WO2019107546A1 - 細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置 - Google Patents

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英樹 谷口
友美 田所
哲也 坂下
松本　聡
聡 足立
晃 東端
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公立大学法人横浜市立大学
国立研究開発法人宇宙航空研究開発機構
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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present invention relates to a method for aggregating cell masses and an apparatus for aggregating cell masses.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2017-230609, filed Nov. 30, 2017, the content of which is incorporated herein by reference.
  • the culture apparatus for cells described in Patent Document 1 is a single-shaft rotary bioreactor equipped with a gas exchange function.
  • the liquid medium is filled in the horizontal cylindrical bioreactor.
  • culture is performed while rotating the bioreactor along the horizontal axis of the bioreactor.
  • the rotation of the bioreactor periodically changes the direction of gravity applied to the cells (lumps) in the bioreactor, whereby the cells are held in a relatively small range relative to the bioreactor. That is, sedimentation of cells is suppressed.
  • the cells are uniformly suspended in liquid medium, cultured and grown for a required time, and fused to form a tissue mass.
  • the culture apparatus described in Patent Document 2 uses a crinostat equipped with a liquid medium circulation system.
  • the clinostat comprises a support provided on the body, an outer frame and an inner frame.
  • the outer frame is rotatably supported relative to the post.
  • the inner frame is rotatably supported relative to the outer frame.
  • the culture vessel is rotated in unison with the inner frame. Inside the culture vessel, a liquid medium and a cell mass to be cultured are enclosed. When each frame is rotated about the supported axis, the direction of gravity acting on the culture vessel is dispersed, and the cell mass can grow and extend in any direction. Therefore, three-dimensional culture of cell mass is possible.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 realize a microgravity environment in a culture vessel, and culture a cell mass in the environment.
  • these culture devices there is a problem that cell masses dispersed in the specific gravity adjusting solution can not be collected at a predetermined position.
  • the present invention has been made in view of such problems, and it is an object of the present invention to provide a method and apparatus for aggregating cell masses capable of aggregating cell masses at a predetermined position in a specific gravity adjustment solution. To aim.
  • the method for aggregating the cell mass of the present invention comprises rotating a rotating body containing a biocompatible specific gravity adjusting liquid and a cell mass having a smaller specific gravity than the specific gravity adjusting liquid to aggregate the cell mass. It is characterized in that a cell mass aggregation step is carried out. Further, the device for aggregating the cell mass of the present invention is characterized by comprising a rotating body in which a specific gravity adjusting liquid having biocompatibility and a cell mass having a smaller specific gravity than the specific gravity adjusting liquid are accommodated.
  • the cell mass when the rotating body is rotated, the cell mass is located at a predetermined position in the specific gravity adjustment liquid with respect to the specific gravity adjustment liquid by the centripetal force generated by the difference between the specific gravity of the specific gravity adjustment liquid and the specific gravity of the cell mass.
  • the specific gravity adjusting solution is biocompatible, the cell mass collected at the predetermined position continues to survive in the specific gravity adjusting solution. Therefore, the cell mass can be collected at a predetermined position in the specific gravity adjusting solution.
  • the cell mass in the cell mass aggregation step, may be aggregated around the central axis by rotating the rotator about the central axis of the rotator. .
  • cell clusters can be gathered around the central axis.
  • the cell mass collecting step may be performed in a state where a base material is disposed on the central axis of the rotating body.
  • an attachment portion for attaching a base material on a central axis of the rotating body may be provided. According to these inventions, cell masses can be gathered around the matrix.
  • the cell mass aggregation step may be performed while supplying a liquid medium into the matrix.
  • the apparatus may further include a supply unit for supplying a liquid culture medium to the base material. According to these inventions, nutrition, oxygen and the like in the liquid medium can be supplied through the matrix to suppress necrosis of the cell mass.
  • a degassing step of rotating the rotating body to collect the air in the rotating body on the base material and removing the air from the rotating body through the base material.
  • the degassing step may be performed prior to the cell mass aggregation step.
  • the cell mass can be more reliably gathered from the state where there is no air in the rotating body.
  • the matrix may be an artificial blood vessel or a regenerated blood vessel.
  • the cell mass can be aggregated at a predetermined position in the specific gravity adjusting solution.
  • the collecting apparatus 1 includes a rotating body 11, a pair of attachment parts 21 and 22, and a supply part 26.
  • the shape of the rotator 11 is not particularly limited as long as an accommodation space for accommodating the specific gravity adjusting solution and cells (cell mass) described later is formed.
  • the rotating body 11 has a first side 12, a second side 13, and an outer peripheral plate 14.
  • the side portions 12 and 13 are formed in a disc shape and arranged to face each other.
  • the outer peripheral plate 14 is formed in a tubular shape.
  • the rotating body 11 is formed of a resin or the like in a hollow cylindrical shape.
  • the inlet 15 is formed in the outer peripheral plate 14 by rubber or the like. The inlet 15 penetrates the outer peripheral plate 14 and reaches the internal space of the rotating body 11. It is preferable that the rotating body 11 be provided with an openable and closable lid portion. When the lid is closed, the lid is liquid-tightly connected to the portion of the rotating body 11 other than the lid.
