WO2017057599A1 - 癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法 - Google Patents

癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法 Download PDF

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WO2017057599A1
WO2017057599A1 PCT/JP2016/078865 JP2016078865W WO2017057599A1 WO 2017057599 A1 WO2017057599 A1 WO 2017057599A1 JP 2016078865 W JP2016078865 W JP 2016078865W WO 2017057599 A1 WO2017057599 A1 WO 2017057599A1
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cells
cancer
culture
medium
cell
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PCT/JP2016/078865
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Inventor
北原　真樹
泰斗 西野
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日産化学工業株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the present invention relates to a method for co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer.
  • Cancer tissue is formed of cancer cells, various cell groups other than cancer cells, extracellular matrix, and cell stroma components.
  • cancer cell characteristics studies and anticancer drug studies have been conducted by culturing cancer cells alone. In some cancer cells, these studies have revealed the characteristics of innovative cancer cells, leading to the development of innovative anticancer agents.
  • no ground-breaking or fundamental treatment has yet been found. The reason for this is that conventional cancer cell research was based on anchor-dependent monolayer culture of cancer cells and culture of cancer cells alone.
  • cancer cells in actual cancer tissues are in a three-dimensional environment independent of anchorage, and there are various cell groups (pericancer cells: CAF) and extracellular matrix (ECM) around cancer cells. ) Exists.
  • CAF pericancer cells
  • ECM extracellular matrix
  • Non-patent Document 1 Cancer progression including invasion, metastasis, and proliferation including EMT is conferred to confer resistance and malignancy.
  • Non-patent Document 2 Anchorage-independent growth of cancer cells is maintained in a cell environment peculiar to cancer tissues, and is strongly influenced by the microenvironment in the growth, invasion, and metastasis of cancer cells. Therefore, a culture technique that more closely reproduces the characteristics of cancer cells in cancer tissue in vitro is required for cancer research and technological anticancer drug development. Cancer treatment targeting CAF is thought to be difficult to make resistant, and may lead to new cancer treatment such as maintaining the tumor in a dormancy state.
  • heterogeneous cell co-culture systems have been devised as a technique for reproducing the cancer tissue environment. Many of them use devices such as insert wells and culture cassettes, or make full use of collagen gel embedding technology (Non-patent Documents 3 and 4).
  • heterogeneous cells are physically separated by separating the cells in the outer well from the cells in the encapsulated well, or by placing one cell in the gel and the other cell outside the gel. It is an indirect co-culture technique.
  • cancer cells and cells surrounding the cancer coexist in close proximity without being physically separated as such. Therefore, in order to reproduce the environment closer to the in vivo cancer tissue, it is necessary to construct an appropriate direct co-culture system.
  • the indirect co-culture system requires a special culture apparatus, is complicated in operation, and cannot perform high-throughput screening of drugs such as anticancer agents. In addition, it is difficult to collect cells after culturing.
  • the animal and plant cells and / or tissues can be allowed to remain static without substantially increasing the viscosity of the liquid medium. It has been reported that suspension culture can be performed in a placed state, and that the cell proliferation activity is enhanced by culturing using the medium composition containing the structure (Patent Document 1).
  • an amorphous structure is obtained by linking a polymer compound having an anionic functional group such as deacylated gellan gum via a metal ion (eg, divalent metal ion such as calcium ion). This forms a three-dimensional network in the medium, which becomes a carrier for floating cells and the like.
  • An object of the present invention is to provide a technique for co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer under an environment as similar as possible to cancer tissue in a living body.
  • the present inventors have determined that cells surrounding cancer are suspended in a state where cancer cells are suspended in a medium composition in which cells or tissues containing deacylated gellan gum and the like are suspended and cultured in the same culture vessel.
  • a medium composition in which cells or tissues containing deacylated gellan gum and the like are suspended and cultured in the same culture vessel.
  • the present invention is as follows: [1] In a medium composition containing a structure capable of culturing cells or tissues in a suspended state, including culturing cancer cells in a suspended state and cells surrounding the cancer adhered to a solid phase, A method of co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer. [2] The method according to [1], wherein the cancer cells have the ability to form a solid tumor. [3] The method according to [1] or [2], wherein the surrounding cancer cells are any cells selected from the group consisting of fibroblasts, stellate cells, and vascular endothelial cells. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the structure comprises deacylated gellan gum.
  • a screening method for an anticancer agent comprising the following steps: (1) co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer by the method according to any one of [1] to [6] in the presence of a test substance; (2) Measure the number of cancer cells surviving after culturing in (1), and (3) a control in which the number of cancer cells surviving in (2) was cultured in the absence of the test substance Compare with the number of cancer cells surviving.
  • cancer cells can be directly co-cultured with cells surrounding cancer in an anchorage-independent state. Therefore, studies on characterization of various cancer cells in cancer tissues in vivo and various types of anticancer agents Promote exploration and development research.
  • an anticancer agent can be screened in an environment similar to that of a cancerous tissue in vivo, so that an anticancer agent that exerts an antitumor effect even in vivo cancerous tissue affected by surrounding cancer cells can be selected with high efficiency. can do.
  • the present invention provides a cancer cell / surround cancer cell co-culture system that is simple and applicable to high-throughput screening corresponding to multiwell culture plates such as 96-well culture plates and 384-well culture plates.
  • Proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts in DAG medium Proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts on Preset VECELL. Effect of Gefitinib on proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of MK2206 on proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of Trametinib on proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of CYT387 on proliferation of A549 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts in DAG medium.
  • Proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts on Preset VECELL Effect of Paclitaxel on proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of Gefitinib on proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of MK2206 on proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of Trametinib on proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts. Effect of CYT387 on proliferation of MCF7 cells in single culture or co-culture with fibroblasts.
  • the present invention provides a technique for co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer in a medium composition capable of culturing cells and tissues while maintaining a floating state. To do.
  • the medium composition makes it possible to culture cancer cells to be evaluated and tissues containing the same while maintaining a floating state.
  • the medium composition can be prepared according to the description of WO 2014/017513 A1.
  • the culture medium composition may be referred to as culture medium composition I.
  • a cell is the most basic unit constituting an animal, and has, as its elements, a cytoplasm and various organelles inside a cell membrane.
  • the cancer cells and surrounding cancer cells used in the present invention are mammalian cells.
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, rabbit eyes such as rabbits, ungulates such as pigs, cows, goats, horses, and sheep, cats such as dogs and cats, and humans Primates such as monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans and chimpanzees.
  • the mammal is preferably a rodent (such as a mouse) or a primate, more preferably a human.
  • cancer examples include, but are not limited to, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell cancer, basal cell cancer, Adenocarcinoma, bone marrow cancer, renal cell cancer, ureter cancer, liver cancer, bile duct cancer, cervical cancer, endometrial cancer, testicular cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, craniopharyngeal cancer, Laryngeal cancer, tongue cancer, fibrosarcoma, mucosal sarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, hemangiosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphatic endothelial sarcoma, synovial, mesothelioma, Ewing tumor, smooth Myoma, rhabdomyosarcom
  • the cancer cell may be a cancer cell (primary culture) isolated from a cancer tissue collected from a cancer patient with an enzyme or the like, or may be a established cancer cell line.
  • cancer cell lines include, but are not limited to, human breast cancer cell lines HBC-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7 / ADR RES, HS578T, MDA- MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, T47D, HeLa as human cervical cancer cell line, A549 as human lung cancer cell line, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114, Caco-2, COLO-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29 as human colon cancer cell lines KM-12, SW-620, WiDr, human prostate cancer cell line DU-145, PC
  • cell lines include, but are not limited to, HEK293 (human embryonic kidney cells), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, NIH3T3, PC12, S2 , Sf9, Sf21, High® Five (registered trademark), Vero, and the like.
  • the floating of cells (or cell aggregates) and / or tissues in the present invention means a state in which cells (or cell aggregates) and / or tissues can contact the bottom surface but do not adhere to the culture vessel (non-adhesion). ). Furthermore, in the present invention, when cells (or cell aggregates) and / or tissues are grown, differentiated or maintained, external pressure or vibration to the liquid medium composition, shaking in the composition, rotation operation, etc. A state in which cells (or cell aggregates) and / or tissues are uniformly dispersed in the liquid medium composition and are in a floating state without being accompanied by “floating standing”. Cultivation) and / or tissue culture is referred to as “floating stationary culture”. In addition, the period that can be floated in “floating standing” includes 5 minutes or more, 1 hour or more, 24 hours or more, 48 hours or more, 7 days or more, etc. It is not limited to.
  • the medium composition used in the present invention is a suspension of cells (or cell aggregates) and / or tissues in at least one point in a temperature range (for example, 0 to 40 ° C.) in which cells and tissues can be maintained and cultured. Is possible.
  • the medium composition used in the present invention is preferably capable of allowing cells (or cell aggregates) and / or tissues to float in suspension at least at one point in the temperature range of 25 to 37 ° C., and most preferably at 37 ° C. .
  • Whether or not the suspension can be suspended is determined by, for example, dispersing the cells to be cultured at a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / ml uniformly in the medium composition to be evaluated and injecting 10 ml into a 15 ml conical tube. By standing at 37 ° C for at least 5 minutes or more (eg, 1 hour or more, 24 hours or more, 48 hours or more, 7 days or more), and observing whether or not the floating state of the cells is maintained Can be evaluated. If more than 70% of all cells are floating, it can be concluded that the floating state was maintained. Instead of cells, polystyrene beads (Size 500-600 ⁇ m, manufactured by Polysciences Inc.) may be substituted for evaluation.
  • the medium composition used in the present invention is a composition containing a structure and a medium in which cells (or cell aggregates) or tissues can be suspended and cultured (preferably capable of floating stationary culture).
  • the medium composition used in the present invention is preferably a composition capable of recovering cells (or cell aggregates) or tissues from the medium composition after replacement of the medium composition at the time of culture and after completion of the culture. More preferably, the composition does not require any temperature change, chemical treatment, enzyme treatment, or shearing force when cells (or cell aggregates) or tissues are collected from the medium composition.
  • the structure in the present invention is formed from a specific compound and exhibits the effect of uniformly floating cells (or cell aggregates) and / or tissues.
  • the structure of the present invention includes the microgel as one embodiment.
  • the film-like structure is mentioned as the one aspect
  • the size of the structure in the present invention is preferably one that passes through a filter having a pore diameter of 0.2 ⁇ m to 200 ⁇ m when filtered through a filter.
  • the lower limit of the pore diameter is more preferably more than 1 ⁇ m, and more preferably more than 5 ⁇ m in consideration of stably floating cells (or cell aggregates) or tissues.
  • the upper limit of the pore diameter is more preferably 100 ⁇ m or less, and even more preferably 70 ⁇ m or less considering the size of cells (or cell aggregates) or tissue.
  • the specific compound in the present invention forms an amorphous structure when the specific compound is mixed with a liquid medium, the structure is uniformly dispersed in the liquid, and substantially increases the viscosity of the liquid. It has the effect of substantially retaining the cells and / or tissues and preventing their sedimentation.
  • Does not substantially increase the viscosity of the liquid means that the viscosity of the liquid does not exceed 8 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of the liquid (that is, the viscosity of the medium composition used in the present invention) is 8 mPa ⁇ s or less, preferably 4 mPa ⁇ s or less, more preferably 2 mPa ⁇ s or less at 37 ° C. is there.
