TWI750204B - 液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置 - Google Patents

液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置，前述製造方法為將含有特定化合物之第1液體A1及含有連結物質之第2液體B1混合，以製造液狀之培養基組成物之方法，該方法係使用前述製造裝置而實施。該製造裝置具有於壁部設置有至少2個開口部2、3之容器1，前述2個開口部藉由容器外之管體4互相連接，該管體具有於蠕動泵5可作為泵管安裝之形狀及具備柔軟性的部分。該製造方法為使蠕動泵運轉，使第1液體與第2液體循環、混合，於容器內形成目的之液狀的培養基組成物。

Description

液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置
本發明係有關液狀之培養基組成物之製造方法及為了實施該製造方法而使用之製造裝置。更詳言之，本發明係有關為了形成上述培養基組成物，將需混合之至少2種液體(含有特定化合物之第1液體及含有將該特定化合物彼此連結形成構造物的物質之第2液體)適當地混合，製造分散有上述構造物之培養基組成物之製造方法，及為了實施該製造方法而較佳使用之製造裝置。
近年來，正在發展用以使於動物、植物體內擔任不同任務之各種器官、組織及細胞在生物體外增殖或維持之技術。將該等器官、組織於生物體外增殖或維持，係分別稱為器官培養、組織培養，而將從器官、組織分離之細胞在生物體外增殖、分化或維持，係稱為細胞培養。
細胞培養為將經分離之細胞於培養基中進行在生物體外的增殖、分化或維持之技術，為了詳細解析生物體內 的各種器官、組織、細胞之功能及構造，此技術乃是不可或缺的。
而且，藉由該技術培養之細胞及/或組織，係被利用於評估化學物質、醫藥品等之藥效及毒性，大量生產酵素、細胞增殖因子、抗體等有用物質，補充因疾病、缺損而失去的器官、組織、細胞之再生醫療，改良植物品種，基因改造產物之作成等各種領域。
作為用於培養細胞等(器官、組織、細胞)之培養基之一，可列舉液體培養基，本發明人等已成功的開發可將細胞等以懸浮狀態培養之液狀培養基組成物(專利文獻1及2)。
於專利文獻1中記載之液狀培養基組成物，為將特定之化合物(尤其是具有陰離子性官能基之高分子化合物)經由2價金屬陽離子等聚集，成為不定形之構造物，該構造物為於液體培養基係呈分散、懸浮之狀態。以下，所謂具有陰離子性官能基之高分子化合物等之上述特定化合物，亦稱為「特定化合物」，將該特定化合物彼此連結之2價金屬陽離子等物質亦稱為「連結物質」。
該培養基組成物，係成為不伴隨有引起細胞等的障害或、喪失功能之風險的振動、旋轉等操作，可將細胞等以懸浮狀態進行培養之較佳的液狀培養基。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2014/017513號
[專利文獻2]美國專利申請公開第2014/0106348A1號說明書
上述專利文獻1中記載之液狀培養基組成物原本意欲之較佳狀態為特定化合物彼此經由2價金屬陽離子等連結物質連結，所形成之構造物呈均勻分散於液體培養基中之狀態。
然而，本發明人等對於該液狀培養基組成物之實際製作步驟進行詳細檢討時得知，為了獲得該種較佳狀態，必需留意混合方法、混合條件，以使構造物不會不均勻地形成在培養基組成物中的局部。
例如，特定化合物為去醯化結蘭膠時，該去醯化結蘭膠在與液體培養基混合時，經由液體培養基中之連結物質(例如，鈣離子)而形成不定形構造物，並以此構造物作為使細胞等懸浮之載體。
但是，將含有連結物質之液體培養基於進行攪拌同時注入含有特定化合物的液體之混合方法，係有可能會產生因為兩種液體與外部氣體接觸，而外部氣體中之細菌混入培養基中的問題。
而且，已知在將含有連結物質之液體培養基收容於容器內，並於容器注入含有高濃度特定化合物的液體之混合方法中，於兩種液體合流之瞬間，特定化合物與連結物質 連接而成為構造物，藉此，該構造物成為於混合液中以繩狀長長地連接且懸浮之狀態(或是繩狀之構造物纏繞成塊狀之狀態)，而有無法成為原本意欲之均勻分散狀態之情形。而且，已知該種狀態即使在以較高速度進行攪拌時仍會發生。而且，已知當於液體培養基中一旦形成該種繩狀之構造物，則形成分子鏈之雙螺旋會互相經由連結物質(例如鈣離子)而形成牢固之三維網絡，而且就該構造物之性質而言，係難以將之切成細段並使分散於母料中。
因此，為了獲得較佳地分散有目的之構造物之混合液，需要能夠使兩種液體以高速接觸之特殊攪拌裝置，但該種特殊攪拌裝置之攪拌作用，一般而言，多有只對於約3L(L表示公升)以下之少量液體有效之限制，因此亦知不適用於要大量(例如，20L以上等)地製造較佳分散有上述構造物之混合液。
本發明之目的為提供液狀之培養基組成物之製造方法，及為了實施該製造方法而較佳使用之製造裝置；前述液狀之培養基組成物之製造方法可解決上述問題，能將含有2價金屬陽離子等連結物質之任意液體與含有特定化合物之液體進行無菌混合，且可大量地獲得分散有微細構造物之液狀之培養基組成物。
可達成前述目的之本發明之主要構成如以下所述。
〔1〕一種液狀之培養基組成物之製造方法，其係將含有下 述(i)之特定化合物之第1液體與含有下述(ii)之連結物質之第2液體混合，製造液狀之培養基組成物之方法；使用於壁部設置有至少2個開口部之容器，其中，上述之至少2個開口部藉由容器外之管體互相連接，該管體具有於蠕動泵可作為泵管安裝之形狀及具備柔軟性的部分，將前述管體安裝於前述蠕動泵，使該蠕動泵運轉，使前述第1液體與第2液體在前述管體與前述容器之間循環、混合，於容器內形成分散有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成之構造物之液狀培養基組成物。
(i)特定化合物，其可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物，為具有陰離子性官能基之高分子化合物。
(ii)連結物質，為2價金屬陽離子。
〔2〕如前述〔1〕所述之液狀培養基組成物之製造方法，其中，前述(i)之特定化合物為去醯化結蘭膠，第1液體為含有該去醯化結蘭膠之水溶液；前述(ii)之連結物質為鈣離子及鎂離子中之一者或兩者，第2液體為含有鈣離子及鎂離子中之一者或兩者之液體培養基之濃縮液。
〔3〕如前述〔2〕所述之液狀培養基組成物之製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的去醯化結蘭膠之濃度為0.001%(w/v)至1.0%(w/v)。
〔4〕如前述〔1〕至〔3〕中任一項所述之液狀培養基組成 物之製造方法，其中，第1液體與第2液體之體積混合比率，係相對於第1液體之體積100，第2液體之體積為50至200。
〔5〕如前述〔1〕至〔4〕中任一項所述之製造方法，其中，前述一開口部係設置於構成前述容器的底面之壁部或構成前述容器的側面之壁部的底部以作為出口，前述之另一開口部係設置於構成前述容器上面之壁部或構成側面壁部之上部以作為入口，使前述蠕動泵運轉，將第1液體與第2液體在管體內以從前述出口往前述入口之方向使該等液體移動，藉此使容器內之第1液體與第2液體從上方往下方之方向移動。
〔6〕如前述〔1〕至〔5〕中任一項所述之製造方法，其中，前述2個開口部係以出口及入口為1對，前述容器中係設置複數對之前述2個開口部，各對之2個開口部係分別以管體連接；於前述第2步驟中，將各個管體安裝於個別之蠕動泵，使該蠕動泵運轉，使前述第1液體與第2液體經由各管體循環。
〔7〕如前述〔1〕至〔6〕中任一項所述之製造方法，其中，前述容器係由能夠配合該容器內部所收容之液體的體積而改變該容器的容積之柔軟的材料所形成，藉此，可確保該容器內之密閉性，同時還可於該容器內注入液體，且可將液體排出到該容器外。
