CN112601813A - 细胞的培养或诱导方法 - Google Patents

细胞的培养或诱导方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112601813A
CN112601813A CN201980054197.8A CN201980054197A CN112601813A CN 112601813 A CN112601813 A CN 112601813A CN 201980054197 A CN201980054197 A CN 201980054197A CN 112601813 A CN112601813 A CN 112601813A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
medium
cells
cell
closed system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980054197.8A
Other languages
English (en)
Inventor
田边刚士
须藤健太
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epping World Co ltd
I Peace Inc
Original Assignee
Epping World Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epping World Co ltd filed Critical Epping World Co ltd
Publication of CN112601813A publication Critical patent/CN112601813A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

提供一种细胞的培养或诱导方法，其包括在封闭体系内培养或诱导细胞。

Description

细胞的培养或诱导方法
技术领域
本发明涉及细胞技术，并且涉及一种细胞的培养或诱导方法。
背景技术
胚胎干细胞(ES细胞)是由人类或小鼠的早期胚胎建立的干细胞。ES细胞具有能够分化为生物体内所存在的所有细胞的多能性。现在，人类ES细胞可以应用于针对帕金森病、幼年型糖尿病和白血病等众多疾病的细胞移植疗法中。然而，在ES细胞的移植中也存在障碍。特别是ES细胞的移植可能引起与随着不成功的器官移植而产生的排斥反应同样的免疫排斥反应。另外，对于破坏人类胚胎而建立的ES细胞的利用而言，从来自伦理性观点批判或反对意见较多。
在此种背景的状况下，京都大学的山中伸弥教授通过将4种基因：OCT3/4、KLF4、c-MYC和SOX2导入至体细胞，从而成功地建立诱导性多能干细胞(iPS细胞)。由此，山中教授获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖(例如参照专利文献1、专利文献2)。iPS细胞是没有排斥反应和伦理性问题的理想的多能性细胞。因此，期待将iPS细胞应用于细胞移植疗法中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4183742号公报
专利文献2：日本特开2014-114997号公报
发明内容
技术问题
期望一种能够高效且简便地培养或诱导不限于iPS细胞的各种各样的细胞的方法。因此，本发明的目的之一在于，提供一种能够高效且简便地培养或诱导细胞的方法。
技术方案
根据本发明的实施方式，提供一种细胞的培养或诱导方法，其包括在封闭体系内培养或诱导细胞。
在上述的方法中，诱导可以包括再编程、初始化、转分化、分化诱导和细胞命运改变中的至少任一种。
在上述的方法中，在封闭体系内与外部之间可以不发生气体交换。
上述的方法还可以包括对封闭体系内的温度进行控制。
在上述的方法的培养中，封闭体系可以密闭。
在上述的方法中，在封闭体系密闭的状态下，外部气体可以不进入封闭体系内。
在上述的方法中，在封闭体系密闭的状态下，封闭体系外的细胞、微生物、病毒和灰尘可以不进入封闭体系内。
在上述的方法中，在封闭体系密闭的状态下，封闭体系内的物质可以不流出到封闭体系外。
在上述的方法中，可以不向封闭体系内供给二氧化碳气体、氮气和氧气中的至少任一种。
在上述的方法中，可以将封闭体系内的培养基的pH保持在预定的范围内。
在上述的方法中，封闭体系的至少一部分可以通过埋入非透气性物质而形成。
在上述的方法中，封闭体系的至少一部分也可以包括非透气性物质。
在上述的方法中，可以在封闭体系内补充或更换培养基的同时培养或诱导细胞。
在上述的方法中，可以在封闭体系内使培养基循环的同时培养或诱导细胞。
在上述的方法中，封闭体系具备培养细胞的培养槽，在培养槽设置有用于向培养槽内供给流体的供给口和用于排出封闭体系内的流体的排出口，供给口和排出口可以是能够密闭的。
在上述的方法中，用于向供给口供给流体的供给器是能够装卸的，用于向排出口排出流体的排出器是能够装卸的，如果从供给器向培养槽内供给流体，则培养槽内的流体可以移动至排出器内。
在上述的方法中，如果从供给器向培养槽内供给培养基，则培养槽内的空气可以移动至排出器内。
在上述的方法中，如果从供给器向培养槽内供给培养基，则培养槽内的培养基可以移动至排出器内。
在上述的方法中，培养基可以含有细胞。
在上述的方法中，从供给器向培养槽内供给流体时，外部气体可以不进入培养槽内。
在上述的方法中，在进行培养中，可以不控制封闭体系内的二氧化碳浓度。
在上述的方法的培养中，可以不控制封闭体系外的二氧化碳浓度。
在上述的方法的培养中，封闭体系内的物质可以通过封闭体系内的半透膜移动。
在上述的方法中，封闭体系具备培养细胞的培养槽和连接于培养槽的流路，培养基可以在培养槽与流路中循环。
在上述的方法中，在流路中与外部可以不发生气体交换。
在上述的方法中，通过培养基循环，培养槽内的培养基的pH可以保持在预定的范围内。
在上述的方法中，培养可以是悬浮培养。
在上述的方法中，培养可以是粘附培养。
在上述的方法中，可以在封闭体系内的凝胶培养基中培养细胞。
在上述的方法中，可以在封闭体系内的液体培养基中培养细胞。
在上述的方法中，可以搅拌封闭体系内的培养基。
在上述的方法中，可以不搅拌封闭体系内的培养基。
上述的方法还包括对细胞进行传代。
在上述的方法中，在接种与传代期间可以不进行培养基的添加和更换。
在上述的方法中，在接种与传代期间可以进行培养基的添加或更换。
在上述的方法中，在传代与传代期间可以不进行培养基的添加和更换。
在上述的方法中，在传代与传代期间可以进行培养基的添加或更换。
在上述的方法中，细胞可以是干细胞。
在上述的方法中，干细胞可以是iPS细胞、ES细胞或成体干细胞。
上述的方法的培养中，干细胞可以维持未分化状态。
在上述的方法中，在进行培养中，干细胞可以维持多能性。
在上述的方法中，细胞可以是体细胞。
在上述的方法中，细胞可以是从血液系统细胞、神经系统细胞、心肌系统细胞、上皮系统细胞、间叶系统细胞、肝细胞、胰岛素产生细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞中选择的至少一种。
在上述的方法中，细胞可以是被导入了诱导因子的细胞。
在上述的方法中，可以向封闭体系内的培养基添加诱导因子，向在封闭体系内培养的细胞导入诱导因子。
在上述的方法中，细胞可以被诱导为干细胞。
在上述的方法中，干细胞可以是iPS细胞。
在上述的方法中，细胞可以是血液系统细胞。
在上述的方法中，细胞可以被诱导为其他种类的细胞。
在上述的方法中，细胞为血液系统细胞，可以向封闭体系内的培养基添加诱导因子，将诱导因子导入在封闭体系内培养的血液系统细胞，将血液系统细胞诱导为iPS细胞。
在上述的方法中，诱导因子可以包含在质粒中。
在上述的方法中，诱导因子可以是RNA。
在上述的方法中，诱导因子可以包含在仙台病毒中。
另外，根据本发明的实施方式，提供一种细胞的培养或诱导方法，其包括：准备细胞培养器，上述细胞培养器具备：培养成分能够透过的培养成分透过部件、覆盖培养成分透过部件的一侧的面，并用于保持含细胞培养基且培养细胞的培养槽、以及覆盖培养成分透过部件的另一侧的面且用于保持培养基的培养基保持槽；以及在培养槽中培养或诱导细胞。
在上述的方法中，诱导可以包括再编程、初始化、转分化、分化诱导和细胞命运改变中的至少任一种。
在上述的方法中，可以相对于外部封闭细胞培养器的内部。
在上述的方法中，细胞培养器内的培养基的pH可以保持在预定的范围内。
在上述的方法中，培养可以是悬浮培养。
在上述的方法中，细胞可以是干细胞。
在上述的方法中，细胞可以是体细胞。
在上述的方法中，细胞可以是从血液系统细胞、神经系统细胞、心肌系统细胞、上皮系统细胞、间叶系统细胞、肝细胞、胰岛素产生细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞中选择的至少一种。
在上述的方法中，细胞可以是被导入了诱导因子的细胞。
在上述的方法中，也可以向培养槽内的培养基添加诱导因子，向在培养槽内培养的细胞导入诱导因子。
在上述的方法中，细胞可以被诱导为其他种类的细胞。
在上述的方法中，细胞培养器可以具备与培养成分透过部件的培养槽侧的面重叠并设置有开口的培养侧板。
在上述的方法中，细胞培养器可以具备与培养成分透过部件的培养基保持槽侧的面重叠并设置有开口的培养侧板。
在上述的方法中，培养侧板可以是深色。
上述的方法可以包括将培养侧板的不设置有开口的部分作为背景，对细胞或由细胞组成的细胞团进行观察。
上述的方法可以包括将培养侧板的不设置有开口的部分作为背景，对细胞或由细胞组成的细胞团进行拍摄。
上述的方法还可以包括添加或更换培养基保持槽的培养基。
发明效果
根据本发明，可以提供一种能够高效且简便地培养或诱导细胞的方法。
附图说明
图1是实施方式的细胞培养器的分解立体图。
图2是实施方式的细胞培养器的立体图。
图3是实施方式的细胞培养器的一部分的主视图。
图4是实施方式的细胞培养器的一部分的立体图。
图5是实施方式的细胞培养器的一部分的主视图。
图6是实施方式的细胞培养器的后视图。
图7是实施方式的细胞培养器的分解立体图。
图8是用实施例1的培养方法培养出的细胞的光学显微镜照片。
图9是示出将用实施例1的培养方法培养出的细胞通过流式细胞仪分析得到的结果的分布图。
图10的(a)是在实施例2的培养方法中使用的试管的照片。图10的(b)是用实施例2的培养方法培养出的细胞的光学显微镜照片。
图11是示出将用实施例2的培养方法培养出的细胞通过流式细胞仪分析得到的结果的分布图。
图12是用实施例3的培养方法培养出的细胞的光学显微镜照片。
图13是示出将用实施例3的培养方法培养出的细胞通过流式细胞仪分析得到的的结果的分布图。
图14是在实施例4的诱导性多能干细胞的制作方法中使用的培养瓶的照片。
图15是用实施例4的诱导性多能干细胞的制作方法制作出的细胞的光学显微镜照片。
图16是按每个集落的形态示出用实施例4的诱导性多能干细胞的制作方法制作出的细胞的集落数的图。
图17是示出将用实施例4的诱导性多能干细胞的制作方法制作出的细胞通过流式细胞仪分析得到的结果的分布图。
图18是用实施例5的诱导性多能干细胞的制作方法制作出的细胞的光学显微镜照片。
图19是示出将用实施例5的诱导性多能干细胞的制作方法制作出的细胞通过流式细胞仪分析得到的结果的分布图。
图20是实施例6的细胞培养器的分解立体图。
图21是实施例6的细胞培养器的立体图。
图22是实施例6的细胞团的显微镜照片。
图23是示出实施例6的iPS细胞的流式细胞仪的结果的分布图。
图24是实施例7的细胞团的显微镜照片。
图25是示出实施例7的iPS细胞的流式细胞仪的结果的分布图。
图26是实施例8的细胞团的显微镜照片。
图27是示出实施例8的iPS细胞的流式细胞仪的结果的分布图。
符号说明
10…培养成分透过部件、21…培养侧板、22…培养基侧板、30…培养槽、31…箱体、32…盖体、33…插销、34…插销、40…培养基保持槽、41…整流板、51…导入用流体机械、52…排出用流体机械、60…培养基罐、61…插销、62…插销、70…流路箱、80…驱动部保持部件、82…孔、90…衬垫、110…半透膜、131…开口、132…窗、140…开口、145…喷出块、151…泵头、152…泵头、200…培养基流路、231…供给口、240…导入口、241…喷出口、242…开口、251…驱动部、252…驱动部、331…排出口、340…排出口、351…导入用流体机械用外部气体阻断部件、352…排出用流体机械用外部气体阻断部件、401…输入装置、402…输出装置、403…关系储存装置、501…图像处理部、511…轮廓定义部、512…细胞评价部、513…统计处理部、514…密度计算部、515…培养基评价部
具体实施方式
实施方式的细胞的培养方法包括在封闭体系内培养细胞。封闭体系为例如完全封闭的体系，并且在封闭体系内与外部之间不发生气体交换。封闭体系为例如，被密闭且外部气体不进入封闭体系内。例如，封闭体系外的细胞、微生物、病毒和灰尘不进入封闭体系内。例如，封闭体系内的物质不流出至封闭体系外。
细胞可以在封闭体系内的液体培养基中进行培养，可以在凝胶培养基中进行培养。另外，细胞可以在封闭体系内进行粘附培养，也可以进行悬浮培养。在封闭体系内培养细胞期间，可以搅拌培养基，也可以不搅拌培养基。当粘附培养细胞时，可以使用饲养细胞，也可以不使用饲养细胞。在悬浮培养细胞时，可以不使用饲养细胞。
在封闭体系内培养的细胞可以是包括人类在内的动物细胞，也可以是昆虫细胞，还可以是植物细胞。
在封闭体系内培养的细胞可以是例如体细胞，也可以是分化细胞，也可以是未分化细胞，还可以是干细胞。在封闭体系内培养的细胞虽然没有特别的限定，但也可以是例如血液系统细胞、神经系统细胞、心肌系统细胞、上皮系统细胞、血管内皮细胞、间叶系统细胞、成纤维细胞、肝细胞、胰岛素产生细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞。
