JP7028776B2 - 液状の培地組成物の製造方法およびそれに用いられる製造装置 - Google Patents
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Description
細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。
また、当該技術により培養された細胞及び/又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。
特許文献1に記載された液状の培地組成物は、特定の化合物(特に、アニオン性官能基を有する高分子化合物)が2価金属カチオン等を介して集合し不定形の構造体となり、該構造体が液体培地中に分散して浮遊した状態となっているものである。以下、アニオン性官能基を有する高分子化合物などといった上記特定の化合物を「特定化合物」ともいい、該特定化合物同士を結びつける2価金属カチオン等の物質を「連結物質」ともいう。
該培地組成物は、細胞等の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに、細胞等を浮遊状態にて培養することができる好ましい液状の培地となる。
しかしながら、本発明者らが、該液状の培地組成物の実際の作製工程を詳細に検討したところ、そのような好ましい状態を得るためには、構造体が培地組成物中の局所に偏在して形成されないように、混合方法や混合条件に留意しなければならないことがわかった。
しかし、連結物質を含んだ液体培地を攪拌しながら、その中に、特定化合物を含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が外気に接触し、それにより外気中の細菌が培地中に混入するといった問題が生じる可能性がある。
また、連結物質を含んだ液体培地中を容器内に収容し、そこへ特定化合物を高濃度に含んだ液体を注ぎ入れるといった混合方法では、両液が合流した瞬間に特定化合物が連結物質と接して構造体となり、よって該構造体は、混合液中に紐状に長く連なって浮遊する状態(または、紐状の構造体が塊状に絡み合った状態)となり、本来意図された均一な分散状態にはならない場合があることがわかった。また、そのような状態は、比較的高速で攪拌を行なったとしても発生することがわかった。また、液体培地中にそのような紐状の構造体がいったん形成されると、分子鎖が形成するダブルへリックスがお互いに連結物質(例えば、カルシウムイオン)を介して強固な三次元ネットワークを形成しているという該構造体の性質上、それを細かく切断して母材中に分散させることは容易ではないこともわかった。
よって、目的の構造体が好ましく分散した混合液を得るためには、両液を高速で接触させ得るような特殊な撹拌装置が必要となるが、そのような特殊な撹拌装置の撹拌作用は、一般に、3L(Lはリットルを表す)以下程度の少量の液体に対して有効となるような限られたものである場合が多く、上記の構造体が好ましく分散した混合液を大量(例えば、20L以上など)に製造するのには適していないこともわかった。
〔1〕下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体と、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法であって、
少なくとも2つの開口部が壁部に設けられた容器を用い、ここで、前記少なくとも2つの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結され、該チューブは、蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
前記チューブを前記蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第1の液体と第2の液体を、前記チューブと前記容器との間を循環させて混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を容器内に形成することを特徴とする、
前記液状の培地組成物の製造方法。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
(ii)2価金属カチオンである連結物質。
〔2〕前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地の濃縮液である、
前記〔1〕記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔3〕前記液状の培地組成物中の脱アシル化ジェランガムの濃度が、0.001%(w/v)~1.0%(w/v)である、前記〔2〕記載の培地組成物の製造方法。
〔4〕第1の液体と第2の液体との体積混合比率が、第1の液体の体積100に対して、第2の液体の体積50~200である、前記〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔5〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に出口として設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に入口として設けられており、
前記蠕動ポンプを作動させて、第1の液体と第2の液体を、それら液体がチューブ内を前記出口から前記入口に向かう方向に移動させ、それにより、容器内の第1の液体と第2の液体を、上方から下方へ向かう方向に移動させる、
前記〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の製造方法。
