is physically destroyed or cut, exosomes can be recovered without enzymatic or chemical treatment using alginate lyase or the like. Therefore, treatment to dissolve hydrogels such as alginate gels is not necessary. In this case, since there is no process of dissolving a hydrogel such as alginate gel, the process of collecting exosomes is simplified.
  • Collected exosomes can be concentrated and purified as necessary. That is, the exosome-containing liquid can be subjected to processing for concentrating and purifying exosomes.
  • concentration and purification can be performed by ultrafiltration, ultracentrifugal sedimentation, equilibrium density gradient centrifugation, immunocapture, size exclusion, and the like.
  • KBM 501: METHYLCELLULOSE STOCK SOLUTION 9:1.
  • 9:1 is expressed as a volume ratio.
  • ⁇ Cell seeding conditions on Day 0> human peripheral blood mononuclear cells (Human PBMCs, IQB-PBMC102 manufactured by iQ Bioscience) were thawed, and a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared. Growth medium was used to prepare this cell suspension. This cell suspension was dispensed into a 6-well plate at 6 mL/well. In order to activate and proliferate T cells in human peripheral blood mononuclear cells, ImmunoCult TM Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator was added, and the cells were cultured under the condition of static culture at 37°C in a CO 2 incubator. It started.
  • ⁇ Cell fiber production on Day 3_Examples 1 to 3> On Day 3, a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared using Day 3 medium. Cell fibers were produced using this cell suspension. Specifically, according to the method described in Patent Document 4 (that is, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2016-77229), a first laminar flow of a cell suspension (that is, a core solution) and a shell around the first laminar flow are formed. A second laminar flow of solution and a third laminar flow of sheath solution were formed around the second laminar flow and these laminar flows were discharged into saline. This produced cell fibers. Note that the conditions for producing cell fibers were as follows.
  • ALG300 is medical sodium alginate manufactured by Kimica Co., Ltd.
  • the cell fibers and 30 mL of Day 3 medium were placed in a culture container (specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Violamo), and the cells were continuously cultured in a CO 2 incubator under the condition of static culture at 37°C.
  • the outer diameter and inner diameter of the cell fibers were as follows. Note that the outer diameter and inner diameter were measured at five locations per cell fiber. The average values along with those measurements are shown in the table below.
  • ⁇ Medium exchange> The medium was replaced according to Table 1.
  • the culture medium exchange on Day 11 was performed only in Comparative Example 2, Comparative Example 3, Example 2, and Example 3.
  • Invitrogen TM eBioscience TM Cell Stimulation Cocktail was added after the medium was replaced on Day 12.
  • FIGS. 3A to 3F show microscopic photographs taken on Day 12.
  • the 6-well plate culture hereinafter sometimes referred to as "suspension culture”
  • some dispersed cells were observed, and fairly large aggregates of about 1000 ⁇ m were also observed.
  • FIGS. 3D to 3F short string-like aggregates were observed in the cell fiber culture.
  • FIGS. 4A to 4F show micrographs taken on Day 15.
  • FIGS. 4A and 4B in the suspension culture, fairly large aggregates exceeding 1000 ⁇ m were observed.
  • FIG. 4C in suspension culture with cell activation treatment on Day 12, large aggregates exceeding 2000 ⁇ m were observed.
  • FIGS. 4D to 4F short string-like aggregates were observed in the cell fiber culture.
  • Example collection_Examples 1 to 3_Exosome collection from cell fiber lumen> Cell fibers were removed from the culture container with tweezers, transferred to a 15 mL tube, 1 mL of 10 mM EDTA-PBS was added, and 1 mL of 10 mM EDTA-PBS was further added. After the hydrogel of the cell fibers was dissolved to the extent that cells in the lumen of the cell fibers could be suspended by pipetting, centrifugation was performed at 300 G to collect the supernatant. Note that the cell pellet obtained by this centrifugation was used to measure the survival rate and proliferation rate described below.
  • the resulting gel was immersed in a transfer buffer (AE-1465 EzFastBlot (10X), ATTO Corporation), and the protein was transferred to Immobilon-P membrane (PVDF, Merck) using a transblot SD cell (Bio-Rad). ) was set at 20V and 120mA, and the transfer was performed for 60 minutes. Thereafter, blocking was performed using Blocking One (Nacalai Tesque), and an anti-human CD81 antibody (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diluted 2000 times with Blocking One was reacted at room temperature for 60 minutes.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • liquid amount means the amount of medium used for culture outside the fiber
  • the amount inside the fiber means the amount of liquid used for recovering exosomes inside the fiber
  • the amount of medium for the comparative example corresponds to the volume of the collected sample. Note that the “liquid volume” was used when calculating the “concentration” described below.
  • Consration is a value calculated by particle number/liquid volume.
  • Amount of medium for Comparative Examples 1 to 3 is the amount of medium used (that is, added) per medium exchange after cell seeding on Day 3. On the other hand, for Examples 1 to 3, this is the amount of medium used (that is, added) per medium exchange after cell fiber production.
  • the row “Outside the fiber” shows the measurement results (particle size and number of particles) regarding the culture supernatant collected in the above-mentioned “Sample collection_Examples 1 to 3_Exosome collection outside the cell fiber”.
  • the “inside fiber” row shows the measurement results (particle size and number of particles) regarding the supernatant collected in the above-mentioned “Sample collection_Examples 1 to 3_Exosome collection in cell fiber lumen".
  • the total number of particles in the cell fiber culture was also larger than the total number of particles in the suspension culture (see Comparative Example 1 and Example 1. Also see Comparative Example 2 and Example 2. Comparative Example 3 and Example 3) See also.).
  • HEK293 cells (Gibco TM Expi293F TM Cells product number A14527) were thawed, and a cell suspension of 4.0 to 6.0 ⁇ 10 7 cells/mL was prepared.
  • Expi293 TM Expression Medium (hereinafter sometimes simply referred to as "medium") was used to prepare this cell suspension. 30 mL of this cell suspension was placed in a culture container. Culture was started in a CO 2 incubator at 37° C. under shaking culture conditions. The cells were maintained by passage as appropriate and cultured until the day of cell fiber production (Day 0).
  • ALG100 is medical sodium alginate manufactured by Kimica Co., Ltd. Note that ALG100 is a grade with a lower weight average molecular weight and lower viscosity (specifically, viscosity at 20° C. in a 1.0% aqueous solution) than ALG300.
  • the cell fibers and 30 mL of the medium were placed in a culture container (specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Corning), and the cells were subsequently cultured in a CO 2 incubator at 37° C. under shaking culture conditions.
  • a culture container specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Corning
  • the cells were subsequently cultured in a CO 2 incubator at 37° C. under shaking culture conditions.
  • the average value of the inner diameter of the cell fibers was 168 ⁇ m
  • the average value of the outer diameter of the cell fibers was 397 ⁇ m.
  • the inner diameter is the average value measured at five locations per cell fiber. The same applies to the outer diameter.
  • ⁇ Cell seeding conditions on Day 0_Comparative example 4> On Day 0, a cell suspension of 4.0 ⁇ 10 5 cells/mL was prepared using the medium. 30 mL of this cell suspension was placed in a culture container (specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Corning). The cells were subsequently cultured in a CO 2 incubator at 37° C. under shaking culture conditions.
  • a culture container specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Corning.
  • Example collection_Comparative example 4> After culturing for three days without changing the medium, the culture supernatant was collected. That is, the culture supernatant was collected on Day 3.
  • Example collection_Example 4_Exosome collection from cell fiber lumen> On Day 3, the cell fibers were removed from the culture container with tweezers, transferred to a 50 mL tube, and 25 mL of 2 mM EDTA-PBS was added. After the hydrogel of the cell fibers was dissolved to the extent that cells in the lumen of the cell fibers could be suspended by pipetting, centrifugation was performed at 300 G to collect the supernatant.
  • Example 4 As shown in Table 5, the number of particles per mL of medium in Example 4 (i.e., cell fiber culture) was greater than that in Comparative Example 4 (i.e., suspension culture). The total number of particles in Example 4 was also larger than that in Comparative Example 4.
  • Example 4 although there were more particles inside the fiber than outside the fiber, the number of particles inside the fiber was not significantly different from the number of particles outside the fiber.
  • EV medium means KBM 501 (human lymphocyte activation culture medium) manufactured by Kohjin Bio Co., Ltd.
