CN108796028A - 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法。本发明提供：培养细胞和/或组织的方法，所述方法特征在于使用培养基组合物以漂浮状态培养细胞和/或组织，其中无定形结构在液体培养基中形成，均匀地分散于溶液中并实质上支持细胞和/或组织，而不会实质上增加溶液的粘度，因而所述培养基组合物具有防止结构沉淀的作用；等等。

Description

培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法
本申请是申请日为2013年07月24日、发明名称为“培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法”的中国发明专利申请No.201380049416.6(国际申请号为PCT/JP2013/070001)的分案申请。
技术领域
本发明涉及含有能够悬浮细胞或组织的结构的培养基组合物、和通过使用所述培养基组合物培养细胞或组织的方法。培养基组合物和使用本发明的培养基组合物的细胞培养方法可以优选用于培养动物或植物的细胞和/或组织，尤其是以悬浮状态培养。
背景技术
在近些年，已开发了用于体外增生或维持在动物和植物机体内起不同作用的多种器官、组织和细胞的技术。体外增生或维持器官和组织分别被称为器官培养和组织培养，并且体外增殖、分化或维持从器官或组织分离的细胞被称为细胞培养。细胞培养是在培养基中体外增殖、分化或维持分离的细胞的技术，并且对于详细分析多种器官、组织和细胞的体内功能和结构是必要的。此外，通过该技术培养的细胞和/或组织用于以下多个领域：化学物质、药品等的效力和毒性评价，有用物质诸如酶、细胞生长因子、抗体等的大规模生产，再生性医学补充由于疾病和缺乏而损失的器官、组织和细胞，改进植物品牌(plant brand)，生产基因重组产物等等。
动物来源的细胞基于其特性被大体分为非粘附细胞和粘附细胞。非粘附细胞是不需要支架用于生长和增殖的细胞，而粘附细胞是需要支架用于生长和增殖的细胞。大部分构成活体的细胞是后者，即粘附细胞。作为粘附细胞的培养方法，单层培养、分散培养、包埋培养(embedded culture)、微载体培养、球培养(sphere culture)等是已知的。
单层培养是通过使用由经受多种表面处理的玻璃或合成聚合物材料制成的培养容器或者被称为饲养细胞的支持细胞作为支架来培养目的细胞为单层的方法，并且一般而言是最普遍的。例如，已开发了培养方法，其使用多种形状或特性诸如聚苯乙烯的培养容器，所述培养容器应用有多种表面处理(等离子体处理、电晕处理等)，用细胞粘附因子诸如胶原、纤连蛋白、聚赖氨酸等包被，或者预先铺有饲养细胞等。然而，单层培养的问题在于细胞无法长期维持它们在体内具有的特定功能，这是由于其二维的培养环境完全不同于体内环境，细胞无法重建与体内组织类似的组织，由于每恒定面积的细胞数目是受限的，因此它不适合于细胞的大量培养，等等(专利文献1)。此外，在饲养细胞上培养目的细胞的方法有时会面对从饲养细胞中分离目的细胞的问题(非专利文献1)。
分散培养是培养悬浮状态的粘附细胞的方法，其包括在培养基中接种细胞，并在应用有抑制细胞粘附的表面处理的培养容器中摇动培养基，以抑制细胞与培养容器的附着。然而，通过该方法培养的粘附细胞无法粘附于支架，并因此，所述方法无法应用于根本上需要粘附于支架以进行细胞增殖的细胞。此外，持续地被剪切力破坏，细胞无法展示出其粘附细胞功能，并因此，功能性细胞有时无法大量培养(非专利文献2)。
包埋培养是通过将细胞在固体或半固体凝胶基材诸如琼脂、甲基纤维素、胶原、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、藻酸盐等中包埋并固定来培养细胞的方法。由于该方法使得细胞以更接近于体内的状态进行三维培养并且凝胶基材自身有时促进细胞的增殖和分化，因此当与单层培养和分散培养相比时，细胞可以以高密度进行培养同时维持细胞功能(专利文献2、3)。此外，也已经开发了培养细胞的方法，包括通过将细胞包埋在凝胶基材中形成大小为100-300μm的微囊，和在水溶液培养基中培养细胞同时分散微囊(非专利文献3)。然而，这些方法具有的问题在于培养细胞的连续观察是不可能的，除非可见光穿透凝胶基材，从培养基中回收细胞需要损伤细胞的复杂操作诸如酶处理(例如，在胶原凝胶的情况下，胶原酶处理)等，这是由于培养基和含有微囊的凝胶基材具有高粘度，对于长期培养必需的培养基更换是困难的等等。在近些年，已经开发了通过用热、剪切力等处理使得从凝胶基材中回收细胞的技术。然而，热、剪切力等可能对细胞功能施加不利作用，并且凝胶基材对活体的安全性尚未得到阐明(专利文献4、5，非专利文献4、5、6、7)。此外，在食品领域已经开发了sol食品，其用于防止被切成小块以使食品均匀分散并悬浮的颗粒食品诸如水果、蔬菜等沉淀并使其漂浮。然而，sol食品没有考虑回收分散的颗粒食品，并且细胞和组织是否可以进行悬浮培养尚未检查(专利文件6)。
微载体培养是这样的方法，其通过在略微比水重的细颗粒(下文也称为微载体)的表面上增殖以单层的细胞来以悬浮状态培养细胞，并在培养容器诸如烧瓶等中搅拌细颗粒。通常，用于该方法的微载体是具有直径100-300μm、表面积3000-6000cm2/g、比重1.03-1.05的球颗粒，并且由材料诸如葡聚糖、明胶、藻酸、聚苯乙烯等构成。胶原、明胶或带电荷基团诸如二甲基氨基乙基等也可以提供至微载体表面以利于细胞的粘附。由于该方法可以显著增加培养面积，因此将其应用到细胞的大量培养上(专利文件7、8)。然而，难以将目的细胞几乎均匀地附着至所有微载体上，并且由于搅拌过程中的剪切力、细胞上的损伤等会发生问题诸如细胞从微载体上解离(非专利用文献8)。
球培养是这样的培养方法，其包括形成由若干打－几百个目的细胞构成的聚集体(下文中也称为球(sphere))，并在培养基中以静置或摇动培养所述聚集体。与单层培养和分散培养方法相比，已知球具有高细胞密度，重构与体内环境中的接近的细胞-细胞相互作用和细胞结构，并且可以进行培养同时更长时期维持细胞功能(非专利文献9、10)。然而，球培养无法形成大的球，这是由于当球的大小过于大时，球内部的营养供应和废物排出是困难的。此外，由于形成的球需要在培养容器的底部上以分散状态进行培养，因此每给定体积的球的数目无法容易地增加，并且其不适合于大量培养。此外，作为形成球的方法，悬滴培养、在细胞非粘附表面上培养、微孔内培养、旋转培养、利用细胞支架培养，通过离心力、超声处理、电场或磁场等凝聚均是已知的。然而，这些方法的问题在于操作复杂，回收球困难，大小控制和大规模生产困难，对细胞的影响是未知的，特定的专有容器和设备是必需的等等(专利文献9)。
另一方面，对于植物、细胞、无细胞壁的原生质体或器官、组织、植物诸如叶、茎、根、生长点、种子、胚、花粉等的愈伤组织也可以通过以无菌状态培养进行生长。使用用于这样的植物组织和细胞的培养技术，植物的品牌提升(brand improvement)和有用物质的生产已变得可能。作为在短时间内大量增殖植物细胞和组织的方法，植物细胞和组织在液体培养基中的悬浮培养方法是已知的(非专利文献11)。为了实现其良好的增殖，供应足够的氧、维持均匀的混合状态、防止细胞损伤等是重要的。向培养基中的氧供应和悬浮细胞和组织可以通过组合通气和机械搅拌或单独地通气来进行。前者由于搅拌对细胞和组织的损伤而可以导致受损的增殖，而后者的问题在于即使细胞和组织的剪切较小，但由于均匀的混合状态可能难以在高密度培养中维持，因此细胞和组织形成沉淀，会降低增殖效率等。
此外，对于在癌症治疗中的抗癌药的研究和开发或合适的抗癌药的选择，药物对癌细胞的抗癌活性通过体外在含有候选药物或抗癌药物的培养基中培养癌细胞来评价。然而，现存的抗癌活性的评价方法具有在体外评价结果与实际临床效果之间存在距离等的问题。为了改进问题，已经开发了尽可能在再现体内环境的细胞培养条件下评价活性的方法。例如，已经开发了这样的方法，其包括在支持物诸如软琼脂、胶原凝胶、水凝胶等中包埋癌细胞以允许在抑制粘附至培养容器的环境中培养癌细胞，并且评价抗癌药物(专利文献10，非专利文献12、13)。此外，已经开发了这样的方法，其包括通过用抑制细胞粘附的材料包被培养容器的表面或应用表面的特殊处理来抑制细胞粘附，以凝聚状态培养癌细胞(球培养)，并评价抗癌活性(专利文献11、12)。
然而，那些癌细胞培养方法具有的多种问题在于培养容器的生产方法和细胞培养的操作是复杂的，从支持物诸如胶原等中回收细胞随后评价抗癌活性的操作是复杂的，当支持物是动物来源的组分时，由于其是昂贵的，因此支持物的供应有时会受限，细胞聚集体(球)结合会具有过大的大小，由此降低细胞存活率和可再现性(reproducibility)等。此外，当筛选抗癌药物时，期望方便的、能够处理大量一致样品并具有高可再现性的癌细胞培养方法。
此外，药品候选药物和药品对肝细胞的多种活性已经通过体外在含有药品候选药物或药品的培养基中培养肝细胞来评价。然而，由于肝细胞体内固有地展示出的功能可能由于体外培养肝细胞而丧失，因此现存的肝细胞培养方法具有的问题在于药品候选药物和药品的精确评价是无法获得的，许多样品的评价是困难的等等。为了克服此类问题，已经开发了尽可能在再现体内环境的细胞培养条件下进行活性评价的方法。例如，已经开发了这样的方法，其包括在细胞外基质诸如胶原、层粘连蛋白、Matrigel(注册商标)等上培养肝细胞，维持肝细胞的功能(专利文献13，非专利文献14、15)。此外，已经开发了这样的方法，其包括通过处理形成肝细胞的聚集体(球)，例如，通过用抑制细胞粘附的材料包被培养容器的表面或应用容器表面的特殊处理、振动培养容器等来抑制细胞粘附，由此来维持肝细胞的功能(专利文献14、15，非专利文献16、17)。
然而，那些肝细胞培养方法具有的多种问题在于培养容器的生产方法和细胞培养的操作是复杂的，从支持物诸如胶原等中回收细胞和评价肝细胞功能的操作是复杂的，当支持物是动物来源的组分时，由于其是昂贵的，因此支持物的供应有时会受限，细胞聚集体(球)结合会具有过大的大小，由此降低细胞存活率和可再现性(reproducibility)等。此外，当筛选药品候选药物或药品时，期望方便的、能够处理大量一致样品并具有高可再现性的肝细胞培养方法。
文献列表
专利文献
[专利文献1]JP-A-2001-128660
[专利文献2]JP-A-S62-171680
[专利文献3]JP-A-S63-209581
[专利文献4]JP-A-2009-29967
[专利文献5]JP-A-2005-60570
[专利文献6]JP-A-8-23893
[专利文献7]JP-A-2004-236553
[专利文献8]WO2010/059775
[专利文献9]JP-A-2012-65555
[专利文献10]JP-A-2008-11797
[专利文献11]JP-A-2008-61609
[专利文献12]JP-A-2012-249547
[专利文献13]WO2005/028639
[专利文献14]WO2010/079602
[专利文献15]JP-A-2009-50194
非专利文献
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[非专利文献2]King等,Curr Opin Chem Biol.2007,11:394-398
[非专利文献3]Murua等,J.of Controlled Release 2008,132:76-83
[非专利文献4]Mendes,Chemical Society Reviews 2008,37:2512-2529
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[非专利文献6]Pek等,Nature Nanotechnol.2008,3:671-675
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[非专利文献17]Franziska等,World J Hepatol 2010,2:1-7。
发明概述
本发明待解决问题
本发明的一个目的是解决现有技术的上述问题，并且提供用于尤其是以三维或悬浮状态培养动物或植物的细胞和/组织的培养基组合物，以及通过使用所述培养基组合物培养动物或植物的细胞和/组织的方法。
此外，本发明的一个目的是解决现有技术的上述问题，并且提供用于在三维环境中培养癌细胞的细胞聚集体(球)的培养基组合物和通过使用所述培养基组合物的癌细胞的测试方法。
或者，本发明的一个目的是解决现有技术的上述问题，并且提供用于在三维环境中培养肝细胞的细胞聚集体(球)的培养基组合物和通过使用所述培养基组合物的癌细胞的测试方法。
此外，本发明的一个目的是提供在培养癌细胞中促进癌细胞的增殖的培养基添加剂和在培养肝细胞中抑制肝细胞数目的降低的培养基添加剂。
解决问题的方法
本发明人已经对多种化合物以及在含有其的液体培养基中悬浮细胞和/或组织的作用进行了大量研究，并成功发现能够以悬浮状态均匀地分散细胞和/或组织同时不会实质性增加液体培养基的粘度的结构。他们已经发现通过使用含有至少所述结构的培养基组合物，细胞和/或组织可以在保持悬浮状态时增殖，分化或维持。此外，他们还发现经培养的细胞和/或组织可以容易地从培养基组合物中回收，其导致本发明的完成。
本发明人还已经对多种化合物以及含有其的液体培养基对癌细胞聚集体(球)的作用进行了大量研究，并成功发现防止球结合并提供均匀分散液的培养基组合物。他们已经发现通过使用所述培养基组合物球可以以高存活率进行培养并且抗癌药物针对癌细胞的活性可以有效地评价并具有好的灵敏度。此外，他们还发现经培养的球可以容易地从培养基组合物中回收并评价，其导致本发明的完成。
而且，本发明人已经对多种化合物以及含有其的液体培养基对肝细胞聚集体(球)的作用进行了大量研究，并成功发现防止球结合并提供均匀分散液的培养基组合物。他们已经发现通过使用所述培养基组合物球可以以高存活率进行培养同时维持肝细胞的功能，并且药品候选药物或药品对肝细胞的作用可以有效地评价并具有好的灵敏度。此外，他们还发现经培养的球可以容易地从培养基组合物中回收并评价，其导致本发明的完成。
此外，本发明人已经发现癌细胞的增殖可以通过向含有癌细胞的培养基中添加脱酰基结冷胶或其盐而显著促进，其导致本发明的完成。
此外，本发明人已经发现肝细胞数目的降低可以通过向含有肝细胞的培养基中添加脱酰基结冷胶或其盐而得到抑制，其导致本发明的完成。
因此，本发明提供了以下：
(1)培养基组合物，其包含能够通过悬浮细胞或组织而对其进行培养的结构。
(2)(1)的培养基组合物，其允许在培养过程中培养基组合物的交换处理和完成培养后细胞或组织的回收。
(3)(1)的培养基组合物，其在从培养基组合物中回收细胞或组织过程中不需要任何温度改变、化学处理、酶处理和剪切力。
(4)(1)的培养基组合物，其具有不多于8mPa·s的粘度。
(5)(1)的培养基组合物，其中上述结构具有当其经过滤器时经过具有0.2μm-200μm孔径的滤器的大小。
(6)(1)的培养基组合物，其中上述结构含有聚合物化合物。
(7)(6)的培养基组合物，其中上述聚合物化合物包括具有阴离子官能团的聚合物化合物。
(8)(6)的培养基组合物，其中上述聚合物化合物为多糖。
(9)(7)的培养基组合物，其中上述阴离子官能团为选自羧基、磺基和磷酸基的至少一种。
(10)(8)的培养基组合物，其中上述多糖为选自透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、鼠李聚糖胶(rhamsan gum)、迪特胶(diutan gum)、黄原胶、角叉菜胶、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitin sulfate)、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、鼠李聚糖硫酸酯及其盐的至少一种。
(11)(10)的培养基组合物，其中上述多糖为选自透明质酸、脱酰基结冷胶、迪特胶、黄原胶、角叉菜胶及其盐的至少一种。
(12)(10)或(11)的培养基组合物，其中上述多糖为脱酰基结冷胶或其盐。
(13)(12)的培养基组合物，其中培养基组合物中的上述脱酰基结冷胶或其盐的终浓度为0.001-1.0％(重量/体积)。
(14)(13)的培养基组合物，其进一步包含除脱酰基结冷胶或其盐之外的多糖。
(15)(14)的培养基组合物，其中上述多糖为选自黄原胶、海藻酸、角叉菜胶、迪特胶及其盐的至少一种。
(16)(14)的培养基组合物，其中上述多糖为选自甲基纤维素、槐豆胶及其盐的至少一种。
(17)(1)至(16)中任一项的培养基组合物，其进一步包含金属离子。
(18)(17)的培养基组合物，其中上述金属离子为二价金属离子。
(19)(18)的培养基组合物，其中上述金属离子为选自钙离子、镁离子、锌离子、亚铁离子和铜离子的至少一种。
(20)(19)的培养基组合物，其中上述金属离子为钙离子。
(21)(20)的培养基组合物，其进一步包含除钙离子之外的金属离子。
(22)(21)的培养基组合物，其中上述金属离子为选自镁离子、钠离子和钾离子的至少一种。
(23)(1)至(22)中任一项的培养基组合物，其进一步包含细胞外基质和/或细胞粘附分子。
(24)(23)的培养基组合物，其中上述细胞外基质为选自胶原、透明质酸和蛋白聚糖的至少一种。
(25)(23)的培养基组合物，其中上述细胞粘附分子为选自钙粘蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白的至少一种。
(26)(1)至(25)中任一项的培养基组合物，其用于细胞培养。
(27)(26)的培养基组合物，其中上述细胞为粘附细胞或非粘附细胞。
(28)(27)的培养基组合物，其中上述粘附细胞附着至微载体。
(29)(27)的培养基组合物，其中上述粘附细胞包埋于载体中。
(30)(27)的培养基组合物，其中上述粘附细胞是球。
(31)(27)的培养基组合物，其中上述粘附细胞选自多能干细胞、癌细胞和肝细胞。
(32)细胞或组织培养物，其包含(1)至(31)中任一项的培养基组合物和细胞或组织。
(33)培养细胞或组织的方法，其包括在(1)至(31)中任一项的培养基组合物中培养细胞或组织。
(34)(33)的培养方法，其中上述细胞选自多能干细胞、癌细胞和肝细胞。
(35)回收细胞或组织的方法，其包括从(32)的培养物中分离细胞或组织。
(36)(35)的回收方法，其中上述分离通过过滤、离心或磁力分离来进行。
(37)产生球的方法，其包括在(1)至(31)中任一项的培养基组合物中培养粘附细胞。
(38)筛选抗癌药物的方法，其包括
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下在权利要求1-31中任一项的培养基组合物中培养癌细胞的步骤，和
(b)分析癌细胞增殖中的变化的步骤。
(39)(38)的方法，其进一步包括选择比在测试物质不存在的情况下抑制癌细胞增殖的物质作为候选物质的步骤。
(40)筛选作用于肝细胞的药品候选物质的方法，其包括
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下在权利要求1-31中任一项的培养基组合物中培养肝细胞的步骤，和
(b)分析肝细胞的生理功能中的变化的步骤。
(41)(40)的方法，其进一步包括选择比在测试物质不存在的情况下抑制或增加肝细胞的生理功能的物质作为候选物质的步骤。
(42)评价作用于肝细胞的药品候选物质的效力或毒性的方法，其包括
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下在权利要求1-31中任一项的培养基组合物中培养肝细胞的步骤，和
(b)分析肝细胞的生理功能中的变化的步骤。
(43)培养基添加剂，其用于制备能够通过悬浮细胞或组织对其进行培养的培养基组合物，包含溶解于或分散于溶剂中的聚合物化合物。
(44)(43)的培养基添加剂，其处于灭菌状态。
(45)(43)或(44)的培养基添加剂，其中上述聚合物化合物为具有阴离子官能团的聚合物化合物。
(46)(43)或(44)的培养基添加剂，其中上述聚合物化合物为脱酰基结冷胶或其盐。
(47)产生能够通过悬浮细胞或组织对其进行培养的培养基组合物的方法，其包括将聚合物化合物和培养基混合。
(48)(47)的方法，其包括将(43)至(46)任一项的培养基添加剂和培养基混合。
(49)(48)的方法，其中上述培养基溶解于或分散于溶剂。
(50)(47)的方法，其中上述聚合物化合物为具有阴离子官能团的聚合物化合物。
(51)(50)的方法，其中上述聚合物化合物为脱酰基结冷胶或其盐。
(52)(47)的方法，其中将上述聚合物化合物和培养基与水混合。
(53)(52)的方法，其包括在与水混合后在80-130℃下加热。
(54)(53)的方法，其包括在100-125℃下加热。
(55)(47)的方法，其包括过滤灭菌。
(56)(55)的方法，其中上述过滤灭菌包括经过0.1-0.5μm滤器。
(57)用于癌细胞培养基的添加剂，其包含脱酰基结冷胶或其盐、或迪特胶或其盐。
(58)(57)的添加剂，其在培养癌细胞中促进癌细胞的增殖。
(59)(57)的添加剂，其用于评价抗癌药物的抗癌活性。
(60)用于癌细胞的培养基组合物，其包含(57)至(59)中任一项的添加剂。
(61)培养癌细胞的方法，其包括在(57)至(59)中任一项的添加剂存在的情况下或在(60)的培养基组合物中培养癌细胞。
(62)评价抗癌药物对癌细胞的活性的方法，其包括在(57)至(59)中任一项的添加剂存在的情况下或在(60)的培养基组合物中培养癌细胞。
(63)(61)或(62)的方法，其中癌细胞在用于癌细胞的培养基组合物中形成细胞聚集体。
(64)(61)或(62)的方法，其中用于培养癌细胞的培养容器抑制癌细胞的附着。
(65)用于肝细胞培养基的添加剂，其包含脱酰基结冷胶或其盐、或迪特胶或其盐。
(66)(65)的添加剂，其在培养肝细胞中抑制肝细胞数目的降低。
(67)(65)的添加剂，其用于评价药品和药品候选药物对肝细胞的作用。
(68)用于肝细胞的培养基组合物，其包含(65)至(67)中任一项的添加剂。
(69)评价药品和药品候选药物对肝细胞的活性的方法，其包括在(65)至(67)中任一项的添加剂存在的情况下或在(68)的培养基组合物中培养肝细胞。
(70)(69)的方法，其中肝细胞在用于肝细胞的培养基组合物中形成细胞聚集体。
(71)(69)的方法，其中用于培养肝细胞的培养容器抑制肝细胞的附着。
发明效果
本发明提供了含有具体化合物的结构(下文也称为具体化合物)，尤其是具有阴离子官能团的聚合物化合物的培养基组合物。使用该培养基组合物，细胞和/或组织可以在无具有引起细胞和组织的损伤和功能丧失的风险的操作(诸如摇动、旋转等)下以悬浮状态进行培养。此外，使用该培养基组合物，培养基可以在培养过程中容易地交换，并且培养的细胞和/或组织还可以容易地回收。本发明应用该培养方法于从动物体或植物体收集的细胞和/或组织，并可以大量制备目的细胞和/或组织而不会削弱其功能。当进行化学物质、药品等的效力和毒性评价，有用物质诸如酶、细胞生长因子、抗体等的大规模生产，再生性医学补充由于疾病和缺乏而损失的器官、组织和细胞，等等时，可以使用进行通过该培养方法获得的细胞和/或组织。尤其是，通过使用脱酰基结冷胶制备的培养基组合物是优秀的，并具有以下特征。由于表现特性的浓度是极低的(一个数量级或更低)，因此对培养基组分的影响可以抑制至最小。由于当溶解于水中时团块不易形成，因此大规模生产轻易不会产生麻烦。此外，由于其中表达特性的浓度范围中的粘度低，因此可操作性诸如回收细胞和/或组织等是非常好的。
此外，使用本发明的培养基组合物，癌细胞聚集体(球)的结合可以得到抑制，并且球可以以分散状态进行培养，并因此，癌细胞的增殖得到促进。此外，当使用培养基组合物评价抗癌药物时，可以将抗癌药物容易地添加至培养基中，并可以容易地添加用于评价细胞增殖的检测试剂。此外，由于可以回收培养的癌细胞，因此回收的细胞的功能评价也可容易地进行。当用通过培养方法获得的癌细胞进行化学物质、抗癌药物等的效力评价和筛选时，可以优选利用本发明。
当在本发明的培养基组合物中培养时，由于来自二维培养中的非体内环境的影响小，并仅发生细胞间的粘附，因此促进癌变的HB-EGF(肝素结合表皮生长因子类生长因子)的敏感性在癌细胞中变高，并且对在其下游的EGF受体抑制剂的敏感性得到增强。此外，对MEK和Akt的抑制剂(其是癌细胞支架依赖性增殖的重要信号转导途径)的敏感性也可以得到增强。
或者，使用本发明的培养基组合物，可以抑制肝细胞聚集体(球)的结合，并且球可以以分散状态进行培养。因此，肝细胞的存活和细胞功能在体外得到维持。此外，当使用培养基组合物进行药品候选药物或药品的评价时，可以将药品候选药物或药品容易地添加至培养基中，并且用于评价细胞功能的检测试剂也可以容易地添加。由于可以回收经培养的肝细胞，因此可以容易地进行回收的细胞的功能评价。当用通过培养方法获得的肝细胞进行化学物质、抗癌药物等的效力和毒性评价和筛选时，可以优选利用本发明。
此外，当培养癌细胞时，本发明的含有脱酰基结冷胶或其盐的培养基添加剂可以明显促进癌细胞的增殖。
而且，当培养肝细胞时，本发明的含有脱酰基结冷胶或其盐的培养基添加剂可以抑制肝细胞数目的降低。
附图简述
图1为这样的图，其显示当HepG2细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，球均匀地分散并可以以悬浮状态培养。
图2为这样的图，其显示当HeLa细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，球均匀地分散并可以以悬浮状态培养。
图3为这样的图，其显示当HeLa细胞的球在本发明的培养基组合物中培养并用显微镜观察时，相比于现存的培养基，球的结合可以被抑制。
图4是这样的图，其显示当多能干细胞在本发明的培养基组合物中培养时，未发现对细胞的毒性。
图5为这样的图，其显示当多能干细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，球均匀地分散并处于悬浮状态。
图6为这样的图，其显示当多能干细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，多能干细胞有效地增殖。
图7是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中培养的多能干细胞保持未分化。
图8是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中悬浮静置培养后的多能干细胞维持正常核型。
图9是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中培养的多能干细胞保持未分化。
图10为这样的图，其显示当附着有HepG2细胞的微载体在本发明的培养基组合物中培养时，HepG2细胞能够在微载体上增殖。
图11为这样的图，其显示当将HeLa细胞的球添加至本发明的培养基组合物时，球均匀地分散并处于悬浮状态。
图12是这样的图，其显示HeLa细胞的球可以在本发明的培养基组合物中形成。
图13是这样的图，其显示为本发明的结构的一个实施方案的薄膜，其中培养基组合物中脱酰基结冷胶的浓度为0.02％(重量/体积)。
图14是这样的图，其显示HepG2细胞的球可以在本发明的培养基组合物中形成。
图15是这样的图，其显示当附着有HepG2细胞的层粘连蛋白包被的GEM在本发明的培养基组合物中培养时，其的悬浮状态。
图16是这样的图，其显示当包埋于海藻酸珠中的HepG2细胞在本发明的培养基组合物中培养时，其的悬浮状态。
图17是这样的图，其显示当包埋于胶原凝胶囊中的HepG2细胞在本发明的培养基组合物中培养时，其的悬浮状态。
图18是这样的图，其显示当稻来源的愈伤组织在本发明的培养基组合物中培养时，其的悬浮状态。
图19为这样的图，其显示当HeLa细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，球均匀地分散并可以以悬浮状态培养。
图20为这样的图，其显示当A549细胞和HCT116细胞的球在本发明的培养基组合物中培养时，球均匀地分散并可以以悬浮状态培养。
图21为这样的图，其显示当人原代肝细胞在本发明的培养基组合物中培养时，球形成并可以培养。
图22为这样的图，其显示当食蟹猴原代肝细胞在本发明的培养基组合物中培养时，球形成并可以培养。
图23是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中培养MCF-7细胞5天后的MCF-7细胞聚集体。
图24是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中培养A375细胞和MNNG/HOS细胞4天后的聚集体。
图25是这样的图，其显示在本发明的培养基组合物中培养MIAPaCa-2细胞6天后的聚集体。
实施方案描述
本发明在下文中更详细说明。
本说明书中所用的术语如下定义。