血液系统细胞可以是T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、巨核细胞、巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、造血干细胞、血液干/前体细胞、红细胞、白细胞和血小板等血液细胞。神经系统细胞可以是神经细胞和胶质细胞、少突胶质细胞、神经干细胞。心肌系统细胞可以是心肌干细胞和心肌细胞、起搏细胞。上皮系统细胞可以是角质细胞、肠道上皮细胞、口腔上皮细胞、角膜上皮细胞上皮细胞。间叶系统细胞可以是真皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和软骨细胞等。
干细胞是例如，诱导性多能干(iPS)细胞、胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞。成体干细胞也可以是间叶系统干细胞。在细胞为干细胞的情况下，干细胞在培养基中在维持未分化的状态且维持多能性的状态的情况下进行增殖。
例如，干细胞在进行悬浮培养前，被分解为单细胞或细胞团，将被分解为单细胞或细胞团的干细胞加入培养基。单细胞或细胞团以保持克隆性的状态进行增殖，并在培养基中形成集落。
干细胞在例如，干细胞用培养基中进行培养。作为干细胞用培养基，可使用例如mTeSR1(注册商标，干细胞技术有限公司(STEMCELL TECHNOLOGIES))等人类ES/iPS培养基。
但是，干细胞用培养基不限于此，可使用各种干细胞培养基。例如，也可以将含有20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher SCIENTIFIC))、GlutaMAX(注册商标，赛默飞世尔科技公司)和非必须氨基酸(NEAA)的培养基用作干细胞培养基。或者，也可以将灵长类ES细胞培养基(Primate ES Cell Medium)、Reprostem、ReproFF、ReproFF2、ReproXF(Reprocell公司)、TESR2、TESRE8、ReproTESR(干细胞技术有限公司)、PluriSTEM(注册商标)人类ES/iPS培养基(默克公司(Merck))、用于人类iPS和ES细胞的NutriStem(注册商标)XF/FF培养基(XF/FF Culture Medium for Human iPS and ESCells)、Pluriton重编程培养基(Pluriton reprogramming medium)(Stemgent公司)、PluriSTEM(注册商标)、Stemfit AK02N、Stemfit AK03(味之素公司(Ajinomoto))、用于hESC/iPS的ESC-Sure(注册商标)血清和无饲养层培养基(应用干细胞公司(Appliedstemcell))、以及L7(注册商标)hPSC培养基系统(龙沙公司(LONZA))等用作干细胞培养基。
封闭体系内的培养基可以根据在封闭体系内培养的细胞的种类进行适当地选择。例如，在细胞为血液系统细胞的情况下，将适合血液系统细胞的培养基加入封闭体系。例如，在细胞是间叶系统细胞的情况下，将适合间叶系统细胞的培养基加入封闭体系。
培养基可以不包含例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，basic fibroblastgrowth factor)等生长因子。或者，培养基也可以包含400μg/L以下、40μg/L以下或10μg/L以下的低浓度的bFGF等生长因子。
另外，培养基可以不含有tgf-β。或者，培养基也可以包含2μg/L(2ng/mL)以下、600ng/L以下、300ng/L以下或者100ng/L以下的低浓度的tgf-β。
培养基也可以包含从钙黏蛋白、层连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白组成的组中选择的至少一种物质。
当培养基是凝胶培养基时，凝胶培养基是通过向培养基中加入脱酰基结冷胶使其最终浓度为例如0.001重量％至0.5重量％、0.005重量％至0.1重量％、或者0.01重量％至0.05重量％调制而成。
凝胶培养基可以包含由结冷胶、透明质酸、中性树胶(Rhamsan gum)、定优胶(diutan gum)、黄原胶、卡拉胶、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李糖以及它们的盐组成的组中选择的至少一种高分子化合物。另外，凝胶培养基也可以包含甲基纤维素。由于含有甲基纤维素，可以更加抑制细胞之间的聚集。
或者，凝胶培养基也可以包含从聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(poly(glycerolmonomethacrylate)，PGMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟丙基酯)(poly(2-hydroxypropylmethacrylate)，PHPMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAM)、胺封端(amine terminated)、羧酸封端(carboxylic acid terminated)、马来酰亚胺封端(maleimide terminated)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯封端(N-hydroxysuccinimide ester terminated)、三乙氧基硅烷封端(triethoxysilaneterminated)、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酰胺)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-丙烯酸丁酯)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸)(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid))、聚(N-异丙基丙烯酰胺-共聚-甲基丙烯酸-共聚-丙烯酸十八烷基酯(Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylicacid-co-octadecyl acrylate))和N-异丙基丙烯酰胺(N-Isopropylacrylamide)中选择的少量温敏凝胶。
应予说明，在本公开中，凝胶状的培养基或凝胶培养基包括聚合物培养基。
在封闭体系内培养细胞期间，封闭体系内的培养基的温度保持在例如0℃以上、4℃以上、15℃以上、20℃以上或34℃以上。另外，在封闭体系内培养细胞期间，封闭体系内的培养基的温度保持在例如45℃以下、39℃以下或20℃以下。在封闭体系内培养细胞期间，也可以使用加热器和冷却器等温度控制装置对封闭体系内的培养基的温度进行控制。
加入封闭体系的培养基的pH在例如4.0以上、5.0以上、6.0以上、7.0以上或8.0以上。另外，加入封闭体系的培养基的pH在例如10.0以下、9.0以下、8.8以下或8.0以下。加入封闭体系的培养基由于存在于封闭体系内，因此在培养细胞期间，pH倾向于保持在上述范围内。如果加入封闭体系的培养基的pH在7.0以上或8.0以上，则在封闭体系内培养细胞过程中将乳酸中和从而抑制pH的降低，因此是优选的。
在封闭体系内培养细胞期间，可以不向封闭体系内供给二氧化碳气体、氮气和氧气中的至少任一种或全部。另外，在封闭体系内培养细胞期间，可以不控制封闭体系内的二氧化碳浓度。在封闭体系内培养细胞期间，可以不控制封闭体系外的二氧化碳浓度。例如，可以不将封闭体系配置在二氧化碳(CO2)培养箱内。但是，将封闭体系配置在二氧化碳(CO2)培养箱内也无妨。
在封闭体系内培养细胞时，优选封闭体系内没有或少有空气层等气体层。因此，优选以使封闭体系内不残留或少残留气体层的方式将培养基填充到封闭体系内。
在封闭体系内培养细胞期间，可以使培养基以与外部气体不接触的方式在封闭体系内循环。在封闭体系内，可以在细胞悬浊液与循环的培养基之间配置半透膜，通过半透膜使培养基的有效成分渗入细胞悬浊液。
在封闭体系内，培养细胞例如3小时以上、1日以上、14日以上或30日以上。但是，在进行传代、更换培养基和添加培养基时，封闭体系也可以敞开。
应予说明，在细胞的接种与传代期间，也可以不更换和添加培养。此时，在接种与传代之间，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养。在接种与传代之间例如1日以上、5日以上或10日以上完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养。
细胞的传代与传代期间，也可以不更换和添加培养基。此时，在传代与传代之间，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养。在传代与传代之间例如1日以上、5日以上或10日以上完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养。
或者，在细胞的接种与传代期间，可以敞开封闭体系，添加或更换培养基。另外，在细胞的传代与传代期间，也可以敞开封闭体系，添加或更换培养基。可以每隔1日以上、2日以上或5日以上进行培养基的添加或更换。除了添加或更换培养基以及传代以外，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养。
另外，实施方式的细胞的诱导方法包括在封闭体系内诱导细胞。封闭体系如上所述。诱导是指再编程、初始化、转分化(Transdifferentiation or Lineagereprogramming：转分化或谱系重编程)、分化诱导和细胞命运改变(Cell fatereprogramming)等。
在封闭体系内诱导的细胞也可以是预先在封闭体系外导入了诱导因子的细胞。或者，也可以向封闭体系内的培养基添加诱导因子，向在封闭体系内培养的未导入诱导因子的细胞导入诱导因子而在封闭体系内诱导细胞。
在封闭体系内诱导的细胞可以是动物细胞，也可以是植物细胞。
细胞可以在封闭体系内的液体培养基中进行诱导，也可以在封闭体系内的凝胶培养基中进行诱导。另外，细胞可以在封闭体系内进行粘附培养的同时进行诱导，也可以在进行悬浮培养的同时进行诱导。在封闭体系内诱导细胞期间，可以搅拌培养基，也可以不搅拌培养基。在对细胞进行粘附培养的同时进行诱导时，可以使用饲养细胞，也可以不使用饲养细胞。对细胞进行悬浮培养的同时进行诱导时，也可以不使用饲养细胞。
在封闭体系内可以将细胞诱导为iPS细胞等干细胞。在封闭体系内也可以将细胞诱导为干细胞以外的其他种类的细胞。在封闭体系内还可以将iPS细胞和ES细胞等干细胞诱导为其他种类的细胞。
在封闭体系内被诱导为iPS细胞的细胞可以是血液细胞等血液系统细胞。或者，在封闭体系内被诱导为iPS细胞的细胞也可以是成纤维细胞、骨髓干细胞、角质细胞、毛乳头细胞、口腔上皮细胞和成体干前体细胞等。在封闭体系内细胞也可以被诱导为例如血液系统细胞、神经系统细胞、心肌系统细胞、上皮系统细胞、间叶系统细胞、肝细胞、胰岛素产生细胞、视网膜色素上皮细胞和角膜细胞。
血液细胞从血液中分离出。血液是例如末梢血和脐带血，但不限于这些。血液可以从成年生物采集，也可以从未成年生物采集。在采血时，使用乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素和生物制剂标准血液保存溶液A液(ACD-A)等抗凝剂。
血液细胞是例如单核细胞(Mono nuclear cell)、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血液干/前体细胞和血管内皮细胞等有核细胞，不包括红细胞和血小板。血液细胞也可以是例如血管内皮前体细胞、血液干/前体细胞、T细胞或B细胞。T细胞是例如αβT细胞。
单核细胞是使用血液细胞的分离用介质和离心分离装置等从血液中分离而得。使用Ficoll(GE医疗)作为血液细胞的分离用介质时的单核细胞的分离方法如下。
由于在低温下单核细胞的分离精度趋于恶化，因此将离心机设定在4℃至42℃，优选为18℃。从成年人或未成年人采集10μL至50mL的血液，向血液中添加包含EDTA的螯合剂后充分混合以不使血液凝固。另外，将人类淋巴细胞分离用的介质(Ficoll-PaquePREMIUM，GE医疗)分装到两只15mL的试管内，每只5mL。相对于5mL的血液加入5mL的PBS进行稀释，在试管中的人类淋巴细胞分离用的介质上铺层5mL。此时，以不破坏界面的方式沿试管的管壁在介质上缓慢添加稀释血液。
将试管中的溶液以10×g至1000×g、优选400×g，在4℃至42℃、优选为18℃下离心5分钟至2小时、优选为30分钟。离心后，在试管中出现白浊的中间层。该白浊的中间层包含单核细胞。用移液器将试管中的白浊的中间层缓慢地回收，移至新的15mL试管。此时，以下层不被吸取的方式进行。能够从一只试管中回收1mL左右的白浊的中间层。将两只试管中的中间层合并转移至一只试管内。
向回收的单核细胞加入1mL至48mL、优选为12mL的PBS，将溶液进一步以10×g至1000×g、优选为200×g，在4℃至42℃、优选为18℃下离心1分钟至60分钟、优选为10分钟。然后，使用吸液器吸取并弃去溶液的上清，加入1mL至12mL、优选为3mL的已知组成的无血清造血细胞培养基(X-VIVO(注册商标)10，Lonza公司)进行悬浊，得到单核细胞悬浊液。用台盼蓝对其中10μL的单核细胞悬浊液进行染色后用血细胞计数器进行计数。
