WO2022210034A1 - 細胞の培養器及び細胞の培養方法 - Google Patents

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WO2022210034A1
WO2022210034A1 PCT/JP2022/012699 JP2022012699W WO2022210034A1 WO 2022210034 A1 WO2022210034 A1 WO 2022210034A1 JP 2022012699 W JP2022012699 W JP 2022012699W WO 2022210034 A1 WO2022210034 A1 WO 2022210034A1
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WO
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container
channel
cells
variable
variable volume
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PCT/JP2022/012699
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剛士 田邊
亮二 平出
Original Assignee
アイ ピース， インコーポレイテッド
剛士 田邊
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M39/00—Tubes, tube connectors, tube couplings, valves, access sites or the like, specially adapted for medical use
    • A61M39/10—Tube connectors; Tube couplings
    • A61M39/16—Tube connectors; Tube couplings having provision for disinfection or sterilisation
    • A61M39/18—Methods or apparatus for making the connection under sterile conditions, i.e. sterile docking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to cell technology, and relates to a cell incubator and a cell culture method.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from early embryos of humans and mice. ES cells have pluripotency capable of differentiating into all cells existing in living organisms. Human ES cells are now available for cell transplantation therapy for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes, and leukemia. However, ES cell transplantation also has obstacles. In particular, transplantation of ES cells can provoke immune rejection similar to the rejection that follows unsuccessful organ transplantation. In addition, from an ethical standpoint, there are many criticisms and objections to the use of ES cells established by destroying human embryos.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • one of the objects of the present invention is to provide a cell incubator and a cell culture method capable of efficiently culturing cells.
  • a container and a container channel connected to the container for channeling a fluid into the container, wherein at least a portion of the container is gas permeable.
  • a cell incubator is provided which is
  • the gas-permeable portion of the container may be impermeable to viruses.
  • the container may include a housing having an opening and a lid for the opening.
  • the container channel may be connected to the housing of the container.
  • At least part of the housing may be gas permeable.
  • the container flow path may be connected to the lid of the container.
  • At least part of the lid may be gas permeable.
  • the container channel may be closable.
  • the cell incubator described above may further include a variable volume container connected to the container flow path.
  • the cell incubator described above may further include a variable volume container channel connected to the variable volume container.
  • the flow path for the variable volume container may be closable.
  • the container channel and the volume-variable container channel may be aseptically joined.
  • the above cell incubator may be configured such that the volume of the variable volume container changes when the fluid in the variable volume container moves into the container.
  • the volume of the variable volume container may be changed when the fluid in the container moves into the variable volume container.
  • the container includes a container, and a container channel connected to the container for sending a fluid into the container, wherein at least a part of the container is a gas.
  • Preparing a permeable culture vessel for cells connecting a variable volume container containing cells inside to the container channel, and contracting the variable volume container to move the cells into the container and culturing the cells in the container.
  • the above cell culture method may further include closing the container channel after moving the cells into the container.
  • the volume-variable container channel is connected to the volume-variable container, and the container channel and the volume-variable container channel are aseptically joined to each other so that the container channel has a variable volume.
  • Containers may be connected.
  • the above method for culturing cells may further include closing the channel for the variable volume container after moving the cells into the container.
  • the above cell culture method may further include expanding the variable-volume container and moving the culture medium in the container into the variable-volume container.
  • the container may be placed in a carbon dioxide incubator in culturing the cells in the container.
  • the container includes a container, and a container channel connected to the container for sending a fluid into the container, wherein at least a part of the container is a gas.
  • the above cell initialization method may further include closing the container channel after moving the reprogramming factor into the container.
  • variable-volume container channel is connected to the variable-volume container, and the container channel and the variable-volume container channel are aseptically joined so that the volume of the container channel is increased.
  • a variable container may be connected.
  • the above cell initialization method may further include closing the variable volume container channel after moving the cells into the container.
  • the container may be placed in a carbon dioxide incubator to initialize the cells within the container.
  • the container includes a container, and a container channel connected to the container for sending a fluid into the container, wherein at least a part of the container is a gas.
  • Culturing cells in a container of a permeable cell incubator, connecting a variable volume container containing a differentiation-inducing factor inside to the container channel, contracting the variable volume container, and performing differentiation A method of inducing cell differentiation is provided, comprising transferring an inducer into the vessel and inducing differentiation of the cell within the vessel.
  • the above method of inducing cell differentiation may further include closing the container channel after moving the differentiation-inducing factor into the container.
  • the volume-variable container channel is connected to the volume-variable container, and the container channel and the volume-variable container channel are aseptically joined to form a volume in the container channel.
  • a variable container may be connected.
  • the above cell differentiation induction method may further include closing the variable volume container channel after moving the cells into the container.
  • the container may be placed in a carbon dioxide incubator to induce differentiation of the cells within the container.
  • the present invention it is possible to provide a cell incubator and a cell culture method capable of efficiently culturing cells.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic perspective view and a schematic cross-sectional view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic perspective view and a schematic cross-sectional view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
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  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an aseptic welding device according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
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  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
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  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
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  • FIG. 1 is
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
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  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 1 is a schematic side view of an incubator according to an embodiment;
  • FIG. 4 is a photograph showing cells according to an example. 4 is a photograph showing cells according to an example. 4 is a photograph showing cells according to an example. 4 is a photograph showing cells according to an example. 4 is a photograph showing cells according to an example.
  • the cell incubator includes a container 10 and a container flow path 20 connected to the container 10 for sending a fluid into the container 10. and a flow path 20 .
  • At least a portion of container 10 is gas permeable.
  • the gas permeable portion is gas permeable and liquid impermeable.
  • Gas permeable parts are for example filters.
  • the container 10 includes, for example, a housing 11 having an opening and a lid 12 for the opening. At least part of the housing 11 may be gas permeable, and at least part of the lid 12 may be gas permeable.
  • FIG. 1 shows an example in which a lid 12 is provided with a gas permeable filter 13 .
  • a gas permeable portion is impermeable to, for example, dust, dirt, bacteria, and viruses.
  • Cells are cultured within the housing 11.
  • the size and shape of the housing 11 are not particularly limited as long as cells can be cultured inside.