本发明中的细胞是构成动物和植物的最基础单位，其作为其要素具有细胞膜内细胞质和的多种细胞器。在这种情况下，包封DNA的细胞核可以被或可以不被胞内包含。例如，本发明的动物来源的细胞包括生殖细胞诸如精子、卵母细胞等，构成活体的体细胞，干细胞(多能干细胞等)，祖细胞，从活体分离的癌细胞，从活体分离的细胞，其获得永生能力并在体外稳定地维持(细胞系)，从活体分离并应用人工遗传修饰的细胞，从活体分离的细胞(其中细胞核被人工交换)等。构成活体的体细胞的实例包括但不限于，成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系统细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心细胞、食管细胞、肌细胞(例如平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血祖细胞(例如脐带血衍生的CD34阳性细胞)、单核细胞等。体细胞包括从任何组织，例如皮肤、肾、脾、肾上腺、肝、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、骨组织(bond tissue)、骨骼、关节、血管组织、血液(包括脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑、神经组织等，收集的细胞。干细胞是同时具有自我复制能力和分化为其他多种谱系的能力的细胞。其实例包括但不限于，胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌症干细胞、毛囊干细胞等。在上述干细胞中，多能干细胞的实例包括ES细胞、胚胎生殖干细胞和iPS细胞。祖细胞是处于从上述干细胞分化为具体体细胞或生殖细胞的细胞。癌细胞是从体细胞衍生并已获得无限增殖能力的细胞。细胞系是通过体外人工操作已获得无限增殖能力的细胞。
癌组织的实例包括但不限于，来自以下的组织：胃癌、食道癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、扁平上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、骨髓癌、肾细胞癌、泌尿道癌、肝癌、胆管癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、颅咽管瘤、喉癌、舌癌、纤维肉瘤、粘膜肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨髓瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、恶性淋巴瘤以及衍生自癌症患者的血液等。癌细胞系的实例包括但不限于HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADR RES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D作为人乳腺癌细胞系，HeLa细胞作为人宫颈癌细胞系，A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114作为人肺癌细胞系，Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr作为人大肠癌细胞系，DU-145、PC-3、LNCaP作为人前列腺癌细胞系，U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19作为人中枢神经系统癌细胞系，OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3、IGROV-1作为人卵巢癌细胞系，RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10作为人肾癌细胞系，MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74作为人胃癌细胞系，LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14作为皮肤癌细胞系，CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat作为白血病细胞系，A431作为人上皮样癌细胞系，A375人黑色素瘤细胞系，MNNG/HOS作为人骨肉瘤细胞系，MIAPaCa-2作为人胰腺癌细胞系，等等。细胞系的实例包括但不限于HEK293(人胚肾细胞)、MDCK、MDBK、BHK、C-33A、AE-1、3D9、Ns0/1、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等。
本发明中的肝细胞的实例包括收集自肝组织的原代肝细胞，在对体外培养优化的条件下通过传代培养建立的肝细胞株，和从来源于肝以外的组织的细胞、多能干细胞诸如iPS细胞、ES细胞等、间充质干细胞、来源于外周血的干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、肝干细胞、肝祖细胞等体外分化并诱导的肝细胞。肝组织是从人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猪、牛、马、犬、猫、猴等收集的肝脏，其可以是正常肝脏或癌化的肝脏。尽管原代肝细胞可以通过使用胶原酶的灌注法从此类肝脏中分离并回收，但其可以购自试剂公司诸如Primarycell、Japan Becton Dickinson and Company、Takara Bio Inc.、HokkaidoSystem Science Co.,Ltd.、Lonza Japan、Veritas Ltd.、Life Technologies JapanCorporation等。购买的肝细胞可以处于冷冻状态或附着于载体诸如胶原等。肝细胞系的实例包括但不限于，HepG2、Hep3B、HepaRG(注册商标)、JHH7、HLF、HLE、PLC/PRF/5、WRL68、HB611、SK-HEP-1、HuH-4、HuH-7等。
尽管本发明中的肝细胞的功能并无具体限制，但它包括细胞色素P450(也称为CYP)诸如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5等的活性的表达和通过这些酶代谢药品等，通过葡糖醛酸、谷胱甘肽、硫酸、甘氨酸等的药品的缀合，有用蛋白诸如白蛋白、载脂蛋白、血小板生成素等的产生，胆红素的分泌，尿素的合成，胆汁酸和脂肪酸的合成，药品等通过转运蛋白的转运，等等。在本发明的实施方案中，肝细胞优选从上述功能中维持细胞色素P450的活性、白蛋白的产生和/或药品等通过转运蛋白的转运(例如，羧基二氯二乙酸荧光素(Carboxydichlorofluoresceindiacetate)、溴化四乙胺、牛磺胆酸盐、Rosvastatin的摄取和羧基二氯荧光素的排泄)。
本发明中的药品包括应用于医学用途的任何物质。药品候选药物是作为药品的候选已成为搜寻或开发和研究对象的物质，并包括合成化合物、蛋白、核酸、糖类、天然存在的物质等。
本发明中的抗癌药物包括直接作用于癌细胞并抑制癌细胞的增殖和功能的药物，以及不直接作用于癌细胞但抑制癌细胞的增殖或功能、或通过与体内免疫细胞或其他药物的协同作用来杀死癌细胞的药物。抗癌药物的实例包括但不限于，烷化剂，铂衍生物，5-FU的抗癌药物代表的代谢拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，微管抑制剂，表柔比星代表的抗癌抗生素，吉非替尼、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、厄洛替尼、帕尼单抗、拉帕替尼、西罗莫司、依维莫司、易普利姆玛、凡德他尼、crizotinib、ruxolitinib、曲美替尼代表的分子靶向药物等等。分子靶向药物的靶分子的实例包括但不限于，多种激酶，HER2、EGFR(表皮生长因子受体)、PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)、mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)、Akt、CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)、VEGFR(血管内皮细胞增殖因子受体)、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)、FGFR(成纤维细胞生长因子受体)、c-Met、Raf、p38MAPK、CTLA-4、ALK、JAK、MEK(MAPK/ERK激酶)、Hsp90、组蛋白脱乙酰酶等等。此外，待作用具有此类作用的药物的候选的合成化合物、蛋白、核酸、糖类、天然产物也包括于本发明中的抗癌药物中。
本发明中的植物来源的细胞也包括从植物体的各组织分离的细胞，以及通过从细胞人工去除细胞壁获得的原生质体。
本发明中的组织是其为具有一些种类的不同特性和功能的细胞以某一方式的装配(assembly)的结构单位，并且动物组织的实例包括上皮组织、骨组织(bond tissue)、肌肉组织、神经组织等。植物组织的实例包括分生组织、表皮组织、同化组织、叶肉组织、传导组织、机械组织、薄壁组织、去分化细胞群(愈伤组织)等。
当细胞和/或组织通过本发明的方法进行培养时，待培养的细胞和/或组织可以从上文描述的细胞和/或组织中随意选择并培养。细胞和/或组织可以直接从动物或植物体回收。细胞和/或组织可以通过施加特殊处理并随后收集而从动物或植物体进行诱导、生长或转化。在这种情况下，处理可以是体内或体外的。动物的实例包括昆虫、鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类、泛甲壳类、六足类、哺乳动物等。哺乳动物的实例包括但不限于，大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、犬、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨猴、松鼠猴、猕猴、黑猩猩和人。植物并无具体限制，只要收集的细胞和/或组织可以应用于液体培养。其实例包括但不限于，产生生药(例如，皂苷、生物碱、小檗碱、东莨菪苷、植物甾醇等)的植物(例如，人参、长春花、莨菪、黄连、颠茄等)，产生用作化妆品或食品的起始材料的染料或多糖(例如，花色素苷、红花染料、茜草染料、藏红花染料、黄酮等)的植物(例如，蓝莓、红花、茜草、藏红花等)，或产生制药药物的植物，待用于饲喂或作为食物的植物(稻、玉米、小麦或大麦等)等等。
本发明中细胞和/或组织的悬浮指其中细胞和/或组织不粘附于培养容器(非粘附性的)的状态。此外，在本发明中，当细胞和/或组织增殖，分化或维持时，其中在不存在来自外部或摇动、旋转操作等的对液体培养基组合物的压力或将其振动的情况下，细胞和/或组织均匀地分散并悬浮于液体培养基组合物中的状态被称为“悬浮静置(suspensionstanding)”，并且细胞和/或组织在这样的条件下的培养被称为“悬浮静置培养(suspension standing culture)”。在“悬浮静置”中，悬浮时期包括至少5-60min，1小时-24小时，1天-21天，尽管该时期并无对其的限制，只要维持悬浮状态。
本发明的培养基组合物是含有能够悬浮培养细胞或组织(优选能够悬浮静置培养)的结构和培养基的组合物。
本发明的培养基组合物优选是允许在培养过程中交换处理培养基组合物并在完成培养后从该培养基组合物中回收细胞或组织的组合物。更优选地，其为在从培养基组合物中回收细胞或组织过程中不需要任何温度改变、化学处理、酶处理和剪切力的组合物。
本发明中的结构从具体化合物形成并显示均匀悬浮细胞和/或组织的作用。更具体而言，它包括聚合物化合物经离子的组装，通过聚合物化合物形成的三维网络等。已知多糖经金属离子形成微凝胶(例如,JP-A-2004-129596)，并且本发明的结构也包括此类微凝胶作为一个实施方案。
经离子装配聚合物化合物的一个实施方案是薄膜结构。此类薄膜显示于图13中作为实例。
本发明中的结构的大小优选为当其经过滤器时经过具有0.2μm-200μm孔径的滤器的大小。孔径的下限为更优选大于1μm，并且考虑到细胞或组织的稳定悬浮，其更优选超过5μm。孔径的上限为更优选小于100μm，并且考虑到细胞或组织的大小，其更优选小于70μm。
本发明中的具体化合物指在与液体培养基混合时形成不确定(indeterminate)结构的化合物，所述不确定结构均匀地分散于液体中，实质上保留细胞和/或组织而不会实质上增加液体的粘度，并且显示出防止其沉淀的作用。“而不会实质上增加液体的粘度”意指液体的粘度不超过8mPa·s。在这种情况下，液体的粘度(即，本发明的培养基组合物的粘度)不多于8mPa·s，优选不多于4mPa·s，更优选不多于2mPa·s。此外，具体化合物的化学结构、分子量、特性等没有限制，只要它在液体培养基中形成该结构，并且显示出均匀地悬浮(优选悬浮静置)细胞和/或组织而不会实质上增加液体的粘度的作用。
含有该结构的液体的粘度例如可以通过下文描述的实施例中描述的方法进行测量。具体而言，它可以在37℃条件下并使用E型粘度计(由Toki Sangyo Co.,Ltd.制造,TV-22型粘度计,型号:TVE-22L,corn转子(roter):标准转子(roter)1°34’×R24,旋转数100rpm)进行测量。
本发明中待使用的具体化合物的实例包括但不限于，聚合物化合物，优选具有阴离子官能团的聚合物化合物。
作为阴离子官能团，可以提及羧基、磺基、磷酸基及其盐，优选羧基或其盐。
作为本发明中待使用的聚合物化合物，可以使用具有选自上述阴离子官能团的一种或多种的聚合物化合物。
本发明中待使用的聚合物化合物的优选具体实例包括但不限于多糖，其中不少于10个单糖(例如丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合，更优选地，具有阴离子官能团的酸性多糖。本文的酸性多糖并无具体限制，只要其在其结构中具有阴离子官能团，并且包括例如具有糖醛酸(例如葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖，在其结构的一部分中具有硫酸基或磷酸基的多糖，和具有两种结构的多糖，并且不仅包括天然获得的多糖，而且包括由微生物产生的多糖、由遗传工程产生的多糖、和使用酶人工合成的多糖。更具体而言，其实例包括由选自以下的一种或多种构成的聚合物化合物：透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶(以下有时称为DAG)、鼠李聚糖胶、迪特胶、黄原胶、角叉菜胶、黄原胶、抗坏血酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitin sulfate)、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、鼠李聚糖硫酸酯及其盐。多糖优选为透明质酸、DAG、迪特胶、黄原胶、角叉菜胶或其盐，最优选为DAG，这是由于其以低浓度使用可以悬浮细胞或组织并且考虑到细胞或组织的容易回收。
本文的盐包括例如碱金属盐诸如锂、钠、钾，与碱土金属诸如钙、钡、镁的盐和与铝、锌、铜、铁、铵、有机碱和氨基酸的盐等盐。
这些聚合物化合物(多糖等)的重均分子量为优选10,000-50,000,000，更优选100,000-20,000,000，仍更优选1,000,000-10,000,000。例如，分子量可以基于普鲁兰(pullulan)通过凝胶渗透层析(GPC)进行测量。
如下文提及的实施例中描述，磷酸化的DAG也可以使用。磷酸化可以通过已知方法进行。
在本发明中，多种(优选两种)上述多糖可以组合使用。多糖的组合的种类并无具体限制，只要在液体组合物中形成上述结构，并且细胞和/或组织可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)而不会实质上增加液体的粘度。优选地，组合包括至少DAG或其盐。即，多糖的优选组合含有DAG或其盐，和除DAG之外的多糖及其盐(例如，黄原胶、海藻酸、角叉菜胶、迪特胶、甲基纤维素、槐豆胶或其盐)。多糖的具体组合的实例包括但不限于，DAG和鼠李聚糖胶(rhamsan gum)、DAG和迪特胶、DAG和黄原胶、DAG和角叉菜胶、DAG和黄原胶、DAG和槐豆胶、DAG和κ-角叉菜胶、DAG和海藻酸钠、DAG和甲基纤维素等。
更优选的本发明中待使用的具体化合物的具体实例包括透明质酸、脱酰基结冷胶、迪特胶、角叉菜胶和黄原胶及其盐。最优选的实例包括脱酰基结冷胶及其盐，这是由于培养基组合物的粘度可以变低并且细胞或组织可以容易回收。
本发明中的脱酰基结冷胶为含有4个分子的糖(1-3成键的葡萄糖、1-4成键的葡糖醛酸、1-4成键的葡萄糖和1-4成键的鼠李糖)作为构成单元的直链聚合物多糖，其是下式(I)的多糖，其中R1、R2各自为氢原子，并且n为2或更大的整数。R1可以含有甘油基，R2可以含有乙酰基，并且乙酰基和甘油基的含量优选不多于10％，更优选不多于1％。
本发明中的结构根据具体化合物采用多种形式。在脱酰基结冷胶的情况下，当与液体培养基混合时，其摄取培养基中的金属离子(例如，钙离子)，经金属离子形成不确定结构(indeterminate structure)，并悬浮细胞和/或组织。从脱酰基结冷胶制备的本发明的培养基组合物的粘度不多于8mPa·s，优选不多于4mPa·s，并更优选不多于2mPa·s，以易于回收细胞或组织。
本发明中的具体化合物可以通过化学合成方法获得。当该化合物为天然存在的物质时，其优选通过常规技术经提取、分离和纯化获自含有该化合物的各种植物、各种动物、各种微生物。对于提取，可以使用水和超临界气体有效提取该化合物。例如，作为结冷胶的生产方法，在发酵培养基中培养生产微生物，通过常规纯化方法回收真菌外产生的粘性物质(mucosal substance)，并且在干燥、磨粉等步骤后，将其粉末化。当其为脱酰基结冷胶时，当回收粘性物质时施加碱处理，将与1-3成键葡萄糖残基成键的甘油基和乙酰基脱酰基并回收。纯化方法的实例包括液液提取、级分沉淀、结晶、各种离子交换层析、使用SephadexLH-20等的凝胶过滤层析、使用活性炭、硅胶等的的吸附层析，通过薄层层析的活性物质的吸附和脱附处理、使用反向柱等的高效液相层析，并且杂质可以去除并且化合物可以通过单独或以任何次序组合、或重复使用它们来纯化。产生结冷胶的微生物的实例包括但不限于，Sphingomonas elodea和通过改变Sphingomonas elodea的基因获得的微生物。
当其为脱酰基结冷胶时，可商购产品诸如由SANSHO Co.,Ltd.制造的“KELCOGEL(CP Kelco的注册商标)CG-LA”和由San-Ei Gen F.F.I.,Inc.制造的“KELCOGEL(CP Kelco的注册商标)”等可以使用。作为天然类型的结冷胶，由San-Ei Gen F.F.I.,Inc.制造的“KELCOGEL(CP Kelco的注册商标)”等可以使用。
培养基中具体化合物的浓度依赖于具体化合物的类型，并且可以在这样的范围内合适地确定，其中该具体化合物可以在液体培养基中形成上述结构，并可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)细胞和/或组织而不会实质上增加液体的粘度。其通常为0.0005％-1.0％(重量/体积)、优选0.001％-0.4％(重量/体积)、更优选0.005％-0.1％(重量/体积)、仍更优选0.005％-0.05％(重量/体积)。例如，在脱酰基结冷胶的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、优选0.003％-0.5％(重量/体积)、更优选0.005％-0.1％(重量/体积)、更优选0.01％-0.05％(重量/体积)、最优选0.01％-0.03％(重量/体积)添加至培养基。在黄原胶的情况下，将其以0.001％-5.0％(重量/体积)、优选0.01％-1.0％(重量/体积)、更优选0.05％-0.5％(重量/体积)、最优选0.1％-0.2％(重量/体积)添加至培养基。在κ-角叉菜胶和槐豆胶混合物的情况下，将其以0.001％-5.0％(重量/体积)、优选0.005％-1.0％(重量/体积)、更优选0.01％-0.1％(重量/体积)、最优选0.03％-0.05％(重量/体积)添加至培养基。在天然类型的结冷胶的情况下，将其以以0.05％-1.0％(重量/体积)、优选0.05％-0.1％(重量/体积)添加至培养基。
当多种(优选两种)上述多糖用于组合中时，多糖的浓度可以在液体培养基中形成上述结构，并且可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)细胞和/或组织而不会实质上增加液体的粘度。例如，当使用DAG或其盐与除DAG之外的多糖及其盐的组合时，DAG或其盐的浓度为例如0.005-0.02％(重量/体积)、优选0.01-0.02％(重量/体积)，并且除DAG之外的多糖及其盐的浓度为例如0.005-0.4％(重量/体积)、优选0.1-0.4％(重量/体积)。浓度范围的组合的具体实例包括以下：
DAG或其盐：0.005-0.02％(优选0.01-0.02％)(重量/体积)
除DAG之外的多糖
黄原胶：0.1-0.4％(重量/体积)
海藻酸钠：0.1-0.4％(重量/体积)
槐豆胶：0.1-0.4％(重量/体积)
甲基纤维素：0.1-0.4％(重量/体积)(优选0.2-0.4％(重量/体积))
角叉菜胶：0.05-0.1％(重量/体积)
迪特胶：0.05-0.1％(重量/体积)。
浓度可以通过下式进行计算。
浓度(％)＝具体化合物的重量(g)/培养基组合物的体积(ml)×100。
上述化合物还可以通过化学合成方法进一步转化为不同的衍生物，并且由此获得衍生物可以还有效地用于本发明中。具体而言，在脱酰基结冷胶的情况下，由式(I)表示的化合物的衍生物，其中R1和/或R2的羟基被C1-3烷氧基、C1-3烷基磺酰基、单糖残基诸如葡萄糖、果糖等、寡糖残基诸如蔗糖、乳糖等、或氨基酸残基诸如甘氨酸、精氨酸等所取代，也可以用于本发明中。此外，化合物还可以使用交联剂诸如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)等交联。
本发明中待使用的具体化合物或其盐可以以任何晶体形式存在，这取决于生产条件，并且可以作为任何水合物存在。此类晶体形式、水合物及其混合物也包括在本发明的范围内。此外，它们可以作为含有机溶剂诸如丙酮、乙醇、四氢呋喃等的溶剂合物存在。此类形式均包括在本发明的范围内。
本发明中待使用的具体化合物可以以通过在环内或环外异构化形成的互变体、几何异构体或互变体、或几何异构体的混合物、或其混合物的形式存在。当本发明的化合物具有不对称中心时，无论化合物是否通过异构化形成，它可以以分解的旋光异构体(resolvedoptical isomer)或以任何比例含有其的混合物的形式存在。
本发明的培养基组合物可以含有金属离子，例如，二价金属离子(钙离子、镁离子、锌离子、亚铁离子、铜离子等)，并优选含有钙离子。两种或多种金属离子可以组合使用，例如，钙离子和镁离子，钙离子和锌离子，钙离子和亚铁离子，和钙离子和铜离子。本领域普通技术人员可以合适地确定组合。在一个实施方案中，由于培养基组合物含有金属离子，聚合物化合物经金属离子聚集并形成三维网络(例如，多糖经金属离子形成微凝胶)，由此本发明的结构得以形成。金属离子的浓度可以在这样的范围内合适地确定，其中该具体化合物可以在液体培养基中形成上述结构，并可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)细胞和/或组织而不会实质上增加液体培养基的粘度。盐浓度为但不限于，0.1mM-300mM，优选0.5mM-100mM。金属离子可以与培养基混合，或单独制备盐溶液，并加入到培养基中。本发明的培养基组合物可以含有下述的胞外基质、粘附分子等。
本发明还包括通过使用培养基组合物增殖细胞或组织的培养方法，通过例如过滤、离心或磁力分离回收获得的细胞或组织的方法，和通过使用培养基组合物的球的产生方法。
当细胞和/或组织体外培养时，由本发明中待使用的具体化合物构成的结构显示悬浮含有具体化合物的结构的液体中的细胞和/或组织的作用(优选悬浮静置的作用)。通过悬浮作用，当与单层培养相比时，每给定体积的更加增加的量的细胞和/或组织可以被培养。当常规漂浮培养方法伴随旋转或摇动操作时，细胞和/或组织的增殖速率和回收速率可以变低，或细胞的功能可能由于作用于细胞和/或组织上的剪切力而受损。使用本发明的培养基组合物，其含有具体化合物的结构，可以均匀地分散细胞和/或组织而无需操作诸如摇动等，并且可以容易地以大量获得目的细胞和/或组织，而不会损失细胞功能。此外，当细胞和/或组织悬浮培养于含凝胶基材的常规培养基中时，细胞和/或组织的观察和回收有时是困难的，并且其功能在回收过程中有时受损。然而，使用含有本发明的具体化合物的结构的培养基组合物，细胞和/或组织可以进行悬浮培养，观察，而不会损伤其功能，并且可以回收。此外，含有凝胶基材的常规培养基有时显示出使其难于更换培养基的高粘度。然而，由于含有本发明的具体化合物的结构的培养基组合物具有低粘度，其可以用移液器、泵等容易地更换。
通过本发明的方法培养的人来源的细胞和/或组织可以移植用于对患有疾病或病症的患者的治疗目标。在这种情况下，治疗靶疾病、病症的种类、预处理方法及细胞移植方法由本领域普通技术人员合适地选择。受体中经移植的细胞的移入、从疾病或病症中的恢复、与移植相关的副作用的存在或不存在、和治疗作用通过用于移植疗法的一般方法合适地检查并判断。
此外，由于细胞和/或组织通过本发明的方法有效地增殖，因此本发明的含有具体化合物及其结构的培养基组合物可以用作细胞研究的试剂。例如，当阐释控制细胞和组织的分化和增殖的因子时，将细胞与该目标因子共培养，并分析细胞的数目和种类、和细胞表面分化标志物和所表达的基因的变化。在这种情况下，使用本发明的培养基组合物，可以有效地扩大分析靶细胞的数目，以及有效地回收。当阐释目标因子时，本领域普通技术人员从本发明中所描述的范围中可以适合地选择培养条件、培养设备、培养基的种类、本发明的化合物的种类、具体化合物的含量、添加剂的种类、添加剂的含量、培养时期、培养温度等。通过培养增殖或出现的细胞可以使用所属领域中的标准显微镜进行观察。在这种情况下，可以用特异性抗体染色所培养的细胞。由于目标因子而已改变的表达的基因可以通过从培养细胞中提取DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)并通过DNA印迹、RNA印迹、RT-PCR等检测来发现。此外，细胞表面分化标志物通过ELISA和流式细胞术使用特异性抗体来检测，并且目标因子对分化和增殖的作用可以进行观察。
当细胞和/或组织通过本发明的培养方法进行培养时，通常用于细胞培养的培养工具诸如培养皿、烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、皿、培养皿(schale)、组织培养皿、多皿(multidish)、微量培养板、微孔板、多板(multiplate)、多孔板、细胞培养载玻片、细胞培养瓶、转瓶(spinner flask)、管、盘、培养袋、滚瓶等可用于培养。尽管这些培养工具的材料并无具体限制，但例如，玻璃，塑料诸如聚氯乙烯，纤维素聚合物诸如乙基纤维素、乙酰纤维素等，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚丁二烯、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物、聚(丁二烯-苯乙烯)共聚物、聚(丁二烯-丙烯腈)共聚物、聚(乙烯-丙烯酸乙酯)共聚物、聚(乙烯-甲基丙烯酸酯)共聚物、聚氯丁二烯、苯乙烯树脂、氯磺化聚乙烯、乙烯醋酸乙烯酯、丙烯酸嵌段共聚物等可以提及。这些塑料不仅在对氧气、二氧化碳等的透气性上是优秀的，而且还在工业模塑加工性上是优秀的，可以经受多种灭菌处理，并优选为透明材料，以允许对培养工具内部的观察。在此，用于灭菌处理的方法无具体限制，并且例如，辐射灭菌、氧化乙烯气体灭菌、高压灭菌等可以提及。此外，这些塑料可以应用多种表面处理(例如，等离子体处理、电晕处理等)。此外，这些培养工具可以预先用胞外基质、细胞粘附分子等进行包被。包被材料的实例包括I型至XIX型胶原、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘素、桥粒糖蛋白(desmocolin)、桥粒核心糖蛋白、各种整联蛋白、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白、透明质酸、超家族、Matrigel、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、藻酸凝胶、水凝胶、其切割片段等。还可以使用具有通过基因重组技术人工改变的氨基酸序列的这些包被材料。用于抑制细胞和/或组织与培养工具粘附的包被材料也可以使用。包被材料的实例包括但不限于，硅、聚(2-羟基甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-甲氧基甲基丙烯酸酯)、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)、聚-N-异丙基丙烯酰胺、mebiol凝胶(注册商标)等。