  • the structure is formed in a liquid medium, and the cell (or cell aggregate) and / or tissue is uniformly suspended (preferably allowed to stand still) without substantially increasing the viscosity of the liquid. As long as it shows, the chemical structure, molecular weight, physical properties, etc.
  • the viscosity of the liquid containing the structure can be measured, for example, by the method described in the examples described later. Specifically, E type viscometer under the condition of 37 ° C (Toki Sangyo Co., Ltd., TV-22 type viscometer, model: TVE-22L, cone rotor: standard rotor 1 ° 34 ⁇ ⁇ R24, rotation speed 100rpm) Can be measured.
  • the medium composition used in the present invention can achieve improvement in the engraftment rate and viability in the living body when transplanted to a recipient mammal by suspension culture of cancer cells in the medium composition.
  • the viscosity of the medium composition used in the present invention is substantially increased, it does not prevent the viscosity of the medium composition from being increased by the specific compound (the viscosity of the liquid exceeds 8 mPa ⁇ s). (Viscosity does not exceed 8 mPa ⁇ s).
  • the viscosity of the medium composition used in the present invention is 8 mPa ⁇ s or less, preferably 4 mPa ⁇ s or less, more preferably 2 mPa ⁇ s or less at 37 ° C.
  • Examples of the specific compound used in the present invention include, but are not particularly limited to, a polymer compound, preferably a polymer compound having an anionic functional group.
  • examples of the anionic functional group include a carboxy group, a sulfo group, a phosphate group, and salts thereof, and a carboxy group or a salt thereof is preferable.
  • the polymer compound used in the present invention one having one or more selected from the group of anionic functional groups can be used.
  • the polymer compound used in the present invention include, but are not particularly limited to, a polysaccharide obtained by polymerizing 10 or more monosaccharides (for example, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, etc.). More preferably, an acidic polysaccharide having an anionic functional group is used.
  • the acidic polysaccharide here is not particularly limited as long as it has an anionic functional group in its structure.
  • a polysaccharide having uronic acid for example, glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid is used.
  • hyaluronic acid gellan gum, deacylated gellan gum (hereinafter sometimes referred to as DAG), rhamzan gum, diyutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin, pectinic acid, pectinic acid, Examples include those composed of one or more from the group consisting of heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, kerato sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, rhamnan sulfate and salts thereof.
  • the polysaccharide is preferably hyaluronic acid, DAG, Grotan gum, xanthan gum, carrageenan or a salt thereof, and can float cells or tissues with a low concentration, and facilitate recovery of the cells or tissues.
  • DAG is most preferable.
  • the salt herein include salts of alkali metals such as lithium, sodium and potassium, salts of alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium, and salts of aluminum, zinc, copper, iron, ammonium, organic bases and amino acids. Is mentioned.
  • the weight average molecular weight of these polymer compounds (polysaccharides and the like) is preferably 10,000 to 50,000,000, more preferably 100,000 to 20,000,000, still more preferably 1,000, 000 to 10,000,000. For example, the molecular weight can be measured in pullulan conversion by gel permeation chromatography (GPC).
  • phosphorylated DAG can be used. The phosphorylation can be performed by a known method.
  • a plurality of (preferably two) polysaccharides may be used in combination.
  • the type of combination of polysaccharides is that the above-mentioned structure is formed in a liquid medium, and the cells (or cell aggregates) and / or tissues are uniformly suspended without substantially increasing the viscosity of the liquid medium (preferably Is not particularly limited as long as it can be left floating), but preferably the combination contains at least DAG or a salt thereof.
  • suitable polysaccharide combinations include DAG or a salt thereof, and polysaccharides other than DAG or a salt thereof (eg, xanthan gum, alginic acid, carrageenan, diutan gum, methylcellulose, locust bean gum or a salt thereof).
  • polysaccharide combinations include DAG and Ramzan gum, DAG and Valtan gum, DAG and Xanthan gum, DAG and Carrageenan, DAG and Xanthan gum, DAG and locust bean gum, DAG and ⁇ -Carrageenan, DAG and sodium alginate, DAG And methyl cellulose, but are not limited thereto.
  • More preferable specific examples of the specific compound used in the present invention include hyaluronic acid, deacylated gellan gum, diyutan gum, carrageenan and xanthan gum, and salts thereof. Considering the ease of tissue recovery, the most preferable example is deacylated gellan gum or a salt thereof.
  • the deacylated gellan gum in the present invention is a linear chain composed of four sugar molecules of 1-3 linked glucose, 1-4 linked glucuronic acid, 1-4 linked glucose and 1-4 linked rhamnose.
  • R 1 and R 2 are both hydrogen atoms
  • n is a polysaccharide represented by an integer of 2 or more.
  • R 1 may contain a glyceryl group and R 2 may contain an acetyl group, but the content of acetyl group and glyceryl group is preferably 10% or less, more preferably 1% or less.
  • the structure in the present invention can take various forms depending on the specific compound. Deacylated gellan gum will be described in the case of deacylated gellan gum.
  • deacylated gellan gum When deacylated gellan gum is mixed with a liquid medium, metal ions (for example, calcium Ions) and form an amorphous structure via the metal ions, and the cells (or cell aggregates) and / or tissues are suspended.
  • the viscosity of the medium composition used in the present invention prepared from deacylated gellan gum is 8 mPa ⁇ s or less, preferably 4 mPa ⁇ s or less, and is easy to recover cells (or cell aggregates) or tissues. Considering this point, it is more preferably 2 mPa ⁇ s or less.
  • the specific compound in the present invention can be obtained by a chemical synthesis method, but when the compound is a natural product, it can be extracted from various plants, animals, and microorganisms containing the compound using conventional techniques. It is preferable to obtain by separation and purification. In the extraction, the compound can be extracted efficiently by using water or supercritical gas. For example, as a method for producing gellan gum, the produced microorganism is cultured in a fermentation medium, and the mucosa produced outside the cells is collected by a normal purification method, and after drying, pulverization, etc., it is powdered. Good.
  • deacylated gellan gum it may be recovered after subjecting it to alkali treatment when recovering the mucosa and deacylating the glyceryl group and acetyl group bonded to the 1-3 bonded glucose residue.
  • Purification methods include, for example, liquid-liquid extraction, fractional precipitation, crystallization, various ion exchange chromatography, gel filtration chromatography using Sephadex LH-20, etc., adsorption chromatography using activated carbon, silica gel, or thin layer It is possible to purify by removing impurities by using adsorption / desorption treatment of an active substance by chromatography or high-performance liquid chromatography using a reverse phase column alone or in combination in any order and repeatedly.
  • gellan gum producing microorganisms examples include, but are not limited to, Sphingomonas elodea and microorganisms modified from the genes of the microorganisms.
  • deacylated gellan gum commercially available products such as “KELCOGEL (registered trademark of CPE Kelco) CG-LA” manufactured by Sanki Co., Ltd., “Kelcogel (CPP) manufactured by Saneigen FFI Co., Ltd. ⁇ Registered trademark of Kelco) ”or the like.
  • Kelcogel (registered trademark of CPI Kelco) HT” manufactured by San-Ei Gen FFI Co., Ltd. can be used as native gellan gum.
  • the concentration of the specific compound in the medium depends on the type of the specific compound, and the specific compound forms the above-described structure in the liquid medium (preferably without substantially increasing the viscosity of the liquid medium). It can be set as appropriate as long as cells (or cell aggregates) and / or tissues can be floated uniformly (preferably allowed to stand still), but usually 0.0005% to 1.0% (w / v), Preferably, it may be 0.001% to 0.4% (w / v), more preferably 0.005% to 0.1% (w / v), and still more preferably 0.005% to 0.05% (w / v).
  • % (W / v) medium may be added.
  • the sum of both compounds is 0.001% to 5.0% (w / v), preferably 0.005% to 1.0% (w / v), more preferably 0.01% to 0.1%. (W / v), most preferably 0.03% to 0.05% (w / v) may be added to the medium.
  • native gellan gum it may be added in a medium of 0.05% to 1.0% (w / v), preferably 0.05% to 0.1% (w / v).
  • the concentration of the polysaccharide is such that the combination of the polysaccharide forms the above-described structure in the liquid medium (preferably, the liquid medium It can be appropriately set within a range in which cells (or cell aggregates) and / or tissues can be suspended in a uniform manner (preferably allowed to stand still) without substantially increasing the viscosity.
  • the concentration of DAG or a salt thereof is 0.005 to 0.02% (w / v), preferably 0.01 to 0.02% (w / v v) is exemplified, and the concentration of polysaccharides other than DAG or a salt thereof is 0.0001 to 0.4% (w / v), preferably 0.005 to 0.4% (w / v), more preferably 0.1 to 0.4% (w / v) is exemplified.
  • concentration of DAG or a salt thereof is 0.005 to 0.02% (w / v), preferably 0.01 to 0.02% (w / v v) is exemplified
  • the concentration of polysaccharides other than DAG or a salt thereof is 0.0001 to 0.4% (w / v), preferably 0.005 to 0.4% (w / v), more preferably 0.1 to 0.4% (w / v) is exemplified.
  • concentration ranges are examples of specific combinations of concentration ranges.
  • DAG or a salt thereof 0.005 to 0.02% (preferably 0.01 to 0.02%) (w / v)
  • Polysaccharide xanthan gum other than DAG 0.1-0.4% (w / v)
  • Sodium alginate 0.0001 to 0.4% (w / v) (preferably 0.1 to 0.4% (w / v))
  • Native gellan gum 0.0001-0.4% (w / v)
  • Locust bean gum 0.1-0.4% (w / v)
  • Methyl cellulose 0.1 to 0.4% (w / v) (preferably 0.2 to 0.4% (w / v))
  • Carrageenan 0.05-0.1% (w / v)
  • Valtan gum 0.05-0.1% (w / v)
  • the compound can be further changed into another derivative by a chemical synthesis method, and the derivative thus obtained can also be used effectively in the present invention.
  • the hydroxyl group corresponding to R 1 and / or R 2 of the compound represented by the general formula (I) is a C 1-3 alkoxy group, a C 1-3 alkylsulfonyl group, Derivatives substituted with monosaccharide residues such as glucose or fructose, oligosaccharide residues such as sucrose and lactose, and amino acid residues such as glycine and arginine can also be used in the present invention.
  • the compound can be crosslinked using a crosslinker such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
  • the specific compound or salt thereof used in the present invention can exist in any crystal form depending on the production conditions, and can exist as any hydrate. These crystal forms, hydrates, and mixtures thereof. Are also included within the scope of the present invention. Moreover, although it may exist as a solvate containing organic solvents, such as acetone, ethanol, and tetrahydrofuran, all of these forms are contained in the scope of the present invention.
  • the specific compound used in the present invention may exist in the form of a tautomer, geometric isomer, tautomer or mixture of geometric isomers, or a mixture thereof formed by intra-ring or exocyclic isomerization. Good. Regardless of whether the compound of the present invention is produced by isomerization, when it has an asymmetric center, it may exist in the form of a resolved optical isomer or a mixture containing them in an arbitrary ratio.
  • the medium composition used in the present invention may contain metal ions such as divalent metal ions (calcium ions, magnesium ions, zinc ions, iron ions, copper ions, etc.), and preferably contains calcium ions. .