〔6〕前記2つの開口部が出口と入口として1対になっており、前記容器には前記2つの開口部が複数対設けられ、各対における2つの開口部がそれぞれにチューブで接続されており、
前記第2の工程において、それぞれのチューブを別個の蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第1の液体と第2の液体とを、各チューブを通して循環させる、前記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の製造方法。
〔7〕前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それによって、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、前記〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の製造方法。
〔8〕前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部が設けられており、
前記容器に第1の液体および第2の液体のうちのいずれか一方の液体を先に入れておき、該液体を前記蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を前記出入口用の開口部から容器内に注入する、
前記〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の液状の培地組成物の製造方法。
〔9〕前記〔1〕記載の液状の培地組成物の製造方法を実施するために用いられる製造装置であって、
当該製造装置は、前記製造方法において混合される第1の液体と第2の液体を収容するための容器を有し、
該容器の壁部には少なくとも2つの開口部が設けられ、これらの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結されており、
前記チューブは、該チューブ内の液体を送るように構成された蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着し得かつ該蠕動ポンプにおいてポンピングチューブとして作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものである、
前記製造装置。
〔10〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられている、
前記〔9〕記載の製造装置。
〔11〕前記2つの開口部が出口と入口として1対になっており、前記容器には前記2つの開口部が複数対設けられ、各対における2つの開口部がそれぞれにチューブで接続されている、前記〔9〕または〔10〕記載の製造装置。
〔12〕さらに、前記蠕動ポンプを当該製造装置の構成要素として有し、該蠕動ポンプは、前記チューブを装着し該チューブをポンピングチューブとして作動させるものである、前記〔9〕~〔11〕のいずれかに記載の製造装置。
〔13〕前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられており、
前記チューブ内の液体が下側の開口部から上側の開口部へと移動するように、前記蠕動ポンプが作動するように構成され、それにより、容器内に収容された液体が、上方から下方へと移動するようになっている、
前記〔12〕記載の製造装置。
〔14〕前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それにより、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、前記〔9〕~〔13〕のいずれかに記載の製造装置。
〔15〕前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部がさらに設けられている、前記〔9〕~〔14〕のいずれかに記載の製造装置。
以下、蠕動ポンプの作動によって、容器内の液体が、一方の開口部からチューブ内に出て行き、該チューブを通過し、他方の開口部から該容器内に再び戻って循環する移動を、〔液体が容器とチューブとの間で循環する〕とも表現し、単に〔液体が循環する〕とも表現する。
また、当該製造方法によれば、両液体の合計が100Lにも達するような大量の液状の培地組成物を無菌的に効率良く製造できるようになる。
また、本発明の製造装置(以下、当該製造装置ともいう)は、容器とチューブとを有してなる構成によって、当該製造方法を実施可能にし、前記の無菌的かつ大量の混合を可能にする。とりわけ、容器を柔軟な合成樹脂などの有機高分子材料からなる袋状物とすれば、装置全体を安価な袋状物とチューブとで構成することができるので、混合毎の使い捨てが可能になる。これにより、容器内やチューブ内の洗浄が不要になり、また、容器内やチューブ内の無菌性がより高くなる。
また、当該製造装置は、蠕動ポンプを必須に含んだ装置であっても、チューブは蠕動ポンプの駆動部分に装着されるだけであって、一体的に連結されるわけではない。よって、容器とチューブとを有してなる循環経路に係る主要部分は、混合毎の使い捨てが可能であり、容器内やチューブ内の洗浄が不要である。
本発明の製造方法は、下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体と、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法である。これら特定化合物、連結物質、および、それぞれを含有する第1の液体、第2の液体の詳細については後述する。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
