JP6475322B2 - 3次元細胞培養システム及びこれを用いた細胞培養方法 - Google Patents
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Description
多孔性膜を細胞培養容器の内部に非接触的に位置させ;
上記多孔性膜の片側表面に生分解性合成バイオゲル溶液を塗布してゾルゲル相転移を通して生分解性合成バイオゲルをコーティングし;
上記コーティングされた生分解性合成バイオゲルの上に細胞を含んだ培地を入れて培養することを含む細胞培養方法に関する。
細胞培養容器;
上記細胞培養容器の底の上部に非接触的に配置される多孔性膜;及び、
上記多孔性膜の上部でゾルゲル相転移を通して多孔性膜の上部表面に付着される生分解性合成バイオゲルを含む細胞培養システムに関する。
生分解性合成バイオゲル(BASF,Germany)を滅菌された3次蒸留水に5%から30%まで5%間隔の濃度に溶かして多様な%のゲルを製造した後、250μl/cm2で0.4μm乃至1μmの高分子膜(Corning,USA)上に塗布して1時間30分の間37℃で固めて細胞培養容器を製作した。その後、既存の培養方法により培養皿で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞、ヒト皮膚由来角質細胞(Keratonocyte)またはイヌ脂肪由来間葉系幹細胞(Canine ADMSC)を上記細胞培養容器の生分解性合成バイオゲルの上に接種し、下記の各細胞に最適化された培養液で37℃、CO2培養器にて3日乃至4日間培養した。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞はCEFOgro ADMSC培地(CB-ADMSC-GM,CEFO,Korea)、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞はCEFOgro BMMSC培地(CB-BMMSC-GM,CEFO,Korea)、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞はCEFOgro UCMSC培地(CB-UCMSC-GM,CEFO,Korea)、ヒト皮膚由来角質細胞(Keratonocyte)はCEFOgro HK培地(CB-HK-GM,CEFO,Korea)及びイヌ脂肪由来間葉系幹細胞(Canine ADMSC)はCEFOgro MSGM培地(CB-MS-GM,CEFO,Korea)で培養した(図1)。
従来の幹細胞培養方法である2次元的培養方法で幹細胞を培養した。具体的に、細胞培養容器(皿)に上記実施例のように幹細胞を接種し幹細胞を培養した(図2)。
上記実施例で高分子膜なしに生分解性合成バイオゲルを細胞培養皿の底に塗布した後、この上に上記実施例と同様に幹細胞を接種し培養した(図3)。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養後の細胞培養程度を確認するために、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を比較例1の2次元培養方法、比較例3の培養方法及び上記実施例の培養方法(5%、10%または15%生分解性合成バイオゲル)で培養した。細胞培養後、位相差顕微鏡で細胞を観察した結果、比較例2の方法では幹細胞がよく付着できておらず、実施例の方法を用いて培養した場合は従来の2次元培養方法(比較例1)よりも細胞がよく生長することが確認できた(図4)。また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の生存を確認するために、細胞死滅が発生した場合は赤色に染色され、生存細胞は緑色に染色されるLive/Dead分析を行うために、上記のように細胞を培養した後、培地を除去し、洗浄過程なしにLive/Dead assay(Invitrogen,USA)溶液を150μl/12well添加して20分間常温で反応させた。反応後、洗浄過程なしに直ちに蛍光顕微鏡(LEICA,Germany)上でイメージを分析し、この全ての試験過程は製造社提供プロトコルに従った。その結果、上記位相差顕微鏡による観察結果と同様に、実施例の方法で培養した場合は、比較例方法よりも細胞がよく付着され生長することが分かった(図4)。また、幹細胞能を間接的に確認するために、1個の細胞から細胞が分裂してコロニーを形成することを確認するCFU分析を行った。具体的に、実施例、比較例1及び比較例2の方法で6ウェルプレート(Corning,USA)にヒト骨髄由来間葉系幹細胞を1ウェル当たり200個ずつ接種し、約8日間培養した後、ホルマリンで固定して1%クリスタルバイオレット溶液で染色した。染色後、3次蒸留水またはリン酸緩衝食塩水(PBS,Phosphate buffer saline)で洗浄し、倒立顕微鏡(LEICA,Germany)上でイメージ分析を行った結果、上記の他の実験結果と類似の結果を示し、本発明の実施例の方法で培養された幹細胞の細胞分裂(増殖)能力は、1乃至20%生分解性合成バイオゲルで可能であり、特に、5%生分解性合成バイオゲル及び10%生分解性合成バイオゲルで優れていることが分かった(図4)。これを通して、培養皿に生分解性合成バイオゲルを直接コーティングして細胞を培養する場合(比較例2)は、細胞が付着されず細胞培養方法としては適していないものと判断され、これは空気透過及び培地提供に問題があるためと類推される。