细胞和/或组织还可以通过自动进行细胞接种、培养基更换、细胞图像获得、和培养的细胞的回收，在机械控制下并在密闭的环境中同时控制pH、温度、氧浓度等并使用能够高密度培养的生物反应器和自动培养箱来进行培养。作为用于在培养过程中使用此类装置供应新培养基和向细胞和/或组织加放所需物质的方法，分批补料培养、连续培养和灌注培养是可用的，并且所用这些方法均可用于本发明的培养方法。用于生物反应器和自动培养箱的培养容器包括具有易于打开-关闭(easy opening-closing)和与外部世界的大接触面积的开放式培养容器(例如，具有盖的培养容器)，和具有难于末端关闭(ending-closing)和与外部世界小的接触面积的封闭式培养容器(例如，筒型培养容器(cartridge typeculture container))。两种培养容器均可用于本发明的培养方法。
当使用本发明的具体化合物培养细胞和/或组织时，可以通过将用于培养细胞和/或组织的培养基与具体化合物混合来制备培养基组合物。根据由培养基的此类组合物的分类，可以提及天然培养基、半合成培养基和合成培养基。根据通过形状的分类，可以提及半固体培养基、液体培养基、粉末培养基(下文有时称为粉末培养基)等。当细胞和/或组织来源于动物时，可以使用用于培养动物细胞的任何培养基。培养基的实例包括Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)、hamF12培养基(Ham’s营养混合物F12)、DMEM/F12培养基、McCoy’s5A培养基、Eagle MEM培养基(Eagle’s极限必需培养基；EMEM)、αMEM培养基(α改良Eagle’s极限必需培养基；αMEM)、MEM培养基(极限必需培养基)、RPMI1640培养基、Iscove’s改良Dulbecco’s培养基(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(由Invitrogen制造)、X-VIVO 10(由Cambrex Corporation制造)、X-VIVO 15(由Cambrex Corporation制造)、HPGM(由Cambrex Corporation制造)、StemSpan H3000(由STEMCELL Technologies制造)、StemSpanSFEM(由STEMCELL Technologies制造)、StemlineII(由Sigma Aldrich制造)、QBSF-60(由Qualitybiological制造)、StemPro hESCSFM(由Invitrogen制造)、Essential8(注册商标)培养基(由Gibco制造)、mTeSR1或2培养基(由STEMCELL Technologies制造)、ReproFF或ReproFF2(由ReproCELL制造)、PSGro hESC/iPSC培养基(由System Biosciences制造)、NutriStem(注册商标)培养基(由BiologicalIndustries制造)、CSTI-7培养基(由Cell Science&Technology Institute、Inc.制造)、MesenPRO RS培养基(由Gibco制造)、MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(由TOYOBO CO.、LTD.制造)、Sf-900II(由Invitrogen制造)、Opti-Pro(由Invitrogen制造)等。
待用于培养癌细胞的培养基可以是添加有细胞粘附因子的上述培养基，并且其实例包括Matrigel、胶原凝胶、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白。可以组合添加两种或多种这些细胞粘附因子。此外，待用于培养癌细胞球的培养基可以进一步与增稠剂诸如瓜尔胶、罗望子胶、海藻酸丙二醇、槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素等混合。
待用于培养肝细胞的培养基的实例除了上述培养基外，包括HepatoZYME-SFM(由Life Technologies制造)、HCM(注册商标)-肝细胞培养基Bullet Kit(注册商标、由Lonza制造)、HBM(注册商标)-肝细胞基础培养基(由Lonza制造)、HMM(注册商标)-肝细胞维持培养基(由Lonza制造)、改良的Lanford’s培养基(由NISSUI PHARMACEUTICAL CO.、LTD.制造)、ISOM’s培养基、肝细胞增殖培养基(由Takara Bio Inc.制造)、肝细胞维持培养基(由Takara Bio Inc.制造)、肝细胞基础培养基(由Takara Bio Inc.制造)、活性维持超级培养基(由In Vitro ADMET Laboratories制造)等。这些培养基可以含有细胞粘附因子，并且其实例包括Matrigel、胶原凝胶、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白。还可以组合添加两种或多种这些细胞粘附因子。此外，待用于培养癌细胞球或肝细胞球的培养基可以进一步与增稠剂诸如瓜尔胶、罗望子胶、海藻酸丙二醇、槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素等混合。
当细胞和/或组织来源于植物时，作为培养基可以提及通过将生长素和(当需要时)植物生长控制物质(植物激素)诸如细胞因子等以合适浓度添加至通常用于培养植物组织的基础培养基诸如Murashige Skoog(MS)培养基、Linsmaier Skoog(LS)培养基、White培养基、Gamborg’s B5培养基、niche培养基、hela培养基、Morel培养基等获得的培养基，或者其中这些培养基组分改良至最优浓度(例如以半浓度的氨氮等)的改良培养基。当需要时，这些培养基可以进一步补充有酪蛋白降解酶、玉米浆、维生素等。生长素的实例包括但不限于，3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚基丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等。例如，生长素可以以约0.1-约10ppm的浓度添加至培养基。细胞因子的实例包括但不限于，激动素、苄基腺嘌呤(BA)、玉米素等。例如，细胞因子可以以约0.1-约10ppm的浓度添加至培养基。
本领域普通技术人员可以根据目标自由添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、多种氨基酸、多种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等至上述培养基。对于培养动物来源的细胞和/或组织，本领域普通技术人员可以还根据目标组合添加一种或多种其他化学组分和生物源物质(biogenic substance)。
待添加至用于动物来源的细胞和/或组织的组分的实例包括胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种增殖因子、各种胞外基质、各种细胞粘附分子等。待添加至培养基的细胞因子的实例包括但不限于，白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激剂(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激剂(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病细胞的抑制因子(LIF)、制瘤素M(OM)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等。
待添加至培养基的激素的实例包括但不限于，褪黑激素、血清素、甲状腺素、三碘甲状腺氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、抗苗勒激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素、心钠素、降钙素、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放激素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、促胃液素、生长素释放肽、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、促黄体激素、黑素细胞刺激素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、胃泌素释放肽、促生长素抑制素、血小板生成素、甲状腺刺激激素、促甲状腺激素释放激素、皮质醇、雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白三烯、前列腺素、血栓素、催乳激素释放激素、促脂素、脑利钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、凝乳酶和脑啡肽。
待添加至培养基的生长因子的实例包括但不限于，转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、上皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子-1、2、3、4、5、6、7、8或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞生长因子(NGF)肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶连接素I、蛋白酶连接素II、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胆碱血管活性分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Delta1等)、Wnt蛋白、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP)、多效蛋白等。
此外，还可以添加具有通过基因重组技术人工改变的氨基酸序列的这些细胞因子和生长因子。其实例包括IL-6/可溶性IL-6受体复合体、Hyper IL-6(IL-6和可溶性IL-6受体的融合蛋白)等。
各种细胞外基质和各种细胞粘附分子的实例包括I型至XIX型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘素、桥粒糖蛋白(desmocolin)、桥粒核心糖蛋白、各种整联蛋白、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、Matrigel、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、透明质酸、藻酸凝胶、各种水凝胶、其切割片段等。
待添加至培养基中的抗生素的实例包括磺胺类药物及制剂、青霉素、苯氧乙基青霉素、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、环己西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、andinocillin、头孢菌素和其衍生物、奥索利酸、氨氟沙星、替马沙星、萘啶酸、吡咯米酸、环丙沙星、西诺沙星、诺氟沙星、甲氟哌酸、Rosaxacin、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、克拉维酸、β-溴青霉烷酸(bromopenisillanic acid)、β-氯青霉烷酸(chloropenisillanicacid)、6-乙酰基亚甲基-青霉烷酸(penisillanic acid)、头孢噁唑、sultampicillin、adinoshirin和舒巴坦甲醛水合物酯(sulbactam formaldehyde hudrate ester)、他佐巴坦、氨曲南、sulfazethin、isosulfazethin、norcardicin、间羧基苯基、苯基乙酰氨基膦酸甲基(phenylacetamidophosphonic acid methyl)、金霉素、土霉素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素和米诺环素。
当将本发明中的具体化合物添加至上述培养基时，当使用时，该具体化合物溶解于或分散于合适的溶剂中(这用作培养基添加剂)。随后，培养基添加剂可以添加至培养基中，使得培养基中的具体化合物的浓度如上文详述为这样的浓度，在该浓度下细胞和/或组织可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)而不会实质上增加液体的粘度，例如0.0005％-1.0％(重量/体积)、优选0.001％-0.4％(重量/体积)、更优选0.005％-0.1％(重量/体积)、进一步优选0.005％-0.05％(重量/体积)。例如，在脱酰基结冷胶的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、优选0.003％-0.5％(重量/体积)、更优选0.005％-0.1％(重量/体积)、最优选0.01％-0.03％(重量/体积)添加至培养基。在另一方面，在脱酰基结冷胶的情况下，将其以0.0005％-1.0％(重量/体积)、优选0.001％-0.5％(重量/体积)、更优选0.003％-0.1％(重量/体积)、最优选0.005％-0.03％(重量/体积)添加至培养基。在黄原胶的情况下，将其以0.001％-5.0％(重量/体积)、优选0.01％-1.0％(重量/体积)、更优选0.05％-0.5％(重量/体积)、最优选0.1％-0.2％(重量/体积)添加至培养基。在κ-角叉菜胶和槐豆胶混合物混合物的情况下，将其以0.001％-5.0％(重量/体积)、优选0.005％-1.0％(重量/体积)、更优选0.01％-0.1％、最优选0.03％-0.05％(重量/体积)添加至培养基。在脱酰基结冷胶和迪特胶混合物的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.005％-0.01％(重量/体积)添加至培养基。在脱酰基结冷胶和甲基纤维素混合物的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.005％-0.2％(重量/体积)添加至培养基。在脱酰基结冷胶和槐豆胶混合物的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.01％-0.1％(重量/体积)添加至培养基。在脱酰基结冷胶和海藻酸钠混合物的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.01％-0.1％(重量/体积)添加至培养基。在脱酰基结冷胶和黄原胶混合物的情况下，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.01％-0.1％(重量/体积)添加至培养基。脱酰基结冷胶和κ-角叉菜胶混合物，将其以0.001％-1.0％(重量/体积)、最优选0.01％-0.1％(重量/体积)添加至培养基。浓度可以通过下式进行计算。
浓度(％)＝具体化合物的重量(g)/培养基组合物的体积(ml)×100。
在此，用于培养基添加剂的合适溶剂的实例包括但不限于，含水溶剂，诸如水、二甲基亚砜(DMSO)、各种醇(例如，甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等)等等。在这种情况下，具体化合物的浓度为0.001％-5.0％(重量/体积)、优选0.01％-1.0％(重量/体积)、更优选0.1％-0.6％(重量/体积)。还可以的是进一步添加添加剂以增强具体化合物的作用，或当使用时降低浓度。作为此类添加剂的实例，可以混合一种或多种瓜尔胶、罗望子胶(tamarind gum)、海藻酸丙二醇酯、槐豆胶、阿拉伯树胶、塔拉胶、罗望子胶(tamarindgum)、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子胶(tamarind seed gum)、多糖诸如普鲁兰(pullulan)等。还可以的是在载体表面上固定具体化合物或者在培养过程中在载体内携带具体化合物。具体化合物在供应或保存过程中可以具有任何形状。具体化合物可以以配制固体的形式，诸如片剂、丸剂、胶囊、颗粒，或液体诸如通过使用增溶剂溶解于合适的溶剂中获得的溶液、或悬浮液，或者可以与基材或单一物质成键。用于配制的添加剂的实例包括防腐剂，诸如对羟基苯甲酸酯等；赋形剂诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等；润滑剂诸如硬脂酸镁、滑石等；粘合剂诸如聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等；表面活性剂诸如脂肪酸酯等；增塑剂诸如甘油等；等等。这些添加剂不限于上文提及的那些，并且可以自由选择，只要它们对于本领域普通技术人员是可利用的。本发明的具体化合物需要时可以灭菌。灭菌方法无具体限制，并且例如，辐射灭菌、氧化乙烯气体灭菌、高压灭菌、过滤灭菌等可以提及。当过滤灭菌(filter sterilization)(下文有时也称为过滤灭菌(filtrationsterilization))将进行时，滤器部分的材料无具体限制，并且，例如可以提及玻璃纤维、尼龙、PES(聚醚砜)、亲水性PVDF(聚偏氟乙烯)、纤维素混合酯、乙酸纤维素、聚四氟乙烯等。尽管滤器中的孔径并无具体限制，但其优选为0.1μm-10μm、更优选0.1μm-1μm、最优选0.1μm-0.5μm。当具体化合物为固体状态或溶液状态时，灭菌处理可以施加。
本发明的培养基组合物可以通过向液体培养基中添加如上制备的具体化合物的溶液或分散液而在液体培养基中形成上述结构来获得。由于培养基通常含有足够浓度的金属离子以经离子装配聚合物化合物或形成聚合物化合物的三维网络，因此本发明的培养基组合物可以通过简单地将本发明的具体化合物的溶液或分散液添加至液体培养基中来获得。或者，可以将培养基添加至培养基添加剂(具体化合物的溶液或分散液)中。此外，本发明的培养基组合物还可以通过将具体化合物和培养基组分在含水溶剂(例如，水，包括离子交换水、超纯水等)中混合来制备。混合的实施方案的实例包括但不限于，(1)混合液体培养基和培养基添加剂(溶液)，(2)混合液体培养基和上述聚合物化合物(固体诸如粉末等)，(3)混合培养基添加剂(溶液)和粉末培养基，(4)混合粉末培养基和上述聚合物化合物(固体诸如粉末等)与含水溶剂，等等。为了防止本发明的培养基组合物中具体化合物不均匀地分布，实施方案(1)或(4)、或(1)或(3)是优选的。
当将具体化合物溶解于溶剂(例如，含水溶剂诸如水、液体培养基)或将具体化合物和粉末培养基溶解于溶剂中时，优选加热混合物以促进溶解。加热温度例如为80℃-130℃、优选100℃-125℃(例如,121℃)，在该温度下进行加热灭菌。
加热后，将具体化合物的所获溶液冷却至室温。由具体化合物构成的上述结构可以通过将上述金属离子加入到溶液中(例如，通过将溶液加入到培养基中)来形成。或者，由具体化合物构成的上述结构还可以通过当溶解于含有上述金属离子的溶剂(例如，含水溶剂诸如水和液体培养基)中时加热(例如,80℃-130℃,优选100℃-125℃(例如,121℃))具体化合物，并随后冷却所获溶液至室温来形成。
本发明的培养基组合物的制备方法的实例显示于下文，其不应解释为限制性的。将具体化合物添加至离子交换水或超纯水中。随后，将混合物在具体化合物可以溶解的温度(例如，不低于60℃,不低于80℃,不低于90℃)下加热搅拌，以允许溶解至透明状态。
溶解后，允许混合物搅拌冷却，并灭菌(例如，在121℃下高压灭菌20min)。冷却至室温后，将上述灭菌的水溶液边搅拌(例如，均匀混合器等)边添加至待用于静置培养的给定培养基中，以均匀混合溶液与培养基。水溶液与培养基的混合方法无具体限制，并且可以手动混合诸如吸打等，或者用仪器诸如磁力搅拌器、机械搅拌器、均匀混合器和匀浆器进行混合。此外，本发明的培养基组合物可以在混合后经滤器进行过滤。待用于过滤处理的滤器的孔径为5μm-100μm、优选5μm-70μm、更优选10μm-70μm。
或者，将粉末培养和上述聚合物化合物(固体诸如粉末等)与含水溶剂混合，并将混合物在上述温度下加热以制备本发明的培养组合物。
例如，当制备脱酰基结冷胶时，将脱酰基结冷胶加入到离子交换水或超纯水中至0.1％-1％(重量/体积)、优选0.2％-0.5％(重量/体积)、更优选0.3％-0.4％(重量/体积)。此外，在另一方面，当制备脱酰基结冷胶时，将脱酰基结冷胶加入到离子交换水或超纯水中至0.1％-1％(重量/体积)、优选0.2％-0.8％(重量/体积)、更优选0.3％-0.6％(重量/体积)。
随后，将上述脱酰基结冷胶通过在任何温度下(只要溶解是可以的)加热搅拌来溶解至透明状态，所述温度可以为不低于60℃，优选不低于80℃，更优选不低于90℃(例如,80-130℃)。溶解后，允许混合物搅拌冷却，并在例如121℃下20分钟经高压灭菌器进行灭菌。冷却至室温后，将水溶液例如添加至DMEM/F-12培养基，同时通过均匀混合器等搅拌，至期望的终浓度(例如，当终浓度为0.015％时，0.3％水溶液：培养基的比例为1：19)，并将混合物均匀地混合。
水溶液与培养基的混合方法无具体限制，并且可以手动混合诸如吸打等，或者用仪器诸如磁力搅拌器、机械搅拌器、均匀混合器和匀浆器进行混合。此外，本发明的培养基组合物可以在混合后经滤器进行过滤。待用于过滤处理的滤器的孔径为5μm-100μm、优选5μm-70μm、更优选10μm-70μm。
此外，制备本发明的培养基组合物后，可以通过离心处理将结构沉淀。
本领域普通技术人员可以自由选择待通过本发明的方法培养的细胞和/或组织的形式和状态。其优选的具体实例包括但不限于，其中细胞和/或组织单独分散于培养基组合物中的状态，其中细胞和/或组织附着至载体的表面的状态，其中细胞和/或组织包埋于载体内的状态，其中多个细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态，或其中两种或多种细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态，等等。更优选的是其中细胞和/或组织附着至载体的表面的状态，其中细胞和/或组织包埋于载体内的状态，其中多个细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态，和其中两种或多种细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态。进一步优选的是其中细胞和/或组织附着至载体的表面的状态，其中多个细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态，和其中两种或多种细胞集合并形成细胞聚集(球)的状态。在这些状态中，形成细胞聚集(球)的状态可以作为待通过本发明的培养方法培养的最优选状态提及，这是由于接近在体内环境中的那些的细胞-细胞相互作用和细胞结构被重构，可以进行长期培养同时维持细胞功能，而且细胞回收相对容易。
作为在表面上支持细胞和/或组织的载体，可以提及由各种聚合物构成的微载体和玻璃珠、陶瓷珠、聚苯乙烯珠、葡聚糖珠等。作为聚合物的实例，可以使用乙烯基树脂、聚氨酯树脂、环氧树脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、硅树脂、酚树脂、三聚氰胺树脂、尿素树脂、苯胺树脂、离聚物树脂、聚碳酸酯、胶原、葡聚糖、明胶、纤维素、海藻酸盐、其混合物，等等。载体可以用增强细胞粘附或物质从细胞释放的化合物来包被。作为此类包被材料的实例，可以提及聚(单硬脂酰甘油酯琥珀酸)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、n-异丙基丙烯酰胺、I型至XIX型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘素、桥粒糖蛋白(desmocolin)、桥粒核心糖蛋白、各种整联蛋白、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、Matrigel、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、海藻酸凝胶、各种水凝胶，进一步，其切割片段等。在此，两种或多种包被材料可以进行组合。此外，一种或多种多糖诸如瓜尔胶、罗望子胶、槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子胶、普鲁兰(pullulan)等也可以与待用于培养在表面上支持细胞和/或组织的载体的培养基进行混合。载体还可以含有磁性材料，例如，铁氧体。载体的直径为几十微米至几百微米，更优选100μm-200μm，并且其比重优选接近1，更优选0.9-1.2，尤其优选约1.0。载体的实例包括但不限于，Cytodex 1(注册商标)、Cytodex 3(注册商标)、Cytoline 1(注册商标)、Cytoline 2(注册商标)、Cytopore 1(注册商标)、Cytopore 2(注册商标)、(以上，GEHealthcare Life Sciences)、Biosilon(注册商标)(NUNC)、Cultispher-G(注册商标)、Cultispher-S(注册商标)(以上，Thermo SCIENTIFIC)、HILLEXCT(注册商标)、ProNectinF-COATED(注册商标)、和HILLEXII(注册商标)(SoloHill Engineering)、GEM(注册商标)(Global Eukaryotic Microcarrier)等。载体需要时可以进行灭菌。灭菌方法无具体限制，并且例如，辐射灭菌、氧化乙烯气体灭菌、高压灭菌、干热灭菌等可以提及。使用载体培养动物细胞的方法无具体限制，并且使用一般的流动层型培养瓶(flow layer-type culturevessel)或填充层型培养瓶(filling layer-type culture vessel)的培养方法等可以使用。在此，在表面上支持细胞和/或组织的载体和使用包含本发明的具体化合物的结构的培养基组合物允许均匀分散，甚至在无摇动等操作下。结果是，目的细胞和/或组织可以进行培养而不会损失细胞功能。
通过该方法培养的细胞和/或组织可以通过进行离心和过滤处理来收集，同时细胞和/或组织在培养后被载体所支持。在这种情况下，离心和过滤处理可以在添加使用的液体培养基后进行。例如，无限制性地，离心的重力加速度(G)为50G至1000G，更优选100G至500G，并且用于过滤处理的滤器的孔径为10μm-100μm。此外，培养的载体可以通过包封具有磁性的材料诸如铁氧体在载体中而通过磁力进行回收。通过该方法培养基的细胞和/或组织可以通过使用各种螯合剂、热处理或酶通过释放载体来收集。
当细胞和/或组织包埋于载体内时，由各种聚合物构成的材料可以选作载体。作为此类聚合物的实例，可以提及胶原、明胶、海藻酸盐、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白粘合剂、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、蛋白聚糖、糖胺聚糖、海棉例如聚氨酯泡沫、DSEA-3D(注册商标)、聚N-取代的丙烯酰胺衍生物、聚N-取代的甲基丙烯酰胺衍生物、及其共聚物、聚乙烯基甲基醚、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷、温度敏感的聚合物例如部分醋化的(acetified)聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、甲基纤维素、硝酸纤维素、丁酸纤维素、聚环氧乙烷和水凝胶如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)/聚己内酯等。此外，可以通过使用两种或多种这些聚合物制备用于包埋细胞的载体。此外，载体可以在这些聚合物之外具有生理学上有活性的物质。作为生理学上有活性的物质的实例，细胞生长因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、外源凝集素、胞外基质等可以提及，并且这些中的多数也可以被包含。细胞粘附因子的实例包括聚(单硬脂酰甘油酯琥珀酸)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯、透明质酸钠、n-异丙基丙烯酰胺、I型至XIX型胶原、明胶、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白-1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘素、桥粒糖蛋白(desmocolin)、桥粒核心糖蛋白、各种整联蛋白、E-选择素、P-选择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、Matrigel、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、海藻酸凝胶、各种水凝胶，进一步，其切割片段，等等。在这种情况下，两种或多种细胞粘附因子可以组合。此外，一种或多种增稠剂诸如瓜尔胶、罗望子胶、海藻酸丙二醇、槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子胶、普鲁兰(pullulan)等也可以与用于培养包埋细胞和/或组织的载体的培养基进行混合。