  • Container 10 may be a flask. Examples of materials for the housing 11 include resin and glass.
  • the housing 11 may be transparent.
  • At least part of the surface constituting the housing 11 may or may not be coated with a coating agent for cell adhesion.
  • cell adhesion coatings include matrigel, collagen, polylysine, fibronectin, vitronectin, gelatin, and laminin.
  • at least a portion of the surface constituting housing 11 may be coated with a coating agent that suppresses cell adhesion.
  • coating agents that inhibit cell adhesion include poly(2-hydroxyethyl methacrylate).
  • at least part of the surface forming the housing 11 may be hydrophilic.
  • the inside of the housing 11 may be sterilized. Examples of sterilization include autoclave sterilization, irradiation with radiation such as gamma rays, and sterilization with UV irradiation.
  • Examples of cells cultured in incubators include somatic cells, but are not particularly limited.
  • Examples of cells include fibroblasts, nerve cells, retinal epithelial cells, hepatocytes, ⁇ cells, renal cells, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, megakaryocytes, T cells, NK cells, NKT cells, chondrocytes, cardiomyocytes, myocytes, vascular cells, epithelial cells, factor-introduced cells, reprogramming cells, and stem cells, but are not limited thereto.
  • Examples of stem cells include, but are not limited to, mesenchymal stem cells, somatic stem progenitor cells, pluripotent stem cells, ES cells, and iPS cells.
  • the medium for culturing cells is appropriately selected according to the type of cells. For example, if the cells are somatic cells, a somatic cell culture medium such as differentiated cell culture medium is selected. If the cells are stem cells, a stem cell medium suitable for stem cells is selected.
  • the medium may be a gel, a liquid, or a flowable solid. Flowable solids include agar and temperature sensitive gels.
  • the medium may contain a polymer compound.
  • Polymer compounds include, for example, gellan gum, deacylated gellan gum, hyaluronic acid, rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate , deltamansulfate, rhamnansulfate, and salts thereof.
  • the medium may contain methylcellulose.
  • the medium may be poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide (NHS ) ester terminated, triethoxysilane terminated, Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide), Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate), Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate), and N-isopropylacrylamide.
  • a gel medium or gel medium includes a polymer medium.
  • the container flow path 20 may be connected to the housing 11 of the container 10, or may be connected to the lid 12 of the container 10 as shown in FIG.
  • a portion of the housing 11 of the container 10 to which the container flow path 20 is connected is not particularly limited.
  • the container channel 20 may be connected at or near a corner of the housing 11 of the container 10 or connected above the cell adhesion surface of the housing 11 of the container 10 .
  • the container flow path 20 may be inserted into the inside of the housing 11 of the container 10 .
  • the container flow path 20 may reach the bottom surface inside the housing 11 of the container 10 . This may facilitate removal of solution near the bottom surface.
  • the container flow path 20 may reach the corner of the bottom surface inside the housing 11 of the container 10 or the periphery of the corner.
  • the portion of the lid 12 of the container 10 to which the container flow path 20 is connected is also not particularly limited.
  • the container channel 20 is, for example, a flexible tube.
  • the container flow path 20 is made of resin, for example.
  • the resin is, for example, synthetic resin. Examples of synthetic resins include polyvinyl chloride.
  • the container flow path 20 is made of, for example, a heat-sealable material.
  • the container channel 20 can be closed, for example.
  • the container flow path 20 when the container flow path 20 is made of resin, the container flow path 20 is closed by sandwiching the container flow path 20 with pressurizers while heating the container flow path 20 .
  • the inside of the container flow path 20 , and the inside of the housing 11 can be kept in a clean environment.
  • the method for closing the container flow path 20 is not limited to the above, and includes optical processing, laser beam processing, friction processing, rubbing processing, thermal processing without pressure, and pressure processing without heating. can be used.
  • the container channel 20 may be sandwiched with clips or the like.
  • the cell incubator according to the embodiment may further include a variable volume container 30 connected to the container channel 20 .
  • a volume-variable container channel 40 may be connected to the volume-variable container 30 , and the volume-variable container 30 may be connected to the container channel 20 via the volume-variable container channel 40 .
  • the variable volume container 30 contains, for example, a solution containing cells.
  • the volume-variable container 30 containing the cell-containing solution may be placed in a temperature control bath that can be set to a temperature suitable for the cells until it is connected to the container channel 20 .
  • the volume-variable container 30 includes, for example, a syringe containing a fluid and a plunger that is inserted into the syringe and is movable within the syringe. It may be possible. Alternatively, the variable volume container 30 may be a flexible bellows or bag.
  • the volume-variable container channel 40 is, for example, a flexible tube.
  • the volume-variable container flow path 40 is made of resin, for example.
  • the resin is, for example, synthetic resin. Examples of synthetic resins include polyvinyl chloride.
  • the volume-variable container channel 40 can be closed, for example.
  • the container channel 20 whose end is closed and the volume variable container channel 40 whose end is closed are joined by an aseptic joining device, and the container channel 20 is connected to the volume variable container channel 40. It may penetrate up to the flow path 40 .
  • the aseptic joining apparatus includes, for example, holders 121 and 132 that hold the container flow path 20 and the volume-variable container flow path 40 that are partially arranged in parallel, a holder 121, a cutter 50 movable between 132; Cutter 50 is heatable.
  • the cutter 50 moves between the holders 121 and 132 and melts and cuts the container channel 20 and the volume-variable container channel 40, respectively.
  • the melted and cut portions of the container flow path 20 and the volume variable container flow path 40 are in close contact with the side surfaces of the cutter 50, and outside air is present inside the container flow path 20 and the volume variable container flow path 40. Do not invade.
  • At least one of the holders 121 and 132 is held while the melted and cut portions of the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 are kept in close contact with the side surface of the cutter 50. is moved so that the melted and cut portions of the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 are arranged on the same line.
  • the cutter 50 between the melted and cut portions of the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 is removed, and at the same time, the container channel is removed.
  • the melted and cut portions of the channel 20 and the volume-variable container channel 40 are joined together.
  • the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 can be aseptically joined without allowing outside air to enter the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 .
  • the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 are removed from the holders 121 and 132 .