在使用Vacutainer(注册商标，BD)作为采血管的情况下，单核细胞的分离方法如下。
由于在低温下单核细胞的分离精度趋于恶化，因此将离心机设定为4℃至42℃、优选为18℃。使用采血管(Vacutainer(注册商标)、BD)从成年人或未成年人采血8mL，翻转混合以与抗凝剂混合。然后调整平衡，将溶液在4℃至42℃、优选18℃下以100×g至3000×g、优选1500×g至1800×g用水平转子离心1分钟至60分钟、优选为20分钟。离心后除去上层即血浆层，并进行吹打(pipetting)而使单细胞层与附着于凝胶的血液细胞悬浊以得到悬浊液。将得到的悬浊液移至另一个15mL试管内。
向15mL试管的悬浊液中加入1mL至14mL、优选12mL的PBS，将悬浊液在4℃至42℃、优选18℃下以100×g至3000×g、优选200×g离心1分钟至60分钟、优选5分钟。离心后用吸液器弃去上清。另外，用无菌水将溶血剂(PharmLyse(注册商标)，10倍浓度，BD)稀释到一倍浓度。轻拍以使15mL试管中的结块分散，加入1mL至14mL、优选1mL的溶血剂。然后，将溶液在室温下避光静置1分钟至60分钟、优选1分钟。
然后，向15mL试管中加入1mL至14mL、优选12mL的PBS，在4℃至42℃下、优选室温，以100×g至3000×g、优选200×g离心1分钟至60分钟、优选5分钟。离心后用吸液器弃去上清，加入1mL至15mL、优选3mL的已知组成的无血清造血细胞培养基(X-VIVO(注册商标)10，Lonza公司)进行悬浮，得到单核细胞悬浊液。用台盼蓝对其中10μL的单核细胞悬浊液进行染色后用血细胞计数器进行计数。
从血液分离单核细胞的方法不限于上述的方法，例如，也可以使用透析膜从血液分离单核细胞。另外，也可以使用全血单核细胞浓缩用纯细胞选择系统(注册商标，PALL公司)、去除血细胞用净化器(Cell Sover E，注册商标，旭化成公司)、以及血小板制剂用白血球除去过滤器(Sepacell PL，注册商标，PLX-5B-SCD，旭化成公司)等过滤器。
单核细胞也可以使用能够通过将红细胞重力沉淀或离心分离从而分离有核细胞的红细胞沉降剂来分离。作为红细胞沉降剂的示例，可列举例如HetaSep(注册商标，STEMCELL Technologies公司)和HES40(NIPRO公司)。
另外，作为单核细胞，也可以使用由Cellular Technology Limited公司出售的CTL-UP1、Sanguine Biosciences公司的PBMC-001等。
或者，也可以将下述血液细胞解冻来用作血液细胞，该血液细胞为使用CELLBANKER-1、STEM-CELLBANKER GMP grade和STEM-CELLBANKER DMSO FREE GMP grade(ZENOAQ)等细胞冷冻保存液来冷冻保存的血液细胞。
解冻单核细胞时，首先，向15mL试管中加入1mL至15mL、优选8mL的已知组成的无血清造血细胞培养基(X-VIVO(注册商标)10，Lonza公司)，将装有已冷冻的单核细胞的试管放入4℃至42℃、优选37℃的恒温槽中开始将单核细胞融化。然后，在有少量冰残留的状态下，将装有单核细胞的试管从温浴槽取出，将单核细胞移至装有已知组成的无血清造血细胞培养基的试管中。用台盼蓝对其中10μL的单核细胞悬浊液进行染色后用血细胞计数器进行计数。
血液细胞也可以根据细胞表面标志物被分离。在血液干/前体细胞中CD34为阳性。在T细胞中，CD3,CD4,CD8中的任一种为阳性。在B细胞中，CD10,CD19,CD20中的任一种为阳性。血液干/前体细胞、T细胞或B细胞使用例如，自动磁性细胞分离装置和免疫磁珠从血液细胞中被分离。或者，也可以准备预先分离出的单核细胞。但是，还可以使用根据细胞表面标志物不被分离的血液细胞。
CD34阳性细胞为干/前体细胞，倾向于易于被再编程。另外，如果使用作为CD3阳性细胞的T细胞制作iPS细胞，则由于源自T细胞的iPS细胞保持为TCR重组型，因此有能够有效地向T细胞分化诱导的倾向。
向粘附培养的细胞导入诱导因子。或者，向在凝胶培养基中悬浮培养的细胞导入诱导因子。诱导因子可以是RNA。诱导因子可以包含在仙台病毒中。或者，诱导因子还可以通过转染被导入细胞。诱导因子可以是DNA。诱导因子也可以包含在质粒中。
诱导因子也可以包含在例如腺病毒、慢病毒(Lentivirus)和反转录病毒中。
诱导因子也可以是蛋白质。
可以使用CytoTune(注册商标，Invitrogen公司)作为仙台病毒。作为仙台病毒的效价(Titer)指标可列举感染复数(MOI)。仙台病毒的MOI为例如0.1至100.0、或1.0至50.0。
将细胞诱导为干细胞的情况下，例如导入细胞的诱导因子包括OCT3/4的mRNA、SOX2的mRNA、KLF4的mRNA和c-MYC的mRNA。也可以使用将OCT4改良而成的M3O作为诱导因子。另外，诱导因子还可以包含从LIN28A、FOXH1、LIN28B、GLIS1、p53-显性阴性(p53-dominantnegative)、p53-P275S、L-MYC、NANOG、DPPA2、DPPA4、DPPA5、ZIC3、BCL-2、E-RAS、TPT1、SALL2、NAC1、DAX1、TERT、ZNF206、FOXD3、REX1、UTF1、KLF2、KLF5、ESRRB、miR-291-3p、miR-294、miR-295、NR5A1、NR5A2、TBX3、MBD3sh、TH2A、TH2B和P53DD组成的组中选择至少一种因子的mRNA。这些因子的mRNA可以从TriLink公司购买。
诱导因子中包含的mRNA也可以通过从假尿苷(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、5-甲基尿苷(5meU或m5U)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、5-甲氧尿苷(5moU)、5-羟基甲基尿苷(5hmU)、5-氟尿嘧啶(5fU)、5-羧甲基尿苷(5camU)、硫鸟嘌呤(tioguanine，thG)、N4-甲基胞苷(me4C)、5-甲基胞苷(m5C)、5-甲氧噻啶(5moC)、5-羟基甲基胞苷(5hmC)、5-羟基胞苷(5hoC)、5-氟胞苷(5-Fluorocytidine)(5fC)、5-羟基胞苷(5caC)、N6-甲基-2-氨基腺苷(m6DAP)、二氨基嘌呤(DAP)、2’-O-甲基尿苷(Um或m2’-OU)、2-硫尿苷(s2U)、和N6-甲基腺苷(m6A)组成的组中选择的至少一种被修饰。
胞嘧啶也可以被置换为5-甲基胞嘧啶(m5C)。尿嘧啶也可以被假尿嘧啶置换。
诱导因子中包含的mRNA也可以被聚腺苷酸化。
诱导因子中包含的mRNA可以通过在体外被转录(IVT)RNA的聚腺苷酸化来调制。可以通过使用编码聚(A)末端的DNA模板，在IVT期间使mRNA聚腺苷酸化。mRNA可以被加帽。为了使细胞中的表达的效率最大化，优选大部分的mRNA分子含有帽子结构。mRNA可以具有5’帽子[m7G(5')ppp(5')G]结构。该序列是使mRNA稳定，并促进转录的序列。可以通过脱磷酸处理从具有5'三磷酸的mRNA中除去5'三磷酸。mRNA可以具有[3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G]作为抗-反向帽类似物(ARCA)。ARCA是在转录起始点之前插入的序列，使转录的mRNA的效率加倍。mRNA可以具有多聚A尾(PolyA tail)。
诱导因子中包含的mRNA可以用核糖核酸酶III(RNAseIII)进行处理。
另外，诱导因子中包含的mRNA可以是具有自增殖能力的复制型RNA。复制型RNA是具有自增殖能力的RNA，与普通的RNA不同，复制型RNA还具有使RNA复制所必须的蛋白质表达的能力。复制型RNA来源于作为α病毒中的一种的委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒。如果将复制型RNA转染到细胞内，则由于能够使持续制作再编程因子的RNA在细胞中表达，因此可以省去将诱导因子RNA多次导入到细胞。
复制型RNA的序列可以包括从由α病毒复制子RNA、东部马脑炎病毒(EEE，easternequine encephalitis)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、埃弗格赖德病毒(Everglades)病毒、穆坎布(Mucambo)病毒、皮春娜(Pixuna)病毒和西部马脑炎病毒(WEE，western equineencephalitis)组成的组中选择的α病毒得到的序列。
另外，复制型RNA可以从由辛德毕斯(Sindbis)病毒、塞姆利基森林(SemlikiForest)病毒、米德尔堡(Middelburg)病毒、基孔肯雅(Chikungunya)病毒、阿尼昂尼昂(O’nyong-nyong)病毒、罗斯河(Ross River)病毒、巴马森林(Barmah Forest)病毒、格塔(Getah)病毒、鹭山(Sagiyama)病毒、贝巴鲁(Bebaru)病毒、马亚罗(Mayaro)病毒、乌纳(Una)病毒、奥拉(Aura)病毒、瓦塔罗阿(Whataroa)病毒、巴班基(Babanki)病毒、克泽拉格齐甲(Kyzylagach)病毒、高地J(Highlands J)病毒、摩根堡(Fort Morgan)病毒、恩杜姆(Ndumu)病毒和博吉河(Buggy Creek)病毒组成的组中选择的α病毒得到的序列。
复制型RNA例如从5’向3’包括(VEE RNA复制酶)-(启动子)-(RF1)-(自剪切型肽)-(RF2)-(自剪切型肽)-(RF3)-(IRES或核心启动子)-(RF4)-(IRES或任意启动子)-(可任意选择的标志物)-(VEE 3’UTR和多聚A尾)-(可任意选择的标志物)-启动子。上述RF1-4是诱导去分化为多能性细胞的因子。上述RF2-3、RF3-4、RF4是任意的。上述RF1-4可以从由OCT-4、KLF4、SOX-2、c-MYC、LIN28A、LIN28B、GLIS1、FOXH1、p53-显性阴性、p53-P275S、L-MYC、NANOG、DPPA2、DPPA4、DPPA5、ZIC3、BCL-2、E-RAS、TPT1、SALL2、NAC1、DAX1、TERT、ZNF206、FOXD3、REX1、UTF1、KLF2、KLF5、ESRRB、miR-291-3p、miR-294、miR-295、NR5A1、NR5A2、TBX3、MBD3sh、TH2A和TH2B组成的组中选择。
根据导入诱导因的细胞的种类对培养导入诱导因的细胞的培养基进行适当选择。另外，根据导入诱导因的细胞的种类对培养导入诱导因的细胞的培养基进行适当选择。
如上所述，培养基可以不包含例如bFGF等生长因子，或者，可以包含低浓度的生长因子。另外，培养基可以不包含tgf-β，也可以包含低浓度的tgf-β。培养基可以包含从由钙黏蛋白、层连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白组成的组中选择至少一种物质。
在培养基为凝胶培养基的情况下，培养基可以包含如上所述至少一种高分子化合物。另外，凝胶培养基也可以包含甲基纤维素。或者，凝胶培养基也可以如上所述包含温敏凝胶。
在封闭体系内诱导细胞期间，封闭体系内的培养基的温度例如与上述的在封闭体系内培养细胞期间的温度相同。
加入诱导细胞的封闭体系中的培养基的pH例如与上述加入培养细胞的封闭体系的培养基的pH相同。
在封闭体系内诱导细胞期间，可以不向封闭体系内供给二氧化碳气体、氮气和氧气中的至少任一种或全部。另外，在封闭体系内诱导细胞期间，可以不控制封闭体系内的二氧化碳浓度。在封闭体系内诱导细胞期间，可以不控制封闭体系外的二氧化碳浓度。例如，可以不将封闭体系配置在二氧化碳(CO2)培养箱内。但是，将封闭体系配置在二氧化碳(CO2)培养箱内也无妨。
在封闭体系内诱导细胞时，优选封闭体系内没有或少有空气层等气体层。因此，优选以在封闭体系内不残留或少残留气体层的方式向封闭体系内填充培养基。
在封闭体系内诱导细胞期间，可以使培养基以与外部气体不接触的方式在封闭体系内循环。在封闭体系内，可以在细胞悬浊液与循环的培养基之间配置半透膜，通过半透膜使培养基的有效成分渗入到细胞悬浊液。
在封闭体系内，细胞在培养例如1日以上、14日以上或30日以上的同时进行诱导。但是，在传代、更换培养基和添加培养基时，也可以敞开封闭体系。
应予说明，在细胞的接种与传代期间，可以不进行更换和添加培养基。在该情况下，在接种与传代之间，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞在进行培养的同时进行诱导。接种与传代之间为例如1日以上、5日以上或10日以上，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养的同时进行诱导。
在细胞的传代与传代期间，可以不进行更换和添加培养基。在该情况下，在传代与传代之间，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞在进行培养的同时进行诱导。传代与传代之间为例如1日以上、5日以上或10日以上，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞进行培养的同时进行诱导。
或者，在细胞的接种与传代期间，可以敞开封闭体系，添加或更换培养基。另外，在细胞的传代与传代期间，也可以敞开封闭体系，添加或更换培养基。添加或更换培养基可以间隔1日以上、间隔2日以上或间隔5日以上进行。除添加或更换培养基和传代时以外，在完全不敞开封闭体系的情况下对封闭体系内的细胞在进行培养的同时进行诱导。