  • ⁇ Cell seeding conditions on Day 0> human peripheral blood mononuclear cells (Human PBMCs, IQB-PBMC102 manufactured by iQ Bioscience) were thawed, and a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared. Growth medium was used to prepare this cell suspension. This cell suspension was dispensed into 2 wells of a 6-well plate at 4 mL/well. In order to activate and proliferate T cells in human peripheral blood mononuclear cells, ImmunoCult TM Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator was added, and the cells were cultured under the condition of static culture at 37°C in a CO 2 incubator. It started.
  • ⁇ Cell seeding conditions on Day 3_Comparative example 5> On Day 3, a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared using the following core solution. This cell suspension was placed in a 125 mL Erlenmeyer flask at 5 ⁇ 10 5 cells/flask, and 30 mL of growth medium was added. Thereafter, the cells were continuously cultured at 37° C. in a CO 2 incubator (static culture).
  • ⁇ Cell fiber production on Day 3_Example 5 and Example 6> On Day 3, a cell suspension of 1 ⁇ 10 6 cells/mL was prepared using the following core solution. Cell fibers were produced using this cell suspension. Specifically, according to the method described in Patent Document 4 (that is, Japanese Patent Application Publication No. 2016-77229), a first laminar flow of the cell suspension and a second layer of the shell solution around the first laminar flow are performed. A third laminar flow of sheath solution was formed around the second laminar flow and these laminar flows were discharged into the saline. This produced cell fibers. Note that the conditions for producing cell fibers were as follows.
  • ALG300 is medical sodium alginate manufactured by Kimica Co., Ltd.
  • Cell fibers and 30 mL of growth medium were placed in a culture container (specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Violamo), and the cells were continuously cultured in a CO 2 incubator under the condition of static culture at 37°C.
  • a culture container specifically, a 125 mL Erlenmeyer flask manufactured by Violamo
  • FIG. 8 shows a micrograph of the cell fiber (Example 6) taken on Day 15. As shown in FIG. 8, short string-like aggregates were observed in the cell fiber culture.
  • Example collection_Example 5_Exosome collection in cell fiber lysate> Cell fibers were removed from the culture container with tweezers, transferred to a 15 mL tube, 1 mL of 10 mM EDTA-PBS was added, and 1 mL of 10 mM EDTA-PBS was further added. After the hydrogel of the cell fibers was dissolved to the extent that cells in the lumen of the cell fibers could be suspended by pipetting, centrifugation was performed at 300 G to collect the supernatant. Note that the cell pellet obtained by this centrifugation was used to measure the survival rate and proliferation rate described below.
  • Example collection_Example 6_Exosome collection in supernatant after cell fiber cutting Cell fibers were cut 100 times with scissors in a culture vessel. Most of the cut cell fibers were fragmented into small pieces of 1 cm or less. After cutting the cell fibers, the cut cell fibers and 10 mL of the medium were transferred to an Erlenmeyer flask and cultured with shaking at 125 rpm for 30 minutes. Thereafter, the supernatant was collected.
  • Example collection_Example 6_Exosome collection in cell fiber lysate> To the Erlenmeyer flask in which the cut cell fibers remained, 1 mL of 10 mM EDTA-PBS was added, followed by 1 mL of 10 mM EDTA-PBS. After the cell fiber hydrogel was dissolved, it was centrifuged at 300G and the supernatant was collected. Note that the cell pellet obtained by this centrifugation was used to measure the survival rate and proliferation rate described below.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Example 5 the total number of particles in cell fiber culture (Example 5 and Example 6) was greater than that in suspension culture (Comparative Example 5).
  • the amount of particles present in the supernatant collected before dissolving, disrupting, or cutting the hydrogel was determined under the present conditions (cells, culture conditions, (fiber fabrication conditions), it was small. That is, it can be seen that a large number of exosomes are accumulated in the lumen of cell fibers.
  • Example 6 shows that by physically destroying or cutting the hydrogel constituting the cell fiber, a large amount of particles can be recovered from the lumen of the cell fiber without dissolving the hydrogel.
  • the broken or cut hydrogel is dissolved and the particles are further collected.
  • the total number can be further increased (Example 6).
  • the present invention relates to a method for producing exosomes, the present invention has industrial applicability.

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Abstract

