DE102018115360A1

DE102018115360A1 - Verfahren und zusammensetzungen zum ablösen adhärenter zellen

Info

Publication number: DE102018115360A1
Application number: DE102018115360.0A
Authority: DE
Inventors: Lior Raviv
Original assignee: Pluristem Ltd
Current assignee: PLURI BIOTECH LTD, IL
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2019-01-03
Also published as: US20190002821A1; IL260253A

Abstract

[0105] Diese Offenbarung betrifft Verfahren und Systeme zum Ernten von Zellen.

Description

Gebiet der Technologie
Die vorliegende Offenbarung betrifft Systeme und Verfahren zum Ernten von Zellen.
Allgemeiner Stand der Technik
Manche Zellen wachsen gut in Suspension, während andere oberflächenadhärent sein müssen, um wachsen und sich teilen zu können. Letzterer Typ wurde klassisch in einlagigen Zellschichten (Monolayern) auf Glas- oder Kunststoffflächen (2D-Matrizes), in Gewebekulturschalen, in Platten mit mehreren Vertiefungen oder in ähnlichen Vorrichtungen gezüchtet (expandiert).
In jüngerer Zeit wurden adhärente Zellen auf dreidimensionalen (3D) Trägern und Matrizes expandiert. Solche Matrizes können poröse Träger, nichtgewebte und gewebte faserige Träger sowie schwammartige Materialien einschließen, die in ein gepacktes Bett im Inneren eines Bioreaktors platziert werden können. Solche Träger werden häufig zur Herstellung und Sammlung sezernierter Proteine verwendet, wobei die Zellen an der Matrix gebunden bleiben, weniger zur Kultur von Zellen, die letztendlich entfernt und als Therapeutika verwendet werden. Beispiele solcher Träger sind Fibra-Cel®-Scheiben (New-Brunswick).
Adhärente Zellen, die auf 2D-Matrizes wachsen, werden normalerweise durch enzymatische Behandlung (z. B. mit Trypsin), gefolgt von sanfter Agitation mit einer Pipette oder einer ähnlichen Vorrichtung zum Passagieren, entfernt. Bei Zellen, die an faserige 3D-Matrizes gebunden sind, sind solche Verfahren aber ineffektiv, da die Zellen in einem solchen Fall fester anhaften. Durch die Tatsache, dass robuste physikalische Agitation die Lebensfähigkeit von Zellen, die von der Matrix entfernt werden, und/oder ihre nachgeordnete Nutzbarkeit, insbesondere in der Gegenwart von oder kurz nach dem Kontakt mit Proteasen, beeinträchtigen kann, wird das Problem weiter kompliziert. WO/2012/140519 an Barak Zohar et al. beschreibt bestimmte Lösungen; viele der Lösungen in der Technik können jedoch maßstäblich nicht auf größere Bioreaktoren übertragen werden oder leiden an anderen Problemen, beispielsweise Schaumbildung, uneinheitlicher Ernteeffizienz und/oder Lebensfähigkeit von Zellen in der resultierenden Suspension.
Bei der Ernte von gerillten, starren 3D-Trägern, z. B. von Trägern, die mehrere von außen nach innen verlaufende 2D-Flächen enthalten, z. B. solchen, die in WO/2014/037862 an Eytan Abraham et al. beschrieben sind, tritt ein anderes Problem auf. Das starre Äußere schirmt die Zellen von auf die Träger einwirkenden Scherkräften ab, was eine andere Größenordnung und Dynamik von Kräften erforderlich macht, um die Zellen abzulösen und gleichzeitig ihre Lebensfähigkeit zu erhalten. Darüber hinaus müssen die Zellen aus den Innenräumen dieser Träger gespült werden, um effizient in eine pharmazeutische Suspension gesammelt zu werden.
KURZDARSTELLUNG DER OFFENBARUNG
Erscheinungsformen der Offenbarung betreffen Systeme und Verfahren, die ein effizienteres Ernten von Zellen von 3D-Trägern ermöglichen.
In manchen Ausführungsformen wird ein Verfahren zum Ablösen adhärenter Zellen von faserigen, dreidimensionalen (3D) Trägern bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubieren der adhärenten Zellen mit einem Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbricht; und (b) Unterziehen der 3D-Träger einer Drehbewegung, während die 3D-Träger in eine wässrige Lösung eingetaucht sind. In bestimmten Ausführungsformen sind die 3D-Träger in einer Bioreaktorkammer angeordnet. Der Fachmann wird erkennen, dass faserige Träger typischerweise eine flexible Struktur aufweisen.
Hierin wird auch ein Verfahren zum Ablösen adhärenter Zellen von gerillten, starren 3D-Trägern bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubieren der adhärenten Zellen mit einem Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbricht; und (b) Unterziehen der 3D-Träger einer Drehbewegung, während die 3D-Träger in eine wässrige Lösung eingetaucht sind. Die PCT-Veröffentlichung Nummer WO/2014/037862 von Eytan Abraham et al. beschreibt einige Ausführungsformen von starren Trägern. Diese Träger können mehrere 2D-Flächen umfassen, wobei diese mehreren 2D-Flächen konfiguriert sind, um ein Monolayer-Wachstum eukaryotischer Zellen auf mindestens einen Großteil der 2D-Flächen zu unterstützen.
In der folgenden detaillierten Beschreibung sind zusätzliche Ausführungsformen, die mit den Prinzipien der Offenbarung übereinstimmen, dargelegt oder können durch die Durchführung von Verfahren oder die Verwendung von hierin offenbarten Systemen oder Herstellungsartikeln erlernt werden. Es versteht sich, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur beispielhaft und erklärend sind und die beanspruchte Offenbarung nicht beschränken. Außerdem versteht es sich, dass andere Ausführungsformen verwendet werden können und dass elektrische, logische und strukturelle Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Offenbarung abzuweichen.
Figurenliste
Die beigefügten Zeichnungen, die in die vorliegende Beschreibung aufgenommen sind und einen Teil davon bilden, veranschaulichen mehrere Ausführungsformen der Offenbarung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Offenbarung zu erläutern. In den Zeichnungen ist Folgendes dargestellt:

1A ist eine perspektivische Ansicht eines Trägers (bzw. „3D-Körpers“) gemäß einer beispielhaften Ausführungsform. B ist eine perspektivische Ansicht eines Trägers gemäß einer anderen beispielhaften Ausführungsform. C ist eine Querschnittsansicht eines Trägers gemäß einer beispielhaften Ausführungsform.
2 ist eine perspektivische Ansicht eines Systems zum Züchten und Ernten von Zellen gemäß einer beispielhaften Ausführungsform.
3A ist eine perspektivische Ansicht eines Systems in einer offenen Konfiguration gemäß einer beispielhaften Ausführungsform. B ist eine perspektivische Ansicht eines Impellers gemäß einer beispielhaften Ausführungsform.
4 ist eine perspektivische Ansicht eines Systems zum Züchten und Ernten von Zellen in einer geöffneten Position gemäß einer anderen beispielhaften Ausführungsform.
5A ist eine perspektivische Ansicht eines Systems zum Züchten und Ernten von Zellen in einer geöffneten Position gemäß einer anderen beispielhaften Ausführungsform. B ist eine perspektivische Anssicht eines rotierenden Zylinders des Systems von 5A gemäß einer beispielhaften Ausführungsform.
6 ist ein Diagramm eines Bioreaktors, der verwendet werden kann, um adhärente Zellen zu expandieren.

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wird nun im Detail auf die vorliegenden Ausführungsformen der Offenbarung Bezug genommen, von denen Beispiele in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht sind.
In dieser Anmeldung schließt die Verwendung des Singulars den Plural ein, sofern nichts anderes konkret angegeben ist. Ferner bedeutet die Verwendung von „oder“ in dieser Anmeldung „und/oder“, sofern nicht anderes angegeben ist. Darüber hinaus sind die Verwendung des Begriffs „einschließlich“ sowie anderer Formen wie „schließt ein“ und „eingeschlossen“ nicht einschränkend. Jeder hierin beschriebene Bereich ist so zu verstehen, dass er die Endpunkte und alle Werte zwischen den Endpunkten einschließt.
Bestimmte Ausführungsformen der Systeme und Vorrichtungen der vorliegenden Offenbarung sind zum Ernten von Zellen konfiguriert. Bestimmte Ausführungsformen dieser Behältnisse sind konfiguriert, um mit Trägern verschiedener Form und Größe zu funktionieren, einschließlich aber nicht beschränkt auf sphärische, zylindrische, kubische, hyperrechteckige, ellipsoide und polyedrische Formen mit einer Vielzahl von Größen, wie hierin spezifiziert. In manchen Ausführungsformen ermöglichen diese Träger das Wachstum (die Proliferation) von eukaryotischen Zellen. Die Bezugnahme hierin auf „Wachstum“ von Zellen ist gleichbedeutend mit der Expansion einer Zellpopulation.
Der Begriff „zweidimensionale Kultur“ bezieht sich auf eine Kultur, in der die Zellen Bedingungen ausgesetzt sind, die mit einem Zellwachstum kompatibel sind und zulassen, dass die Zellen in einem Monolayer wachsen, die als „zweidimensionale Kulturvorrichtung“ bezeichnet wird. Solche Vorrichtungen weisen typischerweise flache Wachstumsflächen auf, die in manchen Ausführungsformen ein adhärentes Material umfassen, das flach oder gekrümmt sein kann. Nicht einschränkende Beispiele für Vorrichtungen für die 2D-Kultur sind Zellkulturschalen und -platten. Diese Definition schließt mehrlagige Tabletts, wie beispielsweise die von Nunc™ hergestellte Cell Factory™, ein, vorausgesetzt, dass jede Schicht eine Monolayerkultur unterstützt. Es versteht sich, dass selbst in 2D-Vorrichtungen Zellen übereinander wachsen können, wenn zugelassen wird, dass sie überkonfluent werden. Dies hat keine Auswirkungen auf die Klassifizierung der Vorrichtung als „zweidimensional“.
Der Begriff „dreidimensionale Kultur“ und „3D-Kultur“ bezieht sich auf eine Kultur, in der die Zellen Bedingungen ausgesetzt sind, die mit einem Zellwachstum kompatibel sind und es den Zellen erlauben, relativ zueinander in 3D-Ausrichtung zu wachsen. Der Begriff „dreidimensionale [bzw. 3D-]Kulturvorrichtung“ bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen unter Bedingungen, die mit einem Zellwachstum kompatibel sind und es den Zellen erlauben, relativ zueinander in 3D-Ausrichtung zu wachsen. Solche Vorrichtungen haben typischerweise eine 3D-Wachstumsfläche (Substrat), das bei manchen Ausführungsformen ein adhärentes Material umfasst, das in der 3D-Kulturvorrichtung, z. B. dem Bioreaktor, vorhanden ist. Bestimmte, nicht einschränkende Ausführungsformen von 3D-Kultivierungsbedingungen, die zur Expansion von adhärenten Stromazellen geeignet sind, sind in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnr. WO/2007/108003 an Ora Burger et al. beschrieben, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit vollständig eingeschlossen ist. Typischerweise wachsen Zellen, die auf einem 3D-Substrat wachsen, außerhalb der Grenzen eines Monolayers. Träger, die eine 3D-Kultur ermöglichen, werden hierin als 3D-Träger bezeichnet.
In manchen Ausführungsformen wird ein Verfahren zum Ablösen adhärenter Zellen von faserigen, dreidimensionalen (3D) Trägern bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubieren der adhärenten Zellen mit einem Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbricht; und (b) Unterziehen der 3D-Träger einer Drehbewegung, während die 3D-Träger in eine wässrige Lösung eingetaucht sind. In bestimmten Ausführungsformen sind die 3D-Träger in einer Bioreaktorkammer angeordnet. Der Fachmann wird erkennen, dass faserige Träger typischerweise eine flexible Struktur aufweisen.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die 3D-Träger ein adhärentes Material. In manchen Ausführungsformen ist das adhärente Material faserig, was in spezifischeren Ausführungsformen eine gewebte faserige Matrix, eine nichtgewebte faserige Matrix oder beides sein kann. In noch weiteren Ausführungsformen weist das Material eine chemische Struktur auf, zum Beispiel geladene Oberflächengruppen, welche eine Zelladhäsion ermöglicht, z. B. Polyester, Polypropylene, Polyalkylene, Polyfluorchlorethylene, Polyvinylchloride, Polystyrole, Polysulfone, Celluloseacetate und Poly-L-Milchsäuren. In spezielleren Ausführungsformen kann das Material aus einem Polyester und einem Polypropylen ausgewählt sein. Der Fachmann wird erkennen, dass faserige Matrizen typischerweise porös sind.
Alternativ oder zusätzlich umfassen die 3D-Träger ein faseriges Material, wahlweise ein adhärentes faseriges Material, das in spezifischeren Ausführungsformen eine gewebte faserige Matrix, eine nichtgewebte faserige Matrix oder beides sein kann. Nicht einschränkende Beispiele für faserige Träger sind Fibracel®-Träger von New Brunswick Scientific, die im Handel von Eppendorf Inc., Enfield, CT, USA, erhältlich und aus Polyester und Polypropylen hergestellt sind; und BioNOC-II-Träger, die im Handel von CESCO BioProducts (Atlanta, GA, USA) erhältlich und aus PET (Polyethylenterephthalat) hergestellt sind. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die genannte faserige Matrix einen Polyester, ein Polypropylen, ein Polyalkylen, ein Polyfluorchlorethylen, ein Polyvinylchlorid, ein Polystyrol oder ein Polysulfon. In spezielleren Ausführungsformen ist die faserige Matrix aus einem Polyester und einem Polypropylen ausgewählt.