用于在这些载体中包埋细胞和/或组织的方法并无具体限制，并且例如，可以使用包括用注射器抽吸细胞和前述聚合物的混合物并从约25G-19G注射针将其逐滴加入培养基中，或使用微量加液器逐滴加入至培养基中的方法，等等。
在此形成的珠样载体的大小由用于逐滴添加细胞和前述聚合物的混合物的工具的尖端的形状所决定，其优选为几十微米至几百微米，更优选100μm-2000μm。可以在珠样载体上培养的细胞的数目无具体限制，并且可以根据珠大小自由选择。例如，可以将五百万个细胞包埋在直径约2000μm的珠样载体中。细胞可以单独分散在载体内或者多个细胞可以集合以形成细胞聚集体。在此，将细胞和/或组织包埋于其中的载体和使用包含本发明的具体化合物的结构的培养基组合物允许均匀分散，甚至在无摇动等操作下。结果是，目的细胞和/或组织可以进行培养而不会损失细胞功能。通过该方法培养的细胞和/或组织可以通过进行离心和过滤处理来收集，同时细胞和/或组织在培养后包埋于载体中。在这种情况下，离心和过滤处理可以在添加使用的液体培养基后进行。例如，无限制性地，离心的重力加速度(G)为50G至1000G，更优选100G至500G，并且用于过滤处理的滤器的孔径为10μm-100μm。通过该方法培养基的细胞和/或组织可以通过使用各种螯合剂、热、酶等处理将载体分解从而将它们分散来收集。
用于形成细胞聚集体(球)的方法无具体限制，并可以由本领域普通技术人员适合地选择。其实例包括使用具有细胞非粘附性表面的容器的方法、悬滴法、旋转培养法、三维支架方法、离心法、使用通过电场或磁场凝聚(coagulation)的方法，等。例如，使用用具有细胞非粘附性表面的容器的方法，将目的细胞在施加有表面处理以抑制细胞粘附的培养容器诸如培养皿(schale)中进行培养，由此可以形成球。使用此类细胞非粘附性培养容器，首先收集目的细胞，制备其细胞悬浮液并铺于培养容器中以进行培养。当培养持续约1周时，细胞自发地形成球。作为本文使用的细胞非粘附性表面，可以使用通常使用的培养容器诸如培养皿等的表面，其包被有抑制细胞粘附的物质等。此类物质的实例包括琼脂糖、琼脂、聚HEMA(聚(2-羟基(hydroxl)-甲基丙烯酸乙酯)-2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱和其他单体(例如，甲基丙烯酸丁酯等)的共聚物、聚(2-甲氧基丙烯酸甲酯)、聚-N-异丙基丙烯酰胺，mebiol凝胶(注册商标)等。当细胞毒性不存在时，物质不限于此。
作为用于形成细胞聚集体(球)的方法，还可以使用描述于NATUREBIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579,Stem Cell Research,7,2011,97-111,Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259中的方法。
此外，用于形成球的用于培养的培养基还可以包含促进球形成或促进其维持的组分。具有此类作用的组分的实例包括二甲亚砜、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸磷酸酯、生育酚、类黄酮、尿酸、胆红素、含有硒的化合物、转铁蛋白、不饱和脂肪酸、白蛋白、茶碱、毛喉素、胰高血糖素、二丁酰cAMP等。作为含有硒的化合物，可以提及ROCK抑制剂诸如亚硒酸钠、硒酸钠、二甲基硒、硒化氢、硒代甲硫氨酸、硒―甲基硒代半胱氨酸、丙氨酸丁氨酸硒醚、硒代半胱氨酸、硒高半胱氨酸、腺苷-5'-三磷酸、硒―腺苷硒代甲硫氨酸、Y27632、法舒地尔(HA1077)、H-1152、Wf-536等。为了获得具有均一大小的目的细胞聚集体，也可以将具有与目的细胞聚集体相同直径的多个凹面(concaves)引入到待使用的细胞非粘附性培养容器上。当这些凹面彼此接触或在目的细胞聚集体的直径范围内时，铺上细胞，铺上的细胞不会在凹面之间形成细胞聚集体，而是一定会在凹面中形成具有对应于其体积的大小的细胞聚集体，因此提供具有均一大小的细胞聚集体群。作为在这种情况下的凹面的形状，优选为半球或锥形。
或者，基于显示细胞粘性的支持物，也可以形成球。此类支持物的实例包括胶原、聚轮烷、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)共聚物、水凝胶等。
此外，球还可以通过用饲养细胞共培养来形成。作为促进球形成的饲养细胞，可以使用任何黏着细胞。优选地，用于各种细胞的饲养细胞是期望的。尽管并无限制，但例如，当形成来源于肝或软骨的细胞的球时，饲养细胞的实例包括COS-1细胞和血管内皮细胞作为优选的细胞类型。
此外，球还可以使用含有本发明的具体化合物的结构的培养组合物来形成。在这种情况下，可以将具体化合物添加至用于球形成的培养基中，使得具体化合物的浓度如上文详述为这样的浓度，在该浓度下细胞和/或组织可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)而不会实质上增加液体的粘度，例如0.0005％-1.0％(重量/体积)、优选0.001％-0.3％(重量/体积)、更优选0.005％-0.1％(重量/体积)、进一步优选0.01％-0.05％(重量/体积)。在另一方面，可以将具体化合物添加至用于球形成的培养基中，使得具体化合物的浓度如上文详述为这样的浓度，在该浓度下细胞和/或组织可以均匀地悬浮(优选悬浮静置)而不会实质上增加液体的粘度，例如0.0005％-1.0％(重量/体积)、优选0.001％-0.3％(重量/体积)、更优选0.003％-0.1％(重量/体积)、进一步优选0.005％-0.05％(重量/体积)。
球通过均匀地将目的细胞分散于含有具体化合物的结构的培养基中并允许它们通过静置放置3天至10天进行培养来制备。制备的球可以通过离心和过滤处理来回收。例如，无限制性地，离心的重力加速度(G)为50G至1000G，更优选100G至500G，并且用于过滤处理的滤器的孔径为10μm-100μm。此外，使用在表面上用特异性结合目的细胞的抗体包被的磁性微粒，经培养的球可以通过磁力回收。此类磁性微粒的实例包括Dynabeads(由VeritasLtd.制造)、MACS microbead(由Miltenyi Biotec制造)、BioMag(由Techno ChemicalsCorporation制造)等。
球的大小取决于细胞类型和培养时期而不同，并且无具体限制。当其具有球形或椭球形时，其直径为20μm-1000μm、优选40μm-500μm、更优选50μm-300μm、最优选80μm-200μm。
通过持续静置培养，此类球可以维持增殖能力不少于10天，优选不少于13天，更优选不少于30天。在静置培养过程中，通过有规律地进一步进行机械分离(mechanicaldivision)、或形成单细胞处理和凝集，增殖能力可以实质上无限维持。
待用于培养球的培养容器无具体限制，只要其通常允许动物细胞培养。例如，烧瓶、皿、培养皿(schale)、组织培养皿、多皿、微量培养板、微孔板、多板、多孔板、细胞培养载玻片、细胞培养瓶、转瓶(spinner flask)、培养皿、管、盘、培养袋、滚瓶、EZ SPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)、Sumilon细胞密闭板(cell tight plate)(由SUMITOMOBAKELITE制造)等可以提及。
当进行许多抗癌药、药品候选化合物或药品的评价时，在这些培养容器中，优选使用微量培养板、微孔板、多板和多孔板。尽管这些板的孔底形状并无具体限制，但可以使用平底、U形底和V形底，且优选使用U形底。尽管这些培养工具的材料并无具体限制，但例如，可以提及玻璃、塑料诸如聚氯乙烯，纤维素聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯等等。
待用于球的静置培养的培养基可以含有细胞粘附因子，其实例包括Matrigel、胶原凝胶、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白。两种或多种这些细胞粘附因子也可以组合添加。此外，待用于培养球的培养基可以与增稠剂诸如瓜尔胶、罗望子胶、海藻酸丙二醇、槐豆胶、阿拉伯胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子胶、普鲁兰等混合。
使用包含本发明的具体化合物的结构的培养基组合物，可以提供培养基中的均匀分散液，甚至在无摇动等操作下。结果是，目的细胞和/或组织可以作为球进行培养而不会损失细胞功能。
通过该方法静置培养的球可以通过在培养后进行离心和过滤处理来收集。在这种情况下，离心和过滤处理可以在添加使用的液体培养基后进行。例如，无限制性地，离心的重力加速度(G)为50G至1000G，更优选100G至500G，并且用于过滤处理的滤器的孔径为10μm-100μm。此外，使用在表面上用特异性结合目的细胞的抗体包被的磁性微粒，经培养的球可以通过磁力回收。此类磁性微粒的实例包括Dynabeads(由Veritas Ltd.制造)、MACSmicrobead(由Miltenyi Biotec制造)、BioMag(由Techno Chemicals Corporation制造)等。回收的球可以通过用各种螯合剂、热、滤器、酶等处理来进一步分解而分散为单细胞。细胞回收和培养基组合物的交换还可以通过进行离心、过滤处理或回收处理(其通过磁性通过使用能够在机械控制下和在密闭环境下传导(conducting)的生物反应器和自动培养箱)来实现。
作为用于静置培养植物来源的细胞和/或组织的方法，愈伤组织(其为未分化的植物细胞聚集体)可以进行培养。愈伤组织可以通过对于待使用的每种植物物种已知的方法来诱导。例如，需要时，用70％乙醇、1％次氯酸钠溶液等将分化的植物体的组织(例如，根、茎、叶部分、种子、生长点、胚、花粉等)的一部分的表面灭菌，将具有具有合适大小的组织部分(例如，约1-约5mm2的根部分)用刀等切出(需要时)，将组织部分通过无菌操作用超净台等置于预先灭菌的愈伤组织诱导培养基上，并在合适条件下无菌培养。在此诱导的愈伤组织可以进行液体培养用于大量增殖，或也可以通过在传代培养基上传代而维持为种子株(seed strain)。传代培养可以使用任何液体培养基和固体培养基进行。
当使用本发明的培养基组合物开始静置培养时接种的植物细胞聚集体的量根据目的细胞的增殖速率、培养方式(分批培养、补料分批培养、连续培养等)、培养周期等而不同。例如，当植物细胞聚集体诸如愈伤组织等将进行培养时，将它接种到本发明的培养基组合物，使得细胞聚集体相对于本发明的培养基组合物的湿重为4–8(重量/体积(w/v))％，优选5–7(w/v)％。培养过程中植物细胞聚集体的具体大小为1mm-40mm，优选3mm-20mm，更优选5mm-15mm。如本文所用的“具体大小”指当例如植物细胞聚集体具有球形时的直径，当其具有椭球形时的长直径，和当其具有其他形状时可能的最大长度。
当培养细胞和/或组织时的温度对于动物细胞通常为25-39℃，优选33-39℃。CO2浓度在培养大气中通常为4-10体积％，并且优选4-6体积％。培养时期通常为3-35天，其可以根据培养目标而自由设定。植物细胞的培养温度通常为20-30℃，并且当光是必需的时，它们可以在照度2000-8000lux的照度条件下培养。
尽管培养时期通常为3-70天，但其可以根据培养目标而自由设定。
当细胞和/或组织通过本发明的方法培养时，将单独制备的细胞和/或组织添加至本发明的培养基组合物中，并混合以生成均匀的分散液。在这种情况下，混合方法并无具体限制，并且例如，使用吸打等的手动混合，使用仪器诸如搅拌器、涡旋混合器、微粒培养板混合器、摇动器等的混合可以提及。混合后，可以将培养基保持静置，或者如需要培养基可以旋转、摇动或搅拌。旋转数和频率可以根据本领域普通技术人员的目标适合地设定。当培养基组合物在静置培养周期过程中需要进行交换时，通过离心或过滤处理将细胞和/或组织与培养基组合物分开，并且新的培养基组合物可以添加到细胞和/或组织中。或者，细胞和/或组织通过离心或过滤处理适合地浓缩，并且新的培养基组合物可以添加至浓缩的液体中。
例如，无限制性地，离心的重力加速度(G)为50G至1000G，更优选100G至500G，并且用于过滤处理的滤器的孔径为10μm-100μm。此外，使用在表面上用特异性结合目的细胞的抗体包被的磁性微粒，经培养的细胞和/或组织可以通过磁力分离。此类磁性微粒的实例包括Dynabeads(由Veritas Ltd.制造)、MACS microbead(由Miltenyi Biotec制造)、BioMag(由Techno Chemicals Corporation制造)、磁力微球(由Polysciences Inc.制造)等。培养基组合物的交换还可以通过使用能够在机械控制下和在密闭环境中传导(conducting)的生物反应器和自动培养箱来进行。
由于癌细胞可以通过本发明的方法有效地增殖，因此含有本发明的具体化合物的培养基组合物可以用于评价用于癌细胞的抗癌药物。例如，当阐释抑制癌细胞增殖的抗癌药物时，将癌细胞与抗癌药物共培养，并分析细胞的数目和种类、和细胞表面分化标志物和所表达的基因的变化。在这种情况下，使用本发明的培养基组合物，可以有效地扩大待分析的靶细胞的数目，以及有效地回收。在本发明中，尤其是，含有脱酰基结冷胶或其盐的用于癌细胞的培养基添加剂和含有该添加剂的用于癌细胞的培养基组合物可以用于评价癌细胞增殖或抗癌活性等。在这种情况下，脱酰基结冷胶或其盐的浓度如上提及。
尽管甚至通过使用迪特胶，癌细胞也增殖，但脱酰基结冷胶是更优选的，这是由于对癌细胞的增殖作用是尤其优秀的，并且它可以以低浓度(上文提及的优选浓度)使用，其继而防止培养基中气泡发生并利于癌细胞的回收。
用于抗癌药物的更优选的筛选方法包括，例如，包括(a)在本发明的培养基组合物中在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下培养癌细胞的步骤，和(b)分析癌细胞增殖中的变化的步骤的方法。该方法可以进一步包括选择与在测试物质不存在的情况下的相比抑制癌细胞的增殖的物质的步骤和/或回收癌细胞的步骤。改变表示癌细胞的增殖中的增加或降低。对于分析，可以进行上述方法，但方法不限于此。
当评价抗癌药物的活性时，本领域普通技术人员从本说明书中所描述的范围中可以适合地确定培养条件、培养工具、培养设备、培养基的种类、具体化合物的种类、具体化合物的含量、添加剂的种类、添加剂的含量、培养时期、培养温度、抗癌药物的种类、抗癌药物的含量等。通过培养增殖或出现的细胞可以使用所属领域中的标准显微镜进行观察。当测量细胞数目时，可以使用集落形成法、结晶紫法、胸苷摄入法、锥虫蓝染色法、ATP(腺苷三磷酸)测量法、3-(4,5-二甲基硫醛-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)染色法、WST-1(注册商标)染色法、WST-8(注册商标)染色法、流式细胞术、使用细胞数自动测量仪的方法等等。其中，WST-8(注册商标)染色法可以是最优选使用的。当评价细胞毒性时，可以使用乳酸脱氢酶(LDH)活性测量法、CytoTox-ONE(注册商标)法等。或者，用特异性抗体染色经培养的细胞，通过ELISA或流式细胞术检测细胞表面分化标志物，并可以观察抗癌药物对增殖和凋亡的作用。此外，由于癌症抵抗而显示不同表达的基因可以通过从培养细胞中提取DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)并通过DNA印迹、RNA印迹、RT-PCR等检测来发现。
由于本发明的方法维持肝细胞的存活和功能，因此含有本发明的具体化合物的培养基组合物可以用于评价药品或药物候选物质对肝细胞的多种作用。例如，当阐释药物候选物质的毒性作用时，将肝细胞与评价目标测试物质共培养，并分析细胞的数目和种类、和细胞表面分化标志物和所表达的基因的变化。在这种情况下，使用本发明的培养基组合物，可以维持分析目标肝细胞的存活和功能，以及肝细胞可以有效地回收。
作为筛选作用于肝细胞的药品候选物质的方法，可以提及这样的方法，其包括：(a)在本发明的培养基组合物中在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下培养肝细胞的步骤，和(b)分析肝细胞的生理功能中的改变的步骤。
作为评价作用于肝细胞的药品候选物质的效力或毒性的方法，可以提及这样的方法，其包括：(a)在本发明的培养基组合物中在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下培养肝细胞的步骤，和(b)分析肝细胞的生理功能中的改变的步骤。这些方法可以进一步包括选择比在测试物质不存在的情况下抑制或增加肝细胞的生理功能的物质的步骤，和/或回收肝细胞的步骤。改变指肝细胞的生理功能(例如，肝细胞增殖、细胞色素P450的酶活性等)中的增加或降低。肝细胞的生理功能中的增加可以进行评价以显示低效力或毒性，并且肝细胞的生理功能中的降低可以进行评价以显示高效力或毒性，等等。
当评价药物候选物质的活性时，本领域普通技术人员从本说明书中所描述的范围中可以适合地选择培养条件、培养工具、培养设备、培养基的种类、具体化合物的种类、具体化合物的含量、添加剂的种类、添加剂的含量、培养时期、培养温度、药品或药物候选物质的种类和含量等。通过培养维持或出现的细胞可以使用所属领域中的标准显微镜进行观察。当测量细胞数目时，可以使用集落形成法、结晶紫法、胸苷摄入法、锥虫蓝染色法、ATP(腺苷三磷酸)测量法、3-(4,5-二甲基硫醛-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)染色法、WST-1(注册商标)染色法、WST-8(注册商标)染色法、流式细胞术、使用细胞数自动测量仪的方法等等。其中，WST-8(注册商标)染色法可以是最优选使用的。当评价细胞毒性时，可以使用乳酸脱氢酶(LDH)活性测量法、CytoTox-ONE(注册商标)法等。或者，用特异性抗体染色经培养的细胞，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)或流式细胞术检测细胞表面分化标志物，并可以观察药品或药物候选物质对增殖和凋亡的作用。此外，由于药品或药物候选物质而显示不同表达的基因可以通过从培养细胞中提取DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)并通过DNA印迹、RNA印迹、RT-PCR等检测来发现。此外，由于药品或药物候选物质而显示不同表达的蛋白可以通过ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术等来检测。此外，细胞色素P450的酶活性可以通过测量该酶转变底物结构的活性来检测，其通过放射性同位素法、高效液相色谱法、发光法、显色法等。
实施例
本发明在下文中通过具体地描述本发明的培养基组合物的分析实施例和实验实施例作为实施例更详细地解释；然而，本发明不限于此。
(分析实施例1：含有脱酰基结冷胶的培养基的粘度测量和细胞悬浮测试)
含有脱酰基结冷胶的培养基的制备和粘度测量
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于纯水中至0.4％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。允许该水溶液边搅拌边冷却至室温，并在高压灭菌器中在121℃下灭菌20min。将2倍浓度的DMEM/F-12培养基(由Aldrich制造，50mL)和灭菌水(47.5mL)置于300mL高烧杯中，同时通过均匀混合器(homomixer)在室温下(3000rpm)搅拌，加入含水的脱酰基结冷胶溶液(2.5mL)，并将混合物持续搅拌1min以制备具有0.01％的终浓度的脱酰基结冷胶培养基组合物。类似地制备添加了具有0.02、0.03和0.05％(w/v)终浓度的含水脱酰基结冷胶溶液的培养基组合物。使用E型粘度计(由Toki Sangyo Co.,Ltd.制造,粘度计TVE-22L,标准转头1°34’×R24)在37℃条件下以100rpm持续5min测量培养基组合物的粘度。
含脱酰基结冷胶的培养基的细胞悬浮测试
人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以250000个细胞/mL悬浮于含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的EMEM培养基中，并将该悬浮液(10mL)铺板在EZ SPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)上，并在CO2培养箱(5％CO2)中培养3天。将所获的球(直径100-200μm)的悬浮液(10mL)离心(200G,5min)以允许球沉淀，并将上清液去除以生成球悬浮液(1.0mL)。紧接着，将如上制备的含有脱酰基结冷胶的培养基以1.0mL置于1.5mL Eppendorf管中，并进一步添加HeLa细胞球悬浮液(10μL)。通过轻敲将细胞聚集体分散，在37℃下孵育，并目视观察1小时后的细胞分散状态。
(比较实施例)含有甲基纤维素和胶原的培养基的制备
含有甲基纤维素的培养基的制备
将DMEM/F-12培养基(由Aldrich制造,100mL)置于200mL梨形瓶中，并添加甲基纤维素(M0387,由Aldrich制造,0.1g)。将混合物搅拌同时在冰浴上冷却以溶解甲基纤维素。使用该溶液，制备以0.1、0.3、0.6或1.0％(w/v)的终浓度添加含水甲基纤维素溶液的培养基组合物。
含有胶原的培养基的制备
将10倍浓度的DMEM/F-12培养基(由Aldrich制造,1mL)、用于重构的缓冲液(由NittaGelatin Inc.制造,1mL)和纯水(1.5mL)添加至0.3％I-A型细胞基质(由NittaGelatin Inc.制造,6.5mL)，并将混合物在冰上搅拌以生成含有0.2％胶原的培养基。类似地，制备以0.01、0.05、0.1或0.2％(w/v)的终浓度添加胶原的培养基组合物。
将如上制备的培养基组合物进行HeLa细胞球的悬浮测试和粘度测量，以与含有脱酰基结冷胶的培养基相同的方式。由于仪器的测量范围，以50rpm测量1.0％(w/v)甲基纤维素的粘度。
[表1]
[表2]
[表3]
[实验实施例]
尽管本发明的培养基组合物在细胞培养中的有用性在以下实验实施例中具体解释，但本发明并不单独限于此。CO2培养箱中的CO2浓度(％)通过大气中的CO2的％体积显示。PBS表示磷酸缓冲盐溶液(由Sigma Aldrich Japan制造)，并且FBS表示胎牛血清(由BiologicalIndustries制造)。此外，(w/v)显示重量/体积。
(实验实施例1：通过分散单细胞的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清和10ng/mL促血小板生成素(由WAKO制造)的IMDM培养基(由Gibco制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将人白血病细胞系UT7/TPO置于添加有上述脱酰基结冷胶的培养基组合物中至20000个细胞/mL，并以5mL/孔分散至6孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造)中。类似地，将人宫颈癌细胞系HeLa以20000个细胞/mL铺至通过将0.015％(w/v)脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)添加至含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的EMEM培养基中获得的培养基组合物上，并将组合物以5mL/孔分散至6孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造)。将细胞悬浮液在CO2培养箱(5％CO2)中同时保持静置3天进行培养。随后，回收一部分培养基，加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞仪(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，UT7/TPO细胞和HeLa细胞可以以悬浮状态均匀培养，并且有效地在培养基组合物中增殖。静置悬浮培养3天后UT7/TPO细胞和HeLa细胞的细胞数显示于表4中。
[表4]
(实验实施例2：通过培养细胞系衍生的球的细胞增殖测试)
人肝癌细胞系HepG2(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以250000个细胞/mL悬浮于含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中，并将该悬浮液(10mL)铺板在EZ SPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)上，并在CO2培养箱(5％CO2)中培养7天。类似地，人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以250000个细胞/mL悬浮于含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的EMEM培养基中，并将该悬浮液(10mL)铺板在EZSPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)上，并在CO2培养箱(5％CO2)中培养7天。将在此获得的每种细胞系的球(直径100-200μm)的悬浮液(2.5mL)离心(200G，5min)以允许球沉淀，并去除上清液。紧接着，将上述培养基(10mL)添加到球(约800个球)中以悬浮它们并将悬浮液转移至平底管(由BM Equipment Co.,Ltd.制造)中。类似地，使用通过将0.015％(w/v)脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)添加至上述培养基中获得的培养基组合物，产生球悬浮液并将其转移至平底管(由BM Equipment Co.,Ltd.制造)中。通过首先将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，通过在90℃下加热搅拌将其溶解，在高压灭菌器中在121℃下将该水溶液灭菌20min，并以1/20稀释度将该溶液加入到含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中来制备添加有0.015％(w/v)脱酰基结冷胶的培养基组合物。
将上述球悬浮液在CO2培养箱(5％CO2)中在37℃下静置培养3天后，加入两倍体积的培养基。将混合物离心(200G,5min)以允许球沉淀，并将上清液去除。在这时，取出一部分球，并用光学显微镜(由OLMPUS制造,CK30-F100)观察其形状。紧接着，将回收的球用PBS(10mL)洗涤一次，加入1mL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育5min。加入上述培养基(9mL)，并通过离心(200G,5min)收集细胞。向获得的细胞悬浮液(2mL)的一部分中加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞和死细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态培养HepG2细胞和HeLa细胞的球，并且细胞有效地在培养基组合物中增殖。此外，当细胞增殖时，本发明的培养基组合物证实相比于现存培养基显示小比例的死细胞，并且具有优秀的细胞增殖促进作用。在现存培养基中培养的球沉淀于培养容器底部。此外，通过光学显微镜观察培养的球的形状。结果是，本发明的培养基组合物不显示球的结合，而在现存培养基中观察到球的结合。
HepG2细胞和HeLa细胞的相对数目显示于表5中，其中在无脱酰基结冷胶的培养基中培养的细胞数目为1。此外，死细胞的相对比例显示于表6中，其中在无脱酰基结冷胶的培养基中培养的死细胞比例(死细胞数/活细胞数)为1。在本发明的培养基组合物中培养的HepG2细胞和HeLa细胞的球的悬浮状态分别显示于图1和图2中。此外，培养的HeLa细胞的球的形状显示于图3中。
