JP6879517B2 - 培地組成物及び当該組成物を用いた細胞又は組織の培養方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞又は組織を浮遊させることを可能とする構造体を含有する培地組成物、及び当該培地組成物を用いることを特徴とする細胞又は組織の培養方法に関する。本発明の培地組成物及びそれを用いた細胞培養方法は、動植物細胞及び／又は組織を特に浮遊状態にて培養する際に好適に利用することができる。
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。
動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及びスフェア培養等が知られている。
単層培養は、ガラス或いは種々の表面処理を行った合成高分子材料から成る培養容器や、フィーダー細胞と呼ばれる補助的な細胞を足場として目的の細胞を単層状に培養する方法であり、最も一般的に普及している。例えば、ポリスチレンに対して種々の表面処理（プラズマ処理、コロナ処理等）を施したもの、コラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着因子をコーティングしたもの、或いはフィーダー細胞を予め播種したもの等、種々の形状又は性状の培養容器を用いた培養方法が開発されている。しかしながら、単層培養は、その二次元的培養環境が生体内での環境と全く異なるために細胞が生体内で有している特異的な機能を長期間維持することができない、生体内と同様な組織を再構築する事ができない、一定面積当たりの細胞数が制限されるため細胞の大量培養には向かない、等が問題となっている（特許文献１）。また、フィーダー細胞上にて目的の細胞を培養する方法は、フィーダー細胞と目的の細胞との分離が問題となる場合がある（非特許文献１）。
分散培養は、培地中に細胞を播いた後、細胞の付着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて、その培養液を撹拌し続けることにより細胞の培養容器への接着を阻害し、浮遊状態で接着細胞を培養する方法である。しかしながら、当該方法で培養される接着細胞は足場への接着ができないため、細胞増殖のために足場への接着を必須とする細胞には応用できない。また、せん断力で常時破砕されることにより本来の細胞機能を発揮できないため、機能を有する細胞を大量に培養することができない場合がある（非特許文献２）。
包埋培養は、寒天、メチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形或いは半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。当該方法は、細胞を生体内に近い形で三次元的に培養することを可能とし、ゲル基材そのものが細胞の増殖や分化を促進する場合もあるため単層培養や分散培養と比較して、細胞の機能を維持したまま細胞を高密度に培養することが可能である（特許文献２、３）。更に、これらのゲル基材を細胞に埋め込んだ状態で大きさ１００〜３００μｍのマイクロカプセルを作成し、当該マイクロカプセルを分散させながら水溶液培地で細胞を培養する方法も開発されている（非特許文献３）。しかしながら、これらの方法は、ゲル基材が可視光を透過しない場合は培養細胞の継時的な観察ができない、ゲル基材を含む培地やマイクロカプセルは粘度が高いため当該培地中から細胞を回収するために酵素処理（例えば、コラーゲンゲルの場合はコラゲナーゼ処理）等の煩雑かつ細胞に障害を与える操作を必要とする、長期間培養する際に必要な培地交換が困難である等の問題を有している。近年、熱やせん断力などの処理によりゲル基材から細胞回収が可能となる技術が開発されているが、熱やせん断力等は細胞機能に悪影響を与えることがある上に、当該ゲル基材の生体に対する安全性については未だ明らかにはなっていない（特許文献４、５、非特許文献４、５、６、７）。また、小さくカットした果実や野菜等の粒状食品を均一に分散、浮遊させ、その沈殿や浮上を防ぐためのゾル状食品が食品分野にて開発されているが、当該ゾル状食品は分散させた粒状食品を回収することは考慮しておらず、細胞や組織を浮遊状態で培養できるかどうかの検討もなされていない（特許文献６）。
マイクロキャリア培養は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。通常、当該方法で用いるマイクロキャリアは、直径１００〜３００μｍ、表面積３０００〜６０００ｃｍ２／ｇ、比重１．０３〜１．０５の球状粒子であり、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸あるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基を付与することもできる。当該方法は、培養面積を極めて増大させることが可能になるため、細胞の大量培養に応用されている（特許文献７、８）。しかしながら、全てのマイクロキャリアで目的とする細胞をほぼ均一に付着させることは困難であり、また、撹拌中のせん断力により細胞がマイクロキャリアから脱離する、細胞が障害を受ける等が問題となっている（非特許文献８）。
スフェア培養は、目的の細胞が、数十〜数百個から成る凝集塊（以下、スフェアともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置或いは振とうして培養する方法である。スフェアは、細胞密度が高く、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、単層培養、分散培養法よりも細胞機能を長期的に維持したまま培養できることが知られている（非特許文献９、１０）。しかしながら、スフェア培養は、スフェアのサイズが大きすぎる場合、スフェア内部の栄養分の供給と老廃物の排出が困難となるため、大きなスフェアを形成させることができない。また、形成したスフェアは培養容器の底面において分散状態で培養する必要があるため、一定体積あたりのスフェア数を増やすことが困難であり、大量培養には向かない。さらに、スフェアの作成方法としては、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、細胞の足場を利用した培養、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などが知られているが、これらの方法は操作が煩雑、スフェアの回収が困難、サイズの制御と大量生産が困難、細胞に対する影響が不明、特殊な専用容器や装置が必要である等が問題となっている（特許文献９）。
一方、植物に関しても細胞、細胞壁を除去したプロトプラストあるいは植物の葉、茎、根、成長点、種子、胚、花粉などの器官、組織、カルスを無菌の状態で培養して増やすことができる。このような植物の組織や細胞の培養技術を用いて、植物の品種改良や有用物質生産も可能となっている。植物の細胞や組織を短期間で大量に増殖させるための手法として、植物細胞や組織を液体培地で懸濁培養する方法が知られている（非特許文献１１）。それらの良好な増殖を達成するためには、十分な酸素の供給と均一な混合状態の維持、さらに細胞の破損を防ぐ等が重要である。培養液への酸素の供給と細胞や組織の懸濁は、通気と機械的攪拌とを組み合わせて行なわれる場合と、通気のみにより行なわれる場合とがあるが、前者は、攪拌による細胞や組織の破損が原因で増殖不良を招く場合があり、一方、後者は細胞や組織のせん断は少ないが、高密度培養では均一な混合状態を維持することが困難となる場合があるため、細胞や組織が沈降して増殖効率が低下する等の問題がある。
さらに、抗がん剤の研究開発或いはがん治療における適切な抗がん剤の選択のために、候補薬剤或いは抗がん剤を含有する培養液中でがん細胞を生体外で培養することにより、がん細胞に対する薬剤の抗がん活性を評価することが行われている。しかし、既存の抗がん活性の評価方法では、生体外での評価結果と実際の臨床効果に乖離がある等の問題が存在する。当該問題を改善するため、体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、軟寒天、コラーゲンゲル、ハイドロゲル等の支持体にてがん細胞を包埋することにより、培養容器への接着を阻害した環境でがん細胞を培養し、抗がん剤の評価を行う方法が開発されている（特許文献１０、非特許文献１２、１３）。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングすることや、表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害してがん細胞を凝集させた状態にて培養（スフェア培養）し、抗がん活性の評価を行う方法が開発されている（特許文献１１、１２）。
しかしながら、これらのがん細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して抗がん活性を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分である際には高価であるためにその供給が制限される場合がある、細胞凝集塊（スフェア）同士の会合が生じてその大きさが過剰になり細胞生存率や再現性が低くなる等の様々な問題がある。その上、抗がん剤のスクリーニングを実施する際には、簡便かつ均一で、大量のサンプルを処理できる、再現性の高いがん細胞の培養方法が求められている。
加えて、医薬品候補剤或いは医薬品を含有する培養液中で肝細胞を生体外で培養することにより、肝細胞に対する医薬品候補剤或いは医薬品の各種活性を評価することが行われている。しかし、肝細胞を生体外で培養すると本来生体内で有している機能が失われる場合があるため、既存の肝細胞の培養方法では、医薬品候補剤或いは医薬品の正確な評価ができない、多数のサンプルの評価が困難である等の問題が存在した。当該問題を克服するため、体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（登録商標）等の細胞外マトリックス上にて肝細胞を培養し、肝細胞の機能を維持する方法が開発されている（特許文献１３、非特許文献１４、１５）。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングする、容器表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害する、培養容器を振動させる等の処理により肝細胞の凝集塊（スフェア）を形成させ、肝細胞の機能を維持する方法が開発されている（特許文献１４、１５、非特許文献１６、１７）。
しかしながら、これらの肝細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して肝細胞機能を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分であると高価である故その供給が制限される場合がある、細胞凝集塊（スフェア）同士の会合が生じてその大きさが過剰になるために細胞生存率や再現性が低くなる等の様々な問題がある。その上、医薬品候補剤或いは医薬品のスクリーニングを実施する際には、簡便かつ均一で、大量のサンプルを処理できる、再現性の高い肝細胞の培養方法が求められている。
特開２００１−１２８６６０号公報 特開昭６２−１７１６８０号公報 特開昭６３−２０９５８１号公報 特開２００９−２９９６７号公報 特開２００５−６０５７０号公報 特開平８−２３８９３号公報 特開２００４−２３６５５３号公報 国際公開第２０１０／０５９７７５号 特開２０１２−６５５５５号公報 特開２００８−１１７９７号公報 特開２００８−６１６０９号公報 特開２０１２−２４９５４７号公報 国際公開第２００５／０２８６３９号 国際公開第２０１０／０７９６０２号 特開２００９−５０１９４号公報
Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら，Ｌａｎｃｅｔ ２００５，３６５：１６３６−１６４１ Ｋｉｎｇら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００７，１１：３９４−３９８ Ｍｕｒｕａら，Ｊ．ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００８，１３２：７６−８３ Ｍｅｎｄｅｓ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００８，３７：２５１２−２５２９ Ｍｏｏｎら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ２０１２，４１：４８６０−４８８３ Ｐｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８，３：６７１−６７５ Ｌｉｕら，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１１，７：５４３０−５４３６ Ｌｅｕｎｇら，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１１，１７：１６５−１７２ Ｓｔａｈｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． ２００４，３２２：６８４−６９２ Ｌｉｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ． ２００８，３：１１７２−１１８４ Ｗｅａｔｈｅｒｓら，Ａｐｐl Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０，８５：１３３９−１３５１ Ｔａｋａｍｕｒａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００２，９８：４５０−４５５ Ｙａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７９，７６：３４０１−３４０５ Ｂｉｓｓｅｌｌら，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７，７９：８０１−８１２ ＬｅＣｌｕｙｓｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２０１２，４２：５０１−５４８ Ｂｒｏｐｈｙら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２００９，４９：５７８−５８６ Ｆｒａｎｚｉｓｋａら，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０１０，２：１−７
本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、動植物細胞及び／又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いた動植物細胞及び／又は組織の培養方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、がん細胞の細胞凝集塊（スフェア）を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
あるいは、本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、肝細胞の細胞凝集塊（スフェア）を、三次元環境にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いたがん細胞の試験方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する培地添加剤を提供すること、及び、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する培地添加剤を提供することにある。
本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地における細胞及び／又は組織の浮遊効果について鋭意研究した結果、当該液体培地中の粘度を実質的に高めることなく細胞及び／又は組織を浮遊状態で均一に分散させることができる構造体の発見に成功した。当該構造体を少なくとも含む培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞及び／又は組織が増殖、分化或いは維持できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
また、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地のがん細胞凝集塊（スフェア）に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く培養することが可能であり、がん細胞に対する抗がん剤の活性を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
あるいは、本発明者らは、各種化合物及びそれらを含有する液体培地の肝細胞凝集塊（スフェア）に対する効果について鋭意研究した結果、当該スフェア同士の会合を防ぎ、均一に分散させることができる培地組成物の発見に成功した。当該培地組成物を用いると当該スフェアを生存率高く、肝細胞としての機能を維持したまま培養することが可能であり、肝細胞に対する医薬品候補剤或いは医薬品の効果を効率的かつ感度よく評価できることを見出した。更に、当該培地組成物から、培養したスフェアを容易に回収して評価することができることも見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、本発明者らは、がん細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、がん細胞の増殖が大きく促進されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
加えて、本発明者らは、肝細胞を含む培地に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を添加したところ、肝細胞数の減少が抑制されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は下記のとおりである：
（１）細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有することを特徴とする培地組成物。
（２）培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である（１）記載の培地組成物。
（３）培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない（１）記載の培地組成物。
（４）粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする（１）記載の培地組成物。
（５）前記構造体の大きさが、フィルターで濾過した場合、孔径が０．２μｍ乃至２００μｍのフィルターを通過するものであることを特徴とする（１）記載の培地組成物。
（６）前記構造体が高分子化合物を含有することを特徴とする（１）記載の培地組成物。（７）前記高分子化合物が、アニオン性官能基を有する高分子化合物を含有することを特徴とする（６）記載の培地組成物。
（８）前記高分子化合物が、多糖類であることを特徴とする（６）記載の培地組成物。
（９）前記アニオン性官能基が、カルボキシ基、スルホ基およびリン酸基からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（７）記載の培地組成物。
（１０）前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（８）に記載の培地組成物。
（１１）前記多糖類が、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン及びそれらの塩からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（１０）に記載の培地組成物。
（１２）前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩であることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の培地組成物。
（１３）前記脱アシル化ジェランガムまたはその塩の培地組成物に対する最終濃度が、０．００１〜１．０％（重量／容量）であることを特徴とする（１２）に記載の培地組成物。
（１４）さらに、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有することを特徴とする（１３）に記載の培地組成物。
（１５）前記多糖類が、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（１４）に記載の培地組成物。
（１６）前記多糖類が、メチルセルロース、ローカストビーンガム及びそれらの塩からなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（１４）に記載の培地組成物。
（１７）さらに、金属イオンを含有することを特徴とする（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の培地組成物。
（１８）前記金属イオンが、２価の金属イオンであることを特徴とする（１７）記載の培地組成物。
（１９）前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオンからなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（１８）記載の培地組成物。
（２０）前記金属イオンが、カルシウムイオンであることを特徴とする（１９）記載の培地組成物。
（２１）さらに、カルシウムイオン以外の金属イオンを含有することを特徴とする（２０）に記載の培地組成物。
（２２）前記金属イオンが、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンおよびカリウムイオンからなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（２１）記載の培地組成物。
（２３）さらに、細胞外マトリックス及び／又は細胞接着分子を含有することを特徴とする（１）乃至（２２）のいずれか１項に記載の培地組成物。
（２４）前記細胞外マトリックスが、コラーゲン、ヒアルロン酸およびプロテオグリカンからなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（２３）に記載の培地組成物。
（２５）前記細胞接着分子が、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンからなる群から少なくとも１種選択されることを特徴とする（２３）に記載の培地組成物。
（２６）細胞培養用である、（１）乃至（２５）のいずれか１項に記載の培地組成物。
（２７）前記細胞が、接着細胞または浮遊細胞であることを特徴とする（２６）に記載の培地組成物。
（２８）前記接着細胞が、マイクロキャリアに付着した状態であることを特徴とする（２７）に記載の培地組成物。
（２９）前記接着細胞が、担体に包埋した状態であることを特徴とする（２７）に記載の培地組成物。
（３０）前記接着細胞が、スフェアであることを特徴とする（２７）に記載の培地組成物。
（３１）前記接着細胞が、多能性幹細胞、がん細胞及び肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする（２７）に記載の培地組成物。
（３２）（１）乃至（３１）のいずれか１項に記載の培地組成物と、細胞又は組織とを含む、細胞又は組織培養物。
（３３）（１）乃至（３１）のいずれか１項に記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。
（３４）前記細胞が、多能性幹細胞、がん細胞、肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする（３３）に記載の培養方法。
（３５）（３２）の培養物から細胞または組織を分離することを特徴とする、細胞又は組織の回収方法。
（３６）前記分離が、ろ過、遠心または磁性分離で行われることを特徴とする（３５）に記載の回収方法。
（３７）（１）乃至（３１）のいずれか１項に記載の培地組成物中で接着細胞を培養することを特徴とするスフェアの製造方法。
（３８）抗がん剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の培地組成物中でがん細胞を培養する工程、及び
（ｂ）がん細胞の増殖の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
（３９）さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、がん細胞の増殖を抑制する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、（３８）に記載の方法。
（４０）肝細胞に作用する医薬品候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
（ｂ）肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
（４１）さらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を候補物質として選択する工程を含むことを特徴とする、（４０）に記載の方法。
（４２）肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法であって、
（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び
（ｂ）肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含むことを特徴とする方法。
（４３）細胞または組織を浮遊させて培養することができる培地組成物を調製するための培地添加剤であって、高分子化合物が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする培地添加剤。
（４４）滅菌された状態であることを特徴とする（４３）に記載の培地添加剤。