  • the material forming the side portions 12 and 13 of the rotating body 11 and the outer peripheral plate 14 is not particularly limited, such as metal or acrylic resin. However, in terms of biocompatibility and internal visibility, it is preferable to form the rotating body 11 of resin by injection molding.
  • the cells referred to in the present specification are not particularly limited as long as they can form spheroids, but they are, for example, animal-derived cells, and human, monkey, cow, horse, pig, sheep, dog, cat, It means cells derived from mammals such as rabbits, rats, mice and hamsters.
  • the cells may be established as cultured cells or may be primary cells obtained from biological tissue.
  • Embryonic stem cells ES cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • mesenchymal stem cells neural stem cells etc.
  • ES cells Embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • mesenchymal stem cells neural stem cells etc.
  • differentiated cells hepatocytes, pancreatic islets Cells, kidney cells, nerve cells, corneal endothelial cells, chondrocytes, cardiomyocytes and the like can be used.
  • cells induced to differentiate from cord blood, bone marrow, fat, and blood-derived tissue stem cells can also be used.
  • cells transformed into tumor cells transformed by genetic engineering techniques, or cells infected with a viral vector can be used.
  • the rotating body 11 is rotatably supported around a central axis C by a support (not shown).
  • the rotating body 11 rotates around the central axis C by a drive unit such as a motor.
  • the drive portion transmits the driving force by contacting the outer surface of the outer peripheral plate 14 of the rotating body 11 to rotate the outer surface or rotating a belt wound around a pulley or the like fixed coaxially with the rotating body 11.
  • the attachment portions 21 and 22 are formed in a cylindrical shape, and are disposed on the central axis C of the rotating body 11 respectively.
  • the first mounting portion 21 is fixed to the surface of the first side 12 facing the second side 13.
  • the second mounting portion 22 is fixed to the surface of the second side portion 13 facing the first side portion 12.
  • a gap is formed between the first attachment portion 21 and the second attachment portion 22.
  • the mounting portions 21 and 22 are formed of the same material as the rotating body 11.
  • the artificial blood vessel (base material) D is attached to the attachment parts 21 and 22.
  • the artificial blood vessel referred to here means a blood vessel formed of synthetic fibers, biomaterials and the like.
  • the artificial blood vessel D is formed in a tubular shape by a material having gas permeability.
  • the artificial blood vessel D is attached to the attachment parts 21 and 22 by fitting each end of the artificial blood vessel D into the attachment parts 21 and 22 from outside in the radial direction.
  • the base material is the artificial blood vessel D, the base material is not limited to this and may be a regenerated blood vessel or the like.
  • the regenerating blood vessel referred to here means a blood vessel formed by regenerative medicine.
  • the stock solution W is accommodated in the rotating body 11.
  • the stock solution W contains a specific gravity adjusting solution W1 and a cell mass W2.
  • the cell mass W2 is a mixture W2a of a mixture of iPS cell-derived cells W4, vascular endothelial cells (HUVECs) W5 and mesenchymal cells (MSCs) W6 in a predetermined ratio. They are internally collected and cocultured.
  • vascular endothelial cell as used herein means a cell constituting vascular endothelium or a cell capable of differentiating into such a cell.
  • mesenchymal cells are mainly present in connective tissue derived from mesoderm and mean connective tissue cells that form support structures for cells that function in tissues, but differentiation into mesenchymal cells It is a concept that includes a cell whose fate has been determined but has not yet differentiated into mesenchymal cells.
  • the specific gravity of the cell mass W2 is smaller than the specific gravity of the specific gravity adjusting solution W1. For example, the specific gravity of the cell mass W2 is 1.05.
  • the specific gravity adjusting liquid W1 contains a first liquid medium and a specific gravity adjusting agent having biocompatibility.
  • the specific gravity adjusting liquid W1 may contain a pH adjusting agent, a suspending agent and the like in addition to the first liquid medium and the specific gravity adjusting agent.
  • the specific gravity adjusting agent W1 may be Iodixanol (Iodixanol), Ficoll (Ficoll) or the like.
  • the first liquid medium and the second liquid medium described later are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the cells (lumps) to be cultured.
  • known media such as MEM, ⁇ -MEM, DMEM, RPM1, cRDF, ERDF, F12, MCDB 131, F12 / DMEM, and WE can be mentioned.
  • the cells are human stem cells, mTeSR1 (Stem Cell Tech.), Essential 8 (registered trademark, Life Technologies), Ripro FF / FF2 / XF, which is commercially available as a medium for human totipotent stem cells.
  • the term "biocompatibility” as used herein means that there is no strong adverse effect or strong stimulus to the living body, and therefore, it coexists with any one or more of living body components, living tissues such as cells (lumps), and living body-derived substances. Implies an attribute that can be
  • the first liquid medium is used to differentiate the cell mass W2 into the liver.
  • the specific gravity of the first liquid medium is about 1.0.
  • the specific gravity adjusting agent is preferably a density gradient medium for cell separation.
  • OptiPrep registered trademark, manufactured by Cosmo Bio Inc.
  • the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid W1 is 1.06 or more and 1.08 or less.
  • the specific gravity of the specific gravity adjustment liquid W1 can be, for example, 1.03 or more and 1.15 or less, or 1.01 or more and 1.20 or less.
  • the concentration of the specific gravity adjusting agent in the specific gravity adjusting solution W1 is preferably such a concentration that the specific gravity adjusting solution W1 does not harm the cell mass W2.