(ii)2価金属カチオンである連結物質。
当該製造方法は、図1に例示するように、少なくとも2つの開口部2、3が壁部に設けられた容器1を用いる。前記少なくとも2つの開口部2、3は、容器外のチューブ4によって互いに連結されており、該チューブ4は、蠕動ポンプ5にポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を、該チューブの一部または全部として有するものである。
図1では、容器1内の液体が第1の液体A1と第2の液体B1とに明確に分離しているようには描いていないが、容器内の液体に対して符号A1、B1を付与することによって、第1の液体A1と第2の液体B1とが混合される途上であることを示唆している。
前記容器1の壁部には少なくとも2つの開口部2、3が設けられ、これら少なくとも2つの開口部2、3は、容器1の外側にあるチューブ4によって互いに連結されている。該チューブ4は、蠕動ポンプ5に装着されてポンピングチューブとして機能し得る形状と柔軟性とを有するものである。図1では、蠕動ポンプ5の詳細な構造は図示しておらず、破線によって該蠕動ポンプの存在を示唆している。該蠕動ポンプ5は、本発明の製造装置の一部として含まれていてもよく、また、外部装置であってもよい。
当該製造方法では、図1に示すように、チューブ4を蠕動ポンプ5に装着する。即ち、該チューブ4が蠕動ポンプ5のポンピングチューブとなるように、該チューブ4を該蠕動ポンプ5に係合させる。そして、該蠕動ポンプ4を作動させて、第1の液体A1と第2の液体B1を、容器1とチューブ4との間で循環させ、該循環によって、両液体を攪拌、混合し、液状の培地組成物を形成する。両液体が十分に攪拌、混合された液状の培地組成物中には、特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が均一に分散しており、細胞等を浮遊状態で培養するのに適したものとなっている。
当該製造方法によって、上記したように、両液体の合計が1000Lにも達するような、またはそれ以上の任意の大量の第1の液体A1と第2の液体B1を取り扱うことができ、しかも、外気などの汚染源に接触させることなく、簡単な操作で両液を十分に混合することが可能になる。
該容器の容積は、特に限定はされないが、容積が大きいと、両液体を大量に混合し得る本発明の利点が顕著となる。該容器の好ましい容積は、特に限定はされず、要求に応じて適宜決定すればよいが、例えば、100L~1000L程度が一般的な細胞培養のための液体培地を大量生産するためには好ましい容積として例示される。
容器1の形状もまた、特に限定されず、例えば、立方体、直方体、円柱体、軟質の有機高分子材料製のフィルムからなる壁面を持った袋状物(例えば、2枚のフィルムの外周縁部を互いに接合した袋状物、底面と側面と持った袋状物、上面と底面と側面とを持った袋状物など)などであってもよい。
容器1が軟質の有機高分子材料製のフィルムなどからなる柔軟な袋状物であれば、次に示す(a)~(c)の好ましい作用が得られる。
(a)第1の液体または第2の液体を容器1に最初に注入する前に、該容器を収縮させて内部の空気を抜いておくことができる。容器1は、液体の注入につれて膨張することができるので、注入される液体は空気と接触することがない。
(b)第1の液体と第2の液体とを循環させることによって十分に混合された混合物(液状の培地組成物)を、該容器を収縮させながら、空気と接触させないように該容器1から、外部容器へと取り出すことができる。
(c)容器1が軟質の有機高分子材料製のフィルムなどからなる柔軟な袋状物であれば、該容器が安価に得られることから、該容器とチューブとを混合毎に使い捨てることができ、当該製造装置内の洗浄の手間が省けると共に、容器とチューブ内の無菌性がより高くなる。
該壁部のフィルムの厚さは、特に限定はされないが、通常、50μm~150μm程度、好ましくは100μm程度である。
前記の柔軟な袋状物の全体的な形態としては、2枚のフィルムの外周縁部を互いに接合した袋状物、底面と側面と持った袋状物、上面と底面と側面とを持った袋状物、種々の形状(直方体、6角柱(図4に示す)、多角柱、円柱など)を持った袋状物が例示される。
前記の柔軟な袋状物には、市販の細胞培養用のバッグを転用してもよいし、本発明専用の容器として前記フィルムを用いて製作してもよい。いずれの場合も、容器の壁面に少なくとも2つの開口部を形成し、それらの開口部同士をチューブで連結し、閉鎖された循環経路を構成すれば、本発明による製造装置が得られる。
これら少なくとも2つの開口部のいずれか一方または両方は、循環用チューブを取り外すことによって、容器内に記第1の液体と第2の液体を注入するための開口部として、または、容器内から両液体の混合物を取り出すための開口部として使用してもよい。
液体の循環に用いられる前記2つの開口部2、3は、外界に開放されることがないように、循環用チューブ4によって無菌的に連結されることが好ましい。一方、液体を容器内に注入するためのチューブ(注入用チューブ)は、濾過滅菌前の液体に接触している。よって、それを、濾過滅菌後のチューブ部分で切り離し、循環用に連結して使用すれば、内容液が汚染させる可能性がある。