  • the metal ions can be used in combination of two or more, such as calcium ions and magnesium ions, calcium ions and zinc ions, calcium ions and iron ions, calcium ions and copper ions. Those skilled in the art can appropriately determine the combination.
  • a metal ion eg, calcium ion
  • the medium composition whereby the polymer compound is aggregated via the metal ion, and the polymer compound forms a three-dimensional network
  • the structure of the present invention is formed by the polysaccharide forming a microgel via metal ions (eg, calcium ions).
  • the concentration of the metal ion is such that the specific compound forms the above-described structure in the liquid medium, and preferably (without substantially increasing the viscosity of the liquid medium) cells (or cell aggregates) and / or tissue. It can be set as appropriate as long as it can be uniformly suspended (preferably allowed to float and stand).
  • the metal ion concentration is 0.1 mM to 300 mM, preferably 0.5 mM to 100 mM, but is not limited thereto.
  • the metal ions may be mixed with the medium, or a salt solution may be separately prepared and added to the medium. Further, the medium composition used in the present invention may contain an extracellular matrix, an adhesion molecule, etc. described later.
  • the structure composed of a specific compound used in the present invention contains the structure of the specific compound when the cell (or cell aggregate) and / or tissue are cultured in vitro. It shows the effect of floating in a liquid (preferably the effect of floating and standing). Due to the floating effect, it is possible to increase the number of cells (or cell aggregates) and / or the number of tissues per fixed volume as compared with monolayer culture. In addition, when a conventional suspension culture method involves a rotation or shaking operation, a shearing force acts on cells (or cell aggregates) and / or tissues, so that the proliferation rate and recovery rate of cells and / or tissues are low, or Cell function may be impaired.
  • cells (or cell aggregates) and / or tissue can be uniformly dispersed without performing operations such as shaking.
  • Target cells (or cell aggregates) and / or tissues can be obtained easily and in large quantities without loss of cell function.
  • cells (or cell aggregates) and / or tissues are suspended and cultured in a medium containing a conventional gel substrate, it is difficult to observe or recover the cells (or cell aggregates) and / or tissues. In some cases, the function may be impaired.
  • cells (or cell aggregates) and / or tissues are cultured in suspension, and observed and recovered without losing their state and function. be able to.
  • the culture medium containing the conventional gel base material has a high viscosity, and replacement
  • the medium composition containing the structure of the specific compound of the present invention has a low viscosity, the medium can be easily replaced using a pipette, a pump, or the like.
  • a medium composition can be prepared.
  • the classification according to the composition of the medium includes a natural medium, a semi-synthetic medium, and a synthetic medium, and the classification according to the shape includes a semi-solid medium, a liquid medium, and a powder medium (hereinafter sometimes referred to as a powder medium).
  • any medium can be used as long as it is a medium used for culturing animal cells.
  • Examples of such medium include Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham F12 Medium (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM / F12 Medium, McCoy's 5A Medium, Eagle's Medium (E Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium; ⁇ MEM), MEM medium (Minimum Essential Medium), RPMI1640 medium, Iscove's Modified Dulbecco's medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium medium; , IPL41 medium, Fischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO-10 (manufactured by Cambridge), X-VIVO-15 (manufactured by Cambridge), HPGM (manufactured by Cambridge), StemSpan-H3000 (Stem Cell Technology) ), StemSpanSFEM (manufactured by Stem Cell Technology), Stemline II (Sigma Aldrich) ),
  • a medium used for culturing cancer cells and cells surrounding cancer can contain a cell adhesion factor in the medium.
  • a cell adhesion factor examples thereof include matrigel, collagen gel, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, and fibronectin. These cell adhesion factors can be added in combination of two or more.
  • a thickener such as guar gum, propylene glycol alginate, locust bean gum, gum arabic, tara gum, tamarind gum, methylcellulose, etc., may be further mixed with the medium used when the cancer cells are suspended as spheres. it can.
  • Components added to animal-derived cells (or cell aggregates) and / or tissue culture media include fetal bovine serum, human serum, horse serum, insulin, transferrin, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenite, Monothioglycerol, 2-mercaptoethanol, bovine serum albumin, sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices and various Examples include cell adhesion molecules.
  • antibiotics added to the medium include sulfa drugs, penicillin, pheneticillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, nafcillin, ampicillin, penicillin, amoxicillin, cyclacillin, carbenicillin, ticarcillin, piperacillin, piperacillin, Mecuzurocillin, mecillinam, andinocillin, cephalosporin and its derivatives, oxophosphoric acid, amifloxacin, temafloxacin, nalidixic acid, pyromido acid, ciprofloxane, sinoxacin, norfloxacin, perfloxacin, rosoxacin, ofloxacin, enoxacin, pipexamic acid, sulbactam acid, sulbactam acid, sulbactam acid, sulbactam acid , ⁇ -bromopenicill
  • the specific compound in the present invention When the specific compound in the present invention is added to the above medium, the specific compound is first dissolved or dispersed in an appropriate solvent (this is referred to as a medium additive). Thereafter, the concentration of the specific compound in the medium, as detailed above (preferably without substantially increasing the viscosity of the liquid medium), the cells (or cell aggregates) and / or tissue are uniformly distributed. Concentration at which it can be floated (preferably suspended), for example 0.0005% to 1.0% (w / v), preferably 0.001% to 0.4% (w / v), more preferably 0.005% to 0.1% (w / v), more preferably 0.005% to 0.05% (w / v), the medium additive may be added to the medium.
  • 0.001% to 1.0% (w / v), preferably 0.003% to 0.5% (w / v), more preferably 0.005% to 0.3% (w / v), most preferably 0.01% to 0.05% (w / v) medium may be added.
  • % (W / v) medium may be added.
  • the sum of both compounds is 0.001% to 5.0% (w / v), preferably 0.005% to 1.0% (w / v), more preferably 0.01% to 0.1%. Most preferably, it may be added to a 0.03% to 0.05% (w / v) medium.
  • the total of both compounds should be added to the medium between 0.001% and 1.0% (w / v), most preferably 0.005% to 0.01% (w / v). It ’s fine.
  • the total amount of both compounds may be added to a medium of 0.001% to 1.0% (w / v), most preferably 0.005% to 0.2% (w / v). .
  • the total of both compounds should be added to the medium between 0.001% and 1.0% (w / v), most preferably between 0.01% and 0.1% (w / v). It ’s fine.
  • the total of both compounds can be added to a medium of 0.001% to 1.0% (w / v), most preferably 0.01% to 0.1% (w / v). good.
  • the total of both compounds may be added to a medium of 0.001% to 1.0% (w / v), most preferably 0.01% to 0.1% (w / v). .
  • the total amount of both compounds should be added to the medium between 0.001% and 1.0% (w / v), most preferably between 0.01% and 0.1% (w / v). It ’s fine.
  • suitable solvents used for the medium additive include aqueous solvents such as water, dimethyl sulfoxide (DMSO), various alcohols such as methanol, ethanol, butanol, propanol, glycerin, propylene glycol, and butylene glycol.
  • aqueous solvents such as water, dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • various alcohols such as methanol, ethanol, butanol, propanol, glycerin, propylene glycol, and butylene glycol.
  • the concentration of the specific compound is 0.001% to 5.0% (w / v), preferably 0.01% to 1.0% (w / v), more preferably 0.1% to 0.6% (w / v).
  • an additive that enhances the effect of the specific compound or lowers the concentration at the time of use can be further added.
  • additives include one or more polysaccharides such as guar gum, propylene glycol alginate, locust bean gum, gum arabic, tara gum, tamarind gum, methylcellulose, carboxymethylcellulose, agarose, tamarind seed gum, pullulan, etc. be able to.
  • the specific compound can be used by immobilizing on the surface of the carrier or supporting the specific compound inside the carrier.
  • the specific compound can be in any shape at the time of provision or storage.
  • the specific compound is bound to formulated solids such as tablets, pills, capsules, granules, liquids such as solutions or suspensions dissolved in appropriate solvents and solubilizers, or substrates or single substances. It can be in the state.
  • Additives for formulation include preservatives such as p-hydroxybenzoates; excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol; lubricants such as magnesium stearate and talc; polyvinyl Examples include binders such as alcohol, hydroxypropyl cellulose, and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; and plasticizers such as glycerin. These additives are not limited to those described above, and can be freely selected as long as they are available to those skilled in the art.
  • the specific compound in the present invention may be sterilized as necessary.
  • the sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and filter sterilization.
  • the material of the filter part when performing filter sterilization is not particularly limited.
  • the pore size of the filter is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, more preferably 0.1 ⁇ m to 1 ⁇ m, and most preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the specific compound may be in a solid state or a solution state.
  • the structure is formed in the liquid medium, and the medium composition used in the present invention can be obtained.
  • the medium usually contains metal ions (eg, divalent metal ions such as calcium ions) at a concentration sufficient for polymer compounds to assemble via ions or to form a three-dimensional network. Therefore, the medium composition used in the present invention can be obtained only by adding the solution or dispersion of the specific compound of the present invention to the liquid medium. Alternatively, the medium may be added to a medium additive (a solution or dispersion of the specific compound).
  • the medium composition used in the present invention can also be prepared by mixing a specific compound and medium components in an aqueous solvent (for example, water containing ion-exchanged water or ultrapure water).
  • an aqueous solvent for example, water containing ion-exchanged water or ultrapure water.
  • a liquid medium and a medium additive (solution) are mixed, (2) the polymer compound (solid such as a powder) is mixed in the liquid medium, (3) a medium additive ( Examples include, but are not limited to, mixing a powder medium with (solution), (4) mixing the powder medium and the above polymer compound (solid such as powder) with an aqueous solvent, and the like.
  • the embodiment of (1) or (4) or (1) or (3) is preferable.
  • the specific compound When the specific compound is dissolved in a solvent (for example, an aqueous solvent such as water or a liquid medium), or when the specific compound and the powder medium are dissolved in the solvent, it is preferable to heat the mixed solution to promote dissolution.
  • the heating temperature includes, for example, 80 ° C. to 130 ° C., preferably 100 ° C. to 125 ° C. (eg, 121 ° C.) that is sterilized by heating. After heating, the obtained solution of the specific compound is cooled to room temperature.
  • the above metal ions eg, divalent metal ions such as calcium ions
  • the specific compound is heated (for example, 80 ° C. to 130 ° C.) when dissolved in a solvent (eg, water, an aqueous solvent such as a liquid medium) containing the above metal ions (eg, divalent metal ions such as calcium ions).
  • a solvent eg, water, an aqueous solvent such as a liquid medium
  • the above metal ions eg, divalent metal ions such as calcium ions.
  • the above structure composed of the specific compound can also be formed by cooling the resulting solution to room temperature at a temperature of 0 ° C., preferably 100 ° C. to 125 ° C. (eg, 121 ° C.).
  • a specific compound is added to ion exchange water or ultrapure water. And it stirs at the temperature (for example, 60 degreeC or more, 80 degreeC or more, 90 degreeC or more) which can melt
  • stirring for example, a homomixer
  • the method for mixing the aqueous solution and the medium is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a magnetic stirrer, mechanical stirrer, homomixer, and homogenizer. Moreover, you may filter the culture medium composition used for this invention with a filter after mixing.
  • the pore size of the filter used for the filtration treatment is 5 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 70 ⁇ m, more preferably 10 ⁇ m to 70 ⁇ m.