（４５）前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、（４３）又は（４４）に記載の培地添加剤。
（４６）前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、（４３）又は（４４）に記載の培地添加剤。
（４７）細胞または組織を浮遊させて培養することが出来る培地組成物の製造方法であって、高分子化合物と培地を混合することを特徴とする培地組成物の製造方法。
（４８）（４３）乃至（４６）のいずれか1項に記載の培地添加剤と培地とを混合することを特徴とする（４７）に記載の培地組成物の製造方法。
（４９）前記培地が溶媒中に溶解または分散していることを特徴とする（４８）に記載の培地組成物の製造方法。
（５０）前記高分子化合物がアニオン性官能基を有する高分子化合物である、（４７）に記載の培地組成物の製造方法。
（５１）前記高分子化合物が脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、（５０）に記載の培地組成物の製造方法。
（５２）前記高分子化合物と培地を、水と混合することを特徴とする（４７）に記載の培地組成物の製造方法。
（５３）水と混合した後、８０〜１３０℃で加熱することを特徴とする（５２）に記載の培地組成物の製造方法。
（５４）１００〜１２５℃で加熱することを特徴とする（５３）に記載の培地組成物の製造方法。
（５５）ろ過滅菌することを特徴とする（４７）に記載の培地組成物の製造方法。
（５６）前記ろ過滅菌が０．１〜０．５μｍのフィルターを通過させることを特徴とする（５５）に記載の培地組成物の製造方法。
（５７）脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含むがん細胞用培地添加剤。
（５８）がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を促進する、（５７）に記載の添加剤。
（５９）抗がん剤の抗がん活性を評価するために用いられる、（５７）に記載の添加剤。（６０）（５７）乃至（５９）のいずれか１項に記載の添加剤を含有してなるがん細胞用培地組成物。
（６１）がん細胞の培養方法であって、（５７）乃至（５９）のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は（６０）に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
（６２）がん細胞に対する抗がん剤の活性評価方法であって、（５７）乃至（５９）のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は（６０）に記載の培地組成物中で、該がん細胞を培養することを特徴とする、方法。
（６３）該がん細胞が該がん細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、（６１）又は（６２）に記載の方法。
（６４）該がん細胞を培養する際の培養容器ががん細胞の付着を抑制することを特徴とする、（６１）又は（６２）に記載の方法。
（６５）脱アシル化ジェランガム若しくはその塩、又はダイユータンガム若しくはその塩を含む肝細胞用培地添加剤。
（６６）肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制する、（６５）に記載の添加剤。（６７）医薬品及び医薬品候補剤の肝細胞に対する効果を評価するために用いられる、（６５）に記載の添加剤。
（６８）（６５）乃至（６７）のいずれか１項に記載の添加剤を含有してなる肝細胞用培地組成物。
（６９）肝細胞に対する医薬品及び医薬品候補剤の活性評価方法であって、（６５）乃至（６７）のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は（６８）に記載の培地組成物中で、該肝細胞を培養することを特徴とする、方法。
（７０）該肝細胞が該肝細胞用培地組成物中において細胞凝集塊を形成していることを特徴とする、（６９）に記載の方法。
（７１）該肝細胞を培養する際の培養容器が肝細胞の付着を抑制することを特徴とする、（６９）に記載の方法。
本発明は、特定の化合物（以下、特定化合物ともいう）、特にアニオン性官能基を有する高分子化合物の構造体を含む培地組成物を提供する。当該培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することもできる。本発明は、当該培養方法を、動物生体或いは植物体から採取した細胞及び／又は組織に適用し、目的の細胞及び／又は組織をその機能を損なうことなく大量に調製することができる。そして、当該培養方法で得られる細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等を実施する際に利用することができる。特に、脱アシル化ジェランガムから作製される培地組成物が優れており、以下の特徴を有している。性能を発現させるための濃度が極めて低いので（１桁程度低い）、培地成分に与える影響が最低限に抑えられる。また、水に溶解させる際にダマになりにくいので、大量に製造する際にも、トラブルが起こりにくい。さらに、性能を発現する濃度域での、粘度が低いので、細胞及び／又は組織の回収等の操作性が極めて良好である。
また、本発明の培地組成物を用いると、がん細胞の凝集塊（スフェア）同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、がん細胞の増殖を促進することができる。更に、当該培地組成物を用いると、抗がん剤の評価を実施する際に、容易に抗がん剤を培地に添加することができる上に、細胞増殖を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養したがん細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られるがん細胞を用いて化学物質、抗がん剤等の薬効評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
本発明の培地組成物で培養すると、二次元培養における非生体内的環境からの影響が少ないことと細胞同士の接着のみが起こるため、がん化を促進するＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子）の感受性ががん細胞で高まり、その下流におけるＥＧＦ受容体阻害剤に対する感受性を高めることができる。さらにがん細胞足場非依存的な増殖に対する重要なシグナル伝達経路であるＭＥＫ阻害剤およびＡｋｔ阻害剤に対する感受性も高めることができる。
あるいは、本発明の培地組成物を用いると、肝細胞の凝集塊（スフェア）同士の会合が抑制され、当該スフェアを分散状態にて培養することができるために、肝細胞の生存と細胞機能を生体外で維持することができる。更に、当該培地組成物を用いると、医薬品候補剤或いは医薬品の評価を実施する際に、容易に医薬品候補剤或いは医薬品を培地に添加することができる上に、細胞機能を評価するための検出試薬を容易に添加することができる。また、培養した肝細胞を回収することができるため、回収した細胞の機能評価を容易に実施することもできる。本発明は、当該培養方法で得られる肝細胞を用いて化学物質、医薬品候補剤或いは医薬品等の薬効及び毒性評価やスクリーニングを実施する際に好適に利用することができる。
さらに、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、がん細胞の培養において、がん細胞の増殖を大きく促進することができる。
加えて、本発明の脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含む培地添加剤は、肝細胞の培養において、肝細胞数の減少を抑制することができる。
本発明の培地組成物でＨｅｐＧ２細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養し、本スフェアを顕微鏡観察したところ、既存の培地に比べてスフェア同士の会合が抑えられることを示す図である。 本発明の培地組成物で多能性幹細胞を培養したところ、当該細胞に対する毒性が見られないことを示す図である。 本発明の培地組成物で多能性幹細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にあることを示す図である。 本発明の培地組成物で多能性幹細胞のスフェアを培養したところ、多能性幹細胞が効率よく増殖することを示す図である。 本発明の培地組成物で培養した多能性幹細胞は、未分化性を維持していることを示す図である。 本発明の培地組成物で浮遊静置培養した多能性幹細胞は、正常核型を保持していることを示す図である。 本発明の培地組成物で培養した多能性幹細胞は、未分化性を維持していることを示す図である。 本発明の培地組成物でＨｅｐＧ２細胞を付着させたマイクロキャリアを培養したところ、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリア上で増殖できることを示す図である。 本発明の培地組成物にＨｅＬａ細胞のスフェアを添加した際に、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にあることを示す図である。 本発明の培地組成物によりＨｅＬａ細胞のスフェアが形成されることを示す図である。 本発明の構造体の一態様であるフィルムを示す図である。培地組成物に対する脱アシル化ジェランガムの濃度は、０．０２％（重量／容量）。 本発明の培地組成物によりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが形成されることを示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。 ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。 本発明の培地組成物でイネ由来カルスを培養した際の浮遊状態を示す図である。 本発明の培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でＡ５４９細胞及びＨＣＴ１１６細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でヒト初代肝細胞を培養したところ、スフェアを形成し培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でカニクイザル初代肝細胞を培養したところ、スフェアを形成し培養できることを示す図である。 本発明の培地組成物でＭＣＦ−７細胞を５日間培養した後のＭＣＦ−７細胞の凝集塊を示す図である。 本発明の培地組成物でＡ３７５細胞およびＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞を４日間培養した後の凝集塊を示す図である。 本発明の培地組成物でＭＩＡＰａＣａ−２細胞を６日間培養した後の凝集塊を示す図である。
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
がん組織の例としては、以下に限定されるものではないが、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、骨髄がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、がん患者由来の血液等の組織が挙げられる。がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ヒト上皮様癌細胞株として、Ａ４３１、ヒトメラノーマ細胞株としてＡ３７５、ヒト骨肉腫細胞株として、ＭＮＮＧ/ＨＯＳ、ヒト膵臓癌細胞株として、ＭＩＡＰａＣａ−２等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。
本発明における肝細胞とは、肝臓組織から採取された初代肝細胞のほか、生体外での培養に最適化した条件で継代培養され確立された肝細胞株、及び肝臓以外の組織由来の細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、末梢血由来幹細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、肝幹細胞、肝前駆細胞等から生体外にて分化誘導された肝細胞等が挙げられる。肝臓組織は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、或いはサル等から採取された肝臓であり、正常な肝臓だけでなくがん化した肝臓であってもよい。初代肝細胞は、これらの肝臓からコラゲナーゼを用いた灌流法により分離し、採取することができるが、株式会社プライマリーセル、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、タカラバイオ株式会社、北海道システム・サイエンス株式会社、ロンザジャパン株式会社、株式会社ベリタス、ライフテクノロジーズジャパン株式会社等の試薬会社から購入したものであってもよい。購入する肝細胞は、凍結された状態或いはコラーゲン等の担体に付着した状態でありうる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）、ＪＨＨ７、ＨＬＦ、ＨＬＥ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＷＲＬ６８、ＨＢ６１１、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｕＨ−４、ＨｕＨ−７等が挙げられる。
本発明における肝細胞の機能とは、特に制限されないが、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５等のシトクロムＰ４５０（ＣＹＰともいう）活性の発現並びに本酵素による医薬品等の代謝、グルクロン酸、グルタチオン、硫酸、グリシン等による医薬品等の抱合、アルブミン、アポリポ蛋白質、トロンボポイエチン等の有用蛋白質の生産、ビリルビンの分泌、尿素の合成、胆汁酸や脂肪酸の合成、トランスポーターによる医薬品等の輸送等が含まれる。本発明における実施形態では、肝細胞は上記の機能の内、チトクロムＰ４５０の活性、アルブミンの生産及び／又はトランスポーターによる医薬品等の輸送（例えばＣａｒｂｏｘｙｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ、Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ、Ｒｏｓｖａｓｔａｔｉｎの取り込みやＣａｒｂｏｘｙｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの排泄）を維持していることが好ましい。
本発明における医薬品には、医療の用に供される物質全てが含まれる。医薬品候補剤とは、医薬品の候補として探索或いは開発研究がなされている物質であり、合成化合物、蛋白質、核酸、糖類、天然物等が挙げられる。
本発明における抗がん剤とは、がん細胞に直接的に作用してがん細胞の増殖や機能を抑制する薬剤の他、がん細胞に直接的には作用しないが、生体内の免疫細胞又はその他の薬剤との協働的な作用により、がん細胞の増殖又は機能を抑制する、又はがん細胞を死滅させる薬剤も含まれる。この様な抗がん剤の例としては、特に制限されないが、アルキル化剤、白金誘導体、５ＦＵ系抗がん剤に代表される代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、エピルビシンに代表される抗がん性抗生物質、ゲフィチニブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、エルロチニブ、パニツムマブ、ラパチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、イピリムマブ、バンデタニブ、クリゾチニブ、ルキソリチニブ、トラメチニブに代表される分子標的薬などが挙げられる。分子標的薬の標的分子としては、特に制限されないが、各種キナーゼ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）、Ａｋｔ、ＣＤＫ（サイクリン依存キナーゼ）、ＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）、ｃ−Ｍｅｔ、Ｒａｆ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＣＴＬＡ−４、ＡＬＫ、ＪＡＫ、ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）、Ｈｓｐ９０、ヒストンデアセチラーゼ等が挙げられる。更に、この様な効果を有する薬剤の候補となる合成化合物、蛋白質、核酸、糖類、天然物等も本発明における抗がん剤に含まれる。
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、分裂組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。
細胞及び／又は組織を本発明の方法で培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、または形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば昆虫、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物、飼料又は食品となる植物（イネ、トウモロコシ、コムギ又はオオムギ等）などがあげられるが、それらに限定されない。
本発明における細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも５〜６０分、１時間〜２４時間、１日〜２１日、が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
本発明の培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）構造体と培地を含有する組成物である。
本発明の培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において、培地組成物からの細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
本発明における構造体とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開２００４−１２９５９６号公報）、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。当該フィルムを図１３に例示する。
本発明における構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が０．２μｍ乃至２００μｍのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、１μｍを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは５μｍを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、１００μｍ以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは７０μｍ以下のものである。
本発明における特定化合物とは、特定化合物を液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の培地組成物の粘度）は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ−２２型粘度計、機種：ＴＶＥ−２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ １°３４´×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。
本発明に用いる特定化合物の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上を有するものを使用できる。
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のしやすさを考慮すると、最も好ましくは、ＤＡＧである。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
さらに、後述の実施例で記載するように、ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ−カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に用いる特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。
本発明における脱アシル化ジェランガムとは、１−３結合したグルコース、１−４結合したグルクロン酸、１−４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
本発明における構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明の培地組成物の粘度は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。
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本発明における特定化合物は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１−３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液−液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ−ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。
培地中での特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(重量／容量)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(重量／容量)培地中に添加すれば良い。
上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５〜０．０２％（重量／容量）、好ましくは０．０１〜０．０２％（重量／容量）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．００５〜０．４％（重量／容量）、好ましくは０．１〜０．４％（重量／容量）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５〜０．０２％（好ましくは０．０１〜０．０２％）（重量／容量）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１〜０．４％（重量／容量）
アルギン酸ナトリウム：０．１〜０．４％（重量／容量）
ローカトビーンガム：０．１〜０．４％（重量／容量）
メチルセルロース：０．１〜０．４％（重量／容量）（好ましくは０．２〜０．４％（重量／容量））
カラギーナン：０．０５〜０．１％（重量／容量）
ダイユータンガム：０．０５〜０．１％（重量／容量）
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
前記化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１及び／又はＲ２に当たる水酸基を、Ｃ１−３アルコキシ基、Ｃ１−３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、１−ｅｔｈｙｌ−３−(３−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ)ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。
本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在しもよい。本発明の化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
本発明の培地組成物には、金属イオン、例えば２価の金属イオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、２種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地組成物に金属イオンが含まれることにより、高分子化合物が金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより（例えば、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することにより）本発明の構造体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。塩濃度は０．１ｍＭ及至３００ｍＭで、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。また本発明の培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。
本発明は、当該培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法、得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法、当該培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法も含む。
本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び／又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び／又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び／又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。