[表5]
[表6]
(实验实施例3：粘附培养中的人多能干细胞的细胞增殖测试)
将人多能干细胞(hPSC)在允许粘附的平面(flat plane)培养条件下在饲喂细胞(feeder)或包被有Matrigel的培养皿上一般增殖和维持。为了评价脱酰基结冷胶对hPSC的毒性，将脱酰基结冷胶以0.000％-0.020％(w/v)的浓度添加至在使用Matrigel(由Becton,Dickinson and Company制造)的平面培养条件下的mTeSR培养基(由STEM CELLTechnologies制造)中，并检查对hPSC增殖的影响。在这种情况下，将Kyoto University253G1株作为人iPS细胞培养并将Kyoto University KhES-1株作为人ES细胞系培养。通过首先将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，通过在90℃下加热搅拌将其溶解，在高压灭菌器中在121℃下将该水溶液灭菌20min，并以给定浓度将该溶液添加至mTeSR培养基中来制备添加有上述浓度的脱酰基结冷胶的培养基组合物。结果是，通过使用添加有脱酰基结冷胶的培养基可以对人iPS细胞和人ES细胞两者均获得与一般mTeSR培养基的相同水平的细胞数，并且未观察到脱酰基结冷胶的毒性。结果显示于图4中。如显示于图4中的培养后的细胞数是细胞数的相对值，其通过将hPSC铺在包被有Matrigel的培养皿中并在含有脱酰基结冷胶的mTeSR培养基中培养细胞5天至无脱酰基结冷胶的mTeSR培养基中的细胞数为1而获得的。
(实验实施例4：脱酰基结冷胶在人多能干细胞球的培养中的沉淀抑制测试)
hPSC在低粘附培养皿诸如petri培养皿等上形成球。例如，球可以通过描述于NATUREBIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579,Stem Cell Research,7,2011,97-111,Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259中的任何方法形成。回收在饲养细胞(小鼠胎成纤维细胞)上维持的hPSC(Kyoto University 253G1株或Kyoto UniversityKhES-1株)，通过自然沉淀去除饲养细胞，并将hPSC重悬于添加有Rho激酶抑制剂Y-27632(10μM)的mTeSR培养基中。紧接着，将具有给定大小的hPSC集落接种于petri培养皿(由BDFalcon制造)，并在CO2培养箱(5％CO2)在37℃下培养以形成球。在传代后第1天和第3天用无Y-27632的mTeSR培养基交换该培养基，并将细胞每5天在含Y-27632的mTeSR培养基中传代。将因此制备的hPSC球(培养的第4天)悬浮于通过将脱酰基结冷胶添加至mTeSR培养基(以如实验实施例3中相似的方式制备)至0.000％-0.020％(w/v)而获得的培养基组合物中，并转移至小杯中。将小杯在CO2培养箱(5％CO2)中在37℃下静置放置过夜，并检查脱酰基结冷胶的球沉淀抑制作用。结果显示于图5中。如图5中显示，通过添加脱酰基结冷胶球可以在所有浓度范围内以悬浮状态三维维持于培养基中。另一方面，发现在现存的无脱酰基结冷胶的培养基中，球沉淀于培养容器的底部表面并无法保持悬浮状态。此外，脱酰基结冷胶的作用在人iPS细胞和人ES细胞中共有。以上结果显示脱酰基结冷胶可以以悬浮状态维持hPSC球。
(实验实施例5：在人多能干细胞球的培养物中的细胞增殖测试)
检查了hPSC是否可以在管中以三维悬浮状态进行培养。将以如实验实施例4中相似的方式制备和传代的hPSC球(600-800/3mL)铺在5mL聚苯乙烯管(由BD Falcon制造)中的含0.000％、0.015％或0.020％(w/v)的脱酰基结冷胶的mTeSR培养基上，使得每管具有相同的球数目，并在CO2培养箱(5％CO2)中在37℃下培养5天。在传代后第1天和第3天通过添加3倍体积的DMEM/F-12培养基(由Sigma Ltd.制造)至培养基中来将培养基交换，通过离心(100G,3min)沉淀球，并向球添加新的培养基。在第5天，添加等量的DEME/F-12培养基(由Sigma Ltd.制造)，通过离心(100G,3min)回收所有球并用胰蛋白酶-EDTA溶液(由Invitrogen制造)将其解离为单细胞，并通过NucleoCounter(由chemometec制造)测量细胞数。结果是，在无脱酰基结冷胶的培养基中，球沉淀在管的底部上以形成大的细胞聚集体，并且未显示增殖。然而，在含有0.015％或0.020％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基中，以三维悬浮状态的球的大小增加，并且如相对于为1的所铺的细胞数在第5天获得的约10倍的细胞数所证实的，发现细胞增殖。结果显示于图6中。图6相对显示了在第5天对所铺的细胞数为1的细胞数。用人ES细胞，在第5天在聚苯乙烯管中每3mL培养物(对应于1000mL培养基中的约1,000,000,000个细胞)可以实际获得3,000,000个细胞。
(实验实施例6：在人多能干细胞球的培养物中的未分化维持证实测试)
将hPSC球细胞在含有以0.015％或0.020％(w/v)的脱酰基结冷胶的mTeSR培养基中进行悬浮静置培养，通过流式细胞术分析检查其未分化特性的维持。在聚苯乙烯管中以球状态，将人ES细胞(KhES-1)传代3次，人iPS细胞(253G1)传代4次。回收细胞，用SSEA4抗体(#MAB4304,由Millipore制造)和TRA-1-60(#MAB4360,由Millipore制造)抗体(其为显示hPSC未分化特性的表面标志物)染色，并且使用FACSCantoII(由Becton,Dickinson andCompany制造)评价用抗体的细胞染色的阳性率。结果显示于图7中。如图7中所示，在A：人iPS细胞(253G1)和B：人ES细胞(KhES-1)中，在含有脱酰基结冷胶的添加培养基中进行悬浮静置培养的不少于90％的细胞表达多能干细胞标志物，如在Matrigel上维持的细胞。作为负对照，进行仅用二级抗体的染色。从以上内容，阐明在人iPS细胞和人ES细胞两者中，在含有脱酰基结冷胶的添加培养基中进行悬浮静置培养的hPSC球维持未分化的特性。
(实验实施例7：球培养的人多能干细胞的特性分析-1)
使用通过与实验实施例3类似的方法制备的含有0.020％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的mTeSR培养基(由STEM Cell Technologies制造)，将人iPS细胞(253G1)或人ES细胞(KhES-1)的球通过与实验实施例4相似的方法总计传代培养9次，将培养后每种细胞在传代第1天的球铺在小鼠胎成纤维细胞上。第二天，将它们用300μg/mL的胸苷(由Sigma Aldrich制造)处理过夜。紧接着，将它们用100ng/mL的秋水仙碱(由Nacalai Tesque制造)处理，用胰蛋白酶-EDTA分解为单细胞，并用0.075M KCl进行低渗处理。随后，将细胞用Carnoy’s固定剂(甲醇：乙酸＝3：1)进行固定。
通过Q显带法(Q-banding method)对固定细胞的核型进行分析(委托于Chromosome Science Labo.Ltd.的实验)。结果是，阐明在本发明的培养基组合物中进行悬浮静置培养的人iPS细胞和人ES细胞均保留正常核型。结果显示于图8中。
(实验实施例8：球培养的人多能干细胞的特性分析-2)
使用通过与实验实施例3类似的方法制备的含有0.020％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的mTeSR培养基(由STEM Cell Technologies制造)，将人iPS细胞(253G1)的球通过与实验实施例4相似的方法每5天总计传代培养21-22次，将培养后的球用4％(w/v)低聚甲醛(由Nacalai Tesque制造)进行固定。将它们浸没于含20％蔗糖(w/v)的PBS中，并包埋于包埋剂中用于冷冻(O.C.T化合物，由Japanese cherryFinetek Japan Co.,Ltd.制造)。在低温箱(由Thermo Scientific制造)中制备12μm厚的切片，并用NANOG(#4903,由Cell Signaling制造)和OCT3/4(#sc-5279,由Santa Cruz制造)和SSEA4(#MAB4304,由Millipore制造)的抗体染色，显示hPSC的未分化。结果是，阐明在含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中进行悬浮静置培养的细胞表达多能干细胞的未分化标志物。如上所述，阐明在含有脱酰基结冷胶的培养基组合物中进行悬浮静置培养少于100天的人iPS细胞球维持未分化特性。结果显示于图9中。
(实验实施例9：通过培养附着在微载体上的细胞系的细胞增殖测试)
将微载体Cytodex(注册商标)1(由GE Healthcare Life Sciences制造)在PBS中以0.02g/mL悬浮，并将悬浮液放置过夜。丢弃上清液，并将微载体用新鲜PBS洗涤两次。随后，将它在PBS中以0.02g/mL再次悬浮，并在高压灭菌器中在121℃下灭菌20min。紧接着，将该微载体用70％乙醇洗涤两次并用PBS洗涤3次，并以0.02g/mL悬浮于含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中。使用该微载体悬浮液，制备含有120mg的Cytodex(注册商标)1和4000000HepG2细胞的DMEM培养基(含有10％(v/v)胎牛血清,20mL)，并将细胞悬浮液在用硅涂层剂(由AGC TECHNO GLASS Co.,Ltd.制造)预先处理的烧杯中进行培养，同时用搅拌器在37℃下搅拌(100rpm)6小时。在这时，用显微镜证实HepG2细胞附着至微载体上。紧接着，将细胞附着其上的微载体用含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基洗涤两次，并悬浮于相同培养基(3mL)中。
将上述微载体悬浮液(300μL)添加至含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(20mL)和通过将0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)添加至该培养基中获得的培养基组合物的各个中，并将混合物在37℃下培养3天。在无脱酰基结冷胶的培养基的情况下，将混合物进行培养，同时用搅拌器进行搅拌(100rpm)。培养后，用显微镜证实细胞在微载体上的附着状态，并通过离心(200G，5min)沉淀微载体。将该微载体用PBS(10mL)洗涤，添加1mL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育5min。此外，添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(9mL)，通过Cell Strainer(由BD Falcon制造,网目大小70μm)去除微载体。通过离心(200G，5min)将细胞从获得的滤液中回收。将细胞悬浮在培养基(500μL)中，并向其一部分中加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。结果是，无脱酰基结冷胶的培养基含有123,000个细胞，而含有脱酰基结冷胶的培养基含有1,320,000个细胞。如上所述，证实含有本发明的具体混合物的结构的培养基组合物与现存培养基相比，在细胞增殖促进作用中是优秀的，甚至当使用微载体培养细胞时。使用含有本发明的具体化合物的结构的培养基组合物的微载体培养3天后的HepG2细胞的附着状态显示于图10中。
(实验实施例10：使用细胞系衍生的球的细胞悬浮测试)
将黄原胶(KELTROL CG,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至1％(w/v)的浓度，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。使用该水溶液，制备具有0.1、0.15或0.2％(w/v)黄原胶终浓度的DMEM/F-12培养基组合物。此外，通过在90℃下加热制备含有0.2％(w/v)κ-角叉菜胶(GENUGEL WR-80-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和0.2％(w/v)槐豆胶(GENUGUM RL-200-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的水溶液。使用该水溶液，制备含有0.03、0.04或0.05％(w/v)κ-角叉菜胶和槐豆胶的DMEM/F-12培养基(由Sigma Ltd.制造)组合物。
以如实验实施例2中相同方式，形成HeLa细胞的球，并将几十个球添加至上面制备的各培养基(1mL)中，将混合物在37℃下保持静置1小时，并目视观察球细胞的悬浮状态。结果是，证实HeLa细胞的球在任何上文提及的培养基组合物中保持悬浮状态。此外，证实向细胞悬浮液中添加等量的培养基及其离心(300-400G,5min)导致HeLa细胞的球的沉淀和回收。在本发明的培养基组合物中培养的HeLa细胞的球的悬浮状态各自显示于图11中。此外，以如分析实施例1中相似的方式测量的粘度显示于表7和8中。
[表7]
[表8]
(实验实施例11：使用用滤器过滤的培养基组合物的细胞悬浮测试)
以如实验实施例2中相似的方式制备含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的DMEM/F-12培养基组合物。紧接着，将该培养基组合物(1mL)经70μm滤器和40μm滤器(由BD Falcon制造)、30μm滤器和20μm滤器(由AS ONE Corporation制造)、10μm滤器(由Partec制造)、和5μm滤器、1.2μm滤器、0.45μm滤器和0.2μm滤器(由Sartorius Stedim Japan制造)过滤。将以如实验实施例2中相似的方式制备HepG2的球以几十个球添加至上述滤液中并在37℃下静置1小时，并目视观察球细胞的悬浮状态。结果是，证实HepG2细胞的球在经过不小于10μm的滤器的培养基组合物中维持悬浮状态，但在经过小于5μm的滤器的培养基组合物中沉淀。此外，证实在室温下以300G,5min离心或添加等量的培养基并在室温下以200G,5min离心处于悬浮状态的HepG2细胞球导致球的沉淀和回收。
(实验实施例12：球形成测试)
以与实验实施例2相同的方式，制备含有0.01％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(由WAKO制造)的组合物。紧接着，将HeLa细胞加入至1000个细胞/mL的浓度，并分配至24孔板(由Corning Incorporated制造)中。通过在37℃下保持静置9天悬浮-培养该板，并用显微镜证实球的形成。此外，通过离心处理(300G,5min)将球细胞形成沉淀，并用PBS(5mL)洗涤一次。加入100μL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并在37℃下将混合物孵育5min。在此，向获得的细胞悬浮液(100μL)中加入含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(100μL)，向细胞悬浮液的子集(subset)中以相同量加入锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。结果是，证实HeLa细胞增加至170000个细胞/mL。在本发明的培养基组合物中形成的HeLa细胞的球显示于图12中。
(实验实施例13：结构的光学显微镜观察)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于纯水中至0.4％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将DMEM/F-12培养基(由Aldrich制造,95mL)以两倍浓度置于300mL高烧杯中，添加含水脱酰基结冷胶溶液(5mL)同时用磁力搅拌器在室温下搅拌，并将混合物搅拌持续5min以生成含有终浓度为0.02％的脱酰基结冷胶的培养基组合物。此外，通过均匀混合器(3000rpm)将培养基组合物搅拌5min。用光学显微镜(KEYENCECorporation,BIOREVO BZ-9000)观察所制备的培养基组合物。所观察的结构显示于图13中。
(实验实施例14：通过混合加热粉末培养基和DAG制备)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造,20mg)和DMEM/F-12培养基(由Life Technologies制造,1.58g)置于200mL锥形瓶中，并且将纯水(100mL)倒入其中。将混合物在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟，以制备具有0.02％的脱羧基结冷胶浓度的DMEM/F-12培养基组合物。向制备的培养基中加入葡聚糖珠Cytodex 1(大小200μm,由GEHealthcare Life Sciences制造)，并且通过目视观察确定珠的分散状态。对于评价，悬浮状态为○，部分沉淀/分散状态为Δ，和沉淀状态为×。结果显示于表9中。
[表9]
(实验实施例15：制备含有多糖的培养基组合物)
将黄原胶(KELTROL CG,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于纯水中至0.5％(w/v)的浓度，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。类似地，制备海藻酸钠(Duck alginic acid NSPM,由FOOD CHEMIFA Co.,Ltd.制造)、槐豆胶(GENUGUM RL-200-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)、κ-角叉菜胶(GENUGEL WR-80-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和迪特胶(KELCO CRETE DG-F,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的0.5％(w/v)的水溶液。
将该水溶液和0.2或0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液和以10倍浓度的DMEM/F-12培养基混合，并将混合物在80℃下加热30min，允许冷却至室温，并将7.5％含水碳酸氢钠溶液添加以制备含有以0.01、0.02％(w/v)终浓度的脱酰基结冷胶和以0.1、0.2、0.3、0.4％(w/v)终浓度的其他多糖的DMEM/F-12培养基组合物。此外，如上所述制备含有脱酰基结冷胶的培养基，并添加甲基纤维素的粉末(cP400，由WAKO制造)。将混合物在冰浴中搅拌以溶解甲基纤维素以制备含有以0.01、0.02％(w/v)终浓度的脱酰基结冷胶和以0.1、0.2、0.3、0.4％(w/v)终浓度的其他甲基纤维素的DMEM/F-12培养基组合物。
将聚苯乙烯珠(大小500-600μm,由Polysciences Inc.制造)添加至如上制备的培养基中，并通过目视观察证实珠的分散状态。对于评价，悬浮状态为○，部分沉淀/分散状态为Δ，和沉淀状态为×。结果显示于表10中。
(实验实施例16：含有多糖的培养基组合物的粘度测量)
通过与对实验实施例15的多糖混合物的类似的方法，制备含有以0.005、0.01％(w/v)的终浓度的脱酰基结冷胶和其他多糖的DMEM/F-12培养基。将多糖的终浓度设定为：黄原胶、海藻酸钠、槐豆胶为0.1％(w/v)，甲基纤维素为0.2％(w/v)，和κ-角叉菜胶和迪特胶为0.05％(w/v)。每种培养基组合物的状态和通过与分析实施例1中的相似的方法测量的粘度显示于表11-16中。
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[表15]
[表16]
(实验实施例17：制备具有改变的二价金属离子浓度的培养基组合物)
使用无氯化钙、硫酸镁和氯化镁的DMEM/F-12(D9785,由Aldrich制造)并以如实验实施例14的方法相同的方式，制备含有0.02％(w/v)脱酰基结冷胶的DMEM/F-12培养基组合物。制备添加有氯化钙或硫酸镁和氯化镁使得将终浓度设定至DMEM/F-12培养基的确定量的DMEM/F-12培养基组合物。考虑到DMEM/F-12培养基的确定组成，将各终浓度设定为：氯化钙为0.116g/L，硫酸镁为0.049g/L，和氯化镁为0.061g/L。
向制备的培养基组合物中加入葡聚糖珠Cytodex 1(由GE Healthcare LifeSciences制造)，并且2天后通过目视观察确定珠的分散状态。对于评价，悬浮状态为○，部分沉淀/分散状态为Δ，和沉淀状态为×。结果显示于表17中。
[表17]
(实验实施例18：制备随后添加有二价金属离子的培养基组合物)
通过将0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液、5倍浓度的DMEM/F-12培养基(不含有氯化钙、硫酸镁和氯化镁，D9785，由Aldrich制造)、氯化钙(1167mg)、硫酸镁(489mg)和氯化镁(287mg)溶解于纯水(300mL)中制备盐溶液。将含水脱酰基结冷胶溶液和纯水置于200mL高烧杯中，并使用锚型搅拌叶片以200rpm将溶液搅拌。添加其为培养基溶液和水的混合物的溶液A，并将混合物直接搅拌10min。随后，添加盐溶液，将7.5％含水碳酸氢钠溶液(1.6mL)进一步添加以制备含有以0.02％的终浓度的脱酰基结冷胶的DMEM/F-12培养基组合物。每种溶液的混合的量显示于表中。制备4小时后，将6种培养基组合物进行聚苯乙烯珠和Cytodex1的分散评价。结果显示于表18、19中。
[表18]
[表19]
(实验实施例19：各种培养基组合物的制备)
制备0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液和具有高浓度的培养基溶液。作为具有高浓度的培养基溶液，制备具有10倍浓度的MEM(M0268,由Aldrich制造)，具有10倍浓度的RPMI-1640(R6504,由Aldrich制造)，和具有5倍浓度的DMEM(高压灭菌相应的培养基，由Nissui制造)。将0.1％(w/v)的脱酰基结冷胶溶液、各种高浓度培养基和用于调节浓度的纯水混合，并将混合物在80℃下加热30min。允许混合物冷却至室温，并将7.5％的含水碳酸氢钠溶液添加以制备含有以0.01、0.02、0.03％(w/v)的终浓度的脱酰基结冷胶的培养基组合物。
评价所制备的9种培养基组合物的聚苯乙烯珠和葡聚糖珠Cytodex1的悬浮和分散状态，其中悬浮状态为○，部分沉淀/分散状态为Δ，且沉淀状态为×。结果显示于表20、21中。
[表20]
[表21]
(实验实施例20：含有脱酰基结冷胶的培养基组合物的粒径分布测量)
根据分析实施例1，制备含有0.038％(w/v)脱酰基结冷胶的DEME/F-12培养基组合物。通过经均匀混合器(homomixer)以3000rpm和6000rpm搅拌1分钟来制备培养基。培养基组合物的粒径分布通过Beckman Instruments Coulter,Inc.Multisizer 4(通过库尔特原理的准确粒径分布测量仪器)进行测量并且测定体积标准粒径分布的粒度中值(d50)。结果显示于表22中。
[表22]
(实验实施例21：脱酰基结冷胶的磷酸化)
在100mL玻璃试管中测量脱酰基结冷胶(1g)和纯水(40mL)，并将混合物在100℃加热30分钟以制备悬浮液。向该悬浮液中加入含水磷酸溶液(85％,1g)，并将混合物在回流下加热5小时。随后，允许其冷却至室温同时搅拌12小时，并将所获的白色悬浮液倒入99％乙醇(500mL)中。通过过滤收集所获的絮状白色固体并干燥以生成作为脱酰基结冷胶的磷酸化物质的淡棕色固体(0.4g)。通过傅里叶变换红外光谱分析(由SHIMADZU CORPORATION制造,IR-Prestage 21)(1700cm-1；P-OH,1296cm-1,1265cm-1；P＝O)验证磷酸基团的引入。通过微波加热消化仪器(ETHOS TC,由Milestone General制造)分解淡棕色固体，并通过电感耦合等离子体发射光谱分析仪(ICP-OES)(SPS 5520,由SII NanoTechnology制造)测量磷原子的含量。结果为3.5wt％(n＝2)。
(实验实施例22：含有磷酸化脱羧基结冷胶的培养基组合物的制备)
将任选量的磷酸化脱羧基结冷胶(30mg)和DMEM/F-12培养基(由Life Technologies制造,1.56g)置于200mL锥形瓶中，并且将纯水(100mL)倒入其中。将混合物在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟，以制备具有0.03％的脱羧基结冷胶浓度的DMEM/F-12培养基组合物。向制备的培养基中加入葡聚糖珠Cytodex 1(由GE Healthcare Life Sciences制造)，并且通过目视观察确定珠的分散状态。在0.03％(w/v)的磷酸化脱酰基结冷胶浓度发现珠的分散状态。
(实验实施例23：含有脱羧基结冷胶的培养基组合物的制备)
将含水脱酰基结冷胶溶液和培养基溶液以下表中显示的速率混合来制备具有0.02％脱酰基结冷胶浓度的DMEM/F-12培养基组合物，并评价聚苯乙烯珠(大小500-600μm,由Polysciences Inc.制造)的分散状态。结果显示于表23和24中。经保持1天或更久，苯乙烯珠在所有条件下均分散。
[表23]
将“DMEM/F12粉末培养基/纯水”加入到“脱酰基结冷胶/纯水”。
[表24]
将“脱酰基结冷胶/纯水”加入到“DMEM/F12粉末培养基/纯水”。
(实验实施例24：使用滤器制备培养基组合物)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.02或0.04％(w/v)的终浓度，并通过在90℃加热30分钟或在121℃加热20分钟来溶解。此外，将该水溶液(100mL)用具有0.22μm孔径的聚醚砜膜滤器(由CorningIncorporated制造)过滤。紧接着，将该滤液与2至4倍浓度的DMEM/F-12培养基(由SigmaAldrich制造)混合，并将该混合物用轻度混合器(SI-24,由TAITEC Co.,Ltd.制造)摇动1小时来制备含有以0.01或0.015％(w/v)终浓度的脱酰基结冷胶的培养基组合物(例如，将25mL各0.02％(w/v)含水脱酰基结冷胶溶液和具有2倍浓度的DMEM/F-12培养基混合以制备0.01％(w/v)脱酰基结冷胶培养基组合物(50mL))。通过与实验实施例2中的方法类似的方法，形成HepG2细胞的球，并将几十个球加入到上文制备的培养基(1mL)中，放置于37℃，在1小时和一夜后目视观察到球细胞的悬浮状态。结果是，确定HepG2细胞的球在所有上文提及的培养基组合物中保持悬浮状态。此外，加入两倍提及的培养基，并将细胞悬浮液离心(500G,5min)。确定HepG2细胞的球沉淀，并且细胞可以在所有培养基组合物中回收。一夜后球的分散状态通过目视观察确定并评估，其中悬浮的和分散的状态为○，部分沉淀/分散状态是Δ，并且沉淀状态是×。评价结果显示于表25中。
[表25]
(实验实施例25：通过培养细胞系衍生的球的细胞增殖测试)
人胚肾细胞系HEK293(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以250000个细胞/mL悬浮于含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的EMEM培养基中，并将该悬浮液(10mL)铺板在EZ SPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)上，并在CO2培养箱(5％CO2)中培养2天。将在此获得的HEK293细胞的球(直径100-200μm)的悬浮液(10mL)离心(200G,5min)，以允许球沉淀，去除上清液并将球悬浮于1mL中。紧接着，将培养基(10mL)添加到球悬浮液(200μL,细胞数约200000)中以悬浮它们并将悬浮液转移至平底管(由BM Equipment Co.,Ltd.制造)中。类似地，使用通过将0.015％(w/v)脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)添加至上述培养基中获得的培养基组合物，产生球悬浮液并将其转移至平底管(由BMEquipment Co.,Ltd.制造)中。通过首先将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，通过在90℃下加热搅拌将其溶解，在高压灭菌器中在121℃下将该水溶液灭菌20min，并以1/20稀释度将该溶液加入到含10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基中来制备添加有0.015％(w/v)脱酰基结冷胶的培养基组合物。