  • the medium composition used in the present invention is prepared by mixing the powder medium and the polymer compound (solid such as powder) with an aqueous solvent and heating at the above temperature.
  • deacylated gellan gum when preparing a deacylated gellan gum, it is 0.1% to 1% (w / v), preferably 0.2% to 0.5% (w / v), more preferably 0.3% to 0.4% (w / v).
  • deacylated gellan gum is added to ion-exchanged water or ultrapure water.
  • 0.1% to 1% (w / v), preferably 0.2% to 0.8% (w / v), more preferably 0.3% to 0.6% (w / v) Add deacylated gellan gum to ion-exchanged water or ultrapure water.
  • the temperature may be any temperature at which the deacylated gellan gum can be dissolved.
  • the aqueous solution is added to the medium so as to have a desired final concentration (for example, when the final concentration is 0.015%, a 0.3% aqueous solution: The ratio of the medium is 1:19).
  • the method for mixing the aqueous solution and the medium is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a magnetic stirrer, mechanical stirrer, homomixer, and homogenizer. Moreover, you may filter the culture medium composition used for this invention with a filter after mixing.
  • the pore size of the filter used for the filtration treatment is 5 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 70 ⁇ m, more preferably 10 ⁇ m to 70 ⁇ m.
  • the medium composition used in the present invention is preferably a medium composition that can be cultured by suspending cells or tissues, and the viscosity of the medium composition is 8 mPa ⁇ s or less (under 37 ° C.), And a medium composition comprising deacylated gellan gum or a salt thereof.
  • the concentration of deacylated gellan gum or salt thereof in the medium composition is 0.01-0.05% (w / v).
  • the medium composition further contains a polysaccharide other than deacylated gellan gum or a salt thereof.
  • the medium composition contains a divalent metal ion (eg, calcium ion) at a concentration sufficient to form a structure in which the deacylated gellan gum can float and culture cells or tissues.
  • concentration is, for example, 0.1 mM to 300 mM, preferably 0.5 mM to 100 mM.
  • the medium composition can be produced by mixing deacylated gellan gum or a salt thereof and a medium.
  • the medium is a liquid medium.
  • the liquid medium contains a concentration of divalent metal ions (eg, calcium ions) sufficient to form a structure in which the deacylated gellan gum can be cultured by suspending cells or tissues. The concentration is, for example, 0.1 mM to 300 mM, preferably 0.5 mM to 100 mM.
  • the medium is mixed with deacylated gellan gum or salt thereof dissolved or dispersed in a solvent.
  • the deacylated gellan gum or salt thereof dissolved or dispersed in a solvent is in a sterile state.
  • sterilization is performed by autoclave sterilization.
  • sterilization is performed by filter sterilization.
  • filter sterilization is performed by passing through a 0.1-0.5 ⁇ m filter.
  • the present invention includes a method for culturing cancer cells and peri-cancerous cells, comprising culturing each of the cancer pericellular cells in a state of adhering to a solid phase in the medium composition I while the cancer cells are suspended. Is provided.
  • the cancer cell used in the present invention is preferably a cancer cell having the ability to form a solid tumor in vivo.
  • Cancer cells having the ability to form solid tumors include stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell cancer, basal cell cancer, adenocarcinoma, Renal cell cancer, ureteral cancer, liver cancer, bile duct cancer, cervical cancer, endometrial cancer, testicular cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, craniopharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, Fibrosarcoma, mucosal sarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma, lymphangiosarcoma, lymphatic endothelial sarcoma, synovial tumor, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcom
  • Pericancer cells refer to cells that can form a tumor tissue in vivo together with cancer cells and contribute to the microenvironment of cancer cells.
  • pericentric cells include, but are not limited to, inflammatory cells such as fibroblasts, stellate cells, vascular endothelial cells, macrophages, and leukocytes.
  • the pericancer cells are preferably fibroblasts and macrophages.
  • the pericancer cells are not limited to cells isolated from cancer tissues, but also include cells isolated from non-cancerous tissues such as normal tissues.
  • the pericancerous cells may be isolated from a tissue from which cancer cells are derived (for example, lung tissue if lung cancer cells), or may be isolated from a tissue different from the tissue from which cancer cells are derived.
  • the pericancer cells are those simultaneously isolated from the cancer tissue from which the cancer cells are isolated. From the viewpoints of convenience and versatility, commercially available cell line fibroblasts, cell line macrophages, isolated fibroblasts, isolated leukocytes, isolated vascular endothelial cells and the like may be used.
  • the cancer cells and pericancer cells cultured in the method of the present invention are preferably isolated.
  • “Isolation” means that an operation to remove a target component or a factor other than cells has been performed, and the state existing in nature has been removed.
  • the purity of “isolated cancer cells” (percentage of cancer cells in the total number of cells) is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, most Preferably it is 100%. That is, in the method of the present invention, usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 99% or more of all cells cultured in a suspended state in the medium composition I.
  • 100% are cancer cells, and usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of all cells cultured in the medium composition I while adhering to a solid phase. More preferably, 99% or more, and most preferably 100% are cells surrounding the cancer.
  • the cells are cultured in the same system (for example, in the same well), with the cancer cells floating and with the cells surrounding the cancer adhered to the solid phase.
  • the culture medium composition is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, and most preferably 100% of the cancer cells cultured in the method of the present invention. Floating in I.
  • normally 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100% of the pericancerous cells cultured in the method of the present invention are solid phase. It is adhered to.
  • solid phase examples include microcarriers, scaffolds and the like in addition to the inner wall surface (eg, bottom surface) of the culture vessel described in detail below.
  • the solid phase is preferably the inner wall surface (eg, bottom surface) of the culture vessel.
  • Co-culture of cancer cells and peri-cancer cells is commonly used for cell culture.
  • a multiwell plate As a culture vessel.
  • the size (about 127mm x about 85mm) and shape of the multi-well plate are almost uniform worldwide, and the shape is the same, but depending on the size of the well, 6-well, 12-well, 24-well, 48-well, There are variations such as 96-well and 384-well.
  • a 48-384 well plate more preferably a 96-384 well plate is preferably used.
  • cancer cells can be directly co-cultured with surrounding cells in such a multiwell plate in an anchorage-independent state.
  • the culture vessel to be used is cell adhesive.
  • the inner wall surface (eg, bottom surface) of the culture vessel is artificially treated (for example, coating treatment with polylysine, extracellular matrix, etc.) for the purpose of improving the adhesion with cells. You can use what you have.
  • the cancer cells are preferably subjected to suspension culture in a state where they are not adhered to the surface of the solid support or embedded in the support.
  • the cancer cell is in a state of being dispersed in the medium composition I in a single cell state, or in a state where a plurality of cells are aggregated to form a cell aggregate (sphere (spheroid)).
  • the suspension culture (preferably suspension static culture) is performed in the suspension culture.
  • the state in which cell aggregates (spheres (spheroids)) are formed is because cell-cell interactions and cell structures close to the in vivo environment have been reconstructed, and cell functions are maintained for a long time. Can be cultured as it is, and the cells can be collected relatively easily.
  • the sphere size is preferably 500 ⁇ m or less, and most preferably 50 to 100 ⁇ m, as an average value of the maximum diameter.
  • the method for forming a cell aggregate is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art. Examples thereof include a method using a container having a cell non-adhesive surface, a hanging drop method, a swirl culture method, a three-dimensional scaffold method, a centrifugation method, a method using aggregation by an electric field or a magnetic field, and the like.
  • Spheres can also be formed using the culture composition I.
  • a sphere can be obtained by collecting target cancer cells as single cells by cell-dispersing enzyme treatment, then uniformly dispersing them in the culture composition I, and allowing them to stand for 3 to 10 days for suspension culture. Prepared.
  • the spheres prepared here can be collected by centrifugation or filtration.
  • the cells surrounding the cancer are cultured in the above-described culture container in a state where they are adhered to a solid phase (eg, the inner wall of the bottom surface of the culture container).
  • a solid phase eg, the inner wall of the bottom surface of the culture container.
  • the cancer cell suspension in the culture composition I is added, followed by culturing.
  • a cancer cell suspension can be obtained by adding separately prepared cancer cells to the culture composition I and mixing them so that they are uniformly dispersed.
  • the mixing method in that case is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a stirrer, a vortex mixer, a microplate mixer, and a shaker.
  • adherent cancer cells are recovered from subculture and dispersed to a single cell or a state close thereto.
  • the cancer cells are dispersed using an appropriate cell dissociation solution.
  • the cell dissociation solution for example, EDTA; proteolytic enzymes such as trypsin, collagenase IV, metalloprotease and the like can be used alone or in appropriate combination.
  • the cancer cells suspended in the DAG-containing medium can be directly superimposed on the culture layer of the cancer surrounding cells.
  • 0.5-2%, preferably 1% in any medium warmed at 37 ° C above the culture phase of pericancer cells 0.5-2%, preferably 1% in any medium warmed at 37 ° C above the culture phase of pericancer cells.
  • Low-melting agarose dissolved at a concentration can be overlaid to form an agarose layer solidified at 4 ° C. to 25 ° C., and cancer cells suspended in a DAG-containing medium can be overlaid thereon.
  • the co-culture may be performed in a stationary state, or the culture solution may be rotated, shaken or stirred as necessary, but is preferably stationary culture.
  • the temperature for culturing cancer cells and cells surrounding the cancer is usually 25 to 39 ° C, preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is usually 4 to 10% by volume, preferably 5% by volume, in the culture atmosphere.
  • the oxygen concentration is 15 to 50% by volume, preferably 20% by volume, in the culture atmosphere.
  • the co-culture period in the medium composition I can be appropriately set depending on the purpose of culture and is not particularly limited, but is usually 12 hours or longer, preferably 24 hours or longer, more preferably 48 hours or longer.
  • the upper limit of the culture period is theoretically infinite, but from the viewpoint of avoiding changes in the characteristics of cancer cells, for example, it is preferably within 30 days, preferably within 10 days. .
  • the cancer cells proliferate while being maintained in a state suspended in the medium composition I in a single cell state or in a sphere state. That is, cancer cells are suspended in the medium composition I in an anchorage-independent state.
  • cells surrounding cancer are cultured in a state of being adhered to a solid phase (eg, an inner wall surface such as a bottom surface of a culture vessel). Therefore, direct contact between cancer cells and cells surrounding the cancer is limited to a very small number of cells on the surface of the solid phase (eg, inner wall surface such as the bottom surface of the culture vessel), and most floating cancer cells are It does not come into direct contact with the peri-cancer cells but is only affected by the humoral factors secreted from the peri-cancer cells.
  • Such interaction between cancer cells and cells surrounding cancer is similar to the environment in cancer tissue in vivo, so research on characterization of various cancer cells in cancer tissue in vivo, It is useful for screening anticancer agents that can be expected to be effective, and for evaluating pharmaceuticals for treating or preventing cancer.
  • the cancer cells cultured in suspension are separated from the cells surrounding the cancer to recover only the cancer cells, and the cell response (gene expression, proliferation, intracellular calcium ion concentration change)
  • the cell response gene expression, proliferation, intracellular calcium ion concentration change
  • the cellular response is compared to the cellular response in a negative control group without cancer surrounding cells (cancer cells cultured under the same culture conditions except for no cancer surrounding cells).