〔8〕如前述〔1〕至〔7〕中任一項所述之製造方法，其中， 於前述容器設置有該容器內的液體出入所使用之出入口用之開口部，於前述容器中先注入第1液體與第2液體中之任一液體後，以前述蠕動泵使該液體循環，同時將另一液體從前述出入口用之開口部注入至容器內。
〔9〕一種製造裝置，其係用以實施前述〔1〕所述之液狀培養基組成物之製造方法而使用之製造裝置，該製造裝置具有用以收容於前述製造方法中混合之第1液體及第2液體之容器，於該容器之壁部至少設置2個開口部，該等開口部藉由容器外之管體互相連接，前述管體具有：於以運送該管體內之液體的方式構成之蠕動泵可作為泵管安裝，且具有於該蠕動泵可作為泵管運轉之形狀及具備柔軟性的部分。
〔10〕如前述〔9〕所述之製造裝置，其中，前述一開口部係設置於構成前述容器的底面之壁部或構成前述容器的側面的壁部之底部，前述另一開口部設置於構成前述容器的上面之壁部或構成前述容器的側面之壁部之上部。
〔11〕如前述〔9〕或〔10〕所述之製造裝置，其中，前述2個開口部係以出口與入口為1對，於前述容器係設置複數對之前述2個開口部，於各對之2個開口部分別以管體連接。
〔12〕如前述〔9〕至〔11〕中任一項所述之製造裝置，其 進一步具有前述蠕動泵作為該製造裝置之構成要件，該蠕動泵為安裝前述管體以將之作為泵管運轉者。
〔13〕如前述〔12〕所述之製造裝置，其中，前述一開口部係設置於構成前述容器的底面之壁部或構成側面之壁部之底部，前述另一開口部係設置於構成前述容器的上面之壁部或構成側面之壁部之上部，使前述蠕動泵以使上述管體內之液體以從下側之開口部往上側之開口部移動之方式運轉而構成，藉此，容器內所收容之液體係從上方往下方移動。
〔14〕如前述〔9〕至〔13〕中任一項所述之製造裝置，其中，前述容器係由能夠配合該容器內部所收容之液體之體積而改變該容器的容積之柔軟的材料所形成，藉此，可確保該容器內之密閉性，同時還可於該容器內注入液體，且可將液體排出到該容器外。
〔15〕如前述〔9〕至〔14〕中任一項所述之製造裝置，其中，於前述容器進一步設置有該容器內的液體出入所使用之出入口用之開口部。
根據本發明之製造方法(以下，亦稱為該製造方法)，藉由蠕動泵5對於第1圖管體4之作用，可使第1液體與第2液體以[從容器出來到管體，通過該管體，回到原來之容器]之封閉路徑循環。藉由該封閉路徑之循環，可使兩種液體以不與外部氣體等污染源接觸，且容器不與管 體(包含用以連接該等之連接器零件)以外之其他構件接觸地進行混合。
以下，藉由蠕動泵之運轉，容器內之液體係循環進行「從一開口部流向管體內，通過該管體，從另一開口部再流回該容器內」之移動，此移動也稱為[液體在容器與管體之間進行循環]，亦稱為[液體進行循環]。
而且，根據該製造方法，可以無菌且效率良好地製造兩種液體合計高達100L之大量的液狀培養基組成物。
而且，本發明之製造裝置(以下，亦稱為該製造裝置)藉由具有容器及管體形成之構成，而可實施該製造方法，並可以無菌且大量的進行混合。尤其，只要將由柔軟之合成樹脂等有機高分子材料所成之袋狀物作為容器，即可以低價格之袋狀物及管體構成裝置整體，故可以在每次混合使用後丟棄。藉此，容器內、管體內不需洗淨，而且容器內、管體內之無菌性更為提高。
又且，該製造裝置雖然為必需含有蠕動泵之裝置，但是只需將管體安裝於蠕動泵之驅動部分，不需一體化地連結。因此，具有容器及管體所成之循環路徑相關之主要部分可於每次混合使用後丟棄，容器內或管體內不需洗淨。
1‧‧‧容器
1a、1b‧‧‧端面
2、2a、2b、3、3a、3b‧‧‧開口部
4、41、42、43、44、45、4a、4b‧‧‧管體
5、5a、5b‧‧‧蠕動泵
6、6a、6b、6c‧‧‧開口部
7、7a、7b‧‧‧外部容器
11a‧‧‧外周壁面
12‧‧‧臂
13‧‧‧滾子
14‧‧‧旋轉軸
A1‧‧‧第1液體
B1‧‧‧第2液體
C1、C2、C3、C4‧‧‧無菌連接器
第1圖係概略性表示本發明之製造方法及製造裝置之圖。
第2圖係表示本發明之製造裝置之構成例之圖。
第3圖係表示本發明之製造裝置之另一構成例之圖。
第4圖係表示本發明之製造裝置之另外的構成例之圖。第4圖(a)表示容器之一端面。第4圖(b)表示容器之另一端面。第4圖(c)為表示製造裝置整體的連接構造之塊解圖，表示斜視容器之圖。第4圖(c)係將隱藏部分以虛線表示，用以於該隱藏部分附予符號之指線亦使用虛線。
第5圖係表示本發明之製造方法及製造裝置中使用之蠕動泵的構造之一例之圖。
第6圖係表示於本發明之實施例，用以評估所製造之液狀培養基組成物的混合狀態之判定基準之示意圖。
以下，詳細說明本發明之製造方法，並提及本發明之製造裝置，並且就該製造裝置之構造加以詳細說明。
本發明之製造方法，係將含有下述(i)之特定化合物之第1液體與含有下述(ii)之連結物質之第2液體進行混合，製造液狀培養基組成物之方法。該等特定化合物、連結物質及含有各者之第1液體、第2液體係詳述於後。
(i)特定化合物，其可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物，為具有陰離子性官能基之高分子化合物。
(ii)連結物質，為2價金屬陽離子。
該製造方法如第1圖所例示，係使用於壁部設置有至少2個開口部2、3之容器1。前述之至少2個開口部2、3 藉由容器外之管體4互相連接，該管體4係具有於蠕動泵5可作為泵管安裝之形狀及具備柔軟性的部分來作為該管體之一部分或全部者。
第1圖雖未描繪容器1內之液體明確地分離為第1液體A1及第2液體B1，惟係對於容器內之液體賦予符號A1、B1，以提示第1液體A1與第2液體B1於混合途中。
前述容器1之壁部係設置至少2個的開口部2、3，該等至少2個的開口部2、3係藉由於容器1外側之管體4互相連接。該管體4係具有於蠕動泵5可作為泵管安裝並發揮功能之形狀及柔軟性。第1圖中對於蠕動泵5之詳細構造並未加以圖示，而係藉由虛線提示該蠕動泵之存在。該蠕動泵5可包含作為本發明製造裝置之一部分，亦可為外部裝置。
該製造方法如第1圖所示，於蠕動泵5安裝管體4。亦即，將該管體4接合於蠕動泵5，使該管體4成為蠕動泵5之泵管。然後，使該蠕動泵4運轉，使第1液體A1與第2液體B1於容器1與管體4之間循環，藉由該循環，將兩種液體攪拌、混合，形成液狀之培養基組成物。於充分攪拌、混合有兩種液體之液狀培養基組成物中，特定化合物藉由連結物質連結而形成之構造物係均勻地分散，為適合將細胞等以懸浮狀態進行培養者。
藉由該製造方法，如上所述，可處理兩種液體合計會達到1000L或超過1000L之任意的大量之第1液體A1及第2液體B1，而且不與外部氣體等污染源接觸，可以簡單 之操作將兩種液體充分混合。
本發明之製造裝置為用於實施上述本發明之製造方法之裝置。該製造裝置如第1圖所示，具有用以收容該製造方法所混合之第1液體A1與第2液體B1之容器1。該容器1之壁部設置至少2個開口部2、3，該等至少2個的開口部係藉由容器外之管體4互相連接，藉此，形成可將收容於容器1內之液體從一開口部2流出，並通過該管體4從另一開口部3回到上述容器1內之循環流徑。該管體4具有以能夠運送該管體內之液體的方式構成之可安裝於蠕動泵5之泵管之特性。將該管體安裝於蠕動泵，並使該蠕動泵運轉，藉此，容器內之液體不與外部氣體等污染源接觸，在容器1與管體4之間循環，並充分混合，可獲得目的之液狀培養基組成物。
本發明之製造方法及本發明之製造裝置中可利用之上述容器1，較佳為由可不影響第1液體及第2液體並加以收容之材料組成者。
該容器之容積並無特別限制，容積若大，則本發明之可將兩種液體大量混合之優點變得顯著。該容器之較佳容積並無特別限制，只要視要求而適當決定即可，例如可例示：100L至1000L左右之用以大量生產通常之細胞培養用之液體培養基的較佳容積。
上述容器1之材料並無特別限制，可列舉例如硬質或軟質之有機高分子材料(尤其是合成樹脂材料等)、玻璃、金屬等。硬質或軟質之有機高分子材料可為板 狀物，亦可為薄膜。前述之板狀物和薄膜可為由單一材料所成者(單層品)，亦可如後所述，為包含由互不相同之材料所成之層的多層構造(2層以上)。