将上述球悬浮液在CO2培养箱(5％CO2)中在37℃下静置培养5天后，加入两倍体积的培养基。将混合物离心(500G,5min)以允许球沉淀，并将上清液去除。紧接着，将回收的球用PBS(10mL)洗涤一次，加入1mL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育5min。加入上述培养基(9mL)，并通过离心(200G,5min)收集细胞。向获得的细胞悬浮液(2mL)的一部分中加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由InvitrogenCorporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞和死细胞的数目。作为对照，产生无脱酰基结冷胶的培养基组合物，并进行相似实验。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态培养HEK293细胞的球，并且细胞有效地在培养基组合物中增殖。此外，当细胞增殖时，本发明的培养基组合物证实相比于无脱酰基结冷胶的培养基组合物显示小比例的死细胞，并且具有优秀的细胞增殖促进作用。在现存培养基中培养的球沉淀于培养容器底部。
HEK293细胞的相对数目显示于表26中，其中在无脱酰基结冷胶的培养基中培养的细胞数目为1。此外，死细胞的相对比例显示于表27中，其中在无脱酰基结冷胶的培养基中培养的死细胞比例(死细胞数/活细胞数)为1。
[表26]
[表27]
(实验实施例26：通过培养昆虫细胞的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至Sf-900(注册的商标)III SFM培养基(由Gibco制造)来制备培养基组合物。紧接着，将草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)来源的Sf9细胞(由Gibco制造)以100000细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以1mL/孔分配至24孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造)的孔中。通过在培养箱中在25℃下保持静置5天培养细胞悬浮液。随后，回收一部分培养基，加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。作为对照，产生无脱酰基结冷胶的培养基组合物，并进行相似实验。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态均匀地培养Sf9细胞，并且在培养基组合物中增殖。此外，证实当增殖细胞时，如与无脱酰基结冷胶的培养基组合物相比，本发明的培养基组合物在促进细胞增殖作用中是优秀的。悬浮静置培养5天后Sf9细胞的细胞数显示于表28中。
[表28]
(实验实施例27：通过培养CD34阳性细胞的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过将以0.015％(w/v)终浓度的脱酰基结冷胶、20ng/mL促血小板生成素(由WAKO制造)和100ng/mL干细胞因子(SCF，由WAKO制造)加入到StemSpanSFEM培养基(由StemCell Technologies制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将人脐带血来源的CD34阳性细胞(由Lonza制造)接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中至10000个细胞/mL，并以1mL/孔分配至24孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造)的孔中。将细胞悬浮液在CO2培养箱(5％CO2)中在37℃下进行静置培养7天。随后，回收一部分培养基，加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。将3倍体积的培养基加入到培养物培养基(culture medium)中并将混合物离心(500G,5min)以允许沉淀所有细胞。作为对照，产生无脱酰基结冷胶的培养基组合物，并进行相似实验。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态均匀地培养CD34阳性细胞，并且在培养基组合物中增殖。此外，证实本发明的培养基组合物显示出与现存不存在脱酰基结冷胶的培养基相同的或比其更高的水平的细胞增殖促进作用。此外，证实离心导致细胞的沉淀并且可以回收细胞。当在无脱酰基结冷胶的培养基中培养的细胞的数目为1时，悬浮静置培养7天后从CD34阳性细胞增殖的细胞的相对数目显示于表29中。
[表29]
(实验实施例28：球形成测试)
以与实验实施例2相同的方式，制备含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)的组合物。紧接着，将HepG2细胞加入至15000个细胞/mL的细胞浓度，并以1mL分配至24孔板(由CorningIncorporated制造)中。通过在37℃下保持静置7天悬浮-培养该板，并用显微镜证实球的形成。此外，通过离心处理(400G,5min)将球细胞形成沉淀，并用PBS(5mL)洗涤一次。加入100μL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并在37℃下将混合物孵育5min。在此，向获得的细胞悬浮液(100μL)中加入含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(100μL)，向细胞悬浮液的子集(subset)中以相同量加入锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。结果是，证实HepG2细胞在本发明的培养基组合物中形成球，并增加至80800个细胞/mL。在本发明的培养基组合物中形成的HepG2细胞的球显示于图14中。
(实验实施例29：使用细胞系衍生的球的细胞悬浮测试)
将迪特胶(KELKO-CRETE DG,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)的浓度，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。使用该水溶液，制备具有0.1％(w/v)迪特胶终浓度的DMEM/F-12培养基组合物。此外，通过在90℃下加热制备含有0.5％(w/v)天然类型结冷胶(KELCO胶HT,由San-Ei Gen F.F.I.,Inc.制造)的水溶液。使用该水溶液，制备含有0.05或0.1％(w/v)天然类型结冷胶的DMEM/F-12培养基(由Sigma Ltd.制造)。
以如实验实施例2中相同方式，产生HeLa细胞的球，并将几十个球添加至上面制备的各培养基(1mL)中，将混合物在37℃下保持静置1小时，并目视观察球细胞的悬浮状态。结果是，证实HeLa细胞的球在任何上文提及的培养基组合物中保持悬浮状态。此外，证实含有0.1％(w/v)迪特胶的细胞悬浮液的离心(200G,5min)导致HeLa细胞的球的沉淀和回收。
(实验实施例30：使用具有细胞粘附能力的磁珠的细胞悬浮测试-1)
将用层粘连蛋白或纤连蛋白包被的GEM(注册商标,Global EukaryoticMicrocarrier,由GL Sciences Inc.制造)的悬浮液以500μL分配至1.5mL体积的微型试管(由Eppendorf制造)中，通过使用磁力架(TA4899N12,由TAMAGAWA SEIKI CO.,LTD.制造)从上述GEM悬浮液积累GEM并去除溶剂。此外，用含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造,500μL)将GEM洗涤两次，并悬浮于相同培养基(500μL)中。将该悬浮液以50μL/1孔分配至Sumilon细胞紧密板(cell tight plate)24F(由SUMITOMO BAKELITE制造)，其为细胞低粘附板。紧接着，将单独制备的HepG2细胞以250000个细胞/mL添加，并用相同培养基将终体积调节至500μL/孔。手动搅拌该细胞悬浮液，并将板在CO2培养箱(5％CO2)中放置过夜。用显微镜证实在GEM上的细胞粘附后，将细胞悬浮液转移至1.5mL的微型试管(由Eppendorf制造)，用上述磁力架积累粘附细胞的GEM，并去除上清液。
以与实验实施例2中的相似的方法，制备含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)组合物。该培养基组合物或无脱酰基结冷胶的上述培养基各自以1mL添加至如上制备的HepG2细胞粘附的GEM(层粘连蛋白或纤连蛋白包被的)，悬浮并转移至Sumilon细胞紧密板24F。紧接着，将该板在CO2培养箱(5％CO2)中放置6天，并将细胞培养基转移至1.5mL微型试管(由Eppendorf制造)中，在上述磁力架上轻柔地吸打时积累细胞粘附的GEM，并去除上清液。将GEM用PBS(1mL)洗涤一次，加入200μL的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育10分钟。向在此获得的200μL细胞悬浮液中加入800μL的含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，将相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)加入到细胞悬浮液的一部分中，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，粘附有HepG2细胞的GEM可以以悬浮状态培养，并且有效地在培养基组合物中增殖。此外，证实本发明的培养基组合物显示优于现存的无脱酰基结冷胶的培养基的细胞增殖促进作用。此外，证实使用磁力，附着HepG2细胞的GEM可以从本发明的培养基组合物中收集，并且进一步，可以从该GEM中回收HepG2细胞。
当在含脱酰基结冷胶或无脱酰基结冷胶的培养基中的GEM上培养6天后，HepG2细胞的细胞数显示于表30中。此外，当在本发明的培养基组合物中培养时，附着有HepG2细胞的层粘连蛋白包被的GEM的悬浮状态显示于图14中。
[表30]
(实验实施例31：使用具有细胞粘附能力的磁珠的细胞悬浮测试-2)
以如实验实施例30中相同的方式，将纤连蛋白包被的GEM(注册商标,GlobalEukaryotic Microcarrier,由GL Sciences Inc.制造)悬浮于MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(由TOYOBO CO.,LTD.制造)。将该悬浮液以50μL/1孔分配至Sumilon细胞紧密板(cell tight plate)24F(由SUMITOMO BAKELITE制造)，其为细胞低粘附板。紧接着，将单独制备的人骨髓来源的间充质干细胞(由Cell Applications制造)以250000个细胞/mL添加，以如实验实施例30中相同的方式，将该板在CO2培养箱(5％CO2)中静置过夜以制备粘附有间充质干细胞的GEM。
通过与实验实施例2中的相似的方法，制备含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(由TOYOBO CO.,LTD.制造)组合物。该培养基组合物或无脱酰基结冷胶的上述培养基各自以1mL添加至如上制备的间充质干细胞粘附的GEM(纤连蛋白包被的)，悬浮并转移至Sumilon细胞紧密板24F。紧接着，将该板在CO2培养箱(5％CO2)中放置4天，并将细胞培养基转移至1.5mL微型试管(由Eppendorf制造)中，在上述磁力架上轻柔地吸打时积累细胞粘附的GEM，并去除上清液。将GEM用PBS(1mL)洗涤一次，加入200μL的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育10分钟。向在此获得的200μL细胞悬浮液中加入800μL的含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，将相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)加入到细胞悬浮液的一部分中，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，粘附有间充质干细胞的GEM可以以悬浮状态培养，并且有效地在培养基组合物中增殖。此外，证实本发明的培养基组合物显示优于现存的无脱酰基结冷胶的培养基的细胞增殖促进作用。此外，证实使用磁力，附着间充质干细胞的GEM可以从本发明的培养基组合物中收集，并且进一步，可以从该GEM中回收间充质干细胞。
当在含脱酰基结冷胶或无脱酰基结冷胶的培养基中的GEM上培养4天后，间充质干细胞的细胞数显示于表31中。
[表31]
(实验实施例32：使用海藻酸珠的细胞悬浮测试)
根据由PG Research制造的海藻酸三维培养试剂盒的方法进行以下测试。将单独制备的HepG2细胞以400000个细胞/mL添加至海藻酸钠溶液(由PG research制造,2.5mL)，并将人重组层粘连蛋白511(由Veritas Ltd.制造)以5μg/mL进一步加入以制备细胞悬浮液。将细胞悬浮液用具有灌胃针(gavage needle)的5mL注射器(由TERUMO CORPORATION制造)回收，并将22G注射针(由TERUMO CORPORATION制造)安装至该注射器。紧接着，将细胞悬浮液以10滴添加至加有2mL各含水氯化钙溶液(由PG research制造)的24孔平底微量培养板(由PG research制造)的每孔中。将混合物在室温下保持10min，证实海藻酸珠的形成，去除氯化钙溶液，加入PBS(2mL)，并将混合物在室温下静置15min。此外，去除PBS，加入含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造，2mL)，并将混合物在室温下静置15min。去除培养基，将含有0.03％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)组合物(其通过与实验实施例2中的相似的方法制备)、或无脱酰基结冷胶的上述培养基以1mL添加至每孔，并将混合物在CO2培养箱(5％CO2)中进行静置培养8天。在培养第4天交换培养基。
使用1mL吸头将培养的海藻酸珠转移至1.5mL微型试管(由Eppendorf制造)，向每管中加入柠檬酸钠溶液(1mL，由PG research制造)，并将混合物在室温下搅拌15min以溶解海藻酸珠。紧接着，通过以300G离心3min将细胞沉淀，并去除上清液。向细胞中加入200μL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并在37℃下将混合物孵育5min。向获得的细胞悬浮液(200μL)中加入800μL含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，并向细胞悬浮液的一部分中以相同量加入锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，包埋有HepG2细胞的海藻酸珠可以以悬浮状态培养，并且有效地在培养基组合物中增殖。此外，证实本发明的培养基组合物显示优于现存的无脱酰基结冷胶的培养基的细胞增殖促进作用。
当在含脱酰基结冷胶或无脱酰基结冷胶的培养基中的海藻酸珠中培养8天时，HepG2细胞的细胞数显示于表32中。此外，当包埋有HepG2细胞的海藻酸珠在本发明的培养基组合物中培养时，悬浮状态显示于图16中。
[表32]
(实验实施例33：使用胶原凝胶囊的细胞悬浮测试)
将A：组织培养胶原细胞基质(注册商标)类型I-A(细胞基质，由Nitta Gelatin Inc.制造)，B：10倍浓度的DMEM/F-12培养基(由Aldrich制造)，C：重构缓冲液(通过加入碳酸氢钠(2.2g)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))(4.77g)至0.05N氢氧化钠溶液(100mL)并将混合物进行过滤灭菌获得)以A:B:C＝8:1:1进行混合同时在冰上冷却。此外，以5μg/mL加入人重组层粘连蛋白511(由Veritas Ltd.制造)以制备胶原混合溶液(500μL)。向混合的溶液中加入以200000个细胞/mL的单独制备的HepG2细胞，并使用具有25G注射针头(由TERUMOCORPORATION制造)的1.5mL注射器(由TERUMO CORPORATION制造)回收总量。紧接着，使用上述注射器以一滴逐滴将细胞悬浮液加入到含有含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)(10mL)并在37℃下预先孵育的平底管(由BM Equipment Co.,Ltd.制造)中。将混合物在37℃下的水浴中孵育10min并证实具有约2mm直径的不确定的胶原凝胶囊的形成，通过与实验实施例2中的相似的方法将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)以0.04％的终浓度加入，并通过轻柔搅拌悬浮上述囊。紧接着，使管在CO2培养箱(5％CO2)中进行静置培养5天。
将PBS(25mL)加入到含有胶原凝胶囊的培养基中，并通过以400G离心5min沉淀胶原凝胶囊，并去除上清液。再次，加入PBS(25mL)，并离心混合物，并去除上清液以使剩余部分的量为5mL。向该溶液中加入1％(W/V)胶原酶L(由Nitta Gelatin Inc.制造,20μL)，并将混合在37℃下摇动2小时。在证实胶原凝胶溶解后，加入PBS(10mL)，并将细胞通过400G离心5min进行沉淀，并去除上清液。向细胞中加入1mL胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育5min。向获得的细胞悬浮液中加入4mM的含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，并将细胞通过在400G离心5min进行沉淀，并去除上清液。将获得的细胞悬浮在2mL上文的相同培养基中，并向其一部分中加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态培养包埋有HepG2细胞的胶原凝胶囊，并且细胞有效地在培养基组合物中增殖。此外，证实本发明的培养基组合物显示出优于现存不存在脱酰基结冷胶的培养基的细胞增殖促进作用。
当在含脱酰基结冷胶或无脱酰基结冷胶的培养基中的胶原凝胶囊中培养5天时，HepG2细胞的细胞数显示于表33中。此外，当包埋有HepG2细胞的胶原凝胶囊在本发明的培养基组合物中培养时，悬浮状态显示于图17中。
[表33]
(实验实施例34：使用滤器的球回收测试)
通过与实验实施例2中的相似的方法，制备含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)组合物。此外，作为对照，制备无脱酰基结冷胶的相同培养基。通过与实验实施例2中的相似的方法形成HepG2细胞球，并以86000个细胞加入到如上制备的培养基(1mL)中，并将混合物在37℃下静置1小时，目视观察球细胞悬浮液。此外，将细胞悬浮液加入到具有40μm的网目大小的Cell Strainers(由Becton,Dickinson and Company制造)中以在滤器上捕获球。紧接着，将PBS(10mL)从滤器的背面流出以在15mL管中回收球，通过以300G离心5min沉淀球。回收上清液，向球中加入500μL的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(由WAKO制造)，并将混合物在37℃下孵育5min。向获得的细胞悬浮液中加入含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(1mL)，并向其一部分中加入相同量的锥虫蓝染色溶液(由Invitrogen Corporation制造)，并通过血细胞计数器(由ERMA INC.制造)测量活细胞的数目。结果是，证实HepG2细胞的球在上文提及的培养基组合物中保持悬浮状态。此外，证实通过滤器处理含有0.015％脱酰基结冷胶的球悬浮液，HepG2细胞球的细胞可以以等同于无脱酰基结冷胶的培养基的回收率被回收。从含有脱酰基结冷胶的培养基回收的相对数目显示于表34中，其中用滤器和使用无脱酰基结冷胶的培养基回收的HepG2细胞的数目为1。
[表34]
(实验实施例35：使用多种多糖的组合试剂的细胞悬浮测试)
通过与实验实施例15中的相似的方法制备含有黄原胶(KELTROL CG,由SANSHO Co.,Ltd.制造)、海藻酸钠(Duck alginic acid NSPM,由FOOD CHEMIFA Co.,Ltd.制造)、槐豆胶(GENUGUM RL-200-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)、甲基纤维素(cP400,由WAKO制造),κ-角叉菜胶(GENUGEL WR-80-J,由SANSHO Co.,Ltd.制造)、果胶(GENU pectin LM-102AS,由SANSHO Co.,Ltd.制造)或迪特胶(KELCO CRETE DG-F,由SANSHO Co.,Ltd.制造)和脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的组合的DMEM/F-12培养基组合物。以如实验实施例2中相同方式，产生HepG2细胞的球，并将几十个球添加至上面制备的各培养基(1mL)中，将混合物在37℃下保持静置1小时或一夜，并目视观察球细胞的悬浮状态。结果是，证实HepG2细胞的球在任何上文提及的培养基组合物中保持悬浮状态。此外，在所有的培养基组合物中均证实添加2倍量的培养基和离心(500G,5min)细胞悬浮液导致HepG2细胞球的沉淀和回收。一夜后球的分散状态通过目视观察确定，其中悬浮的和分散的状态为○，部分沉淀/分散状态是Δ，并且沉淀状态是×。评价结果显示于表35和表36中。在表中，-显示未进行。
[表35]
珠和细胞的可分散性的比较-1
比较上文制备的含有脱酰基结冷胶的培养基(比较实施例)和含有甲基纤维素的培养基之间的葡聚糖珠Cytodex(注册商标)1(由GE Healthcare Life Sciences制造)和HeLa细胞球的分散状态。结果显示于表中。由于Cytodex1和HeLa细胞球的分散状态关联好，因此Cytodex1可以用作细胞球模型。
[表37]
[表38]
珠和细胞的可分散性的比较-2
比较实验实施例15中制备的多糖和含脱酰基结冷胶的培养基之间的聚苯乙烯珠(大小500-600μm,由Polysciences Inc.制造)和HepG2细胞球的分散状态。评价中悬浮和分散状态为○，部分沉淀/分散状态为Δ，和沉淀状态为×。结果显示于表中。由于聚苯乙烯珠和HepG2细胞球的分散状态关联好，因此聚苯乙烯珠可以用作细胞球模型。
(实验实施例36：稻来源的植物愈伤组织的漂浮培养测试)
将用盐溶液选择的50粒完全成熟的稻日本晴(Nipponbare)种子(购自Kotoagricultural cooperatives)转移至50mL聚苯乙烯管(由BD Falcon制造)，用灭菌水(50mL)洗涤，并在70％乙醇水(30mL)中搅拌1min。去除乙醇水，加入Kitchen Haiter(由KaoCorporation制造,30mL)，并将混合物搅拌1小时。去除Kitchen Haiter，并用灭菌水(50mL)洗涤4次。将灭菌后的种子在含有2μg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸(由Sigma Aldrich制造)和琼脂的Murashige Skoog基础培养基(M9274,由Sigma Aldrich制造)上以1.5mL/孔(24孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造))培养。将它们在30℃、16小时黑暗位置/8小时黑暗位置的条件下培养3周，并收获在种子囊胚上生长的奶油色的愈伤组织(1-2mm)。
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有2μg/mL 2,4-二氯苯氧乙酸(由SigmaAldrich制造)的Murashige Skoog基础培养基(M9274,由Sigma Aldrich制造)中以0.03％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。将上面制备的15块愈伤组织添加至以10mL/平底管(由BM Equipment Co.,Ltd.制造)的该培养基组合物中，并在25℃下摇动培养7天。结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以悬浮状态培养稻来源的愈伤组织，并且愈伤组织维持在培养基组合物中。当稻来源的愈伤组织在本发明的培养基组合物中培养时，悬浮状态显示于图18中。
(实验实施例37：通过分散HeLa细胞的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％(w/v)或0.030％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中至200μL/孔。作为负对照，将HeLa细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置8天进行培养。培养3和8天后，向培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。将培养8天后的含有细胞的培养基用移液器搅拌并将获得的搅拌后的溶液(20μL)与锥虫蓝染色剂0.4％(由Invitrogen制造,20μL)混合，并在显微镜下测量细胞密度。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以均匀的分散状态培养HeLa细胞而不会形成具有过大体积的细胞聚集体，并且在培养基组合物中有效增殖。培养8天后的HeLa细胞的聚集体的显微镜观察结果显示于图19中。此外，静置培养3、8天后在450nm处的吸光度(对应于HeLa细胞数)显示于表40中。培养8天后HeLa细胞的细胞数显示于表41中。
[表40]
[表41]
(实验实施例38：通过分散A549细胞和HCT116细胞的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基或McCoy’s 5a培养基(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)或人结肠直肠癌细胞系HCT116(由DS PHARMA BIOMEDICALCO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将A549细胞和HCT116细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置7天进行培养。培养3、5和7天后，向培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，可以以均匀的分散状态培养A549细胞和HCT116细胞而不会形成具有过大体积的细胞聚集体，并且在培养基组合物中有效增殖。培养5天后的A549细胞和HCT116细胞的聚集体的显微镜观察结果显示于图20中。此外，静置培养3、5、7天后，在450nm处的吸光度(对应于A549细胞数)显示于表42中，并且在450nm处的吸光度(对应于HCT116细胞数)显示于表43中。
[表42]
[表43]
(实验实施例39：使用具有U形底的低粘附表面板的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔U形底低粘附表面微量培养板(由SUMITOMO BAKELITE制造,#MS-9096U)的孔中。作为负对照，将HeLa细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置7天进行培养。向培养2、5和7天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDOLaboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，证实通过使用本发明的培养基组合物在其他低粘附板中也实现有效增殖。静置培养2、5、7天后在450nm处的吸光度(对应于HeLa细胞数)显示于表44中。