本発明の方法により培養されたヒト由来の細胞及び／又は組織は、疾患や障害を有する患者に対し治療目的にて移植することができる。この際、治療の対象とする疾患や障害の種類、前処置方法並びに細胞移植方法は、当事者により適宜選択される。移植された細胞のレシピエントへの生着と疾患や障害からの回復や、移植に伴う副作用の有無、治療の効果は、移植治療における一般的な方法により適宜検査され、判断することができる。
さらに、本発明の方法により細胞及び／又は組織が効率よく増殖されるため、本発明における特定化合物及びその構造体を含有する培地組成物は細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞や組織の分化や増殖を調節する因子を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅するだけでなく、効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、本発明化合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いはＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。
本発明の培養方法を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、エチルセルロースやアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（ブタジエン−スチレン）コポリマー、ポリ（ブタジエン−アクリロニトリル）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマー、ポリクロロプレン、スチロール樹脂、クロロスルフォン化ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、アクリル系ブロックコポリマー等のプラスチック等が挙げられる。これらのプラスチックは、酸素や二酸化炭素等のガス透過性に優れるだけでなく、工業的に成形加工性に優れ、各種の滅菌処理に耐えうるものであり、かつ培養器材内部の様子を観察することができる透明性の材質であることが好ましい。ここで、滅菌処理を施す方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理等）を施してもよい。更に、これらの培養器材に対しては、予め細胞外マトリックスや細胞接着分子などをコーティングしてもよい。このようなコーティング材料としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリン、ヒアルロン酸、スーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。これらのコーティング材料は、遺伝子組換え技術によりアミノ酸配列を人為的に改変させたものも使用することできる。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、シリコン、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２−メトキシメチルアクリレート）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル（登録商標）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。
細胞及び／又は組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の培養方法に用いることができる。また、バイオリアクターや自動培養装置に用いられる培養容器には、開閉が容易で外界との接触面積が大きい開放系培養容器（例えば蓋を有する培養容器）と、開閉が容易ではなく外界との接触面積の小さい閉鎖系培養容器（例えばカートリッジ型培養容器）があるが、いずれの培養容器も本発明の培養方法に用いることができる。
本発明における特定化合物を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と特定化合物を混合して培地組成物を調製することができる。このような培地の組成による分類では天然培地、半合成培地、合成培地、また、形状による分類では半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）などが挙げられる。細胞及び／又は組織が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。このような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
がん細胞の培養に用いられる培地には、上記培地に、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、がん細胞スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
肝細胞の培養に用いられる培地としては、上記培地に加えて、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ（ライフテクノロジーズ社製）、ＨＣＭ（登録商標）−肝細胞培養培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標、ロンザ社製）、ＨＢＭ（登録商標）−肝細胞基本培地（ロンザ社製）、ＨＭＭ（登録商標）−肝細胞メンテナンス培地（ロンザ社製）、変法ランフォード培地（日水製薬株式会社製）、ＩＳＯＭ’ｓ培地、肝細胞増殖培地（タカラバイオ株式会社製）、肝細胞維持培地（タカラバイオ株式会社製）、肝細胞基本培地（タカラバイオ株式会社製）、活性維持スーパー培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＡＤＭＥＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）などが挙げられる。これらの培地には細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、がん細胞又は肝細胞のスフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
細胞及び／又は組織が植物由来である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１〜約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。
上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、マクロファージ炎症蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子−１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ−１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ ＩＬ−６（ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
本発明における特定化合物を上記の培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて当該特定化合物を用時溶解または分散させる（これを、培地添加剤とする。）。その後、培地中での特定化合物濃度として、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該培地添加剤を培地中に添加すれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムの場合、０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００３％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．０３％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとダイユータンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．０１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとメチルセルロースの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％ （重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱ア
シル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ−カラギーナンの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
ここで、培地添加剤に用いる適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられるが、これらに限られるわけではない。この際、特定化合物濃度は０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．１％乃至０．６％（重量／容量）とすることが望ましい。その際、当該特定化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該特定化合物を培養の際に担体表面上に固定化或いは、担体内部に担持して使用することもできる。当該特定化合物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該特定化合物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ乃至１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ乃至１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ乃至０．５μｍである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
上記調製により特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより、液体培地中に上記構造体が形成され、本発明の培地組成物を得ることができる。培地には通常、高分子化合物がイオンを介して集合、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオンが含まれるので、本発明の特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、本発明の培地組成物を得ることができる。あるいは、培地添加剤（特定化合物の溶液又は分散液）に培地を添加してもよい。さらに、本発明の培地組成物は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒（例えばイオン交換水や超純水等を含む水）中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、（１）液体培地と培地添加剤（溶液）とを混合する、（２）液体培地に上記高分子化合物（粉末等の固体）を混合する、（３）培地添加剤（溶液）に粉末培地を混合する、（４）粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地組成物における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、（１）若しくは（４）又は（１）若しくは（３）の態様が好ましい。
特定化合物を溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば８０℃〜１３０℃、好ましくは加熱滅菌されるような１００℃〜１２５℃（例、１２１℃）が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオンを添加することにより（例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより）、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオンを含む溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する際に、加熱（例えば８０℃〜１３０℃、好ましくは１００℃〜１２５℃（例、１２１℃））し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。
本発明の培地組成物の調製方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。特定化合物をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度（例えば、６０℃以上、８０℃以上、９０℃以上）で加熱しながら撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌）を行う。室温に戻した後、静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
あるいは、粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合し、上記温度で加熱することで本発明の培地組成物を調製する。
例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（重量／容量）、好ましくは０．２％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．３％乃至０．４％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（重量／容量）、好ましくは０．２％乃至０．８％（重量／容量）、より好ましくは０．３％乃至０．６％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上（例、８０〜１３０℃）に加熱しながら撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が０．０１５％の場合は０．３％水溶液：培地の比率は１：１９）、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明の培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。
さらに、本発明の培地組成物は調製後、遠心処理により構造体を沈降させることができる。
本発明の方法で培養する細胞及び／又は組織の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、細胞及び／又は組織が単独で培地組成物中に分散した状態、細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態等が、より好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が、さらに好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が挙げられる。これらの状態の内、細胞塊（スフェア）を形成した状態は、生体内環境に近い細胞−細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、本発明の方法で培養する最も好ましい状態として挙げることができる。
細胞及び／又は組織を表面上に担持させる担体としては、種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ、セラミックスビーズ、ポリスチレンビーズ、デキストランビーズ等が挙げられる。当該高分子の例としては、ビニル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、アニリン樹脂、アイオノマー樹脂、ポリカーボネート、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、セルロース、アルギン酸塩及びこれらの混合物等が使用できる。当該担体は、細胞の接着を高める、或いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、２種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び／又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数１０μｍから数１００μｍ、より好ましくは１００μｍから２００μｍであり、その比重は、１に近いことが好ましく、より好ましくは０．９〜１．２、特に好ましくは約１．０である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ２（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２（登録商標）、（以上、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（登録商標）（ＮＵＮＣ）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｇ（登録商標）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓ（登録商標）（以上、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＨＩＬＬＥＸＣＴ（登録商標）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ−ＣＯＡＴＥＤ（登録商標）、及びＨＩＬＬＥＸＩＩ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ＧＥＭ（登録商標）（Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）等が挙げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び／又は組織を表面上に担持させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は、５０Ｇ乃至１０００Ｇ、より好ましくは、１００Ｇ乃至５００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。
細胞及び／又は組織を担体内部に包埋する際、種々の高分子から構成された材料を当該担体として選択することができる。この様な高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、ポリウレタンフォーム等のスポンジ、ＤｓｅＡ―３Ｄ（登録商標）、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させことも可能である。細胞接着因子の例としては、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン−１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、２種以上の細胞接着因子を組みわせても良い。また更に、細胞及び／又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を１種以上混合することができる。
これらの担体に細胞及び／又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、２５Ｇ〜１９Ｇ程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数１０μｍから数１０００μｍ、より好ましくは１００μｍから２０００μｍである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約２０００μｍのビーズ状担体の場合、５００万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び／又は組織を包埋させた担体は、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は、５０Ｇ乃至１０００Ｇ、より好ましくは、１００Ｇ乃至５００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。
細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ−ＨＥＭＡ（ポリ−（２−ハイドロキシ−エチルメタクリレート）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体、ポリ（２−メトキシメチルアクリレート）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル（登録商標）などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。
また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ ２０１０，３６１−３６６、ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９−７００、ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２−５７９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７−１１１、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８−２５９等に記載された方法を用いることもできる。
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ヂブチルリルｃＡＭＰなどを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ― メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、アデノシン−５’−ホスホセレン酸、Ｓｅ―アデノシルセレノメチオニン、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ−１１５２、Ｗｆ−５３６等のＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。
あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ−１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
さらに、本発明の特定化合物の構造体を含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．３％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。また、別の局面では、当該特定化合物の濃度が、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．３％（重量／容量）、より好ましくは０．００３％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該特定化合物をスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。
スフェアは、当該特定化合物の構造体を含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、３日間乃至１０日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は、５０Ｇ乃至１０００Ｇ、より好ましくは、１００Ｇ乃至５００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。
スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍ、最も好ましくは８０μｍ乃至２００μｍの直径を有する。
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、ＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。
これらの培養容器のうち、多数の抗がん剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、Ｕ字型、Ｖ字型のものを用いることが可能であり、好ましくはＵ字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。
スフェアの静置培養に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の増粘剤を更に混合することができる。
本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養されたスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は、５０Ｇ乃至１０００Ｇ、より好ましくは、１００Ｇ乃至５００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。細胞の回収や培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置を用いて遠心やろ過処理或いは磁気による回収処理を行うことにより達成することもできる。