In bestimmten Ausführungsformen bezieht sich „ein adhärentes Material“ auf ein Material, das synthetisch ist oder in anderen Ausführungsformen natürlich vorkommt, oder in anderen Ausführungsformen eine Kombination davon. In bestimmten Ausführungsformen ist das Material nicht zytotoxisch (oder ist in anderen Ausführungsformen biologisch kompatibel). Alternativ oder zusätzlich ist das Material faserig, was in spezifischeren Ausführungsformen eine gewebte faserige Matrix, eine nichtgewebte faserige Matrix oder jegliche Art von faseriger Matrix sein kann. In weiteren Ausführungsformen weist das Material eine chemische Struktur wie geladene oberflächenexponierte Gruppen auf, was eine Zelladhäsion ermöglicht. Nicht einschränkende Beispiele von adhärenten Materialien, die in Übereinstimmung mit dieser Erscheinungsform verwendet werden können, schließen einen Polyester, ein Polypropylen, ein Polyalkylen, ein Polyfluorchlorethylen, ein Polyvinylchlorid, ein Polystyrol, ein Polysulfon, ein Celluloseacetat, eine Glasfaser, einen Keramikpartikel, eine Poly-L-Milchsäure und eine inerte Metallfaser ein. Andere Ausführungsformen umfassen Matrigel™, eine extrazelluläre Matrixkomponente (z. B. Fibronectin, Chondronectin, Laminin) und ein Kollagen. In spezielleren Ausführungsformen kann das Material aus einem Polyester und einem Polypropylen ausgewählt sein. Nicht einschränkende Beispiele für synthetische adhärente Materialien umfassen Polyester, Polypropylene, Polyalkylene, Polyfluorchlorethylene, Polyvinylchloride, Polystyrole, Polysulfone, Celluloseacetate und Poly-L-Milchsäuren, Glasfasern, Keramikteilchen und eine inerte Metallfaser, oder, in spezifischere Ausführungsformen, Polyester, Polypropylene, Polyalkylene, Polyfluorchlorethylene, Polyvinylchloride, Polystyrole, Polysulfone, Celluloseacetate und Poly-L-Milchsäuren.
In bestimmten Ausführungsformen sind die 3D-Träger und die wässrige Lösung in einer Kammer angeordnet, und die Drehbewegung wird durch hervorstehende Objekte vermittelt, die von einer zentralen Achse der Kammer aus radial vorspringen. In spezifischeren Ausführungsformen ist die beschriebene Kammer zylindrisch. In anderen Ausführungsformen ist die beschriebene Kammer eine Variante einer zylindrischen Form, z. B. ein unregelmäßiger Zylinder, dessen Querschnittsfläche entlang der Achse des Zylinders nicht konstant ist. In anderen Ausführungsformen ist der Zylinder ein elliptischer Zylinder, ein parabolischer Zylinder oder ein hyperbolischer Zylinder, die sich jeweils auf einen Zylinder beziehen, dessen Querschnitt eine Ellipse, Parabel oder Hyperbel ist. In weiteren Ausführungsformen ist der Zylinder ein schräger Zylinder, d. h. ein Zylinder, dessen zwei kreisförmige Endflächen parallel zueinander sind, aber anders als der rechte kreisförmige Zylinder, bei dem die Seitenfläche (die gekrümmte Fläche) nicht senkrecht zu den Endflächen ist. Die beschriebenen hervorstehenden Objekte erstrecken sich in manchen Ausführungsformen radial von einem axialen Element aus, das konfiguriert ist, um sich zu drehen, und das an der zentralen Achse des Zylinders oder einer Variante davon ausgerichtet ist. In bestimmten Ausführungsformen ist das axiale Element selbst zylindrisch oder eine Variante davon, wobei es relativ zum Durchmesser der Kammer einen kleinen Durchmesser aufweist. „Axial“ bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine Linie, welche die Zentren der Grundflächen eines Zylinders oder einer ähnlichen Form verbindet.
Die beschriebenen hervorstehenden Objekte sind in bestimmten Ausführungsformen speichenartige Vorsprünge. In anderen Ausführungsformen können die hervorstehenden Objekte stabförmig sein. Alternativ oder zusätzlich können sich 10 bis 50, 10 bis 40, 10 bis 30, 15 bis 50, 15 bis 40, 15 bis 30, 15 bis 25, 17 bis 23, 20 bis 30 oder 22 bis 28 Speichen radial von einer zentralen Achse aus erstrecken. In weiteren Ausführungsformen können die hervorstehenden Objekte und das axiale Element zusammen eine Helixkonformation aufweisen.
In weiteren Ausführungsformen beträgt die Länge der hervorstehenden Objekte (senkrecht zur Kammerachse) 50 bis 90 %, 50 bis 95 %, 50 bis 80 %, 40 bis 95 %, 40 bis 90 %, 40 bis 80 %, 40 bis 70 % oder 50 bis 70 % des inneren Querschnittsradius der Kammer, wobei sich das Maß von der äußeren Fläche des axialen Elements zu der inneren Fläche der Kammerwand erstreckt. Somit erstrecken sich die hervorstehenden Objekte um den angegebenen Prozentsatz des Abstands von der äußeren Fläche des axialen Elements zu der inneren Fläche der Kammerwand.
Alternativ oder zusätzlich beträgt der Radius der hervorstehenden Objekte (parallel zur Kammerachse) 0,5 bis 5 %, 0,5 bis 4 %, 0,5 bis 3 %, 0,5 bis 2 %, 0,5 bis 1,5 %, 0,4 bis 5 %, 0,4 bis 4 %, 0,4 bis 3 %, 0,4 bis 2 %, 0,4 bis 1,5 %, 0,3 bis 5 %, 0,3 bis 4 %, 0,3 bis 3 %, 0,3 bis 2 % oder 0,3 bis 1,5 % der Kammerachse.
In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte in einer kontinuierlichen Drehbewegung gedreht. In spezifischeren Ausführungsformen liegt die Drehbewegung zwischen 100 und 400 Umdrehungen pro Minute (U/min); in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 350 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 50 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 60 und 250 U/min in anderen Ausführungsformen zwischen 80 und 250 U/min; oder in anderen Ausführungsformen zwischen 150 und 250 U/min. Alternativ oder zusätzlich werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten gedreht.
In weiteren Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte in oszillierender Weise einer Rotationskraft (relativ zu einer zentralen Achse der Kammer) ausgesetzt. In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten in einer oszillierenden Drehbewegung gedreht. Alternativ oder zusätzlich kann die Frequenz der Oszillation einmal pro 1 bis 10 Sekunden; 1 bis 15 Sekunden; 1 bis 20 Sekunden; 1 bis 30 Sekunden; 1 bis 45 Sekunden; 1 bis 60 Sekunden; 2 bis 10 Sekunden; 2 bis 15 Sekunden; 2 bis 20 Sekunden; 2 bis 30 Sekunden; 2 bis 45 Sekunden; 2 bis 60 Sekunden; 3 bis 10 Sekunden; 3 bis 15 Sekunden; 3 bis 20 Sekunden; 3 bis 30 Sekunden; 3 bis 45 Sekunden; 3 bis 60 Sekunden; 5 bis 10 Sekunden; 5 bis 15 Sekunden; 5 bis 20 Sekunden; 5 bis 30 Sekunden; 5 bis 45 Sekunden; 5 bis 60 Sekunden; 10 bis 20 Sekunden; 10 bis 30 Sekunden; 10 bis 45 Sekunden; oder 10 bis 60 Sekunden betragen.
Die maximale Winkelgeschwindigkeit der beschriebenen Drehbewegung (bei der es sich in manchen Ausführungsformen um eine kontinuierliche Drehbewegung oder in anderen Ausführungsformen um eine oszillierende Drehbewegung handelt) beträgt in bestimmten Ausführungsformen 3 bis 30, 3 bis 25, 3 bis 20, 3 bis 15, 3 bis 10, 4 bis 30, 4 bis 25, 4 bis 20, 4 bis 15, 4 bis 10, 5 bis 30, 5 bis 25, 5 bis 20, 5 bis 15, 5 bis 10, 6 bis 30, 6 bis 25, 6 bis 20, 6 bis 15, 6 bis 10, 8 bis 30, 8 bis 25, 8 bis 20, 8 bis 15 oder 8 bis 10 U/min.
Jede der vorstehend genannten Ausführungsformen der Anzahl, Geometrie und Anordnung der hervorstehenden Objekte; und die Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der oszillierenden Bewegung) der Drehbewegung kann frei kombiniert werden.
In anderen Ausführungsformen sind die faserigen 3D-Träger in einem mittleren Bereich 42 (der alternativ in der Technik als „Korb“ bezeichnet werden kann) gepackt (siehe nachstehende Beschreibung), und die Drehbewegung erfolgt durch die Drehung des Korbs und kann in verschiedenen Ausführungsformen eine kontinuierliche Drehung oder eine oszillierende Drehung sein. In manchen Ausführungsformen umfasst der Korb poröse Wände oder ist durch poröse Wände begrenzt, die eine radiale Begrenzung des Korbs definieren, die sich innerhalb der radialen Begrenzung des Korbs befindet. In bestimmten Ausführungsformen sind die porösen Wände ausreichend porös, um einen freien Austausch der wässrigen Lösung zwischen den Bereichen innerhalb und außerhalb des Korbs zu ermöglichen. Alternativ oder zusätzlich ist der Korb durch obere und untere Strukturen begrenzt (siehe z. B. Komponente 35 und die untere Komponente 110 in der Beschreibung von 2 und 3A nachstehend), die in manchen Ausführungsformen unabhängig porös sein können. In bestimmten Ausführungsformen sind die 3D-Träger ausreichend dicht gepackt, so dass sich ihre Massenschwerpunkte während der beschriebenen Drehung des Korbes relativ zu den Korbwänden im Wesentlichen nicht bewegen. Typischerweise enthält der Korb auch die wässrige Lösung. In spezifischeren Ausführungsformen kann der Korb innerhalb eines äußeren Behälters angeordnet sein, während sich die wässrige Lösung in dem Korb und dem äußeren Behälter befindet, und der Korb wird relativ zu dem äußeren Behälter gedreht. Andere Ausführungsformen der hierin beschriebenen Körbe sind nur durch obere und untere Strukturen und nicht durch Wände begrenzt.
In manchen Ausführungsformen wird der Korb in einer kontinuierlichen Drehbewegung gedreht. In spezifischeren Ausführungsformen liegt die Drehbewegung zwischen 100 und 400 Umdrehungen pro Minute (U/min); in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 350 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 50 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 60 und 250 U/min in anderen Ausführungsformen zwischen 80 und 250 U/min; oder in anderen Ausführungsformen zwischen 150 und 250 U/min. Alternativ oder zusätzlich werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten gedreht.
In weiteren Ausführungsformen wird der Korb in einer oszillierenden Drehbewegung gedreht. In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten in oszillierender Weise einer Rotationskraft (relativ zu einer zentralen Achse der Kammer) ausgesetzt. Alternativ oder zusätzlich kann die Frequenz der Oszillation einmal pro 1 bis 10 Sekunden; 1 bis 15 Sekunden; 1 bis 20 Sekunden; 1 bis 30 Sekunden; 1 bis 45 Sekunden; 1 bis 60 Sekunden; 2 bis 10 Sekunden; 2 bis 15 Sekunden; 2 bis 20 Sekunden; 2 bis 30 Sekunden; 2 bis 45 Sekunden; 2 bis 60 Sekunden; 3 bis 10 Sekunden; 3 bis 15 Sekunden; 3 bis 20 Sekunden; 3 bis 30 Sekunden; 3 bis 45 Sekunden; 3 bis 60 Sekunden; 5 bis 10 Sekunden; 5 bis 15 Sekunden; 5 bis 20 Sekunden; 5 bis 30 Sekunden; 5 bis 45 Sekunden; 5 bis 60 Sekunden; 10 bis 20 Sekunden; 10 bis 30 Sekunden; 10 bis 45 Sekunden; oder 10 bis 60 Sekunden betragen.
Die maximale Winkelgeschwindigkeit der beschriebenen Drehbewegung (bei der es sich in manchen Ausführungsformen um eine kontinuierliche Drehbewegung oder in anderen Ausführungsformen um eine oszillierende Drehbewegung handelt) beträgt in bestimmten Ausführungsformen 3 bis 30, 3 bis 25, 3 bis 20, 3 bis 15, 3 bis 10, 4 bis 30, 4 bis 25, 4 bis 20, 4 bis 15, 4 bis 10, 5 bis 30, 5 bis 25, 5 bis 20, 5 bis 15, 5 bis 10, 6 bis 30, 6 bis 25, 6 bis 20, 6 bis 15, 6 bis 10, 8 bis 30, 8 bis 25, 8 bis 20, 8 bis 15 oder 8 bis 10 (U/min).
Jede der vorstehend genannten Ausführungsformen von Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der oszillierenden Bewegung) der Drehbewegung kann frei kombiniert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird das beschriebene Mittel entfernt, bevor die 3D-Träger einer Drehbewegung ausgesetzt werden. Dies kann in verschiedenen Ausführungsformen erreicht werden, indem eine wässrige Lösung, die das Mittel enthält, entfernt und durch eine Lösung ersetzt wird, der das Mittel fehlt. In weiteren Ausführungsformen werden die Träger mit einer Waschlösung inkubiert, die anschließend durch eine andere Lösung ersetzt wird, der das Mittel fehlt, was in der Technik als „Waschschritt“ bekannt ist.