[表44]
(实验实施例40：通过使用其他公司的低粘附表面板的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.005％和0.030％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔平底低粘附表面微量培养板(由IWAKI制造,#Ez-BindShut)的孔中。作为负对照，将HeLa细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置7天进行培养。向培养3天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，证实通过使用本发明的培养基组合物在其他低粘附板中也实现有效增殖。静置培养3天后在450nm处的吸光度(对应于HeLa细胞数)显示于表45中。
[表45]
(实验实施例41：用Happy Cell ASM培养基的细胞增殖比较测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。预先将Happy CellASM培养基(由biocroi制造)与DMEM培养基(由WAKO制造)调节至给定浓度(以1:1混合)。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)或人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物或Happy Cell ASM培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将HeLa细胞和A549细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置5天进行培养。向培养3和5天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，与Happy Cell ASM相比，细胞在该培养基组合物中有效增殖。静置培养3、5天后在450nm处的吸光度(对应于HeLa细胞数)显示于表46中，并且在450nm处的吸光度(对应于A549细胞数)显示于表47中。
[表46]
[表47]
(实验实施例42：使用其他多糖的细胞增殖测试)
将迪特胶(KELCO CRETE DG-F,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至1.5％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.2％和0.3％(w/v)的终浓度添加迪特胶至含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由NISSUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有迪特胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将A549细胞悬浮于上述无迪特胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置3天进行培养。向培养3天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDOLaboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，证实含有其他多糖的本发明的培养基组合物的有效增殖。静置培养3天后在450nm处的吸光度(对应于A549细胞数)显示于表48中。
[表48]
(实验实施例43：使用多种抗癌药物的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.030％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶和以0.001、0.01、0.1、1μM的终浓度添加多种抗癌药物至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。所用的抗癌药物为阿霉素(由WAKO制造)、紫杉醇(由WAKO制造)、或丝裂霉素C(由WAKO制造)。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3474)的孔中。
作为无添加，将HeLa细胞悬浮于仅含有以0.030％(w/v)终浓度的脱酰基结冷胶的上述培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置7天进行培养。培养3、5、7天后，向培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。将培养5天后的含有细胞的培养基用移液器搅拌并将获得的搅拌后的溶液(20μL)与锥虫蓝染色剂0.4％(由Invitrogen制造,20μL)混合，并在显微镜下测量细胞密度。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，通过细胞增殖测试方法能够有效评价抗癌药物。此外，静置培养3、5、7天后在450nm处的吸光度(对应于HeLa细胞数)显示于表49中。5天后HeLa细胞的细胞密度显示于表50中。
[表49]
[表50]
(实验实施例44：人原代肝细胞的维持和功能测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％或0.030％(w/v)的终浓度将脱酰基结冷胶添加至添加有添加剂(HCM single Quots(注册商标),BSA-无脂肪酸,EGF,抗坏血酸,转铁蛋白,胰岛素,GA-1000,氢化可的松21半琥珀酸酯；Lonza Japan)的HBM培养基(由LonzaJapan制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将冷冻的人原代肝细胞(由Xenotech制造)以250000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔U形底超低粘附表面微量培养板(由SUMITOMO BAKELITE,PrimeSurface制造,#MS-9096U)的孔中。作为负对照，将人原代肝细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置3天进行培养。
1.测量活细胞数
向培养4小时、8小时和1天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，以测量活细胞的数目。
2.白蛋白分泌量的分析
培养3天后，回收含有肝细胞的培养基，并通过离心(400g,3min)回收培养上清液。使用Albumin ELISA Quantitation试剂盒(由Bethyl Laboratories制造)测量培养基中的人白蛋白的浓度。
3.通过实时PCR方法的mRNA表达分析
回收培养8小时后含有肝细胞的培养基，并通过离心(400g,3min)回收细胞。使用RNeasyMini试剂盒(由QIAGEN制造)从细胞中提取总RNA。使用总RNA和PrimeScript(注册商标)RT Master Mix(由Takara Bio Inc.制造)，使用GeneAmp PCR System 9700(由AppliedBiosystems制造)进行逆转录反应以合成cDNA。通过分散并用灭菌水稀释1/10获得作为用于PCR反应的每一cDNA样品。此外，作为待用于校正曲线的样品，使用分散并混合的cDNA，并以3倍公比设置在1/3至1/243稀释的定量范围内。使用每种cDNA样品、校正样品、Premix ExTaq(注册商标)(由Takara Bio Inc.制造)和多种Taqman探针(由Applied Biosystems制造)和7500Real-time PCR System(由Applied Biosystems制造)进行PCR反应。使用GAPDH的mRNA作为内源性对照计算特异性，并用GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的值校正每一mRNA的表达，并且负对照为100％。
所用的每一探针(由Applied Biosystems制造)显示于下文。
GAPDH:HS99999905
白蛋白：HS99999922
Cyp3A4:HS00604506
Cyp2C9:HS02383631
PXR(孕烷X受体):HS01114267
ApoA1(载脂蛋白A1):HS00163641。
结果是，证实本发明的培养基组合物具有维持人原代肝细胞处于分散状态和通过保护抑制活细胞数降低的作用。而且，证实培养基组合物显示比负对照更高的白蛋白产生能力和更高的与药代动力学相关的mRNA组表达能力。静置培养4小时、8小时、1天后在450nm处的吸光度(对应于人原代肝细胞数)显示于表51中。悬浮静置培养3天后培养上清液的白蛋白值显示于表52中。此外，基于作为100％的静置培养8小时后的负对照的每一mRNA表达值显示于表53中。当人原代肝细胞培养4小时时的细胞状态显示于图21中。
[表51]
[表52]
[表53]
(实验实施例45：食蟹猴原代肝细胞的维持和功能测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％或0.030％(w/v)的终浓度将脱酰基结冷胶添加至添加有添加剂(HCM single Quots(注册商标),BSA-无脂肪酸,EGF,抗坏血酸,转铁蛋白,胰岛素,GA-1000,氢化可的松21半琥珀酸酯；Lonza Japan)的HBM培养基(由LonzaJapan制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将冷冻的食蟹猴原代肝细胞(由Ina Research制造)以250000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔U形底超低粘附表面微量培养板(由SUMITOMO BAKELITE,PrimeSurface制造,#MS-9096U)的孔中。作为负对照，将食蟹猴原代肝细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置3天进行培养。
1.测量活细胞数
向培养4小时、8小时、1天和3天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDOLaboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，以测量活细胞的数目。
2.白蛋白分泌量的分析
培养3天后，回收含有肝细胞的培养基，并通过离心(400g,3min)回收培养上清液。使用Albumin ELISA Quantitation试剂盒(由Bethyl Laboratories制造)测量培养基中的人白蛋白的浓度。
3.通过实时PCR的mRNA表达分析
回收培养1、2、3天后含有肝细胞的培养基，并通过离心(400g,3min)回收细胞。使用RNeasy Mini试剂盒(由QIAGEN制造)从细胞中提取总RNA。使用总RNA和PrimeScript(注册商标)RT Master Mix(由Takara Bio Inc.制造)，使用GeneAmp PCR System 9700(由Applied Biosystems制造)进行逆转录反应以合成cDNA。通过分散并用灭菌水稀释1/10获得作为用于PCR反应的每一cDNA样品。此外，作为待用于校正曲线的样品，使用分散并混合的cDNA，并以3倍公比设置在1/3至1/243稀释的定量范围内。使用每种cDNA样品、校正样品、Premix Ex Taq(注册商标)(由Takara Bio Inc.制造)和多种Taqman探针(由AppliedBiosystems制造)和7500Real-time PCR System(由Applied Biosystems制造)进行PCR反应。使用GAPDH的mRNA作为内源性对照计算特异性，并用GAPDH的值修正每一mRNA的表达。
所用的每一探针(由Applied Biosystems制造)显示于下文。
GAPDH:Rh02621745
白蛋白：Rh02789672
ApoA1(载脂蛋白A1):Rh02794272。
结果是，证实本发明的培养基组合物通过保护食蟹猴原代肝细胞提供对活细胞数目降低的抑制性作用。而且，证实培养基组合物中培养的肝细胞显示比负对照更高的白蛋白产生能力和更高的白蛋白和ApoA1的mRNA组表达能力。静置培养4小时、8小时、1天、3天后在450nm处的吸光度(对应于食蟹猴原代肝细胞数)显示于表54中。静置培养3天后培养上清液的白蛋白值显示于表55中。此外，基于作为100％的负对照的静置培养2、3天后的白蛋白的mRNA表达值显示于表56中，并且ApoA1的mRNA表达值显示于表57中。当食蟹猴原代肝细胞培养4小时时的细胞状态显示于图22中。
[表54]
[表55]
[表56]
[表57]
(实验实施例46：胶原包被的微量培养板中肝细胞的维持和功能测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.015％或0.030％(w/v)的终浓度将脱酰基结冷胶添加至添加有添加剂(HCM single Quots(注册商标),BSA-无脂肪酸,EGF,抗坏血酸,转铁蛋白,胰岛素,GA-1000,氢化可的松21半琥珀酸酯；Lonza Japan)的HBM培养基(由LonzaJapan制造)中来制备培养基组合物。紧接着，将冷冻的食蟹猴原代肝细胞(由Ina Research制造)以100000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔胶原包被的微量培养板(由IWAKI制造,4860-010)的孔中。作为负对照，将食蟹猴原代肝细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置3天进行培养。
1.测量活细胞数
向培养1天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX190)在450nm下测量吸光度，以测量活细胞的数目。
2.待分泌的白蛋白的量的分析
培养3天后，回收含有肝细胞的培养基，并通过离心(400g,3min)回收培养上清液。使用Albumin ELISA Quantitation试剂盒(由Bethyl Laboratories制造)测量培养基中的人白蛋白的浓度。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，甚至当使用胶原包被的板时，培养基组合物中的原代肝细胞的保护抑制了活细胞数的降低。而且，证实培养基组合物比负对照显示更高的白蛋白产生能力。静置培养1天后在450nm处的吸光度(对应于食蟹猴原代肝细胞数)显示于表58中。此外，静置培养3天后培养上清液的白蛋白值显示于表59中。
[表58]
[表59]
(实验实施例47：用Happy Cell ASM培养基比较测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过将添加有添加剂(HCM single Quots(注册商标),BSA-无脂肪酸,EGF,抗坏血酸,转铁蛋白,胰岛素,GA-1000,氢化可的松21半琥珀酸酯；LonzaJapan)的HBM培养基(由Lonza Japan制造)与DMEM培养基(由WAKO制造)以1:1混合并以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。预先将Happy Cell ASM培养基(由biocroi制造)与DMEM培养基制备至给定浓度(以1:1混合)。紧接着，将冷冻的人原代肝细胞(由Xenotech制造)以250000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物或Happy Cell ASM培养基组合物中，并以200μL/孔分配至96孔U形底超低粘附表面微量培养板(由SUMITOMO BAKELITE制造)的孔中。作为负对照，将人原代肝细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置6天进行培养。
1.测量活细胞数
向培养2小时、4小时、8小时、1天、4天和6天后的培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDOLaboratories制造,20μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，以测量活细胞的数目。
结果是，证实本发明的培养基组合物与Happy Cell ASM相比时，在通过保护原代肝细胞抑制活细胞数的降低的作用上时优秀的。静置培养2小时、4小时、8小时、1天、4天、6天后在450nm处的吸光度(对应于人原代肝细胞数)显示于表60中。
[表60]
(实验实施例48：化合物对肝细胞的毒性测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。另一方面，将HepG2细胞与DMEM培养基(由WAKO制造)以100000个细胞/mL混合，并将细胞悬浮液以100μL/孔分散至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3474)的孔中。向上述含水的脱酰基结冷胶溶液中以各浓度加入曲格列酮(由WAKO制造,#71750)，并将该溶液添(10μL)加至上述细胞悬浮液(100μL)中。通过上述处理，制备具有0.18％(v/v)的DMSO浓度，20.0、40.0、60.0、100(μmol/L)的曲格列酮浓度和0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶浓度的细胞悬浮液。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置1天进行培养。
1.测量活细胞数
将培养1天后的培养基(50μL)分散至96孔滴定板(由Corning Incorporated制造)，向该培养基中加入Cell Titer-Glo(注册商标)试剂(由Promega制造,50μL)，并将混合物在室温下孵育10min。通过多板读数器(由Molecular Devices制造,FlexStation3)测量发光强度以测量活细胞数。
2.乳酸脱氢酶(LDH)活性测量
向培养1天后的培养基(100μL)中添加DMEM培养基(由WAKO制造,100μL)，并将板以440G离心15min。将上清液(100μL)分散至96孔滴定板(由Corning Incorporated制造)，加入细胞毒性检测试剂盒(由Roche Applied Science制造)中的反应混合物(100μL)，并将混合物在室温下避光放置30分钟。紧接着，根据上述试剂盒的方案，通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)测量在490nm处的吸光度，由此测量紊乱细胞的比例，即，细胞紊乱比(cell disorder rate)(％)。
结果是，证实使用本发明的培养基组合物，曲格列酮具有对肝细胞的细胞毒性。当培养1天后的无添加条件为1时，相对细胞数目和细胞紊乱比(％)显示于表61中。
[表61]
(实验实施例49：通过ATP定量方法使用A549的细胞增殖测试)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过以0.005％(w/v)、0.015％(w/v)或0.030％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶至含10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中来制备培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以100000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以100μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将A549细胞悬浮于上述无脱酰基结冷胶的培养基中并将悬浮液分散。紧接着，将该板在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置5天进行培养。向培养1、3和5天后的培养基中加入ATP试剂(100μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由MolecularDevices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。对于WST-8测量，向培养3天后的细胞中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,10μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，通过ATP测量方法也证实A549细胞当使用本发明的培养基组合物时有效地增殖。静置培养1、3和5天后的RLU值(ATP测量，发光强度)显示于表62中。静置培养3天后在450nm处的吸光度(WST-8)和RLU值(ATP测量，发光强度)显示于表63中。
[表62]
[表63]
(实验实施例50：使用抗癌药物在细胞增殖测试中用单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人宫颈癌细胞系HeLa以37000个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的多种抗癌药物以形成终浓度0.001-1μM和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和单独含有10倍浓度的多种抗癌药物的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养3天。所用的抗癌药物为阿霉素(由WAKO制造)、紫杉醇(由WAKO制造)、或丝裂霉素C(由WAKO制造)。在第4天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent CellViability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。对于WST-8测量，加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,15μL)，并将混合物在37℃下孵育100min。通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示丝裂霉素C的效力。静置培养的第4天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表64中。静置培养的第4天在450nm处的吸光度(WST-8测量)的％对照值显示于表65中。
[表64]
[表65]
(实验实施例51：使用诱导凋亡的试剂在细胞增殖测试中与单层培养方法的比较)将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人宫颈癌细胞系HeLa以37000个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的多种用于诱导凋亡的试剂以形成终浓度0.2-10μM和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和单独含有10倍浓度的多种用于诱导凋亡的试剂的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养3天。所用的用于诱导凋亡的试剂为Apoptosis Inducer组(由Merck Millipore制造,APT800:放线菌素D、喜树碱、环己酰亚胺、地塞米松、依托泊苷)。在第4天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。对于WST-8测量，加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,15μL)，并将混合物在37℃下孵育100min，通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)在450nm下测量吸光度，并通过单独减去培养基的吸光度测量活细胞的数目。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示喜树碱和依托泊苷的效力。静置培养的第4天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表66中。静置培养的第4天在450nm处的吸光度(WST-8测量)的％对照值显示于表67中。
[表66]
[表67]
(实验实施例52：使用曲美替尼和MK-2206在HeLa细胞增殖测试中与单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人宫颈癌细胞系HeLa以7400个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的多种抗癌药物以形成终浓度0.001-30μM和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和仅含有10倍浓度的多种抗癌药物的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养5天。所用的抗癌药物为曲美替尼(由Santa Cruz制造,MEK抑制剂)和MK-2206(由Santa Cruz制造,Akt抑制剂)。在第6天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)LuminescentCell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示MK-2206和曲美替尼的效力。静置培养的第4天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表68中。
[表68]
(实验实施例53：使用曲美替尼和MK-2206在A549细胞增殖测试中与单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以14800个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人肺癌细胞系A549以14800个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的多种抗癌药物以形成终浓度0.001-30μM和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和仅含有10倍浓度的多种抗癌药物的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养5天。所用的抗癌药物为曲美替尼(由Santa Cruz制造,MEK抑制剂)和MK-2206(由Santa Cruz制造,Akt抑制剂)。在第6天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)LuminescentCell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示MK-2206的效力。静置培养的第4天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表69中。
[表69]
(实验实施例54：在用人HB-EGF刺激的HeLa细胞的增殖作用中与单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人宫颈癌细胞系HeLa以37000个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的人HB-EGF(肝素结合EGF-样生长因子,由PEPROTECH制造)以形成终浓度10、30和100ng/ml和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和仅含有10倍浓度的人HB-EGF的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养7天。在第6天和第8天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的HeLa细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示人HB-EGF的细胞增殖促进作用。静置培养的第6天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表70中。静置培养的第8天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表71中。