  • the method of connecting the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 is not particularly limited. , may be connected.
  • the solution containing cells in the variable volume container 30 shrinks as shown in FIG. 7(b).
  • the volume-variable container channel 40 and the container channel 20 into the housing 11 .
  • gas such as air in the housing 11 is discharged from the gas permeable portion.
  • the inside of housing 11 may be filled with a solution containing cells so that no air layer remains inside housing 11 . However, if the air layer does not remain, minute air bubbles may remain in the solution filled in the housing 11 .
  • the inside of housing 11 may be filled with a solution containing cells so that an air layer remains inside housing 11 .
  • the cells may be cultured while the variable volume container 30 is connected to the container channel 20 .
  • at least one of the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 may be closed to culture the cells.
  • a method for closing at least one of the container channel 20 and the volume-variable container channel 40 includes thermocompression bonding.
  • the variable volume container 30 may be removed from the housing 11 after at least one of the container channel 20 and the variable volume container channel 40 is closed.
  • the cell incubator may be placed in an incubator that can be set to a temperature and carbon dioxide concentration suitable for culturing the cells. Carbon dioxide can be supplied into the container 10 through the gas permeable portion of the container 10 .
  • the cell incubator may be placed in a hypoxic environment so that the container 10 is in a hypoxic state.
  • FIGS. 9(a) and 9(b) when exchanging the medium in the housing 11 while culturing adherently cultured cells in the housing 11, as shown in FIGS. 20 is connected to an expandable volume variable container 31 via a volume variable container channel 41 .
  • the volume of the variable volume container 31 changes and expands
  • the culture medium in the housing 11 moves between the container channel 20 and the volume variable container channel 41.
  • the surface of the housing 11 on which the cells are adhered may be parallel to the direction of gravity.
  • FIG. 9C the variable volume container 31 is removed from the housing 11.
  • FIG. 9C the variable volume container 31 is removed from the housing 11.
  • the volume-variable container 30 containing the culture medium may be placed in a temperature control bath that can be set to a temperature suitable for the culture medium until it is connected to the container flow path 20 .
  • a suitable temperature for the medium may be 4°C.
  • the medium may be replaced multiple times.
  • the type of medium may be changed and the medium may be exchanged.
  • variable volume container 32 containing a solution containing When introducing a factor into the cells cultured in the housing 11, as shown in FIG. A variable volume container 32 containing a solution containing is connected.
  • the variable volume container 32 containing the solution containing the factor may be placed in a temperature controlled bath that can be set to a temperature suitable for the factor until it is connected to the housing 11 .
  • Factors may be nucleic acids such as DNA, RNA, and oligonucleotides, proteins, compounds, or viruses.
  • the DNA may be plasmid DNA.
  • RNA can be mRNA, siRNA, and miRNA.
  • the RNA may be modified RNA or unmodified RNA.
  • Nucleic acids may be incorporated into vectors. Examples of vectors include plasmids, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, episomal and Sendai viruses.
  • the protein may be a nuclease protein such as the Cas9 protein.
  • the virus may be a lentivirus.
  • the factor may be an inducer that induces cells in a first state to cells in a second state. Factors may be hormones, growth factors, and small molecule compounds.
  • induction refers to reprogramming, reprogramming, transformation, transdifferentiation or lineage reprogramming, differentiation induction, cell fate reprogramming, and the like.
  • Factors that induce cells other than pluripotent stem cells to become pluripotent stem cells are called reprogramming factors.
  • Reprogramming factors include, for example, OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC.
  • Reprogramming factors also include growth factors and compounds such as, for example, bFGF and TGF- ⁇ .
  • a factor that induces a cell to differentiate is called a differentiation-inducing factor.
  • Differentiation-inducing factors induce stem cells into differentiated cells.
  • the differentiation inducer induces somatic cells other than stem cells into other somatic cells.
  • Differentiation-inducing factors include growth factors such as activin, bone morphogenetic proteins, and FGFs, and compounds such as GSK inhibitors and smad inhibitors. Induction of somatic cells other than stem cells into other somatic cells other than stem cells is sometimes referred to as direct reprogramming.
  • Examples of factors that induce cells into nervous system cells include the ASCL family, DLX family, MYT family, NeuroD family, SOX family, and NGN family.
  • Examples of the ASCL family include ASCL1.
  • Examples of the DLX family include DLX2.
  • Examples of the MYT family include MYT1L.
  • Examples of the NGN family include NGN2.
  • Examples of neural cells include nerve cells, neural stem cells and neural progenitor cells.
  • Examples of neurons include inhibitory, excitatory and dopaminergic neurons, cerebral nerves, interneurons, and optic nerves.
  • the nervous system cells may be motor neurons, oligodendrocyte progenitor cells, astrocytes, oligodenrhodocytes, and the like.
  • Examples of factors that induce cells into cardiomyocytes include the GATA family, MEF family, TBX family, MYOCD family, MESP family, and miR-133 family.
  • Examples of the GATA family include GATA4A.
  • Examples of the MEF family include MEF2C.
  • Examples of the TBX family include TBX5.
  • Examples of the MESP family include MESP1.
  • the solution containing the factor in the variable volume container 32 moves to the channel 42 for the variable volume container. , and the container channel 20 into the housing 11 .
  • the factors come into contact with the cells within the housing 11 and are introduced into the cells.
  • the factor may be introduced into the cells while the variable volume container 32 is connected to the container channel 20 .
  • the container channel 20 or the volume-variable container channel 42 is closed, and then the volume-variable container 32 is removed from the housing 11. good too.
  • the housing 11 may be placed in an incubator that can be set to a temperature and carbon dioxide concentration suitable for factor introduction.
  • the introduction of factors into cells may be performed multiple times. Further, after the factor is introduced into the cell, the solution containing the factor in the housing 11 may be replaced with the medium in the same procedure as the medium replacement, and the cell culture may be continued. Furthermore, the exchange of medium may be repeated in the above-described procedure. Cultivation includes initialization culture and expansion culture.
  • a volume-variable container 33 containing a solution containing a stripping agent is connected to .
  • stripping agents include trypsin, triple select, acutase, EDTA, and the like.