In anderen Ausführungsformen ist das Mittel während des Schritts des Aussetzens des 3D-Trägers einer Drehbewegung vorhanden. In weiteren Ausführungsformen werden die 3D-Träger in Gegenwart des Mittels einer Drehbewegung ausgesetzt, dann wird das Mittel entfernt, und die 3D-Träger werden einer zusätzlichen Drehbewegung in Abwesenheit des Mittels ausgesetzt. Die beiden Drehbewegungen in dieser Ausführungsform können unabhängig jede der vorstehend genannten Ausführungsformen von Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der Oszillationsbewegung) aufweisen, die frei kombinierbar sind.
Hierin wird auch ein Verfahren zum Ablösen adhärenter Zellen von gerillten, starren 3D-Trägern bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubieren der adhärenten Zellen mit einem Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbricht; und (b) Unterziehen der 3D-Träger einer Drehbewegung, während die 3D-Träger in eine wässrige Lösung eingetaucht sind. Die PCT mit der Veröffentlichungsnummer WO/2014/037862 an Eytan Abraham et al., veröffentlicht am 13. März 2014, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird, beschreibt einige Ausführungsformen von starren Trägern. Diese Träger umfassen mehrere 2D-Flächen, wobei die mehreren 2D-Flächen konfiguriert sind, um ein Monolayer-Wachstum eukaryotischer Zellen auf mindestens einen Großteil der 2D-Flächen zu unterstützen.
Mit Bezug auf die 1A-B, und wie in der am 13. März 2014 veröffentlichten WO/2014/037862 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist, werden die gerillten Träger 30 in manchen Ausführungsformen für die Proliferation und/oder Inkubation von ASC verwendet. In verschiedenen Ausführungsformen können die Träger nach einer 2D-Inkubation (z. B. auf Kulturplatten oder -schalen) oder ohne vorherige 2D-Inkubation verwendet werden.
Unter Bezugnahme auf 1A können die Träger 30 mehrere zweidimensionale (2D-) Flächen 12 einschließen, die sich von einem Äußeren des Trägers 30 zu einem Inneren des Trägers 30 erstrecken. Wie gezeigt ist, werden die Flächen durch eine Gruppe von Rippen 14 gebildet, die voneinander beabstandet sind, um Öffnungen 16 zu bilden, die von der Größe her so angelegt sind, dass sie den Fluss von Zellen und Kulturmedium (nicht gezeigt) während der Verwendung ermöglichen. Unter Bezugnahme auf 1C kann ein Träger 30 auch mehrere 2D-Flächen 12 einschließen, die sich von einer zentralen Trägerachse 18 des Trägers 30 erstrecken und sich im Allgemeinen senkrecht zu Rippen 14 erstrecken, die beabstandet sind, um Öffnungen 16 zu bilden, wodurch mehrere 2D-Flächen 12 erzeugt werden. In anderen Ausführungsformen haben die Öffnungen 16 eine Querschnittsform, die im Wesentlichen ein Halbkreisbogen ist (siehe 1A). In weiteren Ausführungsformen ist die zentrale Trägerachse 18 eine Ebene 25, welche die Kugel halbiert, und von der Oberfläche des Trägers erstrecken sich Öffnungen 16 zur proximalen Fläche der Ebene. In weiteren Ausführungsformen erstrecken sich die Öffnungen 16 von der Oberfläche 20 des Trägers 30 zu der proximalen Fläche der Ebene und haben eine Querschnittsform, die im Wesentlichen ein Halbkreisbogen ist. In weiteren Ausführungsformen ist der Träger 30 im Wesentlichen kugelförmig und hat einen größten Durchmesser von 4 bis 10 Millimeter (mm) oder zwischen 4 und 9 mm, zwischen 4,5 und 8,5 mm, zwischen 5 und 8 mm, zwischen 5,5 und 7,5 mm, zwischen 6 und 7 mm, zwischen 6,1 und 6,9 mm, zwischen 6,2 und 6,8 mm, zwischen 6,3 und 6,7 mm, zwischen 6,4 und 6,6 mm oder im Wesentlichen von 6,5 mm. In bestimmten Ausführungsformen des vorstehend genannten Trägers sind die Rippen 14 im Wesentlichen flach und erstrecken sich parallel zueinander. In konkreteren Ausführungsformen befinden sich 3 bis 7, 4 bis 6 oder 5 parallele Rippen (wobei die äußersten äußeren Rippen 19 nicht mitgezählt sind), die 6 Öffnungen 16 bilden, auf jeder Seite der Ebene 25. Alternativ oder zusätzlich kann die Breite 15 der Rippen 14 und die Breite 17 der Öffnungen 16 derart sein, dass das Verhältnis der Rippenbreite 15 geteilt durch (Rippenbreite 15 + Öffnungsbreite 17) zwischen 0,4 und 0,8, zwischen 0,45 und 0,75, zwischen 0,5 und 0,7, zwischen 0,5 und 0,8, zwischen 0,5 und 0,75, zwischen 0,55 und 0,65, zwischen 0,58 und 0,62 oder im Wesentlichen 0,6 beträgt.
In anderen Ausführungsformen sind die Träger 30 „3D-Körper“, wie in WO/2014/037862 beschrieben; deren Inhalte in Bezug auf 3D-Körper sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Wie erwähnt, kann der Träger 30 unterschiedliche Formen aufweisen, einschließlich kugelförmiger, zylindrischer, kubischer, hyperrechteckiger, ellipsoider, polyedrischer und/oder unregelmäßiger polyedrischer Formen, ist aber nicht darauf beschränkt. In manchen Ausführungsformen kann der Durchmesser der kleinsten begrenzenden Kugel (z. B. der Durchmesser des Trägers im Falle einer Kugelform) des Trägers 30 im Bereich von 1 bis 50 mm liegen. In anderen Ausführungsformen kann die äußerste größte Abmessung im Bereich von 2 bis 20 mm, von 3 bis 15 mm oder von 4 bis 10 mm liegen. In anderen Ausführungsformen liegt die allgemeine Sehnenlänge der Träger 30 im Bereich von 0,5 bis 25 mm, von 1 bis 10 mm, von 1,5 bis 7,5 mm, von 2 bis 5 mm oder von 2,5 bis 4 mm. Wie dem Fachmann bekannt ist, wird die allgemeine Sehnenlänge unter anderem in Li et al., Determination of non-spherical particle size distribution from chord length measurements. Part 1: Theoretical analysis. Chemical Engineering Science 60(12): 3251-3265, 2005) beschrieben.
Abhängig von der Gesamtgröße des Trägers 30 können die Rippen 14 und die Öffnungen 16 verschieden bemessen sein. Zum Beispiel können die Rippen 14 eine Dicke von 0,1 bis 2 mm oder von 0,2 bis 1 mm aufweisen. Insbesondere können die Rippen 14 0,4 bis 0,6 mm, 0,5 bis 0,7 mm oder 0,6 bis 0,8 mm dick sein. Die Öffnungen 16 können eine Breite von 0,01 bis 1 mm oder von 0,1 bis 0,5 mm aufweisen. Insbesondere können die Öffnungen 16 0,25 bis 0,35 mm, 0,35 bis 0,45 mm oder 0,45 bis 0,55 mm breit sein.
In bevorzugten Ausführungsformen stellen die Träger 2D-Flächen für die Bindung und Monolayer-Wachstum über mindestens einen Großteil oder den gesamten Flächenbereich der mehreren 2D-Flächen 12, 22 bereit. Alternativ oder zusätzlich weisen die Träger ein Verhältnis von Fläche zu Volumen zwischen 3 und 1000 cm²/cm³, zwischen 3 und 500 cm²/cm³, zwischen 3 und 300 cm²/cm³, zwischen 3 und 200 cm²/cm³, zwischen 3 und 100 cm²/cm³, zwischen 3 und 50 cm²/cm³, zwischen 3 und 30 cm²/cm³, zwischen 5 und 20 cm²/cm³ oder zwischen 10 und 15 cm²/cm³ auf.
Wie in den 1A-B gezeigt ist, können die Träger 30 in verschiedenen Ausführungsformen, im Wesentlichen kugelförmig sein und einen Durchmesser aufweisen, der die größte Abmessung der Träger bildet. In manchen Ausführungsformen kann ein Durchmesser des Trägers 30 im Bereich von 1 bis 50 mm liegen. In anderen Ausführungsformen kann der Durchmesser im Bereich von 2 bis 20 mm, 3 bis 15 mm oder 4 bis 10 mm liegen. Unter Bezugnahme auf 1B können die Rippen 24 und die Öffnungen 26 in Abhängigkeit von der Gesamtgröße des Trägers 30 verschieden bemessen sein. Zum Beispiel können die Rippen 24 eine Dicke im Bereich von 0,1 bis 2 mm oder von 0,2 bis 1 mm aufweisen. Insbesondere können die Rippen 24 0,45 bis 0,55 mm, 0,55 bis 0,65 mm oder 0,65 bis 0,75 mm dick sein. In manchen Ausführungsformen kann eine kleinste Breite der Öffnungen 26 im Bereich von 0,01 bis 1 mm, von 0,05 bis 0,8 mm oder von 0,1 bis 0,5 mm liegen. Insbesondere kann die kleinste Breite der Öffnungen 26 0,25 bis 0,35 mm, 0,35 bis 0,45 mm oder 0,45 bis 0,55 mm betragen. In anderen Ausführungsformen kann die größte Querschnittsabmessung der Öffnung 26 im Bereich von 0,1 bis 5 mm, von 0,2 bis 3 mm oder von 0,5 bis 2 mm liegen. Insbesondere kann die Öffnung 26 eine größte Querschnittsabmessung von 0,75 bis 0,85 mm, 0,95 bis 1,05 mm oder 1,15 bis 0,25 mm aufweisen. Ferner umfasst der Träger 30 eine Öffnung 36, die sich durch das Zentrum des Trägers erstreckt und zusätzliche Flächen 32 bildet, die das Monolayer-Wachstum von eukaryotischen Zellen unterstützen können.
In der in 1A gezeigten Ausführungsform sind die Rippen 14 im Wesentlichen flach und erstrecken sich parallel zueinander. In anderen Ausführungsformen haben die Rippen andere Konfigurationen. Zum Beispiel zeigt 1B einen Träger 30 mit mehreren zweidimensionalen Flächen 22, die durch Rippen 24 in einer anderen Konfiguration gebildet sind. Insbesondere sind die Rippen 24 geformt, um Öffnungen 26 bilden, die um den Umfang des Trägers 30 herum beabstandet sind, wobei die Öffnungen 26 allgemein keilförmig sein können. Die Rippen 24 können sich allgemein radial von einer zentralen Trägerachse 18 des Trägers 30 zu einer peripheren Fläche des Trägers 30 erstrecken. Der Träger 30 kann auch eine oder mehrere laterale Ebenen umfassen, die sich von der zentralen Trägerachse 18 des Trägers 30 erstrecken und sich allgemein senkrecht zu den Rippen 24 erstrecken, wie in 1C dargestellt ist, bei der es sich um eine Querschnittsansicht bestimmter Ausführungsform des Trägers 30 von 1A handelt.
In weiteren Ausführungsformen umfasst das Material, das die mehreren 2D-Flächen bildet, mindestens ein Polymer. In spezielleren Ausführungsformen ist das Polymer aus einem Polyamid, einem Polycarbonat, einem Polysulfon, einem Polyester, einem Polyacetal und Polyvinylchlorid ausgewählt.
Das Material, das zur Herstellung der beschriebenen Träger verwendet wird, kann in verschiedenen Ausführungsformen Metalle (z. B. Titan), Metalloxide (z. B. Titanoxidfilme), Glas, Borsilikat, Kohlenstofffasern, Keramik, biologisch abbaubare Materialien (z. B. Kollagen, Gelatine, PEG, Hydrogele) und/oder Polymere einschließen. Geeignete Polymere können Polyamide wie etwa GRILAMID® TR 55 (EMS-Grivory, Sumter, SC, USA); Polycarbonate wie etwa LEXAN® (Sabic, Pittsfield, MA, USA) und Macrolon® (Bayer); Polysulfone wie etwa RADFL® PPSU (Solvay) und UDEL® PSU (Solvay); Polyester wie etwa TRITAN® (Polyon) und PBT® HX312C; Polyacetale wie etwa CELON® (Ticana) und Polyvinylchlorid einschließen. In bestimmten Ausführungsformen bestehen die beschriebenen Träger aus einem nicht porösen Material oder, wenn Poren vorhanden sind, sind diese nicht größer als 20 Mikrometer, in anderen Ausführungsformen 10 Mikrometer, in anderen Ausführungsformen 5 Mikrometer, in anderen Ausführungsformen 3 Mikrometer, in anderen Ausführungsformen 2 Mikrometer, oder in anderen Ausführungsformen 1 Mikrometer.
In spezielleren Ausführungsformen sind Zellkulturträger durch Behandlung der spritzgegossenen Oberfläche mit LEXAN® oder GRILAMID® gebildet und weisen eine glatte Oberflächenstruktur auf, wobei Wachstumsmediumproteine und/oder Polylysin auf LEXAN®- oder GRILAMID®-Träger verwendet werden; Zellkulturträger, die aus spritzgegossenem GRILAMID® gebildet sind, weisen eine raue Oberfläche auf, die mit Wachstumsmediumproteinen vorinkubiert wurde. In anderen Ausführungsformen werden unbehandelte LEXAN®- oder GRILAMID®-Oberflächen verwendet.