  • the cancer surrounding cells are adherently cultured in the same medium, so that the cancer cells and the cancer surrounding cells after co-culture are separated, and It is possible to easily collect cancer cells.
  • the present invention also provides a culture preparation containing cancer cells and cells surrounding the cancer obtained by the method of the present invention.
  • cancer cells are in a suspended state in the medium composition I, and cells surrounding the cancer are in a state of being adhered to a solid phase.
  • the culture medium composition I usually contains 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, and most preferably 100% of the cancer cells contained in the culture preparation. 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 99% or more, and most preferably 100% of the cells surrounding cancer contained in the culture preparation. Is adhered to the solid phase.
  • the present invention provides a screening method for an anticancer agent comprising the following steps: (1) co-culturing cancer cells and cells surrounding cancer by the method of the present invention in the presence of a test substance; (2) Measure the number of cancer cells surviving after culturing in (1), and (3) a control in which the number of cancer cells surviving in (2) was cultured in the absence of the test substance Compare with the number of cancer cells surviving.
  • the test substance may be any known compound or new compound, such as a nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, low molecular organic compound, compound library prepared using combinatorial chemistry technology, random peptide Examples include natural components derived from libraries, random nucleic acid libraries, microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like. Moreover, the artificial polymer which carry
  • the culture period in the presence of the test substance is not particularly limited as long as the presence or absence of the effect of the test substance as an anticancer agent can be evaluated, but is usually about 12 hours to 7 days.
  • the number of cancer cells surviving is measured.
  • Methods for measuring the number of viable cells are well known to those skilled in the art, and examples thereof include, but are not limited to, methods using WST reagent, ATP measurement reagent, and the like.
  • the measurement of the number of viable cancer cells is preferably performed by separating the cancer cells from the cells surrounding the cancer.
  • the cancer surrounding cells are adherently cultured in the same medium, so that the cancer cells and the cancer surrounding cells after co-culture are separated, and It is possible to easily collect cancer cells.
  • control cancer cells cultured in the absence of the test substance cancer cells cultured under the same culture conditions except that there is no test substance) )
  • the comparison of the number of viable cells can be preferably performed based on the presence or absence of a statistically significant difference.
  • the number of surviving cells of the control cancer cells may be measured in advance or simultaneously with the measurement of the number of surviving cells of cancer cells cultured in the presence of the test substance. It is preferable that they are measured simultaneously from the viewpoint of accuracy and reproducibility.
  • a substance whose cancer cell viable cell count has been reduced by the addition of the test substance is selected as a candidate substance for an anticancer drug (particularly, a candidate substance for an anticancer drug effective against cultured cancer cells).
  • I can do it.
  • the screening method of the present invention the sensitivity of cancer cells to anticancer agents is evaluated in an environment close to that of in vivo cancer tissue, so that the antitumor effect can also be exhibited in in vivo cancer tissue affected by surrounding cancer cells. Can be selected with high efficiency.
  • DMEM medium containing 0.015% (w / v) deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) and fetal bovine serum (0.5, 1.25, 2.5, or 10% (v / v)) Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared with a homomixer according to the method of Patent Document 1 and used for the following test (DAG medium).
  • a human lung cancer-derived cancer cell line A549 cells were used as cancer cells, and normal human alveolar-derived fibroblasts were used as cancer surrounding cells. Alveolar fibroblasts were cultured in a 96-well culture plate and adhered monolayer. Separately cultured A549 cells were collected by trypsin treatment and suspended in the DAG medium. 2500 to 20000 cells were added to a culture hole of a fibroblast obtained by monolayer culture of a cancer cell suspension. Thereafter, various anticancer agents were added. The cancer cell culture was collected after 5 days of suspension culture of the cancer cells. WST reagent or ATP measurement reagent (Cell titer GLO) was added to the obtained A549 cancer cell suspension, and the number of cells was measured.
  • WST reagent or ATP measurement reagent Cell titer GLO
  • A549 cells were suspended in DAG medium and seeded on fibroblasts cultured in a 96-well culture plate (2500, 5000, 10000 or 20000 cells / well). After culturing for 5 days, A549 cells in the DAG medium were recovered and the number of cells was counted. When A549 cells were cultured alone, the cell growth was low, but co-culture with Fibroblast markedly promoted cell growth and achieved high cell growth activity from low FBS concentrations ( Figure 1). ). On the other hand, in co-culture using Preset VECELL (single-layer culture of fibroblast in the outer well and single-layer culture of A549 cells in the encapsulated well), high cell proliferation was observed even in single culture of A549 cells. The growth-promoting effect of co-culture was small compared to co-culture using DAG medium (Fig. 2). The effect was clear in co-culture with fibroblast by three-dimensional suspension culture using DAG medium.
  • cancer cells can be directly co-cultured with cells surrounding cancer in an anchorage-independent state. Therefore, studies on characterization of various cancer cells in cancer tissues in vivo and various types of anticancer agents Promote exploration and development research.
  • an anticancer agent can be screened in an environment similar to that of a cancerous tissue in vivo, so that an anticancer agent that exerts an antitumor effect even in vivo cancerous tissue affected by surrounding cancer cells can be selected with high efficiency. can do.
  • the present invention provides a cancer cell / surround cancer cell co-culture system that is simple and applicable to high-throughput screening corresponding to multiwell culture plates such as 96-well culture plates and 384-well culture plates.

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Abstract

本発明は、細胞又は組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養することを含む、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法を提供する。

Description

癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法
　本発明は、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法に関する。
　癌組織は、癌細胞、並びに癌細胞以外の多彩な細胞群、細胞外マトリックス、及び細胞間質成分から形成されている。従来、癌細胞自体に関する研究が進み、癌細胞単独での培養により癌細胞特性研究や抗癌剤研究がなされてきた。一部の癌細胞では、それらの研究により画期的な癌細胞の特性が明らかにされ、画期的な抗癌剤の開発に繋がったケースもある。しかしながら、多くの癌細胞では、画期的な、また、根本的な治療法が見出されていないのが現状である。その原因として、従来の癌細胞研究が、癌細胞の足場依存的な単層培養や、癌細胞単独での培養を基礎としていたことがあげられる。しかし、実際の癌組織における癌細胞は、足場非依存的な三次元的な環境にあり、そこには、癌細胞の周囲に多彩な細胞群（癌周囲細胞:CAF）や細胞外マトリクス(ECM)が存在する。そのためこれらの因子と癌細胞が複雑に相互作用をしながら癌組織が形成されており、従来の培養条件では見られた癌細胞の特性や抗癌剤の効果が、実際の癌において異なる挙動を示すことが知られてきた。そのため、最近では、癌周囲細胞や細胞外マトリクスの存在の重要性が指摘されている。なかでも間質細胞（線維芽細胞、星細胞）や血管内皮細胞は、癌細胞との相互作用を介し、癌特異的間質組織から供給される誘導因子が上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal Transition: EMT）を含む浸潤・転移・増殖など癌の進展を促進し、その治療抵抗性を付与したり悪性度に寄与したりすることが最近の研究で明らかにされつつある（非特許文献1）。癌細胞の足場非依存的増殖は、癌組織特有の細胞環境下維持され、癌細胞の増殖、浸潤、転移においてその微小環境の影響を強く受けている（非特許文献2）。そのため、癌組織内の癌細胞の特性をインビトロでより再現する培養技術が、癌研究、画期的抗がん剤開発に求められる。CAFを対象とした癌治療は耐性化しにくいと考えられ腫瘍をdormancyの状態に維持するといった新しい癌治療につながる可能性がある。
　癌組織内環境を再現する技術として、異種細胞の共培養系が多数考案されている。その多くは、インサートウェルや培養カセットなどのデバイスを用いたり、コラーゲンゲル包埋技術を駆使したりするものである（非特許文献3及び4）。これらの方法では、外郭ウェル内細胞と内包ウェル内細胞とをフィルターで隔てることにより、又は一方の細胞をゲル内に、他方の細胞をゲル外に配置することにより、異種細胞を物理的に分離して培養するので、間接的な共培養技術といえる。しかし、実際の生体内癌組織では、癌細胞と癌周囲細胞は、そのように物理的に分離されることなく近接し共存する。従って、より生体内癌組織に近い環境を再現するためには、適切な直接共培養系の構築を要する。間接的共培養系は、特殊な培養装置を必要とし、操作が煩雑であり、抗癌剤などの薬物のハイスループットスクリーニングが不可能である。また、培養後の細胞の回収も困難である。
　上述の間接的共培養系では、細胞を培養器やコラーゲンフィルム（ゲル）に接着させて培養するため、細胞は足場依存的な環境に置かれる。最近の知見では、癌組織での癌周囲細胞の環境は足場依存的である一方、癌細胞の環境は足場非依存性と言われている。このことから、従来の間接的共培養系は、細胞が晒される環境の足場依存性が、実際の生体内癌組織と異なることが指摘されている。現在、GFPなどのタグをつけたタンパク質を強制発現させる技術で、直接共培養系から、目的の癌細胞を単離（可視化）することが可能になったが、本技術は遺伝子操作を伴うため人工的なバイアスは避けられない。このような人工的なバイアスなしで、且つ複雑な器具装置を使うことなく、簡便にまたハイスループットに癌細胞を癌周囲細胞と直接共培養する技術が、新たな癌研究、抗癌剤研究に求められている。
　脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物を含む構造体を液体培地中に混合することにより、該液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養し得ること、この前記構造体を含む培地組成物を用いて培養することにより細胞の増殖活性が亢進することが報告されている（特許文献1）。当該培地組成物においては、脱アシル化ジェランガム等のアニオン性官能基を有する高分子化合物が、金属イオン（例、カルシウムイオン等の二価金属イオン）を介して連結することにより不定形な構造体を形成し、これが培地中で三次元ネットワークを形成することにより、細胞等を浮遊させるための担体となる。
WO2014/017513 A1
Calabrese et al., Cancer Cell, vol. 11, no. 1, pages 69-82, 2007 清木元治：癌転移の分子医学，羊土社，東京，1996 Xiao et al., Chinese Medical Journal, vol. 127, no. 11, pages 2091-2096 山添泰宗ら、2013年第35回日本バイオマテリアル学会、プログラム第295頁、2B-14