  • the supply unit 26 includes a main body 27, a supply pipe 28, and a discharge pipe 29.
  • the supply pipe 28 and the first attachment portion 21 communicate with each other.
  • the discharge pipe 29 and the second attachment portion 22 communicate with each other.
  • the main body 27 has a supply tank, a pump, and a waste tank.
  • a second liquid medium (liquid medium) is accommodated in the supply tank.
  • the second liquid medium is not particularly limited, but may be the same as the first liquid medium.
  • the pump supplies the second liquid medium in the supply tank to the supply pipe 28 at a constant flow rate.
  • the supply unit 26 supplies the second liquid medium into the rotating body 11.
  • the used second liquid medium returned to the main body 27 through the discharge pipe 29 is accommodated in the waste tank.
  • the supply unit 26 may supply blood, artificial blood or the like instead of the second liquid medium.
  • FIG. 3 is a flow chart illustrating the aggregation method S in an embodiment of the present invention.
  • the lid of the rotating body 11 is opened, and the respective ends of the artificial blood vessel D are fitted into the attachment portions 21 and 22.
  • the artificial blood vessel D is disposed on the central axis C of the rotating body 11.
  • the space between each end of the artificial blood vessel D and the attachment parts 21 and 22 is sealed in a fluid tight manner.
  • the lid of the rotating body 11 is closed.
  • step S3 the specific gravity adjusting liquid W1 is filled into the rotating body 11 through the injection port 15 by a syringe or the like. At this time, it is preferable to fill the specific gravity adjusting liquid W1 so that no air bubbles remain in the rotating body 11.
  • step S5 the rotating body 11 containing the specific gravity adjusting liquid W1 is rotated around the central axis C by the drive unit. Since the specific gravity of air is smaller than the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid W1, air moves from the outside in the radial direction of the central axis C toward the central axis C with respect to the specific gravity adjusting liquid W1 by the centripetal force acting on the air.
  • the air in the rotating body 11 collects on the artificial blood vessel D. Since the artificial blood vessel D has gas permeability, air is removed from within the rotating body 11 through the blood vessel wall of the artificial blood vessel D into the artificial blood vessel D.
  • the degassing step S5 is performed before the cell mass collecting step S9 described later.
  • step S7 a plurality of cell masses W2 are injected into the rotating body 11 through the injection port 15 by a syringe or the like. Since the specific gravity adjusting liquid W1 in the rotating body 11 is biocompatible, the plurality of cell masses W2 can continue to survive in the specific gravity adjusting liquid W1.
  • step S9 the rotating body 11 containing the specific gravity adjusting solution W1 and the plurality of cell masses W2 is rotated around the central axis C by the drive unit.
  • a plurality of cell masses W2 move toward the central axis C with respect to the specific gravity adjusting liquid W1 by the centripetal force acting on the cell mass W2. As shown in FIG. 4, a plurality of cell masses W2 gather on the outer peripheral surface of the artificial blood vessel D disposed on the central axis C.
  • This cell mass collecting step S9 may be performed while supplying the second liquid medium into the artificial blood vessel D by the supply unit 26. By doing this, nutrients, oxygen and the like in the second liquid medium are supplied to the cell mass W2. Thus, all the steps of the aggregation method S are completed.
  • the aggregation method S of the present embodiment is performed in a space where gravity does not work, or a place where only a small gravity acts compared to the gravity of the earth, even if the rotating body 11 does not rotate around the central axis C, It is difficult for the cell mass W2 to settle in the specific gravity adjusting solution W1. By rotating the rotating body 11 around the central axis C, the cell mass W2 can be stabilized and collected.
  • the collecting method S and the collecting device 1 of the present embodiment when the rotating body 11 is rotated around the central axis C, the difference between the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid W1 and the specific gravity of the cell mass W2 A plurality of cell masses W2 move from the outside in the radial direction of the central axis C toward the central axis C with respect to the specific gravity adjusting liquid W1 by the resulting centripetal force.
  • the specific gravity adjusting solution W1 has biocompatibility, so that a plurality of cell masses W2 can be collected on the central axis C while surviving.
  • the cell mass collecting step S9 is performed. Thereby, a plurality of cell masses W2 can be collected on the artificial blood vessel D. While the second liquid medium is supplied into the artificial blood vessel D by the supply unit 26, the cell mass collecting step S9 is performed. Therefore, nutrients, oxygen and the like in the second liquid medium can be supplied to the plurality of cell masses W2 through the artificial blood vessel D.
  • the degassing step S5 is performed. Thereby, even if air is contained in the rotating body 11, it is possible to suppress the disturbance of the flow in the specific gravity adjusting liquid W1 by the air, and to reliably collect the cell mass W2.
  • the degassing step S5 is performed prior to the cell mass collecting step S9. Therefore, from the state where there is no air in the rotator 11, the cell mass W2 can be more reliably collected in the cell mass collecting step S9.
  • the collecting apparatus 1 may not include the attachment portions 21 and 22.
  • the attaching step S1 is not performed.
  • the cell mass W2 is assembled without attaching the artificial blood vessel D
  • the cell mass W2 is assembled around the central axis C (on the central axis C).
  • the centripetal force on the central axis C is weak, the cell mass W2 collects in a tubular shape.
  • the aggregation device 1 may not include the supply unit 26.
