JP2019509047A - 撹拌タンクバイオリアクタを用いた多能性幹細胞の増殖および継代 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
細胞培養容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと、
を含む。
細胞培養容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと、
を含む。
いくつかの実施形態では、上記の方法は、連続継代を行うことにより、細胞凝集体および/またはその子孫の1つまたは複数をさらに増殖させるステップをさらに含む。このような実施形態のいくつかでは、細胞凝集体および/またはその子孫のさらなる増殖の1つまたは複数は、膜フィルタを有する第2の容器への継代によって行われる。
撹拌タンクバイオリアクタ容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
細胞凝集体の凝集体採取および無酵素スライシングを行うステップと、
閉鎖系において継代を行うステップと
を含む。
材料および方法
材料:図3〜図4に示すGEプロトタイプの撹拌タンク反応器で凝集体を培養した。Hyclone Labtainerバッグを使用して供給用の新鮮な培地を保持し、使用済み培地を回収した。Accutase(商標)は、MP Biomedical(CA、USA)から購入した。mTeSRTM1培地はSTEMCELL(商標)Technology Inc.(Vancouver、BC、Canada)から購入した。Y−27632(ROCK阻害剤)はSigma Aldrich(St.Louis、MO)から購入した。CT2 hESCは、コネチカット大学保健センターのRen−He Xuから得た。ポリゴングリッドスライサーおよび継代に使用される重力沈降のための配管アセンブリは、この用途のために特別に製造されたものであり、商業ベンダーを通じて購入されたものではない。
撹拌タンクバイオリアクタ上の配管アセンブリの概念的構成を図1〜図4に示す。アセンブリは、以下の機能を提供するが、これに限定されるものではない。(1)細胞/細胞培養培地混合物の除去、(2)出て行く細胞培養培地からの細胞凝集体の分離、(3)細胞培養培地の付加、および(4)細胞培養培地の除去。
スライサーは、様々な生体適合性材料で構成することができる。材料は、滅菌に適していなければならず、細胞試料の流れ中に受ける応力に耐えることができる機械的強度を有していなければならない。多能性幹細胞凝集体の継代培養について試験された2つの材料は、ニッケル合金およびシリコンであった。当業者は、他の材料が、凝集体の継代のために所望のスライサー性能を可能にする特性を有することを認識するであろう。スライサーは、例えば、正方形または六角形のグリッドなどの多角形のグリッド状パターンで設計され、50ミクロン〜400ミクロンのグリッドの壁間の間隔を有する。いくつかの実験では、スライサーを疎水性材料でコーティングして剪断および汚れを低減した。下記の多能性幹細胞凝集体の継代培養実験では、100μm間隔の正方形および六角形のグリッドを使用した。スライサーは、閉鎖系内で配管を通ってスライサーを横切って凝集体の滅菌された流れを可能にする配管に沿って取り付けられた。スライサーは、限定はしないが、接着剤、溶融ポリマー流、または締付けを含む様々な締結機構によって閉鎖系に一体化されてもよい。好ましい方法では、ポンプおよびインライン円錐状バッグ(図8)によって駆動される循環ループを介して、凝集体を懸濁液中に維持する。スライサーに通じる配管は、主循環ループに接続され、循環ループ内の細胞凝集体の一部は、循環ループを制御するポンプよりも遅い速度で動作する第2のポンプを介してスライサーに送達される。スライスされた凝集体は別々の容器に集められるか、または同じ容器に再導入されてもよい。
凝集体は、100mL〜1Lの体積からなる流れストリーム中でスライサーを通過した。酵素的継代と比較したスライサーの利点は、時間、労力および試薬の削減である。約100μmの寸法に良好にスライスすることは、スライサーを一方向または双方向の流れの中を1回または複数回通過させることによって達成された。流量は剪断を最小にするように制御された。スライサーを15〜150mL/分の流量で通過した多能性幹細胞凝集体で、サイズ縮小、細胞生存率の維持およびその後の増殖のための凝集スライス性能が実証された。当業者であれば、他の流量でも良好な性能を達成できることを認識するであろう。スライサーを通過するために使用された細胞凝集体濃度は、高い生存率でスライスされた細胞凝集体の回収に影響を与えることが判明した。スライサーの汚れは、細胞回収および生存率を低下させる可能性がある。約3×10^6細胞/mL未満の細胞凝集体濃度のスライスは、約3×10^6細胞/mLを超える細胞濃度よりも高い回収でより高い生存率サンプルを産生することが判明した。図8に示す混合装置を使用するなどして、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁を維持することによって汚れを最小限に抑え、その結果、より高い細胞生存率および回収が得られた。スライスした凝集体のサンプル画像を図9に示す。スライス後の凝集形態は、不規則な形状、直方体形状および球形形状を含む。100μmのスライサーでは、凝集体の少なくとも1つの寸法は、約100μmの直径に縮小される。スライスした凝集体をmTeSR1および任意選択的に1〜10μMのY27632 ROCK阻害剤中で培養し、増殖を可能にした。