[表70]
[表71]
(实验实施例55：在用人HB-EGF刺激的A549细胞的增殖作用中与单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中至14800个细胞/mL，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人肺癌细胞系A549以14800个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的人HB-EGF(由PEPROTECH制造)以形成10、30和100ng/ml的终浓度和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和仅含有10倍浓度的人HB-EGF的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养7天。在第6天和第8天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的A549细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示人HB-EGF的细胞增殖促进作用。静置培养的第6天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表72中。静置培养的第8天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表73中。
[表72]
[表73]
(实验实施例56：在用人HB-EGF刺激的A431细胞的增殖作用中与单层培养方法的比较)
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮于超纯水(Milli-Q水)中至0.3％(w/v)，并通过在90℃下加热搅拌来溶解。将该水溶液在高压灭菌器中在121℃下灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中以0.015％(w/v)的终浓度添加脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并且制备无脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人鳞状细胞癌细胞系A431(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种入添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。在单层培养方法中，将人鳞状细胞癌细胞系A431以37000个细胞/mL接种入无脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配至96孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3585)的孔中。将各板在CO2培养箱(37°,5％CO2)中保持静置进行培养。在培养第1天，将含有10倍浓度的人HB-EGF(由PEPROTECH制造)以形成10、30和100ng/ml的终浓度和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)、和仅含有10倍浓度的人HB-EGF的培养基组合物(单层培养组)各自以15μL加入，并将细胞连续培养7天。在第6天和第8天向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)以生成悬浮液，其在室温下放置约10min，并通过FlexStation3(由MolecularDevices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过单独减去培养基的发光值来测量活细胞数。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的A431细胞增殖测试方法相比于单层培养方法强烈显示人HB-EGF的细胞增殖促进作用。静置培养的第6天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表74中。静置培养的第8天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值显示于表75中。
[表74]
[表75]
(实验实施例57：在利用人HB-EGF刺激的SKOV3细胞的增殖活动中与单层培养方法的比较)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有15％(v/v)胎牛血清的McCoy’s 5a培养基(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中加入终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并制备没有脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人卵巢癌细胞系SKOV3(由DSPHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3474)中。在单层培养方法中，将人卵巢癌细胞系SKOV3以37000个细胞/mL接种到没有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3585)的孔中。通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静止来培养每一个平板。在培养的第1天，各自加入15μL含有10倍浓度的人HB-EGF(由PEPROTECH制造)以产生10、30和100ng/ml终浓度和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)，和仅含有10倍浓度的人HB-EGF的培养基组合物(单层培养组)，并将细胞连续培养8天。在第6天和第9天，向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下放置约10分钟，并且通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物的SKOV3细胞增殖测试方法与单层培养方法相比强烈地显示人HB-EGF的细胞增殖促进作用。在表76中显示了在静置培养的第6天RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值。在表77中显示了在静置培养的第9天RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值。
[:表76]
[表77]
(实验实施例58：在利用人HB-EGF刺激的HeLa细胞的VEGF mRNA表达中与单层培养方法的比较)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)中加入终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并制备没有脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人宫颈癌细胞系HeLa(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)中。在单层培养方法中，将人宫颈癌细胞系HeLa以37000个细胞/mL接种到没有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3585)的孔中。通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静止来培养每一个平板。在培养的第1天，各自加入15μL含有10倍浓度的人HB-EGF(由PEPROTECH制造)以产生10、30和100ng/ml终浓度和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)，和仅含有10倍浓度的人HB-EGF的培养基组合物(单层培养组)，并将细胞连续培养6天。第7天回收含有癌细胞的培养基，并通过离心(400g,3分钟)回收所述细胞。通过使用RNeasy Mini试剂盒(由QIAGEN制造)从细胞中提取总RNA。使用总RNA和PrimeScript(注册商标)RT MasterMix(由Takara Bio Inc.制造)，使用GeneAmp PCR System 9700(由Applied Biosystems制造)进行逆转录反应，并合成cDNA。分配用于PCR反应的每一cDNA样品并用灭菌水将其稀释至1/10。此外，用于校准曲线的样品是以3倍公比在1/3-1/243稀释的定量范围内分配和混合，并调整的cDNA。使用各cDNA样品、校正样品、Premix Ex Taq(注册商标)(由Takara BioInc.制造)和多个Taqman探针(由Applied Biosystems制造)，和7500实时PCR系统(由Applied Biosystems制造)进行PCR反应。使用GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)的mRNA作为内源对照，利用GAPDH的值修正VEGF(血管内皮生长因子)mRNA的表达，并使用负对照作为100％来计算特异性。在下文中显示了所用的每一个探针(由Applied Biosystems制造)。
GAPDH:HS99999905
VEGF:HS00173626。
结果是，发现使用本发明的培养基组合物培养的HeLa细胞与单层培养方法相比强烈地显示人HB-EGF对VEGF的mRNA表达促进作用。此外，在表78中显示了当在静置培养的第7天负对照是100％时VEGF mRNA的表达值。
[表78]
(实验实施例59：吉非替尼(Gefinitib)对人HB-EGF刺激的A549细胞的细胞增殖的影响)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(由WAKO制造)中加入终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并制备没有脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人肺癌细胞系A549(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以14800个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静止来培养每一个平板。在培养的第1天，为各抗癌药物制备终浓度0.1-30μm并为人HB-EGF制备终浓度0ng/ml或100ng/ml，各自加入15μL含有10倍浓度的各抗癌药物、人HB-EGF(由PEPROTECH制造)和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)，并将细胞连续培养5天。所用的抗癌药物是吉非替尼(由Santa Cruz制造,EGF受体抑制剂)。在第6天，向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下静置约10分钟，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。
结果是，根据使用本发明的培养基组合物和人HB-EGF的A549细胞增殖测试方法，添加有HB-EGF的培养条件显示吉非替尼的更强抑制效果。在表79中显示了在静置培养的第6天RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值。
[表79]
(实验实施例60：吉非替尼(Gefinitib)、厄洛替尼对利用人HB-EGF刺激的A431细胞的生长增殖活动的影响)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中加入终浓度为0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物，并制备没有脱酰基结冷胶的培养基组合物。紧接着，将人鳞状细胞癌细胞系A431(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以37000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以135μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置来培养每一个平板。在培养的第1天，为各抗癌药物制备终浓度0.1-30μm并为人HB-EGF制备终浓度0ng/ml或100ng/ml，各自加入15μL含有10倍浓度的各抗癌药物、人HB-EGF(由PEPROTECH制造)和终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(脱酰基结冷胶添加组)，并将细胞连续培养7天。所用的抗癌药物是吉非替尼(由Santa Cruz制造,EGF受体抑制剂)和厄洛替尼(由Santa Cruz制造,EGF受体抑制剂)。在第4、6和8天，向培养基中加入ATP试剂(150μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下静置约10分钟，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。
结果是，通过将本发明的培养基组合物和人HB-EGF组合的培养方法，在低粘附培养条件下观察到A431细胞增殖。此外，通过将本发明的培养基组合物和人HB-EGF组合的A431细胞增殖测试方法，可以评价吉非替尼和厄洛替尼对HB-EGF诱导的细胞增殖的抑制效果。对于人HB-EGF生长促进活动，在表80中显示了静置培养的第4天、第6天、第8天的RLU值(ATP测量，发光强度)。此外，对于各抗癌药物对人HB-EGF增殖促进活动的作用，在表81中显示了第4天、第8天的RLU值(ATP测量，发光强度)的％对照值。
[表80]
[表81]
(实验实施例61：通过分散MCF-7细胞的细胞增殖测试)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(由DS PHARMABIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中加入终浓度为0.005％(w/v)或0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。紧接着，将人乳腺癌细胞系MCF-7(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以50000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以100μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将MCF-7细胞悬浮在没有脱酰基结冷胶的上述培养基中并分配所述悬浮液。紧接着，通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置来培养该平板5天。在培养2天和5天后，向培养基中加入ATP试剂(100μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent CellViability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下放置约10分钟，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。对于WST-8测量，在培养2天和5天后，向细胞中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,10μL)，并将混合物在37℃下温育100分钟，通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)测量450nm处的吸光度，并通过减去单独培养基的吸光度来测量活细胞的数量。
结果是证实，使用本发明的培养基组合物，根据ATP测量方法和WST-8测量方法，MCF-7细胞有效增殖。在表82中显示了静置培养2、5天后的RLU值(ATP测量，发光强度)。在表83中显示了静置培养2、5天后450nm(WST-8)的吸光度。在图23中显示了培养5天后MCF-7细胞的聚集体的显微观察结果。
[表82]
[表83]
(实验实施例62：当A375细胞和MNNG/HOS细胞分散时的细胞增殖测试)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基或EMEM培养基(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)中加入终浓度为0.005％(w/v)或0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。紧接着，将各人黑色素瘤细胞系A375(由ATCC制造)和人骨肉瘤癌细胞系MNNG/HOS(由ATCC制造)以50000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以100μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由Corning Incorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将A375细胞和MNNG/HOS细胞悬浮在没有脱酰基结冷胶的上述培养基中并分配所述悬浮液。紧接着，通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置来培养该平板4天。在培养4天后，向培养基中加入ATP试剂(100μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下放置约10分钟，并通过FlexStation3(由MolecularDevices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。在培养4天后，向培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,10μL)，并将混合物在37℃下温育100分钟，通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRAMAX 190)测量450nm处的吸光度，并通过减去单独培养基的吸光度来测量活细胞的数量。
结果是证实，使用本发明的培养基组合物，可以以均匀分散的状态培养A375细胞和MNNG/HOS细胞，而不形成具有过大尺寸的细胞聚集体，并且在培养基组合物中有效增殖。在图24中显示了培养4天后A375细胞和MNNG/HOS细胞的聚集体的显微观察结果。此外，在A375细胞中，在表84中显示了静置培养4天后450nm处的吸光度(WST-8)和RLU值(ATP测量，发光强度)。在MNNG/HOS细胞中，在表85中显示了静置培养4天后450nm处的吸光度(WST-8)和RLU值(ATP测量，发光强度)。
[表84]
[表85]
(实验实施例63：通过分散MIAPaCa-2细胞的细胞增殖测试)
在超纯水(Milli-Q水)中将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)悬浮至0.3％(w/v)，并在90℃加热的情况下搅拌溶解。将该水溶液在高压灭菌器中121℃灭菌20分钟。使用该溶液，通过向含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中加入终浓度为0.005％(w/v)或0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶来制备培养基组合物。紧接着，将人胰腺癌细胞系MIAPaCa-2(由ATCC制造)以50000个细胞/mL接种到添加有脱酰基结冷胶的上述培养基组合物中，并以100μL/孔分配到96孔平底超低粘附表面微量培养板(由CorningIncorporated制造,#3474)的孔中。作为负对照，将MIAPaCa-2细胞悬浮在没有脱酰基结冷胶的上述培养基中并分配所述悬浮液。紧接着，通过在CO2培养箱(37℃,5％CO2)中保持静置6天来培养该平板。在培养6天后，向培养基中加入ATP试剂(100μL)(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay,由Promega制造)，以产生悬浮液，其在室温下放置约10分钟，并通过FlexStation3(由Molecular Devices制造)测量发光强度(RLU值)，并通过减去单独培养基的发光值来测量活细胞的数量。在培养6天后，向培养基中加入WST-8溶液(由DOJINDO Laboratories制造,10μL)，并将混合物在37℃下温育100分钟，通过吸光度分光计(由Molecular Devices制造,SPECTRA MAX 190)测量450nm处的吸光度，并通过减去单独培养基的吸光度来测量活细胞的数量。
结果是证实，使用本发明的培养基组合物，可以以均匀分散的状态培养MIAPaCa-2细胞，而不形成具有过大尺寸的细胞聚集体，并且在培养基组合物中有效增殖。在图25中显示了培养6天后MIAPaCa-2细胞的聚集体的显微观察结果。此外，在表86中显示了静置培养4天后MIAPaCa-2细胞在450nm处的吸光度(WST-8)和RLU值(ATP测量，发光强度)。
[表86]
(实验实施例64：含脱酰基结冷胶的培养基的浓缩和稀释)
将以实验实施例2中相同方式制备的含有0.015％(w/v)脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造)的DMEM培养基(由WAKO制造)以10mL分配到15mL离心管(由VIOLAMO制造)中，并通过在悬臂旋转器LC-200(由TOMY SEIKO Co.,Ltd.制造)中离心(700G，5min)沉淀所述脱酰基结冷胶。通过抽吸器去除上清液(8mL)，由此浓缩含有脱酰基结冷胶的培养基。此外，向该浓缩的培养基中加入没有脱酰基结冷胶的DMEM培养基(由WAKO制造)，并且通过吹吸混合，以产生具有任选浓缩率的培养基。
另一方面，将人肝癌细胞HepG2(由DS PHARMA BIOMEDICAL CO.,LTD.制造)以500000个细胞/mL悬浮在含有10％(v/v)胎牛血清(由WAKO制造)的DMEM培养基中，将该悬浮液(10mL)接种到EZ SPHERE(由ASAHI GLASS CO.,LTD.制造)中，并且将细胞在37℃,CO2培养箱(5％CO2)中培养7天。在本文中，将所获得的球(直径100-200μm)的悬浮液(10mL)离心(200G,5分钟)，以允许沉淀，并且去除上清液，以制备球悬浮液(1.0mL)。向制备成上述任选浓度的培养基中加入100μL的该球悬浮液，并通过吹吸分散球并在37℃下温育，并且1小时后目视观察该球的分散状态。在表87中显示了结果。
如表87中所示，在制备为培养基组合物后，可以将脱酰基结冷胶浓缩和稀释到任选的浓度。证实以这种方式浓缩和稀释的培养基组合物具有球的悬浮效果。
[表87]
(实验实施例65：含脱酰基结冷胶的DMEM/Ham’s F12培养基的产生)
在纯水(72mL)中悬浮脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA,由SANSHO Co.,Ltd.制造,120mg)，并通过在90℃下加热搅拌溶解。向其中加入纯水，以制备脱酰基结冷胶的0.017％(w/v)溶液(720mL)，并使用除菌滤器(孔径0.22μm)灭菌所述溶液。另一方面，向含有等量DMEM/Ham’s F12(Life Technologies Corporation)的混合粉剂培养基和碳酸氢钠的培养基中加入对应于为制备培养基推荐的1/10量的纯水，以制备10倍浓度的80mL水溶液，并且使用除菌滤器(孔径0.22μm)灭菌所述溶液。这在25℃灭菌条件下搅拌混合，以制备具有0.015％(w/v)脱酰基结冷胶浓度的目标培养基(800mL)。
工业实用性
本发明的培养基组合物显示悬浮细胞和/或组织的优良效果，并且对于大规模培养来源于动物和植物的细胞和/或组织同时维持其功能极其有用。此外，通过本发明的方法培养的细胞和/或组织对化学物质、药品等的效力和毒性评估、大规模产生有用的物质如酶、细胞生长因子、抗体等，和在用于补充由于疾病和缺乏而损失的器官、组织和细胞的再生医学领域中极其有用。
本申请基于在日本提交的专利申请号2012-164227(提交日期:2012年7月24日)、2012-263801(提交日期:2012年11月30日)、2013-017836(提交日期:2013年1月31日)，其内容以其整体并入本文。

Claims (20)

1.抗癌药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下、在液体状态的培养基组合物中培养癌细胞的步骤，所述培养基组合物能够以悬浮状态培养癌细胞，并且包含脱酰基结冷胶或其盐；和
(b)测量所述癌细胞的增殖的变化的步骤。
2.权利要求1的方法，其特征在于，进一步包括，选择与所述测试物质不存在的情况相比抑制所述癌细胞增殖的物质作为候选物质的步骤。
3.评价作用于肝细胞的药品候选物质的活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下、在液体状态的培养基组合物中培养肝细胞的步骤，所述培养基组合物能够以悬浮状态培养肝细胞，并且包含脱酰基结冷胶或其盐；和
(b)测量所述肝细胞的生理功能的变化的步骤。
4.权利要求3的方法，其特征在于，进一步包括，选择与所述测试物质不存在的情况相比抑制或增加所述肝细胞的生理功能的物质的步骤。
5.评价作用于肝细胞的药品候选物质的效力或毒性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)在测试物质存在的情况下和在其不存在的情况下、在液体状态的培养基组合物中培养肝细胞的步骤，所述培养基组合物能够以悬浮状态培养肝细胞，并且包含脱酰基结冷胶或其盐；和
(b)分析所述肝细胞的生理功能的变化的步骤。
6.用于癌细胞培养基的添加剂，其包含脱酰基结冷胶或其盐、或者迪特胶或其盐。
7.权利要求6的添加剂，其在癌细胞的培养中促进癌细胞的增殖。
8.权利要求6的添加剂，其用于评价抗癌药物的抗癌活性。
9.用于癌细胞的培养基组合物，其包含权利要求6-8中任一项的添加剂。
10.培养癌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求6-8中任一项的添加剂存在的情况下或在权利要求9的培养基组合物中培养癌细胞。
11.评价抗癌药物对癌细胞的活性的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求6-8中任一项的添加剂存在的情况下或在权利要求9的培养基组合物中培养癌细胞。
12.权利要求11或12的方法，其特征在于，所述癌细胞在用于所述癌细胞的培养基组合物中形成细胞聚集体。
13.权利要求11或12的方法，其特征在于，用于培养所述癌细胞的培养容器抑制癌细胞的附着。
14.用于肝细胞培养基的添加剂，其包含脱酰基结冷胶或其盐、或者迪特胶或其盐。
15.权利要求14的添加剂，其在肝细胞的培养中抑制肝细胞数目的降低。
16.权利要求14的添加剂，其用于评价药品和药品候选药物对肝细胞的作用。
17.用于肝细胞的培养基组合物，其包含权利要求14-16中任一项的添加剂。
18.评价药品和药品候选药物对肝细胞的活性的方法，其特征在于，所述方法包括在权利要求14-16中任一项的添加剂存在的情况下或在权利要求17的培养基组合物中培养肝细胞。
19.权利要求18的方法，其特征在于，所述肝细胞在用于所述肝细胞的培养基组合物中形成细胞聚集体。
20.权利要求18的方法，其特征在于，用于培养所述肝细胞的培养容器抑制肝细胞的附着。
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