容器1之形狀亦無特別限制，可為例如立方體、長方體、圓柱體、具有由軟質之有機高分子材料製造之薄膜所成的壁面之袋狀物(例如，2張薄膜之外周緣部互相接合之袋狀物，具有底面及側面之袋狀物，具有上面、底面及側面之袋狀物等)等。
容器1只要是由軟質之有機高分子材料製造之薄膜等所成之柔軟袋狀物，即可獲得如下述表示之(a)至(c)之較佳作用。
(a)於最初將第1液體或第2液體注入至容器1之前，可使該容器收縮以去除內部之空氣。容器1可隨著液體注入而膨漲，因此注入的液體不會與空氣接觸。
(b)可使該容器收縮，同時以不與空氣接觸之方式，將藉由循環而第1液體與第2液體經充分混合之混合物(液狀之培養基組成物)從該容器1取出到外部容器。
(c)容器1只要是由軟質之有機高分子材料製造之薄膜等所成之柔軟袋狀物，即能以低價格獲得該容器，因此可在每次混合使用後將該容器與管體丟棄，得以省略洗淨該製造裝置內部之工序，並且能更為提高容器及管體內之無菌性。
由如前述之軟質有機高分子材料製造之薄膜形成之柔軟袋狀物可列舉與以往公知之細胞培養用之袋體 相同袋體。作為構成該種細胞培養用之柔軟袋體壁部之薄膜材料，可列舉例如：乙烯/乙酸乙烯酯共聚樹脂(EVA樹脂)、聚乙烯系樹脂、聚丙烯系樹脂、聚胺基甲酸酯系樹脂、聚酯系樹脂、聚醯胺系樹脂、氯乙烯系樹脂等。薄膜為多層構造時，各層之材料只要對應功能而適當選擇即可。例如，若為3層構造，則可例示(聚對苯二甲酸乙二酯層(內層)/聚乙烯層(中間層)/尼龍層(外層))之組合。
該壁部的薄膜之厚度並無特別限制，通常為50μm至150μm左右，較佳為100μm左右。
前述柔軟袋狀物之整體性形態，可例示：2張薄膜之外周緣部互相接合之袋狀物，具有底面及側面之袋狀物，具有上面、底面及側面之袋狀物，具有各種形狀(長方體、6角柱(表示於第4圖)、多角柱、圓柱等)之袋狀物。
前述之柔軟袋狀物，可轉用市售之細胞培養用的袋體，亦可使用前述薄膜製作本發明專用之容器。於任一情況下，只要容器之壁面至少形成2個開口部，且該等開口部彼此以管體連結而構成封閉之循環路徑，即可得到本發明之製造裝置。
如第1圖所例示，係於容器1之壁部設置至少2個開口部2、3。至少2個開口部中之一開口部(於圖之例中為下側之開口部2)為用以將液體A1、B1從容器1內流到管體(循環用管體)4內之出口，另一開口部(於圖之例中為上側之開口部3)為用以將液體從循環用管體4內流入容器1內之入口。
該等至少2個開口部中之任一者或兩者，亦可使用作為藉由將循環用管體移除，而於容器內注入第1液體及第2液體用之開口部，或將兩種液體之混合物從容器內取出用之開口部。
液體之循環所使用之前述2個開口部2、3，較佳係以不對外界開放之方式，藉由循環用管體4無菌地連結。另一方面，用以將液體注入至容器內之管體(注入用管體)接觸到過濾滅菌前之液體。因此，若將接觸到過濾滅菌前之液體的管體以過濾滅菌後之管體部分切斷，並連結使用於循環用，則內容液可能會被污染。
從以上之點而言，用以將第1液體及/或第2液體注入容器內之開口部，係以於循環用之2個開口部之外僅設置必要數目的另外之開口部為較佳。例如，可如第3圖所示，設置1個作為專用出入口之開口部6，將第1液體與第2液體從該開口部6依序注入至容器內；也可如第4圖所示，設置2個以上之開口部，將第1液體與第2液體同時注入至容器內。此處，「作為…出入口之開口部」係意指用以將液體從外部注入至容器內的入口用之開口部，及用以將混合後之液體(液狀之培養基組成物)排出容器外的出口用之開口部。例如，可設置入口用之開口部，將第1液體與第2液體從該入口用之開口部注入至容器內，將混合後之液體從循環用之開口部取出。而且，可例如設置出口用之開口部，將第1液體與第2液體從循環用之開口部注入至容器內，將混合後之液體從出口專用之開口部取出。 又且，可分別將入口用之開口部及出口用之開口部個別地設置於容器。
為了維持該等製造裝置內之無菌性，較佳係於注入用管體之途中插入過濾器，將經過濾之液體注入至容器。例如，於第3圖所示之管體4c之途中組入筒式過濾器而挿入於路徑之構成。
而且，連接容器、管體、滅菌過濾器、連接器時，有受到外部氣體污染之疑慮，因此，較佳為在將容器、管體、滅菌過濾器、連接器全部接合而構成封閉性的製造裝置之後，實施γ射線照射滅菌。
第2圖為表示設置於容器之開口的位置之其他例之圖。於同一圖，圖示中係省略用以將容器與管體連接之連接器(connector)、聯結器(coupling)。於本發明，係將管體4連接於設置在容器壁部之開口部2、3，並藉由蠕動泵之作用使第1液體及第2液體循環，以將兩種液體混合。藉此，出口之開口部2及成為入口之開口部3盡可能的互相遠離者，能以良好效率混合兩種液體。出口與入口若接近，則只有該等開口部附近之液體局部地循環，容器內其餘的液體未加入循環之流動而殘留的可能性變高。
於第2圖(a)之態樣，係於構成容器的下面之壁部設置成為出口之開口部2，於構成上面之壁部設置成為入口之開口部3，並將該等開口部以管體4連接。藉此，於容器內產生如箭頭所示般從上方向下方之流動，使第1液體與第2液體效率良好地混合。
於第2圖(b)之態樣，成為出口之開口部2係設置於前述容器之一個壁部，另一開口部3係設置於與前述壁部相對之壁部，該等以管體4連接。藉此，於容器內產生如箭頭所示般水平流過容器內之流動，使第1液體與第2液體無殘留地混合。
於第2圖(c)之態樣，係將成為出口之複數個開口部(於圖之例中為2a、2b兩者)設置於前述容器之一個壁部(於圖之例為構成容器底面之壁部)，成為入口之複數個開口部(於圖之例中為3a、3b兩者)設置於與前述壁部相對之壁部(於圖之例中為構成容器的上面之壁部)，該等成為複數對之入口及出口，各對之開口部(2a、3a)、(2b、3b)係分別以管體4a、4b連接，該管體4a、4b分別安裝於蠕動泵5a、5b。藉此，於容器內產生如箭頭所示般在容器從上方往下方之幅寬且平行的流動，容器內之液體的循環流動增加之可能性變高，第1液體與第2液體能效率良好地混合。又，當如第2圖(c)之態樣般連接複數管體時，亦可是相對於一管體內液體移動之方向(例如，於第2圖(c)為上昇方向)，使另一管體內液體移動之方向為相反方向(例如，於第2圖(c)為下降方向)，而有意地使容器內之流動產生紊亂。
使蠕動泵運轉時，從一開口部向另一開口部流動之方向係如第1圖、第2圖(a)至(c)所示，可為垂直方向(下降方向、上昇方向)、水平方向、斜方向等，亦可為其他之如產生漩渦之方向、如產生亂流之方向。當第1液體為含有去醯化結蘭膠之水溶液時，可看到去醯化結蘭膠 在培養液中有上浮之傾向，因此，如第1圖、第2圖(a)、第2圖(c)、第4圖所示般液體從容器之上方往下方下降之流動，會藉由對抗該種浮上而更有效地進行混合，而為較佳之流動。
於第1圖、第2圖(a)至(c)所示之開口部的配置或數目，為一例示，亦可將該等改變方向，適當組合。例如，於第1圖之態樣，係於容器之垂直的壁部設置2個開口部2、3，惟該2個開口部亦可係設置於容器的上面(或底面)之壁部的2個開口部，也可以改變第1圖容器之態勢而使用。而且，於第1圖之態樣，係只於容器右側之壁部設置2個開口部2、3，惟亦可在相對於該壁部的左側之壁部也設置一對開口部，各對之開口部可分別以管體連接。又且，亦可將設置於容器的上面之開口部與設置於容器的側面之開口部g設成對，並以管體連接。
於第2圖(a)至(c)之態樣亦相同，可適當改變容器之態勢而使用。
設置於容器之開口部，並非一定要將2個開口部成對地作為出口及入口，亦可藉由使管體分岐，而以1個開口部(例如出口)對應複數個開口部(例如入口)(未具圖示)。
開口部之口徑並無特別限制，較佳係等同於連接之管體的口徑。此處所謂開口部之口徑，當於該開口部安裝用以連接管體之連接器、聯結器時，係指該連接器、聯結器的流路之內徑。為了確保容器內之無菌性，較佳為 所有之開口部藉由栓體、開關閥、連接器、聯結器、密封構件等而封閉至使用時。連接器、聯結器較佳係：具有將流路封閉直到連結至各個標的之連接器、聯結器為止之構造，且具有藉由連結至標的之連接器、聯結器而無菌地連通流路之構造者。
而且，亦可於開口部結合短的管體以取代上述之連接器、聯結器，該管體之外界側出口係藉由上述之連接器、聯結器而關閉。