植物由来の細胞及び／又は組織を静置培養する際の方法として、分化していない植物細胞塊であるカルスを培養することができる。カルスの誘導は、使用する植物種についてそれぞれ公知の方法により行うことができる。例えば、分化した植物体の一部の組織（例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等）表面を、必要に応じて７０％アルコールや１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、必要に応じてメス等を用いて適当な大きさの組織片（例えば、約１〜約５ｍｍ角の根切片）を切り出し、クリーンベンチ等を用いた無菌操作により、当該組織片を予め滅菌したカルス誘導培地に播種して適当な条件下で無菌培養する。ここで誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に付されてもよいし、あるいは継代用培地で継代培養することにより種株として維持することもできる。継代培養は、液体培地及び固形培地のいずれを用いて行ってもよい。
本発明の培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式（回分培養、流加培養、連続培養等）、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、本発明の培地組成物に対する細胞塊の湿重量が４〜８（重量／容積（ｗ／ｖ））％、好ましくは５〜７（ｗ／ｖ）％となるように本発明の培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は１ｍｍ乃至４０ｍｍ、好ましくは３ｍｍ乃至２０ｍｍ、より好ましくは５ｍｍ乃至１５ｍｍである。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。
細胞及び／又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６％体積が好ましい。培養期間は通常３乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０乃至３０℃であり、光が必要であれば照度２０００〜８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。
培養期間は通常３乃至７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。
本発明の方法で細胞及び／又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞及び／又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織と培地組成物を分離した後、新しい培地組成物を細胞及び／又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。
例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は、５０Ｇ乃至１０００Ｇ、より好ましくは、１００Ｇ乃至５００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び／又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）、磁性ミクロスフェア（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
本発明の方法によりがん細胞が効率よく増殖されるため、本発明における特定化合物を含有する培地組成物は、がん細胞に対する抗がん剤の評価に用いることができる。例えば、がん細胞の増殖を阻害する抗がん剤を評価する際、がん細胞と抗がん剤を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅するだけでなく、効率よく回収することができる。本発明においては、特に、脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含むがん細胞用培地添加剤、該添加剤を含むがん細胞用培地組成物を、がん細胞の増殖、又は抗がん活性の評価等に使用することができる。その際の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度は、前述のとおりである。
そして、ダイユータンガムを使用しても、がん細胞が増殖されるが、がん細胞への増殖効果が格別に優れている点、並びに、低濃度で使用（前述の好ましい濃度）できることから培養液に気泡が発生しにくい点、及びがん細胞を回収しやすい点を考慮すると脱アシル化ジェランガムがより好ましい。
より具体的な抗がん剤のスクリーニング方法としては、（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中でがん細胞を培養する工程、及び（ｂ）がん細胞の増殖の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。当該方法はさらに、被験物質の非存在下の場合と比べて、がん細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程、及び／又は、がん細胞を回収する工程を含むことができる。変化とは、がん細胞の増殖が増加又は減少することをいう。解析は上記方法を行うことができるが、これらに限定されない。
抗がん剤の活性を評価する際の培養条件、培養器具、培養装置、培地の種類、特定合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度、抗がん剤の種類、抗がん剤の含量などは、本明細書に記載した範囲から当事者が適宜決定し得る。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。細胞数を測定する際には、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）測定法、３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ−２−ｙｌ ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）染色法、ＷＳＴ−１（登録商標）染色法、ＷＳＴ−８（登録商標）染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いることができる。これらの中では、ＷＳＴ−８（登録商標）染色法が最も好適に利用することができる。また、細胞に対する障害性を評価する際には、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定法、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）法等を用いることができる。あるいは、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色した後、細胞表面分化マーカーをＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーにより検出し、抗がん剤による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。さらに、抗がんにより発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いはＲＮＡ（リボ核酸）を抽出し、サザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。
本発明の方法により肝細胞の生存及び機能が維持されるため、本発明における特定化合物を含有する培地組成物は、医薬品或いは医薬候補物質の肝細胞に対する各種効果を評価する際に用いることができる。例えば、肝細胞に対する医薬候補物質の毒性効果を評価する際、肝細胞と評価の対象とする被験物質を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析する。この際、本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる肝細胞の生存と機能を維持するだけでなく、効率よく肝細胞を回収することができる。
肝細胞に作用する医薬品候補物質をスクリーニングする方法としては、（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び（ｂ）肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。
肝細胞に作用する医薬品候補物質の薬効又は毒性を評価する方法としては、（ａ）被験物質の存在下及び非存在下、本発明の培地組成物中で肝細胞を培養する工程、及び（ｂ）肝細胞の生理学的機能の変化を解析する工程、を含む方法が挙げられる。これらの方法はさらに、被験物質の非存在下の場合と比べて肝細胞の生理学的機能を抑制又は増加する物質を選択する工程、及び／又は、肝細胞を回収する工程を含むことができる。当該変化とは、肝細胞の生理学的機能（例えば、肝細胞増殖、シトクロムＰ４５０の酵素活性など）が増加又は減少することをいう。そして、肝細胞の生理学的機能が増加する場合、薬効又は毒性が低い、肝細胞の生理学的機能が低下する場合、薬効又は毒性が高い、等の評価を行うことができる。
当該医薬候補物質の活性を評価する際の培養条件、培養器具、培養装置、培地の種類、特定合物の種類、特定化合物の含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度、医薬品或いは医薬候補物質の種類又はその含量などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により維持或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。また、細胞数を測定する際には、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）測定法、３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）染色法、ＷＳＴ−１（登録商標）染色法、ＷＳＴ−８（登録商標）染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いることができる。この中では、ＷＳＴ−８（登録商標）染色法が最も好適に利用することができる。また、細胞に対する障害性を評価する際には、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定法、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）法等を用いることができる。また、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色した後、細胞表面分化マーカーをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）やフローサイトメトリーにより検出し、医薬品或いは医薬候補物質による増殖やアポトーシスに対する効果を観察することができる。医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した遺伝子は、培養した細胞からＤＮＡ（デオキシリボ核酸）或いはＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しサザンブロッティング法、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、医薬品或いは医薬候補物質により発現が変化した蛋白質は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法等によって検出することができる。更に、シトクロムＰ４５０の酵素活性は、当該酵素による基質の構造変換活性を放射性同位体法、高速液体クロマトグラフィー法、発光法、発色法等を用いることにより検出することができる。
以下に本発明の培地組成物の分析例、試験例を実施例として具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
（分析例１：脱アシル化ジェランガムを含む培地の粘度測定及び細胞浮遊試験）
脱アシル化ジェランガム含有培地の調製及び粘度測定
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌しながら室温まで放冷し、１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０ｍＬと滅菌水４７．５ｍＬを入れ、室温でホモミキサー（３０００ｒｐｍ）で攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液２．５ｍＬを添加し、そのまま１分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０１％培地組成物を調製した。同様に終濃度が０．０２、０．０３、０．０５％（ｗ／ｖ）となるよう脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ ＴＶＥ−２２Ｌ、標準ロータ１°３４´×Ｒ２４）を用いて、回転数１００ｒｐｍで５分間測定した。
脱アシル化ジェランガム含有培地の細胞浮遊試験
ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で３日間培養した。ここで得られたスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液１．０ｍＬを調製した。引き続き、上記で調製した脱アシル化ジェランガム含有培地を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに１．０ｍＬずつ入れ、更にＨｅＬａ細胞スフェア懸濁液１０μLを加えた。タッピングにより細胞塊を分散させ、３７℃でインキュベートし、１時間後の細胞の分散状態を目視にて観察した。
（比較例）メチルセルロース、コラーゲン含有培地の調製
メチルセルロース含有培地の調製
２００ｍＬナスフラスコにＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍＬを入れ、メチルセルロース（Ｍ０３８７、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．１ｇを加えた。氷浴にて冷却しながら攪拌し、メチルセルロースを溶解させた。本溶液を用いて終濃度が０．１、０．３、０．６、１．０％（ｗ／ｖ）となるようメチルセルロース水溶液を添加した培地組成物を調製した。
コラーゲン含有培地の調製
０．３％セルマトリックスタイプＩ−Ａ（新田ゼラチン社製）６．５ｍＬに１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｍＬ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）１ｍＬ及び純水１．５ｍＬを入れ、氷中にて撹拌しながら０．２％のコラーゲン含有培地を調製した。同様に、終濃度が０．０１、０．０５、０．１、０．２％（ｗ／ｖ）となるようコラーゲンを添加した培地組成物を調製した。
上記で調製した培地組成物についても脱アシル化ジェランガム含有培地と同様にＨｅＬａ細胞スフェアの浮遊試験および粘度測定を実施した。ただし、１．０％（ｗ／ｖ）メチルセルロースの粘度は、装置の測定範囲より５０ｒｐｍにて測定した。
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［試験例］
次に、本発明の培地組成物の細胞培養における有用性について、以下の試験例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。
（試験例１：単一の細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清及び１０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト白血病細胞株ＵＴ７／ＴＰＯを、２００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬなるように分注した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、２００００細胞／ｍＬとなるように１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むEＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬなるように分注した。これらの細胞懸濁液をＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。
その結果、ＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。浮遊静置培養３日間後のＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞数を表４に示す。
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（試験例２：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験）
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。ここで得られたそれぞれの細胞株のスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液２．５ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた。引き続き、本スフェア（約８００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地に添加することにより調製した。
３７℃で３日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（２００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。ここで、スフェアの一部を分取し、光学顕微鏡（ＯＬＭＰＵＳ社製、ＣＫ３０−Ｆ１００）にてその形状を観察した。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。
その結果、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、既存の培地と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。更に、培養したスフェアの形状を光学顕微鏡にて観察したところ、本発明の培地組成物ではスフェア同士の会合が見られないのに対し、既存の培地ではスフェア同士の会合が観察された。
ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表５に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表６に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１及び図２にそれぞれ示す。さらに、培養したＨｅＬａ細胞のスフェアの形状を図３に示す。
Figure 0006879517
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（試験例３：ヒト多能性幹細胞の接着培養における細胞増殖試験）
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）は、通常フィーダー上やマトリゲルをコーティングした培養皿上に接着させる平面培養条件下で増殖維持される。脱アシル化ジェランガムのｈＰＳＣｓに対する毒性を評価するために、マトリゲル（ベクトン・ディッキントン社製）を用いた平面培養条件下で、ｍＴｅＳＲ培地（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に０．０００％乃至０．０２０％ （ｗ／ｖ)の濃度となるように脱アシル化ジェランガムを添加し、ｈＰＳＣｓの増殖に対する影響を検討した。この際、ヒトｉＰＳ細胞として京都大学２５３Ｇ１株、ヒトＥＳ細胞株として京都大学ＫｈＥＳ−１株を培養した。なお、上記濃度の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、所定の濃度となる様にｍＴｅＳＲ培地に添加することにより調製した。その結果、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞共に、脱アシル化ジェランガムの添加培地においても、通常のｍＴｅＳＲ培地と同程度の細胞数を得ることができ、脱アシル化ジェランガムによる毒性は認められなかった。その結果を図４に示す。図４における培養後の細胞数は、マトリゲルコーティング培養皿にｈＰＳＣｓを播種し、脱アシル化ジェランガムを含むｍＴｅＳＲ培地で５日間培養し、得られた細胞数を、脱アシル化ジェランガムを含まないｍＴｅＳＲ培地での細胞数を1として相対値で示した。
（試験例４：ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における脱アシル化ジェランガムの沈降抑制試験）
ｈＰＳＣｓは、ペトリ培養皿など低接着性の培養皿でスフェアを形成する。例えば、該スフェアは、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ ２０１０，３６１−３６６、ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９−７００、ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２−５７９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７−１１１、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８−２５９に記載されたいずれの方法を用いても形成できる。フィーダー細胞（マウス胎児線維芽細胞）上で維持したｈＰＳＣｓ（京都大学２５３Ｇ１株或いは京都大学ＫｈＥＳ−１株）を回収し、フィーダー細胞を自然沈降で除去した後、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＹ−２７６３２（１０μＭ）を添加したｍＴｅＳＲ培地にｈＰＳＣｓを再懸濁した。引き続き、一定のサイズのｈＰＳＣｓコロニーをペトリ培養皿(ＢＤファルコン社製)に播種し、３７℃にてＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で培養することによりスフェアを形成させた。培地交換は、Ｙ−２７６３２を含まないｍＴｅＳＲ培地で継代後１日目と３日目に行い、継代は５日毎にＹ−２７６３２を含むｍＴｅＳＲ培地で行った。このようにして調製したｈＰＳＣｓのスフェア（培養４日目）を、ｍＴｅＳＲ培地に０．０００％乃至０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物（試験例３と同様の方法にて調製）にて懸濁したのち、キュベットに移した。本キュベットを３７℃にてＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で一晩放置し、脱アシル化ジェランガムによるスフェアの沈降抑制効果について検討した。その結果を図５に示す。図５に示すように、脱アシル化ジェランガムの添加により全ての濃度域にてスフェアを培地中に三次元的に浮遊状態で保つことができた。一方、脱アシル化ジェランガムを添加していない既存の培地ではスフェアは培養容器の底面に沈降し、浮遊状態に出来ないことが分かった。また、脱アシル化ジェランガムの効果はヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞で共通であった。以上の結果より、脱アシル化ジェランガムはｈＰＳＣｓのスフェアを浮遊状態に保てることが示された。
（試験例５：ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における細胞増殖試験）
三次元的な浮遊状態でｈＰＳＣｓがチューブ培養できるかを検討した。０．０００％、０．０１５％或いは０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むｍＴｅＳＲ培地に対して、試験例４と同様な方法にて調製、継代したｈＰＳＣｓスフェア（６００乃至８００個／３ｍＬ）を５ｍＬのポリスチレンチューブ（ＢＤファルコン社製)中 にそれぞれ同一のスフェア数となる様に播種し、３７℃にて５日間ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で培養した。培地交換は、３倍容量のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）を培養液に添加した後遠心処理（１００Ｇ、３分間）によりスフェアを沈降させ、本スフェアに新たな培地を添加する形で、継代後1日目と３日目に行った。５日目に等量のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）を添加後、遠心処理（１００Ｇ、３分間）によりスフェアを全て回収し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液 (インビトロジェン社製) を用いて単細胞に解離した後、ヌクレオカウンター (ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製) にて細胞数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培地では、スフェアはチューブの底に沈み、大きな細胞塊となり増殖を示さなかったが、０．０１５％或いは０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含む培地では三次元的な浮遊状態でスフェアのサイズは大きくなり、播種した細胞数を１とすると５日目には、約１０倍の細胞数が得られ、細胞増殖が認められた。その結果を図６に示す。図６は播種した細胞数を1とした時に５日目の細胞数を相対的に示している。また、ヒトＥＳ細胞では、ポリスチレンチューブ中での培養５日目に３ｍＬあたり３，０００，０００個の細胞数を実際に得ることができた（培地１０００ｍＬの場合には約１，０００，０００，０００個の細胞数に相当する）。
（試験例６：ヒト多能性幹細胞のスフェア培養における未分化性維持の確認試験）