  • the volume-variable container 33 containing the stripping agent-containing solution may be placed in a temperature controlled bath that can be set to a temperature suitable for the stripping agent until it is connected to the housing 11 .
  • the solution containing the stripping agent in the variable volume container 33 changes to the variable volume container flow. It moves into the housing 11 via the channel 43 and the container channel 20 . As a result, the cells in the housing 11 are brought into contact with the solution containing the detachment agent.
  • the detachment agent may be brought into contact with the cells while the variable volume container 33 is connected to the housing 11 .
  • the variable volume container 33 may be removed from the housing 11 after the container channel 20 or the variable volume container channel 43 is closed.
  • the housing 11 may be placed in an incubator that can be set to a temperature and carbon dioxide concentration suitable for cell detachment. After that, the stripping agent in the housing may be sucked by a method similar to the method of removing the culture medium described with reference to FIGS. 8 and 9 .
  • the release agent in the housing is released into the container channel and the container channel. It moves into the variable volume container via the variable volume container channel.
  • the culture solution may be supplied into the housing 11 and the housing 11 may be shaken to detach the cells from the housing 11 .
  • Detached cells may be seeded in the same or another housing 11 to passage the cells.
  • the collected cells may be seeded in the housing without discrimination without colony picking.
  • the lid 12 When collecting the cells in the housing 11 , the lid 12 may be opened and the cells may be collected through the opening of the housing 11 .
  • the cell suspension in the housing may be aspirated by a method similar to the medium removal method described with reference to FIGS. 8 and 9 .
  • a variable volume container containing a coating agent is connected to the container channel 20 via the variable volume container channel 41 .
  • the coating agent in the variable volume container 32 moves into the housing 11 via the variable volume container channel and the container channel. do.
  • the coating agent is placed in the housing 11 at room temperature for one hour or longer, for example.
  • the coating agent is placed, for example, in housing 11 at 4° C. for 6 hours or more. After that, when collecting the excess coating agent in the housing 11 , the lid 12 may be opened and the coating agent may be collected through the opening of the housing 11 .
  • the coating agent inside the housing may be aspirated by a method similar to the medium removal method described with reference to FIGS. 8 and 9 . That is, when an inflatable volume-variable container is connected to the container channel through the volume-variable container channel and the volume of the volume-variable container is expanded, the coating agent in the housing spreads through the container channel and the container channel. It moves into the variable volume container via the variable volume container channel.
  • a flask housing with an interior coated with laminin 511 was provided.
  • the opening of the housing was provided with a lid, and the housing was connected with a resin tube as a container flow path.
  • the lid was also provided with a filter for gas permeation.
  • Human peripheral blood mononuclear cells were suspended in a blood cell medium, and the number of mononuclear cells was measured using a hemocytometer to adjust the mononuclear cell count in the blood cell medium.
  • a blood cell culture medium containing mononuclear cells was placed in a syringe as a variable volume container, and the variable volume container was aseptically connected to the container channel via a resin tube as the variable volume container channel.
  • the volume of the variable volume container was reduced, and the blood cell culture medium containing mononuclear cells in the variable volume container was moved into the housing. After that, the container channel was closed, the housing was placed in an incubator, and the mononuclear cells were two-dimensionally cultured in the housing at 37° C. for 1 to 7 days. On the third day, the blood cell culture medium was placed in the variable volume container, and the variable volume container was aseptically connected to the container channel through the variable volume container channel. The volume of the variable volume container was reduced, the blood cell medium in the variable volume container was moved into the housing, and the housing was replenished with the blood cell medium.
  • a solution containing Sendai virus (CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, registered trademark, Thermofisher) capable of expressing the reprogramming factor OSKM (OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC) was placed in a variable volume container.
  • the volume variable container was aseptically connected to the container channel through the volume variable container channel.
  • the volume of the variable volume container was reduced, and the solution containing the Sendai virus in the variable volume container was moved into the housing.
  • Sendai virus was added at an MOI of 5 to the mononuclear cells cultured in the housing. After that, the container channel was closed, the housing was placed in an incubator, and the cells were cultured at 34°C.
  • the iPS cell medium was added to the housing.
  • an empty variable volume container was aseptically connected to the housing, and the medium in the housing was sucked into the variable volume device.
  • the variable volume container containing the culture medium was aseptically connected to the housing, and the medium in the variable volume container was supplied into the housing.
  • the iPS cell medium was added into the housing once every two days.
  • the medium inside the housing was replaced with the medium for iPS cells once every two days.
  • an empty variable volume container was aseptically connected to the housing, and the medium in the housing was sucked into the variable volume device.
  • variable volume container containing the culture medium was aseptically connected to the housing, and the medium in the variable volume container was supplied into the housing.
  • the temperature of the incubator in which the housing was placed was raised stepwise to 37°C and 38°C.
  • Eight days after the infection stem cell-like cell clusters were generated. Almost all the cells became TRA1-60 positive cells on the 18th day after the infection and exhibited an iPS cell-like morphology.
  • a photograph of the cells 14 days after the infection is shown in FIG. 12(a).
  • FIG. 12(b) shows a photograph of the cells 5 days after the first passage.
  • FIG. 12(c) A photograph of the cells 5 days after the second passage is shown in FIG. 12(c). Seven days after the second passage, the third passage was performed.
  • FIG. 12(d) shows a photograph of cells five days after the third passage.