以上の点からは、容器内に第1の液体および/または第2の液体を注入するための開口部は、循環用の2つの開口部とは別の開口部として必要数だけ設けることが好ましい。例えば、図3に示すように、専用の出入口としての開口部6を1つだけ設けて、該開口部6から、第1の液体と第2の液体を順次容器内に注入してもよいし、図4に示すように、2以上の開口部を設け、第1の液体と第2の液体を同時に容器内に注入してもよい。ここでいう「出入口としての開口部」は、液体を外部から容器内に注入するための入口用の開口部、および、混合後の液体(液状の培地組成物)を容器外に排出するための出口用の開口部をも意味する。例えば、入口用の開口部を設けておき、第1の液体と第2の液体を該入口用の開口部から容器内に注入し、混合後の液体を、循環のための開口部から取り出してもよい。また、例えば、出口用の開口部を設けておき、循環のための開口部から第1の液体と第2の液体を容器内に注入し、混合後の液体を出口専用の開口部から取り出してもよい。また、入口用の開口部と出口用の開口部をそれぞれ別個に容器に設けてもよい。
これら製造装置内の無菌性を維持するためには、注入用チューブの途中に、濾過フィルターを挿入し、濾過された液体を容器へ注入することが好ましい。例えば、図3に示すチューブ4cの途中にカートリッジ式のフィルターを組み込んで経路に挿入する構成が可能である。
また、容器、チューブ、滅菌フィルター、コネクターを接続する際に、外気によって汚染される恐れがあるため、容器、チューブ、滅菌フィルター、コネクターを全て接合し、閉鎖的な製造装置を構成した後に、γ線照射滅菌を実施することが好ましい。
図2(a)の態様では、容器の下面を構成する壁部に出口となる開口部2が設けられ、入口となる開口部3は、上面を構成する壁部に設けられ、これらがチューブ4で接続されている。これにより、容器内には矢印で示すような、上方から下方に向かう流れが生じ、第1の液体と第2の液体は効率良く混合される。
図2(b)の態様では、出口となる開口部2が前記容器の1つの壁部に設けられ、他方の開口部3が、前記壁部に対向する壁部に設けられ、これらがチューブ4で接続されている。これにより、容器内に矢印で示すように、容器内を水平に渡る流れが生じ、第1の液体と第2の液体は残らず混合される。
図2(c)の態様では、出口となる複数の開口部(図の例では、2a、2bの2つ)が前記容器の1つの壁部(図の例では、容器の底面を構成する壁部)に設けられ、入口となる複数の開口部(図の例では、3a、3bの2つ)が、前記壁部に対向する壁部(図の例では、容器の上面を構成する壁部)に設けられ、これらが複数対の入口と出口となっており各対の開口部(2a、3a)、(2b、3b)がそれぞれにチューブ4a、4bで接続され、該チューブ4a、4bがそれぞれ蠕動ポンプ5a、5bに装着されている。これにより、容器内に矢印で示すように、容器内には上方から下方への幅広い平行な流れが生じ、容器内の液体が循環の流れに加わる可能性が高くなり、第1の液体と第2の液体は効率良く混合される。尚、図2(c)の態様のように、複数のチューブが接続されている場合、一方のチューブ内を液体が移動する方向(例えば、図2(c)では上昇方向)に対して、他方のチューブ内を液体が移動する方向を逆方向(例えば、図2(c)では下降方向)として、容器内の流れに意図的な乱れを生じさせてもよい。
図2(a)~(c)の態様も同様であって、容器の姿勢を適宜変更して用いてもよい。
また、開口部には、前記のコネクターやカップリングの替りに、短いチューブが結合され、該チューブの外界側出口が前記のコネクターやカップリングによって閉じられていてもよい。
蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得、かつ、ポンピングチューブとして機能・作動し得る形状と柔軟性を持つとは、使用される蠕動ポンプに適合するチューブの内径、外形、および、長さを持つこと、および、蠕動ポンプのアクチュエーター(ローラーなど)に押圧されて潰れる軟らかさ、該アクチュエーターによる押圧から解放されたときに原形に復帰し得る弾性を持つことを、少なくとも意味する。
チューブは、全体がポンピングチューブとなり得るものであってもよいし、蠕動ポンプに装着される部分だけがポンピングチューブとなり得るものであってもよい。
ポンピングチューブとなる部分を蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させることにより、前記第1の液体と第2の液体が前記チューブ内を移動する。これにより、両液体が循環し、混合され、特定化合物が連結物質を介して結びついてなる構造体が均一に分散した液状の培地組成物が容器内に形成される。
ポンピングチューブとなる部分の材料は、第1の液体と第2の液体に影響を与えず、細胞培養に利用可能であり、かつ、弾性と柔軟性とを持った樹脂材料、とりわけ合成樹脂材料が好ましく、スチレン系熱可塑性エラストマー、シリコン系樹脂、フッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂などが挙げられる。
ポンピングチューブとなる部分の内径、肉厚、長さは、使用する蠕動ポンプに応じたものであればよく、内径は5mm~50mm程度、チューブの肉厚は2mm~6mm程度である。一例を挙げると、実施例で用いたチューブは、内径13mm、肉厚3mm(外径19mm)である。
チューブ全体の長さは、接続すべき開口部同士の間の距離や、容器の大きさに応じて適宜決定すればよく、例えば、1500mm~3000mm程度が挙げられる。
図3に例示した構成によって、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、そこへ他方の液体を注入するという手順が可能になる。とりわけ、図3に示したように、第2の液体B1を先に収容しておき、これを循環させながら、第1の液体A1を外部容器7から所定の流量にて容器1内に注入するという混合手順が可能になる。