In anderen Ausführungsformen kann zumindest ein Teil der Träger unter Verwendung eines Polystyrolpolymers gebildet sein. Das Polystyrol kann ferner unter Verwendung von Koronaentladung, Gasplasma (Rollflaschen und Kulturröhrchen) oder anderen ähnlichen Verfahren modifiziert sein. Diese Verfahren können hochenergetische Sauerstoffionen erzeugen, die an die Polystyrolketten an der Oberfläche binden, so dass die Oberfläche hydrophil und negativ geladen wird, wenn Medium hinzugefügt wird. Ferner kann jeder der Träger zumindest teilweise aus Materialkombinationen hergestellt sein. Materialien der Träger können ferner beschichtet oder behandelt sein, um die Zellbindung zu unterstützen. Eine solche Beschichtung und/oder Vorbehandlung kann die Verwendung von Kollagen I, Kollagen IV, Gelatine, Poly-d-Lysin, Fibronectin, Laminin, Amin und Carboxyl einschließen.
In verschiedenen Ausführungsformen sind die beschriebenen Träger mit einer oder mehreren Beschichtungen beschichtet. Geeignete Beschichtungen können in manchen Ausführungsformen ausgewählt sein, um die Zellbindung oder Parameter der Zellbiologie zu steuern. Geeignete Beschichtungen können zum Beispiel Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäure, Lipide, Polysaccharide, Glycosaminoglykane, Proteoglykane, Hormone, extrazelluläre Matrixmoleküle, Zelladhäsionsmoleküle, natürliche Polymere, Enzyme, Antikörper, Antigene, Polynukleotide, Wachstumsfaktoren, synthetische Polymere, Polylysin, Arzneistoffe und/oder andere Moleküle oder Kombinationen oder Fragmente davon einschließen.
Ferner können die Oberflächen der hierin beschriebenen Träger in verschiedenen Ausführungsformen behandelt oder in anderer Weise verändert sein, um die Zellbindung und/oder andere biologische Eigenschaften zu steuern. Optionen zur Behandlung der Oberflächen schließen chemische Behandlung, Plasmabehandlung und/oder Koronabehandlung ein. Ferner können die Materialien in verschiedenen Ausführungsformen behandelt sein, um funktionelle Gruppen in das oder auf dem Material einzuführen, einschließlich Gruppen, die Kohlenwasserstoffe, Sauerstoff und/oder Stickstoff enthalten. Zusätzlich kann das Material in verschiedenen Ausführungsformen hergestellt oder verändert worden sein, um eine Textur aufzuweisen, um das Absetzen von Zellen zu erleichtern oder andere Zelleigenschaften zu steuern. Zum Beispiel weisen die Materialien, die verwendet werden, um die Zellkulturträger herzustellen, in manchen Ausführungsformen eine Rauheit im Nanometer- oder Mikrometerbereich auf, welche das Absetzen von Zellen erleichtern und/oder andere Zelleigenschaften steuert.
In bestimmten Ausführungsformen sind die starren Träger und die wässrige Lösung in einer Kammer angeordnet, und die Drehbewegung wird durch hervorstehende Objekte vermittelt, die von einer zentralen Achse der Kammer aus radial vorspringen. In spezielleren Ausführungsformen ist die beschriebene Kammer zylindrisch oder von ähnlicher Form, z. B. ein unregelmäßiger Zylinder, dessen Querschnittsfläche entlang der Achse des Zylinders nicht konstant ist. In anderen Ausführungsformen ist der Zylinder ein elliptischer Zylinder, ein parabolischer Zylinder oder ein hyperbolischer Zylinder, d. h. ein Zylinder, dessen Querschnitt eine Ellipse, Parabel bzw. Hyperbel ist. In weiteren Ausführungsformen ist der Zylinder ein schräger Zylinder. Die beschriebenen hervorstehenden Objekte erstrecken sich in manchen Ausführungsformen radial von einem axialen Element aus, das konfiguriert ist, um sich zu drehen, und das in einer Linie mit der zentralen Achse ausgerichtet ist. In bestimmten Ausführungsformen ist das axiale Element zylindrisch oder im Wesentlichen zylindrisch, wobei es relativ zum Durchmesser der Kammer einen kleinen Durchmesser aufweist. „Axial“ bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine Linie, welche die Zentren der Grundflächen eines Zylinders oder einer ähnlichen Form verbindet.
Die beschriebenen hervorstehenden Objekte sind in bestimmten Ausführungsformen speichenartige Vorsprünge. In anderen Ausführungsformen können die hervorstehenden Objekte stabförmig sein. Alternativ oder zusätzlich können sich 10 bis 50, 10 bis 40, 10 bis 30, 15 bis 50, 15 bis 40, 15 bis 30, 15 bis 25, 17 bis 23, 20 bis 30 oder 22 bis 28 Speichen radial von einer zentralen Achse aus erstrecken. In weiteren Ausführungsformen können die hervorstehenden Objekte und das axiale Element eine Helixkonformation bilden.
In weiteren Ausführungsformen beträgt die Länge der hervorstehenden Objekte (senkrecht zur Kammerachse) 50 bis 90 %, 50 bis 95 %, 50 bis 80 %, 40 bis 95 %, 40 bis 90 %, 40 bis 80 %, 40 bis 70 % oder 50 bis 70 % des inneren Querschnittsradius der Kammer, wobei sich das Maß von der äußeren Fläche des axialen Elements zu der inneren Fläche der Kammerwand erstreckt. Somit erstrecken sich die hervorstehenden Objekte um den angegebenen Prozentsatz des Abstands von der äußeren Fläche des axialen Elements zu der inneren Fläche der Kammerwand.
Alternativ oder zusätzlich beträgt der Radius der hervorstehenden Objekte (parallel zur Kammerachse) 0,5 bis 5 %, 0,5 bis 4 %, 0,5 bis 3 %, 0,5 bis 2 %, 0,5 bis 1,5 %, 0,4 bis 5 %, 0,4 bis 4 %, 0,4 bis 3 %, 0,4 bis 2 %, 0,4 bis 1,5 %, 0,3 bis 5 %, 0,3 bis 4 %, 0,3 bis 3 %, 0,3 bis 2 % oder 0,3 bis 1,5 % der Kammerachse.
In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte in einer kontinuierlichen Drehbewegung gedreht. In spezifischeren Ausführungsformen liegt die Drehbewegung zwischen 100 und 400 Umdrehungen pro Minute (U/min); in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 350 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 50 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 60 und 250 U/min in anderen Ausführungsformen zwischen 80 und 250 U/min; oder in anderen Ausführungsformen zwischen 150 und 250 U/min. Alternativ oder zusätzlich werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten gedreht.
In weiteren Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte in oszillierender Weise einer Rotationskraft (relativ zu einer zentralen Achse der Kammer) ausgesetzt. In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten in einer oszillierenden Drehbewegung gedreht. Alternativ oder zusätzlich kann die Frequenz der Oszillation einmal pro 1 bis 10 Sekunden; 1 bis 15 Sekunden; 1 bis 20 Sekunden; 1 bis 30 Sekunden; 1 bis 45 Sekunden; 1 bis 60 Sekunden; 2 bis 10 Sekunden; 2 bis 15 Sekunden; 2 bis 20 Sekunden; 2 bis 30 Sekunden; 2 bis 45 Sekunden; 2 bis 60 Sekunden; 3 bis 10 Sekunden; 3 bis 15 Sekunden; 3 bis 20 Sekunden; 3 bis 30 Sekunden; 3 bis 45 Sekunden; 3 bis 60 Sekunden; 5 bis 10 Sekunden; 5 bis 15 Sekunden; 5 bis 20 Sekunden; 5 bis 30 Sekunden; 5 bis 45 Sekunden; 5 bis 60 Sekunden; 10 bis 20 Sekunden; 10 bis 30 Sekunden; 10 bis 45 Sekunden; oder 10 bis 60 Sekunden betragen.
Die maximale Winkelgeschwindigkeit der beschriebenen Drehbewegung (bei der es sich in manchen Ausführungsformen um eine kontinuierliche Drehbewegung oder in anderen Ausführungsformen um eine oszillierende Drehbewegung handelt) beträgt in bestimmten Ausführungsformen 3 bis 30, 3 bis 25, 3 bis 20, 3 bis 15, 3 bis 10, 4 bis 30, 4 bis 25, 4 bis 20, 4 bis 15, 4 bis 10, 5 bis 30, 5 bis 25, 5 bis 20, 5 bis 15, 5 bis 10, 6 bis 30, 6 bis 25, 6 bis 20, 6 bis 15, 6 bis 10, 8 bis 30, 8 bis 25, 8 bis 20, 8 bis 15 oder 8 bis 10 U/min.
Jede der vorstehend genannten Ausführungsformen der Anzahl, Geometrie und Anordnung der hervorstehenden Objekte; und die Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der oszillierenden Bewegung) der Drehbewegung kann frei kombiniert werden.
In anderen Ausführungsformen sind die starren 3D-Träger in einem mittleren Bereich 42 (der alternativ in der Technik als „Korb“ bezeichnet werden kann) gepackt (siehe nachstehende Beschreibung), und die Drehbewegung erfolgt durch die Drehung des Korbs. In weiteren Ausführungsformen umfasst der Korb poröse Wände oder ist durch poröse Wände begrenzt, die eine radiale Begrenzung des Korbs definieren, die sich innerhalb der radialen Begrenzung des Korbs befindet. In bestimmten Ausführungsformen sind die porösen Wände ausreichend porös, um einen freien Austausch der wässrigen Lösung zwischen den Bereichen innerhalb und außerhalb des Korbs zu ermöglichen. Alternativ oder zusätzlich ist der Korb durch obere und untere Strukturen begrenzt (siehe z. B. Komponente 35 und die untere Komponente 110 in der Beschreibung der 2 und 3A nachstehend), die in manchen Ausführungsformen unabhängig porös sein können. In bestimmten Ausführungsformen sind die 3D-Träger ausreichend dicht gepackt, so dass sich ihre Massenschwerpunkte während der beschriebenen Drehung des Korbes relativ zu den Korbwänden im Wesentlichen nicht bewegen. Typischerweise enthält der Korb auch die wässrige Lösung. In spezifischeren Ausführungsform kann der Korb innerhalb eines äußeren Behälters angeordnet sein, während sich die wässrige Lösung in dem Korb und dem äußeren Behälter befindet, und der Korb wird relativ zu dem äußeren Behälter gedreht. Manche Ausführungsformen der hierin beschriebenen Körbe sind nur durch obere und untere Strukturen und nicht durch Wände begrenzt.
In manchen Ausführungsformen wird der Korb in einer kontinuierlichen Drehbewegung gedreht. In spezifischeren Ausführungsformen liegt die Drehbewegung zwischen 100 und 400 Umdrehungen pro Minute (U/min); in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 350 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 300 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 100 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 120 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 50 und 250 U/min; in anderen Ausführungsformen zwischen 60 und 250 U/min in anderen Ausführungsformen zwischen 80 und 250 U/min; oder in anderen Ausführungsformen zwischen 150 und 250 U/min. Alternativ oder zusätzlich werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten gedreht.
In weiteren Ausführungsformen wird der Korb in einer oszillierenden Drehbewegung gedreht. In manchen Ausführungsformen werden die hervorstehenden Objekte für eine Zeitdauer zwischen 0,5 bis 15, 0,6 bis 15, 0,8 bis 15, 1 bis 15, 2 bis 15, 3 bis 15, 4 bis 15, 5 bis 15, 0,5 bis 20, 0,6 bis 20, 0,8 bis 20, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 0,5 bis 30, 0,6 bis 30, 0,8 bis 30, 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30 oder 5 bis 30 Minuten in oszillierender Weise einer Rotationskraft (relativ zu einer zentralen Achse der Kammer) ausgesetzt. Alternativ oder zusätzlich kann die Frequenz der Oszillation einmal pro 1 bis 10 Sekunden; 1 bis 15 Sekunden; 1 bis 20 Sekunden; 1 bis 30 Sekunden; 1 bis 45 Sekunden; 1 bis 60 Sekunden; 2 bis 10 Sekunden; 2 bis 15 Sekunden; 2 bis 20 Sekunden; 2 bis 30 Sekunden; 2 bis 45 Sekunden; 2 bis 60 Sekunden; 3 bis 10 Sekunden; 3 bis 15 Sekunden; 3 bis 20 Sekunden; 3 bis 30 Sekunden; 3 bis 45 Sekunden; 3 bis 60 Sekunden; 5 bis 10 Sekunden; 5 bis 15 Sekunden; 5 bis 20 Sekunden; 5 bis 30 Sekunden; 5 bis 45 Sekunden; 5 bis 60 Sekunden; 10 bis 20 Sekunden; 10 bis 30 Sekunden; 10 bis 45 Sekunden; oder 10 bis 60 Sekunden betragen.
Die maximale Winkelgeschwindigkeit der beschriebenen Drehbewegung (bei der es sich in manchen Ausführungsformen um eine kontinuierliche Drehbewegung oder in anderen Ausführungsformen um eine oszillierende Drehbewegung handelt) beträgt in bestimmten Ausführungsformen 3 bis 30, 3 bis 25, 3 bis 20, 3 bis 15, 3 bis 10, 4 bis 30, 4 bis 25, 4 bis 20, 4 bis 15, 4 bis 10, 5 bis 30, 5 bis 25, 5 bis 20, 5 bis 15, 5 bis 10, 6 bis 30, 6 bis 25, 6 bis 20, 6 bis 15, 6 bis 10, 8 bis 30, 8 bis 25, 8 bis 20, 8 bis 15 oder 8 bis 10 (U/min).