単一多能性細胞の生存率を維持するために一般的にY27632 ROCK阻害剤などの薬剤を必要とする酵素的に継代された多能性幹細胞凝集体とは異なり、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖には、Y27632 ROCK阻害剤は必要ではなかった。スライスされた凝集体の形態は、培養条件下で急速に球形に再形成された。スライスされた凝集体の増殖速度は、酵素的に継代された細胞の増殖速度と同様であった(図10および図11)。凝集体は、酵素的継代に必要なPBS洗浄を行わずにスライサーによって継代することができ、したがって、スライスによる継代は、酵素的継代よりも短い時間でよく、全体的な労力も少ない。当業者であれば理解するように、スライサーの機能および性能は、Xuri Cellbagバイオリアクタプラットフォームに依存せず、限定はしないが、他のロッキング運動、スピン運動もしくは軌道運動プラットフォームまたは撹拌タンクバイオリアクタを含む他のタイプのバイオリアクタと互換性がある。
Claims (18)
- 閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
細胞培養容器を提供するステップと、
前記容器内で凝集体を形成するステップと、
前記容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
前記灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
前記閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと
を含む方法。 - 前記閉鎖系において前記継代を行うステップは、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤の存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記閉鎖系における前記継代を行うステップは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 多能性細胞の前記生存率を維持する前記薬剤は、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤である、請求項3に記載の方法。
- 増殖された前記細胞凝集体は、ヒト多能性幹細胞を含む、請求項1乃至4の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記細胞培養容器は、撹拌タンクバイオリアクタである、請求項1乃至5の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記自動的に灌流するステップは、人的介入なしに前記閉鎖系で行われる、請求項1乃至6の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記重力沈降チャンバは、少なくとも1cmの長さであり、細胞凝集体の重力沈降を引き起こす方向に配置される、請求項1乃至7の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記自動的に灌流するステップは、約100ミクロン〜約800ミクロン直径の細胞凝集体の重力沈降を可能にする速度で行われる、請求項1乃至8の1つまたは複数に記載の方法。
- 連続継代を行うことにより、前記細胞凝集体またはその子孫の1つまたは複数をさらに増殖させるステップをさらに含む、請求項1乃至9の1つまたは複数に記載の方法。
- 細胞凝集体の連続継代は、前記閉鎖系においてスライサーグリッドを用いた無酵素継代により可能である、請求項1乃至10の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記細胞凝集体は、約100ミクロンの距離などの、約20〜約500ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される、請求項11に記載の方法。
- 前記細胞凝集体は、配管に沿うスライサーグリッドおよび細胞凝集体の混合のための装置により分離される、請求項11または12に記載の方法。
- 前記スライサーは、疎水性材料でコーティングされるか、または疎水性材料を含む、請求項11、12または13に記載の方法。
- 増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約800ミクロン以下の大きさ、例えば、約500ミクロン以下の大きさである、請求項1乃至14の1つまたは複数に記載の方法。
- 前記培養容器の容積は、約50mL〜約100Lである、請求項1乃至15の1つまたは複数に記載の方法。
- 閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
撹拌タンクバイオリアクタ容器を提供するステップと、
前記容器内で凝集体を形成するステップと、
前記容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
前記灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
細胞凝集体の凝集体採取および無酵素スライシングを行うステップと、
前記閉鎖系において継代を行うステップと
を含む方法。 - 前記閉鎖系における前記継代を行うステップは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる、請求項17に記載の方法。
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