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Abstract

容器と、容器に接続された容器用流路であって、容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器。

Description

細胞の培養器及び細胞の培養方法
　本発明は細胞技術に関し、細胞の培養器及び細胞の培養方法に関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。
　このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１、２参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。
特許第４１８３７４２号公報 特開２０１４－１１４９９７号公報
　ｉＰＳ細胞に限らず、様々な細胞を効率的に培養可能な手法が望まれている。そこで、本発明は、細胞を効率的に培養可能な細胞の培養器及び細胞の培養方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、容器と、容器に接続された容器用流路であって、容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器が提供される。
　上記の細胞の培養器において、容器の気体透過性の部分が、ウイルスを通さなくともよい。
　上記の細胞の培養器において、容器が、開口を有する筐体と、開口の蓋と、を備えていてもよい。
　上記の細胞の培養器において、容器用流路が、容器の筐体に接続されていてもよい。
　上記の細胞の培養器において、筐体の少なくとも一部が気体透過性であってもよい。
　上記の細胞の培養器において、容器用流路が、容器の蓋に接続されていてもよい。
　上記の細胞の培養器において、蓋の少なくとも一部が気体透過性であてもよい。
　上記の細胞の培養器において、容器用流路が閉塞可能であってもよい。
　上記の細胞の培養器が、容器用流路に接続される容積可変容器をさらに備えていてもよい。
　上記の細胞の培養器が、容積可変容器に接続された容積可変容器用流路をさらに備えていてもよい。
　上記の細胞の培養器において、容積可変容器用流路が閉塞可能であってもよい。
　上記の細胞の培養器において、容器用流路と容積可変容器用流路が無菌接合されてもよい。
　上記の細胞の培養器において、容積可変容器内の流体が容器内に移動する際に、容積可変容器の容積が変化するよう構成されていてもよい。
　上記の細胞の培養器において、容器内の流体が容積可変容器内に移動する際に、容積可変容器の容積が変化するよう構成されていてもよい。
　また、本発明の態様によれば、容器と、容器に接続された容器用流路であって、容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器を用意することと、容器用流路に、内部に細胞を含む容積可変容器を接続することと、容積可変容器を収縮させ、細胞を容器内に移動させることと、容器内で細胞を培養することと、を含む、細胞の培養方法が提供される。
　上記の細胞の培養方法が、細胞を容器内に移動させた後、容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の培養方法において、容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、容器用流路と容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、容器用流路に容積可変容器を接続してもよい。
　上記の細胞の培養方法が、細胞を容器内に移動させた後、容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の培養方法が、容積可変容器を膨張させ、容器内の培地を容積可変容器内に移動させることをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の培養方法において、容器内で細胞を培養することにおいて、容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置してもよい。
　また、本発明の態様によれば、容器と、容器に接続された容器用流路であって、容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器の容器内で細胞を培養することと、容器用流路に、内部に初期化因子を含む容積可変容器を接続することと、容積可変容器を収縮させ、初期化因子を容器内に移動させることと、容器内で細胞を初期化することと、を含む、細胞の初期化方法が提供される。
　上記の細胞の初期化方法において、初期化因子を容器内に移動させた後、容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の初期化方法において、容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、容器用流路と容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、容器用流路に容積可変容器を接続してもよい。
　上記の細胞の初期化方法が、細胞を容器内に移動させた後、容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の初期化方法において、容器内で細胞を初期化することにおいて、容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置してもよい。
　また、本発明の態様によれば、容器と、容器に接続された容器用流路であって、容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器の容器内で細胞を培養することと、容器用流路に、内部に分化誘導因子を含む容積可変容器を接続することと、容積可変容器を収縮させ、分化誘導因子を容器内に移動させることと、容器内で細胞を分化誘導することと、を含む、細胞の分化誘導方法が提供される。
　上記の細胞の分化誘導方法が、分化誘導因子を容器内に移動させた後、容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の分化誘導方法において、容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、容器用流路と容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、容器用流路に容積可変容器を接続してもよい。
　上記の細胞の分化誘導方法が、細胞を容器内に移動させた後、容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含んでいてもよい。
　上記の細胞の分化誘導方法において、容器内で細胞を分化誘導することにおいて、容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置してもよい。
　本発明によれば、細胞を効率的に培養可能な細胞の培養器及び細胞の培養方法を提供可能である。