エクソソームを効率的に製造することが可能なエクソソームの製造方法を提供することを目的とする。エクソソームの製造方法は、中空ファイバ状のハイドロゲル（１４）、およびハイドロゲル（１４）の内腔に内包された細胞（１２）を含む細胞ファイバ（１０）を用いて細胞（１２）を培養する工程と、細胞（１２）が放出したエクソソームを回収する工程とを含む。

Description

エクソソームの製造方法
　本発明は、エクソソームの製造方法に関する。
　エクソソームは、細胞から細胞外に放出される、脂質二重層で覆われた小型の粒子である。エクソソームは、細胞外小胞の一つであり、典型的には、５０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の直径を有すると言われている。なお、エクソソームのマーカーとして、たとえば、分化抗原群（ＣＤ）９やＣＤ６３、ＣＤ８１が知られている。
　エクソソームの機能、たとえば、細胞間や個体間での情報伝達に関与するといった機能が次第に明らかになってきている中、エクソソームそのものを治療薬として利用するための研究開発や、ドラッグデリバリーシステムの運搬体として利用するための研究開発などが活発に進められている。
　エクソソームの製造方法の研究開発も進められており（特許文献１～３参照）、たとえば、特許文献１には、中空糸膜の内表面にヒト骨髄間葉系幹細胞を接着させたうえで、細胞培養液を灌流し、培養上清を回収し、培養上清からエクソソームを得る方法が記載されている。
　ところで、細胞を、細胞ファイバという形態で培養することが知られている（たとえば特許文献４参照）。細胞ファイバは、中空ファイバ状のハイドロゲルと、ハイドロゲルの内腔に内包された複数の細胞とを含んでおり、細胞ファイバそれ自体が三次元細胞組織の形態をなす。細胞ファイバを織る、巻く、束ねる、といった操作をおこなうことによって、より大きな三次元細胞組織（たとえば、シート状の細胞組織）を構築することができる。このため、細胞ファイバは、三次元細胞組織の構築のために、積極的に開発が進められている。
特許第７０５２４８０号公報 特表２０２０－５３２９９７号公報 特表２０１９－５１４４０２号公報 特開２０１６－７７２２９号公報
　本発明者は、細胞ファイバを三次元細胞組織の構築のためではなく、エクソソームの製造のために用いることによって、エクソソームを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、エクソソームを効率的に製造することが可能なエクソソームの製造方法を提供することを目的とする。
　この課題を解決するために、本発明は、下記［１］の構成を備える。
　［１］
　中空ファイバ状のハイドロゲル、および前記ハイドロゲルの内腔に内包された細胞を含む細胞ファイバを用いて前記細胞を培養する工程と、
　前記細胞が放出したエクソソームを回収する工程とを含む、
　エクソソームの製造方法。
　ここで、ハイドロゲルの内腔に細胞が「内包された」状態とは、細胞が、ハイドロゲルから出ない状態の細胞を言う。ただし、これは、細胞が、ハイドロゲルから一切出ない意味合いではなく、意図しない細胞の漏れ出しを許容する意味合いである。
　［１］によれば、細胞ファイバで細胞を培養するため、エクソソームを効率的に製造することができる。これについて説明する。仮に、培養プレート（たとえば６ウェルプレート）を用いて細胞を培養したとすると（以下、このような培養を「懸濁培養」と言うことがある。）、球状の細胞塊すなわち、球状の凝集塊が発生しやすく、球状の凝集塊の内部まで栄養や酸素が充分に届かないため、凝集塊の内部の細胞が死にやすい。その結果、細胞の増殖率や生存率が低くなる傾向がある。これに対して、［１］によれば、細胞ファイバで細胞を培養することによって、凝集塊を球状ではなく、ひも状（これは、棒状と言い換えてもよいかもしれない。）に成長させることができ、凝集塊の径方向の寸法（すなわち、細胞ファイバの径方向での凝集塊の寸法）を制限することができる。その結果、凝集塊の内部まで栄養や酸素を届けることが可能となり、細胞の増殖率を高めることができ、場合によっては生存率を高めることもできる。したがって、エクソソームを効率的に製造することができる。
　本発明は、下記［２］以降の構成が好ましい。
　［２］
　前記エクソソームを回収する工程では、少なくとも前記ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収する、［１］に記載のエクソソームの製造方法。
　［２］によれば、ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収するため、高濃度のエクソソーム含有液を入手することができる。したがって、エクソソームが高濃度であるという意味で、エクソソームの精製が容易になる。
　［３］
　前記エクソソームを回収する工程では、前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルを物理的に破壊または切断したうえで前記エクソソームを回収する、［１］または［２］に記載のエクソソームの製造方法。
　［３］によれば、ハイドロゲルを物理的に破壊または切断したうえでエクソソームを回収することから、ハイドロゲルを溶解させる処理なしで、たとえば、アルギン酸リアーゼを用いる酵素処理も化学処理もなしで、ハイドロゲルの内腔のエクソソームを回収できる。したがって、ハイドロゲルの内腔のエクソソームを回収するために、ハイドロゲルを溶解させる必要がない、という意味で、エクソソームの回収工程を簡略化することができる。なお、［３］に係るエクソソームの製造方法において、後述するように、ハイドロゲルを物理的に破壊または切断した後に、ハイドロゲルを溶解させてもよいことはもちろんである。
　［４］
　前記エクソソームを回収する工程では、破壊または切断されたハイドロゲルを溶解したうえで、前記エクソソームを回収する、［３］に記載のエクソソームの製造方法。
　［５］
　前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルの物理的な破壊または切断が、前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルを、５ｃｍ以下の小片に分断することを含む、［３］または［４］に記載のエクソソームの製造方法。
　［６］
　前記エクソソームを回収する工程では、前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルを溶解したうえで前記エクソソームを回収する、［１］または［２］に記載のエクソソームの製造方法。
　［７］
　前記細胞ファイバの直径（外径）が２０００μｍ以下、１５００μｍ以下、１０００μｍ以下、または５００μｍ以下である、［１］～［６］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法。
　［８］
　前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルは両端（具体的には長さ方向の両端）で閉じている、［１］～［７］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法。
　［９］
　前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルの内径が１０００μｍ以下、７５０μｍ以下、５００μｍ以下、４５０μｍ以下、４００μｍ以下、３５０μｍ以下、３００μｍ以下、２５０μｍ以下、または２００μｍ以下である、［１］～［８］のいずれかに記載のエクソソームの製造方法。
　本発明によれば、エクソソームを効率的に製造することが可能なエクソソームの製造方法を提供することができる。
Ｄａｙ３に撮影した顕微鏡写真（厳密には、細胞播種や細胞ファイバ作製の前に顕微鏡で撮影した写真）である。スケールバーの長さは２００μｍである。 作製直後の細胞ファイバの一部の顕微鏡写真である。スケールバーの長さは２００μｍである。 比較例１においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例２においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例３においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例１においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例２においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例３においてＤａｙ１２に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例１においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例２においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例３においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例１においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例２においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 実施例３においてＤａｙ１５に撮影した顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例１～３および実施例１～３についての細胞の増殖率を示す棒グラフである。 比較例１～３および実施例１～３についての細胞の生存率を示す棒グラフである。 比較例１～３および実施例１～３についてのＣＤ８１特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。 Ｄａｙ１５に撮影した実施例６に係る細胞ファイバの一部の顕微鏡写真である。スケールバーの長さは５００μｍである。 比較例５および実施例５～６についての細胞の増殖率を示す棒グラフである。 比較例５および実施例５～６についての細胞の生存率を示す棒グラフである。 本実施形態で使用可能な細胞ファイバの模式図である。 本実施形態で使用可能な細胞ファイバの模式的断面図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
　＜１．エクソソームの製造方法＞
　本実施形態のエクソソームの製造方法は、中空ファイバ状のハイドロゲル、およびハイドロゲルの内腔に内包された細胞を含む細胞ファイバを用いて細胞を培養する工程（以下、「培養工程」と言うことがある。）と、細胞が放出したエクソソームを回収する工程（以下、「回収工程」と言うことがある。）とを含む。
　本実施形態のエクソソームの製造方法は、培養工程に先立ち、細胞ファイバを準備する工程（以下、「準備工程」と言うことがある。）を含んでいてもよい。
　＜１．１．準備工程＞