被导入诱导因子的细胞是否被诱导(再编程)为iPS细胞，能够通过例如细胞的形态来确认。或者，细胞是否被诱导为iPS细胞，能够通过用流式细胞仪分析从表示未分化的细胞表面标志物即TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-1和SSEA5中选择至少一种表面标志物是否为阳性来进行。TRA-1-60是iPS/ES细胞的特异性抗原，在分化细胞中未检测出。根据iPS细胞仅能够来自TRA-1-60阳性部分，认为TRA-1-60阳性细胞是iPS细胞的种子。
实施方式的用于在内部培养或诱导细胞的封闭体系也可以具备例如如图1所示的细胞培养器。细胞培养器具备：培养成分能够透过的培养成分透过部件10；培养槽30，其覆盖培养成分透过部件10的一侧的面，用于保持含细胞培养基并培养细胞；以及培养基保持槽40，其覆盖培养成分透过部件10的另一侧的面，并用于保持培养基。培养槽30内的含细胞培养基能够与培养成分透过部件10接触。另外，培养基保持槽40内的培养基能够与培养成分透过部件10接触。培养基保持槽40内的培养基不含有细胞。
培养成分透过部件10使培养基保持槽40内的培养基的有效成分透过至培养槽30内的含细胞培养基中。另外，培养成分透过部件10也可以使培养槽30内的含细胞培养基中的代谢物渗透到培养基保持槽40内的培养基中。作为培养成分透过部件10，例如能够使用半透膜和筛网。半透膜包括透析膜。
在培养成分透过部件10为半透膜的情况下，半透膜的截留分子量为例如0.1KDa以上、10KDa以上或50KDa以上。半透膜包括例如纤维素酯、乙基纤维素、纤维素酯类、再生纤维素、聚砜、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯-乙烯醇共聚物、聚酯系聚合物合金、聚碳酸酯、聚酰胺、乙酸纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素、铜铵人造丝、皂化纤维素、血仿膜、磷脂酰胆碱膜和维生素E涂膜等。
在培养成分透过部件10是筛网的情况下，筛网具有比培养槽30内培养的细胞或细胞团小的孔。由此，可阻碍培养槽30内的细胞或细胞团移动到培养基保持槽40内。筛网的材料为例如树脂和金属，但没有特别的限定。培养成分透过部件10的表面可以为细胞不粘附性。
实施方式的细胞培养器还可以具备夹着培养成分透过部件10并分别设置有开口的培养侧板21和培养基侧板22。培养侧板21和培养基侧板22以抑制因培养槽30内的含细胞培养基和培养基保持槽40内的培养基的压力而导致培养成分透过部件10变动的方式，夹持培养成分透过部件10而保持培养成分透过部件10。由此，因压力变动而导致培养成分透过部件10与培养槽30或培养基保持槽40的内壁接触得到抑制。培养侧板21和培养基侧板22具有不因从培养槽30内的含细胞培养基和培养基保持槽40内的培养基承受的压力而变动的硬度。培养侧板21和培养基侧板22的材料为例如树脂和金属，但没有特别的限定。培养侧板21的表面可以是细胞不粘附性。应予说明，在培养成分透过部件10不因从培养槽30内的含细胞培养基和培养基保持槽40内的培养基承受的压力而变动的情况下，也可以省略培养侧板21和培养基侧板22。
在培养侧板21，以能够使培养槽30内的含细胞培养基与培养成分透过部件10接触的方式设置有开口。另外，在培养基侧板22，以能够使培养基保持槽40内的培养基与培养成分透过部件10接触的方式设置有开口。培养槽30内的含细胞培养基的成分和培养基保持槽40内的培养基的成分能够通过培养侧板21的开口而透过培养成分透过部件10。虽然设置于各个培养侧板21和培养基侧板22的开口的形状为例如圆形，但没有特别的限定。设置于各个培养侧板21和培养基侧板22的开口具有能够抑制培养成分透过部件10变动的范围内的大小。开口例如格子状地或随机地设置于各个培养侧板21和培养基侧板22。
培养侧板21可以具有例如黑色等深色。如果培养侧板21具有深色，则能够将培养侧板21作为背景，以高对比度目视确认含细胞培养基中的细胞或使其图像化。如果培养侧板21的未设置有开口的部分的面积等的大小大于细胞或细胞团，则将培养侧板21的未设置有开口的部分作为背景，以高对比度目视确认细胞或细胞团或使其图像化变得容易。但是，通过调整照射细胞或细胞团的光，即使培养成分透过部件10和/或培养侧板21为透明，也能够目视确认细胞或细胞团或使其图像化。
培养槽30与培养基保持槽40可以通过螺丝、销钉或电磁铁等进行固定。培养槽30的接触部紧贴培养侧板21的一侧的面的至少一部分。培养侧板21的另一侧的面的至少一部分紧贴培养成分透过部件10的一侧的面的至少一部分。培养成分透过部件10的另一侧的面的至少一部分紧贴培养基侧板22的一侧的面的至少一部分。培养基侧板22的另一侧的面的至少一部分紧贴培养基保持槽40的接触部。紧贴时，可以适当使用衬垫等。衬垫可以配置在例如培养成分透过部件10与培养槽30之间。衬垫也可以配置在培养成分透过部件10的外周与培养槽30之间。配置在培养成分透过部件10与培养槽30之间的衬垫的外径可以大于培养成分透过部件10的外径。另外，衬垫也可以配置在例如培养成分透过部件10与培养基保持槽40之间。衬垫也可以配置在培养成分透过部件10的外周与培养基保持槽40之间。配置在培养成分透过部件10与培养基保持槽40之间的衬垫的外径也可以大于培养成分透过部件10的外径。
培养槽30具备例如箱体31和覆盖箱体31的盖体32。箱体31和盖体32可以一体化。可以在培养槽30的内壁，以不粘附细胞的方式涂覆聚-HEMA(poly 2-hydroxyethylmethacrylate：聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯)等细胞不粘附性物质，而使培养槽30的内壁为细胞不粘附性。在箱体31，设置有用于通过培养侧板21的开口使培养成分透过部件10露出的开口131。如图2所示，在培养槽30的盖体32，设置有能够观察培养槽30内的含细胞培养基的窗132。作为窗132的材料，可以使用例如玻璃和树脂。
实施方式的细胞培养器也可以具备用于加热和冷却窗132的温度调节部。温度调节部可以是配置于窗132并加热窗的透明导电膜等透明加热器。或者，实施方式的细胞培养器也可以具备用于加热和冷却培养槽30的箱体31或盖体32的温度调节部。通过用温度调节部对箱体31、盖体32和窗132中的任何一个进行温度调节，能够对培养槽30内的含细胞培养基进行温度调节。实施方式的细胞培养器还可以具备测量培养槽30内的含细胞培养基的温度的温度计。温度计可以不与含细胞培养基接触，而基于培养槽30的温度来测量含细胞培养基的温度，也可以与含细胞培养基接触来直接测量含细胞培养基的温度。在该情况下，可以以使含细胞培养基的温度成为预定的温度的方式对温度调节部进行反馈控制。
如图1所示，在培养槽30设置有用于向培养槽30内供给流体的供给口231和用于排出培养槽30内的流体的排出口331。例如，在供给口231插入能够与用于供给流体的气囊、波纹管和注射器等供给器连接的如图2所示的插销33。供给器也可以是泵等流体机械。但是，也可以将注入装置直接连接于图1所示的供给口231。供给器能够装卸于供给口231，在供给器不连接于供给口231的情况下，供给口231可以密闭，不会发生通过供给口231的培养槽30内外的流体的交换。
插销33可以是无针连接器。无针连接器可以是分隔膜(split septum)型，也可以是机械瓣膜(mechanical valve)型。在插销33为分隔膜型的无针连接器的情况下，插销33具备设置有缝隙的盘阀。在向培养槽30内供给流体时，供给器或连接于供给器的流路插入到盘阀的缝隙。在供给器或连接于供给器的流路不插入到缝隙的情况下，缝隙密闭。在供给器或连接于供给器的流路插入到缝隙的情况下，盘阀紧贴供给器或连接于供给器的流路的外周。因此，即使在供给器或连接于供给器的流路插入到插销33的情况下，外部气体也不会通过插销33进入培养槽30内。但是，插销33也可以是供针刺入的连接器。
另外，例如，在排出口331插入能够与用于排出培养槽30内的流体的气囊、波纹管和注射器等排出器连接的如图2所示的插销34。排出器也可以是泵等流体机械。但是，在图1示出的排出口331也可以直接连接排出器。排出器也可以主动地吸引培养槽30内的流体。或者，排出器可以根据培养槽30内的压力而使内部容积被动地增加，收容从培养槽30挤出的流体。排出器能够装卸于排出口331，在排出器不与排出口331连接的情况下，排出口331可以密闭，不会发生通过排出口331的培养槽30内外的流体的交换。插销34也可以是无针连接器。无针连接器可以是分隔膜型，也可以是机械瓣膜型。在排出器或连接于排出器的流路插入到插销34的情况下，外部气体也不会通过插销34进入培养槽30内。但是，插销34也可以是供针刺入的连接器。
例如，在培养槽30处于将培养侧板21、培养成分透过部件10和培养基侧板22夹在中间而紧贴培养基保持槽40的状态，并且空气进入培养槽30内的情况下，通过在从排出口331排出培养槽30内的空气的同时，从供给口231向培养槽30内注入含细胞培养基，从而能够向图2所示的培养槽30内加入含细胞培养基。另外，也能够完全消除培养槽30内的空气层。但是，空气层也可以残留在培养槽30内。在培养槽30内已经加入含细胞培养基的情况下，通过从图1所示的排出口331排出培养槽30内的含细胞培养基的同时，从供给口231向培养槽30内注入另外的含细胞培养基，从而能够置换图2所示的培养槽30内的含细胞培养基中的至少一部分。
实施方式的细胞培养器还可以具备能够保持培养槽30并能够调整培养槽30的倾斜度的培养槽保持部件。通过调整培养槽30的倾斜度，从而易于排出培养槽30内的空气等气体。
培养槽30的供给口231和排出口331能够通过栓等来封闭。或者，与培养槽30的供给口231和排出口331分别连接的插销33和插销34是能够封闭的。另外，或者，培养槽30的供给口231通过与供给器连接而能够与外部隔离，培养槽30的排出口331通过与排出器连接而能够与外部隔离。在供给口231和排出口331被封闭，且如图2所示使培养槽30紧贴培养基保持槽40的情况下，培养槽30内相对于培养槽30外的空气而被密闭。由此，抑制外部气体进入培养槽30内，抑制培养槽30内的含细胞培养基的pH的变化并使其保持在预定的范围内。应予说明，根据本发明人等的见解，由于细胞能够在完全封闭的密闭空间进行培养，因此可以不向培养槽30内积极地供给二氧化碳气体、氮气和氧气等。因此，可以不将培养槽30配置在CO2培养箱内。另外，由于存在于培养槽30外的细胞、微生物、病毒和灰尘等不进入密闭的培养槽30内，因此确保了培养槽30内的清浄度。因此，可以不将培养槽30配置在净化室内。培养槽30也可以被非透气性物质包埋。换言之，培养槽30也可以埋入非透气性物质中。
在图1所示的培养基保持槽40，设置有用于通过培养基侧板22的开口而使培养成分透过部件10露出的图3所示的开口140。开口140被图1所示的培养成分透过部件10覆盖。另外，在图3所示的培养基保持槽40，设置有用于向培养基保持槽40内导入流体的导入口240和用于排出培养基保持槽40内的流体的排出口340。而且，在培养基保持槽40内，也可以配置有多个整流板41。多个整流板41以例如从培养基保持槽40的对置的内壁交替突出的方式配置。
例如，在培养基保持槽40处于将图1所示的培养基侧板22、培养成分透过部件10和培养侧板21夹在中间而紧贴于培养槽30的状态，并且空气进入培养基保持槽40内的情况下，通过在从图3所示的排出口340排出培养基保持槽40内的空气的同时，从导入口240向培养基保持槽40内注入细胞培养基，从而能够使细胞培养基进入培养基保持槽40内。另外，在培养基已经进入培养基保持槽40内的情况下，通过在从排出口340排出培养基保持槽40内的细胞培养基的同时，从导入口240向培养基保持槽40内注入细胞培养基，从而能够使细胞培养基流入培养基保持槽40内。
在多个整流板41配置于培养基保持槽40内的情况下，在培养基保持槽40内，培养基从导入口240朝着排出口340，沿着多个整流板41流动。因此，确保了培养基的成分与培养成分透过部件10接触的机会。
或者，如图4所示，在培养基保持槽40的内壁也可以设置与图3所示的导入口240连通的一个或多个喷出口241。图4所示的多个喷出口241例如设置为横向一列。多个喷出口241的数量和/或排列可以均等地配置，也可以随机配置。根据培养基的粘度等特性设定多个喷出口241的数量和/或排列。如图5所示，通过从多个喷出口241喷出培养基，从而能够在培养基保持槽40内提高与培养成分透过部件10接触的培养基的均一性。
可以在培养基保持槽40的内壁能够插入设置有1个或多个喷出口241的喷出块145。例如，可以准备多个喷出口241的数量和/或排列等样式不同的喷出块145，根据培养基和/或被培养的细胞的特性而区分使用。相对于培养基保持槽40的内壁的重力，上侧可以向上方或下方曲折或弯曲。相对于培养基保持槽40的内壁的重力，下侧可以向上方或下方曲折或弯曲。
如图4和图5所示，在培养基保持槽40的内壁的多个喷出口241的附近也可以设置有开口242。随着从多个喷出口241喷出的培养基被储存在培养基保持槽40内，培养基保持槽40内的空气从开口242流出到外部。在使培养基进入培养基保持槽40后，开口242可以密闭。
如图3所示，培养基保持槽40的导入口240与排出口340可以通过培养基流路200连接，培养基可以在培养基保持槽40与培养基流路200之间循环。培养基流路200可以具备树脂管和/或硅胶管等。培养基流路200也可以被非透气性物质包埋。换言之，培养基流路200可以埋入非透气性物质中。例如，培养基流路200可以是在设置由树脂、玻璃和金属等构成的部件中的孔。在该情况下，例如，通过将设置有凹部的部件彼此贴合，从而形成培养基流路200。在培养基流路200可以设置有流体机械，该流体机械用于将培养基导入培养基保持槽40内并将培养基从培养基保持槽40内排出。流体机械具备例如用于将培养基导入培养基保持槽40内的导入用流体机械51和用于将培养基从培养基保持槽40内排出的排出用流体机械52。