尚、外部容器7から容器1に液体を移動させるに際しては、チューブ4cを蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプの送り能力を利用してもよいし、外部容器7を容器1よりも上方に配置し、外部容器7内の液体を、重力によってチューブ内を移動させ、容器1内へと落下させてもよい。
容器1の全体的な形状は、図4(c)に示すように六角柱を呈する柔軟なバッグである。図の例では、該六角柱を呈する柔軟なバッグそれ自体は、市販の細胞培養バッグを利用したものである。図4(a)は容器1の一方の端面1aを示しており、図4(b)は容器1の他方の端面1bを示している。これら両端面1a、1bは、六角柱の端面として六角形を呈しており、これら両端面が垂直面となるように、容器の姿勢が保たれている。
図4(a)に示すように、端面1aの上部には、容器1内に第1の液体を流入させるための開口部6aと、容器1内に第2の液体を流入させるための開口部6bとが設けられている。開口部6cは閉鎖されており、混合液の取り出しなどに利用され得る。一方、図4(b)に示すように、端面1bの下部と上部には、循環用の開口部2、3がそれぞれ設けられている。図の例では、全ての開口部には、管路となるチューブを接続するためのコネクターが設けられている。
図4(c)は、当該製造装置全体の接続構成を示すブロック図である。容器1の端面1aでは、開口部6aに対しては、第1の液体が収容された外部容器7aが管路(チューブ)41を介して接続され、開口部6bに対しては、第2の液体が収容された外部容器7bがチューブ42を介して接続されている。これら外部容器7a、7bは、当該製造装置の要素として含めてもよいし、外部の液体供給源とみなしてもよい。
開口部6aに接続されたチューブと、外部容器7aに接続されたチューブとが、無菌コネクターC1によって1つのチューブ41へと連結されている。同様に、開口部6bに接続されたチューブと、外部容器7bに接続されたチューブとが、無菌コネクターC2によって1つのチューブ42へと連結されている。一方、容器1の端面1bでは、開口部2にチューブ43が接続され、該チューブ43は無菌コネクターC3によってポンピングチューブ44に接続され、該ポンピングチューブ44はローラーポンプ5に装着されかつ通過して、無菌コネクターC4によってチューブ45に接続され、該チューブ45は開口部3に接続されている。
図4(c)の例では、先ず、空気が抜かれて収縮した状態の容器1に対して、外部容器7bに収容された第2の液体が容器1に注入される。容器1は、注入された第2の液体の分だけ膨らむ。次いで、ローラーポンプ5が作動し、第2の液体を循環させながら、外部容器7aに収容された第1の液体が容器1に注入され、その後の循環により混合が進行する。ローラーポンプ5は、液体が開口部2から開口部3へ向かうように、ポンピングチューブ44への圧縮ポイントを移動させる。これにより、容器1内の液体は、上方から下方に向かうように移動する。
図5は、蠕動ポンプの構成の一例を概略的に示した図である。同図の例では、ハウジング11に円弧状や半円状の外周壁面11aが設けられ、該外周壁面11aに沿ってポンピングチューブ4が湾曲して装着されている。該外周壁面11aは、ポンピングチューブ4を外周側で支持している。該ポンピングチューブ4の湾曲の内周側では、アーム12に支持されたローラー13が回転軸14を中心に、液体送り方向(矢印fの方向)に回転し、それにより、蠕動運動のごとくポンピングチューブ4が液体送り方向に順次圧縮され、ポンピングチューブ内の液体が送られる。蠕動ポンプにチューブを装着するとは、図5に例示するように、チューブ4が蠕動ポンプのポンピングチューブとして機能するように、チューブ4を蠕動ポンプの送り駆動部分(チューブを順次圧縮する部分)に挿通してセットすることを意味する。
図5の例では、直線状のアーム12の両端に2つのローラー13が設けられているが、蠕動ポンプによっては、より多数のローラが設けられたものや、アームを持たない1つの大きなローラーが偏心した軸を中心に回転するものなどもある。蠕動ポンプは、図5のように経路が湾曲した構造のものであってもよいし、直線的に配列された多数のアクチュエーターがポンピングチューブを局所的に順次圧縮し、該ポンピングチューブに蠕動運動を加える構造のものであってもよい。蠕動ポンプの送り構造の詳細については、従来技術を参照することができる。
第1、第2の液体を混合するためのそれら液体の循環の流量を増大させるためには、より大きい内径のポンピングチューブと、より大きい送り能力を持った蠕動ポンプを用いてもよいし、小さい送り能力を持ったチューブと蠕動ポンプのペアを必要なペア数だけ平行に用い、液体を平行に循環させてもよい。
容器の容積に対して、蠕動ポンプによる液体の流量が過度に小さいと、混合に長時間を要し、また、混合が十分になされない状態が局所的に生じる場合がある。
蠕動ポンプの作動時間(即ち、循環を継続させて混合する時間)は、蠕動ポンプの送り量に応じて、また、混合状態に基づいて、適宜決定すればよい。一例を挙げると、容器の容積が50L~150L程度であって、蠕動ポンプの送り能力が10(L/分)程度である場合には、2~4時間程度が好ましい作動時間として例示される。
第1の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、第2の液体が2価金属カチオンである連結物質を含有する液体(例えば、カルシウムイオンおよび/またはマグネシウムイオンを含有する液体培地)であるような場合には、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を容器内に注入するという手順が好ましく、予め両液体を所定の割合にて容器内に注入した後で循環を開始する場合に比べて、脱アシル化ジェランガムが培養液の局所に偏重し難くなるという効果が得られる。とりわけ、第2の液体(前記液体培地)を先に容器に収容し、これを蠕動ポンプで循環させながら、第1の液体(該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液)を容器内に注入する場合には、脱アシル化ジェランガムがより好ましく分散する傾向が見られる。