実施形態に係る培養器の模式的斜視図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的斜視図と模式的断面図である。 実施形態に係る培養器の模式的斜視図と模式的断面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る無菌接合装置の模式図である。 実施形態に係る無菌接合装置の模式図である。 実施形態に係る無菌接合装置の模式図である。 実施形態に係る無菌接合装置の模式図である。 実施形態に係る無菌接合装置の模式図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施形態に係る培養器の模式的側面図である。 実施例に係る細胞を示す写真である。 実施例に係る細胞を示す写真である。 実施例に係る細胞を示す写真である。 実施例に係る細胞を示す写真である。
　以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
　実施形態に係る細胞の培養器は、図１及び図２に示すように、容器１０と、容器１０に接続された容器用流路２０であって、容器１０内に流体を送るための容器用流路２０と、を備える。容器１０の少なくとも一部は、気体透過性である。気体透過性の部分は、気体を透過させ、液体を透過させない。気体透過性の部分は、例えばフィルターである。
　容器１０は、例えば、開口を有する筐体１１と、開口の蓋１２と、を備える。筐体１１の少なくとも一部が気体透過性であってもよいし、蓋１２の少なくとも一部が気体透過性であってもよい。図１は、蓋１２に気体透過性のフィルター１３が設けられた例を示している。気体透過性の部分は、例えば、塵、埃、細菌、及びウイルスを透過させない。
　筐体１１内で細胞が培養される。筐体１１の大きさ及び形状は、内部で細胞を培養することが可能であれば、特に限定されない。容器１０は、フラスコであってもよい。筐体１１の材料の例としては、樹脂及びガラスが挙げられる。筐体１１は透明であってもよい。
　筐体１１を構成する面の少なくとも一部は、細胞接着用コーティング剤でコーティングされていてもよいし、コーティングされていなくともよい。細胞接着用コーティング剤の例としては、マトリゲル、コラーゲン、ポリリジン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、ゼラチン、及びラミニンが挙げられる。あるいは、細胞を浮遊培養する場合は、筐体１１を構成する面の少なくとも一部は、細胞の接着を抑制するコーティング剤でコーティングされていてもよい。細胞の接着を抑制するコーティング剤の例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）が挙げられる。また、筐体１１を構成する面の少なくとも一部は、親水性であってもよい。筐体１１内部は、滅菌処理されていてもよい。滅菌処理の例としては、高圧蒸気滅菌処理、ガンマ線等の放射線照射、及びＵＶ照射による滅菌処理が挙げられる。
　培養器で培養される細胞の例としては体細胞が挙げられるが、特に限定されない。細胞の例としては、線維芽細胞、神経細胞、網膜上皮細胞、肝細胞、β細胞、腎細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、メガカリオサイト、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、軟骨細胞、心筋細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、因子導入細胞、リプログラミング細胞、及び幹細胞が挙げられるが、特に限定されない。幹細胞の例としては、間葉系幹細胞、体性幹前駆細胞、多能性幹細胞、ＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞が挙げられるが、特に限定されない。
　細胞を培養するための培地は、細胞の種類に応じて適宜選択される。例えば、細胞が体細胞である場合は、分化細胞培地等の体細胞培地が選択される。細胞が幹細胞である場合は、幹細胞に適した幹細胞培地が選択される。培地は、ゲルであってもよいし、液体であってもよいし、流動可能な固体であってもよい。流動可能な固体としては、寒天及び温度感受性ゲルが挙げられる。
　培地がゲル状である場合、培地は、高分子化合物を含んでいてもよい。高分子化合物は、例えば、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であってもよい。また、培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。
　あるいは、培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。なお、本開示において、ゲル状の培地あるいはゲル培地とは、ポリマー培地を包含する。
　容器用流路２０は、容器１０の筐体１１に接続されていてもよいし、図３に示すように、容器１０の蓋１２に接続されていてもよい。容器１０の筐体１１の容器用流路２０が接続される部分は、特に限定されない。例えば、容器用流路２０は、容器１０の筐体１１の角又は角の近傍に接続されてもよいし、容器１０の筐体１１の細胞接着面の上方に接続されてもよい。容器用流路２０は、容器１０の筐体１１内部にまで挿入されていてもよい。容器用流路２０は、容器１０の筐体１１内部の底面にまで達してもよい。これにより、底面近傍の溶液の除去が容易になり得る。容器用流路２０は、容器１０の筐体１１内部の底面の角や角の周辺にまで達してもよい。容器１０の蓋１２の容器用流路２０が接続される部分も、特に限定されない。
　容器用流路２０は、例えば、可撓性のチューブである。容器用流路２０は、例えば、樹脂からなる。樹脂は、例えば、合成樹脂である。合成樹脂の例としては、ポリ塩化ビニルが挙げられる。容器用流路２０は、例えば、ヒートシール可能な素材からなる。容器用流路２０は、例えば、閉塞可能である。
　例えば、容器用流路２０が樹脂からなる場合、容器用流路２０を加熱しながら加圧器で挟み込みことにより、容器用流路２０が閉塞される。例えば、清浄な環境下で筐体１１を製造し、清浄な環境下で筐体１１と容器用流路２０を接続し、容器用流路２０を閉塞することにより、容器用流路２０の内部と、筐体１１の内部と、を清浄な環境に保つことが可能である。なお、容器用流路２０を閉塞する方法は、上記に限定されず、光加工、レーザー光加工、摩擦加工、擦り合わせ加工、加圧を伴わない熱加工、及び加熱を伴わない加圧加工等を用いることができる。例えば、容器用流路２０をクリップ等で挟んでもよい。
　図４に示すように、実施形態に係る細胞の培養器は、容器用流路２０に接続される容積可変容器３０をさらに備えていてもよい。容積可変容器３０には、容積可変容器用流路４０が接続され、容積可変容器３０は、容積可変容器用流路４０を介して、容器用流路２０に接続されてもよい。
　容積可変容器３０は、例えば、細胞を含む溶液を含む。細胞を含む溶液を含む容積可変容器３０は、容器用流路２０に接続されるまで、細胞に適した温度に設定可能な温度管理槽内に配置されてもよい。
　容積可変容器３０は、例えば、流体を収容するシリンジと、シリンジに挿入され、シリンジ内を移動可能なプランジャーと、を備え、プランジャーの移動により、シリンジ内の流体を収容可能な容積を変更可能であってもよい。あるいは、容積可変容器３０は、可撓性を有する蛇腹やバッグであってもよい。
　容積可変容器用流路４０は、例えば、可撓性のチューブである。容積可変容器用流路４０は、例えば、樹脂からなる。樹脂は、例えば、合成樹脂である。合成樹脂の例としては、ポリ塩化ビニルが挙げられる。容積可変容器用流路４０は、例えば、閉塞可能である。
　例えば、端部が閉塞している容器用流路２０と、端部が閉塞している容積可変容器用流路４０とを、無菌接合装置により接合し、容器用流路２０から容積可変容器用流路４０までを貫通させてもよい。