　準備工程では、中空ファイバ状のハイドロゲル、およびハイドロゲルの内腔に内包された細胞を含む細胞ファイバを準備する。たとえば、細胞ファイバをマイクロ流体デバイスで作製してもよいし、凍結状態の細胞ファイバを解凍してもよい。
　本実施形態のエクソソームの製造方法で使用可能な細胞ファイバの一例について、この段落では図１１および図１２を参照しながら説明する。図１１および図１２に示すように細胞ファイバ１０はファイバ状をなす。細胞ファイバ１０は、中空ファイバ状のハイドロゲル１４と、ハイドロゲル１４の内腔に内包された複数の細胞１２とを含む。なお、図１２のＲ１は細胞ファイバ１０の直径（外径）である。具体的には、Ｒ１は、細胞ファイバ１０の断面形状（すなわち、細胞ファイバ１０の径方向を含む面で細胞ファイバ１０を切断したときの断面において、ハイドロゲル１４の外面によって構成される形状）が円形である場合の、細胞ファイバ１０の直径（外径）である。図１２のＲ２はハイドロゲル１４の内径である。具体的には、Ｒ２は、ハイドロゲル１４の断面形状が円形である場合の、ハイドロゲルの内径である。
　細胞ファイバはファイバ状をなす。細胞ファイバの長さは、たとえば１ｃｍ以上であってもよく、１０ｃｍ以上であってもよく、１ｍ以上であってもよく、１０ｍ以上であってもよい。細胞ファイバの長さは、たとえば１０００ｍ以下であってもよく、５００ｍ以下であってもよく、２００ｍ以下であってもよく、１００ｍ以下であってもよい。
　細胞ファイバの断面形状（すなわち、細胞ファイバの径方向を含む面で細胞ファイバを切断したときの断面において、ハイドロゲルの外面によって構成される形状）として、円形（たとえば楕円、真円など）、多角形などを例示することができる。なかでも円形が好ましい。断面形状が円形である場合、ハイドロゲルは筒状をなすことができる。
　細胞ファイバの断面形状（すなわち、細胞ファイバの径方向を含む面で細胞ファイバを切断したときの断面において、ハイドロゲルの外面によって構成される形状）が円形である場合、細胞ファイバの直径（外径）は、たとえば１０μｍ以上であってもよく、５０μｍ以上であってもよく、１００μｍ以上であってもよく、１５０μｍ以上であってもよく、２００μｍ以上であってもよく、２５０μｍ以上であってもよい。細胞ファイバの直径（外径）は、たとえば２０００μｍ以下であってもよく、１５００μｍ以下であってもよく、１０００μｍ以下であってもよく、５００μｍ以下であってもよい。
　細胞ファイバは、中空ファイバ状のハイドロゲルと、ハイドロゲルの内腔に内包された複数の細胞とを含む。
　ハイドロゲルの内腔は、細胞ファイバの長さ方向に延びている。細胞ファイバの両端（具体的には長さ方向の両端）では、ハイドロゲルの内腔はハイドロゲルで閉じられている。すなわち、ハイドロゲルは、両端に開口部を有さない。
　ハイドロゲルが構成する層（以下、「ハイドロゲル層」という。）は、単層構成であってもよく、複層構成であってもよい。なお、ハイドロゲル層が複層構成である場合、それらは同種の材料で構成されていてもよく（たとえば、アルギン酸ゲルである限りにおいて同種の材料で構成されていてもよく）、それらのうちの少なくとも一層が異種の材料で構成されていてもよい。
　ハイドロゲルの断面形状が円形である場合、ハイドロゲルが内径および外径を有するところ、ハイドロゲルの内径は、１０００μｍ以下が好ましく、７５０μｍ以下がより好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましく、４５０μｍ以下がさらに好ましく、４００μｍ以下がさらに好ましく、３５０μｍ以下がさらに好ましく、３００μｍ以下がさらに好ましい。内径は、たとえば２５０μｍ以下であってもよく、２００μｍ以下であってもよい。いっぽう、ハイドロゲルの内径は、たとえば５μｍ以上であってもよく、２５μｍ以上であってもよく、５０μｍ以上であってもよく、７５μｍ以上であってもよい。ハイドロゲルの外径の説明は、細胞ファイバの直径の説明と重複し得るため省略する。
　ハイドロゲルの厚み、すなわち膜厚は、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上がさらに好ましい。４０μｍ以上であると、細胞をファイバの内腔に溜めることができる。いっぽう、ハイドロゲル層の厚みは、培地成分の透過による細胞培養効率の観点から１５０μｍ以下が好ましく、１３０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下がさらに好ましい。
　ハイドロゲルとしては、アルギン酸ゲル、アガロースゲルなどを例示することができる。これらのうち一種または二種以上でハイドロゲルが構成されていることができる。なかでも、細胞ファイバをマイクロ流体デバイスで作製できるといった理由でアルギン酸ゲルが好ましい。
　アルギン酸ゲルとして、アルギン酸カルシウムゲル、アルギン酸マグネシウムゲル、アルギン酸ストロンチウムゲル、アルギン酸バリウムゲルなどを例示することができる。アルギン酸の一価金属塩の水溶液（たとえばアルギン酸ナトリウム水溶液、アルギン酸カリウム水溶液）やアルギン酸アンモニウム水溶液は、二価金属イオンによってゲル化することが知られているところ、このようなゲル化を利用して、アルギン酸ゲルを形成することができる。二価金属イオンとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンを例示することができる。
　なお、ハイドロゲルは、ハイドロゲル以外の成分を含んでいてもよい。
　ハイドロゲルの内腔に内包される細胞として、たとえば、生物から採取された細胞を挙げることができる。生物として、哺乳類（たとえばヒト、ハムスター、マウス、ラット、イヌ、アフリカミドリザルなど）が好ましい。ヒトから採取された細胞として、たとえば、ヒトの末梢血から分離された単核細胞、すなわちヒト末梢血単核細胞であってもよく、ヒト末梢血単核細胞から活性化されたリンパ球（たとえばＴ細胞）であってもよい。いっぽう、ハイドロゲルの内腔に内包される細胞として、分化万能性を有するＥＳ細胞やｉＰＳ細胞、分化多能性を有する各種の幹細胞（たとえば造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞など）、分化単一性を有する幹細胞（たとえば肝幹細胞、生殖幹細胞など）などを例示することもできる。分化した各種の細胞、たとえば骨格筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、大脳皮質細胞などの神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、膵β細胞、皮膚細胞、免疫細胞（たとえば抗体産生細胞のようなリンパ球）なども例示することができる。ハイドロゲルに内包された細胞は細胞株であってもよいことはもちろんである。細胞株としては、哺乳類（たとえばヒト、ハムスター、マウス、ラット、イヌ、アフリカミドリザルなど）由来の細胞株を例示することができる。哺乳類由来の細胞株としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞）、ＨＥＫ２９３細胞を例示することができる。ＨＥＫ２９３細胞として、たとえば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｈ細胞を挙げることができる。その他、細胞として、酵母、藻類などの細胞も挙げられる。細胞は、細菌のような微生物の状態で、ハイドロゲルの内腔に内包されていてもよい。
　培養液１ｍＬあたりの細胞密度は、たとえば、２個以上であってもよく、１×１０個以上であってもよく、１×１０２個以上であってもよく、１×１０３個以上であってもよく、１×１０４個以上であってもよく、１×１０５個以上であってもよい。すなわち、ハイドロゲルの内腔の細胞密度は、２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよい。
　細胞ファイバは、ハイドロゲル（すなわち中空ファイバ状のハイドロゲル）の内腔にハイドロゲル（以下、「内腔ハイドロゲル」と言うことがある。）をさらに含んでいてもよい。すなわち、細胞ファイバでは、細胞とともに内腔ハイドロゲルがハイドロゲルに内包されていてもよい。この場合、細胞は、内腔ハイドロゲル中に存在していてもよい。すなわち、細胞は、内腔ハイドロゲルに埋まったような状態で存在していてもよい。内腔ハイドロゲルを構成する材料の説明は、上述のハイドロゲルの説明と重複するため省略する。よって、上述のハイドロゲルの説明を、内腔ハイドロゲルの説明としても扱うことができる。なお、ハイドロゲル（すなわち中空ファイバ状のハイドロゲル）がアルギン酸ゲルで構成されている場合、内腔ハイドロゲルはアルギン酸ゲルで構成されていてもよく、アルギン酸ゲル以外のゲルで構成されていてもよい。ハイドロゲル（すなわち中空ファイバ状のハイドロゲル）がアルギン酸ゲルで構成されている場合、内腔ハイドロゲルもアルギン酸ゲルで構成されていることが好ましい。これらをゲル化するための二価金属イオンは同じであってもよく、異なっていてもよいものの、同じであること、つまり共通していることが好ましい。
　細胞ファイバは、ハイドロゲルの内腔に内包された細胞外基質をさらに含んでいてもよい。すなわち、細胞ファイバでは、細胞とともに細胞外基質がハイドロゲルに内包されていてもよい。細胞外基質として、たとえば、アルギン酸、コラーゲン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、カラギーナンなどを例示することができる。
　なお、細胞ファイバは、他の部材をさらに含んでいてもよい。このような他の部材として、カーボンナノファイバ、ビーズ（たとえば抗体で被覆されたビーズ）、マイクロチップを例示することができる。
　ちなみに、細胞ファイバの内腔は、複数の室（すなわち２以上の室）に区切られていてもよいし、区切られていなくてもよい。
　準備された細胞ファイバは、細胞ファイバの径方向を含む面で細胞ファイバを切断したときの断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たさない状態であることができる。ここで、「ハイドロゲルの内腔を細胞が満たさない状態」とは、そのあらゆる断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たさない状態を意味する。
　＜１．２．培養工程＞
　培養工程では、細胞ファイバを用いて細胞を培養する。
　培地は、細胞に応じて適宜選択することができる。培地として、たとえば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ， ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（αＭＥＭ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｍｅｄｉａ（ＲＰＭＩ）１６４０を挙げることができる。ヒトＴ細胞を含むヒトリンパ球を培養する場合、市販品として、たとえば、コージンバイオ株式会社製のＫＢＭ　５０１（ヒトリンパ球活性化培養用培地）を好適に使用することができる。なお、培地には、必要に応じて、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）や抗生物質、細胞増殖因子といった添加剤を添加してもよい。