０．０１５％或いは０．０２０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むｍＴｅＳＲ培地にて浮遊静置培養したｈＰＳＣｓスフェア細胞に関して、その未分化能の維持をフローサイトメトリーによる解析で検討した。ポリスチレンチューブ中にてスフェア状態でヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１）は３回継代した細胞、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）については４回継代した細胞を回収した後、ｈＰＳＣｓの未分化性を示す表面マーカーであるＳＳＥＡ４の抗体（＃ＭＡＢ４３０４、ミリポア社製）とＴＲＡ−１−６０（＃ＭＡＢ４３６０、ミリポア社製）の抗体にて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて細胞の抗体染色の陽性率を評価した。その結果を図７に示す。図７に示すように、Ａ：ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１）、Ｂ：ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１）共に、マトリゲル上で維持した細胞と同様、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養した細胞の９０％以上が多能性幹細胞マーカーを発現していた。なお、ネガティブコントロールとして二次抗体のみの染色を実施した。以上のように、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞共に、脱アシル化ジェランガムを含む添加培地で浮遊静置培養したｈＰＳＣｓスフェアは未分化性を維持していることが判明した。
(試験例７: スフェア培養したヒト多能性幹細胞の特性解析１)
試験例３と同様の方法にて調製した０．０２０％(ｗ／ｖ)の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含むｍＴｅＳＲ培地（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、試験例４と同様の方法にてヒトｉＰＳ細胞 (２５３Ｇ１)或いはヒトＥＳ細胞 (ＫｈＥＳ−１)のスフェアを合計９回継代培養し、培養後のそれぞれの細胞について継代1日目のスフェアをマウス胎児線維芽細胞上に播種した。次の日に３００μｇ／ｍＬのチミジン（シグマ・アルドリッチ社製）処理を１晩実施した。引き続き、１００ｎｇ／ｍＬのコルセミド（ナカライテスク社製）処理を行い、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液にて単一細胞に解離後、０．０７５ＭのＫＣｌで低張処理を行った。その後、カルノア固定液（メタノール：酢酸＝３：１）にて細胞を固定した。
本固定細胞の核型解析はＱバンディング法で分析した（有限会社クロモソームサイエンスラボへの委託試験）。その結果、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞共に、本発明の培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、正常核型を保持していることが判明した。その結果を図８に示す。
(試験例８: スフェア培養したヒト多能性幹細胞の特性解析２)
試験例３と同様の方法にて調製した０．０２０％(ｗ／ｖ)の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含むｍＴｅＳＲ培地（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、試験例４と同様の方法にてヒトｉＰＳ細胞 (２５３Ｇ１)のスフェアを合計２１回から２２回、５日間毎に継代培養し、培養後のスフェアを４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）で固定した。２０％スクロース（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳで浸漬した後、凍結用包埋剤（Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド, サクラファインテックジャパン株式会社製）で包埋した。クライオスタット（サーモサイエンティフィック社製）で厚さ１２μmの切片を作成し、ｈＰＳＣｓの未分化性を示すＮＡＮＯＧ（＃４９０３、セルシグナリング社製）とＯＣＴ３／４（＃ｓｃ−５２７９、サンタクルツ社製）、ＳＳＥＡ４（＃ＭＡＢ４３０４、ミリポア社製）の抗体にて染色した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で浮遊静置培養した細胞は、多能性幹細胞の未分化マーカーを発現していることが明らかになった。以上のように、脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物で１００日以上浮遊静置培養したヒトｉＰＳ細胞のスフェアは未分化性を維持していることが判明した。その結果を図９に示す。
（試験例９：マイクロキャリア上に付着した細胞株を培養した際の細胞増殖試験）
マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）をＰＢＳに０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し１晩静置後、上清を捨てて新たなＰＢＳで本マイクロキャリアを２回洗浄した。その後、再度ＰＢＳで０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。引き続き、本マイクロキャリアを７０％エタノールにて２回、ＰＢＳにて３回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）にて０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁した。本マイクロキャリア懸濁液を用いて、１２０ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １及び４００００００個のＨｅｐＧ２細胞を含むＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清含有）２０ｍＬを調製し、本細胞懸濁液を予めシリコンコーティング剤（旭テクノグラス社製）で処理したビーカー中にて３７℃、６時間、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。ここで、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリアに接着していることを顕微鏡にて確認した。引き続き、細胞が接着したマイクロキャリアを１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて２回洗浄し、同培地３ｍＬにて懸濁した。
１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地２０ｍＬ或いは本培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に、上記のマイクロキャリア懸濁液３００μＬをそれぞれ添加し、３日間、３７℃にて培養した。この際、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。培養後は、顕微鏡にてマイクロキャリア上の細胞の付着状態を確認した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）でマイクロキャリアを沈降させた。ＰＢＳ１０ｍＬで本マイクロキャリアを洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を９ｍＬ添加した後、メッシュサイズ７０μｍのセルストレーナー（ＢＤファルコン社製）を用いてマイクロキャリアを除去した。ここで得られたろ液から遠心処理（２００Ｇ、５分）により細胞を回収した。本細胞を５００μＬの培地に懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は１２３，０００個の細胞を含んでいたが、脱アシル化ジェランガムを含む培養液は１，３２０，０００個の細胞を含んでいた。上記のとおり、本発明の特定化合物の構造体を含む培地組成物は、マイクロキャリアを用いて細胞培養を実施しても、既存の培地と比べて細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。本発明の特定化合物の構造体を含む培地組成物を用いてマイクロキャリア培養を３日間実施した際の、ＨｅｐＧ２細胞の付着状態を図１０に示す。
（試験例１０：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験）
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、キサンタンガムについて終濃度が０．１、０．１５、０．２％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、０．２％（ｗ／ｖ）のκ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）及び０．２％（ｗ／ｖ）のローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０３、０．０４、０．０５％（ｗ／ｖ）のκ−カラギーナンとローカストビーンガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。
試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、本細胞懸濁液に等量の培地を添加した後、遠心処理（３００乃至４００Ｇ、５分）によりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、回収できることを確認した。ＨｅＬａ細胞のスフェアを本発明の培地組成物にて培養した際の浮遊状態を図１１にそれぞれ示す。また、分析例１と同様の方法で測定した粘度を表７、８に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例１１：フィルターろ過した培地組成物を用いた細胞浮遊試験）
試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。引き続き、本培地組成物１ｍＬを７０μｍ、４０μｍのフィルター（ＢＤファルコン社製）、３０μｍ、２０μｍのフィルター（アズワン社製）、１０μｍのフィルター（Ｐａｒｔｅｃ社製）、５μｍ、１．２μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製）を用いてそれぞれろ過した。試験例２と同様の方法を用いて作成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、上記のろ液に対して約数十個添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、１０μｍ以上のフィルターを透過した培地組成物においては浮遊状態にて維持されるが、５μｍ以下のフィルターを透過した培地組成物においては沈殿することを確認した。更に、ここで浮遊状態にあるＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、室温にて３００Ｇ、５分間の遠心処理、或いは等量の培地を加えた後室温にて２００Ｇ、５分間の遠心処理を施すことにより沈降し、回収できることを確認した。
（試験例１２：スフェア形成試験）
試験例２と同様の方法を用いて０．０１％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅＬａ細胞を、１０００個／ｍＬの濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に分注した。本プレートを９日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、１７００００個／ｍＬまでＨｅＬａ細胞が増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したＨｅＬａ細胞のスフェアを図１２に示す。
（試験例１３：構造体の光学顕微鏡観察）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）９５ｍＬを入れ、室温でマグネチックスターラーにて攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液５ｍＬを添加し、そのまま５分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０２％培地組成物を調製した。さらに当培地組成物をホモミキサー（３０００ｒｐｍ）により５分間攪拌した。調製した培地組成物を光学顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００）により観察した。観察された構造体を図１３に示す。
（試験例１４：粉培地とＤＡＧの混合過熱による調製）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）２０ｍｇと、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１．５８ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（Ｓｉｚｅ ２００μｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表９に示す。
Figure 0006879517
（試験例１５：多糖類を混合した培地組成物の調製）
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度となるように純水に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にアルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）、κ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）、ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製）について、０．５％（ｗ／ｖ）の水溶液を作製した。
本水溶液と０．２もしくは０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）他の多糖を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、脱アシル化ジェランガムを含む培地を前記同様に調製した後、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）の粉末を添加した。氷浴にて攪拌し、メチルセルロースを溶解させ、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）他のメチルセルロースを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。
上記にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表１０に示す。
Figure 0006879517
（試験例１６：多糖類を混合した培地組成物の粘度測定）
試験例１５の多糖混合系と同様の方法で、終濃度が０．００５、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと他の多糖を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を調製した。多糖は最終濃度がキサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムは０．１％（ｗ／ｖ）、メチルセルロースは０．２％（ｗ／ｖ）、κ−カラギーナンとダイユータンガムは０．０５％（ｗ／ｖ）となるように調製した。それぞれの培地組成物の状態と分析例１と同様の方法で測定した粘度を表１１〜１６に示す。
Figure 0006879517
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（試験例１７：２価金属イオン濃度を変更した培地組成物の調製）
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用し、試験例１４の方法と同様に０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、終濃度がＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の規定量になるよう、塩化カルシウムまたは硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地の規定組成より、それぞれの終濃度は塩化カルシウム０．１１６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．０４９ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム０．０６１ｇ／Ｌとした。
調製した培地組成物にデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、２日後にビーズの分散を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表１７に示す。
Figure 0006879517
（試験例１８：２価金属イオンを後添加した培地組成物の調製）
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と５倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム不含、Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、塩化カルシウム１１６７ｍｇ、硫酸マグネシウム４８９ｍｇ、塩化マグネシウム２８７ｍｇを純水３００ｍＬに溶解させた塩溶液を調製した。２００ｍＬのトールビーカーに脱アシル化ジェランガム水溶液と純水を入れ、イカリ型攪拌羽を用いて２００ｒｐｍで溶液を攪拌した。培地液と水を混合したＡ液を添加し、そのまま１０分攪拌した。次いで塩溶液を添加、さらに７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を１．６ｍＬ添加し、終濃度０．０２％の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。それぞれの液の混合量を表に示す。調製４時間後に、６本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとＣｙｔｏｄｅｘ１の分散評価を行なった。結果を表１８、１９に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例１９：各種培地組成物の調製）
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と高濃度の培地液を調製した。高濃度の培地液は１０倍濃度のＭＥＭ（Ｍ０２６８、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ６５０４、Ａｌｄｒｉｃｈ製）と５倍濃度のＤＭＥＭ（高圧滅菌対応培地、ニッスイ製）を調製した。０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と各高濃度培地、濃度調整用の純水を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２、０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム含有する培地組成物をそれぞれ調製した。
調製した９本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１の浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表２０、２１に示す。
Figure 0006879517
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（試験例２０：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の粒度分布測定）
分析例１に倣い、０．０３８％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。培地はホモミキサーを用いて３０００ｒｐｍと６０００ｒｐｍにて１分攪拌し調製した。本培地組成物の粒度分布について、ベックマン・コールター（株）製Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４（コールター原理による精密粒度分布測定装置）を用いて測定し、体積基準粒度分布のメジアン径（ｄ５０）を求めた。結果を表２２に示す。
Figure 0006879517
（試験例２１：脱アシル化ジェランガムのリン酸化）
ガラス製の１００ｍＬ試験管に、脱アシルジェランガム１ｇと、純水４０ｍＬを秤りとり、１００℃で３０分加熱し、懸濁液を調製した。この懸濁液に、リン酸水溶液（８５％）１gを添加し、５時間加熱還流した。その後、１２時間撹拌しながら、室温まで放冷することで得た白色懸濁液を、９９％エタノール（５００ｍＬ）に注いだ。生じた綿状の白色固体を、ろ取後、乾燥させることで、脱アシルジェランガムのリン酸化物として、淡褐色固体（０．４ｇ）を得た。リン酸基が導入されたことは、フーリエ変換赤外分光分析（株式会社島津製作所製、ＩＲ−Ｐｒｅｓｔａｇｅ２１）によって確認した（１７００ｃｍ−１；Ｐ−ＯＨ、１２９６ｃｍ−１、１２６５ｃｍ−１；Ｐ＝Ｏ）。淡褐色固体をマイクロ波加熱分解装置（ETHOS TC, マイルストーンゼネラル製）によって分解した後に、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー社製)によってリン原子の含有率を測定した結果、３．５ｗｔ％（ｎ＝２）であった。
（試験例２２：リン酸化した脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製）
任意量のリン酸化した脱アシル化ジェランガム（３０ｍｇ）と、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ライフテクノロジーズ社製）１．５６ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０３％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。０．０３％（ｗ／ｖ）のリン酸化した脱アシル化シェランガム濃度において、ビーズの分散状態が認められた。
（試験例２３：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製）
脱アシル化ジェランガム水溶液と培地溶液とを下表に示す割合で添加することで混合して、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製したときのポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）の分散状態を評価した。結果を表２３、２４に示す。１日以上静置することで、全ての条件で、スチレンビーズが分散した。
Figure 0006879517
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（試験例２４：フィルターを用いた培地組成物の調製）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を最終濃度が０．０２或いは０．０４％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて３０分間或いは１２１℃にて２０分間加熱することにより溶解した。更に、本水溶液１００ｍＬを孔径が０．２２μｍのポリエーテルスルホン製メンブレンフィルター（コーニング社製）にてろ過した。引き続き、本ろ液を２乃至４倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ・アルドリッチ社製）と混合した後、マイルドミキサー（ＳＩ−２４、タイテック社製）にて１時間振とうし、最終濃度０．０１或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物をそれぞれ調製した（例えば、０．０２％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム水溶液と２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を２５ｍＬずつ混合し、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム培地組成物を５０ｍＬ調製した）。試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表２５に示す。
Figure 0006879517
（試験例２５：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験）
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で２日間培養した。ここで得られたＨＥＫ２９３細胞のスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた後、１ｍＬに懸濁した。引き続き、本スフェア懸濁液２００μＬ（細胞数は約２０００００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地に添加することにより調製した。