  • the degassing step S5 may be performed simultaneously with the cell mass aggregation step S9, or the degassing step S5 may not be performed.
  • the specific gravity adjusting liquid may be configured to include the first liquid medium without containing the specific gravity adjusting agent.
  • Example ⁇ Hereinafter, Examples and Comparative Examples of the present invention will be specifically shown and described in more detail, but the present invention is not limited to the following Examples.
  • Table 1 sample No. 1 as a specific gravity regulator. 1 to No. 6 things were examined.
  • the artificial blood vessel was placed on the central axis of the rotating body.
  • Liver progenitor cells derived from iPS cells, vascular endothelial cells and mesenchymal cells were mixed at a predetermined ratio to form a cell mass.
  • the rotating body was filled with the specific gravity adjusting solution, and the rotating body was rotated in a state where a plurality of cell clusters were injected.
  • the rotor was rotated at a rotational speed of 150 rpm for 12 minutes.
  • the specific gravity adjustment agent has biocompatibility, the specific gravity is larger than the cell mass, and a plurality of cell masses survive in the specific gravity adjustment agent. It is.
  • Example 1 As specific gravity regulators, sample nos. A specific gravity adjusting solution was prepared by mixing 70% (weight%) of the first lymphocyte separation solution (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) with the first liquid medium. In this case, 30% of the specific gravity adjusting solution is the first liquid medium. The specific gravity of the specific gravity adjusting liquid was 1.06, and the pH was 7.8. As a result of filling the prepared specific gravity adjusting solution and rotating the rotating body, it was found that a plurality of cell clusters survived and passed. (Example 2) As specific gravity regulators, sample nos. 14% of OptiPrep (registered trademark, manufactured by Cosmo Bio Inc.) was mixed in the first liquid medium to prepare a specific gravity adjusting solution.
  • OptiPrep registered trademark, manufactured by Cosmo Bio Inc.
  • the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid was 1.06 to 1.07, and the pH was 7.8.
  • vascular endothelial cells expressing mesenchymal cells, mesenchymal cells, and EGFP were expressed.
  • Cell clusters containing liver precursor cells derived from TkDA 3-4 cells (iPS cells) were collected on artificial blood vessels. Under the present circumstances, as shown in FIG. 12, it turned out that several cell mass hold
  • sample nos. A specific gravity adjusting solution was prepared by mixing 15 parts of OptiPrep in the first liquid medium with 15%.
  • the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid was 1.07 to 1.08, and the pH was 7.8.
  • vascular endothelial cells, mesenchymal cells, and TkDA 3-4 cells expressing EGFP are slightly different from the normal form, but a plurality of cell clusters was found to be alive and pass.
  • sample nos. A specific gravity adjusting solution was prepared by mixing 70% of Percoll (registered trademark, manufactured by GE Healthcare Co., Ltd.) in the first liquid medium with 70%.
  • the specific gravity of the specific gravity adjusting liquid was 1.07 to 1.08, and the pH was 8.1.