　培養方法として、細胞ファイバを培地に浸しておく方法を例示することができる。たとえば、培地に浸された細胞ファイバ入りの培養容器を、ＣＯ２インキュベータのような培養装置に静置しておいてもよいし、振とう培養してもよい。なお、培地は灌流させてもよいし、灌流させなくてもよい。なかでも、培地を灌流させないことが好ましい。
　培養工程の間、適宜、培地交換をおこなうことができる。後述する回収工程前の最後の培地交換では、ゼノフリー培地を使用することが好ましい。その際に、細胞を活性化するための添加剤を添加してもよい。
　培養中、細胞ファイバの径方向を含む面で細胞ファイバを切断したときの断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たす状態になってもよいし、その状態にならなくてもよいものの、その状態（すなわち、その断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たす状態）になることが好ましい。これにより、回収可能なエクソソーム数をいっそう高めることができる。「その状態（すなわち、その断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たす状態）になる」とは、あらゆる断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たすまで細胞を培養するという意味合いではなく、少なくとも一つの断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たすまで細胞を培養するという意味合いである。もちろん、その状態（すなわち、その断面において、ハイドロゲルの内腔を細胞が満たす状態）以降、引き続き培養を続けてもよい。
　培養中、細胞がエクソソームを放出するところ、細胞ファイバのハイドロゲルの製造条件（たとえば組成）を調整することで、エクソソームがハイドロゲルを透過しにくいようにすることができる。つまり、エクソソームのハイドロゲルの透過を抑制することができる。もちろん、エクソソームが、細胞ファイバのハイドロゲルを透過しやすいようにすることもできる。なかでも、エクソソームのハイドロゲルの透過を抑制することが好ましい。すなわち、細胞ファイバの内腔にエクソソームを蓄積することが好ましい。なぜなら、エクソソームのハイドロゲルの透過を抑制することによって、高濃度のエクソソーム含有液を入手することができるためである。これに加えて、培養中の培地交換によって失われ得るエクソソームを低減できるためである。
　エクソソームのハイドロゲルの透過を抑制するために、たとえば、アルギン酸ゲルのように、培地中で負電荷を有することが可能なハイドロゲルを用いることが好ましい。なぜなら、エクソソームが負に帯電するため、エクソソームとハイドロゲルとの間に静電反発を生じさせることができるためである。なお、エクソソームの透過性は、静電反発だけでなく、ハイドロゲルの孔径（すなわち、ハイドロゲルが有し得る孔の孔径）も関係すると考えられる。ちなみに、ハイドロゲルがアルギン酸ゲルである場合、アルギン酸ゲルの孔径は、たとえば、アルギン酸の重量平均分子量や、マンヌロン酸のグルロン酸に対する構成比（すなわち、Ｍ／Ｇ比）によって調整することができる。重量平均分子量が大きいほど、孔径が小さくなる傾向がある。アルギン酸の重量平均分子量は、たとえば３０万以上であってもよく、５０万以上であってもよく、１００万以上であってもよく、１５０万以上であってもよい。アルギン酸の重量平均分子量は、たとえば２５０万以下であってもよく、２１０万以下であってもよく、１６０万以下であってもよい。いっぽう、Ｍ／Ｇ比が小さいほど、グルロン酸が豊富であり、孔径が小さくなる傾向がある。Ｍ／Ｇ比は、１．８以下であってもよく、１．０以下であってもよく、０．８以下であってもよい。
　培養日数は、たとえば、１日以上であってもよく、３日以上であってもよく、５日以上であってもよく、７日以上であってもよく、９日以上であってもよく、１１日以上であってもよく、１２日以上であってもよい。いっぽう、培養日数は、たとえば、７０日以下であってもよく、５０日以下であってもよく、３０日以下であってもよく、２０日以下であってもよく、１７日以下であってもよく、１５日以下であってもよい。ここで、培養日数は、細胞ファイバを準備した日（たとえば細胞ファイバを作製した日、または凍結状態の細胞ファイバを解凍した日）の翌日を１日目として数えられる日数を意味する。なお、細胞ファイバの内腔にエクソソームを蓄積する場合、培養日数が、過度に長いと（たとえば１００日であると）、エクソソームが細胞ファイバ外に漏れ出すことがあり得る。したがって、細胞ファイバの内腔にエクソソームを蓄積する場合には、培養日数は、５０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましく、２０日以下がさらに好ましい。
　＜１．３．回収工程＞
　回収工程では、細胞ファイバ内の細胞が放出したエクソソームを回収する。たとえば、細胞ファイバの培養上清からエクソソームを回収してもよいし、細胞ファイバの内腔の液（すなわちエクソソーム含有液）からエクソソームを回収してもよい。もちろん、両者からエクソソームを回収してもよい。
　回収工程では、少なくともハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収することが好ましい。すなわち、少なくともハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを含む液（すなわち高濃度のエクソソーム含有液）を回収することが好ましい。これによれば、エクソソームが高濃度であるという意味で、エクソソームの精製が容易になる。なお、細胞ファイバの内腔の液のエクソソーム数は、培養上清のエクソソーム数の１．５倍以上が好ましく、２．０倍以上が好ましい。細胞ファイバの内腔の液のエクソソーム数は、培養上清のエクソソーム数の２．５倍以上であってもよく、３．０倍以上であってもよい。
　ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収する方法は特に限定されないところ、たとえば、細胞ファイバを培養上清から分離し、細胞ファイバのハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを含む液、すなわちエクソソーム含有液を得て、必要に応じて、細胞を沈殿させるためにエクソソーム含有液を遠心する、という手順を挙げることができる。細胞ファイバを培養上清から分離するために、たとえば、細胞ファイバをつまみ上げることによって分離してもよいし、培養上清を抜き取ってもよい。遠心分離の条件として３００Ｇ程度を例示することができる。
　細胞ファイバを培養上清から分離した後、ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを含む液を得るために、細胞ファイバのハイドロゲルを溶解させてもよい。ハイドロゲルの溶解方法は、ハイドロゲルの種類に応じて適宜選択することができる。ハイドロゲルを溶解するために、たとえば、キレート剤、弱酸、酵素といった溶解剤を使用することができる。キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸を例示することができる。弱酸として、クエン酸のような有機カルボン酸を例示することができる。酵素としてアルギン酸リアーゼを例示することができる。
　ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収するために、中空ファイバ状のハイドロゲルを物理的に破壊または切断してもよい。中空ファイバ状のハイドロゲルの物理的な破壊または切断は、ハイドロゲルを部分的に壊すことであってもよく、ハイドロゲルを複数の部分に切断することであってもよい。ハイドロゲルの破壊または切断は、ハイドロゲルにニードルを突き刺したり、ハイドロゲルをカッターやハサミで切断することによっておこなうことができる。
　ハイドロゲルの物理的な破壊は、ハイドロゲルが複数の断片に分かれるよう切断することによっておこなわれることが好ましい。好ましくは、物理的に破壊または切断されたハイドロゲルを、たとえば培地のような溶液中で静置するか、または溶液中で動かす。この際に、中空ファイバ状のハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームが、ハイドロゲルの外に出る。これにより、少なくともハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収することができる。
　ハイドロゲルを切断する場合、ハイドロゲルは、ハサミやカッターのような切断手段によってたとえば１０回以上、３０回以上、または５０回以上切断されることが好ましい。また、切断された細胞ファイバ（小片）の大部分、たとえば複数の小片のうちの８０％以上が、例えば５ｃｍ以下、３ｃｍ以下、または１ｃｍ以下のサイズに分断されることが好ましい。これにより、細胞ファイバを構成するハイドロゲルの内側からエクソソームを効率よく外へ出すことができる。
　ハイドロゲルは、物理的に破壊または切断されるため、アルギン酸リアーゼなどによる酵素処理や化学処理をすることなく、エクソソームを回収できる。したがって、アルギン酸ゲルのようなハイドロゲルを溶解させる処理は不要である。この場合、アルギン酸ゲルのようなハイドロゲルを溶解するというプロセスがないため、エクソソームの回収の工程が簡略化される。
　回収したエクソソームは必要に応じて、濃縮や精製をおこなうことができる。すなわち、エクソソーム含有液について、エクソソームを濃縮や精製するための処理をおこなうことができる。たとえば、限外ろ過、超遠心沈降法、平衡密度勾配遠心法、免疫学的捕捉法、サイズ排除法などで、濃縮や精製をおこなうことができる。
　以下、本発明を実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
　＜２．ヒト末梢血単核細胞からのＴ細胞を用いたエクソソームの製造＞
　＜Ｄａｙ０からＤａｙ１５（サンプル回収）までの培養条件＞
　培養条件の概要を次に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１において、「－」は、培地交換をおこなわなかったことを意味する。
　「ＥＶ培地」は、コージンバイオ株式会社製のＫＢＭ　５０１（ヒトリンパ球活性化培養用培地）を意味する。
　「増殖培地」は、ＥＶ培地すなわちＫＢＭ　５０１に、Ａｖｅｎｔａｃｅｌｌ　ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ製のＵｌｔｒａ－ＧｒｏＴＭ（ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ（ｈＰＬ））を添加した培地を意味する（ＫＢＭ　５０１：Ｕｌｔｒａ－ＧｒｏＴＭ＝４８７．５ｍＬ：１２．５ｍＬ）。
