JP7322707B2 - ベージュおよび白色脂肪細胞への分化誘導および生産法 - Google Patents
ベージュおよび白色脂肪細胞への分化誘導および生産法 Download PDFInfo
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Description
[1]脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法。
[2]該間葉系細胞が、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、又は線維芽細胞である、[1]記載の方法。
[3]該高分子化合物が多糖類である、[1]又は[2]記載の方法。
[4]該多糖類がグルクロン酸部位を含む、[3]記載の方法。
[5]該多糖類が脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩である、[4]記載の方法。
[6]該多糖類が脱アシル化ジェランガム又はその塩であり、該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が0.01~0.05%(w/v)である、[5]記載の方法。
[7]該多糖類がダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩であり、該培地組成物中のダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩の濃度が0.01~0.5%(w/v)である、[5]記載の方法。
[8]該培地組成物が、2価金属カチオンを含有する、[1]~[7]の何れかに記載の方法。
[9]2価金属カチオンがカルシウムイオンである、[8]記載の方法。
[10]該培地組成物が脂肪細胞分化誘導因子を含有する、[1]~[9]の何れかに記載の方法。
[11]脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸、トリヨードチロニン、及びPPARγ作動剤からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、[10]記載の方法。
[12]脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む、[11]記載の方法。
[13]グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、[12]記載の方法。
[14]シクロオキシゲナーゼ阻害剤がインドメタシンである、[12]又は[13]記載の方法。
[15]脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、[11]記載の方法。
[16]グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、[15]記載の方法。
[17]cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンである、[15]又は[16]記載の方法。
[18]単胞性脂肪細胞がUCP-1陽性である、[1]~[17]の何れかに記載の方法。
[19]浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該高分子化合物濃度を、該間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させ、浮遊状態を維持する単胞性脂肪細胞を回収することを更に含む、[1]~[18]の何れかに記載の方法。
本発明に用いられる培地組成物は、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物である。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、培養対象の細胞(即ち、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞)を培養することを可能にする。当該培地組成物は、WO2014/017513 A1及びUS2014/0106348 A1の記載に従い、調製することが可能である。以下、当該培地組成物を培地組成物Iと称することがある。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
DAG又はその塩:0.005~0.02%(好ましくは0.01~0.02%)(w/v)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.01~0.4%(w/v)
アルギン酸ナトリウム:0.0001~0.4%(w/v)(好ましくは、0.1~0.4%(w/v))
ネイティブジェランガム:0.0001~0.4%(w/v)
ローカストビーンガム:0.1~0.4%(w/v)
メチルセルロース:0.1~0.4%(w/v)(好ましくは0.2~0.4%(w/v))
カラギーナン:0.05~0.1%(w/v)
ダイユータンガム:0.01~0.1%(w/v)
本態様の培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、例えば0.002~0.01 (w/v)%、好ましくは0.002~0.009 (w/v)%、より好ましくは0.003~0.009 (w/v)%である。本態様の培地組成物中のアルギン酸又はその塩の濃度は、例えば、0.004~0.1 (w/v)%、好ましくは0.004~0.02 (w/v)%、より好ましくは0.004~0.015 (w/v)%であり、更に好ましくは0.005~0.015 (w/v)%である。
本態様の培地組成物中に含まれる、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、アルギン酸又はその塩の質量比は、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を1質量部以上、好ましくは2質量部以上とする。一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を例えば1~4質量部、好ましくは1~3質量部、より好ましくは1~2質量部とする。
濃度[%(w/v)]=特定化合物の重量(g)/培地組成物の容量(ml)×100
哺乳動物由来の細胞(又は組織)の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。
本発明は、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、上記培地組成物I中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法(以下、本発明の製造方法1と称する)を提供するものである。
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤(インドメタシン等);
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤(3-イソブチル-1-メチルキサンチン等);
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(コルチゾール等)、及びトリヨードチロニン(T3)(DIABETES, 45, 1435-1438, 1996);
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、シクロオキシゲナーゼ阻害剤(インドメタシン等)、及びトリヨードチロニン(T3)
等を挙げることができるが、これらに限定されない。
インスリンは、例えば、1~100μg/mlの濃度で添加する。
グルココルチコイド受容体作動剤(例、デキサメタゾン)は、種類により異なるが、例えば、0.1~100μMの濃度で添加する。
cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤(例、3-イソブチル-1-メチルキサンチン)は、種類により異なるが、例えば、0.1~10mMの濃度で添加する。
シクロオキシゲナーゼ阻害剤(例、インドメタシン)は、種類により異なるが、例えば、0.01~1000μMの濃度で添加する。
プロスタグランジン(例、PGJ2)は、種類により異なるが、例えば、1~100μMの濃度で添加する。
長鎖脂肪酸(例、アラキドン酸)は、種類により異なるが、例えば、0.5~500μMの濃度で添加する。
PPARγ作動剤(例、ピオグリタゾン)は、種類により異なるが、例えば、1~100μMの濃度で添加する。
本発明は、
(1)脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞及び/又は単胞性脂肪細胞(白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む)、及び
(2)培地組成物I
を含む、培養調製物を提供する。本発明の培養調製物において、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞及び/又は単胞性脂肪細胞(白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む)は、培地組成物I中に浮遊した状態で存在し得る。
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤(インドメタシン等);
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤(3-イソブチル-1-メチルキサンチン等);
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(コルチゾール等)、及びトリヨードチロニン;並びに