管體可作為泵管安裝於後述之蠕動泵，且具有可作為泵管發揮功能/運作之形狀及具備柔軟性的部分。
所謂可作為泵管安裝於蠕動泵，且具備可作為泵管發揮功能/運作之形狀及柔軟性，係至少意指：具備適合所使用之蠕動泵之管體之內徑、外形及長度，以及具備經蠕動泵之致動器(滾子等)擠壓而變形的軟度且藉由從該致動器所致之擠壓解放時可恢復原形之彈性。
管體可為整體可成為泵管者，亦可為只有安裝於蠕動泵之部分可成為泵管者。
將成為泵管之部分安裝於蠕動泵，藉由使該蠕動泵運轉，前述第1液體與第2液體在上述管體內移動。藉此，兩種液體進行循環並混合，而於容器內形成均勻地分散有特定化合物藉由連結物質結合而成之構造物的液狀培養基組成物。
管體的態樣，除了成為泵管部分以外並無特別限制，可為金屬管等，較佳為不會影響第1液體及第2 液體，可利用於細胞培養，柔軟且低價格之樹脂製管體。較佳之一例為管體整體可利用作為泵管之態樣。
成為泵管部分之材料，較佳為不會影響第1液體及第2液體，可利用於細胞培養，且具有彈性及柔軟性之樹脂材料，尤佳為合成樹脂材料，可列舉：苯乙烯系熱塑性彈性體、矽系樹脂、氟系樹脂、聚氯乙烯系樹脂等。
成為泵管的部分之內徑、厚度、長度只要是配合所使用之蠕動泵者即可，內徑為5mm至50mm左右，管體厚度為2mm至6mm左右。作為一例可列舉：實施例中所使用之管體，內徑為13mm、厚度為3mm(外徑19mm)。
管體整體的長度，只要配合需連接之開口部彼此之間的距離和容器之大小而適當決定即可，可列舉例如：1500mm至3000mm左右。
循環用的管體，可為從連接於容器之一開口的部分至連接於另一開口的部分為止係一體性連續的一條管體，亦可為藉由連接器、聯結器而適當連接成為一條管體。為了提高連接於蠕動泵時之操作性(安裝性)，可於成為泵管的部分之兩端設置連接器、聯結器，成為能夠從管體整體裝卸之構成。該種連接器、聯結器，較佳係使用稱為無菌連接器等之可無菌地連接之連接器。
第3圖為表示該製造裝置之其他構成例之圖。於第3圖之例中，係與第2圖(c)之例相同，在容器1的底面之壁部設置成為出口之2個開口部(2a、2b)，於容器的上面之壁部設置成為入口之2個開口部(3a、3b)，該 等成為2對的入口及出口，各對之開口部(2a、3a)、(2b、3b)分別以管體4a、4b連接，該管體4a、4b分別安裝於蠕動泵5a、5b。而且，於容器1之壁面(於圖例中為上面)另外設置出入口用之開口部6，成為液體可從外部容器7經由管體4c而注入於容器1內之構成。
藉由第3圖中例示之構成，順序上可為：以蠕動泵使一種液體進行循環，同時於其中注入另一種液體。尤其，如第3圖所示，混合順序上可為：先收容第2液體B1，並使之進行循環，同時從外部容器7將第1液體A1以預定之流量注入至容器1內。
又，將液體從外部容器7移動到容器1時，可將管體4c安裝於蠕動泵，利用該蠕動泵之輸送能力，亦可將外部容器7配置於容器1之更上方，藉由重力使外部容器7內之液體在管體內移動，流下至容器1內。
第4圖為表示該製造裝置之較佳構成例之圖。
容器1之整體形狀如第4圖(c)所示，為呈六角柱之柔軟袋體。於圖之例中，該呈六角柱之柔軟袋體本體係利用市售之細胞培養袋體。第4圖(a)表示容器1之一端面1a，第4圖(b)表示容器1之另一端面1b。該兩個端面1a、1b係呈現六角形而作為六角柱之端面，該兩個端面係以成為垂直面之方式保持容器之態勢。
如第4圖(a)所示，於端面1a的上部，係設置用以使第1液體流入容器1內之開口部6a，及用以始將第2液體流入容器1內之開口部6b。開口部6c為封閉，可利用於 將混合液取出等。另一方面，如第4圖(b)所示，於端面1b的下部及上部，係分別設置循環用之開口部2、3。於圖之例中，係於所有的開口部設置用以將成為管路之管體連接之連接器。
第4圖(c)為表示該製造裝置整體的連接構成之塊解圖。於容器1之端面1a，對於開口部6a，係經由管路(管體)41連接收容有第1液體之外部容器7a，對於開口部6b，係經由管體42連接收容有第2液體之外部容器7b。該等外部容器7a、7b可作為該製造裝置之要件，亦可視為外部之液體供給源。
連接於開口部6a之管體與連接於外部容器7a之管體，係藉由無菌連接器C1與1個管體41連結。同樣的，連接於開口部6b之管體與連接於外部容器7b之管體，係藉由無菌連接器C2與1個管體42連結。另一方面，於容器1之端面1b，於開口部2連接管體43，該管體43係藉由無菌連接器C3連接於泵管44，該泵管44安裝於滾子泵(roller pump)5且通過滾子泵5，藉由無菌連接器C4連接於管體45，該管體45連接於開口部3。
於第4圖(c)之例中，首先，對於經除去空氣呈收縮狀態之容器1，將收容於外部容器7b之第2液體注入至容器1。容器1只膨脹為所注入之第2液體的分量。接著，滾子泵5運轉，使第2液體循環，同時於容器1中注入收容於外部容器7a之第1液體，並藉由之後之循環進行混合。滾子泵5，係使液體從開口部2流向開口部3之方式使泵管 44之壓縮點移動。藉此，容器1內之液體係以由上方往下方之方式移動。
可利用於本發明之蠕動泵，以管式泵(亦稱為滾子泵)為代表，係為具有將具有彈性及柔軟性之泵管擠扁，並使該擠扁的位置往輸送的方向移動，藉此具有使該管路內之液體移動的作用之泵。
第5圖為概略性表示蠕動泵之一構成例之圖。於第5圖之例中，係於殼體11設置圓弧狀、半圓狀之外周壁面11a，泵管4沿著該外周壁面11a彎曲而安裝。該外周壁面11a係於外周側支撐泵管4。在該泵管4彎曲之內周側，由臂12支撐之滾子13係以旋轉軸14為中心往液體輸送方向(箭頭f之方向)旋轉，藉此，於每次蠕動運動將泵管4往液體輸送方向依序壓縮，運送泵管內之液體。所謂於蠕動泵安裝管體，如第5圖之例示，係意指以管體4發揮作為蠕動泵的泵管之功能之方式，將管體4插通於蠕動泵之輸送驅動部分(將管體依序壓縮之部分)並予以組合。
第5圖之例中，係於直線狀之臂12的兩端設置2個滾子13，惟，視蠕動泵而亦有設置多個滾子者、不具有臂而以一個大滾子以偏心之軸為中心進行旋轉者等。蠕動泵可為如第5圖所示之路徑為彎曲之構造者，亦可為線性排列有多個致動器而局部性地依序壓縮泵管，於該泵管施加蠕動運動之構造者。蠕動泵之詳細輸送構造可參照以往之技術。
就蠕動泵之輸送能力(每分鐘於管體內移動之 液體之流量)而言，市售品係範圍廣而有從微小流量至大流量為止者，例示為0.01(mL/分鐘)至10(L/分鐘)左右。於本發明中利用之蠕動泵之輸送能力，只要視容器之容積而決定即可，並無特別限制，例如於容器容積為20L至100L左右時，蠕動泵之輸送能力較佳為例示在3至18(L/分鐘)左右之範圍。
為了使用以混合第1、第2液體之該等液體之循環流量增大，可使用更大內徑之泵管、具有更大輸送能力之蠕動泵，亦可將具有小的輸送能力之管體與蠕動泵成對地只以必需之對數平行使用，使液體平行地進行循環。
對於容器之容積，由蠕動泵造成的液體之流量若太小，則混合需要長時間，而且有於局部產生無法充分混合的狀態之情形。
蠕動泵之運轉時間(亦即，持續循環並混合之時間)只要配合蠕動泵之輸送量，並以混合狀態為基礎而適當決定即可。列舉一例，當容器之容積為50L至150L左右，蠕動泵之輸送能力為10(L/分鐘)左右時，較佳之運轉時間可例示為2至4小時左右。
蠕動泵可為構成本發明製造裝置之一部分者，亦可視為本發明之裝置所需利用之外部裝置。
藉由蠕動泵使第1液體與第2液體循環並混合時，只要先將第1液體及第2液體中任一液體放入容器內，再以蠕動泵使該液體進行循環，同時將另一液體注入至容器內，即可藉由之後之循環將兩者良好地混合。
當於第1液體為含有該去醯化結蘭膠之水溶液，第2液體為含有為2價金屬陽離子之連結物質之液體(例如，含有鈣離子及/或鎂離子之液體培養基)時，較佳的順序為將一液體以蠕動泵進行循環，同時將另一液體注入至容器內，其與預先將兩種液體以預定之比例注入至容器內之後開始循環之情形相比，係可獲得去醯化結蘭膠不易偏重於培養液之局部之效果。尤其，當於先將第2液體(上述液體培養基)收容於容器中，再以蠕動泵使該第2液體進行循環，同時將第1液體(含有該去醯化結蘭膠之水溶液)注入至容器內時，可看到去醯化結蘭膠有分散更良好之傾向。