作为图1所示的导入用流体机械51和排出用流体机械52，能够使用容积泵。作为容积泵的示例，可列举包括活塞泵、柱塞泵和隔膜泵的往复泵，或者，包括齿轮泵、叶片泵和螺旋泵的旋转泵。作为隔膜泵的示例，可列举管式泵和压电(piezo)泵。有时将管式泵称为蠕动泵。另外，也可以使用组合各种各样种类的泵而成的微流控芯片模块。
如果使用Perista泵(注册商标)、管式泵和隔膜泵等密闭型泵，则能够在泵不与图3所示的培养基流路200内部的培养基直接接触的情况下进行输液。或者，作为导入用流体机械51和排出用流体机械52，也可以使用注射泵。即使是除密闭型泵以外的泵，也能够通过加热灭菌处理等而再次利用。
在导入用流体机械51为密闭型泵的情况下，如图1所示，导入用流体机械51具备泵头151和马达等驱动部251。泵头151和驱动部251是能够装卸的。泵头151具备从外侧挤压管等培养基流路的辊。驱动部251使泵头151的辊旋转。在排出用流体机械52为密闭型泵的情况下，排出用流体机械52具备泵头152和马达等驱动部252。泵头152和驱动部252是能够装卸的。泵头152具备从外侧挤压管等培养基流路的辊。驱动部252使泵头152的辊旋转。
如图3所示，在培养基流路200可以设置有培养基能够进入的培养基罐60。从培养基流路200进入培养基罐60的培养基再次流出至培养基流路200。通过设置培养基罐60，能够使在培养基流路200与培养基保持槽40之间循环的培养基的容量变大。
在培养基罐60也可以设置有用于向培养基罐60内供给流体的供给口和用于排出培养基罐60内的流体的排出口。例如，在培养基罐60的供给口插入有能够连接用于供给流体的气囊、波纹管和注射器等供给器的图6所示的插销61。供给器也可以是泵等流体机械。但是，也可以在培养基罐60的供给口直接连接供给器。在供给器能够装卸于供给口，且供给器未连接到供给口的情况下，供给口可以密闭，不会产生通过供给口的培养基流路200内外的流体的交换。或者，供给口通过连接于供给器从而与外部隔离。插销61可以是无针连接器。无针连接器可以是分隔膜型，也可以是机械瓣膜型。在供给器或连接于供给器的流路插入到插销61的情况下，外部气体也不通过插销61进入培养基罐60内。但是，插销61也可以是供针刺入的连接器。
另外，例如，在培养基罐60的排出口插入有能够连接用于排出培养基罐60内的流体的气囊、波纹管和注射器等排出器的插销62。排出器可以是泵等流体机械。但是，也可以在培养基罐60的排出口直接连接排出器。排出器也可以主动吸引培养基流路内的流体。或者，排出器可以根据培养基流路内的压力而使内部容积被动地增加，收容从培养基流路挤出的流体。在排出器能够装卸于排出口，且排出器未连接于排出口的情况下，排出口可以密闭，不会产生通过排出口的培养基流路200内外的流体的交换。或者，排出口通过连接到排出器，从而与外部隔离。插销62也可以是无针连接器。无针连接器可以是分隔膜型，也可以是机械瓣膜型。在排出器或连接于排出器的流路插入插销62的情况下，外部气体也不会通过插销62进入培养基罐60内。但是，插销62也可以是供针刺入的连接器。
例如，在图1所示的培养基保持槽40处于将培养基侧板22、培养成分透过部件10和培养侧板21夹在中间而紧贴培养槽30的状态，并且空气进入图3所示的培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内的情况下，通过在从培养基罐60的排出口排出培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内的空气的同时，将培养基从培养基罐60的供给口注入培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内，从而能够使培养基进入培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内。可以完全消除培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内的空气层，也可以残留有空气层。
可以将充填有培养基的供给器和空的排出器连接于培养基流路200，使流体机械驱动，从供给器向培养基流路200导入培养基，使空气导入排出器。此时，供给器可以主动地向培养基流路200注入培养基，也可以使供给器内的培养基被吸引至因流体机械的驱动而处于低压的培养基流路200，使供给器内的内部容积被动地减少。另外，排出器可以主动地吸引培养基流路200内的空气，也可以使因流体机械的驱动而处于高压的培养基流路200内的空气流入排出器，使排出器的内部容积被动地增加。
另外，在培养基已经进入培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内的情况下，通过在从培养基罐60的排出口排出培养基罐60内的培养基的同时，从培养基罐60的供给口向培养基罐60内注入培养基，从而能够在培养基罐60内置换细胞培养基。
也可以将填充有培养基的供给器和空的排出器连接于培养基流路200，使流体机械驱动，而从供给器向培养基流路200导入新的培养基，向排出器导入旧的培养基。此时，供给器可以主动地向培养基流路200注入新的培养基，也可以使供给器内的新的培养基被吸引至因流体机械的驱动而处于低压的培养基流路200，使供给器内的内部容积被动地减少。另外，排出器也可以主动地吸引培养基流路200内的旧的培养基，也可以使因流体机械的驱动而处于高压的培养基流路200内的旧的培养基流入排出器，使排出器的内部容积被动地增加。
用于向培养基流路200和培养基保持槽40内供给培养基的供给口和用于排出培养基流路200和培养基保持槽40内的空气的排出口也可以设置在培养基流路200的除设置有培养基罐60的部分以外的部分。例如，用于向培养基流路200和培养基保持槽40内供给培养基的供给口和用于排出培养基流路200和培养基保持槽40内的空气的排出口也可以设置在培养基流路200。
实施方式的细胞培养器也可以具备用于加热和冷却培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60中的至少一个的温度调节部。通过用温度调节部对培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60中的任一个进行温度调节，从而能够对培养基进行温度调节。实施方式的细胞培养器还可以具备测量培养基的温度的温度计。温度计可以不与培养基接触而基于培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60中的至少一个的温度来测量培养基的温度，也可以与培养基接触而直接测量培养基的温度。在该情况下，可以以使培养基的温度成为预定的温度的方式对温度调节部进行反馈控制。
如图3所示，培养基保持槽40、培养基流路200、泵头151、泵头152和培养基罐60也可以被容纳在流路箱70内。在流路箱70内，培养基保持槽40、培养基流路200、泵头151、泵头152和培养基罐60可以完全埋入非透气性物质中。培养基流路200也可以在非透气性物质中设置为隧道状。例如，在流路箱70设置有用于在泵头151插入轴的孔、用于在泵头152插入轴的孔、用于在培养基罐60的供给口插入插销61的孔、以及用于在培养基罐60的排出口插入插销62的孔。用于在培养基罐60的供给口插入插销61的孔和用于在培养基罐60的排出口插入插销62的孔可以是能够封闭的。
如图7所示，导入用流体机械51的驱动部251和排出用流体机械52的驱动部252也可以配置于基板状的驱动部保持部件80。在驱动部保持部件80，设置有用于在培养基罐60的供给口插入插销61的孔和用于在培养基罐60的排出口插入插销62的孔82。用于在培养基罐60的供给口插入插销61的孔和用于在培养基罐60的排出口插入插销62的孔82可以是能够封闭的。
驱动部保持部件80通过图1所示的衬垫90紧贴流路箱70。衬垫90抑制空气从流路箱70与驱动部保持部件80的接触部进入流路箱70内。
可以用流体机械用外部气体阻断部件覆盖用于将培养基导入培养基保持槽40内并将培养基从培养基保持槽40内排出的流体机械。流体机械用外部气体阻断部件具备例如如图7所示，覆盖配置于驱动部保持部件80的导入用流体机械51的驱动部251的导入用流体机械用外部气体阻断部件351、以及覆盖配置于驱动部保持部件80的排出用流体机械52的驱动部252的排出用流体机械用外部气体阻断部件52。
流路箱70和驱动部保持部件80是能够装卸的。如果使驱动部保持部件80紧贴流路箱70，堵住用于在培养基罐60的供给口插入插销61的孔和用于在培养基罐60的排出口插入插销62的孔，用导入用流体机械用外部气体阻断部件351覆盖导入用流体机械51的驱动部251，用排出用流体机械用外部气体阻断部件352覆盖排出用流体机械52的驱动部252，则流路箱70内与外部气体阻断，外部气体变得无法进入流路箱70内。因此，不会发生流路箱70内外的气体的交换。因此，外部气体不会进入培养基保持槽40和培养基流路200内。通过将构成培养基流路用外部气体阻断部件的至少一部分的流路箱70内与外部气体阻断，从而即使培养基流路200是透气性管，也能够抑制培养基保持槽40和培养基流路200内的培养基的pH的变动，将其保持在预定的范围内。
应予说明，根据本发明人等的见解，因为细胞能够在完全封闭的密闭空间内进行培养，因此可以不积极向培养基保持槽40和培养基流路200内供给二氧化碳气体、氮气和氧气等。因此，可以不将培养基保持槽40和培养基流路200配置在CO2培养箱内。另外，由于存在于培养基保持槽40和培养基流路200外的细胞、微生物、病毒和灰尘等不进入密闭的培养基保持槽40和培养基流路200内，因此可确保培养基保持槽40和培养基流路200内的清浄度。因此，可以不将培养基保持槽40和培养基流路200配置在净化室内。培养基保持槽40可以被非透气性物质包埋。换言之，培养基保持槽40也可以埋入非透气性物质中。
当从流路箱70拆下驱动部保持部件80时，通过堵住用于在培养基罐60的供给口插入插销61的流路箱70的孔和用于在培养基罐60的排出口插入插销62的流路箱70的孔，从而将流路箱70内密闭，能够抑制流路箱70内部的物质流出至外部，或者抑制外部气体进入流路箱70内。
在内部包含培养基流路200和泵头151,152的流路箱70可以是一次性的。另一方面，保持驱动部251,252的驱动部保持部件80可反复利用。
例如，以使通过图2所示的导入用流体机械51被输送至培养基保持槽40内的培养基的量与通过排出用流体机械52从培养基保持槽40排出的培养基的量相同的方式控制导入用流体机械51和排出用流体机械52。导入用流体机械51和排出用流体机械52可以一直对培养基保持槽40内输送培养基，也可以以适当的间隔对培养基保持槽40内输送培养基。
在一直对培养基保持槽40内输送培养基的情况下，对培养基保持槽40内输送的培养基的流量可以恒定，也可以不恒定。例如，可以用拍摄装置对培养基和培养基中的细胞团进行监视，根据培养基和培养基中的细胞团的状态，增加或减少对培养基保持槽40内输送的培养基的流量。
另外，在不一直对培养基保持槽40内输送培养基的情况下，也可以根据例如培养基的状态、培养基中的细胞团的状态、细胞数量、细胞团数量、培养基的浊度和pH的变化来开始和结束培养基的输送。在这种情况下，也可以根据培养基和培养基中的细胞团的状态来增加或减少被输送的培养基的流量。
在被搅拌的培养基中，细胞彼此随机碰撞并结合，有时会形成各种各样的大小的细胞团(集落)。因此，有时不保持集落间的均质性。而且，在过大的集落中，有时营养和/或生长因子无法到达集落中，会从内部分化、细胞死亡。另一方面，过小的集落有时不适合进行传代培养。对此，在图2所示的培养槽30内，由于培养基的流速缓慢或培养基不流动，因此细胞彼此碰撞的频率低。因此，在集落中能够维持克隆性。因此，例如，在细胞为iPS细胞等干细胞的情况下，能够确保源自一个细胞的干细胞的克隆性。另外，由于干细胞彼此碰撞的频率低，因此能够将干细胞的集落的大小保持为均质。
实施方式的细胞培养器还可以具备照相机和/或摄像机等拍摄装置，该拍摄装置通过培养槽30的盖体32的窗132而对培养槽30内的含细胞培养基进行拍摄。
根据实施方式的细胞培养器，例如，由于在完全封闭体系中培养细胞，因此能够降低因细胞从培养装置泄露而导致的交叉污染的风险。另外，例如，即使在细胞被HIV肝炎病毒等病毒感染的情况下，也能够降低因细胞的泄露而导致的操作员感染的风险。而且，能够降低细胞培养器内的培养基被细胞培养器外的空气中的细菌、病毒和霉菌等污染的风险。并且根据实施方式的细胞培养器，还能够在不使用CO2培养箱的情况下培养细胞。
应予说明，例如，在不需要培养基循环的情况下，可以不将培养基流路200连接于图3所示的培养基保持槽40。另外，在培养槽30内可以悬浮培养细胞，也可以粘附培养细胞。在粘附培养细胞的情况下，图1所示的培养侧板21的表面可以为细胞粘附性的，培养成分透过部件10的表面也可以为细胞粘附性的。另外，在实施方式的细胞培养器的培养槽30内也可以在培养细胞的同时进行诱导。而且，培养基流路可以不与培养基保持槽和/或培养槽连接而使用，并在作为封闭体系的培养基流路内培养或诱导细胞。
封闭体系不限于图1至图7所示的细胞培养器。例如，封闭体系可以是容器。容器可以是试管和/或培养瓶。容器可以是树脂制，也可以是玻璃制。为了将容器内部完全封闭，可以用封口膜等膜缠绕容器的帽和/或盖等的周围。
实施例
(实施例1)