３７℃で５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（５００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、ＨＥＫ２９３細胞のスフェアは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。
ＨＥＫ２９３細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表２６に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表２７に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例２６：昆虫細胞を培養した際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｆ−９００（登録商標）IIIＳＦＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（ギブコ社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をインキュベーター内にて２５℃で５日間静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、Ｓｆ９細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。浮遊静置培養５日間後のＳｆ９細胞の細胞数を表２８に示す。
Figure 0006879517
（試験例２７：ＣＤ３４陽性細胞を培養した際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム、２０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）及び１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ、ＷＡＫＯ社製）を添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（ロンザ社製）を、１００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液を３７℃で７日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。また、残りの培養液に３倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことにより全ての細胞を沈降させた。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。
その結果、ＣＤ３４陽性細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて同等以上の細胞増殖促進効果を有することが確認された。また、遠心処理により細胞が沈降し、細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの、浮遊静置培養７日間後におけるＣＤ３４陽性細胞から増殖した細胞の相対的細胞数を表２９に示す。
Figure 0006879517
（試験例２８：スフェア形成試験）
試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅｐＧ２細胞を、１５０００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に１ｍＬ分注した。本プレートを７日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞は、本発明の培地組成物にてスフェアを形成し、また細胞数も８０８００個／ｍＬまでが増えていることが確認された。本発明の培地組成物にて形成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを図１４に示す。
（試験例２９：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験）
ダイユータンガム（ＫＥＬＫＯ−ＣＲＥＴＥ ＤＧ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、ダイユータンガムについて終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。また、０．５％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガム（ケルコゲル ＨＴ、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０５、０．１％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。
試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．１％（ｗ／ｖ）のダイユータンガムを含む本細胞懸濁液を遠心処理（２００Ｇ、５分）することによりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを確認した。
（試験例３０：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験１）
ラミニン或いはフィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス株式会社製）懸濁溶液を５００μＬずつ１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分注し、磁石スタンド（ＴＡ４８９９Ｎ１２、多摩川精機株式会社製）を使用して上記ＧＥＭ懸濁溶液からＧＥＭを集積させて溶媒を除去した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）５００μＬによりＧＥＭを２回洗浄した後、同上培地５００μＬに懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、同上培地にて最終容量を５００μＬ／ウェルとした。本細胞懸濁液を手動にて撹拌した後、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した。ＧＥＭ上での細胞の接着を顕微鏡にて確認した後、細胞懸濁液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンドを用いて細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。
試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製したＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭ（ラミニン或いはフィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを６日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を接着させたＧＥＭは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより本発明の培地組成物からＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭからＨｅｐＧ２細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をＧＥＭ上で６日間培養した際の細胞数を表３０に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１４に示す。
Figure 0006879517
（試験例３１：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験２）
試験例３０と同様に、フィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス株式会社製）をＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）に懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、試験例３０と同様に、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置させて間葉系幹細胞が接着したＧＥＭを調製した。
試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製した間葉系幹細胞付着ＧＥＭ（フィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを４日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。
その結果、間葉系幹細胞を接着させたＧＥＭは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより本発明の培地組成物から間葉系幹細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭから間葉系幹細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にて間葉系幹細胞をＧＥＭ上で４日間培養した際の細胞数を表３１に示す。
Figure 0006879517
（試験例３２：アルギン酸ビーズを用いた細胞浮遊試験）
以下の試験は、株式会社ＰＧリサーチ製アルギン酸三次元培養キットの方法に準じて実施した。別途調製したＨｅｐＧ２細胞を４０００００細胞／ｍＬとなる様にアルギン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）２．５ｍＬに添加し、更にヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、細胞懸濁液を調製した。本細胞懸濁液についてゾンデを装着した５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）で回収した後、本シリンジに２２Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した。引き続き、塩化カルシウム水溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）が２ｍＬずつ添加してある２４ウェル平底マイクロプレート（株式会社ＰＧリサーチ製）のウェルに対して、本細胞懸濁液を１０滴ずつ添加した。１０分間、室温にて静置してからアルギン酸ビーズの形成を確認した後、塩化カルシウム溶液を除去し、ＰＢＳ２ｍＬを添加して室温で１５分静置した。更に、ＰＢＳを除去した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）２ｍＬを添加し室温で１５分静置した。培地を除去した後、試験例２と同様の方法を用いて調製した０．０３％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを各ウェルに添加し、８日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。なお、培地交換は、培養４日目に実施した。
培養したアルギン酸ビーズを１ｍＬ容量のチップを用いて１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移した後、クエン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）１ｍＬを各チューブに添加し、室温１５分間攪拌してアルギン酸ビーズを溶解させた。引き続き、３００Ｇ、３分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して２００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をアルギン酸ビーズ内で８日間培養した際の細胞数を表３２に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１６に示す。
Figure 0006879517
（試験例３３：コラーゲンゲルカプセルを用いた細胞浮遊試験）
Ａ：組織培養用コラーゲンＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）ＴｙｐｅＩ‐Ａ (セルマトリックス、新田ゼラチン株式会社製)、Ｂ：１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｃ：再構成用緩衝液（０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬに炭酸水素ナトリウム２．２ｇ、ＨＥＰＥＳ（４‐(２‐ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ)‐１‐ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））４．７７ｇを加えてろ過滅菌したもの）のそれぞれを氷中にて冷却しながらＡ：Ｂ：Ｃ＝８：１：１となるように混合した。更に、ヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、コラーゲン混合溶液５００μＬを調製した。本混合溶液に対して別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２０００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、２５Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した１．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）を用いて全量を回収した。引き続き、３７℃にて予め保温した１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）１０ｍＬを添加した平底チューブ（ＢＭ機器社製）に対して、上記シリンジを用いて１滴ずつ細胞懸濁液を滴下した。３７℃水浴中にて１０分間保温して、直径２ｍｍ程度の不定形なコラーゲンゲルカプセルの形成を確認した後、試験例２と同様の方法にて最終濃度０．０４％となるように脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を添加し、軽く撹拌して上記カプセルを浮遊させた。引き続き、５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で本チューブを静置培養した。
コラーゲンゲルカプセルを含む培養液に対してＰＢＳ２５ｍＬを添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりコラーゲンゲルカプセルを沈降させ、上清を除去した。再度、ＰＢＳ２５ｍＬを加えて遠心処理を行い、残量が５ｍＬとなるように上清を除去した。本液に対して１％（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン株式会社製）２０μＬを添加した後、３７℃にて２時間振とうした。コラーゲンゲルの溶解を確認した後、ＰＢＳ１０ｍＬを加え、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を４ｍＬ添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。得られた細胞を２ｍＬの同上培地にて懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。
その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、本発明の培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をコラーゲンゲルカプセル内で５日間培養した際の細胞数を表３３に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１７に示す。
Figure 0006879517
（試験例３４：フィルターを用いたスフェアの回収試験）
試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。また、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地を調製した。試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ８６０００個の細胞数となるようにスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。更に、メッシュサイズが４０μｍのセルストレーナー（ベクトン・ディッキントン社製）上に本細胞懸濁液を添加し、スフェアをフィルター上に捕捉した。引き続き、フィルターの裏面からＰＢＳ１０ｍＬを流し込むことによりスフェアを１５ｍＬチューブに回収し、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェアを沈降させた。上清を除去した後、スフェアに対して５００μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算板（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物において浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．０１５％の脱アシル化ジェランガムを含む本スフェア懸濁液をフィルター処理することにより、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、脱アシル化ジェランガムを含まない培地と同等の回収率にて細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地を用いてフィルターにて回収されたＨｅｐＧ２細胞数を１としたときの、脱アシル化ジェランガムを含む培地から回収された相対的細胞数を表３４に示す。
Figure 0006879517
（試験例３５：各種多糖類の混合剤を用いたスフェアの細胞浮遊試験）
試験例１５と同様の方法を用いて、キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）、アルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ−２００−Ｊ、三晶株式会社製）、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）、κ−カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ−８０−Ｊ、三晶株式会社製）、ペクチン（ＧＥＮＵ ｐｅｃｔｉｎ ＬＭ−１０２ＡＳ、三晶株式会社製）或いはダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製）と脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を組み合わせて混合したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地組成物を調製した。試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表３５及び表３６に示す。なお、表中の−は未実施を示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
ビーズと細胞の分散性比較１
上記（比較例）にて調製した脱アシルジェランガム含有培地とメチルセルロース含有培地について、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態を比較した。結果を表に示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ１とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、Ｃｙｔｏｄｅｘ１を細胞スフェアモデルとして使用することができる。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
ビーズと細胞の分散性比較２
試験例１５にて調製した多糖および脱アシルジェランガム含有培地について、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００−６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）とＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態を比較した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表に示す。ポリスチレンビーズとＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、ポリスチレンビーズを細胞スフェアモデルとして使用することができる。
Figure 0006879517
（試験例３６：イネ由来植物カルスの浮遊培養試験）
塩水選にて精選されたイネ日本晴の完熟種子（湖東農業協同組合より購入）５０粒を５０ｍＬポリスチレンチューブ（ＢＤファルコン社製)に移し、滅菌水５０ｍＬにて洗浄した後、７０％エタノール水３０ｍＬ中にて１分間撹拌した。エタノール水を除去した後、キッチンハイター（花王株式会社製）３０ｍＬを添加し、１時間撹拌した。キッチンハイターを除去した後、滅菌水５０ｍＬにて４回洗浄した。ここで滅菌した種子を、２μｇ／ｍＬの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）及び寒天を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）１．５ｍＬ／ウェル（２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製））上に置床した。３０℃、１６時間暗所／８時間暗所の条件にて３週間培養し、種子の胚盤上で増殖したクリーム色のカルス（１〜２ｍｍ）を採取した。
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて、２μｇ／ｍＬの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）に終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。上記にて調製したカルス１５個を本培地組成物１０ｍＬ／平底チューブ（ＢＭ機器社製）に添加し、７日間、２５℃にて振とう培養を行った。その結果、イネ由来カルスは本発明の培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物にてカルスが維持されることが確認された。イネ由来カルスを本発明の培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１８に示す。
（試験例３７：ＨｅＬａ細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）或いは０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＨｅＬａ細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて８日間静置状態で培養した。３、８日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、８日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、得られた攪拌液２０μＬとＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ ０．４％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２０μＬを混合した後、顕微鏡下で計測した。
その結果、ＨｅＬａ細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。８日間培養後のＨｅＬａ細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図１９に示す。また、静置培養３、８日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＨｅＬａ細胞の細胞数に相当する）を表４０に示す。８日間培養後のＨｅＬａ細胞の細胞密度を表４１に示す。
Figure 0006879517
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（試験例３８：Ａ５４９細胞及びＨＣＴ１１６細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）或いはＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）或いはヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞およびＨＣＴ１１６細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて７日間静置状態で培養した。３、５、７日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、Ａ５４９細胞およびＨＣＴ１１６細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。５日間培養後のＡ５４９細胞およびＨＣＴ１１６細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図２０に示す。また、静置培養３、５、７日間後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ５４９細胞の細胞数に相当する）を表４２に、４５０ｎｍの吸光度（ＨＣＴ１１６細胞の細胞数に相当する）を表４３に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例３９：Ｕ底の低接着表面プレートを用いた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェルＵ底低接着表面マイクロプレート（住友ベークライト製、＃ＭＳ−９０９６Ｕ）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＨｅＬａ細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて７日間静置状態で培養した。２、５、７日間培養後の培養液に対して、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の低接着プレートでも当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養２、５、７日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＨｅＬａ細胞の細胞数に相当する）を表４４に示す。