例舉混合時之一例，當容器之容積為50L至150L左右，第1液體與第2液體之體積比率為1：1，蠕動泵之運送能力為10(L/分鐘)左右時，較佳為先將一液體收容於容器1中，再使蠕動泵運轉而使液體進行循環，同時於0.5小時至1.0小時左右之間將另一液體的全部量注入至容器1中，之後再繼續進行混合液之循環2.0小時至4.0小時左右。
又，就以蠕動泵使一液體進行循環，同時將另一液體注入於容器內之順序而言，較佳係如第3圖的該製造裝置之構成例所示般，在用以使液體循環之2個開口部之外，另外設置用於將液體從後面注入至容器內之開口部6。該開口部亦可為出入口用。
蠕動泵可藉由手動進行運轉與停止之調控，亦可於該製造裝置設置調控裝置，藉由該調控裝置，可調控為使蠕 動泵只於預先設定之時間自動的進行運轉。
[第1液體]
第1液體，係含有具有陰離子性官能基之高分子化合物作為特定化合物，該高分子化合物可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物。
陰離子性官能基可列舉：羧基、磺基、磷酸基及該等之鹽，較佳為羧基或其鹽。本發明所使用之高分子化合物中，可含有1種或2種以上選自前述陰離子性官能基之群組者。
本發明所使用之高分子化合物之較佳具體例並無特別限制，可列舉聚合有10個以上之單糖類(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)之多糖類，更佳可列舉具有陰離子性官能基之酸性多糖類。此處所謂之酸性多糖類，只要是於其構造中具有陰離子性官能基者即無特別限制，例如：具有糖醛酸(例如葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)之多糖類、構造中之一部分具有硫酸基或磷酸基之多糖類、或具有該兩種構造之多糖類，不僅包含能從自然獲得之多糖類，亦包含藉由微生物產生之多糖類、基因工程方式產生之多糖類或使用酵素而人工合成之多糖類。更具體而言，可例示：由選自玻尿酸、結蘭膠、去醯化結蘭膠(以下，亦稱為DAG)、鼠李聚糖膠(rhamsan gum)、迪坦膠(diutan gum)、黃原膠、角叉菜膠、三仙膠、己糖醛酸、褐藻糖膠、果膠、果膠酸、果膠 酯酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸類肝素(heparitin sulfate)、角質硫酸鹽、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖及該等之鹽所成群組的1種或2種以上所構成之多糖類。多糖類較佳為玻尿酸、DAG、迪坦膠、黃原膠、角叉菜膠或該等之鹽，更佳為DAG或其鹽。DAG亦可使用經磷酸化者。該磷酸化可以公知之手法進行。
此處之鹽可列舉例如：鋰、鈉、鉀等鹼金屬之鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土金屬之鹽或鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹼及胺基酸等之鹽。
該等高分子化合物(多糖類等)之重量平均分子量較佳為10,000至50,000,000，更佳為100,000至20,000,000，又更佳為1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可藉由膠體滲透層析儀(GPC)而以聚三葡萄糖(pullulan)換算測定。
於本發明，可將複數種(較佳為2種)具有上述陰離子性官能基之多糖類組合使用。亦可將具有陰離子性官能基之多糖類與未具有陰離子性官能基之多糖類組合。多糖類的組合之種類，只要能經由2價金屬陽離子連結，並藉此於液體培養基中形成上述之構造物即無特別限制，較佳為該組合至少包含DAG或其鹽。亦即，適當之多糖類組合中包含：DAG或其鹽、及DAG或其鹽以外的多糖類(例如黃原膠、藻酸、角叉菜膠、迪坦膠、甲基纖維素、刺槐豆膠或該等之鹽)。具體之多糖類組合，可列舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與迪坦膠、DAG與黃原膠、DAG與角 叉菜膠、DAG與三仙膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-角叉菜膠、DAG與藻酸鈉、DAG與甲基纖維素等，但不只限於此。
去醯化結蘭膠為將1-3鍵結之葡萄糖、1-4鍵結之葡萄醣醛酸、1-4鍵結之葡萄糖及1-4鍵結之鼠李糖之4分子糖作為構成單位的直鏈狀高分子多糖類，其係於以下通式(I)中，R1、R2皆為氫原子，n表示2以上之整數的多糖類。但是，雖然R1可包含甘油基、R2可包含乙醯基，惟乙醯基及甘油基之含量較佳為在10%以下，更佳為在1%以下。
Figure 106124526-A0202-12-0028-2
特定化合物亦可為以化學合成法獲得者，惟該特定化合物為自然產物時，可為從含有該化合物之各種植物、各種動物、各種微生物以慣用之技術萃取及分離精製而得者。例如，結蘭膠可藉由下述方式製造：以發酵培養基培養生產微生物，並將於菌體外生產之黏膜物以通常之精製方法回收，進行乾燥、粉碎等步驟後作成粉末狀。而且，為去醯化結蘭膠時，只要在將黏膜物回收時施行鹼處理，並將鍵結於經1-3鍵結之葡萄糖殘基的甘油基及乙醯基進行脫醯化後加以回收即可。結蘭膠的生產微生物之 例，可列舉多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及將該微生物之基因改變之微生物，惟不只限於此。
為去醯化結蘭膠時，可使用市售品，例如可使用：三晶股份公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)CG-LA」、三榮源F．F．I股份公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)」等。而且，原型(native type)結蘭膠可使用三榮源F．F．I股份公司製造之「KELCOGEL(CP Kelco公司之註冊商標)」HT」等。
第1液體通常為特定化合物之溶液。用於該溶液之溶劑，只要是能將特定化合物溶解者，即無特別限制，通常為水或親水性溶劑，較佳為水。亦即，於較佳態樣，第1液體為特定化合物之水溶液。
第1液體中所含有之特定化合物之濃度，只要是在與第2液體混合時，於混合液中，特定化合物可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物，且該構造物均勻分散於混合液中，並且，最終所得之液狀培養基組成物可藉由含有該構造物而懸浮培養細胞或組織之濃度，即無特別限制。以下詳細敍述中，對於可懸浮培養細胞或組織之培養基組成物中的特定化合物之濃度及最終產物所得之培養基組成物之體積，係可從第1液體體積之比率算出第1液體中的特定化合物之濃度。例如，將體積V1之第1液體與體積V2之第2液體混合，而於最終獲得體積V1+V2之液狀培養基組成物時，在將該液狀之培養基組成物中的特定化合物之濃度設為C%(w/ v)時，只要將第1液體中特定化合物之濃度設為C×(V1+V2)/V1%(w/v)即可。
第1液體中的2價金屬陽離子之濃度需低於第1液體中的特定化合物形成構造物之濃度。2價金屬陽離子可列舉：鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。尤其，鈣離子及鎂離子中之一者或二者(以下，亦表示為「鈣離子及/或鎂離子」)係有助於DAG等特定化合物構造物之形成。
第1液體亦可含有特定化合物、溶劑以外之因子。該因子可列舉生理上可容許之緩衝劑、鹽、等張劑，但不只限於此。