将干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)凝胶化后制作出凝胶培养基。凝胶培养基的pH调整至4.0至10.0之间。向凝胶培养基以2×105个/mL添加变成单细胞或细胞团的iPS细胞。在15mL离心管(falcon tube，注册商标，康宁公司)中加入含iPS细胞的凝胶培养基。然后，拧紧一部分离心管的管帽，进而用封口膜(Parafilm，注册商标，Bemis公司)缠绕离心管和管帽的周围，将离心管内与外部气体阻断，使离心管内的气体(空气)完全不与外部气体进行交换。其他的离心管仅拧紧管帽而不用封口膜缠绕。
将没有用封口膜缠绕的离心管配置在37℃、二氧化碳浓度为5％的培养箱内，开始iPS细胞的悬浮培养。另外，将用封口膜缠绕的离心管配置在37℃的恒温槽，不放置在CO2培养箱而开始iPS细胞的悬浮培养。作为恒温槽，使用能够电子控温的珠浴槽、水浴槽和恒温机。恒温槽配置在实验室内，并且没有与实验室内的空气隔离。然后，两日一次，打开各离心管的管帽，并向离心管内添加2mL的pH为4.0至10.0之间的凝胶培养基。添加凝胶培养基后，如上所述，将拧紧管帽并配置在恒温槽的离心管用封口膜缠绕管帽的周围。
在开始离心管内的培养7至10日后，打开离心管的管帽，使用过滤器回收在凝胶培养基中形成的iPS细胞的细胞团，用PBS清洗，加入离心管。而且，向细胞团添加500μL的细胞解离试剂(TrypLE Select，注册商标，Thermo Fisher公司)，在CO2培养箱内将细胞团孵育5分钟。接着，从培养箱取出离心管，向离心管内加入500μL的干细胞培养基(含20％KnockOutSR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，使细胞团悬浊，而使iPS细胞变为单细胞。向离心管内添加2mL的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，用离心机以200g对离心管进行离心。离心后，除去离心管内的上清，将iPS细胞和凝胶培养基加入离心管中。然后，与上述相同，将iPS细胞在密闭的离心管内悬浮培养7至10日，期间每两日添加一次凝胶培养基。
以后，与上述相同，反复进行传代和7至10日的悬浮培养，将iPS细胞在密闭的离心管内进行悬浮培养共计一个月以上。
用显微镜对将离心管配置在培养箱内培养出的iPS细胞和将离心管配置在珠浴槽培养出的iPS细胞进行观察，如图8所示，确认了任一种都形成了均一的细胞团。在配置在珠浴槽以外的恒温槽的离心管内培养出的iPS细胞也得到了同样的结果。
另外，在传代时，分开注入一部分的单细胞的iPS细胞，用4％-多聚甲醛固定iPS细胞。并且，用流式细胞仪测定固定后的iPS细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量。已知TRA-1-60是多能性干细胞的代表性表面抗原，在经分化的细胞中表达量减少。
其结果如图9所示，在从开始培养起第8日、第28日和第38日，将离心管配置在培养箱内培养出的iPS细胞和将离心管配置在珠浴槽培养出的iPS细胞均为几乎100％TRA1-60阳性。在配置在珠浴槽以外的恒温槽的离心管内培养出的iPS细胞也得到了同样的结果。因此，示出了如果将容器密闭而设为封闭体系，则即使不控制容器内的二氧化碳浓度，也能够使干细胞在长时间内以未分化状态保持多能性的同时进行培养。
(实施例2)
与实施例1相同地制作出凝胶培养基。向凝胶培养基以2×105个/mL添加变成单细胞的iPS细胞。在2mL带有橡胶衬垫的不透气试管中以使内部不残留空气层的方式加入2mL的含iPS细胞的凝胶培养基。然后，拧紧试管的管帽，进而用封口膜缠绕试管和管帽的周围，将试管内与外部气体阻断，以使外部气体不进入试管内。由此，在培养中凝胶培养基与气体(空气)层不接触。
将各个用封口膜缠绕的试管配置在37℃的CO2培养箱内和CO2培养箱外的37℃的恒温槽，开始iPS细胞的悬浮培养。作为恒温槽，可以使用能够电子控温的珠浴槽、水浴槽和恒温机。恒温槽配置在实验室内，并且不与实验室内的空气阻断。在培养过程中，不添加或更换培养基。在开始试管内的培养10至11日后，打开试管的管帽，用过滤器回收形成在凝胶培养基中的iPS细胞的细胞团，用PBS清洗，装入试管中。进而，向细胞团添加500μL的细胞解离试剂(TrypLE Select，注册商标，Thermo Fisher公司)，在CO2培养箱内将细胞团孵育5分钟。接着，从培养箱取出试管，向试管内加入500μL的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，使细胞团悬浊，而使iPS细胞成为单细胞。向试管内添加2mL的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，用离心机以200g离心试管。离心后，除去试管内的上清，以使iPS细胞的细胞数为2×105个/mL的方式将凝胶培养基加入试管。然后，与上述相同，在不添加或更换凝胶培养基的情况下，将iPS细胞在密闭的试管内悬浮培养5至11日。
以后，与上述相同，反复进行传代和5至11日的悬浮培养，将iPS细胞在密闭的试管内悬浮培养共计一个月以上。
用相机和显微镜对将试管配置在培养箱内培养出的iPS细胞进行观察，确认如图10所示形成了均一的细胞团。在配置在培养箱外的恒温槽的试管内培养出的iPS细胞也得到了同样的结果。
另外，在传代时，分别注入一部分的单细胞的iPS细胞，用4％-多聚甲醛固定iPS细胞。进而，用流式细胞仪测定经固定的iPS细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量。其结果如图11所示，在开始培养起第10日、第21日和第30日，将试管配置在培养箱内培养出的iPS细胞为90％以上TRA1-60阳性。配置在培养箱外的恒温槽的试管内培养出的iPS细胞也得到了同样的结果。因此，示出了如果密闭容器，则即使不控制容器内的二氧化碳浓度，并且不添加和更换培养基，也能够使干细胞长时间以未分化状态在保持多能性的同时进行培养。
(实施例3)
与实施例1相同地制作出凝胶培养基。向凝胶培养基添加变为单细胞的iPS细胞。在15mL离心管中加入2mL的含iPS细胞的凝胶培养基。然后，拧紧离心管的管帽。
将离心管配置在37℃的CO2培养箱内，开始iPS细胞的悬浮培养。然后，每两日一次打开离心管的管帽，向离心管内添加2mL的pH为4.0至10.0之间的凝胶培养基。添加凝胶培养基后，如上所述拧紧管帽。
在开始离心管内的培养7至10日后，打开离心管的管帽，用过滤器回收凝胶培养基中形成的iPS细胞的细胞团，用PBS清洗，加入离心管。而且，向细胞团添加500μL的细胞解离试剂(TrypLE Select，注册商标，Thermo Fisher公司)，将细胞团在CO2培养箱内孵育5分钟。接着，从培养箱取出离心管，向离心管内加入含有20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)、GlutaMAX(注册商标，赛默飞世尔科技公司)和非必需氨基酸(NEAA)的500μL的培养基，使细胞团悬浊，而使iPS细胞变为单细胞。向离心管内添加2mL的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，用离心机以200g将离心管进行离心。离心后，除去离心管内的上清，以使iPS细胞的细胞数为2×105个/mL的方式向离心管中加入凝胶培养基。然后，与上述相同地，在密闭的离心管内悬浮培养iPS细胞7至10日，期间每两日添加一次凝胶培养基。
以后，与上述相同地反复进行传代和7至10日的悬浮培养，将iPS细胞在密闭的离心管内悬浮培养共计一个月以上。
用显微镜对在离心管内培养出的iPS细胞进行观察，确认如图12所示，均形成了细胞团。另外，与实施例3相同地用流式细胞仪测定iPS细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量，如图13所示，开始培养起第7至21日的iPS细胞几乎100％TRA-1-60阳性。
(实施例4)
将增殖因子添加到培养基(StemSpan H3000，注册商标，干细胞技术有限公司)中，还向培养基添加脱酰化结冷胶，来准备凝胶培养基。
将准备好的凝胶培养基放入15mL试管内，向凝胶培养基接种2×105个血液细胞(单核细胞)。然后，将15mL试管配置在37℃的CO2培养箱内，培养血液细胞7日。然后，向凝胶培养基以感染复数(MOI)为10.0的方式添加搭载OCT3/4、SOX2、KLF4、cMYC的仙台病毒载体(CytoTune-iPS2.0，株式会社ID制药)，使血液细胞被仙台病毒感染。
向凝胶培养基添加仙台病毒后，向凝胶培养基添加30mL的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，向接种有饲养细胞的培养瓶加入含有被仙台病毒感染的细胞的培养基，将培养瓶放置15日，对被仙台病毒感染的细胞进行粘附培养。在培养瓶内完全没有空气层。在此期间，如图14所示，用封口膜缠绕培养瓶的瓶帽周边，使培养瓶内完全封闭，完全不进行培养基更换和气体交换，也不控制培养瓶内的CO2浓度。
15日后，用显微镜对细胞进行观察，确认如图15所示，形成了ES细胞样集落。如图16所示，集落中的近100％为ES细胞样集落。另外，使用4％-多聚甲醛固定细胞，用流式细胞仪测定经固定的细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量，确认如图17的(a)所示，在诱导前的细胞中，几乎100％TRA-1-60阴性，与此相对，如图17的(b)所示，在诱导后的细胞中，几乎100％TRA-1-60阳性，几乎完全被再编程。因此，示出了在完全封闭的环境中，在不进行培养基更换和气体交换的情况下，能够从干细胞以外的细胞诱导iPS细胞。
(实施例5)
将与实施例4相同地准备好的凝胶培养基加入15mL试管，向凝胶培养基接种2×105个血液细胞(单核细胞)。然后，将15mL试管配置在37℃的CO2培养箱内，将血液细胞培养7日。然后，向凝胶培养基以感染复数(MOI)为10.0的方式添加搭载OCT3/4、SOX2、KLF4、cMYC的仙台病毒载体(CytoTune-iPS2.0，株式会社ID制药)，使血液细胞被仙台病毒感染。
向凝胶培养基添加仙台病毒后，向凝胶培养基添加15mL经凝胶化的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，将其中15mL含被仙台病毒感染的细胞的培养基加入15mL试管，将15mL试管放置15日，对被仙台病毒感染的细胞悬浮培养。在15mL试管内完全没有空气层。在此期间，将15mL试管内完全封闭，完全不进行培养基更换和气体交换，也不控制15mL试管内的CO2浓度。
15日后，用显微镜对细胞进行观察，确认如图18所示，形成了ES细胞样集落。另外，用4％-多聚甲醛固定细胞，使用流式细胞仪测定经固定的细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量，确认如图19所示，几乎100％TRA-1-60阳性，几乎完全被再编程。因此，示出了在完全封闭的环境中，在不进行培养基更换和气体交换的情况下，能够从干细胞以外的细胞诱导iPS细胞。
(实施例6)
如图20和图21所示，用培养侧板21和培养基侧板22夹着半透膜110(旭化成株式会社或SPECTRUM公司)，而且，用培养槽30和培养基保持槽40夹着半透膜110、培养侧板21和培养基侧板22。
将含20％的血清替代物(KnockOut SR，注册商标，Gibco公司)的干细胞培养基(REPROCELL公司)凝胶化后制作出凝胶培养基。以2×105个/mL向凝胶培养基添加变成单细胞的iPS细胞，来调制含细胞培养基。
将含细胞培养基加入注射器，通过插销33将注射器连接于培养槽30的供给口231。另外，通过插销34将空的注射器连接于培养槽30的排出口331。接着，从培养槽30的供给口231向培养槽30内注入注射器内的含细胞培养基。由于培养槽30内的压力上升，使连接于排出口331的注射器的活塞被动地上升，培养槽30内的空气移动到连接于培养槽30的排出口331的注射器内。向培养槽30内注入含细胞培养基直至培养槽30内的空气层完全消失。然后，隔离培养槽30的供给口231和排出口331。
将凝胶培养基加入注射器，通过插销61将注射器连接于培养基保持槽40的导入口240。另外，通过插销62将空的注射器连接于培养基保持槽40的排出口340。接着，从培养基保持槽40的导入口240向培养基保持槽40内注入射器内的凝胶培养基。由于培养基保持槽40内的压力上升，使连接于培养基保持槽40的排出口340的注射器被动地上升，培养基保持槽40内的空气移动到连接于培养基保持槽40的排出口340的注射器内。向培养基保持槽40内注入凝胶培养基，直至培养基保持槽40内的空气层完全消失。然后，隔离培养基保持槽40的导入口240和排出口340。由此，将培养槽30和培养基保持槽40内部密闭，使培养槽30和培养基保持槽40的内部和外部完全不发生气体交换。
在培养槽30内开始iPS细胞的悬浮培养。然后，每两日一次地将培养基保持槽40内的2mL的凝胶培养基更换为2mL的新鲜的凝胶培养基。开始在培养槽30内的培养7至10日后，将培养槽30内的含细胞培养基通过注射器排出，用过滤器回收形成在凝胶培养基中的iPS细胞的细胞团，用PBS清洗，加入离心管。并且，向细胞团添加500μL的细胞解离酶(TrypLESelect、Thermo Fisher公司)，在CO2培养箱内将细胞团孵育5分钟。接着，从培养箱取出离心管，向离心管内加入500μL的细胞培养基，使细胞团悬浊，而将iPS细胞变为单细胞。向离心管内添加2mL的细胞培养基，用离心机以200g将离心管进行离心。离心后，除去离心管内的上清，将iPS细胞和凝胶培养基加入离心管而调制出含细胞培养基。然后，与上述相同地将含细胞培养基注入培养槽30，将iPS细胞进行7至10日的悬浮培养，期间每两日一次地更换培养基保持槽40内的2mL的凝胶培养基。