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養後の細胞培養程度を確認するために、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を実施例(5%、10%、15%、20%、25%または30%生分解性合成バイオゲル)、比較例1及び比較例2の方法で培養した。細胞培養後、位相差顕微鏡で細胞を観察した結果、上記の骨髄由来間葉系幹細胞と同様に、比較例2の方法では細胞がよく付着できておらず、実施例の方法で(1乃至30%生分解性合成バイオゲル)幹細胞を培養した場合、大部分の細胞がよく育った。また、培養されたヒト脂肪由来間葉系幹細胞を計数するために、各々の方法で培養した後、PBSで2回洗浄し、トリプシン(Invitrogen,USA)を処理して37℃、CO2培養器で7分間反応させ細胞を収集した後、培養液で2回洗浄し、自動細胞計数器(ADAM;Nano&Tech,Korea)で細胞を計数した結果、上記顕微鏡観察と同一であり、特に、実施例の方法で培養した幹細胞のうち5乃至15%の生分解性合成バイオゲルにおいて細胞成長が優れていた(図5)。
他の幹細胞であるヒト臍帯由来間葉系幹細胞を実施例(10%生分解性合成バイオゲル)、比較例1の方法で培養した後、位相差顕微鏡で細胞を観察した結果、臍帯由来間葉系幹細胞も、本発明の高分子膜及び生分解性合成バイオゲルを用いた実施例の方法で培養したとき、生長が促進されることが確認できた(図6)。
ヒト由来の初代培養細胞であるヒト皮膚由来角質細胞を実施例(5%、10%、15%、20%、25%または30%生分解性合成バイオゲル)、比較例1及び比較例2の方法で培養し、細胞培養程度を確認した。具体的に、ヒト皮膚由来角質細胞を実施例(5%、10%、15%、20%、25%または30%生分解性合成バイオゲル)、比較例1及び比較例2の方法でそれぞれ培養した後、位相差顕微鏡で確認し、細胞を収集して計数した。その結果、高分子膜上に1乃至30%の生分解性合成バイオゲルを固めた実施例の方法で培養した皮膚角質細胞が大体よく育ち、生分解性合成バイオゲル%が高いほど細胞産出量が多くなり、20乃至30%生分解性合成バイオゲルでは生分解性合成バイオゲル含有%による差がほとんどないことと現れた。特に、15乃至30%生分解性合成バイオゲルを含む細胞培養容器では、一般の培養皿で培養する方法よりも細胞産出量がより多かった(図7)。
他種由来間葉系幹細胞であるイヌ脂肪由来間葉系幹細胞を実施例(10%生分解性合成バイオゲル)、比較例1の方法で培養し、顕微鏡を用いて確認した結果、2次元培養方法よりも細胞がよく培養されることが確認できた(図8)。
Claims (6)
- 多孔性膜を細胞培養容器の内部に非接触的に位置させること;
前記多孔性膜の片側表面に、ポリオキシエチレン(POE)とポリオキシプロピレン(POP)との共重合体を含むヒドロゲル溶液を塗布して、ゾルゲル相転移を通して、37℃での粘度が1.E+00mPa・s〜1.E+06mPa・s(10 0 mPa・s〜10 6 mPa・s)となるようにヒドロゲルをコーティングすることであって、
幹細胞を培養する場合には前記ヒドロゲルの濃度が5%〜15%であり、初代培養細胞を培養する場合には前記ヒドロゲルの濃度が15%〜30%である、前記コーティングすること;及び
コーティングされた前記ヒドロゲルの上に細胞を含む培地を入れて3次元的に培養すること、
を含み、
前記多孔性膜は0.1μm〜8μmの空隙を有し、
前記多孔性膜及び前記ヒドロゲルは、空気及び培地の透過を許容する、
幹細胞又は初代培養細胞の培養方法。 - 前記多孔性膜と前記細胞培養容器との間に培地が流入して培地及び空気が細胞の付着部位にも提供されることを特徴とする、請求項1に記載の培養方法。
- 前記ゾルゲル相転移は、37℃で1時間〜2時間の間に行われることを特徴とする、請求項1に記載の培養方法。
- 前記幹細胞は、臍帯由来間葉系幹細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cell)、脂肪由来間葉系幹細胞(adipose derived mesenchymal stem cell)又は骨髄由来間葉系幹細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell)であることを特徴とする、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の培養方法。
- 細胞培養容器;及び
片側面にヒドロゲルが付着した多孔性膜、を含み、
前記細胞培養容器の内部に、前記ヒドロゲルが付着した多孔性膜が非接触的に配置されており、
前記ヒドロゲルはポリオキシエチレン(POE)とポリオキシプロピレン(POP)との共重合体を含み、
前記ヒドロゲルの37℃での粘度は1.E+00mPa・s〜1.E+06mPa・s(10 0 mPa・s〜10 6 mPa・s)であり、
幹細胞を培養する場合には前記ヒドロゲルの濃度が5%〜15%であり、初代培養細胞を培養する場合には前記ヒドロゲルの濃度が15%〜30%であり、
前記多孔性膜は0.1μm〜8μmの空隙を有し、
前記多孔性膜及び前記ヒドロゲルは、空気及び培地の透過を許容する、
幹細胞又は初代培養細胞の細胞培養システム。 - 前記多孔性膜及び前記ヒドロゲルは、培地及び空気の透過が可能であることを特徴とする、請求項5に記載の細胞培養システム。
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