  • the method for aggregating the cell mass of the present embodiment and the device for aggregating the cell mass can be suitably used, for example, for aggregating the cell mass.
  • Assembly device (device to assemble cell mass) 11 rotating body 21 first mounting portion (mounting portion) 22 2nd mounting part (mounting part) 26 Supply section C Central axis D Artificial blood vessel (matrix) S assembly method (method of aggregating cell mass) S5 Degassing process S9 Cell mass assembly process W1 Specific gravity adjustment solution W2 Cell mass

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Abstract

この細胞塊を集合させる方法は、生体適合性を有する比重調整液と、比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行う。

Description

細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置
　本発明は、細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置に関する。
　本願は、２０１７年１１月３０日に、日本に出願された特願２０１７－２３０６０９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　従来、液体培地（比重調整液）内で細胞塊（スフェロイド、オルガノイド）に対して様々な処理を行うことが検討されている。
　例えば、特許文献１に記載された細胞の培養装置（以下、培養装置とも略して言う）は、ガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。培養装置では、横向きの円筒形バイオリアクター内に液体培地が満たされている。液体培地に細胞（細胞塊）を播種した後で、バイオリアクターの水平軸方向に沿ってバイオリアクターを回転させながら培養を行う。バイオリアクターの回転によってバイオリアクター内の細胞（塊）に掛かる重力の方向が周期的に変化することで、細胞がバイオリアクターに対して相対的に微小な範囲に保持される。つまり、細胞の沈降が抑制される。細胞は液体培地内で均一に懸濁され、必要時間培養増殖され、融合して組織塊を形成する。
　また、特許文献２に記載された培養装置は、液体培地循環システムを搭載したクリノスタットを用いている。クリノスタットは、本体に設けられた支柱と、外側フレームと、内側フレームと、を備えている。外側フレームは、支柱に対して回転可能に支持されている。内側フレームは、外側フレームに対して回転可能に支持されている。内側フレームと同体に、培養容器が回転する。培養容器の内部には、液体培地と、培養される細胞塊とが封入される。各フレームが支持される軸周りに回転すると、培養容器に働く重力方向が分散され、細胞塊があらゆる方向に向けて増殖・伸展することができる。従って、細胞塊の３次元的な培養が可能になる。
国際公開第２００５／０５６０７２号公報 特開２００６－３０４７９１号公報
　特許文献１及び特許文献２に記載された培養装置は、培養容器内に微小重力環境を実現し、その環境内で細胞塊を培養する。しかしながら、これらの培養装置では、比重調整液内に分散した細胞塊を所定の位置に集合させることができないという問題がある。
　本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであって、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる細胞塊を集合させる方法及びその装置を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
　本発明の細胞塊を集合させる方法は、生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行うことを特徴としている。
　また、本発明の細胞塊を集合させる装置は、生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体を備えることを特徴としている。
　これらの発明によれば、回転体を回転させると、比重調整液の比重と細胞塊の比重との差で生じる向心力により、比重調整液に対して細胞塊が比重調整液内の所定の位置に向かって移動する。比重調整液は生体適合性を有するため、所定の位置に集まった細胞塊は比重調整液内で生存を続ける。従って、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記細胞塊集合工程では、前記回転体を前記回転体の中心軸周りに回転させて、前記中心軸の周辺に前記細胞塊を集合させてもよい。
　この発明によれば、中心軸の周辺に細胞塊を集合させることができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記回転体の前記中心軸上に母材を配置した状態で、前記細胞塊集合工程を行ってもよい。
　また、上記の細胞塊を集合させる装置において、前記回転体の中心軸上に母材を取付けるための取付け部を備えてもよい。
　これらの発明によれば、細胞塊を母材周囲に集合させることができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材内に液体培地を供給させながら、前記細胞塊集合工程を行ってもよい。
　また、上記の細胞塊を集合させる装置において、前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備えてもよい。
　これらの発明によれば、母材を通して液体培地中の栄養や酸素等を供給し、細胞塊が壊死するのを抑制することができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記回転体を回転させて、前記回転体内の空気を前記母材上に集約して前記母材を通して前記回転体内から前記空気を除去する脱気工程を行ってもよい。
　この発明によれば、回転体内に空気が入っていても、その空気により比重調整液内の流れが乱れることを抑制して、細胞を確実に集合させることができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記脱気工程は、前記細胞塊集合工程よりも前に行ってもよい。
　この発明によれば、回転体内に空気が無い状態から、細胞塊をさらに確実に集合させることができる。
　また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材は人工血管又は再生血管であってもよい。
　本発明の細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置によれば、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる。