混合時の一例を挙げると、容器の容積が50L~150L程度であって、第1の液体と第2の液体の体積比率が1:1であり、蠕動ポンプの送り能力が10(L/分)程度である場合には、一方の液体を先に容器1に収容し、蠕動ポンプを作動させて液体を循環させながら、0.5時間~1.0時間程度の間に、他方の液体を全量容器1に注入し、その後さらに2.0時間~4.0時間程度、混合液の循環を継続することが好ましい。
尚、一方の液体を蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を容器内に注入するという手順では、図3に当該製造装置の構成例を示すように、液体を循環させるための2つの開口部に加えて、後から容器内に液体を注入するための開口部6を別途設けることが好ましい。該開口部6は、出入口用であってもよい。
蠕動ポンプは、手動によって作動と停止の制御を行ってもよいし、当該製造装置に制御装置を設け、該制御装置によって、予め定められた時間だけ蠕動ポンプが自動的に作動するように制御してもよい。
第1の液体は、特定化合物として、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する。
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。本発明に用いられる高分子化合物には、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上が含まれていてもよい。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL(シーピー・ケルコ社の登録商標)CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル(シーピー・ケルコ社の登録商標)HT」等を使用することができる。
第2の液体は、連結物質として2価金属カチオンを含有する。2価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。2価金属カチオンの種類は、第1の液体中に含まれる特定化合物が、当該2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくはカルシウムイオンである。
第2の液体中の2価金属カチオン濃度は、最終的に得られる液状の培地組成物中の2価金属カチオン濃度と、第1の液体と第2の液体との混合比率から算出することができる。
本態様においては、本発明の製造方法により、第1の液体と第2の液体を混合することにより、第1の液体に含まれていた特定化合物が第2の液体に含まれていた連結物質を介して結びついてなる構造体を含む、目的とする液状の培地組成物を直ちに得ることができる。
本発明の製造方法により得ることができる液状の培地組成物は、第1の液体に含まれていた特定化合物が第2の液体に含まれていた連結物質(即ち、2価金属カチオン)を介して結びついてなる構造体を含有し、且つ該培地組成物中に該構造体が均一に分散されているので、当該培地組成物を用いると、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能である。
DAG又はその塩:0.005~0.02%(好ましくは0.01~0.02%)(w/v)
DAG以外の多糖類
キサンタンガム:0.1~0.4%(w/v)
アルギン酸ナトリウム:0.0001~0.4%(w/v)(好ましくは、0.1~0.4%(w/v))
ネイティブジェランガム:0.0001~0.4%(w/v)
ローカトビーンガム:0.1~0.4%(w/v)
メチルセルロース:0.1~0.4%(w/v)(好ましくは0.2~0.4%(w/v))
カラギーナン:0.05~0.1%(w/v)
ダイユータンガム:0.05~0.1%(w/v)
濃度[%(w/v)]=特定化合物の重量(g)/培地組成物の体積(mL)×100
第1の液体中のDAG濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のDAG濃度に、(V1+V2)/V1(即ち、150/100~300/100、好ましくは、200/100)を乗じて得られる濃度である。
第2の液体中のカルシウムイオン濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中のカルシウムイオン濃度に、(V1+V2)/V2(即ち、150/50~300/200、好ましくは、200/100)を乗じて得られる濃度である。
第2の液体中の培地構成成分の濃度は、上述の混合の結果として得られる液状の培地組成物中の培地構成成分の濃度に、(V1+V2)/V2(即ち、150/50~300/200、好ましくは、200/100)を乗じて得られる濃度である。
該液状の培地組成物には、DAGがカルシウムイオンを介して結びついてなる構造体が均一に分散して含まれることにより、粘度が実質的に高められること無く、細胞及び/又は組織を均一に浮遊させる(好ましくは浮遊静置させる)ことができる。