　図５（ａ）に示すように、無菌接合装置は、例えば、部分的に並列に並べられた容器用流路２０と容積可変容器用流路４０を保持するホルダー１２１、１３２と、ホルダー１２１、１３２の間を移動可能なカッター５０と、を備える。カッター５０は加熱可能である。図５（ｂ）に示すように、カッター５０は、ホルダー１２１、１３２の間を移動し、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれを溶融切断する。容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれの溶融切断された部分は、カッター５０の側面に密着し、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０の内部には外気が侵入しない。
　図５（ｃ）に示すように、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれの溶融切断された部分をカッター５０の側面に密着させたまま、ホルダー１２１、１３２の少なくともいずれかを移動させ、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれの溶融切断された部分が同一線上に配置されるようにする。
　図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すように、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれの溶融切断された部分の間のカッター５０を取り除くと同時に、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０のそれぞれの溶融切断された部分どうしを接合する。これにより、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０の内部に外気を侵入させることなく、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０を無菌的に接合することが可能である。その後、容器用流路２０と容積可変容器用流路４０をホルダー１２１、１３２から外す。
　なお、容器用流路２０と、容積可変容器用流路４０と、を接続する方法は、特に限定されず、例えば、無菌コネクターによって、容器用流路２０と、容積可変容器用流路４０と、を接続してもよい。
　図７（ａ）に示す、内部に細胞を含む溶液を含む容積可変容器３０の容積が変化して収縮すると、図７（ｂ）に示すように、容積可変容器３０内の細胞を含む溶液が、容積可変容器用流路４０、及び容器用流路２０を介して、筐体１１内に移動する。また、筐体１１内の空気等の気体が、気体透過性の部分から排出される。筐体１１内に空気層が残らないように、筐体１１内を細胞を含む溶液で充填してもよい。ただし、空気層が残らなければ、筐体１１内に充填された溶液中に、微小な気泡が残っていてもよい。筐体１１内に空気層が残るように、筐体１１内を細胞を含む溶液で充填してもよい。
　細胞を含む溶液を筐体１１内に移動させた後、容積可変容器３０を容器用流路２０に接続したまま、細胞を培養してもよい。あるいは、図７（ｃ）に示すように、例えば容器用流路２０及び容積可変容器用流路４０の少なくとも一方を閉塞して、細胞を培養してもよい。容器用流路２０及び容積可変容器用流路４０の少なくとも一方を閉塞する方法としては、熱圧着が挙げられる。図７（ｄ）に示すように、容器用流路２０及び容積可変容器用流路４０の少なくとも一方を閉塞した後、容積可変容器３０を筐体１１から除去してもよい。容積可変容器３０を除去した後、細胞の培養器を、細胞の培養に適した温度及び二酸化炭素濃度に設定可能なインキュベーター内に配置してもよい。容器１０の気体透過性の部分を介して、容器１０内に二酸化炭素を供給可能である。また、細胞の培養器を、低酸素環境下に配置して、容器１０内を低酸素状態にしてもよい。
　例えば接着培養されている細胞を筐体１１内で培養しながら、筐体１１内の培地を交換する際には、図８（ａ）及び図８（ｂ）に示すように、容器用流路２０に、容積可変容器用流路４１を介して、膨張可能な容積可変容器３１が接続される。図９（ａ）及び図９（ｂ）に示すように、容積可変容器３１の容積が変化して膨張すると、筐体１１内の培地が、容器用流路２０及び容積可変容器用流路４１を介して、容積可変容器３１内に移動する。この際、筐体１１の細胞が接着している面を、重力方向と平行にしてもよい。次に、図９（ｃ）に示すように、容積可変容器３１を筐体１１から除去する。その後、図４から図７で説明した方法と同様の方法により、筐体１１内に、新鮮な培地を供給する。培地を含む容積可変容器３０は、容器用流路２０に接続されるまで、培地に適した温度に設定可能な温度管理槽内に配置されてもよい。培地に適した温度は、４℃であってもよい。
　培地の交換は、複数回行ってもよい。また、細胞の状態に応じて、培地の種類を変えて、培地の交換をしてもよい。
　筐体１１内で培養されている細胞に因子を導入する際には、図１０（ａ）に示すように、容器用流路２０に、容積可変容器用流路４２を介して、内部に因子を含む溶液を含む容積可変容器３２が接続される。因子を含む溶液を含む容積可変容器３２は、筐体１１に接続されるまで、因子に適した温度に設定可能な温度管理槽内に配置してもよい。
　因子はＤＮＡ、ＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチド等の核酸であってもよいし、タンパク質であってもよいし、化合物であってもよいし、ウイルスであってもよい。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡであってもよい。ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、修飾ＲＮＡであってもよいし、非修飾ＲＮＡであってもよい。核酸はベクターに組み込まれていてもよい。ベクターの例としては、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、エピソーマル、及びセンダイウイルスが挙げられる。タンパク質はＣａｓ９タンパク質等のヌクレアーゼタンパク質であってもよい。ウイルスはレンチウイルスであってもよい。因子は、第１の状態の細胞を第２の状態の細胞に誘導する誘導因子であってもよい。因子は、ホルモン、成長因子、及び低分子化合物であってもよい。
　本開示において、誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。多能性幹細胞以外の細胞を多能性幹細胞に誘導する因子を、リプログラミング因子という。リプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣを含む。また、リプログラミング因子は、例えば、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ－β等の増殖因子や化合物も含む。また、ある細胞を分化細胞に誘導する因子を、分化誘導因子という。分化誘導因子は、幹細胞を分化細胞に誘導する。あるいは、分化誘導因子は、幹細胞以外の体細胞を、別の体細胞に誘導する。分化誘導因子は、アクチビン、骨形成タンパク質、及びＦＧＦ等の増殖因子、並びにＧＳＫ阻害剤及びｓｍａｄ阻害剤等の化合物を含む。幹細胞以外の体細胞が、幹細胞以外の別の体細胞に誘導されることを、ダイレクトリプログラミングという場合がある。