Jede der vorstehend genannten Ausführungsformen von Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der oszillierenden Bewegung) der Drehbewegung kann frei kombiniert werden.
In bestimmten Ausführungsformen wird das beschriebene Mittel entfernt, bevor die 3D-Träger einer Drehbewegung ausgesetzt werden. Dies kann in verschiedenen Ausführungsformen erreicht werden, indem eine wässrige Lösung, die das Mittel enthält, entfernt und durch eine Lösung ersetzt wird, der das Mittel fehlt. In weiteren Ausführungsformen werden die Träger mit einer Waschlösung inkubiert, die anschließend durch eine andere Lösung ersetzt wird, der das Mittel fehlt, was in der Technik als „Waschschritt“ bekannt ist.
In anderen Ausführungsformen ist das Mittel während des Schritts des Aussetzens des 3D-Trägers einer Drehbewegung vorhanden. In weiteren Ausführungsformen werden die 3D-Träger in Gegenwart des Mittels einer Drehbewegung ausgesetzt, dann wird das Mittel entfernt, und die 3D-Träger werden einer zusätzlichen Drehbewegung in Abwesenheit des Mittels ausgesetzt. Die beiden Drehbewegungen in dieser Ausführungsform können unabhängig jede der vorstehend genannten Ausführungsformen von Geschwindigkeit, Dauer, Art und Frequenz (im Fall der Oszillationsbewegung) aufweisen, die frei kombinierbar sind.
Das vorstehend genannte Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbindet, ist in manchen Ausführungsformen eine Protease. In bestimmten Ausführungsform befindet sich die Protease in einer wässrigen Lösung, die in weiteren Ausführungsform einen Chelator zweiwertiger Kationen umfassen kann, beispielsweise einen Chelator von Calcium und/oder Magnesium, wobei Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ein nicht einschränkendes Beispiel dafür ist. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Proteasen sind Trypsin und andere Enzyme mit ähnlicher Aktivität, nicht einschränkende Beispiele sind TrypLE™, eine Trypsin-artige Pilz-Protease. Solche Enzyme werden in manchen Ausführungsformen in Kombination mit einem anderen Enzym, beispielsweise mit Kollagenase, wobei Kollagenasen des Typs I, II, III und IV (die im Handel von Life Technologies erhältlich sind) nicht einschränkende Beispiele dafür sind, und anderen Enzymen mit ähnlicher Aktivität verwendet, wobei Dispase I und Dispase II, die im Handel von Sigma-Aldrich erhältlich sind, nicht einschränkende Beispiele dafür sind. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Inkubation mit dem beschriebenen Mittel für 1 bis 30, 2 bis 30, 3 bis 30, 4 bis 30, 5 bis 30, 6 bis 30, 8 bis 30, 10 bis 30, 1 bis 20, 2 bis 20, 3 bis 20, 4 bis 20, 5 bis 20, 6 bis 20, 8 bis 20, 10 bis 20, 1 bis 10, 2 bis 10, 3 bis 10, 4 bis 10, 5 bis 10, 6 bis 10, 8 bis 10, 10 bis 20, 11 bis 19, 12 bis 18, 13 bis 17, 14 bis 16, 12 bis 20 oder 15 bis 20 Minuten stattfinden;
In anderen Ausführungsformen ist das vorstehend genannte Mittel ein Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an die extrazelluläre Matrix (ECM) unterbindet. Alternativ oder zusätzlich unterbindet das Mittel die Adhäsion der adhärenten Zellen an benachbarte Zellen; und/oder unterbindet fokale Adhäsionen. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Mittel um ein Mittel, das Peptidbindungen spaltet.
In verschiedenen Ausführungsformen können die Systeme der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um eine Vielzahl von verschiedenen eukaryotischen Zelltypen zu ernten. Zum Beispiel können die Systeme für das Wachstum von Stammzellen, verankerungsabhängigen Zellen, mesenchymalen Zellen und adhärenten Zellen geeignet sein. In seiner vorliegenden Verwendung bezieht sich der Begriff „adhärente Zellen“ auf Zellen, die in der Lage sind, an ein Bindungssubstrat zu binden und auf dem Substrat zu expandieren oder zu proliferieren. In manchen Ausführungsformen sind die Zellen verankerungsabhängig, d. h. sie benötigen die Bindung an einer Fläche, um in vitro proliferieren und wachsen zu können. Geeignete adhärente Zellen können adhärente Stromazellen (ASC) einschließen. In verschiedenen Ausführungsform werden die ASC zum Beispiel aus einer Quelle erhalten, die aus Knochenmark, Fettgewebe, Plazenta, Nabelschnurblut und peripherem Blut ausgewählt ist. Alternativ oder zusätzlich differenzieren sich die ASC in verschiedenen Ausführungsformen in Abhängigkeit von Einflüssen bioaktiver Faktoren nicht zu verschiedenen Zelltypen (z. B. retikulären Endothelzellen, Fibroblasten, Adipozyten, osteogenen Vorstufenzellen) oder sind dazu nicht in der Lage.
In anderen Ausführungsformen stammen die beschriebenen ASC aus der Plazenta. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Begriffe „Plazenta“, „Plazentagewebe“ und dergleichen auf jeglichen Teil der Plazenta. Adhärente Zellen aus der Plazenta können in verschiedenen Ausführungsformen entweder aus fötalen oder in anderen Ausführungsformen aus maternalen Regionen der Plazenta oder in anderen Ausführungsformen aus beiden Regionen erhalten werden. Speziellere Ausführungsformen maternaler Quellen sind die Decidua basalis und die Decidua parietalis. Speziellere Ausführungsformen fötaler Quellen sind das Amnion, das Chorion und die Zotten. In bestimmten Ausführungsformen werden Gewebeproben in einem physiologischen Puffer [z. B. phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Hanks Puffer] gewaschen. In bestimmten Ausführungsformen schließt das Plazentagewebe, aus dem Zellen geerntet werden, mindestens eine der Chorion- und Decidua-Regionen der Plazenta oder, in weiteren Ausführungsformen, sowohl die Chorion- als auch die Decidua-Region der Plazenta ein. Speziellere Ausführungsformen von Chorionregionen sind Chorion-Mesenchym- und Chorion-Trophoblasten-Gewebe. Speziellere Ausführungsformen der Decidua sind die Decidua basalis, die Decidua capsularis und die Decidua parietalis.
In weiteren Ausführungsform kann es sich bei den Zellen um eine plazentare Zellpopulation handeln, die eine Mischung aus vom Fötus gewonnenen plazentaren ASC (hierin auch als „fötale ASC“ oder „fötale Zellen“ bezeichnet) und von der Mutter gewonnen plazentaren ASC (hierin auch als „maternale ASC“ oder „maternale Zellen“ bezeichnet) ist, wobei die meisten Zellen maternale Zellen sind. In spezielleren Ausführungsformen enthält die Mischung mindestens 80 %, mindestens 81 %, mindestens 82 %, mindestens 83 %, mindestens 84 %, mindestens 85 %, mindestens 86 %, mindestens 87 %, mindestens 88 %, mindestens 89 %, mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,1%, mindestens 99,2 %, mindestens 99,3 %, mindestens 99,4 %, mindestens 99,5 %, mindestens 99,6 %, mindestens 99,7 %, mindestens 99,8 %, mindestens 99,9 %, mindestens 99,92 %, mindestens 99,95 %, mindestens 99,96 %, mindestens 99,97 %, mindestens 99,98 % oder mindestens 99,99 % maternale Zellen oder enthält zwischen 90 und 99 %, 91 und 99 %, 92 und 99 %, 93 und 99 %, 94 und 99 %, 95 und 99 %, 96 und 99 %, 97 und 99 %, 98 und 99 %, 90 und 99,5 %, 91 und 99,5 %, 92 und 99,5 %, 93 und 99,5 %, 94 und 99,5 %, 95 und 99,5 %, 96 und 99,5 %, 97 und 99,5 %, 98 und 99,5 %, 90 und 99,9 %, 91 und 99,9 %, 92 und 99,9 %, 93 und 99,9 %, 94 und 99,9 %, 95 und 99,9 %, 96 und 99,9 %, 97 und 99,9 %, 98 und 99,9 %, 99 und 99,9 %, 99,2 und 99,9 %, 99,5 und 99,9 %, 99,6 und 99,9 %, 99,7 und 99,9 % oder 99,8 und 99,9 % maternale Zellen.
In anderen Ausführungsformen handelt es sich bei den Zellen um eine plazentare Zellpopulation, die keine detektierbare Menge an maternalen Zellen enthält, sodass es sich dabei gänzlich um fötale Zellen handelt. Eine detektierbare Menge bezieht sich auf eine Menge an Zellen, die unter Verwendung von Markern oder Kombinationen von Markern, die auf maternalen Zellen, jedoch nicht auf fötalen Zellen vorhanden sind, mittels FACS detektierbar sind, wie hierin beschrieben ist. In bestimmten Ausführungsformen kann sich „eine detektierbare Menge“ auf mindestens 0,1 %, mindestens 0,2 %, mindestens 0,3 %, mindestens 0,4 %, mindestens 0,5 %, mindestens 0,6 %, mindestens 0,7 %, mindestens 0,8 %, mindestens 0,9 % oder mindestens 1 % beziehen.
In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Präparation um eine plazentare Zellpopulation, die eine Mischung aus fötalen und maternalen Zellen ist, wobei die meisten Zellen fötale Zellen sind. In spezielleren Ausführungsformen enthält die Mischung mindestens 70 % fötale Zellen. In spezielleren Ausführungsformen sind mindestens etwa 30 %, 35 %, 40 % , 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % der Zellen fötale Zellen. Die Expression von CD200, wie durch Durchflusszytometrie unter Verwendung einer Isotypkontrolle zur Definition einer negativen Expression gemessen, kann unter bestimmten Bedingungen als Marker für fötale Zellen verwendet werden. In weiteren Ausführungsformen sind mindestens 60 %, mindestens 65 %, mindestens 70 %, mindestens 75 %, mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 92 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 %, mindestens 99 %, mindestens 99,5 %, mindestens 99,7 % oder mindestens 99,9 % der beschriebenen Zellen fötale Zellen.
Alternativ oder zusätzlich handelt es sich bei den Zellen um mesenchymartige adhärente Stromazellen (ASC), die ein ähnliches Markermuster wie mesenchymale Stromazellen aufweisen, sich aber unter Bedingungen, bei denen sich „klassische“ mesenchymale Stammzellen (MSC) zu Osteozyten differenzieren würden, nicht zu Osteozyten differenzieren. In anderen Ausführungsformen weisen die Zellen ein ähnliches Markermuster wie MSC auf, differenzieren sich aber unter Bedingungen, bei denen sich MSC zu Adipozyten differenzieren würden, nicht zu Adipozyten. In weiteren Ausführungsformen weisen die Zellen ein ähnliches Markermuster wie MSC auf, differenzieren sich aber unter Bedingungen, bei denen sich mesenchymale Stammzellen zu Osteozyten oder Adipozyten differenzieren würden, nicht zu Osteozyten bzw. Adipozyten. Bei den MSC, die in diesen Assays zum Vergleich verwendet werden, handelt es sich in manchen Ausführungsformen um MSC, die aus Knochenmark (KM) gewonnen und unter 2D-Bedingungen kultiviert wurden. In anderen Ausführungsformen wurden die zum Vergleich verwendeten MSC aus KM geerntet und unter 2D-Bedingungen und anschließend unter 3D-Bedingungen kultiviert. In spezielleren Ausführungsformen handelt es sich bei den mesenchymartigen ASC um maternale Zellen. In alternativen Ausführungsformen handelt es sich bei den mesenchymartigen ASC um fötale Zellen.
Alternativ oder zusätzlich können die ASC einen Marker oder eine Sammlung von Markern (z. B. Oberflächenmarker) exprimieren, die für MSC oder mesenchymartige Stromazellen charakteristisch sind. In manchen Ausführungsformen exprimieren die ASC einige oder alle der folgenden Marker: CD105 (UniProtKB-Zugangsnummer P17813), CD29 (UniProtKB-Zugangsnummer P05556), CD44 (UniProtKB-Zugangsnummer P16070), CD73 (UniProtKB-Zugangsnummer P21589) und CD90 (UniProtKB-Zugangsnummer P04216). In manchen Ausführungsformen exprimieren die ASC einige oder alle der folgenden Marker nicht: CD3 (z. B. UniProtKB-Zugangsnummern P09693 [Gamma-Kette] P04234 [Delta-Kette], P07766 [Epsilon-Kette] und P20963 [Zeta-Kette]), CD4 (UniProtKB-Zugangsnummer P01730), CD11b (UniProtKB-Zugangsnummer P11215), CD14 (UniProtKB-Zugangsnummer P08571), CD19 (UniProtKB-Zugangsnummer P15391) und/oder CD34 (UniProtKB-Zugangsnummer P28906). In spezielleren Ausführungsformen weisen die ASC auch keine Expression von CD5 (UniProtKB-Zugangsnummer P06127), CD20 (UniProtKB-Zugangsnummer P11836), CD45 (UniProtKB-Zugangsnummer P08575), CD79-alpha (UniProtKB-Zugangsnummer B5QTD1), CD80 (UniProtKB-Zugangsnummer P33681) und/oder HLA-DR (z. B. UniProtKB-Zugangsnummern P04233 [Gamma-Kette], P01903 [Alpha-Kette] und P01911 [Beta-Kette]) auf. Die vorstehend genannten, nicht einschränkenden Marker-Expressionsmuster wurden in bestimmten maternalen Plazentazellpopulationen gefunden, die auf 3D-Substraten expandiert wurden. Alle UniProtKB-Einträge, auf die in diesem Absatz Bezug genommen wird, wurden am 7. Juli 2014 abgerufen. Der Fachmann wird erkennen, dass das Vorhandensein komplexer Antigene wie CD3 und HLA-DR durch Antikörper detektiert werden kann, die einen von deren Komponenten erkennen, wie z. B. die hierin beschriebenen, aber nicht darauf beschränkt sind.