　「Ｄａｙ３培地」は、ＥＶ培地すなわちＫＢＭ　５０１に、アールアンドディー　システムス製のＭＥＴＨＹＬＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＳＴＯＣＫ　ＳＯＬＵＴＩＯＮを混合させたもの（ＫＢＭ　５０１：ＭＥＴＨＹＬＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＳＴＯＣＫ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ＝９：１）を意味する。ここで、「９：１」は体積比で示されている。
　＜Ｄａｙ０の細胞播種条件＞
　Ｄａｙ０に、ヒト末梢血単核細胞（Ｈｕｍａｎ　ＰＢＭＣｓ，ｉＱ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＩＱＢ－ＰＢＭＣ１０２）を解凍し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を調製するために増殖培地を使用した。この細胞懸濁液を、６ウェルプレートに６ｍＬ／ウェルで分注した。ヒト末梢血単核細胞中のＴ細胞を活性化し、増殖させるために、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴＭ　Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒを添加したうえで、ＣＯ２インキュベータで３７℃静置培養という条件で培養を開始した。
　＜Ｄａｙ３の顕微鏡写真＞
　図１に示すように、Ｄａｙ３に撮影した顕微鏡写真（厳密には、後述の細胞播種や細胞ファイバ作製の前に顕微鏡で撮影した写真）を示す。この時点では、それほど大きな凝集塊は見られなかった。
　＜Ｄａｙ３の細胞播種条件＿比較例１～３＞
　Ｄａｙ３に、Ｄａｙ３培地を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、比較例１～３それぞれで、６ウェルプレートの２ウェルに６ｍＬ／ウェルで分注した。そのうえで、ＣＯ２インキュベータで３７℃で引き続き培養した（静置培養）。
　＜Ｄａｙ３の細胞ファイバ作製＿実施例１～３＞
　Ｄａｙ３に、Ｄａｙ３培地を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を用いて細胞ファイバを作製した。具体的には、特許文献４（すなわち特開２０１６－７７２２９号公報）に記載の方法に準じて、細胞懸濁液（すなわちコア溶液）の第１層流と、第１層流の周囲でシェル溶液の第２層流と、第２層流の周囲でシース溶液の第３層流とを形成し、これらの層流を生理食塩水中に吐出した。これにより、細胞ファイバを作製した。なお、細胞ファイバの作製条件は次のとおりであった。
　　　封入細胞数：５×１０５ｃｅｌｌｓ（コア封入量：０．５ｍＬ）
　　　コア部細胞密度：１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
　　　シェル溶液：１．０ｗ／ｖ％　ＡＬＧ３００／生理食塩水
　　　シース溶液：１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液
　ここで、ＡＬＧ３００は、株式会社キミカ製の医療用アルギン酸ナトリウムである。
　細胞ファイバと、Ｄａｙ３培地３０ｍＬとを培養容器（具体的には、ビオラモ社製１２５ｍＬ三角フラスコ）に入れ、ＣＯ２インキュベータで３７℃静置培養という条件で引き続き培養した。
　なお、細胞ファイバの外径や内径は次のとおりであった。なお、外径や内径は、細胞ファイバ一本当たり五か所で測定した。それらの測定値とともに、平均値を次の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜Ｄａｙ３の顕微鏡写真＿細胞ファイバ作製直後＞
　図２に示すように、Ｄａｙ３に細胞ファイバを顕微鏡で撮影した写真を示す。大きな凝集塊は見られなかった。
　＜培地交換＞
　表１に従って培地交換をおこなった。なお、Ｄａｙ１１の培地交換は、比較例２、比較例３、実施例２および実施例３だけおこなった。比較例３および実施例３については、Ｄａｙ１２の培地交換後に、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ　ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加した。
　＜Ｄａｙ１２の顕微鏡写真＞
　図３Ａ～図３Ｆに、Ｄａｙ１２に撮影した顕微鏡写真を示す。図３Ａ～図３Ｃに示すように、６ウェルプレート培養（以下、「懸濁培養」と言うことがある）では、いくらか分散した細胞が見られ、１０００μｍ程度のそれなりに大きな凝集塊も見られた。図３Ｄ～図３Ｆに示すように、細胞ファイバ培養では、短いひも状の凝集塊が見られた。
　＜Ｄａｙ１５の顕微鏡写真＞
　図４Ａ～図４Ｆに、Ｄａｙ１５に撮影した顕微鏡写真を示す。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、懸濁培養では、１０００μｍを超えるようなそれなりに大きな凝集塊が見られた。図４Ｃに示すように、Ｄａｙ１２の細胞活性化処理を伴った懸濁培養では、２０００μｍを超えるような大きな凝集塊が見られた。図４Ｄ～図４Ｆに示すように、細胞ファイバ培養では、短いひも状の凝集塊が見られた。
　＜サンプル回収＿比較例１～３＞
　Ｄａｙ１５に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例１～３＿細胞ファイバ外のエクソソーム回収＞
　Ｄａｙ１５に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例１～３＿細胞ファイバ内腔のエクソソーム回収＞
　細胞ファイバを培養容器からピンセットで取り出し、１５ｍＬチューブに移したうえで、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳを加え、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳをさらに加えた。細胞ファイバの内腔の細胞をピペッティングで懸濁できる程度まで、細胞ファイバのハイドロゲルが溶解した後、３００Ｇで遠心をおこない、上清を回収した。なお、この遠心で得られた細胞ペレットは、後述の生存率や増殖率を測定するために使用された。
　＜増殖率の測定＞
　Ｄａｙ１５に、血球計算盤を用いてＴｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙで、青に染色された細胞数と、総細胞数とを計測した。Ｄａｙ１５の全生細胞数を求めたうえで、全生細胞数をＤａｙ３の播種細胞数で割ることで、増殖率を算出した。
　図５に示すように、細胞ファイバ培養の増殖率は、懸濁培養の増殖率に比べて高かった（比較例１および実施例１参照。比較例２および実施例２も参照。比較例３および実施例３も参照。）。
　＜生存率の測定＞
　Ｄａｙ１５に、血球計算盤を用いてＴｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙで、青に染色された細胞数と、総細胞数とを計測した。その計測結果から、次の式で生存率を算出した。
　　　生存率＝{１．００－（青に染色された細胞数／総細胞数）}×１００
　図６に示すように、比較例３と実施例３とを対比すると、すなわち、Ｄａｙ１２に細胞活性化処理をおこなった二つの例を対比すると、実施例３（すなわち細胞ファイバ培養をおこなった例）の生存率は、比較例３（すなわち懸濁培養をおこなった例）の生存率に比べて高かった。
　＜ウェスタンブロッティング＿ＣＤ８１特異的抗体を用いたエクソソーム検出＞
　回収したサンプル（上述の「サンプル回収」と題された三つの項目参照）にＮｕＰＡＧＥＴＭ　ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　（４Ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加することによって、最終的にＮｕＰＡＧＥＴＭ　ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｘ）になるように調製し、９５℃で５分間煮沸し、ウェスタンブロッティング用の各試料を得た。１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｅ－ＰＡＧＥＬ、Ｅ－Ｒ１０Ｌ、ＡＴＴＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に各試料１８μＬを乗せて、２００Ｖ、３０ｍＡに設定し（電源装置ｍｙ　Ｐｏｗｅｒ　ＩＩ　３００、ＡＴＴＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、４０分間電気泳動した。得られたゲルをトランスファー緩衝液（ＡＥ－１４６５　ＥｚＦａｓｔＢｌｏｔ（１０Ｘ）、ＡＴＴＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）に浸漬し、トランスブロットＳＤセル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐメンブレン（ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社）に２０Ｖ、１２０ｍＡに設定し、６０分間トランスファーした。その後、ブロッキングワン（ナカライテスク社）によりブロッキングし、ブロッキングワンで２０００倍希釈した抗ヒトＣＤ８１抗体（富士フイルム和光純薬株式会社）を室温で６０分間反応させた。
　その後、反応後のＰＶＤＦ膜を０．０５ｖ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　ＴＢＳで洗浄し、ブロッキングワンで２０００倍希釈した２次抗体（Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ、ＨＲＰ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｗｈｏｌｅ　Ａｂ　Ｓｈｅｅｐ、ａｂｃａｍ社）を室温で６０分間反応させた。０．０５ｖ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　ＴＢＳで洗浄後、ＷＳＥ－７１２０　ＥｚＷｅｓｔ　Ｌｕｍｉ　ｐｌｕｓ（ＡＴＴＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を添加し、ｉＢｒｉｇｈｔＴＭ　ＦＬ１５００　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて発光シグナルを検出した。なお、抗ヒトＣＤ８１抗体は、エクソソームのマーカータンパク質の１つであるＣＤ８１に対する抗体である。