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤(デキサメタゾン等)、シクロオキシゲナーゼ阻害剤(インドメタシン等)、及びトリヨードチロニン。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.010%あるいは0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、33333細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したあるいは添加しないヒト脂肪細胞分化培地組成物(未添加、0.010%、0.015%)にそれぞれ播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3474)のウェルに1ウェル当たり150μLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、12日間継続した。ヒト前駆脂肪細胞が接着できる通常のプレートを用いた単層培養法として、5000細胞/mLとなるようにヒト脂肪細胞分化培地あるいはヒト前駆脂肪細胞増殖培地(#CAS11K500、東洋紡社製)にそれぞれ播種した後、96ウェル平底マイクロプレート(コーニング社製、#3585)のウェルに1ウェル当たり150μLになるように分注した。ヒト脂肪細胞分化培地で播種した細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、12日間継続した。一方、ヒト前駆脂肪細胞増殖培地で播種した細胞を、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、4日間継続した後、培地をヒト脂肪細胞分化培地に交換し、さらに12日間培養を継続した。培養完了後にそれぞれ写真撮影を実施した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、30000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、8日間継続した。mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれに脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、それぞれのウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から18日目まで、つまり再播種後10日間継続した。上清部分を継続して培養したサンプル名をsup (10⇒18)に、沈降部分を継続して培養したサンプル名をbottom(10⇒18)とした。培養開始から18日目に、mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれに脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、それぞれのウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から26日目まで、つまり再々播種後8日間継続した。すでに上清部分に存在した脂肪様細胞・sup (10⇒18)を継続して浮遊状態で培養したサンプル名をsup(10⇒26)に;bottom(10⇒18)サンプルを培養し、遠心にて上清部分を分取し、継続して培養したサンプル名はsup (18⇒26)に、沈降部分を分取し継続して培養したサンプル名はbottom(10⇒26)とした。
PPIA:HS99999904
PPAR gamma:HS011155134
FABP4:HS01086177
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、30000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)にそれぞれ播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、10日間継続した。mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、沈降部分2.5mLのみを分取して脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、15mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた(サンプル名はsup20とbottom20)。また別のウェルの細胞懸濁液を、遠心操作(400g、3分間)に付し、上清部分2.5mLを分取して、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再々播種から10日間継続した。すでに上清部分に存在したsup20を継続して培養したサンプル名をsup(20⇒30)とした。
PPIA:HS99999904
PPAR gamma:HS011155134
LPL:HS00173425
先述したsup(20⇒30)細胞を用いて、oil-Red法による細胞内脂肪滴の染色を実施した。剥離防止処理済みスライドガラス(マツナミガラス社製、APSコート)に細胞懸濁液3μLを滴下し、試薬1液(Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製)を2μL添加しピペッティングした。次に試薬2液(Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製)を5μL加えて素早く2回ピペッティングし、そのままスライドガラスに塗り広げ、約2分間静置して固めた。次にDiluted Lipid Droplets Assay Fixative(adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)を75μL滴下し、15分間静置した。さらにWash Solution (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)を100μL滴下し5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。次に、Oil Red O (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)75μLを滴下し、約20分間静置した後、蒸留水で洗浄した。この洗浄操作は洗浄液がピンク色にならなくなるまで繰り返した。Wash Solution (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)100μLを滴下し、約5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。その後、顕微鏡観察を実施した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から21日目まで、つまり再播種から11日間継続した。培養開始から21日目に、15mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、上清部分5mLと沈降部分5mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた(サンプル名はsup21とbottom21)。また別のウェルの細胞懸濁液を50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から36日目まで、つまり再々播種から15日間継続した。培養開始から36日目に50mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作(400g、3分間)を行い、上清部分10mLと沈降部分10mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた(サンプル名はsup36とbottom36)。
PPIA:HS99999904
PPAR gamma:HS011155134
UCP-1:HS00222453
先述したbottom36細胞を用いて、oil-Red法による細胞内脂肪滴の染色を実施した。剥離防止処理済みスライドガラス(マツナミガラス社製、APSコート)に細胞懸濁液3μLを滴下し、試薬1液(Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製)を2μL添加しピペッティングした。次に試薬2液(Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製)を5μL加えて素早く2回ピペッティングし、そのままスライドガラスに塗り広げ、約2分間静置して固めた。次にDiluted Lipid Droplets Assay Fixative(adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)を75μL滴下し、15分間静置した。さらにWash Solution (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)を100μL滴下し5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。次に、Oil Red O (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)75μLを滴下し、約20分間静置した後、蒸留水で洗浄した。この洗浄操作は洗浄液がピンク色にならなくなるまで繰り返した。Wash Solution (adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製)100μLを滴下し、約5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。その後、顕微鏡観察を実施した。