第1液體之調製，可藉由將特定化合物添加於上述溶劑(例如水)，於可將該特定化合物溶解之溫度(例如60℃以上、80℃以上、90℃以上)攪拌並溶解至呈透明狀態為止而進行。若使用經脫2價金屬陽離子處理之DAG，因為不需加熱即溶解於水，故溶解操作容易。若有需要，可將所得之特定化合物的溶液進行脫2價金屬陽離子處理，使溶液中的2價金屬陽離子之濃度低於構造物形成濃度。視所需，亦可於溶劑中預先加入特定化合物以外之因子，也可於所得之特定化合物的溶液中加入特定化合物以外之因子。第1液體較佳為經滅菌處理。滅菌處理之方法可列舉：高壓釜、過濾滅菌等，惟不只限於此。
[第2液體]
第2液體含有2價金屬陽離子作為連結物質。2價金屬陽離子可列舉：鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。2價金屬陽離子之種類，只要是第1液體中所含有之特定化合物可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物者即可，並無特別限制，較佳為鈣離子。
第2液體通常為連結物質(亦即2價金屬陽離子)之溶液。用於該溶液之溶劑，只要是能將特定化合物溶解者即無特別限制，通常為水或親水性溶劑，較佳為水。亦即，於較佳態樣，第2液體為連結物質(亦即2價金屬陽離子)之水溶液。
於第2液體，將第1液體與第2液體混合，最終獲得之液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子之濃度，係包含第1液體中之特定化合物用於形成構造物的充分量之2價金屬陽離子。
第2液體中，2價金屬陽離子之濃度可由最終獲得之液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子之濃度及第1液體與第2液體之混合比率算出。
於第2液體，連結物質(亦即2價金屬陽離子)可含有溶劑以外之因子。該因子可列舉適於培養所欲之細胞之培養基構成成分。該培養基構成成分可列舉：緩衝劑(碳酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、HEPES等)、無機鹽(NaCl等)、各種胺基酸、各種維生素(膽鹼、葉酸等)、糖類(葡萄糖等)、抗氧化劑(單硫丙三醇等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生 素、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、各種細胞介素、各種荷爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基質等，惟不只限於此。第2液體較佳為經滅菌處理。滅菌處理之方法可列舉：高壓釜、過濾滅菌等，惟不只限於此。
於較佳態樣，第2液體為含有形成構造物的濃度之2價金屬陽離子(較佳為鈣離子及/或鎂離子)之液體培養基之濃縮液。第2液體除了含有2價金屬陽離子(較佳為鈣離子及/或鎂離子)及水之外，係含有適於培養所欲之細胞之培養基構成成分。因為通常所使用之細胞培養用液體培養基中的鈣離子濃度之範圍為0.1至2.0mM左右，鎂離子之濃為0.1至1.0mM左右，對於藉由DAG等特定化合物之構造物形成為充分。於第2液體，2價金屬陽離子(較佳為鈣離子及/或鎂離子)之濃度，可考慮與第1液體之混合比，以使最終獲得之液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度成為構造物形成濃度之方式加以調整。其他之連結物質亦相同。而且，於第2液體中，適於培養所欲之細胞之培養基構成成分之濃度，可考慮與第1液體之混合比，以使最終獲得之液狀培養基組成物中的培養基構成成分濃度在適於培養所欲之細胞之濃度範圍內之方式加以調整。例如，將體積V1之第1液體與體積V2之第2液體混合，最終獲得體積V1+V2之液狀培養基組成物時，在該液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子之濃度設為Ci時，只要將第2液體中的2價金屬陽離子之濃度設為Ci×(V1+V2)/V2即可。其他之連結物質亦相同。同樣的，將體積V1 之第1液體與體積V2之第2液體混合，最終獲得體積V1+V2之液狀培養基組成物時，在將該液狀培養基組成物中培養基構成成分之濃度設為Cm之情形下，只要將第2液體中培養基構成成分之濃度設為Cm×(V1+V2)/V2即可。
於本態樣，依據本發明之製造方法，藉由將第1液體與第2液體混合，可直接獲得目的之液狀培養基組成物，該液狀培養基組成物中包含第1液體所含有之特定化合物經由第2液體所含有之連結物質連結而成之構造物。
尤其，於第2液體中，亦可不含上述細胞培養用培養基構成成分之一部分或全部。此時，於本發明之製造方法中，係將第1液體與第2液體混合，得到包含第1液體所含之特定化合物經由第2液體所含之連結物質連結而成之構造物的混合液，並於該混合液中加入上述細胞培養用液體培養基構成成分之一部分或全部，藉此可獲得目的之液狀培養基組成物。
第1液體與第2液體之體積混合比率，相對於第1液體之體積100，第2液體之體積為50至200，較佳為100。
於較佳態樣，於藉由本發明的製造方法所製造之液狀培養基組成物中所含有之特定化合物，其90莫耳%以上(較佳為95莫耳%以上，更佳為99%以上，又更佳為100%)為源自第1液體，該培養基組成物中所含有之2價金屬陽離子，其90莫耳%以上(較佳為95莫耳%以上，更佳為99%以上，又更佳為100%)為源自於第2液體。
[液狀之培養基組成物]
可藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物，係含有第1液體所含之特定化合物經由第2液體中所含之連結物質(亦即2價金屬陽離子)連結而成之構造物，且該構造物均勻分散於該培養基組成物中，因此若使用該培養基組成物，則可維持懸浮狀態進行培養細胞、組織。
成為培養對象之細胞、組織的來源生物之種類並無特別限制，不僅包含動物(昆蟲、魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、汎甲殻類、六足類、哺乳類等)，亦包含植物。
於一態樣中，成為培養對象之細胞為錨定依賴性之細胞。若使用依本發明製造方法可獲得之液狀培養基組成物，則錨定依賴性之細胞可不使用用來著附之載體，而維持懸浮狀態進行培養。
於本發明，細胞及/或組織之懸浮係指對於培養容器，細胞及/或組織為可接觸在底面但非附著之狀態(非接著)。再者，於本發明，係將使細胞及/或組織增殖、分化或維持時，未伴隨對於液體之培養基組成物施以源自外部的壓力、振動或於該組成物中之振動、旋轉操作等，而細胞及/或組織於該液狀培養基組成物中均勻分散且呈懸浮之狀態稱為「懸浮靜置」，並將於該狀態培養細胞及/或組織稱為「懸浮靜置培養」。而且，於「懸浮靜置」可使懸浮之期間，包括5分鐘以上、1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上等，但只要保持懸浮狀態即 不限定於該等期間。
可藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物，於可維持、培養細胞、組織之溫度範圍(例如0至40℃)中之至少1點時，可懸浮靜置細胞及/或組織。可藉由本發明獲得之液狀培養基組成物，其可懸浮靜置細胞及/或組織之溫度較佳為於25至37℃溫度範圍中之至少1點，最佳為於37℃。
是否可懸浮靜置，可藉由例如：將培養對象之細胞以2×104細胞/mL之濃度均勻分散於評估對象之培養基組成物中，並於15mL錐形管(conical tube)中注入10mL，於4℃左右之低溫下至少靜置5分鐘以上(例如1小時以上、24小時以上、48小時以上、7日以上)，觀察該細胞是否維持懸浮狀態而進行評估。懸浮狀態之評估，例如全部細胞中的70%以上為懸浮狀態時，可下結論為維持懸浮狀態。亦可以聚苯乙烯珠(大小500-600μm，Polyscience公司製造)取代細胞而進行評估。