　図７に示すように、比較例１～３および実施例１～３それぞれのサンプルに、ＣＤ８１陽性の粒子、すなわちエクソソームが含まれていた。
　＜粒子数や粒径の測定＞
　エクソソームの平均粒子数および直径は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ；　ＮＳ３００、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）により測定した。測定条件は次のとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　測定結果を次に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４において、「液量」とは、ファイバ外は培養に使用した培地量、ファイバ内は、ファイバ内のエクソソーム回収に使用した液量、比較例は培地量である。よって、「液量」は、回収されたサンプルの液量に相当する、と言える。なお、「液量」は、後述の「濃度」を算出する際に利用された。
　「濃度」とは、粒子数／液量で算出される値である。
　「培地量」とは、比較例１～３については、Ｄａｙ３の細胞播種後の培地交換一回当たりに使用した（すなわち加えた）培地の量である。いっぽう、実施例１～３については、細胞ファイバ作成後の培地交換一回当たりに使用した（すなわち加えた）培地の量である。
　「ファイバ外」の行には、上述の「サンプル回収＿実施例１～３＿細胞ファイバ外のエクソソーム回収」で回収した培養上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　「ファイバ内」の行には、上述の「サンプル回収＿実施例１～３＿細胞ファイバ内腔のエクソソーム回収」で回収した上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表４に示すように、細胞ファイバ培養における培地１ｍＬ当たりの粒子数は、懸濁培養のそれに比べて多かった（比較例１および実施例１参照。比較例２および実施例２も参照。比較例３および実施例３も参照。）。
　細胞ファイバ培養の総粒子数自体も、懸濁培養の総粒子数自体に比べて多かった（比較例１および実施例１参照。比較例２および実施例２も参照。比較例３および実施例３も参照。）。
　細胞ファイバ培養では、ファイバ外よりもファイバ内に多くの粒子、すなわちエクソソームが存在していた。すなわち、細胞ファイバのハイドロゲルの内腔にエクソソームが蓄積していた（実施例１～３参照）。
　＜３．ＨＥＫ２９３細胞を用いたエクソソームの製造＞
　＜細胞の前培養条件＞
　ＨＥＫ２９３細胞（ＧｉｂｃｏＴＭＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ　Ｃｅｌｌｓ　製品番号Ａ１４５２７）を解凍し、４．０～６．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を調製するためにＥｘｐｉ２９３ＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（以下、単に「培地」と言うことがある。）を使用した。この細胞懸濁液を培養容器に３０ｍＬ入れた。ＣＯ２インキュベータで３７℃、振盪培養という条件で培養を開始した。細胞は適宜継代して維持し、細胞ファイバ作製日（Ｄａｙ０）まで培養した。
　＜Ｄａｙ０の細胞ファイバ作製＿実施例４＞
　Ｄａｙ０に培地を用いて１．２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を用いて細胞ファイバを作製した。具体的には、特許文献４（すなわち特開２０１６－７７２２９号公報）に記載の方法に準じて、細胞懸濁液（すなわちコア溶液）の第１層流と、第１層流の周囲でシェル溶液の第２層流と、第２層流の周囲でシース溶液の第３層流とを形成し、これらの層流を生理食塩水中に吐出した。これにより、細胞ファイバを作製した。なお、細胞ファイバの作製条件は次のとおりであった。
　　　封入細胞数：１．２×１０７ｃｅｌｌｓ（コア封入量：０．５ｍＬ）
　　　コア部細胞密度：２．４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
　　　シェル溶液：１．０ｗ／ｖ％　ＡＬＧ１００／生理食塩水
　　　シース溶液：１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液（３％スクロース含有）
　ここで、ＡＬＧ１００は、株式会社キミカ製の医療用アルギン酸ナトリウムである。なお、ＡＬＧ１００は、ＡＬＧ３００よりも重量平均分子量が低く、粘度（具体的には、１．０％水溶液、２０℃での粘度）が低いグレードである。
　細胞ファイバと培地３０ｍＬとを培養容器（具体的には、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製１２５ｍＬ三角フラスコ）に入れ、ＣＯ２インキュベータで３７℃、振盪培養という条件で引き続き培養した。
　なお、細胞ファイバの内径の平均値は１６８μｍ、細胞ファイバの外径の平均値は３９７μｍであった。ここで、内径は、細胞ファイバ一本当たり五か所で測定した際の平均値である。外径も同様である。
　＜Ｄａｙ０の細胞播種条件＿比較例４＞
　Ｄａｙ０に培地を用いて４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を培養容器（具体的には、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製の１２５ｍＬ三角フラスコ）に３０ｍＬ入れた。ＣＯ２インキュベータで３７℃、振盪培養という条件で引き続き培養した。
　＜サンプル回収＿比較例４＞
　三日間培地交換なしで培養したうえで培養上清を回収した。すなわち、Ｄａｙ３に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例４＿細胞ファイバ外のエクソソーム回収＞
　三日間培地交換なしで培養したうえで培養上清を回収した。すなわち、Ｄａｙ３に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例４＿細胞ファイバ内腔のエクソソーム回収＞
　Ｄａｙ３に細胞ファイバを培養容器からピンセットで取り出し、５０ｍＬチューブに移したうえで、２５ｍＬの２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳを加えた。細胞ファイバの内腔の細胞をピペッティングで懸濁できる程度まで、細胞ファイバのハイドロゲルが溶解した後、３００Ｇで遠心をおこない、上清を回収した。
　＜粒子数や粒径の測定＞
　得られたサンプルのエクソソームの粒子数および直径は、ナノ粒子解析システム（Ｎａｎｏ　Ｓｉｇｈｔ　ＬＭ１０－ＨＳ）を用いて、カメラレベル１２で測定した。
　測定結果を次に示す。なお、この表では、測定結果を表４と同じ要領で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、実施例４（すなわち細胞ファイバ培養）における培地１ｍＬ当たりの粒子数は、比較例４（すなわち懸濁培養）のそれに比べて多かった。実施例４の総粒子数自体も、比較例４の総粒子数自体に比べて多かった。
　実施例４では、ファイバ外よりもファイバ内に多くの粒子が存在していたものの、ファイバ内の粒子数は、ファイバ外の粒子数と大差なかった。
　＜４．ヒト末梢血単核細胞からのＴ細胞を用いたエクソソームの製造＞
　＜Ｄａｙ０からＤａｙ１５（サンプル回収）までの培養条件＞
　培養条件の概要を次に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　「ＥＶ培地」は、コージンバイオ株式会社製のＫＢＭ　５０１（ヒトリンパ球活性化培養用培地）を意味する。
　「増殖培地」は、ＥＶ培地すなわちＫＢＭ　５０１に、Ａｖｅｎｔａｃｅｌｌ　ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ製のＵｌｔｒａ－ＧｒｏＴＭ（ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ（ｈＰＬ））を添加した培地を意味する（ＫＢＭ　５０１：Ｕｌｔｒａ－ＧｒｏＴＭ＝４８７．５ｍＬ：１２．５ｍＬ）。
　＜Ｄａｙ０の細胞播種条件＞
　Ｄａｙ０に、ヒト末梢血単核細胞（Ｈｕｍａｎ　ＰＢＭＣｓ，ｉＱ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＩＱＢ－ＰＢＭＣ１０２）を解凍し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を調製するために増殖培地を使用した。この細胞懸濁液を、６ウェルプレートの２ウェルに４ｍＬ／ウェルで分注した。ヒト末梢血単核細胞中のＴ細胞を活性化し、増殖させるために、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＴＭ　Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒを添加したうえで、ＣＯ２インキュベータで３７℃静置培養という条件で培養を開始した。
　＜Ｄａｙ３の顕微鏡写真＞
　Ｄａｙ３に細胞を顕微鏡で観察した（厳密には、後述の細胞播種や細胞ファイバ作製の前に顕微鏡で撮影した）ところ、この時点では、図１に示す顕微鏡写真と同じように、それほど大きな凝集塊は見られなかった。
　＜Ｄａｙ３の細胞播種条件＿比較例５＞
　Ｄａｙ３に、下記のコア溶液を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋになるように入れ、増殖培地を３０ｍＬ添加した。そのうえで、ＣＯ２インキュベータで３７℃で引き続き培養した（静置培養）。
　＜Ｄａｙ３の細胞ファイバ作製＿実施例５および実施例６＞
　Ｄａｙ３に、下記のコア溶液を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を用いて細胞ファイバを作製した。具体的には、特許文献４（すなわち特開２０１６－７７２２９号公報）に記載の方法に準じて、細胞懸濁液の第１層流と、第１層流の周囲でシェル溶液の第２層流と、第２層流の周囲でシース溶液の第３層流とを形成し、これらの層流を生理食塩水中に吐出した。これにより、細胞ファイバを作製した。なお、細胞ファイバの作製条件は次のとおりであった。
　　　封入細胞数：５×１０５ｃｅｌｌｓ（コア封入量：０．５ｍＬ）
　　　細胞懸濁液中の細胞密度：１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
　　　シェル溶液：１．０ｗ／ｖ％　ＡＬＧ３００／生理食塩水
　　　シース溶液：１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液に３％のスクロースを添加したもの