以后，与上述相同地反复进行传代和7至10日的悬浮培养，将iPS细胞在密闭的培养槽30内悬浮培养共计一个月以上。
用显微镜对在培养槽30培养出的iPS细胞进行观察，确认如图22所示，均形成了均一的细胞团。
另外，在传代时，分别注入一部分的单细胞的iPS细胞，用4％-多聚甲醛固定iPS细胞。而且，使用流式细胞仪测定经固定的iPS细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量。其结果如图23所示，开始培养起第39日的iPS细胞为90％以上TRA-1-60阳性。因此，示出了如果将容器密闭，则即使不控制容器内的二氧化碳浓度，也能够使干细胞长时间以未分化状态在保持保持多能性的同时进行培养。
(实施例7)
与实施例6相同地调制出含细胞培养基。另外，准备与图2所示的细胞培养器相同的细胞培养器。向培养槽30内注入含细胞培养基直至培养槽30内的空气层完全消失。然后，隔离培养槽30的供给口和排出口。另外，用凝胶培养基填充培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60。然后，隔离培养基罐60的导入口和排出口。由此，密闭培养槽30和培养基保持槽40内部，使培养槽30和培养基保持槽40的内部和外部完全不发生气体交换。
使凝胶培养基在培养基保持槽40、培养基流路200和培养基罐60内循环，开始在培养槽30内悬浮培养iPS细胞。然后，2至6日一次地将培养基罐60内的10mL的凝胶培养基更换为10mL的新鲜的凝胶培养基。开始在培养槽30内的培养起7至10日后，用注射器将培养槽30内的含细胞培养基排出，进行与实施例6相同的传代处理后，与上述相同地将含细胞培养基注入培养槽30，悬浮培养iPS细胞7至10日，期间每4日一次更换培养基罐60内的10mL的凝胶培养基。
以后，与上述相同地反复进行传代和7至10日的悬浮培养，将iPS细胞在密闭的培养槽30内悬浮培养共计一个月以上。
用显微镜对在培养槽30培养出的iPS细胞进行观察，确认如图24所示，均形成了均一的细胞团。另外，与实施例6相同地使用流式细胞仪测定iPS细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量，如图25所示，开始培养起第15日的iPS细胞为几乎100％TRA-1-60阳性。
(实施例8)
将增殖因子添加到培养基(StemSpan H3000，注册商标，干细胞技术有限公司)，进而向培养基添加脱酰化结冷胶，来准备凝胶培养基。
将准备好的凝胶培养基加入15mL试管，向凝胶培养基接种2×105个血液细胞。然后，将15mL试管配置在CO2培养箱内，培养血液细胞(单核细胞)7日。然后，以感染复数(MOI)为10.0方式向凝胶培养基添加搭载OCT3/4、SOX2、KLF4、cMYC的仙台病毒载体(CytoTune-iPS2.0，株式会社ID药业)，使血液细胞被仙台病毒感染。
向凝胶培养基添加仙台病毒后，向凝胶培养基添加15mL的经凝胶化的干细胞培养基(含20％KnockOut SR(注册商标，赛默飞世尔科技公司)的DMEM/F12)，将其中15mL的含被仙台病毒感染的细胞的培养基加入图20和图21所示的培养槽30，将凝胶培养基注入培养基保持槽40。与实施例6相同地将培养槽30和培养基保持槽40内部密闭，使培养槽30和培养基保持槽40的内部和外部完全不发生气体交换。
开始在培养槽30内悬浮培养导入诱导因子的细胞。然后，每两日一次地将培养基保持槽40内的2mL的凝胶培养基更换为2mL的新鲜的凝胶培养基。
15日后，用显微镜对细胞进行观察，确认如图26所示，形成了ES细胞样集落。另外，用4％-多聚甲醛固定细胞，使用流式细胞仪测定经固定细胞中的细胞表面抗原TRA-1-60的表达量，确认如图27所示，为90％以上TRA-1-60阳性，几乎完全被再编程。因此，示出了在完全被封闭的环境下，在不进行培养基更换和气体交换的情况下，能够从干细胞以外的细胞诱导iPS细胞。

Claims (70)

1.一种细胞的培养或诱导方法，其特征在于，所述方法包括：在封闭体系内培养或诱导细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导包括再编程、初始化、转分化、分化诱导和细胞命运改变中的至少任一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系内与外部之间不发生气体交换。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述封闭体系内的温度进行控制。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，所述封闭体系密闭。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系密闭的状态下，外部气体不进入所述封闭体系内。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系密闭的状态下，所述封闭体系外的细胞、微生物、病毒和灰尘不进入所述封闭体系内。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系密闭的状态下，所述封闭体系内的物质不流出到所述封闭体系外。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，不向所述封闭体系内供给二氧化碳气体、氮气、和氧气中的至少任一种。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系内的培养基的pH保持在预定的范围内。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系的至少一部分通过埋入非透气性物质而形成。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系的至少一部分包括非透气性物质。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系内补充或更换培养基的同时，培养或诱导所述细胞。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系内使培养基循环的同时，培养或诱导所述细胞。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系具备培养所述细胞的培养槽，
在所述培养槽设置有用于向所述培养槽内供给流体的供给口和用于排出所述封闭体系内的流体的排出口，
所述供给口和所述排出口是能够密闭的。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，用于向所述供给口供给流体的供给器是能够装卸的，
用于向所述排出口排出流体的排出器是能够装卸的，
如果从所述供给器向所述培养槽内供给流体，则所述培养槽内的流体移动到所述排出器内。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，如果从所述供给器向所述培养槽内供给培养基，则所述培养槽内的空气移动到所述排出器内。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，如果从所述供给器向所述培养槽内供给培养基，则所述培养槽内的培养基移动到所述排出器内。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述培养基含有细胞。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其特征在于，在从所述供给器向所述培养槽内供给流体时，外部气体不进入所述培养槽内。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，不控制所述封闭体系内的二氧化碳浓度。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，不控制所述封闭体系外的二氧化碳浓度。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，所述封闭体系内的物质通过所述封闭体系内的半透膜而移动。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系具备培养所述细胞的培养槽和连接于所述培养槽的流路，
培养基在所述培养槽与所述流路中循环。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，在所述流路中，与外部不发生气体交换。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其特征在于，通过循环所述培养基，使所述培养槽内的培养基的pH保持在预定的范围内。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养为悬浮培养。
28.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养为粘附培养。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系内的凝胶培养基中培养所述细胞。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其特征在于，在所述封闭体系内的液体培养基中培养所述细胞。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系内的培养基被搅拌。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其特征在于，所述封闭体系内的培养基不被搅拌。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述细胞进行传代。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在接种与传代期间不进行培养基的添加和更换。
35.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在接种与传代期间进行培养基的添加或更换。
36.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在传代与传代期间不进行培养基的添加和更换。
37.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，在传代与传代期间进行培养基的添加或更换。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为干细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述干细胞为iPS细胞、ES细胞或成体干细胞。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，所述干细胞维持未分化状态。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述培养中，所述干细胞维持多能性。
42.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为体细胞。
43.根据权利要求1至37以及42中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为血液系统细胞。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为被导入了诱导因子的细胞。
45.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其特征在于，向所述封闭体系内的培养基添加诱导因子，向在所述封闭体系内培养的所述细胞导入所述诱导因子。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述细胞被诱导为干细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述干细胞为iPS细胞。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为血液系统细胞。
49.根据权利要求44或45所述的方法，其特征在于，所述细胞被诱导为其他种类的细胞。
50.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为血液系统细胞，
向所述封闭体系内的培养基添加诱导因子，向在所述封闭体系内培养的所述血液系统细胞导入所述诱导因子，将所述血液系统细胞诱导为iPS细胞。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导因子包含在质粒中。
52.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导因子为RNA。
53.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导因子包含在仙台病毒中。
54.一种细胞的培养或诱导方法，其特征在于，包括：