本発明の一実施形態の細胞塊を集合させる装置の一部を破断した斜視図である。 人工多能性幹細胞由来細胞、血管内皮細胞、及び間葉系細胞を混合させて細胞塊を生成する工程を説明する斜視図である。 本発明の一実施形態の細胞塊を集合させる方法を示すフローチャートである。 同細胞塊を集合させる方法における細胞塊集合工程で人工血管に複数の細胞塊が集合した状態を説明する斜視図である。 同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転する前の状態を示す斜視図である。 同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから４分後の状態を示す斜視図である。 同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから８分後の状態を示す斜視図である。 同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから１２分後の状態を示す斜視図である。 回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた状態を斜視して示す写真である。 細胞塊が人工血管上に集合した状態を斜視して示す写真である。 細胞塊が人工血管上に集合した状態を正面視して示す写真である。 細胞塊が蛍光発現を保持している状態を側面視して示す写真である。
　以下、本発明に係る細胞塊を集合させる装置（以下、集合装置とも略して言う）の一実施形態を、図面を参照しながら説明する。
　図１に示すように、本実施形態の集合装置１は、回転体１１と、一対の取付け部２１，２２と、供給部２６と、を備えている。
　回転体１１は、後述する比重調整液及び細胞（細胞塊）を収容する収容空間が形成されていれば、特に形状は限定されない。本実施形態では、回転体１１は、第１側部１２と、第２側部１３と、外周板１４と、を有している。側部１２，１３は、円板状に形成され、互いに対向するように配置されている。外周板１４は、筒状に形成されている。外周板１４の軸線方向の各端部は、第１側部１２の外周縁部、及び第２側部１３の外周縁部にそれぞれ連なっている。回転体１１は、樹脂等により中空の円柱状に形成されている。
　例えば、外周板１４には、ゴム等により注入口１５が形成されている。注入口１５は、外周板１４を貫通し、回転体１１の内部空間に達している。回転体１１には、開閉可能な蓋部が設けられていることが好ましい。蓋部を閉じたときに、回転体１１における蓋部以外の部分に対して、蓋部が液密に接続される。
　回転体１１の側部１２，１３及び外周板１４を形成する材料は、金属や、アクリル樹脂等、特に制限されない。しかし、生体適合性・内部の視認性の観点からは、回転体１１を、射出成形により樹脂で形成することが好ましい。
　また、本明細書で言う細胞とは、スフェロイドを形成できるものであれば、特に限定はないが、例えば、動物由来細胞であり、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳動物由来細胞のことを意味する。細胞は、培養細胞として株化されたものであっても、生物組織から得られた初代細胞であってもよい。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞と言う）、間葉系幹細胞、細胞として、神経幹細胞等を用いることができ、また、分化細胞としては、肝細胞、膵島細胞、腎細胞、神経細胞、角膜内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞等を用いることができる。さらに、臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される細胞を用いることもできる。あるいは腫瘍化した細胞、遺伝子工学的手法により形質転換された細胞やウイルスベクターにより感染された細胞を用いることもできる。
　回転体１１は、図示しない支持台により中心軸Ｃ周りに回転可能に支持されている。
　回転体１１は、モータ等の駆動部により中心軸Ｃ周りに回転する。駆動部は、回転体１１の外周板１４の外面に接触してこの外面を回転させたり、回転体１１と同軸に固定されたプーリ等に巻かれたベルトを回転させることにより、駆動力を伝達させる。
　取付け部２１，２２は、筒状に形成され、回転体１１の中心軸Ｃ上にそれぞれ配置されている。第１取付け部２１は、第１側部１２のうち第２側部１３に対向する面に固定されている。第２取付け部２２は、第２側部１３のうち第１側部１２に対向する面に固定されている。第１取付け部２１と第２取付け部２２との間には、隙間が形成されている。
　取付け部２１，２２は、回転体１１と同一の材料で形成されている。
　取付け部２１，２２には、人工血管（母材）Ｄが取付けられる。ここで言う人工血管とは、合成繊維や生体材料等により形成された血管のことを意味する。人工血管Ｄは、ガス透過性を有する材料により管状に形成されている。人工血管Ｄは、人工血管Ｄの各端部を取付け部２１，２２に径方向外側から嵌め込むこと等により、取付け部２１，２２に取付けられる。
　なお、母材は人工血管Ｄであるとしたが、母材はこれに限定されず再生血管等でもよい。ここで言う再生血管とは、再生医療により形成された血管のことを意味する。
　回転体１１内には、原液Ｗが収容される。原液Ｗは、比重調整液Ｗ１と、細胞塊Ｗ２と、を含む。
　図２に示すように、細胞塊Ｗ２は、ｉＰＳ細胞由来細胞Ｗ４と、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）Ｗ５と、間葉系細胞（ＭＳＣ）Ｗ６と、を所定の比率で混ぜた混合物Ｗ２ａを、ウェル内等に集合させて共培養したものである。
　ここで言う血管内皮細胞とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞のことを意味する。ここで言う間葉系細胞とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞のことを意味するが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。
　細胞塊Ｗ２の比重は、比重調整液Ｗ１の比重よりも小さい。例えば、細胞塊Ｗ２の比重は１．０５である。
　比重調整液Ｗ１は、第１液体培地、及び生体適合性を有する比重調整剤を含む。比重調整液Ｗ１は、第１液体培地及び比重調整剤以外に、ｐＨ調整剤や懸濁剤等を含んでもよい。比重調整剤Ｗ１は、イオディキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）やフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）等でもよい。
　ここで言う第１液体培地、及び後述する第２液体培地は特に限定はなく、培養する細胞（塊）に合わせて適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭ１、ｃＲＤＦ、ＥＲＤＦ、Ｆ１２、ＭＣＤＢ１３１、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、及びＷＥ等の公知の培地を挙げることができる。また、細胞がヒト幹細胞である場合、ヒト全能性幹細胞用培地として市販されている、mTeSR1（Stem Cell Tech.社製）、Essential 8（登録商標、Life Technologies社製）、Ripro FF/FF2/XF（リプロセル社製）、StemSure（登録商標、和光純薬社製）、CELRENA（細胞科学研究所製）、S-Medium（DSファーマ社製）、StemFit（味の素社製）等を用いることができる。