　本発明は、生体内の癌組織にできる限り類似した環境下で、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、同一培養容器内において、脱アシル化ジェランガム等を含む細胞又は組織を浮遊させて培養できる培地組成物中、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養することにより、生体内の癌組織に近似した環境をインビトロで再現することに成功した。かかる知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は下記のとおりである：
［1］細胞又は組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養することを含む、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法。
［2］癌細胞が固形腫瘍を形成する能力を有する、［1］記載の方法。
［3］癌周囲細胞が、線維芽細胞、星細胞、及び血管内皮細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞である、［1］又は［2］記載の方法。
［4］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［1］～［3］のいずれか記載の方法。
［5］培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005～0.3％（w/v）である、［4］記載の方法。
［6］培地組成物の37℃における粘度が、8mPa・s以下である、［1］～［5］のいずれか記載の方法。
［7］［1］～［6］のいずれか記載の方法により得られる、癌細胞及び癌周囲細胞を含む培養調製物。
［8］以下の工程を含む、抗癌剤のスクリーニング方法：
（1）被検物質の存在下、［1］～［6］のいずれか記載の方法により、癌細胞と癌周囲細胞を共培養すること、
（2）（1）の培養後の癌細胞の生存細胞数を測定すること、及び
（3）（2）で測定した癌細胞の生存細胞数を、被検物質の非存在下で培養した対照癌細胞の生存細胞数と比較すること。
　本発明により、癌細胞を足場非依存性の状態で、癌周囲細胞と直接共培養することが可能となるので、生体内癌組織における様々な癌細胞の特性解明研究や、様々な種類の抗癌剤の探索、開発研究を促進する。本発明により、生体内癌組織に近似した環境下で、抗癌剤のスクリーニングを行うことができるので、癌周囲細胞の影響を受けた生体内癌組織でも抗腫瘍効果を発揮する抗癌剤を高い効率で選択することができる。また、本発明により、簡便でかつ、96穴培養プレート、384穴培養プレート等のマルチウェル培養プレートに対応したHigh-throughput screeningに適用可能な癌細胞／癌周囲細胞共培養系が提供される。
単独培養又はDAG培地中での線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖。 単独培養又はPreset VECELL上での線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖に対するGefitinibの効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖に対するMK2206の効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖に対するTrametinibの効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるA549細胞の増殖に対するCYT387の効果。 単独培養又はDAG培地中での線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖。 単独培養又はPreset VECELL上での線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖に対するPaclitaxelの効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖に対するGefitinibの効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖に対するMK2206の効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖に対するTrametinibの効果。 単独培養又は線維芽細胞との共培養におけるMCF7細胞の増殖に対するCYT387の効果。
（1）本発明に用いる培地組成物
　本発明は、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物中で、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する技術を提供する。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、評価対象の癌細胞やこれを含む組織を培養することを可能にする。当該培地組成物は、WO 2014/017513 A1の記載に従い、調製することが可能である。以下、当該培地組成物を培地組成物Iと称することがある。
　細胞とは、動物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。
　本発明において用いる癌細胞及び癌周囲細胞は、哺乳動物の細胞である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類であり、より好ましくはヒトである。
　癌の例としては、以下に限定されるものではないが、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、骨髄癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、線維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、癌患者由来の血液等の組織が挙げられる。癌細胞は、癌患者から採取した癌組織から酵素などで単離した癌細胞（初代培養）であってもよいし、株化された癌細胞株であってもよい。癌細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳癌細胞株としてHBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D、ヒト子宮頸癌細胞株としてHeLa、ヒト肺癌細胞株としてA549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114、ヒト大腸癌細胞株としてCaco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr、ヒト前立腺癌細胞株としてDU-145、PC-3、LNCaP、ヒト中枢神経系癌細胞株としてU251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19、ヒト卵巣癌細胞株としてOVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1、ヒト腎癌細胞株としてRXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10、ヒト胃癌細胞株としてAGS、MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74、皮膚癌細胞株としてLOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14、白血病細胞株としてCCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat、ヒト上皮様癌細胞株としてA431、ヒトメラノーマ細胞株としてA375、ヒト骨肉腫細胞株としてHOS、MNMG、MNNG/HOS、ヒト膵臓癌細胞株としてBxPC3、COLO-357HPAC、MIAPaCa-2、Panc-1、ヒト結腸癌細胞株としてLS123等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、HEK293（ヒト胎児腎細胞）、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five（登録商標）、Vero等が含まれる。
　本発明における細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織が底面に対し接触はし得るが付着しない状態（非接着）であることをいう。更に、本発明において、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散しなおかつ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、5分以上、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
　本発明に用いる培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、0～40℃）の少なくとも1点において、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは25～37℃の温度範囲の少なくとも1点において、最も好ましくは37℃において、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織の浮遊静置が可能である。
　浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、2×104cells/mlの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、15mlコニカルチューブ中に10ml注入し、少なくとも5分以上（例、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上）、37℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの70％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Size 500-600μm、Polysciences Inc.製）に代替して評価してもよい。
　本発明に用いる培地組成物は、細胞（または細胞凝集塊）または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）構造体と培地を含有する組成物である。
　本発明に用いる培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において、培地組成物からの細胞（または細胞凝集塊）または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、培地組成物からの細胞（または細胞凝集塊）または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
　本発明における構造体とは、特定化合物から形成されたもので、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開2004-129596号公報）、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
　また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。
　本発明における構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が0.2μm乃至200μmのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、1μmを超えるものであり、安定に細胞（または細胞凝集塊）または組織を浮遊させることを考慮すると、更に好ましくは5μmを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、100μm以下のもの、細胞（または細胞凝集塊）または組織の大きさを考慮すると、更に好ましくは70μm以下のものである。
　本発明における特定化合物とは、特定化合物を液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が8mPa・sを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明に用いる培地組成物の粘度）は、37℃において、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。更に、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
　構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には37℃条件下でE型粘度計（東機産業株式会社製、TV-22型粘度計、機種：TVE-22L、コーンロータ：標準ロータ　1°34´×R24、回転数100rpm）を用いて測定することができる。
　本発明に用いる培地組成物は、当該培地組成物中で癌細胞を浮遊培養することにより、これをレシピエント哺乳動物に移植した際の、生体における生着率及び生育能の向上を達成し得る限り、特定化合物によりその粘度が高められている（液体の粘度が8mPa・sを上回る）ことを妨げるものではないが、好ましくは、本発明に用いる培地組成物の粘度は、実質的に高められていない（粘度が8mPa・sを上回らない）。本発明に用いる培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。
　本発明に用いる特定化合物の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
　アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
　本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
　本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が10個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、DAGという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より1種又は2種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のし易さを考慮すると、最も好ましくは、DAGである。
　ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
　これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは10，000乃至50，000，000であり、より好ましくは100，000乃至20，000，000、更に好ましくは1，000，000乃至10，000，000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるプルラン換算で測定できる。
　更に、DAGはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
　本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともDAG又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、DAG又はその塩、及びDAG又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、DAGとラムザンガム、DAGとダイユータンガム、DAGとキサンタンガム、DAGとカラギーナン、DAGとザンタンガム、DAGとローカストビーンガム、DAGとκ-カラギーナン、DAGとアルギン酸ナトリウム、DAGとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明に用いる特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム、並びにそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のし易さの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。
　本発明における脱アシル化ジェランガムとは、1-3結合したグルコース、1-4結合したグルクロン酸、1-4結合したグルコース及び1-4結合したラムノースの4分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（I）において、R1、R2が共に水素原子であり、nは2以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、R1がグリセリル基を、R2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは10％以下であり、より好ましくは1％以下である。
　本発明における構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明に用いる培地組成物の粘度は、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、細胞（または細胞凝集塊）または組織の回収のし易さの点を考慮すると、より好ましくは2mPa・s以下である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明における特定化合物は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、1-3結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液-液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスLH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
　そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL（シーピー・ケルコ社の登録商標）CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）HT」等を使用することができる。
　培地中での特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常0.0005％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.001％乃至0.4％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.1％（w/v）、更に好ましくは0.005％乃至0.05％（w/v）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.01％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.05％乃至0.5％（w/v）、最も好ましくは、0.1％乃至0.2％（w/v）培地中に添加すれば良い。κ-カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.005％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.01％乃至0.1％（w/v）、最も好ましくは、0.03％乃至0.05％（w/v）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、0.05％乃至1.0％(w/v)、好ましくは、0.05％乃至0.1％(w/v)培地中に添加すれば良い。
　上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、DAG又はその塩と、DAG又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、DAG又はその塩の濃度としては0.005～0.02％（w/v）、好ましくは0.01～0.02％（w/v）が例示され、DAG又はその塩以外の多糖類の濃度としては、0.0001～0.4％（w/v）、好ましくは0.005～0.4％（w/v）、より好ましくは0.1～0.4％（w/v）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
DAG又はその塩：0.005～0.02％（好ましくは0.01～0.02％）（w/v）
DAG以外の多糖類
キサンタンガム：0.1～0.4％（w/v）