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（試験例４０：他社の低接着表面プレートを用いた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．００５％及び０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底低接着表面マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ製、＃Ｅｚ−ＢｉｎｄＳｈｕｔ）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＨｅＬａ細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて７日間静置状態で培養した。３日間培養後の培養液に対して、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の低接着プレートでも当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養３日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＨｅＬａ細胞の細胞数に相当する）を表４５に示す。
Figure 0006879517
（試験例４１：Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地との細胞増殖比較試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地（ｂｉｏｃｒｏｉ社製）はあらかじめ指定の濃度（１：１で混合）になるようにＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）で調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）或いはヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはＨａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて５日間静置状態で培養した。３、５日間培養後の培養液に対して、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭと比較して当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養３、５日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＨｅＬａ細胞の細胞数に相当する）を表４６に、４５０ｎｍの吸光度（Ａ５４９細胞の細胞数に相当する）を表４７に示す。
Figure 0006879517
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（試験例４２：他の多糖類を用いた際の細胞増殖試験）
ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製）を１．５％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）に終濃度０．２％及び０．３％（ｗ／ｖ）のダイユータンガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記のダイユータンガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照としてダイユータンガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。３日間培養後の培養液に対して、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、他の多糖類を含む当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。静置培養３日間後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ５４９細胞の細胞数に相当する）を表４８に示す。
Figure 0006879517
（試験例４３：各種抗がん剤を用いた細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．００１、０．０１、０．１、１μＭの各種抗がん剤を添加した培地組成物を調製した。抗がん剤はＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ＷＡＫＯ社製）、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ＷＡＫＯ社製）或いはＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＷＡＫＯ社製）を用いた。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。
なお、無添加として、終濃度０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムのみを含む同上培地にＨｅＬａ細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて７日間静置状態で培養した。３、５、７日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。細胞密度は、５日間培養後の細胞を含んだ培養液をピペットで攪拌を行い、攪拌液２０μＬとＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎ ０．４％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２０μＬを混合し顕微鏡下で計測した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、抗がん剤を効率的に評価できることが確認された。また、静置培養３、５、７日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＨｅＬａ細胞の細胞数に相当する）を表４９に示す。５日間後のＨｅＬａ細胞の細胞密度を表５０に示す。
Figure 0006879517
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（試験例４４：ヒト初代肝細胞の維持及び機能試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤（ＨＣＭｓｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）、ＢＳＡ−Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ，ＥＧＦ，Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＧＡ−１０００，Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ２１ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ；ロンザジャパン株式会社製）を添加したＨＢＭ培地（ロンザジャパン株式会社製）に終濃度０．０１５％或いは０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製）を、２５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェルＵ底超低接着表面マイクロプレート（住友ベークライト株式会社製、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ、ＭＳ−９０９６Ｕ）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。
１．生細胞数測定
４時間、８時間、１日間培養後の培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
２．アルブミン分泌量の解析
３日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて測定した。
３．リアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡの発現解析
８時間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを内在性コントロールとし、各ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の値で補正し、陰性対照を１００％として算出した。
用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
Ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳ９９９９９９２２
Ｃｙｐ３Ａ４：ＨＳ００６０４５０６
Ｃｙｐ２Ｃ９：ＨＳ０２３８３６３１
ＰＸＲ（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）：ＨＳ０１１１４２６７
ＡｐｏＡ１（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）：ＨＳ００１６３６４１
その結果、本発明の培地組成物は、ヒト初代肝細胞を分散した状態に保ち、保護することにより生細胞数の減少を抑制する効果を有することが確認された。また当該培地組成物でアルブミン産生能と薬物動態に関わるｍＲＮＡ群発現能が陰性対照に比べて高いことが確認された。静置培養４時間、８時間、１日間後の４５０ｎｍの吸光度（ヒト初代肝細胞の細胞数に相当する）を表５１に示す。静置培養３日間後の培養上清中のアルブミン値を表５２に示す。また静置培養８時間後の陰性対照を１００％とした際の各ｍＲＮＡ発現値を表５３に示す。ヒト初代肝細胞を４時間培養した際の細胞の状態を図２１に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
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（試験例４５：カニクイザル初代肝細胞の維持及び機能試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤（ＨＣＭｓｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）、ＢＳＡ−Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ，ＥＧＦ，Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＧＡ−１０００，Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ２１ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ；ロンザジャパン株式会社製）を添加したＨＢＭ培地（ロンザジャパン株式会社製）に終濃度０．０１５％或いは０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞（株式会社イナリサーチ社製）を、２５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェルＵ底超低接着表面マイクロプレート（住友ベークライト株式会社製、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ、ＭＳ−９０９６Ｕ）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。
１．生細胞数測定
４時間、８時間、１日、３日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
２．アルブミン分泌量の解析
３日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて測定した。
３．リアルタイムＰＣＲ法によるｍＲＮＡの発現解析
１、２、３日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合さ
せたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを内在性コントロールとし、各ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正し算出した。
用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
ＧＡＰＤＨ：Ｒｈ０２６２１７４５
Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｒｈ０２７８９６７２
ＡｐｏＡ１（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ１）：Ｒｈ０２７９４２７２
その結果、本発明の培地組成物は、カニクイザル初代肝細胞を保護することにより生細胞数の減少を抑制する効果を有することが確認された。また当該培地組成物で培養した肝細胞は、アルブミン産生能とＡｌｂｕｍｉｎ及びＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ群発現能が陰性対照に比べて高いことが確認された。静置培養４時間、８時間、１日間、３日間後の４５０ｎｍの吸光度（カニクイザル初代肝細胞の細胞数に相当する）を表５４に示す。静置培養３日間後の培養上清中のアルブミン値を表５５に示す。また静置培養２、３日後における、陰性対照を１００％とした際のＡｌｂｕｍｉｎのｍＲＮＡ発現値を表５６に、ＡｐｏＡ１のｍＲＮＡ発現値を表５７に示す。カニクイザル初代肝細胞を４時間培養した際の細胞の状態を図２２に示す。
Figure 0006879517
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Figure 0006879517
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（試験例４６：コラーゲンコートマイクロプレートにおける肝細胞の維持及び機能試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤（ＨＣＭｓｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）、ＢＳＡ−Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ，ＥＧＦ，Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＧＡ−１０００，Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ２１ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ；ロンザジャパン株式会社製）を添加したＨＢＭ培地（ロンザジャパン株式会社製）に終濃度０．０１５％或いは０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、凍結されていたカニクイザル初代肝細胞（株式会社イナリサーチ社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェルコラーゲンコートマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製、４８６０−０１０）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。
１．生細胞数測定
１日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
２．アルブミン分泌量の解析
３日間培養後の、肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで培養上清を回収した。培地中のヒトアルブミン濃度は、Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、コラーゲンをコートしたプレートを用いても当該培地組成物で初代肝細胞を保護することで生細胞数の減少を抑制することが確認された。また当該培地組成物でアルブミン産生能が陰性対照に比べて高いことが確認された。静置培養１日間後の４５０ｎｍの吸光度（カニクイザル初代肝細胞の細胞数に相当する）を表５８に示す。また静置培養３日間後の培養上清中のアルブミン値を表５９に示す。
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Figure 0006879517
（試験例４７：Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地との比較試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて添加剤（ＨＣＭｓｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（登録商標）、ＢＳＡ−Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｆｒｅｅ，ＥＧＦ，Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＧＡ−１０００，Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ２１ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ；ロンザジャパン株式会社製）を添加したＨＢＭ培地（ロンザジャパン株式会社製）をＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に１：１で混合し、終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地（ｂｉｏｃｒｏｉ社製）はあらかじめ指定の濃度（１：１で混合）になるようにＤＭＥＭ培地で調製した。引き続き、凍結されていたヒト初代肝細胞（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社製）を、２５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物或いはＨａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭ培地組成物に播種した後、９６ウェルＵ底超低接着表面マイクロプレート（住友ベークライト株式会社製）のウェルに１ウェル当たり２００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にヒト初代肝細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて６日間静置状態で培養した。
１．生細胞数測定
２時間、４時間、８時間、１日間、４日間、６日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を２０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いることにより、Ｈａｐｐｙ Ｃｅｌｌ ＡＳＭと比較して初代肝細胞を保護することで生細胞数の減少を抑制する効果に優れていることが確認された。静置培養２時間、４時間、８時間、１日間、４日間、６日間後の４５０ｎｍの吸光度（ヒト初代肝細胞の細胞数に相当する）を表６０に示す。
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（試験例４８：肝細胞に対する化合物の毒性試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。一方、ＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に対してＨｅｐＧ２細胞を１０００００細胞／ｍＬとなるように混合し、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように細胞懸濁液を分注した。上記の脱アシル化ジェランガム水溶液に対して各濃度のＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＷＡＫＯ社製、 ＃７１７５０）を添加し、本溶液を上記の細胞懸濁液１００μＬに対して１０μＬ添加した。以上の処理により、ＤＭＳＯ濃度が０．１８％（ｖ／ｖ）、Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ濃度が２０．０、４０．０、６０．０、１００ (μｍｏｌ／Ｌ）、脱アシル化ジェランガム濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）となる細胞懸濁液を調製した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて１日間静置状態で培養した。
１．生細胞数測定
１日間培養後の培養液５０μＬを９６穴タイタープレート（コーニング社製）に分注し、本培養液に対してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（プロメガ社製）を５０μＬ添加した後、１０分間室温にてインキュベートし、マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３）にて発光強度を測定することにより生細胞の数を測定した。
２．乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性測定
１日間培養後の培養液１００μＬに対してＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）１００μＬを添加し、４４０Ｇにてプレートごと１５分間遠心した。上清１００μＬを９６穴タイタープレート（コーニング社製）に分注し、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）の反応混合液１００μＬを添加し、室温にて遮光下３０分間静置した。引き続き、上記キットのプロトコールに従い、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４９０ｎｍの吸光度（リファレンス；６００ｎｍ）を測定することにより障害を受けた細胞の割合、すなわち細胞障害率（％）を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いて、Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅが肝細胞の細胞障害性を有することが確認された。１日間培養後における無添加条件を１とした際の相対的細胞数並びに細胞障害率（％）を表６１に示す。
Figure 0006879517
（試験例４９：Ａ５４９細胞を用いたＡＴＰ定量法による細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）、０．０１５％（ｗ／ｖ）或いは０．０３０％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ５４９細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて５日間静置状態で培養した。１、３、５日間培養後の培養液に対して、ＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＷＳＴ−８測定は、３日間培養後の細胞にＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、Ａ５４９細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより効率的に増殖することがＡＴＰ測定法においても確認された。静置培養１、３、５日間後のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６２に示す。３日間培養後の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８）とＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６３に示す。
Figure 0006879517