　また、ここで言う生体適合性とは、生体に強い悪影響や強い刺激を与えないことから、生体成分、細胞（塊）等の生体組織、及び生体由来の物質のいずれか１つ以上と共存することが可能である属性を意味する。
　例えば、第１液体培地は、細胞塊Ｗ２を肝臓に分化させるものが用いられている。第１液体培地の比重は、約１．０である。
　比重調整剤は、細胞分離用の密度勾配媒体であることが好ましい。密度勾配媒体として、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）が用いられる。例えば比重調整液Ｗ１の比重は、１．０６以上１．０８以下である。ただし、細胞塊Ｗ２の比重が比重調整液Ｗ１の比重よりも小さければ、比重調整液Ｗ１の比重は、例えば１．０３以上１．１５以下、１．０１以上１．２０以下とすることができる。
　比重調整液Ｗ１中の比重調整剤の濃度は、比重調整液Ｗ１が細胞塊Ｗ２に害を与えない程度の濃度であることが好ましい。
　図１に示すように、例えば、供給部２６は、本体２７と、供給配管２８と、排出配管２９と、を有している。供給配管２８と第１取付け部２１とは、互いに連通している。排出配管２９と第２取付け部２２とは、互いに連通している。
　例えば、本体２７は、図示はしないが、供給タンク、ポンプ、廃棄タンクを有している。供給タンク内には、第２液体培地（液体培地）が収容されている。第２液体培地は特に限定されないが、第１液体培地と同一であってもよい。
　ポンプは、供給タンク内の第２液体培地を一定の流速で供給配管２８に供給する。供給部２６は、回転体１１内に第２液体培地を供給する。排出配管２９を通して本体２７に戻された使用済みの第２液体培地は、廃棄タンク内に収容される。
　なお、供給部２６は、第２液体培地に代えて血液や人工血液等を供給してもよい。
　次に、本実施形態の細胞塊を集合させる方法（以下、集合方法とも略して言う）について説明する。図３は、本発明の一実施形態における集合方法Ｓを示すフローチャートである。
　まず、取付け工程（図３に示すステップＳ１）において、回転体１１の蓋部を開け、人工血管Ｄの各端部を取付け部２１，２２に嵌め込む。これにより、回転体１１の中心軸Ｃ上に人工血管Ｄを配置する。人工血管Ｄの各端部と取付け部２１，２２との間は、液密に封止される。人工血管Ｄの配置後、回転体１１の蓋部を閉じる。取付け工程Ｓ１が終了すると、ステップＳ３に移行する。
　次に、充填工程（ステップＳ３）において、注射器等により注入口１５を通して回転体１１内に比重調整液Ｗ１を充填する。このとき、回転体１１内に気泡が残らないように比重調整液Ｗ１を充填することが好ましい。
　次に、脱気工程（ステップＳ５）において、比重調整液Ｗ１が収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。空気の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、空気に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して空気が中心軸Ｃの径方向外側から中心軸Ｃに向かって移動する。回転体１１内の空気は、人工血管Ｄ上に集約する。人工血管Ｄはガス透過性を有するため、空気が回転体１１内から人工血管Ｄの血管壁を通して人工血管Ｄ内に除去される。
　この脱気工程Ｓ５は、後述する細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。
　次に、細胞注入工程（ステップＳ７）において、注射器等により注入口１５を通して回転体１１内に複数の細胞塊Ｗ２を注入する。回転体１１内の比重調整液Ｗ１は生体適合性を有するため、複数の細胞塊Ｗ２は比重調整液Ｗ１内で生存を続けることができる。
　次に、細胞塊集合工程（ステップＳ９）において、比重調整液Ｗ１と複数の細胞塊Ｗ２とが収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。細胞塊Ｗ２の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、細胞塊Ｗ２に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して複数の細胞塊Ｗ２が中心軸Ｃに向かって移動する。図４に示すように複数の細胞塊Ｗ２は、中心軸Ｃ上に配置された人工血管Ｄの外周面に集合する。
　この細胞塊集合工程Ｓ９は、供給部２６により人工血管Ｄ内に第２液体培地を供給させながら行ってもよい。このようにすることで、第２液体培地中の栄養や酸素等が細胞塊Ｗ２に供給される。
　以上により、集合方法Ｓの全工程が終了する。
　本実施形態の集合方法Ｓを宇宙空間等の重力が作用しない場所、又は地球の重力に比べて小さい重力しか作用しない場所で行うと、回転体１１が中心軸Ｃ周りに回転しなくても、比重調整液Ｗ１中で細胞塊Ｗ２が沈降しにくい。回転体１１を中心軸Ｃ周りに回転させることにより、細胞塊Ｗ２を安定化して集合させることができる。
〔シミュレーション結果〕
　以下では、重力が作用する地上において、回転する回転体１１中で複数の細胞塊Ｗ２が移動する様子をシミュレーションした結果について説明する。
　回転体１１の直径を２０ｍｍ、厚さを１０ｍｍとし、側部１２，１３及び外周板１４の厚さは無視した。回転体１１は、中心軸Ｃが水平面に沿って配置されているとした。
　細胞塊Ｗ２の径を１００μｍ（マイクロメートル）、比重を１．０５とした。回転体１１内に供給される細胞塊Ｗ２の数は、６００とした。比重調整液Ｗ１の比重を１．０８とした。人工血管Ｄの径を１ｍｍとした。重力が図５に示す下方Ａに向かって１Ｇ（９．８ｍ／ｓ２）で作用するとした。回転体１１の中心軸Ｃ周りの回転速度を、１５０ｒｐｍ（回転／分）とした。
　回転体１１が回転する前の初期状態では、図５に示すように、複数の細胞塊Ｗ２が比重調整液Ｗ１内でほぼ均等に分散しているとする。回転体１１が中心軸Ｃ周りに４分間、８分間、及び１２分間回転したときの状態を、図６、図７、及び図８にそれぞれ示す。回転体１１が中心軸Ｃ周りに回転する時間が長くなるに従い、複数の細胞塊Ｗ２が人工血管Ｄに近付くように移動する。１２分間回転した図８に示す状態では、人工血管Ｄ周囲に細胞塊Ｗ２が集合することが分かった。
　以上説明したように、本実施形態の集合方法Ｓ及び集合装置１によれば、回転体１１を中心軸Ｃ周りに回転させると、比重調整液Ｗ１の比重と細胞塊Ｗ２の比重との差で生じる向心力により、比重調整液Ｗ１に対して複数の細胞塊Ｗ２が中心軸Ｃの径方向外側から中心軸Ｃに向かって移動する。比重調整液Ｗ１は生体適合性を有するため、複数の細胞塊Ｗ２を生存したまま中心軸Ｃ上に集合させることができる。
　取付け部２１，２２により回転体１１の中心軸Ｃ上に人工血管Ｄを配置した状態で、細胞塊集合工程Ｓ９を行う。これにより、複数の細胞塊Ｗ２を人工血管Ｄ上に集合させることができる。
　供給部２６により人工血管Ｄ内に第２液体培地を供給させながら、細胞塊集合工程Ｓ９を行う。このため、人工血管Ｄを通して第２液体培地中の栄養や酸素等を複数の細胞塊Ｗ２に供給することができる。
　集合方法Ｓにおいて、脱気工程Ｓ５を行う。これにより、回転体１１内に空気が入っていても、その空気により比重調整液Ｗ１内の流れが乱れることを抑制して、細胞塊Ｗ２を確実に集合させることができる。
　脱気工程Ｓ５は、細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。従って、回転体１１内に空気が無い状態から、細胞塊集合工程Ｓ９において細胞塊Ｗ２をさらに確実に集合させることができる。