　　　コア溶液　：ＥＶ培地すなわちＫＢＭ　５０１に、アールアンドディー　システムス製のＭＥＴＨＹＬＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＳＴＯＣＫ　ＳＯＬＵＴＩＯＮを混合させたもの（ＫＢＭ　５０１：ＭＥＴＨＹＬＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＳＴＯＣＫ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ＝９：１）。ここで、「９：１」は体積比で示されている。
　ここで、ＡＬＧ３００は、株式会社キミカ製の医療用アルギン酸ナトリウムである。
　細胞ファイバと、増殖培地３０ｍＬとを培養容器（具体的には、ビオラモ社製１２５ｍＬ三角フラスコ）に入れ、ＣＯ２インキュベータで３７℃静置培養という条件で引き続き培養した。
　＜Ｄａｙ３の顕微鏡写真＿細胞ファイバ作製直後＞
　Ｄａｙ３に細胞ファイバを顕微鏡で観察したところ、図２に示す顕微鏡写真と同じように、細胞ファイバに大きな凝集塊は見られなかった。
　＜培地交換＞
　表６に従って培地交換をおこなった。
　＜Ｄａｙ１５の顕微鏡写真＞
　図８に、Ｄａｙ１５に撮影した細胞ファイバ（実施例６）の顕微鏡写真を示す。図８に示すように細胞ファイバ培養では、短いひも状の凝集塊が見られた。
　＜サンプル回収＿比較例５＿上清中のエクソソーム回収＞
　Ｄａｙ１５に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例５＿細胞ファイバの上清中のエクソソーム回収＞
　Ｄａｙ１５に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例５＿細胞ファイバの溶解液中のエクソソーム回収＞
　細胞ファイバを培養容器からピンセットで取り出し、１５ｍＬチューブに移したうえで、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳを加え、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳをさらに加えた。細胞ファイバの内腔の細胞をピペッティングで懸濁できる程度まで、細胞ファイバのハイドロゲルが溶解した後、３００Ｇで遠心をおこない、上清を回収した。なお、この遠心で得られた細胞ペレットは、後述の生存率や増殖率を測定するために使用された。
　＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバの上清中のエクソソーム回収＞
　Ｄａｙ１５に培養上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバ切断後の上清中のエクソソーム回収＞
　細胞ファイバを培養容器中で１００回ハサミによって切断処理した。切断された細胞ファイバの大部分は、１ｃｍ以下の小片に分断された。細胞ファイバの切断後、切断した細胞ファイバと１０ｍＬの培地とをエルレンマイヤーフラスコに移し、１２５ｒｐｍで３０分振盪培養した。その後、上清を回収した。
　＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバの溶解液中のエクソソーム回収＞
　切断された細胞ファイバが残ったままのエルレンマイヤーフラスコに、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳを加え、１ｍＬの１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳをさらに加えた。細胞ファイバのハイドロゲルが溶解した後、３００Ｇで遠心をおこない、上清を回収した。なお、この遠心で得られた細胞ペレットは、後述の生存率や増殖率を測定するために使用された。
　＜増殖率の測定＞
　比較例５および実施例５～６について、Ｄａｙ１５に、血球計算盤を用いてＴｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙで、青に染色された細胞数と、総細胞数とを計測した。Ｄａｙ１５の全生細胞数を求めたうえで、全生細胞数をＤａｙ３の播種細胞数で割ることで、増殖率を算出した。
　図９に示すように、実施例５および実施例６における細胞ファイバ培養での細胞の増殖率は、比較例５における懸濁培養での細胞の増殖率よりも高かった。したがって、細胞ファイバによる培養によって、エクソソームの効率的な製造が可能となり得ることがわかる。
　＜生存率の測定＞
　比較例５および実施例５～６について、Ｄａｙ１５に、血球計算盤を用いてＴｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｓｓａｙで、青に染色された細胞数と、総細胞数とを計測した。その計測結果から、次の式で生存率を算出した。
　　　生存率＝{１．００－（青に染色された細胞数／総細胞数）}×１００
　図１０に示すように、細胞の生存率は、比較例５および実施例５～６のいずれの場合であっても、ほぼ同程度であった（約９５％）。
　＜粒子数や粒径の測定＞
　回収したサンプル中のエクソソームの平均粒子数および直径は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ；　ＮＳ３００、Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）により測定した。測定条件は次のとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　測定結果を次に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　表８において、比較例５のサンプルの欄の「上清」は、＜サンプル回収＿比較例５＿上清中のエクソソーム回収＞の欄で説明した上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、実施例５のサンプルの欄の「上清」は、＜サンプル回収＿実施例５＿細胞ファイバの上清中のエクソソーム回収＞の欄で説明した上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、実施例５のサンプルの欄の「ファイバ溶解液」は、＜サンプル回収＿実施例５＿細胞ファイバの溶解液中のエクソソーム回収＞の欄で説明したファイバ溶解後に回収された上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、実施例６のサンプルの欄の「ファイバ切断前の上清」は、＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバの上清中のエクソソーム回収＞の欄で説明した上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、実施例６のサンプルの欄の「ファイバ切断後の上清」は、＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバ切断後の上清中のエクソソーム回収＞の欄で説明した、ファイバ切断後に回収された上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、実施例６のサンプルの欄の「ファイバ溶解液」は、＜サンプル回収＿実施例６＿細胞ファイバの溶解液中のエクソソーム回収＞の欄で説明した、ファイバ溶解後に回収された上清に関する測定結果（粒径や粒子数）を示す。
　表８において、「粒子数」とは、比較例５および実施例５～６において回収されたサンプルそれぞれについて、上記のナノ粒子トラッキング分析により測定された粒子数を示す。
　表８において、「液量」とは、比較例５および実施例５～６において回収された各サンプルの液量に相当する。
　「濃度」とは、粒子数／液量で算出される値である。
　表８に示すように、細胞ファイバ培養（実施例５および実施例６）における総粒子数は、懸濁培養（比較例５）のそれに比べて多かった。
　また、細胞ファイバ培養（実施例５および実施例６）では、ハイドロゲルの溶解、破壊または切断をする前に回収した上清中に存在する粒子の量は、今回の条件(細胞、培養条件、ファイバ作製条件)においては、少なかった。すなわち、多数のエクソソームは、細胞ファイバの内腔に蓄積していることがわかる。
　実施例６から、細胞ファイバを構成するハイドロゲルを物理的に破壊または切断することによって、ハイドロゲルを溶解しなくても、多量の粒子を細胞ファイバの内腔から回収することができることがわかる。
　さらに、細胞ファイバを物理的に破壊または切断したうえで細胞ファイバの内腔から粒子を回収した後に、破壊または切断されたハイドロゲルを溶解したうえで粒子をさらに回収することによって、回収する粒子の総数をさらに増加させることができる（実施例６）。
　なお、破壊または切断されたハイドロゲルの溶解は必ずしも必要ではないことに留意されたい。実施例６を参照すると、ファイバ切断前の上清中の粒子数と、ファイバ切断後の上清中の粒子数の合計は、比較例５における上清中の粒子数に近い値になっている。したがって、試薬を用いたハイドロゲルの溶解という手間のかかるステップを採用しなくても、細胞ファイバを破壊または切断してエクソソームを回収することによって、十分に多くのエクソソームを回収し得る。
　上述したように、実施形態および実施例を通じて本発明の内容を開示したが、この開示の一部をなす論述および図面は、本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替の実施形態、実施例および運用技術が明らかとなる。したがって、本発明の技術的範囲は、上述の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
　本発明はエクソソームの製造方法に関するため、本発明には産業上の利用可能性がある。
　１０…細胞ファイバ、１２…細胞、１４…ハイドロゲル、Ｒ１…細胞ファイバの直径（外径）、Ｒ２…ハイドロゲルの内径

Claims (3)

  1. 　中空ファイバ状のハイドロゲル、および前記ハイドロゲルの内腔に内包された細胞を含む細胞ファイバを用いて前記細胞を培養する工程と、
    　前記細胞が放出したエクソソームを回収する工程とを含む、
    　エクソソームの製造方法。
  2. 　前記エクソソームを回収する工程では、少なくとも前記ハイドロゲルの内腔に蓄積したエクソソームを回収する、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
  3. 　前記エクソソームを回収する工程では、前記中空ファイバ状の前記ハイドロゲルを物理的に破壊または切断したうえで前記エクソソームを回収する、請求項１に記載のエクソソームの製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2016077229A (ja) * 2014-10-17 2016-05-16 国立大学法人 東京大学 ファイバ状基材、３次元細胞構造体及びその製造方法、並びに３次元細胞構造体の培養方法

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