本発明の製造方法により得られる液状の培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び/又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び/又は組織を容易に回収することもできる。当該培地組成物を用いると、従来プレート上で単層で、細胞容器に接着した状態での培養を要していた細胞を、浮遊状態にて培養することができるので、接着性の細胞をその機能を損なうことなく効率的に大量に調製することができる。
〔製造装置の各部の仕様〕
図4に示した容器(柔軟なバッグ)1と各チューブ41~45、および、蠕動ポンプとしてのローラーポンプ5を用いて、第1、第2の液体を混合し、液状の培地組成物を製造した。
第1の液体は、脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液(濃度:0.040%)であり、第2の液体は、カルシウムイオンを含有する液体培地(カルシウムイオン濃度:3.29mM)である。
容器1は、ポリエチレン製の柔軟なフィルムを壁部の素材として用いた袋状物(バッグ)であり、容積は100Lである。
ローラーポンプは、古江サイエンス(株)製のRP-KGIである。ローラーポンプに装着される循環用チューブの内径は13mmであり、外形は19mmである。ローラーポンプの送り量は、約10L/分である。ローラーポンプ5による液体の送り方向は、液体が開口部2から出てローラーポンプ5を経て開口部3へ向かうという方向である。
空気が抜かれて収縮した状態の容器1に対して、外部容器7bに収容された第2の液体50Lを容器1に注入した。次いで、ローラーポンプ5を作動させ、第2の液体を循環させながら、外部容器7aに収容された第1の液体50Lを容器1に0.5時間をかけて注入した。また、第1の液体50Lの注入が完了した時点からさらに、循環を3時間継続させて混合を完了し、液状の培地組成物を得た。
上記で得られた液状の培地組成物が、好ましく混合されたものであるかどうか、即ち、第1および第2の液体の混合によって形成された構造体(第1の液体に含まれていた特定化合物が、第2の液体に含まれていた2価金属カチオンを介して集合した構造体)が、液状の培地組成物中に好ましく分散して浮遊した状態となっているかどうかを、下記に示す性能評価試験方法(本発明のために新たに規定した試験方法)を実施し、評価した。
(1)構造体の形成時間を十分に確保する点から、試験は、培地組成物の混合を完了した時点から48時間後に開始する。
(2)ポリスチレン製のビーズ(直径600μm、Polysciences社製)10mgを、容積15mLの滅菌済コニカルチューブに入れ、該コニカルチューブ内へさらに、評価すべき培地組成物を10mL注入し、転倒混和する。
(3)転倒混和終了の直後において、コニカルチューブ内の培地組成物の液面までビーズが均一に分散していることを目視で確認する。
(4)前記(3)の状態の試料を、コニカルチューブを立てた状態とし、培地成分の劣化防止の点から4℃の温度として、12時間以上静置した後、ビーズの分散状態(分散したままであるか、沈降する傾向があるか)を目視にて判定する。構造体が培地組成物中に好ましく分散して浮遊した状態となっていれば、図6(a)に模式的に示すように、該構造体の分散的な浮遊の影響を受けて、ビーズもまた培地組成物中に分散し浮遊したままとなる。一方、混合が好ましくなく、培地組成物中に構造体がより大きい集合体となって浮遊している場合には、培地組成物のうちの残りの構造体の無い部分も大きくなるので、図6(b)に模式的に示すように、構造体の浮遊の影響を受けずに沈降するビーズも多くなる。このように、培地組成物にビーズを混ぜれば、目視では確認し難い構造体の分散の様子を、該ビーズを通じて確認することができる。
(5)ビーズの分散状態の判定基準
合格:ビーズが培地組成物の液面まで均一に分散していること。本実施例では、15mLのコニカルチューブに10mLの培地組成物を注入した場合の判定の目安として、図6(a)に模式的に示すように、9mLのライン以上にビーズが分散しており、チューブの底にビーズの沈降による集まりが全くみられないこととした。
不合格:ビーズが培地組成物の液面まで均一に分散していないこと。本実施例では、前記の合格基準とは逆に、15mLのコニカルチューブに10mLの培地組成物を注入した場合、図6(b)に模式的に示すように、9mLのライン以上にはビーズが無く、チューブの底(とりわけ、1.5mLラインよりも下部)にビーズの沈降による集まりが見られることとした。
上記で得られた培地組成物に対して、上記性能評価試験方法を実施した結果、ビーズの分散状態は合格であり、本発明の製造方法および製造装置が、第1および第2の液体を好ましく混合し得る優れた方法および装置であることがわかった。
2、3 開口部
4 チューブ
5 蠕動ポンプ
Claims (15)
- 下記(i)の特定化合物を含有する第1の液体と、下記(ii)の連結物質を含有する第2の液体とを混合して、液状の培地組成物を製造する方法であって、
少なくとも2つの開口部が壁部に設けられた容器を用い、ここで、前記少なくとも2つの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結され、該チューブは、蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着され得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