　以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の構成の変更、組み合わせ、削除等も含まれる。
　例えば、前記実施形態では、集合装置１は、取付け部２１，２２を備えなくてもよい。この場合、集合方法Ｓでは取付け工程Ｓ１は行われない。人工血管Ｄを取付けずに細胞塊Ｗ２を集合させると、細胞塊Ｗ２は中心軸Ｃの周辺（中心軸Ｃ上）に集合する。中心軸Ｃ上の向心力が弱い場合には、細胞塊Ｗ２は管状に集合する。
　集合装置１は、供給部２６を備えなくてもよい。集合方法Ｓでは、脱気工程Ｓ５を細胞塊集合工程Ｓ９と同時に行ってもよいし、脱気工程Ｓ５を行わなくてもよい。
　比重調整液の比重よりも細胞塊Ｗ２の比重が小さい場合には、比重調整液が比重調整剤を含まずに、第１液体培地を含んで構成されるようにしてもよい。
〔実施例〕
　以下では、本発明の実施例及び比較例を具体的に示してより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　表１に示すように、比重調整剤としてサンプルＮｏ．１～Ｎｏ．６のものを検討した。
　回転体の中心軸上に、人工血管を配置した。ｉＰＳ細胞由来の肝前駆細胞、血管内皮細胞及び間葉系細胞を所定の比率で混ぜて細胞塊を作成した。図９に示すように、回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた。回転体は、回転速度１５０ｒｐｍで、１２分間回転させた。
　なお、比重調整剤（比重調整液）が合格となる判断基準は、比重調整剤が生体適合性を有し、細胞塊よりも比重が大きく、比重調整剤内で複数の細胞塊が生存することである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例１）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．１のリンパ球分離溶液（ナカライテスク株式会社製）を、第１液体培地に７０％（重量％）混合させて比重調整液を作成した。この場合、比重調整液中の３０％が第１液体培地である。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例２）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．２のＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）を、第１液体培地に１４％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６～１．０７であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、図１０、及び図１１において矢頭に示すように、クサビラオレンジを発現した血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ　３－４細胞（ｉＰＳ細胞）由来肝前駆細胞を含む細胞塊は、人工血管上に集合した。この際、図１２に示すように、複数の細胞塊が蛍光発現を保持、すなわち生存しており、合格となることが分かった。
（実施例３）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．３のＯｐｔｉＰｒｅｐを、第１液体培地に１５％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ　３－４細胞は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例４）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．４のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標、ＧＥヘルスケア株式会社製）を、第１液体培地に７０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは８．１であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞及び間葉系細は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（比較例１）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．５のポリタングステン酸ナトリウムを、第１液体培地に６％～８％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは６．６であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、人工血管から細胞塊が剥がれ、細胞塊が壊死してしまうことが分かった。複数の細胞塊が生存できず、不合格であった。
（比較例２）
　比重調整剤として、サンプルＮｏ．６のメチルセルロースを、第１液体培地に０．１０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は、０．９８であった。この比重調整液よりも比重が小さい細胞塊は想定されないため、不合格であった。
　本実施形態の細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置は、細胞塊を集合させるため等に好適に用いることができる。
　１　　集合装置（細胞塊を集合させる装置）
　１１　回転体
　２１　第１取付け部（取付け部）
　２２　第２取付け部（取付け部）
　２６　供給部
　Ｃ　　中心軸
　Ｄ　　人工血管（母材）
　Ｓ　　集合方法（細胞塊を集合させる方法）
　Ｓ５　脱気工程
　Ｓ９　細胞塊集合工程
　Ｗ１　比重調整液
　Ｗ２　細胞塊

Claims (10)

  1. 　生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行う細胞塊を集合させる方法。
  2. 　前記細胞塊集合工程では、前記回転体を前記回転体の中心軸周りに回転させて、前記中心軸の周辺に前記細胞塊を集合させる請求項１に記載の細胞塊を集合させる方法。
  3. 　前記回転体の前記中心軸上に母材を配置した状態で、前記細胞塊集合工程を行う請求項２に記載の細胞塊を集合させる方法。
  4. 　前記母材内に液体培地を供給させながら、前記細胞塊集合工程を行う請求項３に記載の細胞塊を集合させる方法。
  5. 　前記回転体を回転させて、前記回転体内の空気を前記母材上に集約して前記母材を通して前記回転体内から前記空気を除去する脱気工程を行う請求項３又は４に記載の細胞塊を集合させる方法。
  6. 　前記脱気工程は、前記細胞塊集合工程よりも前に行う請求項５に記載の細胞塊を集合させる方法。
  7. 　前記母材は人工血管又は再生血管である請求項３から６のいずれか１項に記載の細胞塊を集合させる方法。
  8. 　生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体を備える細胞塊を集合させる装置。
  9. 　前記回転体の中心軸上に母材を取付けるための取付け部を備える請求項８に記載の細胞塊を集合させる装置。
  10. 　前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備える請求項９に記載の細胞塊を集合させる装置。
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