In bestimmten Ausführungsformen sind mehr als 90 % der ASC CD29-, CD90- und CD54-positiv. In anderen Ausführungsformen sind über 85 % der beschriebenen Zellen CD29-, CD73-, CD90- und CD105-positiv. In noch weiteren Ausführungsformen sind weniger als 3 % der beschriebenen Zellen CD14-, CD19-, CD31-, CD34-, CD39-, CD45RA- (ein Isotyp von CD45), HLA-DR-, Glycophorin A- und CD200-positiv; weniger als 6 % der Zellen sind GlyA-positiv; und weniger als 20 % der Zellen sind SSEA4-positiv. In spezielleren Ausführungsformen sind über 90 % der beschriebenen Zellen CD29-, CD90- und CD54-positiv; und über 85 % der Zellen sind CD73- und CD105-positiv. In weiteren Ausführungsformen sind über 90 % der beschriebenen Zellen CD29-, CD90- und CD54-positiv; über 85 % der Zellen sind CD73- und CD105-positiv; weniger als 6 % der Zellen sind CD14-, CD19-, CD31-, CD34-, CD39-, CD45RA-, HLA-DR-, GlyA-, CD200- und GlyA-positiv; und weniger als 20 % der Zellen sind SSEA4-positiv. Die vorstehend genannten, nicht einschränkenden Marker-Expressionsmuster wurden in bestimmten maternalen Plazentazellpopulationen gefunden, die auf 3D-Substraten expandiert wurden.
„Positive“ Expression eines Markers weist auf einen Wert hin, der höher ist als der Bereich des Hauptpeaks eines Isotypkontrollhistogramms; dieser Begriff ist hierin auch gleichbedeutend mit der Charakterisierung einer Zelle als einen Marker „exprimierend“. „Negative“ Expression eines Markers weist auf einen Wert hin, der in den Bereich des Hauptpeaks eines Isotypkontrollhistogramms fällt; dieser Begriff ist hierin auch gleichbedeutend mit der Charakterisierung einer Zelle als einen Marker „nicht exprimierend“. Eine „hohe“ Expression eines Markers und der Begriff „exprimiert in hohem Maß“ bzw. „exprimieren in hohem Maß“ weisen auf einen Expressionsgrad hin, der um mehr als 2 Standardabweichungen höher ist als der Expressionspeak eines Isotypkontrollhistogramms oder einer glockenförmigen Kurve, die an das Isotypkontrollhistogramm angepasst ist.
In weiteren Ausführungsformen exprimieren die meisten, in anderen Ausführungsformen über 60 %, über 70 %, über 80 % oder über 90 % der expandierten Zellen CD29, CD73, CD90 und CD105. In weiteren Ausführungsformen exprimieren weniger als 20 %, 15 % oder 10 % der beschriebenen Zellen CD3, CD4, CD34, CD39 und CD106. In weiteren Ausführungsformen exprimieren weniger als 20 %, 15 % oder 10 % der beschriebenen Zellen CD56 in hohem Maß. In verschiedenen Ausführungsformen können weniger als 50 %, weniger als 40 %, weniger als 30 %, weniger als 20 % oder weniger als 10 % oder weniger als 5 % der Zellpopulation CD200-positiv sein. In anderen Ausführungsformen ist mehr als 50 %, mehr als 60 %, mehr als 70 %, mehr als 80 %, mehr als 90 %, mehr als 95 %, mehr als 97 %, mehr als 98 %, mehr als 99 % oder mehr als 99,5 % der Zellpopulation CD200-positiv. In bestimmten Ausführungsformen werden CD141 (Thrombomodulin; UniProt-Zugangsnummer P07204) oder in anderen Ausführungsformen SSEA4 (stadienspezifisches embryonales Antigen 4, ein Epitop von Gangliosid GL-7 (IV3 NeuAc 2 → 3 GalGB4); Kannagi R et al.) oder in anderen Ausführungsformen beide Marker von mehr als 50 % der Zellen exprimiert bzw. in anderen Ausführungsformen in hohem Maß exprimiert. Alternativ oder zusätzlich exprimieren mehr als 50 % der Zellen HLA-A2 (UniProt-Zugangsnummer P01892). Die vorstehend genannten, nicht einschränkenden Marker-Expressionsmuster wurden in bestimmten von einem Fötus stammenden plazentaren Zellpopulationen gefunden, die auf 3D-Substraten expandiert wurden. Die UniProt-Zugangsnummern, die in diesem Absatz genannt sind, wurden am 8. Februar 2017 abgerufen.
In anderen Ausführungsformen werden CD73, CD29 und CD105 jeweils von mehr als 90 % der ASC exprimiert; und die Zellen differenzieren sich unter Bedingungen, bei denen sich mesenchymale Stammzellen zu Adipozyten differenzieren würden, nicht zu Adipozyten. In manchen Ausführungsformen, wie hierin bereitgestellt, handelt es sich bei den Bedingungen um die Inkubation in Adipogenese-Induktionsmedium, zum Beispiel in einer Lösung, die 1 µM Dexamethason, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 10 µg/ml Insulin und 100 µM Indomethacin enthält, an den Tagen 1, 3, 5, 9, 11, 13, 17, 19 und 21; und Ersetzen des Mediums durch Adipogenese-Erhaltungsmedium, nämlich durch eine Lösung, die 10 µg/ml Insulin enthält, an den Tagen 7 und 15, für insgesamt 25 Tage. In noch anderen Ausführungsformen werden CD34, CD45, CD19, CD14 und HLA-DR jeweils von weniger als 3 % der Zellen exprimiert; und die Zellen differenzieren sich nach Inkubation unter den vorstehend genannten Bedingungen nicht zu Adipozyten. In anderen Ausführungsformen werden CD73, CD29 und CD105 jeweils von mehr als 90 % der Zellen exprimiert, CD34, CD45, CD19, CD14 und HLA-DR werden jeweils von weniger als 3 % der Zellen exprimiert; und die Zellen differenzieren sich nach Inkubation unter den vorstehend genannten Bedingungen nicht zu Adipozyten. In weiteren Ausführungsformen wird ein modifiziertes Adipogenese-Induktionsmedium verwendet, das 1 µM Dexamethason, 0,5 mM IBMX, 10 µg/ml Insulin und 200 µM Indomethacin enthält, und die Inkubation erfolgt für insgesamt 26 Tage. Die vorstehend genannten Lösungen enthalten normalerweise ein Zellkulturmedium wie DMEM + 10 % Serum oder dergleichen, wie für den Fachmann ersichtlich ist. Die vorstehend genannten, nicht einschränkenden Phänotypen und Marker-Expressionsmuster wurden in bestimmten maternalen Plazentazellpopulationen gefunden, die auf 3D-Substraten expandiert wurden. Diese Versuche wurden wie in Beispiel 2 der WO 2016/098061 beschrieben durchgeführt, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
2 ist eine perspektivische Ansicht eines Systems 10 zum Züchten und Ernten von Zellen gemäß beispielhaften Ausführungsformen. Obwohl das System 10 normalerweise geschlossen gehalten wird, ist es in den Figuren hierin allgemein offen dargestellt, um die Innenkomponenten zu zeigen. Wie gezeigt ist, schließt das System 10 ein Behältnis 20 ein, das konfiguriert ist, um eine Vielzahl von Trägern 30 aufzunehmen (siehe 3A-B und hiernach folgende Beschreibung), die sich in einer Kammer 40 des Behältnisses 20 befinden können. Zur Vereinfachung sind nur 3 Träger gezeigt; normalerweise ist eine viel größere Anzahl vorhanden.
Das System 10 kann auch eine Komponente 35 einschließen, die dazu dient, Träger einzugrenzen, um diese daran zu hindern, sich weiter in Richtung der oberen Platte 60 zu bewegen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Komponente 35 konfiguriert sein, um ein Packen und Entpacken von Trägern 30 innerhalb des Behältnisses 20 zu erlauben. Wie in den 2 und 3A gezeigt ist, kann sich die Komponente 35 im Inneren der Kammer 40 des Behältnisses 20 befinden. Die Komponente 35 kann die Kammer 40 in eine oder mehrere Bereiche trennen. Zum Beispiel kann die Komponente 35 die Kammer 40 in einen mittleren Bereich 42 und einen zweiten Bereich 44 trennen. Im Betrieb kann der mittlere Bereich 42 mit Trägern 30 gefüllt sein (nicht gezeigt). Die Komponente 35 kann dann bewegt werden, um eine Druckkraft auf die Träger 30 auszuüben, um diese in ein spezifisches Volumen des mittleren Bereichs 42 zu packen. In dieser gepackten Konfiguration können die Träger 30 innerhalb des mittleren Bereichs 42 stationär bleiben. Das Medium 145 in dem zweiten Bereich 44 kann gerührt werden und sich durch den mittleren Bereich 42 bewegen, was das Wachstum von Zellen auf Trägern 30 erlaubt, die in dem mittleren Bereich 42 enthalten sind. Zusätzlich kann die Kammer 40 einen dritten Bereich 46 einschließen. Der zweite und der dritte Bereich 44, 46 können sich auf zwei oder mehr Seiten des mittleren Bereichs 42 befinden, um Pufferbereiche bereitzustellen, wo das Medium 145 gerührt werden kann, um einen Fluss von Medium 145 über die Träger 30 bereitzustellen, die sich in dem mittleren Bereich 42 befinden. Dementsprechend kann die Komponente 35 (die auch als die „zweite perforierte Struktur“ bezeichnet wird) porös sein und kann obere Poren 37 von ausreichender Größe aufweisen, um einen Fluss des Mediums 145 über die Komponente 35 zu ermöglichen, die Träger jedoch im mittleren Bereich 42 zu halten. Die Komponente 35 könnte aus jedem geeigneten Material gebildet sein, wie beispielsweise aus einem Polymer, einer Metalllegierung oder einer Kombination verschiedener Materialien. In bestimmten Ausführungsformen kann die Komponente 35 konfiguriert sein, um eine kolbenartige Aktion bereitzustellen, wodurch die Bewegung der Komponente 35 die in der Kammer 40 befindlichen Träger 30 komprimiert. In anderen Ausführungsformen kann der mittlere Bereich 42 durch Hinzufügen einer oder mehrerer zusätzlicher Komponenten 35 in mehrere Kompartimente unterteilt werden (nicht dargestellt).
In manchen Ausführungsformen kann die Komponente 35 bewegbar mit dem Behältnis 20 verbunden sein. Wie in 2 und 3A gezeigt ist, kann die Komponente 35 relativ zu dem Behältnis 20 in vertikaler Richtung bewegt werden. In anderen Ausführungsformen kann die Komponente 35 horizontal bewegt werden, sich ausdehnen oder zusammenziehen oder auf eine andere Weise bewegt werden, um die Bewegung der Träger 30 innerhalb des Behältnisses 20 zu beschränken.
Wie in den 2 und 3A gezeigt, kann das System 10 eine obere Abdeckung oder Platte 60 einschließen, die konfiguriert ist, um sich mit dem Behältnis 20 zu verbinden. In manchen Ausführungsformen kann die obere Abdeckung oder Platte 60 konfiguriert sein, um die Kammer 40 zu versiegeln, die konfiguriert ist, um eine Reihe von Trägern aufzunehmen. Die obere Abdeckung oder Platte 60 kann auch eine oder mehrere Anschlüsse 70 einschließen. Das System 10 kann Rohrleitungen, Sensoren, mechanische Elemente, Impellerwellen und andere Vorrichtungen umfassen, die Zugang zu der Kammer 40 benötigen.
Zum Beispiel kann die obere Platte 60 einen oder mehrere Anschlüsse 70 einschließen, die konfiguriert sind, um eines oder mehrere Stützelemente 80 aufzunehmen, die mit der Komponente 35 verbunden sind. Die Anschlüsse 70 sind vorzugsweise versiegelt, beispielsweise um das Einbringen von Bakterien oder anderen biologischen Verunreinigungen zu verhindern. Wie in den in den 2 und 3A gezeigten Ausführungsformen veranschaulicht ist, können zwei Stützelemente 80 fest mit der Komponente 35 verbunden sein und sich von der Komponente 35 und durch zwei Anschlüsse 70 der oberen Abdeckung oder Platte 60 hindurch nach oben erstrecken. Die Komponente 35 und die Stützelemente 80 können, obwohl sie separat gezeigt sind, als einteilige oder monolithische Vorrichtung ausgebildet sein. Die Komponente 35 und die Stützelemente 80 könnten aus Kunststoff, Metall, Glas oder einem anderen geeigneten Material ausgebildet sein.
Die Komponente 35 und/oder die Stützelemente 80 könnten auch mit einem Griff 90 verbunden sein. Der Griff 90 kann einen Haltegriff 92 einschließen, der konfiguriert ist, um es einem Bediener zu ermöglichen, die Komponente 35 von einer ersten Position zu einer zweiten Position zu bewegen, wie vorstehend beschrieben ist. Wie in 2 gezeigt ist, kann der Griff 90 verwendet werden, um die Komponente 35 zu heben und zu senken, um die Träger 30 zu packen und zu entpacken.