アルギン酸ナトリウム：0.0001～0.4％（w/v）（好ましくは、0.1～0.4％（w/v））
ネイティブジェランガム：0.0001～0.4％（w/v）
ローカストビーンガム：0.1～0.4％（w/v）
メチルセルロース：0.1～0.4％（w/v）（好ましくは0.2～0.4％（w/v））
カラギーナン：0.05～0.1％（w/v）
ダイユータンガム：0.05～0.1％（w/v）
　なお該濃度は、以下の式で算出できる。
　濃度［％（w/v）］＝特定化合物の重量（g）/培地組成物の容量（ml）×100
　前記化合物は、化学合成法によって更に別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式（I）で表される化合物のR1及び／又はR2に当たる水酸基を、C1-3アルコキシ基、C1-3アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
　本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。
　本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在しもよい。本発明の化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
　本発明に用いる培地組成物には、金属イオン、例えば2価の金属イオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、2種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地組成物に金属イオン（例、カルシウムイオン）が含まれることにより、高分子化合物が当該金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより（例えば、多糖類が金属イオン（例、カルシウムイオン）を介してマイクロゲルを形成することにより）本発明の構造体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。金属イオン濃度は0.1mM乃至300mMで、好ましくは、0.5mM乃至100mMであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。また本発明に用いる培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
　本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞（または細胞凝集塊）数及び／又は組織数を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合がある。しかし、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合がある。しかし、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を浮遊培養し、その状態、機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合がある。しかし、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。
　本発明における特定化合物を用いて細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を培養する際には、細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と特定化合物を混合して培地組成物を調製することができる。このような培地の組成による分類では天然培地、半合成培地、合成培地、また、形状による分類では半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）などが挙げられる。細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。このような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM）、ハムF12培地（Ham’s Nutrient Mixture F12）、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地（McCoy’s 5A medium）、イーグルMEM培地（Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM）、αMEM培地（alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM）、MEM培地（Minimum Essential Medium）、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM）、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34（インビトロジェン社製）、X-VIVO 10（ケンブレックス社製）、X-VIVO 15（ケンブレックス社製）、HPGM（ケンブレックス社製）、StemSpan H3000（ステムセルテクノロジー社製）、StemSpanSFEM（ステムセルテクノロジー社製）、StemlineII（シグマアルドリッチ社製）、QBSF-60（クオリティバイオロジカル社製）、StemProhESCSFM（インビトロジェン社製）、Essential8（登録商標）培地（ギブコ社製）、mTeSR1或いは2培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロFF或いはリプロFF2（リプロセル社製）、PSGro hESC/iPSC培地（システムバイオサイエンス社製）、NutriStem（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、CSTI-7培地（細胞科学研究所社製）、MesenPRO RS培地（ギブコ社製）、MF-Medium（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Sf-900II（インビトロジェン社製）、Opti-Pro（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
　癌細胞及び癌周囲細胞の培養に用いられる培地には、上記培地に、細胞接着因子を含むことが可能できる。その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、2種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、癌細胞をスフェアとして浮遊培養する場合に用いられる培地に対してグァーガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
　上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
　動物由来の細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。
　培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
　本発明における特定化合物を上記の培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて当該特定化合物を用時溶解または分散させる（これを、培地添加剤とする。）。その後、培地中での特定化合物濃度として、上に詳述したように、（好ましくは、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く）細胞（または細胞凝集塊）及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば0.0005％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.001％乃至0.4％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.1％（w/v）、更に好ましくは0.005％乃至0.05％（w/v）となるように、当該培地添加剤を培地中に添加すれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.05％（w/v）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.01％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.05％乃至0.5％（w/v）、最も好ましくは、0.1％乃至0.2％（w/v）培地中に添加すれば良い。κ-カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.005％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.01％乃至0.1％、最も好ましくは、0.03％乃至0.05％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとダイユータンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.005％乃至0.01％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとメチルセルロースの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.005％乃至0.2％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.1％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.1％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.1％（w/v）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ-カラギーナンの混合系の場合、両化合物の総和として、0.001％乃至1.0％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.1％（w/v）培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
　濃度［％（w/v）］＝特定化合物の重量（g）/培地組成物の容量（ml）×100
　ここで、培地添加剤に用いる適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（DMSO）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられるが、これらに限られるわけではない。この際、特定化合物濃度は0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.01％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.1％乃至0.6％（w/v）とすることが望ましい。その際、当該特定化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を1種以上添加することができる。また、当該特定化合物を培養の際に担体表面上に固定化或いは、担体内部に担持して使用することもできる。当該特定化合物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該特定化合物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、PES（ポリエーテルスルホン）、親水性PVDF（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、0.1μm乃至10μm、より好ましくは、0.1μm乃至1μm、最も好ましくは、0.1μm乃至0.5μmである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
　上記調製により特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより、液体培地中に上記構造体が形成され、本発明に用いる培地組成物を得ることができる。培地には通常、高分子化合物がイオンを介して集合、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオン（例、カルシウムイオン等の2価金属イオン）が含まれるので、本発明の特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、本発明に用いる培地組成物を得ることができる。あるいは、培地添加剤（特定化合物の溶液又は分散液）に培地を添加してもよい。更に、本発明に用いる培地組成物は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒（例えばイオン交換水や超純水等を含む水）中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、（1）液体培地と培地添加剤（溶液）とを混合する、（2）液体培地に上記高分子化合物（粉末等の固体）を混合する、（3）培地添加剤（溶液）に粉末培地を混合する、（4）粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる培地組成物における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、（1）若しくは（4）又は（1）若しくは（3）の態様が好ましい。
　特定化合物を溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば80℃～130℃、好ましくは加熱滅菌されるような100℃～125℃（例、121℃）が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の2価金属イオン）を添加することにより（例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより）、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の2価金属イオン）を含む溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する際に、加熱（例えば80℃～130℃、好ましくは100℃～125℃（例、121℃））し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。
　本発明に用いる培地組成物の調製方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。特定化合物をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度（例えば、60℃以上、80℃以上、90℃以上）にて撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば、121℃にて20分でのオートクレーブ滅菌）を行う。室温に戻した後、静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明に用いる培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
　あるいは、粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合し、上記温度で加熱することで本発明に用いる培地組成物を調製する。
　例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1％乃至1％（w/v）、好ましくは0.2％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.3％乃至0.4％（w/v）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、0.1％乃至1％（w/v）、好ましくは0.2％乃至0.8％（w/v）、より好ましくは0.3％乃至0.6％（w/v）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
　そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であればよいが、例えば60℃以上、好ましくは80℃以上、より好ましくは90℃以上（例、80～130℃）にて撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば121℃にて20分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばDMEM/F12培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が0.015％の場合は0.3％水溶液：培地の比率は1：19）、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明に用いる培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、5μm乃至100μm、好ましくは5μm乃至70μm、より好ましくは10μm乃至70μmである。
　本発明に用いる培地組成物及びその製造方法の好適な態様を以下に記載する。
　本発明に用いる培地組成物は、好適には、細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物であって、前記培地組成物の粘度が、8mPa・s以下（37℃条件下）であり、且つ脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有することを特徴とする、培地組成物である。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度が、0.01～0.05％（w/v）である。一態様において、当該培地組成物は、更に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有する。一態様において、当該培地組成物には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の2価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。
　当該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムまたはその塩と培地とを混合することにより製造することが出来る。一態様において、当該培地は液体培地である。一態様において、当該液体培地には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の2価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩と、培地とを混合する。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩は、滅菌された状態である。一態様において、滅菌はオートクレーブ滅菌により行われる。別の態様において、滅菌はろ過滅菌により行われる。一態様において、ろ過滅菌は0.1～0.5μmのフィルターを通過させることにより実施する。
（2）共培養方法
　本発明は、培地組成物I中で、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養することを含む、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法を提供する。
　本発明に用いる癌細胞は、好ましくは、生体内において固形腫瘍を形成する能力を有する癌細胞である。
　固形腫瘍を形成する能力を有する癌細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、線維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。固形腫瘍を形成する能力を有する癌細胞は、好ましくは、上皮細胞由来の悪性腫瘍、即ち癌腫（カルシノーマ）細胞（例、大腸癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、結腸癌腫）である。