准备细胞培养器，所述细胞培养器具备：培养成分能够透过的培养成分透过部件、覆盖所述培养成分透过部件的一侧的面，并用于保持含细胞培养基且培养细胞的培养槽、以及覆盖所述培养成分透过部件的另一侧的面且用于保持培养基的培养基保持槽；以及
在所述培养槽中培养或诱导细胞。
55.根据权利要求54所述的方法，其特征在于，所述诱导包括再编程、初始化、转分化、分化诱导和细胞命运改变中的至少任一种。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其特征在于，所述细胞培养器的内部相对于外部被封闭。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养器内的培养基的pH保持在预定的范围内。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养为悬浮培养。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为干细胞。
60.根据权利要求54至58中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为体细胞。
61.根据权利要求54至58以及60中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为血液系统细胞。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为被导入了诱导因子的细胞。
63.根据权利要求54至61中任一项所述的方法，其特征在于，向所述培养槽内的培养基添加诱导因子，向在所述培养槽内培养的所述细胞导入所述诱导因子。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其特征在于，所述细胞被诱导为其他种类的细胞。
65.根据权利要求54至64中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养器还具备培养侧板，所述培养侧板与所述培养成分透过部件的所述培养槽侧的面重叠，并设置有开口。
66.根据权利要求54至65中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞培养器还具备培养基侧板，所述培养基侧板与所述培养成分透过部件的所述培养基保持槽侧的面重叠，并设置有开口。
67.根据权利要求65所述的方法，其特征在于，所述培养侧板为深色。
68.根据权利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述培养侧板的不设置有所述开口的部分作为背景，对所述细胞或由所述细胞组成的细胞团进行观察。
69.根据权利要求65或67所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述培养侧板的不设置有所述开口的部分作为背景，对所述细胞或由所述细胞组成的细胞团进行拍摄。
70.根据权利要求54至69中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述培养基保持槽的所述培养基进行补充或者更换。
CN201980054197.8A 2018-08-20 2019-08-20 细胞的培养或诱导方法 Pending CN112601813A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862766598P 2018-08-20 2018-08-20
US62/766,598 2018-08-20
PCT/JP2019/032438 WO2020040135A1 (ja) 2018-08-20 2019-08-20 細胞の培養又は誘導方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112601813A true CN112601813A (zh) 2021-04-02

Family

ID=69591192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980054197.8A Pending CN112601813A (zh) 2018-08-20 2019-08-20 细胞的培养或诱导方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210198635A1 (zh)
EP (1) EP3842526A4 (zh)
JP (1) JPWO2020040135A1 (zh)
CN (1) CN112601813A (zh)
WO (1) WO2020040135A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7391339B2 (ja) * 2019-08-29 2023-12-05 ファナック株式会社 細胞製造装置及びその製造方法
WO2024072444A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
US11898127B1 (en) 2022-09-26 2024-02-13 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4748124A (en) * 1984-10-30 1988-05-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized cell-culture device and method
US5153131A (en) * 1990-12-11 1992-10-06 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration High aspect reactor vessel and method of use
CN1427888A (zh) * 2000-03-02 2003-07-02 高木产业株式会社 细胞或组织的培养方法及其装置
CN1942575A (zh) * 2004-04-13 2007-04-04 东洋制罐株式会社 双层培养容器以及培养方法
CN104073436A (zh) * 2013-03-28 2014-10-01 爱科来株式会社 细胞培养装置、细胞培养系统以及细胞培养方法
CN106635790A (zh) * 2016-09-01 2017-05-10 奥凯（苏州）生物技术有限公司 一种全封闭自动化细胞培养系统
CN108138113A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 爱平世股份有限公司 多能性干细胞制造系统

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5026650A (en) * 1988-06-30 1991-06-25 The United States Of Amercia As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Horizontally rotated cell culture system with a coaxial tubular oxygenator
JP2003070458A (ja) * 2001-09-04 2003-03-11 Mitsubishi Heavy Ind Ltd ３次元クリノスタット、細胞培養装置、生物育成装置、及び材料形成装置
CN100379854C (zh) * 2002-12-27 2008-04-09 三菱重工业株式会社 培养多能干细胞的方法和设备
JP2007068447A (ja) * 2005-09-06 2007-03-22 Hiroshima Univ 幹細胞の培養方法及び幹細胞
AU2006325975B2 (en) 2005-12-13 2011-12-08 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
GB0821636D0 (en) * 2008-11-26 2008-12-31 Ucl Business Plc Device
EP2843036A4 (en) * 2012-04-27 2015-04-22 Asahi Chemical Ind CELL CULTURE SYSTEM AND CELL CULTURE PROCESS
JP5568620B2 (ja) 2012-12-07 2014-08-06 興研株式会社 局所空気清浄化装置
JP2016007170A (ja) * 2014-06-25 2016-01-18 カジックス株式会社 細胞培養容器
TWI750204B (zh) * 2016-07-22 2021-12-21 日商日產化學工業股份有限公司 液狀之培養基組成物之製造方法及使用於該製造方法之製造裝置

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4748124A (en) * 1984-10-30 1988-05-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized cell-culture device and method
US5153131A (en) * 1990-12-11 1992-10-06 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration High aspect reactor vessel and method of use
CN1427888A (zh) * 2000-03-02 2003-07-02 高木产业株式会社 细胞或组织的培养方法及其装置
CN1942575A (zh) * 2004-04-13 2007-04-04 东洋制罐株式会社 双层培养容器以及培养方法
CN104073436A (zh) * 2013-03-28 2014-10-01 爱科来株式会社 细胞培养装置、细胞培养系统以及细胞培养方法
CN108138113A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 爱平世股份有限公司 多能性干细胞制造系统
CN106635790A (zh) * 2016-09-01 2017-05-10 奥凯（苏州）生物技术有限公司 一种全封闭自动化细胞培养系统

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELLMAX赛澳美: ""动物细胞培养指南（三）"", 《CELLMAX胎牛血清》, pages 3 *
谭映军等: ""封闭型空间细胞培养板研制与验证"", 《航天医学与医学工程》, vol. 30, no. 2, pages 92 - 97 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020040135A1 (ja) 2020-02-27
EP3842526A1 (en) 2021-06-30
US20210198635A1 (en) 2021-07-01
EP3842526A4 (en) 2022-05-25
JPWO2020040135A1 (ja) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7351483B2 (ja) 多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法
CN112601813A (zh) 细胞的培养或诱导方法
CN110392733B (zh) 体细胞制造系统
US20230030031A1 (en) Cell treatment device, suspension culture vessel, and stem cell induction method
EP3981446A1 (en) Red blood cell removal device, mononuclear cell collector, cell culture device, cell culture system, cell culture method, and mononuclear cell collection method
JP2023086913A (ja) 細胞培養器
EP4056673A1 (en) Cell culture device
EP3992277A1 (en) Cell culturing vessel and cell culturing apparatus
JP2020036608A (ja) 多能性幹細胞製造システム、幹細胞の誘導方法、幹細胞の浮遊培養方法、幹細胞の浮遊培養器、人工多能性幹細胞の作製方法、及び動物細胞から特定の体細胞を作製する方法
US20220306993A1 (en) Erythrocyte removal device, mononuclear cell collector, cell culture device, cell culture system, cell culture method, and mononuclear cell collection method
WO2022210034A1 (ja) 細胞の培養器及び細胞の培養方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40043180

Country of ref document: HK