於較佳之態樣中，可藉由本發明之製造方法獲得之液狀培養基組成物，藉由含有上述構造物，實質上其黏度並未提高。所謂「液體之黏度實質上並未提高」係意指液體的黏度不高於8mPa．s。此時，該液體之黏度(亦即可藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物之黏度)於37℃係在8mPa．s以下，較佳為在4mPa．s以下，更佳為在2mPa．s以下。含有構造物之液體的黏度，可於37℃條件下使用E型黏度計(東機產業股份公司製造，TV-22型黏 度計，機種：TVE-22L，錐形轉子：標準轉子1°34′×R24、旋轉數100rpm)進行測定。
可藉由本發明製造方法獲得之液狀培養基組成物中的特定化合物之濃度，係因賴特定化合物之種類而異，可適當設定於特定化合物可在液狀之培養基組成物中形成上述構造物(較佳為該液體培養基之黏度實質上未提高)，使細胞及/或組織均勻地懸浮(較佳為使懸浮靜置)之範圍。例如，特定化合物為DAG時，其濃度為0.001%至1.0%(w/v)，較佳為0.003%至0.5%(w/v)，更佳為0.005%至0.3%(w/v)，又更佳為0.01%至0.05%(w/v)，最佳為0.01%至0.03%(w/v)。特定化合物為黃原膠時，其濃度為0.001%至5.0%(w/v)，較佳為0.01%至1.0%(w/v)，更佳為0.05%至0.5%(w/v)，最佳為0.1%至0.2%(w/v)。特定化合物為κ-角叉菜膠與刺槐豆膠混合系時，兩化合物之總和為0.001%至5.0%(w/v)，較佳為0.005%至1.0%(w/v)，更佳為0.01%至0.1%(w/v)，最佳為0.03%至0.05%(w/v)。特定化合物為原型結蘭膠時，其濃度為0.05%至1.0%(w/v)，較佳為0.05%至0.1%(w/v)。
作為特定化合物，將上述多糖類複數種(較佳為2種)組合使用時，該多糖類之濃度可適當設定為該多糖類之組合可於液狀之培養基組成物中形成上述構造物(較佳為該液體培養基之黏度實質上未提高)，且可使細胞及/或組織均勻地懸浮(較佳為使懸浮靜置)之範圍。例如，當使用DAG或其鹽、DAG或其鹽以外之多糖類之組合時， DAG或其鹽之濃度可例示為0.005至0.02%(w/v)，較佳為0.01至0.02%(w/v)，DAG或其鹽以外之多糖類之濃度可例示為0.0001至0.4%(w/v)，較佳為0.005至0.4%(w/v)，更佳為0.1至0.4%(w/v)。具體之濃度範圍的組合係例示於下。
DAG或其鹽：0.005至0.02%(較佳為0.01至0.02%)(w/v)
DAG以外之多糖類
黃原膠：0.1至0.4%(w/v)
藻酸鈉：0.0001至0.4%(w/v)(較佳為0.1至0.4%(w/v))
原型結蘭膠：0.0001至0.4%(w/v)
刺槐豆膠：0.1至0.4%(w/v)
甲基纖維素：0.1至0.4%(w/v)(較佳為0.2至0.4%(w/v))
角叉菜膠：0.05至0.1%(w/v)
迪坦膠：0.05至0.1%(w/v)
又，該濃度可由以下之公式算出。
濃度[%(w/v)]=特定化合物之重量(g)/培養基組成物之體積(mL)×100
於較佳之態樣中，使用DAG或其鹽作為特定化合物，使用鈣離子作為連結物質。第1液體為DAG或其鹽之水溶液。第2液體為含有鈣離子之液體培養基之濃縮液。第1液體與第2液體之體積混合比如上所述，相對於 第1液體之體積(V1)100，第2液體之體積(V2)為50至200，較佳為100。作為混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的DAG之濃度較佳為0.01%至0.05%(w/v)、最佳為0.01%至0.03%(w/v)。作為混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的鈣離子之濃度，為DAG形成構造物之濃度，通常為0.1至2.0mM左右。作為混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的培養基構成成分之濃度，在適於培養所欲之細胞(例如哺乳動物細胞)之濃度範圍內。
第1液體中的DAG之濃度，係作為上述混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的DAG之濃度乘以(V1+V2)/V1(亦即150/100至300/100，較佳為200/100)而得之濃度。
第2液體中鈣離子之濃度，係作為上述混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的鈣離子之濃度乘以(V1+V2)/V2(亦即150/50至300/200，較佳為200/100)而得之濃度。
第2液體中的培養基構成成分之濃度，係作為上述混合結果而獲得之液狀培養基組成物中的培養基構成成分之濃度乘以(V1+V2)/V2(亦即150/50至300/200，較佳為200/100)而獲得之濃度。
於該液狀之培養基組成物，藉由均勻分散地含有DAG經由鈣離子連接而成之構造物，實質上不會提高黏度，可使細胞及/或組織均勻地懸浮(較佳為懸浮靜置)。
若使用藉由本發明之製造方法所得之液狀培養基組 成物，則可不伴隨有引起細胞或組織的障害或喪失功能之風險的振動、旋轉等操作而將細胞及/或組織以懸浮狀態進行培養。再者，若使用該培養基組成物，則於培養時除了可容易地交換培養基，亦可容易地回收所培養之細胞及/或組織。若使用該培養基組成物，則可將以往需於盤上以單層且以接著於細胞容器之狀態培養的細胞以懸浮狀態進行培養，故可將接著性細胞在不損及其功能之情況下有效率地大量進行調製。
第1液體與第2液體之混合液可為製造目的之培養基組成物，亦可為在該混合液中另加入添加物而成為製造目的之培養基組成物者。
[實施例]
使用本發明之製造裝置，實施本發明之製造方法，藉此評估將第1、第2液體混合而獲得之培養基組成物之混合狀態(藉由2液混合而形成之構造物之分散狀態)。
[製造裝置的各部分之規格]
使用如第4圖所示之容器(柔軟的袋體)1、各管體41至45及作為蠕動泵之滾子泵5，將第1、第2液體混合，製造液狀之培養基組成物。
第1液體為含有去醯化結蘭膠之水溶液(濃度：0.040%)，第2液體為含有鈣離子之液體培養基(鈣離子濃度：3.29mM)。
容器1為將聚乙烯製之柔軟薄膜作為壁部之材料使用 之袋狀物(袋)，容積為100L。
滾子泵為FURUE SCIENCE(古江
Figure 106124526-A0202-12-0040-9
)股份公司製造之RP-KGI。安裝於滾子泵之循環用管體之內徑為13mm，外徑為19mm。滾子泵之輸送量為10L/分鐘左右。由滾子泵5造成之液體的輸送方向為將液體從開口部2流出並經由滾子泵5流向開口部3之方向。
[液狀培養基組成物之製造]
對於將空氣除去而呈收縮狀態之容器1，將收容於外部容器7b之第2液體50L注入至容器1中。接著，使滾子泵5轉動，使第2液體循環，同時耗時0.5小時將收容於外部容器7a之第1液體50L注入至容器1。而且，從第1液體50L注入完成之時間點算起，再繼續3小時之循環而完成混合，獲得液狀之培養基組成物。
[混合狀態之評估]
實施下述所示之性能評估試驗方法(為了本發明而制定之新穎試驗方法)，就上述獲得之液狀培養基組成物是否為經良好混合者，亦即，藉由第1及第2液體之混合而形成之構造物(第1液體所含有之特定化合物經由第2液體所含有之2價金屬陽離子聚集之構造物)是否成為較佳分散在液狀培養基組成物中懸浮之狀態藉由進行評估。
[性能評估試驗方法]
(1)為了充分確保構造物之形成時間，試驗係在從培養基組成物的混合完成之時間點算起的48小時後開始。
(2)於容積15mL之經滅菌之錐形管中放入聚苯乙烯製之珠(直徑600μm，Polysciences公司製造)10mg，另於該錐形管內注入欲評估之培養基組成物10mL，翻轉混和之。
(3)於翻轉混和完成隨後，立即以目視確認珠於錐形管內的培養基組成物為均勻地分散至液面為止。