　癌周囲細胞とは、癌細胞とともに、生体内の腫瘍組織を構成し、癌細胞の微小環境に寄与することができる細胞を意味する。癌周囲細胞としては、線維芽細胞、星細胞、血管内皮細胞、マクロファージ、白血球などの炎症性細胞等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。癌周囲細胞は、好ましくは、線維芽細胞、マクロファージである。癌周囲細胞は、癌組織から単離された細胞に限られるものではなく、正常組織等の非癌組織から単離された細胞も包含される。癌周囲細胞は、癌細胞が由来する組織（例えば、肺癌細胞であれば肺組織）から単離されたものでもよく、癌細胞が由来する組織とは異なる組織から単離されたものでもよいが、好ましくは、癌細胞が由来する組織である。癌周囲細胞は、癌細胞を単離した癌組織から同時に単離されたもの、癌細胞が由来する組織と同一種であるが、別の患者の組織中に発生した癌組織から単離されたもの（例えば、肺癌細胞であれば、該肺癌細胞が由来する患者とは別の患者の肺癌組織）、癌細胞が由来する組織と同一種である、正常組織から単離されたもの、癌細胞が単離された癌組織とは別の独立した癌組織から単離されたもの等であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、癌周囲細胞は、癌細胞を単離した癌組織から同時に単離されたものである。簡便性、汎用性の観点から、市販の、株化線維芽細胞、株化マクロファージ、単離線維芽細胞、単離白血球、単離血管内皮細胞等を用いてもよい。
　本発明の方法において培養される癌細胞及び癌周囲細胞は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された癌細胞」の純度（総細胞数に占める癌細胞数の百分率）は、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％である。即ち、本発明の方法において、培地組成物I中に浮遊した状態で培養されている全ての細胞の通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が癌細胞であり、培地組成物I中に固相に接着した状態で培養されている全ての細胞の通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が癌周囲細胞である。
　本発明の方法においては、同一系内（例、同一ウェル内）において、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養する。一態様において、本発明の方法において培養される癌細胞の、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が培地組成物I中で浮遊している。一態様において、本発明の方法において培養される癌周囲細胞の、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が固相に接着している。
　固相としては、下記に詳述する培養容器の内壁面（例、底面）の他、マイクロキャリア、スキャフォールド等が挙げられる。固相は、好ましくは、培養容器の内壁面（例、底面）である。
　癌細胞と癌周囲細胞の共培養は、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することが可能である。
　本発明の方法を、ハイスループットスクリーニング等に適用する場合、培養容器としては、マルチウエルプレートを用いることが好ましい。マルチウエルプレートの大きさ（約127mm×約85mm）及び形はほぼ世界的に統一されており、形状は同じであるが、ウェルの大きさにより、6ウェル、12ウェル、24ウェル、48ウェル、96ウェル、384ウェルなどのバリエーションがある。ハイスループットスクリーニング等に適用する場合、好ましくは、48～384ウェルプレート、より好ましくは96～384ウェルプレートが用いられる。本発明により、このようなマルチウェルプレート中で、癌細胞を足場非依存性の状態で、癌周囲細胞と直接共培養することが可能となる。
　癌周囲細胞が接着する固相として、培養容器の内壁面（例、底面）を使用する場合、使用する培養容器は、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養容器としては、培養容器の内壁面（例、底面）が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、ポリリジン、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているものを使用できる。
　浮遊培養する癌細胞の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。生体内の癌組織内にできる限り近い系を構築する観点から、好ましくは、固相担体表面上に接着したり、担体に包埋されていない状態で、癌細胞が浮遊培養に付される。好ましくは、癌細胞は、単一細胞の状態で培地組成物I中に分散した状態、又は複数個の細胞が集合し細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態で、培地組成物I中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。これらの状態の内、細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態は、生体内環境に近い細胞－細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、好ましい。また、スフェアの大きさは最大径の平均値として、500μm以下であることが好ましく、50～100μmが最も好ましい。
　細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、3次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。
　培養組成物Iを用いてスフェアを形成させることもできる。例えば、スフェアは、目的とする癌細胞を細胞分散用酵素処理により単一細胞として回収したのち、培養組成物I中に均一に分散させ、3日間乃至10日間静置して浮遊培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。
　癌細胞と癌周囲細胞を共培養する際には、例えば、上述の培養容器内で癌周囲細胞を固相（例、培養容器の底面等の内壁）に接着した状態で培養しておき、必要に応じて培養液を除去した後に、培養組成物I中の癌細胞懸濁液を添加し、引き続き培養する。癌細胞懸濁液は、培養組成物Iに対して別途調製した癌細胞を添加し、均一に分散される様に混合することにより得ることが出来る。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。
　一態様において、接着性の癌細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。癌細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された接着性の癌細胞を、培地組成物I中に懸濁し、得られた懸濁液を、固相（例、培養容器の底面等の内壁）に接着した癌周囲細胞を含む培養容器内に添加し、引き続き培養する。
　浮遊培養する癌細胞と固相培養する癌周囲細胞が直接接しうる培養条件では、癌周囲細胞の培養層に直接DAG含有培地中に懸濁した癌細胞を重層することができる。浮遊培養する癌細胞と固相培養する癌周囲細胞が直接接しない培養条件では癌周囲細胞の培養相の上に、37℃で温めた、任意の培地に0.5～2％、好ましくは1％の濃度で溶解した低温融解アガロースを重層し、4℃～25℃で固化したアガロース層を作成し、その上にDAG含有培地中に懸濁した癌細胞を重層することができる。
　共培養は、静置の状態で行ってもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよいが、好ましくは静置培養する。
　癌細胞及び癌周囲細胞を培養する際の温度は、通常25乃至39℃、好ましくは37℃である。CO2濃度は、通常、培養の雰囲気中、4乃至10体積％であり、好ましくは5体積％である。酸素濃度は、培養の雰囲気中、15～50体積％であり、好ましくは20体積％である。
　培地組成物I中での共培養期間は、培養の目的により適宜設定することが可能であり、特に限定されないが、通常12時間以上、好ましくは24時間以上、より好ましくは48時間以上である。培養期間の上限は、理論的には無限であるが、癌細胞の形質が変化してしまうのを避ける観点からは、例えば30日以内程度、好ましくは10日以内程度に留めておくことが好ましい。
　共培養物中、癌細胞は、単一細胞の状態で、又はスフェアの状態で、培地組成物I中に浮遊した状態で維持されながら、増殖する。即ち、癌細胞は、足場非依存性の状態で、培地組成物I中に浮遊している。一方、癌周囲細胞は、固相（例、培養容器の底面等の内壁面）に接着した状態で、培養される。そのため、癌細胞と癌周囲細胞との直接的な接触は、当該固相表面（例、培養容器の底面等の内壁面）の極めて少数の細胞に限定され、大部分の浮遊する癌細胞は、癌周囲細胞とは直接接触せずに、癌周囲細胞から分泌された液性因子の影響のみを受けることになる。このような癌細胞と癌周囲細胞との間の相互作用は、生体内癌組織における環境と近似しているため、生体内癌組織における様々な癌細胞の特性解明研究、生体内癌組織での有効性が期待できる抗癌剤のスクリーニング、癌を治療又は予防するための医薬品の評価等に有用である。
　更に、本発明の方法により共培養を行った後に、浮遊培養した癌細胞を癌周囲細胞から分離することにより癌細胞のみを回収し、その細胞応答（遺伝子発現、増殖、細胞内カルシウムイオン濃度変化等の測定可能な生物学的反応）を解析することにより、癌周囲細胞から分泌された液性因子の癌細胞への影響を調べることが出来る。例えば、当該細胞応答を、癌周囲細胞なしの陰性対照群（癌周囲細胞なしであること以外は同一培養条件で培養した癌細胞）における細胞応答と比較する。本発明の方法では、上記培地組成物Iを用いて癌細胞を浮遊培養する一方、同一培地中で癌周囲細胞を接着培養するので、共培養後の癌細胞と癌周囲細胞との分離、及び癌細胞の回収を容易に行うことが可能である。
　更に、本発明は、上記本発明の方法により得られる、癌細胞及び癌周囲細胞を含む培養調製物をも提供する。当該培養調製物においては、癌細胞は上記培地組成物I中に浮遊した状態にあり、癌周囲細胞は、固相に接着した状態にある。一態様において、培養調製物中に含まれる癌細胞の、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が培地組成物I中に浮遊した状態にあり、培養調製物中に含まれる癌周囲細胞の、通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは99％以上、最も好ましくは100％が固相に接着した状態にある。
（3）抗癌剤のスクリーニング方法
　本発明は、以下の工程を含む、抗癌剤のスクリーニング方法を提供する：
（1）被検物質の存在下、上記本発明の方法により、癌細胞と癌周囲細胞を共培養すること、
（2）（1）の培養後の癌細胞の生存細胞数を測定すること、及び
（3）（2）で測定した癌細胞の生存細胞数を、被検物質の非存在下で培養した対照癌細胞の生存細胞数と比較すること。
　被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、ランダム核酸ライブラリーあるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。また、上記物質を担持した人工高分子であってもよい。
　被検物質の存在下での培養期間は、当該被検物質の抗癌剤としての効果の有無を評価可能であれば、特に限定されないが、通常12時間～7日間程度である。
　共培養後、癌細胞の生存細胞数を測定する。生存細胞数の測定方法は、当業者に周知であり、例えば、WST試薬、ATP測定試薬等を用いた方法があるが、これに限定されない。バックグラウンドを低減するために、癌細胞の生存細胞数の測定は、癌周囲細胞から癌細胞を分離して行うことが好ましい。本発明の方法では、上記培地組成物Iを用いて癌細胞を浮遊培養する一方、同一培地中で癌周囲細胞を接着培養するので、共培養後の癌細胞と癌周囲細胞との分離、及び癌細胞の回収を容易に行うことが可能である。
　次に、被検物質存在下で培養した癌細胞の生存細胞数を、被検物質の非存在下で培養した対照癌細胞（被検物質なしであること以外は同一培養条件で培養した癌細胞）の生存細胞数と比較する。生存細胞数の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行なわれ得る。対照癌細胞の生存細胞数は、被検物質存在下で培養した癌細胞の生存細胞数の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定されたものであることが好ましい。
　比較の結果、当該被検物質の添加により、癌細胞の生存細胞数を減少させた物質を、抗癌剤の候補物質（特に、培養した癌細胞に対して有効な抗癌剤の候補物質）として選択することが出来る。本発明のスクリーニング方法では、生体内癌組織に近似した環境下で、抗癌剤に対する癌細胞の感受性が評価されるので、癌周囲細胞の影響を受けた生体内癌組織でも抗腫瘍効果を発揮することが期待できる抗癌剤を高い効率で選択することができる。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下に本発明の培地組成物の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［参考例1］
　0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL　CG-LA、三昌株式会社製）及び胎児ウシ血清（0.5、1.25、2.5、又は10％（v/v））を含有するDMEM培地（和光純薬工業株式会社製）を特許文献1の方法に従いホモミキサーにて調製し、以下の試験に用いた（DAG培地）。
［試験例1］
（方法）
　癌細胞としてヒト肺癌由来癌細胞株A549細胞を、癌周囲細胞として正常ヒト肺胞由来線維芽細胞を用いた。肺胞線維芽細胞を96穴培養プレートに接着単層培養した。別途培養したA549細胞をトリプシン処理にて回収し、上記DAG培地に懸濁した。癌細胞懸濁液を単層培養した線維芽細胞の培養穴に2500～20000細胞添加した。その後、各種抗癌剤を添加した。癌細胞を5日間浮遊培養後、癌細胞培養物を回収した。得られたA549癌細胞懸濁液にWST試薬あるいはATP測定試薬（Cell titer GLO）を添加し、細胞数を測定した。
（結果1）
　A549細胞をDAG培地に懸濁し、96well培養plate中で培養したfibroblast上に播種した（2500、5000、10000又は20000 cells/well）。5日培養後、DAG培地中のA549細胞を回収し細胞数を計測した。A549細胞を単独で培養した場合には、その細胞増殖は低いが、Fibroblastとの共培養では、その細胞増殖が著明に促進され、低いFBS濃度から高い細胞増殖活性が達成された（図1）。
　一方、Preset VECELLを用いた共培養（外郭ウェル内でfibroblastを単層培養し、内包ウェル内でA549細胞を単層培養）では、A549細胞の単独培養でも高い細胞増殖が認められ、fibroblastとの共培養による増殖促進効果はDAG培地を用いた共培養に比較して小さかった（図2）。
　DAG培地を用いた3次元浮遊培養によるfibroblastとの共培養において、その効果が明瞭であった。
（結果2）
　A549細胞の細胞増殖に対する抗癌剤の効果を、Fibroblastとの共培養と単独培養とで比較した。Paclitaxel、Gefitinib、MK2206及びTrametinibの細胞増殖抑制効果は、低濃度領域で、Fibroblastとの共培養系で減弱する傾向が認められ、この現象はPreset VECELLでの共培養とDAG培地中での共培養で同様に認められた（図3～5）。特に、gefitinibでは高濃度においても共培養系では、抗がん剤効果が消失していた。一方、CYT387の増殖抑制効果は、共培養により減弱しなかった（図6）。この傾向は、Preset VECELLでの共培養とDAG培地中での共培養で同様に認められた。Preset VECELLなどのインサートウェル法では、最大でも1プレート培養で24ポイントのスループットであるが、DAG培地等を用いた浮遊培養方法では96穴プレート培養において24穴培養と同等の結果が得られており、従来の4倍以上のスループットが得られた。
［試験例2］
　癌細胞としてヒト乳癌由来癌細胞株MCF7細胞を、癌周囲細胞として正常ヒト乳腺由来線維芽細胞を用いた。乳腺線維芽細胞を96穴培養プレートに接着単層培養した。別途培養したMCF7細胞をトリプシン処理にて回収し、上記DAG培地に懸濁した。癌細胞懸濁液を単層培養した線維芽細胞の培養穴に2500～20000細胞添加した。その後、各種抗癌剤を添加した。癌細胞を5日間浮遊培養後、癌細胞培養物を回収した。得られたMCF7癌細胞懸濁液にWST試薬あるいはATP測定試薬（Cell titer GLO）を添加し、細胞数を測定した。
（結果1）
　MCF7細胞をDAG培地に懸濁し、96well培養plate中で培養したfibroblast上に播種した（2500、5000、10000又は20000 cells/well）。5日培養後、DAG培地中のMCF7細胞を回収し細胞数を計測した。MCF7細胞の増殖は、Fibroblastとの共培養により抑制された（図7）。
　一方、Preset VECELLを用いた共培養（外郭ウェル内でfibroblastを単層培養し、内包ウェル内でMCF7細胞を単層培養）では、MCF7細胞の増殖は、fibroblastとの共培養により逆に促進された（図8）。
　このように、MCF7細胞の増殖に対する、fibroblastとの共培養の効果は、DAG培地中でMCF7細胞を浮遊培養した場合と、Preset VECELLを用いてMCF7細胞を単層培養した場合で、反対であった。
（結果2）
　MCF7細胞の細胞増殖に対する抗癌剤の効果を、Fibroblastとの共培養と単独培養とで比較した。Paclitaxel、MK2206、Trametinib及びCYT387の細胞増殖抑制効果は、低濃度領域で、Fibroblastとの共培養系で減弱する傾向が認められ、この現象はPreset VECELLでの共培養とDAG培地中での共培養で同様に認められた（図9、11～13）。一方、Gefitinibは、MCF7細胞に対する増殖抑制効果が認められなかった（図10）。Preset VECELLなどのインサートウェル法では、最大でも1プレート培養で24ポイントのスループットであるが、DAG培地等を用いた浮遊培養方法では96穴プレート培養において24穴培養と同等の結果が得られており、従来の4倍以上のスループットが得られた。
　本発明により、癌細胞を足場非依存性の状態で、癌周囲細胞と直接共培養することが可能となるので、生体内癌組織における様々な癌細胞の特性解明研究や、様々な種類の抗癌剤の探索、開発研究を促進する。本発明により、生体内癌組織に近似した環境下で、抗癌剤のスクリーニングを行うことができるので、癌周囲細胞の影響を受けた生体内癌組織でも抗腫瘍効果を発揮する抗癌剤を高い効率で選択することができる。また、本発明により、簡便でかつ、96穴培養プレート、384穴培養プレート等のマルチウェル培養プレートに対応したHigh-throughput screeningに適用可能な癌細胞／癌周囲細胞共培養系が提供される。
　本出願は、日本で出願された特願２０１５－１９５１１９（出願日：２０１５年９月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　細胞又は組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、癌細胞を浮遊した状態で、癌周囲細胞を固相に接着した状態で、それぞれ培養することを含む、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法。
  2. 　癌細胞が固形腫瘍を形成する能力を有する、請求項1記載の方法。
  3. 　癌周囲細胞が、線維芽細胞、星細胞、及び血管内皮細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞である、請求項1又は2記載の方法。
  4. 　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項1～3のいずれか1項記載の方法。
  5. 　培地組成物中の脱アシル化ジェランガム濃度が0.005～0.3％（w/v）である、請求項4記載の方法。
  6. 　培地組成物の37℃における粘度が、8mPa・s以下である、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
  7. 　請求項1～6のいずれか1項記載の方法により得られる、癌細胞及び癌周囲細胞を含む培養調製物。
  8. 　以下の工程を含む、抗癌剤のスクリーニング方法：
    （1）被検物質の存在下、請求項1～6のいずれか1項記載の方法により、癌細胞と癌周囲細胞を共培養すること、
    （2）（1）の培養後の癌細胞の生存細胞数を測定すること、及び
    （3）（2）で測定した癌細胞の生存細胞数を、被検物質の非存在下で培養した対照癌細胞の生存細胞数と比較すること。
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