Das System 10 kann auch eines oder mehrere Verriegelungselemente 100 einschließen, die konfiguriert sind, um die Komponente 35 in einer oder mehreren Positionen zu verriegeln. Zum Beispiel könnte das Verriegelungselement 100 die Komponente 35 in mindestens einer der ersten Position und der zweiten Position relativ zu dem Behältnis 20 verriegeln. Das Verriegelungselement 100 ist als Bolzen dargestellt, könnte jedoch eine beliebige ähnliche Vorrichtung einschließen, die mit der oberen Platte 60 und/oder dem Stützelement 80 in Eingriff steht. Der Mechanismus könnte beispielsweise ein Gewinde verwenden (nicht sichtbar). Das Verriegelungselement 100 könnte auch eine Verriegelung, eine Klammer, eine Reibpassung, einen Knopf, ein Zahnrad, einen Motor oder eine andere Vorrichtung (nicht dargestellt) einschließen, die zum Verriegeln der Komponente 35, des Stützelements 80 und/oder des Griffs 90 in einer oder mehreren Positionen relativ zu dem Behältnis 20 konfiguriert sind.
Das System 10 kann auch eine untere Komponente 110 einschließen, die konfiguriert ist, um Träger innerhalb des Behältnisses 20 zu unterstützen. Wie in den 2 und 3A gezeigt ist, kann sich die Komponente 110 in einem Abstand von einer unteren Fläche des Behältnisses 20 befinden. Insbesondere kann die untere Komponente 110 zur Positionierung in der Kammer 40 derart geformt und bemessen sein, dass der dritte Bereich 46 ein Volumen des Mediums 145 einschließt. Ähnlich zu der vorstehend beschriebenen Komponente 35 kann die untere Komponente 110 (auch als die „erste perforierte Struktur“ bezeichnet) porös sein. wobei untere Poren 111 von ausreichender Größe sind, um einen Fluss des Mediums 145 zwischen dem mittleren Bereich 42 und dem dritten Bereich 46 zuzulassen, während Träger im mittleren Bereich 42 gehalten werden. In bestimmten Ausführungsformen befinden sich die Träger 30 in dem mittleren Bereich 42 zwischen der Komponente 35 und der unteren Komponente 110.
In manchen Ausführungsformen kann/können die Komponente 35 und/oder die untere Komponente 110 auch eine oder mehrere Öffnungen 130 einschließen, die konfiguriert sind, um einen oder mehrere Kanäle 122, 124 aufzunehmen. Wie in 3A gezeigt ist, können sich mehrere Kanäle 122,124 im Allgemeinen zwischen Komponente 35 und der unteren Komponente 110 durch Öffnungen 130 erstrecken. Die Kanäle 122, 124 können einen direkten Fluiddurchgang zwischen dem zweiten Bereich 44 und dem dritten Bereich 46 bereitstellen. Zum Beispiel können sich ein erster Kanal 122 und ein zweiter Kanal 124 vom unteren Element 110 zu der Komponente 35 hin erstrecken. Die Komponente 35 kann eine oder mehrere Öffnungen 130 einschließen, die bemessen und angeordnet sind, um zugehörige Kanäle 122, 124 aufzunehmen. Insbesondere kann die Komponente 35 eine erste Öffnung 132, die mit dem ersten Kanal 122 assoziiert ist, und eine zweite Öffnung 134, die mit dem zweiten Kanal 124 assoziiert ist, einschließen. Wie in 3A gezeigt ist, können der erste Kanal 122 und die erste Öffnung 132 angeordnet, geformt und bemessen sein, um eine Leitung 140 aufzunehmen. Die Leitung 140 kann einen direkten Durchgang für den Transport von Fluid zu oder von dem dritten Bereich 46 und durch die obere Platte 60 bereitstellen.
Wie in 3A gezeigt ist, können sich die Welle 152, der zweite Kanal 124 und die zweite Öffnung 134 auf einer zentralen Längsachse 153 des Behältnisses 20 befinden. Die Leitung 140, der erste Kanal 122 und die erste Öffnung 132 können sich um eine Peripherie 155 der Kammer 40 herum außerhalb der zentralen Längsachse 153 des Behältnisses 20 befinden.
Der zweite Kanal 124 und die zweite Öffnung 134 können auch angeordnet, geformt und bemessen sein, um einen Impeller mit Schaufeln 150 aufzunehmen. Wie in den 3A-B gezeigt ist, kann der Impeller mit Schaufeln 150 eine Welle 152, die wahlweise mit der oberen Platte 60 verbunden ist, eine Schaufel 154, die konfiguriert ist, um Fluid zu bewegen, wenn sie sich dreht, und/oder ein Magnetelement 156, das konfiguriert ist, um sich magnetisch mit einer Rührvorrichtung 160 zu verbinden (4), einschließen. In bestimmten Ausführungsformen (3B) umfasst der Impeller mit Schaufeln 150 2 bis 5 Schaufeln 154, die sich über ihre gesamte Länge radial von Schaft 152 aus erstrecken. Die Ebene des distalen Endes 158 der Schaufel 154 relativ zu dem Magnetelement 156 befindet sich im Wesentlichen parallel zu der Achse (Neigung von 90 Grad relativ zu dem Magnetelement 156), und die Neigung der Ebene nimmt allmählich von 90 Grad ab, um am proximalen Ende 159 der Schaufel 154 relativ zu dem Magnetelement 156 zwischen 30 und 60° zu erreichen. In bestimmten Ausführungsformen kann sich der Impeller mit Schaufeln 150 drehen, um Medium 145 durch den mittleren Bereich 42 und über Zellen, die auf Trägern 30 wachsen, zu bewegen. Die Welle 152 kann mit der oberen Platte 60 fest verbunden sein und mit der Schaufel 154 und/oder dem Magnetelement 156 drehbar verbunden sein. Alternativ kann die Welle 152 fest mit der Schaufel 154 verbunden sein und/oder das Magnetelement 156 und/oder kann mit der oberen Platte 60 drehbar verbunden sein. In anderen Ausführungsformen könnte die Welle 152 mit einem Motor (nicht gezeigt) oder einer anderen Vorrichtung verbunden sein, die konfiguriert ist, um die Welle 52 und die Schaufel 154 zu drehen. Bei einer solchen Ausführungsform wäre das Magnetelement 156 nicht erforderlich.
Es wird in Betracht gezogen, dass verschiedene vorstehend beschriebene Merkmale an unterschiedlichen Vorrichtungen bereitgestellt sein können und dass verschiedene Konfigurationen von Vorrichtungen möglich sind. Beispielsweise können die Kanäle 122,124 mit der Komponente 35, der oberen Platte 60 oder einem anderen Teil des Systems 10 verbunden sein. Entsprechend können in der unteren Komponente 110, dem Behältnis 20 oder einem anderen Teil des Systems 10 Öffnungen bereitgestellt sein. In manchen Ausführungsformen kann in dem zweiten Bereich 44 der Kammer 40 ein oberer Impeller 170 bereitgestellt sein, um die Zirkulation des Mediums 145 in der gesamten Kammer 40 zu unterstützen. In der Kammer 40 und in den verschiedenen Bereichen 42, 44 und 46 können zusätzliche Sonden, Leitungen und andere Vorrichtungen (nicht dargestellt) bereitgestellt sein. Dementsprechend können die Komponente 35 und die untere Komponente 110 konfiguriert sein, um mit diesen zusätzlichen Vorrichtungen zu arbeiten.
Weitere Beispiele für mögliche alternative Ausführungsformen umfassen das Bereitstellen von einem oder mehreren Impellern 150 innerhalb eines oder mehrerer Bereiche 44 42, 46 der Kammer 40. Eine untere Leitung 180 kann sich (4) oder auch nicht (3A) durch eine Wand des Behältnisses 20 in direkter Fluidverbindung mit einem dritten Bereich 46 befinden. In manchen Ausführungsformen benötigt das System 10 die untere Komponente 110 oder den dritten Bereich 46 nicht. Unter Verwendung von Leitungen, die geeignet um den unteren Teil der Kammer 40 angeordnet sind, kann ein ausreichender Fluss des Mediums 145 erreicht werden. Zum Beispiel können sich von der oberen Platte 60 um einen Umfang 155 der Kammer 40 zusätzliche Leitungen (nicht gezeigt) mit Öffnungen in den mittleren Bereich 42 erstrecken. Einzelne oder mehrere Einlass- und/oder Auslassleitungen 140 und/oder -kanäle 122,124, die eine oder mehrere Öffnungen enthalten, könnten den mittleren Bereich 42 mit einem ausreichenden Fluss des Mediums 145 versorgen, um angemessene Inkubationsbedingungen bereitzustellen. In anderen Ausführungsformen kann der Kanal 124 entfernt sein, und/oder es kann ein geeignet konfigurierter Impeller, zum Beispiel ein Impeller mit Schaufeln 150, verwendet werden, um das Medium 145 durch den mittleren Bereich 42 zu bewegen. In einer weiteren Ausführungsform kann ein gepacktes Bett aus Trägern 30 als eine einzelne Einheit innerhalb des Mediums 145 bewegt werden.
Wie in 4 gezeigt und vorstehend beschrieben ist, kann das System 10 eine Rührvorrichtung 160 einschließen. Die Rührvorrichtung 160 kann manuell auf bestimmte Drehgeschwindigkeiten eines oder mehrerer Impeller 150, 170 eingestellt oder programmiert werden.
In anderen Ausführungsformen des Systems 10 unter Bezugnahme auf 5A umfasst das Behältnis 20 einen rotierenden Zylinder 550, normalerweise entlang der zentralen Achse des Behältnisses 20. Speichen 560 erstrecken sich radial von dem rotierenden Zylinder 550 in dem mittleren Bereich 42, wodurch an die Träger 30 eine Bewegung vermittelt wird, wenn der rotierende Zylinder 550 gedreht wird. In bestimmten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf 5B kann der rotierende Zylinder 550 funktionell mit einer externen Komponente verbunden sein, die zur Übertragung eines angewendeten Drehmoments in der Lage ist, zum Beispiel einem Griff 520, der wahlweise entweder manuell drehbar oder über die Welle 152 mit einem Motor (nicht dargestellt) verbunden ist. In manchen Ausführungsformen umfasst die Wirkverbindung einen Zahnradmechanismus, einschließlich eines kleinen Zahnrads 530 und eines großen Zahnrads 540. Der rotierende Zylinder 550 kann verwendet werden, um zum Zeitpunkt des Erntens den Speichen 560 eine Drehbewegung zu vermitteln, wodurch sich die Träger 30 in einer umlaufenden Weise um den mittleren Bereich 42 herum bewegen und in manchen Fällen den Trägern 30 eine gewisse Drehbewegung vermittelt wird. Der rotierende Zylinder 550 kann sich entweder in einer kontinuierlichen Drehbewegung oder in anderen Ausführungsformen in einer partiellen Drehbewegung drehen, beispielsweise in einer oszillierenden partiellen Drehbewegung.
In noch anderen Ausführungsformen (nicht dargestellt) ist ein rotierender Zylinder funktionell mit einem Korb verbunden, in dem sich die beschriebenen faserigen 3D-Träger oder starren 3D-Träger befinden, wodurch eine Drehung des Korbs relativ zu der äußeren Kammerwand ermöglicht wird.
Wahlweise ist auch ein Zelllift-Impeller 170 vorhanden, der unten einen Vakuumzug 500 erzeugt, welcher in dem mittleren Bereich 42 zu einem Fluidfluss nach unten 510 führt. Der Zelllift-Impeller 170 dreht sich vorzugsweise um die gleiche Achse wie der rotierende Zylinder 550, befindet sich aber nicht in Wirkverbindung mit dem rotierenden Zylinder 550. Der Begriff „Zelllift-Impeller“ kann sich auf einen Impeller mit einem vertikalen Rohr beziehen, dessen Drehbewegung einen niedrigen Differenzialdruck auf die Basis des Rohrs erzeugt.
In bestimmten Ausführungsform wird die 3D-Kultivierung in einem Bioreaktor durchgeführt, welcher gestaltet ist, um 3D-Träger zu enthalten. In manchen Ausführungsformen umfasst der 3D-Bioreaktor einen Behälter zum Halten eines Mediums und ein dreidimensionales Bindungssubstrat (Trägersubstrat), das darin angeordnet ist, und eine Steuerungsvorrichtung zum Steuern des pH-Werts, der Temperatur und des Sauerstoffhiveaus und wahlweise anderer Parameter. Alternativ oder zusätzlich enthält der Bioreaktor Anschlüsse für den Zu- und Abfluss von frischem Medium und Gasen. Sofern nicht anders angegeben, schließt der Begriff „Bioreaktor“ dezellularisierte Organe und Gewebe aus, die von einem Lebewesen stammen.
Beispiele für Bioreaktoren schließen einen Rührkessel-Bioreaktor, ein CelliGen Plus®-Bioreaktorsystem (New Brunswick Scientific (NBS)) und ein BioFlo310-Bioreaktorsystem (New Brunswick Scientific (NBS)) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein 3D-Bioreaktor zur 3D-Expansion adhärenter Stromazellen unter kontrollierten Bedingungen (z. B. pH-Wert, Temperatur- und Sauerstoffniveaus) und mit Perfusion mit Wachstumsmedium, bei der es sich in manchen Ausführungsformen um eine konstante Perfusion handelt und die in anderen Ausführungsformen angepasst ist, um Zielmengen von Glucose oder anderen Komponenten zu erhalten, in der Lage. Darüber hinaus können die Zellkulturen direkt auf Konzentrationen von Glucose, Lactat, Glutamin, Glutamat und Ammonium überwacht werden. Die Glucoseverbrauchsrate und die Lactatbildungsrate der adhärenten Zellen ermöglichen in manchen Ausführungsformen die Messung der Zellwachstumsrate und die Bestimmung des Erntezeitpunkts.