(4)於將錐形管設為直立狀態，並為了防止培養基成分劣化而將溫度設為4℃，而將上述(3)狀態之試料靜置12小時以上之後，以目視判定珠的分散狀態(維持分散，或有沉澱的傾向)。只要構造物於培養基組成物中呈較佳分散且懸浮狀態，則如第6圖(a)之示意性表示般，受到該構造物分散地懸浮的影響，珠於培養基組成物中亦呈分散、懸浮。另一方面，當混合不佳，於培養基組成物中構造物成為更大的聚集體並懸浮時，培養基組成物之中無殘餘構造物之部分亦變大，故如第6圖(b)所示意性表示般，未受構造物懸浮之影響而沉澱之珠亦變多。如此，只要將珠混合於培養基組成物中，即可藉由該珠而確認以目視難以確認之構造物的分散情況。
(5)珠的分散狀態之判定基準
合格：珠於培養基組成物為均勻分散至液面為止。於本實施例，於15mL之錐形管注入有10mL之培養基組成物時，判定標準如第6圖(a)所示意性表示般，珠分散於9mL 線以上，於管體底部完全未看到珠因沉澱而聚集。
不合格：珠於培養基組成物未均勻分散至液面為止。於本實施例，與上述之合格基準相反，於15mL之錐形管注入有10mL之培養基組成物時，如第6圖(b)所示意性表示般，於9mL線以上無珠，而於管體底部(尤其是1.5mL線以下之部位)看到珠因沉澱而聚集。
[評估結果]
對於上述獲得之培養基組成物實施上述性能評估試驗方法之結果，珠的分散狀態為合格，明瞭本發明之製造方法及製造裝置為可將第1及第2液體良好混合之優越方法及裝置。
[產業上之可利用性]
藉由本發明之製造方法及製造裝置，能夠對於含有2價金屬陽離子等連結物質之任意液體與含有特定化合物之液體進行無菌、簡單且良好混合，可低價格且大量地獲得分散有微細構造物之液狀培養基組成物。
本案以於日本提出申請之特願2016-144929(申請日：2016年7月22日)為基礎，其內容皆包含於本說明中。
1‧‧‧容器
2、3‧‧‧開口部
4‧‧‧管體
5‧‧‧蠕動泵
A1‧‧‧第1液體
B1‧‧‧第2液體

Claims (15)

  1. 一種液狀之培養基組成物之製造方法，其係將含有下述(i)之特定化合物之第1液體與含有下述(ii)之連結物質之第2液體混合，製造液狀之培養基組成物之方法；使用於壁部設置有至少2個開口部之容器，其中，前述之至少2個開口部藉由容器外之管體互相連接，該管體具有於蠕動泵可作為泵管安裝之形狀及具備柔軟性的部分，將前述管體安裝於前述蠕動泵，使該蠕動泵運轉，藉此以前述容器內的前述第1液體與前述第2液體不與外部氣體接觸的方式，使前述第1液體與前述第2液體在前述管體與前述容器之間循環、混合，於容器內形成分散有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成之構造物之液狀培養基組成物；(i)特定化合物，可經由2價金屬陽離子連結，並藉此形成可使細胞或組織懸浮之構造物，為具有陰離子性官能基之高分子化合物，(ii)連結物質，為2價金屬陽離子。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之液狀培養基組成物之製造方法，其中，前述(i)之特定化合物為去醯化結蘭膠，第1液體為含有該去醯化結蘭膠之水溶液；前述(ii)之連結物質為鈣離子及鎂離子中之一者或兩者，第2液體為含有鈣離子及鎂離子中之一者或兩者之液體培養基之濃縮液。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之液狀培養基組成物之製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的去醯化結蘭膠之濃度為0.001%(w/v)至1.0%(w/v)。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之液狀培養基組成物之製造方法，其中，第1液體與第2液體之體積混合比率，係相對於第1液體之體積100，第2液體之體積為50至200者。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，前述一開口部設置於構成前述容器的底面之壁部或構成側面之壁部的底部而作為出口，前述之另一開口部設置於構成前述容器的上面之壁部或構成側面之壁部的上部而作為入口；使前述蠕動泵運轉，使第1液體與第2液體為該等液體在管體內從前述出口往前述入口之方向移動，並使容器內之第1液體與第2液體從上方往下方之方向移動。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，前述2個開口部以出口及入口為1對，於前述容器設置複數對之前述2個開口部，各對之2個開口部分別以管體連接；於前述第2步驟，將各個管體安裝於個別之蠕動泵，使該蠕動泵運轉，使前述第1液體與第2液體經由各管體進行循環。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方 法，其中，前述容器係由能夠配合該容器內部所收容之液體之體積而改變該容器容積之柔軟的材料所形成，藉此，可確保該容器內之密閉性，同時還可於該容器內注入液體，且可將液體排出到該容器外。
  8. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之製造方法，其中，於前述容器設置有該容器內的液體出入所使用之出入口用之開口部，於前述容器中先注入第1液體與第2液體中之任一液體後，以前述蠕動泵使該液體循環，同時將另一液體從前述出入口用之開口部注入至容器內。
  9. 一種製造裝置，其係用以實施申請專利範圍第1項所述之液狀培養基組成物之製造方法而使用之製造裝置，該製造裝置具有用於收容於前述製造方法中混合之第1液體及第2液體之容器，該容器之壁部至少設置2個開口部，該等開口部藉由容器外之管體互相連接，前述管體具有：於以運送該管體內之液體構成之蠕動泵可作為泵管安裝，且具有於該蠕動泵可作為泵管運轉之形狀及具備柔軟性的部分前述容器內的前述第1液體與前述第2液體不與外部氣體接觸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之製造裝置，其中，前述一開口部設置於構成前述容器的底面之壁部或構成前述容器的側面的壁部之底部， 前述另一開口部設置於構成前述容器的上面之壁部或構成前述容器的側面之壁部之上部。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之製造裝置，其中，前述2個開口部係以出口與入口為1對，於前述容器係設置複數對之前述2個開口部，於各對之2個開口部分別以管體連接。
  12. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之製造裝置，其進一步具有前述蠕動泵作為該製造裝置之構成要件，該蠕動泵為安裝前述管體，以將該管體作為泵管運轉者。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製造裝置，其中，前述一開口部設置於構成前述容器的底面之壁部或構成側面之壁部之底部，前述另一開口部係設置於構成前述容器的上面之壁部或構成側面之壁部之上部，使前述蠕動泵以使前述管體內之液體以從下側之開口部往上側之開口部移動之方式運轉而構成，藉此，容器內所收容之液體係從上方往下方移動。
  14. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之製造裝置，其中，前述容器係由能夠配合該容器內部所收容之液體之體積而改變該容器的容積之柔軟的材料形成，藉此，可確保該容器內之密閉性，同時還可於該容器內注入液體，且可將液體排出到該容器外。
  15. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述之製造 裝置，其中，於前述容器進一步設置有該容器內的液體出入所使用之出入口用之開口部。
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