前記チューブを前記蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させることによって、前記容器内の前記第1の液体と前記第2の液体が外気に接触することがない閉鎖系の構成にて、前記第1の液体と前記第2の液体を、前記チューブと前記容器との間を循環させて混合し、前記特定化合物が前記連結物質を介して結びついてなる構造体が分散した液状の培地組成物を容器内に形成することを特徴とする、
前記液状の培地組成物の製造方法。
(i)2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物である特定化合物。
(ii)2価金属カチオンである連結物質。 - 前記(i)の特定化合物が脱アシル化ジェランガムであり、第1の液体が該脱アシル化ジェランガムを含有する水溶液であり、
前記(ii)の連結物質が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方であり、第2の液体が、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの一方または両方を含有する液体培地の濃縮液である、
請求項1記載の液状の培地組成物の製造方法。 - 前記液状の培地組成物中の脱アシル化ジェランガムの濃度が、0.001%(w/v)~1.0%(w/v)である、請求項2に記載の培地組成物の製造方法。
- 第1の液体と第2の液体との体積混合比率が、第1の液体の体積100に対して、第2の液体の体積50~200である、請求項1~3のいずれか1項に記載の液状の培地組成物の製造方法。
- 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に出口として設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に入口として設けられており、
前記蠕動ポンプを作動させて、第1の液体と第2の液体を、それら液体がチューブ内を前記出口から前記入口に向かう方向に移動させ、それにより、容器内の第1の液体と第2の液体を、上方から下方へ向かう方向に移動させる、
請求項1~4のいずれか1項に記載の製造方法。 - 前記2つの開口部が出口と入口として1対になっており、前記容器には前記2つの開口部が複数対設けられ、各対における2つの開口部がそれぞれにチューブで接続されており、
前記第2の工程において、それぞれのチューブを別個の蠕動ポンプに装着し、該蠕動ポンプを作動させて、前記第1の液体と第2の液体とを、各チューブを通して循環させる、
請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。 - 前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それによって、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、請求項1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部が設けられており、
前記容器に第1の液体および第2の液体のうちのいずれか一方の液体を先に入れておき、該液体を前記蠕動ポンプで循環させながら、他方の液体を前記出入口用の開口部から容器内に注入する、
請求項1~7のいずれか1項に記載の液状の培地組成物の製造方法。 - 請求項1記載の液状の培地組成物の製造方法を実施するために用いられる製造装置であって、
当該製造装置は、前記製造方法において混合される第1の液体と第2の液体を収容するための容器を有し、
該容器の壁部には少なくとも2つの開口部が設けられ、これらの開口部は、容器外のチューブによって互いに連結されており、
前記チューブは、該チューブ内の液体を送るように構成された蠕動ポンプにポンピングチューブとして装着し得かつ該蠕動ポンプにおいてポンピングチューブとして作動し得る形状と柔軟性とを持った部分を有するものであり、
前記容器内の前記第1の液体と前記第2の液体が外気に接触しないように閉鎖系の構成を有する、
前記製造装置。 - 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられている、
請求項9記載の製造装置。 - 前記2つの開口部が出口と入口として1対になっており、前記容器には前記2つの開口部が複数対設けられ、各対における2つの開口部がそれぞれにチューブで接続されている、請求項9または10記載の製造装置。
- さらに、前記蠕動ポンプを当該製造装置の構成要素として有し、該蠕動ポンプは、前記チューブを装着し該チューブをポンピングチューブとして作動させるものである、請求項9~11のいずれか1項に記載の製造装置。
- 前記一方の開口部が、前記容器の底面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の底部に設けられ、
前記他方の開口部が、前記容器の上面を構成する壁部に、または、側面を構成する壁部の上部に設けられており、
前記チューブ内の液体が下側の開口部から上側の開口部へと移動するように、前記蠕動ポンプが作動するように構成され、それにより、容器内に収容された液体が、上方から下方へと移動するようになっている、
請求項12記載の製造装置。 - 前記容器が、該容器の内部に収容される液体の体積に応じて該容器の容積が変動し得るように柔軟な材料からなるものであり、それにより、該容器内の密閉性を確保しながらも該容器内に液体を注入しかつ該容器外に液体を排出することが可能となっている、請求項9~13のいずれか1項に記載の製造装置。
- 前記容器には、該容器内への液体の出し入れに用いる出入口用の開口部がさらに設けられている、請求項9~14のいずれか1項に記載の製造装置。
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