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)あるいは10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、1 μg/mLインスリン、2 μMデキサメサゾン、500 μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IDI分化誘導材、Takara社、Takara-Bio AdipoInducer Reagent)を含むDMEM培地(WAKO社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)又は10%FBS含有IDI分化培地組成物(0.015%)に懸濁し、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mL又は10%FBS含有IDI分化培地組成物5mLをそれぞれ添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mL又は10%FBS含有IDI分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から31日目および40日目まで、つまり再播種から11日間および20日間継続した。培養開始から10日目、20日目、31日目、40日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。
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UCP-1:HS00222453
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(C-12977、タカラバイオ社製)を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)に懸濁した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再播種から10日間および20日間継続した。培養開始から10日目、20日目、30日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた
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ダイユータンガム(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.03%(w/v)のダイユータンガムを添加した培地組成物を調製した。キサンタンガム(KELTROL CG、三晶株式会社製)を1%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.03%(w/v)のキサンタンガムを添加した培地組成物を調製した。また脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを添加した各ヒト脂肪細胞分化培地組成物に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、9日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再播種から10日間および20日間継続した。培養開始から9日目、20日目、30日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。
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UCP-1:HS00222453
脱アシル化ジェランガム(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製)を0.3%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地(#CAS11D250、東洋紡社製)に終濃度0.015%(w/v)の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞(皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製)を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物(0.015%)に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始20日目に細胞懸濁液を50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再々播種から10日間継続した。
白色脂肪細胞の生産は、30日目の分化した脂肪細胞を含む細胞懸濁液を、6 well トランスウェルプレート(Preset VECELL(R) 30/6well(1) #PSVC30-1、べセル)の上部ウェル部分に播種した。トランスウェルの下部ウェル部分にフィルターを通し染み出てくる分化培地を取り除き、上記ウェルに10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、1 μg/mLインスリン、2 μMデキサメサゾン(Takara社、Takara-Bio AdipoInducer Reagent)および1 nM T3 (3,3′,5-トリヨード-L-チロニン、#T2877、シグマアルドリッチ)および125 nM インドメタシン(#I7378、シグマアルドリッチ)を含むDMEM培地(WAKO社製)、以下(白色脂肪培地)に添加し、培地交換を実施し培養を培養開始59日目まで継続した。トランスウェル中の白色脂肪培地の交換は、39日目と50日目に実施した。培養開始から20日目、30日目、39日目、59日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。
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UCP-1:HS00222453
Adiponectin : Hs00605917
Leptin : Hs00174877
Claims (15)
- 脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、多糖類を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養し、UCP-1陽性である単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性ベージュ脂肪細胞の製造方法であって、ここで、該多糖類が、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩である、方法。
- 該間葉系細胞が、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、又は線維芽細胞である、請求項1記載
の方法。 - 該多糖類が脱アシル化ジェランガム又はその塩であり、該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が0.01~0.05%(w/v)である、請求項1又は2記載の方法。
- 該多糖類がダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩であり、該培地組成物中のダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩の濃度が0.01~0.5%(w/v)である、請求項1又は2記載の方法。
- 該培地組成物が、2価金属カチオンを含有する、請求項1~4の何れか1項記載の方法。
- 2価金属カチオンがカルシウムイオンである、請求項5記載の方法。
- 該培地組成物が脂肪細胞分化誘導因子を含有する、請求項1~6の何れか1項記載の方法。
- 脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸、トリヨードチロニン、及びPPARγ作動剤からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、請求項7記載の方法。
- 脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む、請求項8記載の方法。
- グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、請求項9記載の方法。
- シクロオキシゲナーゼ阻害剤がインドメタシンである、請求項9又は10記載の方法。
- 脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、請求項8記載の方法。
- グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、請求項12記載の方法。
- cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンである、請求項12又は13記載の方法。
- 浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該多糖類濃度を、該間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させ、浮遊状態を維持する単胞性ベージュ脂肪細胞を回収することを更に含む、請求項1~14の何れか1項記載の方法。
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