In manchen Ausführungsformen wird ein Rührkessel-Bioreaktor verwendet, bei welchem dem Bioreaktor kontinuierlich ein Kulturmedium zugeführt und kontinuierlich ein Produkt abgezogen wird, um im Inneren des Reaktors einen zeitlich konstanten Gleichgewichtszustand aufrecht zu erhalten. Ein Rührkessel-Bioreaktor mit einem Faserbettkorb ist beispielsweise von New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, erhältlich. Zusätzliche Bioreaktoren, die in manchen Ausführungsformen verwendet werden können, sind Bioreaktoren mit stationärem Bett und Airlift-Bioreaktoren, bei denen normalerweise Luft in den Boden eines zentralen Saugrohrs eingespeist wird, die nach oben strömt, während Blasen gebildet werden, und an der Oberseite der Säule Abgas abgegeben wird. Weitere Möglichkeiten sind Perfusionsbioreaktoren mit polyaktiven Schäumen [wie in Wendt, D. et al., Biotechnology and Bioengineering 84: 205-214, (2003) beschrieben] und Radialfluss-Perfusionsbioreaktoren, die rohrartige poröse Gerüste aus Poly-L-Milchsäure (PLLA) enthalten [wie in Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006) beschrieben]. Andere Bioreaktoren, die verwendet werden können, sind in den US-Patenten mit den Nummern 6,277,151; 6,197,575; 6,139,578; 6,132,463; 5,902,741; und 5,629,186 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Ein „Bioreaktor mit stationärem Bett“ bezieht sich auf einen Bioreaktor, in dem das Zellwachstumssubstrat in Gegenwart von Wachstumsmedium normalerweise nicht vom Boden des Inkubationsgefäßes angehoben wird. Zum Beispiel kann das Substrat eine ausreichende Dichte aufweisen, um zu verhindern, dass es angehoben wird, und/oder es kann durch mechanischen Druck gepackt sein, um zu verhindern, dass es angehoben wird. Das Substrat kann entweder ein einzelner Körper oder mehrere Körper sein. Das Substrat bleibt während der Standardagitationsgeschwindigkeit des Bioreaktors im Wesentlichen an Ort und Stelle. In manchen Ausführungsformen sind mehrere Träger locker gepackt, zum Beispiel bilden sie ein locker gepacktes Bett, das in ein Nährmedium eingetaucht ist. In bestimmten Ausführungsformen können die Träger, obwohl sie im Wesentlichen an Ort und Stelle bleiben, wenn keine Rotationskraft auf sie ausgeübt wird, ohne Weiteres durch Rotation der beschriebenen hervorstehenden Objekte bewegt werden. In anderen Ausführungsformen kann das Substrat bei ungewöhnlich schnellen Agitationsgeschwindigkeiten, beispielsweise mehr als 200 U/min, angehoben werden.
Ein weiterer beispielhafter Bioreaktor, der Bioreaktor Celligen 310, ist in 6 dargestellt. Ein Faserbettkorb (16) ist mit Polyesterscheiben (10) beladen. In manchen Ausführungsformen wird das Behältnis über einen äußeren Anschluss (1 [dieser Anschluss kann in anderen Ausführungsformen auch zum Ernten von Zellen verwendet werden]) mit entionisiertem Wasser oder isotonischem Puffer befüllt und dann gegebenenfalls autoklaviert. In anderen Ausführungsformen wird die Flüssigkeit nach der Sterilisation durch ein Wachstumsmedium ersetzt, welches das Scheibenbett, wie in (9) dargestellt, sättigt. In noch weiteren Ausführungsformen werden Temperatur, pH-Wert, Konzentration des gelösten Sauerstoffs usw. vor dem Inokulieren eingestellt. In weiteren Ausführungsformen wird zunächst eine niedrige Rührgeschwindigkeit verwendet, um die Zellanheftung zu fördern, dann wird die Rührgeschwindigkeit erhöht. Alternativ oder zusätzlich wird die Perfusion durch Zugabe von frischem Medium über einen äußeren Anschluss (2) initiiert. Falls gewünscht, können aus dem zellfreien Medium über dem Korb (8) Stoffwechselprodukte geerntet werden. In manchen Ausführungsformen erzeugt die Drehung des Impellers einen Unterdruck in dem Saugrohr (18), der zellfreien Abfluss aus einem Reservoir (15) durch das Saugrohr und dann durch einen Impeller-Anschluss (19) zieht, was bewirkt, dass Medium gleichmäßig in einer kontinuierlichen Schleife zirkuliert (12). In noch weiteren Ausführungsformen steuert die Anpassung eines Rohrs (6) den Flüssigkeitsstand; in manchen Ausführungsformen wird zum Ernten eine äußere Öffnung (4) dieses Rohrs verwendet. In anderen Ausführungsformen befindet sich in der Impeller-Belüftungskammer (11) ein Ringverteiler (nicht sichtbar), um das durch den Impeller strömende Medium durch Gase, die über durch einen externen Anschluss (3), der in einem Gehäuse (5) gehalten werden kann, und eine Verteilerleitung (7) zugeführt werden, mit Sauerstoff zu versorgen. Alternativ oder zusätzlich wird das in die entfernt liegende Kammer eingeschlossene, verteilte Gas von dem Nährmedium absorbiert, das über die immobilisierten Zellen gespült wird. In weiteren Ausführungsformen ist eine Wasserummantelung (17) mit Anschlüssen, um das Ummantelungswasser hinein (13) und hinaus (14) zu bewegen, vorhanden.
In bestimmten Ausführungsformen wird ein perfundierter Bioreaktor verwendet, wobei die Perfusionskammer Träger enthält. Die Träger können in spezielleren Ausführungsformen aus Makroträgern, Mikroträgern oder beiden ausgewählt sein. Nicht einschränkende Beispiele für Mikroträger, die im Handel erhältlich sind, umfassen Mikroträger auf Alginatbasis (GEM, Global Cell Solutions), auf Dextranbasis (Cytodex, GE Healthcare), auf Kollagenbasis (Cultispher, Percell) und auf Polystyrolbasis (SoloHill Engineering). In bestimmten Ausführungsformen sind die Mikroträger im Inneren des perfundierten Bioreaktors gepackt.
In manchen Ausführungsformen sind die Träger in dem perfundierten Bioreaktor locker gepackt, zum Beispiel bilden sie ein locker gepacktes Bett, das in ein Nährmedium eingetaucht ist. Alternativ oder zusätzlich handelt es sich bei den Trägern um faserige Träger, die ein adhärentes Material umfassen. In anderen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche der Träger ein adhärentes Material oder die Oberfläche der Träger ist adhärent. In weiteren Ausführungsformen weist das Material eine chemische Struktur wie geladene oberflächenexponierte Gruppen auf, was eine Zelladhäsion ermöglicht. Nicht einschränkende Beispiele von adhärenten Materialien, die in Übereinstimmung mit dieser Erscheinungsform verwendet werden können, schließen einen Polyester, ein Polypropylen, ein Polyalkylen, ein Polyfluorchlorethylen, ein Polyvinylchlorid, ein Polystyrol, ein Polysulfon, ein Celluloseacetat, eine Glasfaser, einen Keramikpartikel, eine Poly-L-Milchsäure und eine inerte Metallfaser ein. In spezielleren Ausführungsformen kann das Material aus einem Polyester und einem Polypropylen ausgewählt sein. In verschiedenen Ausführungsformen bezieht sich „ein adhärentes Material“ auf ein Material, das synthetisch ist oder in anderen Ausführungsformen natürlich vorkommt, oder in anderen Ausführungsformen eine Kombination davon. In bestimmten Ausführungsformen ist das Material nicht zytotoxisch (oder ist in anderen Ausführungsformen biologisch kompatibel). Nicht einschränkende Beispiele für synthetische adhärente Materialien umfassen Polyester, Polypropylene, Polyalkylene, Polyfluorchlorethylene, Polyvinylchloride, Polystyrole, Polysulfone, Celluloseacetate und Poly-L-Milchsäuren, Glasfasern, Keramikteilchen und eine inerte Metallfaser, oder, in spezifischere Ausführungsformen, Polyester, Polypropylene, Polyalkylene, Polyfluorchlorethylene, Polyvinylchloride, Polystyrole, Polysulfone, Celluloseacetate und Poly-L-Milchsäuren. Andere Ausführungsformen umfassen Matrigel™, eine extrazelluläre Matrixkomponente (z. B. Fibronectin, Chondronectin, Laminin) und ein Kollagen.
In anderen Ausführungsformen werden Zellen unter Verwendung einer Spinnerflasche mit gepacktem Bett erzeugt. In manchen Ausführungsformen sind die Träger locker gepackt. In spezielleren Ausführungsformen kann das gepackte Bett eine Spinnerflasche und einen Magnetrührer umfassen. Die Spinnerflasche kann in manchen Ausführungsformen mit einer Vorrichtung mit gepacktem Bett ausgestattet sein, bei der es sich in spezielleren Ausführungsformen um eine faserige Matrix, eine nichtgewebte faserige Matrix, eine Polyester umfassende nichtgewebte faserige Matrix oder eine nichtgewebte faserige Matrix, die mindestens ungefähr 50 % Polyester umfasst, handeln kann. In spezielleren Ausführungsformen kann die Matrix dem Celligen™ Pfropfstrom-Bioreaktor ähnlich sein, der in bestimmten Ausführungsformen mit Fibra-cel® (oder in anderen Ausführungsformen mit anderen Trägern) gepackt ist. Der Spinner wird in bestimmten Ausführungsformen diskontinuierlich gespeist (oder in anderen alternativen Ausführungsformen durch Perfusion gespeist), ist mit einem oder mehreren sterilisierenden Filtern ausgestattet und befindet sich in einem Gewebekulturinkubator. In weiteren Ausführungsformen werden Zellen auf dem Gerüst ausgesät, indem sie in Medium suspendiert werden und das Medium in die Vorrichtung eingeführt wird. In noch weiteren Ausführungsformen wird die Agitationsgeschwindigkeit schrittweise erhöht, zum Beispiel, indem mit 40 U/min für 4 Stunden begonnen und die Geschwindigkeit dann schrittweise auf 120 U/min erhöht wird. In bestimmten Ausführungsformen kann der Glucosespiegel des Mediums periodisch (d. h. täglich) getestet werden, und die Perfusionsgeschwindigkeit kann angepasst werden, um eine akzeptable Glucosekonzentration aufrecht zu erhalten, die in bestimmten Ausführungsformen zwischen 400 und 700 mg/Liter, zwischen 450 und 650 mg/Liter, zwischen 475 und 625 mg/Liter, zwischen 500 und 600 mg/Liter oder zwischen 525 und 575 mg/Liter liegt. In weiteren Ausführungsformen werden am Ende des Kulturverfahrens Träger aus dem gepackten Bett entfernt, mit isotonischem Puffer gewaschen und verarbeitet oder durch Agitation und/oder enzymatischen Verdau von den Trägern entfernt.
Andere Ausführungsformen der Offenbarung werden dem Fachmann aus der Betrachtung der Beschreibung und der Praxis der vorliegenden Offenbarung ersichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass die Beschreibung und die Beispiele nur als beispielhaft betrachtet werden, wobei der wahre Umfang und Geist der Offenbarung durch die folgenden Ansprüche angegeben werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2012/140519 [0004]
WO 2014/037862 [0005, 0008, 0035, 0036, 0038]
WO 2007/108003 [0015]
WO 2016/098061 [0077]
US 6277151 [0098]
US 6197575 [0098]
US 6139578 [0098]
US 6132463 [0098]
US 5902741 [0098]
US 5629186 [0098]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Li et al., Determination of non-spherical particle size distribution from chord length measurements. Part 1: Theoretical analysis. Chemical Engineering Science 60(12): 3251-3265, 2005 [0039]
Wendt, D. et al., Biotechnology and Bioengineering 84: 205-214, (2003) [0098]
Kitagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006) [0098]

Claims

Verfahren zum Ablösen adhärenter Zellen von faserigen dreidimensionalen (3D-)Trägern, das die folgenden Schritte umfasst: Inkubieren der adhärenten Zellen mit einem Mittel, das die Adhäsion der adhärenten Zellen an den Träger unterbindet; und Unterziehen der 3D-Träger einer Drehbewegung, während die 3D-Träger in eine wässrige Lösung eingetaucht sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 3D-Träger in einer Bioreaktorkammer angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 3D-Träger und die wässrige Lösung in einer Kammer angeordnet sind und die Drehbewegung durch hervorstehende Objekte vermittelt wird, die von einer zentralen Achse der Kammer aus radial vorspringen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die hervorstehenden Objekte in einer kontinuierlichen Drehbewegung gedreht werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die hervorstehenden Objekte in einer oszillierenden Drehbewegung gedreht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die 3D-Träger in einem Korb gepackt sind und die Drehbewegung durch die Drehung des Korbs vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Korb innerhalb eines äußeren Behälters angeordnet ist, die wässrige Lösung sich in dem Korb und dem äußeren Behälter befindet und der Korb relativ zu dem äußeren Behälter gedreht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Mittel entfernt wird, bevor die 3D-Träger einer Drehbewegung unterzogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Mittel vorhanden ist, während die 3D-Träger einer Drehbewegung unterzogen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei den adhärenten Zellen um adhärente Stromazellen handelt.