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（試験例５０：抗がん剤を用いた細胞増殖試験における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度０．００１から１μＭになるように、１０倍濃度の各種抗がん剤と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度の各種抗がん剤のみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き３日間培養を継続した。抗がん剤はＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ＷＡＫＯ社製）、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（ＷＡＫＯ社製）或いはＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（ＷＡＫＯ社製）を用いた。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＷＳＴ−８測定は、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１５μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃの薬効が強く示されることが分かった。静置培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６４に示す。静置培養４日目の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８測定）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６５に示す。
Figure 0006879517
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（試験例５１：アポトーシス誘導剤を用いた細胞増殖試験における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度０．２から１０μＭになるように、１０倍濃度の各種アポトーシス誘導剤と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度の各種アポトーシス誘導剤のみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を３日間継続した。アポトーシス誘導剤はＡｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｒ ｓｅｔ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＡＰＴ８００：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ，Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ，Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ， Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ， Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）を用いた。４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＷＳＴ−８測定は、ＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１５μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてＣａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎとＥｔｏｐｏｓｉｄｅの薬効が強く示されることが分かった。静置培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６６に示す。静置培養４日目の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８測定）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６７に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例５２：ＴｒａｍｅｔｉｎｉｂおよびＭＫ−２２０６を用いたＨｅＬａ細胞増殖試験における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを、７４００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度０．００１から３０μＭになるように、１０倍濃度の各抗がん剤と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を５日間継続した。抗がん剤はＴｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ＭＥＫ阻害剤）およびＭＫ−２２０６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、Ａｋｔ阻害剤）を用いた。６日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてＭＫ−２２０６とＴｒａｍｅｔｉｎｉｂの薬効が強く示されることが分かった。静置培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６８に示す。
Figure 0006879517
（試験例５３：ＴｒａｍｅｔｉｎｉｂおよびＭＫ−２２０６を用いたＡ５４９細胞増殖試験における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度０．００１から３０μＭになるように、１０倍濃度の各抗がん剤と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度の各抗がん剤のみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を５日間継続した。抗がん剤はＴｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ＭＥＫ阻害剤）およびＭＫ−２２０６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、Ａｋｔ阻害剤）を用いた。６日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いた細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてＭＫ−２２０６の薬効が強く示されることが分かった。静置培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表６９に示す。
Figure 0006879517
（試験例５４：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＨｅＬａ細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１０、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮成長因子様増殖因子、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を７日間継続した。６日目および８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたＨｅＬａ細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ−ＥＧＦの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７０に示す。静置培養８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７１に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例５５：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＡ５４９細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１０、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を７日間継続した。６日目および８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたＡ５４９細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ−ＥＧＦの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７２に示す。静置培養８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７３に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例５６：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＡ４３１細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１０、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を７日間継続した。６日目および８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたＡ４３１細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ−ＥＧＦの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７４に示す。静置培養８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７５に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例５７：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＳＫＯＶ３細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１０、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を８日間継続した。６日目および９日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物を用いたＳＫＯＶ３細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ−ＥＧＦの細胞増殖促進効果が強く示されることが分かった。静置培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７６に示す。静置培養９日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７７に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例５８：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現における単層培養法との比較）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１０、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ−ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を６日間継続した。７日目の癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとし、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正し、陰性対照を１００％として算出した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
ＶＥＧＦ： ＨＳ００１７３６２６
その結果、本発明の培地組成物を用いて培養したＨｅＬａ細胞は、単層培養法に比べてヒトＨＢ−ＥＧＦによるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現促進効果が強く示されることが分かった。また、静置培養７日目の陰性対照を１００％とした際のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現値を表７８に示す。
Figure 0006879517
（試験例５９：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＡ５４９細胞の増殖に対するＧｅｆｉｎｉｔｉｂの効果）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト肺癌細胞株Ａ５４９（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１４８００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、各抗がん剤は終濃度０．１から３０μＭになるように、ヒトＨＢ−ＥＧＦは終濃度０ｎｇ／ｍｌあるいは１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度の各抗がん剤およびヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を５日間継続した。抗がん剤はＧｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ＥＧＦ受容体阻害剤）を用いた。６日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物とヒトＨＢ−ＥＧＦを用いたＡ５４９細胞増殖試験法により、ＨＢ−ＥＧＦを添加した培養条件のほうがＧｅｆｉｔｉｎｉｂの抑制効果は強かった。静置培養６日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表７９に示す。
Figure 0006879517
（試験例６０：ヒトＨＢ−ＥＧＦで刺激したＡ４３１細胞の増殖作用におけるＧｅｆｉｎｉｔｉｂ、Ｅｌｒｏｔｉｎｉｂの効果）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、各抗がん剤は終濃度０．１から３０μＭになるように、ヒトＨＢ−ＥＧＦは終濃度０ｎｇ／ｍｌあるいは１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度の各抗がん剤およびヒトＨＢ−ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を７日間継続した。抗がん剤はＧｅｆｉｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ＥＧＦ受容体阻害剤）、Ｅｌｒｏｔｉｎｉｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ＥＧＦ受容体阻害剤）を用いた。４日目、６日目および８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
その結果、本発明の培地組成物とヒトＨＢ−ＥＧＦを組み合わせた培養法で、低接着培養条件でのＡ４３１細胞増殖を認めた。さらに本発明の培地組成物とヒトＨＢ−ＥＧＦを組み合わせたＡ４３１細胞増殖試験法により、ＨＢ−ＥＧＦ増殖亢進作用に対するＧｅｆｉｔｉｎｉｂおよびＥｌｒｏｔｉｎｉｂの抑制効果を判断できた。ヒトＨＢ−ＥＧＦの増殖促進作用に関しては、静置培養４日目、６日目、８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８０に示す。さらにヒトＨＢ−ＥＧＦ増殖促進作用に対する各抗がん剤の作用に関しては、静置培養４日目、８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表８１に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例６１：ＭＣＦ−７細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＭＣＦ−７細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて５日間静置状態で培養した。２、５日間培養後の培養液に対して、ＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。ＷＳＴ−８測定は、２、５日間培養後の細胞にＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、ＭＣＦ−７細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより効率的に増殖することがＡＴＰ測定法およびＷＳＴ−８測定法で確認された。静置培養２、５日間後のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８２に示す。２、５日間培養後の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８））を表８３に示す。５日間培養後のＭＣＦ−７細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図２３に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例６２：Ａ３７５細胞及びＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）或いはＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ製）或いはヒト骨肉腫細胞株ＭＮＮＧ/ＨＯＳ（ＡＴＣＣ製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＡ３７５細胞およびＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて４日間静置状態で培養した。４日間培養後の培養液に対して、ＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。４日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、Ａ３７５細胞およびＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。４日間培養後のＡ３７５細胞およびＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図２４に示す。また、Ａ３７５細胞において、静置培養４日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８）とＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８４に示す。ＭＮＮＧ/ＨＯＳ細胞において、静置培養４日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８）とＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８５に示す。
Figure 0006879517
Figure 0006879517
（試験例６３：ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を分散させた際の細胞増殖試験）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。なお、陰性対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地にＭＩＡＰａＣａ−２細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて６日間静置状態で培養した。６日間培養後の培養液に対して、ＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し縣濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。６日間培養後の、培養液に対してＷＳＴ−８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を１０μＬ添加した後、１００分間３７℃にてインキュベートし、吸光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、培地のみの吸光度を差し引くことにより生細胞の数を測定した。
その結果、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞は、本発明の培地組成物を用いることにより細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率的に増殖することが確認された。６日間培養後のＭＩＡＰａＣａ−２細胞の凝集塊の顕微鏡観察の結果を図２５に示す。また、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞において、静置培養４日間後の４５０ｎｍの吸光度（ＷＳＴ−８）とＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８６に示す。
Figure 0006879517
（試験例６４：脱アシル化ジェランガムを含む培地の濃縮及び希釈）
試験例２と同様の方法を用いて調製した０．０１５％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）を、１５ｍＬ遠心チューブ（ＶＩＯＬＡＭＯ社製）に１０ｍＬずつ分注し、スイングローター ＬＣ−２００（トミー精工社製）にて遠心（７００Ｇ、５分間）することにより脱アシル化ジェランガムを沈降させた後、上清８ｍＬをアスピレーターで除去し、これにより脱アシル化ジェランガム含有培地の濃縮を行った。更に、本濃縮培地に脱アシル化ジェランガムを含まないＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）を添加してピペッティングにより混合し、任意の濃縮率の培地をそれぞれ作成した。
一方、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）に５０００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、３７℃、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。ここで得られたスフェア（直径１００〜２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）により沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液１．０ｍＬを調製した。上記の任意濃度にて作成した培地に本スフェア懸濁液を１００μＬずつ加えてピペッティングによりスフェアを分散させ、３７℃でインキュベートし、１時間後のスフェアの分散状態を目視にて観察した。その結果を表８７に示す。
表８７に示した様に、脱アシル化ジェランガムは培地組成物として調製後に任意濃度に濃縮及び希釈することが可能であり、この様にして濃縮及び希釈した培地組成物はスフェアの浮遊効果を有することが確認された。
Figure 0006879517
（試験例６５：脱アシルジェランガム含有ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地の作製）
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）１２０ｍｇを純水７２ｍＬに懸濁させ、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。これに、純水を加えて、脱アシルジェランガムが０．０１７％（ｗ／ｖ）の溶液７２０ｍＬを調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて、滅菌した。他方、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２等量混合の粉末培地（ライフテクノロジー社）と炭酸水素ナトリウムに培地調製時の推奨値の１０分の１量に当たる純水を加え、１０倍の濃度で８０ｍＬ水溶液を調製した後、滅菌フィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて、滅菌した。これらを、滅菌条件下、２５℃で、攪拌しながら混合することで、脱アシルジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ）である目的の培地８００ｍＬを調製した。
本発明に係る培地組成物は、優れた細胞及び／又は組織浮遊効果を示し、動植物由来の細胞及び／又は組織をその機能を維持しながら大量に培養する際に極めて有用である。また、本発明の方法により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等の分野において極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願2012-164227（出願日：2012年7月24日）、特願2012-263801（出願日：2012年11月30日）、特願2013-017836（出願日：2013年1月31日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (1)

  1. 脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有する液体培地組成物中で接着細胞を浮遊培養することを特徴とするスフェアの製造方法。
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