　細胞を神経系細胞に誘導する因子の例としては、ＡＳＣＬファミリー、ＤＬＸファミリー、ＭＹＴファミリー、ＮｅｕｒｏＤファミリー、ＳＯＸファミリー、及びＮＧＮファミリーが挙げられる。ＡＳＣＬファミリーの例としては、ＡＳＣＬ１が挙げられる。ＤＬＸファミリーの例としては、ＤＬＸ２が挙げられる。ＭＹＴファミリーの例としては、ＭＹＴ１Ｌが挙げられる。ＮＧＮファミリーの例としては、ＮＧＮ２が挙げられる。神経系細胞の例としては、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞が挙げられる。神経細胞の例としては、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞、大脳神経、介在性神経、及び視神経が挙げられる。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。
　細胞を心筋細胞に誘導する因子の例としては、ＧＡＴＡファミリー、ＭＥＦファミリー、ＴＢＸファミリー、ＭＹＯＣＤファミリー、ＭＥＳＰファミリー、及びｍｉＲ－１３３ファミリーが挙げられる。ＧＡＴＡファミリーの例としては、ＧＡＴＡ４Ａが挙げられる。ＭＥＦファミリーの例としては、ＭＥＦ２Ｃが挙げられる。ＴＢＸファミリーの例としては、ＴＢＸ５が挙げられる。ＭＥＳＰファミリーの例としては、ＭＥＳＰ１が挙げられる。
　図１０（ｂ）に示すように、内部に因子を含む溶液を含む容積可変容器３２の容積が変化して収縮すると、容積可変容器３２内の因子を含む溶液が、容積可変容器用流路４２、及び容器用流路２０を介して、筐体１１内に移動する。これにより、筐体１１内の細胞に、因子が接触し、細胞内に因子が導入される。
　因子を含む溶液を筐体１１内に移動させた後、容積可変容器３２を容器用流路２０に接続したまま、細胞に因子を導入してもよい。あるいは、例えば、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）に示すように、容器用流路２０又は容積可変容器用流路４２を閉塞した後、容積可変容器３２を筐体１１から除去してもよい。容積可変容器３２を除去した後、筐体１１を、因子の導入に適した温度及び二酸化炭素濃度に設定可能なインキュベーター内に配置してもよい。
　細胞への因子の導入は、複数回行ってもよい。また、細胞に因子を導入した後、培地交換と同じ手順で、筐体１１内の因子を含む溶液を、培地に交換し、細胞の培養を継続してもよい。さらに、上述の手順で、培地の交換を繰り返してもよい。培養は、初期化培養及び拡大培養を含む。
　筐体１１内で培養されている細胞を筐体１１から剥離させる際には、図１１（ａ）に示すように、容器用流路２０に、容積可変容器用流路４３を介して、内部に剥離剤を含む溶液を含む容積可変容器３３が接続される。剥離剤の例としては、トリプシン、トリプルセレクト、アキュテース、及びＥＤＴＡ等が挙げられる。剥離剤を含む溶液を含む容積可変容器３３は、筐体１１に接続されるまで、剥離剤に適した温度に設定可能な温度管理槽内に配置してもよい。
　図１１（ｂ）に示すように、内部に剥離剤を含む溶液を含む容積可変容器３３の容積が変化して収縮すると、容積可変容器３３内の剥離剤を含む溶液が、容積可変容器用流路４３、及び容器用流路２０を介して、筐体１１内に移動する。これにより、筐体１１内の細胞に、剥離剤を含む溶液が接触する。
　剥離剤を筐体１１内に移動させた後、容積可変容器３３を筐体１１に接続したまま、細胞に剥離剤を接触させてもよい。図１１（ｃ）及び図１１（ｄ）に示すように、容器用流路２０又は容積可変容器用流路４３を閉塞した後、容積可変容器３３を筐体１１から除去してもよい。容積可変容器３３を除去した後、筐体１１を、細胞の剥離に適した温度及び二酸化炭素濃度に設定可能なインキュベーター内に配置してもよい。その後、図８及び図９を用いて説明した、培地の除去方法と同様に方法により、筐体内の剥離剤を吸引してもよい。すなわち、容器用流路に、容積可変容器用流路を介して、膨張可能な容積可変容器を接続し、容積可変容器の容積を膨張させると、筐体内の剥離剤が、容器用流路及び容積可変容器用流路を介して、容積可変容器内に移動する。
　剥離剤を除去後、筐体１１内に培養液を供給し、筐体１１を振盪して、細胞を筐体１１から剥離してもよい。剥離した細胞を同じ又は別の筐体１１内に播種して、細胞を継代してもよい。継代の際には、コロニーピックをせず、回収した細胞を区別なく筐体内に播種してもよい。筐体１１内の細胞を回収する際には、蓋１２を開いて、筐体１１の開口から細胞を回収してもよい。あるいは、図８及び図９を用いて説明した、培地の除去方法と同様に方法により、筐体内の細胞懸濁液を吸引してもよい。すなわち、容器用流路に、容積可変容器用流路を介して、膨張可能な容積可変容器を接続し、容積可変容器の容積を膨張させると、筐体内の細胞懸濁液が、容器用流路及び容積可変容器用流路を介して、容積可変容器内に移動する。
　例えば筐体１１内にコーティングをする際には、容器用流路２０に、容積可変容器用流路４１を介して、内部にコーティング剤を含む容積可変容器が接続される。内部にコーティング剤を含む容積可変容器の容積が変化して収縮すると、容積可変容器３２内のコーティング剤が、容積可変容器用流路、及び容器用流路を介して、筐体１１内に移動する。これにより、筐体１１内がコーティングされる。コーティング剤は、例えば、筐体１１内に、室温で１時間以上入れられる。あるいは、コーティング剤は、例えば、筐体１１内に、４℃で６時間以上入れられる。その後、筐体１１内の余剰なコーティング剤を回収する際には、蓋１２を開いて、筐体１１の開口からコーティング剤を回収してもよい。あるいは、図８及び図９を用いて説明した、培地の除去方法と同様に方法により、筐体内のコーティング剤を吸引してもよい。すなわち、容器用流路に、容積可変容器用流路を介して、膨張可能な容積可変容器を接続し、容積可変容器の容積を膨張させると、筐体内のコーティング剤が、容器用流路及び容積可変容器用流路を介して、容積可変容器内に移動する。
　（実施例）
　内部をラミニン５１１でコートされたフラスコの筐体を用意した。筐体の開口には蓋が設けられており、筐体には、容器用流路としての樹脂チューブが接続されていた。また、蓋には、気体透過用のフィルターが設けられていた。ヒト末梢血単核球細胞を血液細胞用培地に懸濁し、血球計算版を用いて単核球細胞の数を測定して、血液細胞用培地における単核球細胞数を調整した。単核球細胞を含む血液細胞用培地を容積可変容器としてのシリンジに入れ、容積可変容器を、容積可変容器用流路としての樹脂チューブを介して、容器用流路に無菌的に接続した。容積可変容器の容積を減少させ、容積可変容器内の単核球細胞を含む血液細胞用培地を、筐体内に移動させた。その後、容器用流路を閉塞し、筐体をインキュベーター内に配置して、単核球細胞を、３７℃で１日間から７日間、筐体内で二次元培養した。なお、３日目に、血液細胞用培地を容積可変容器に入れ、容積可変容器を、容積可変容器用流路を介して、容器用流路に無菌的に接続した。容積可変容器の容積を減少させ、容積可変容器内の血液細胞用培地を、筐体内に移動させ、筐体内に血液細胞用培地を補充した。
　初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を発現させることのできるセンダイウイルス（ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ　２．０　Ｓｅｎｄａｉ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ　Ｋｉｔ、登録商標、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含む溶液を容積可変容器に入れ、容積可変容器を、容積可変容器用流路を介して、容器用流路に無菌的に接続した。容積可変容器の容積を減少させ、容積可変容器内のセンダイウイルスを含む溶液を、筐体内に移動させた。筐体内で培養されている単核球細胞に、センダイウイルスをＭＯＩが５になるよう添加した。その後、容器用流路を閉塞し、筐体をインキュベーター内に配置して、細胞を、３４℃で培養した。
　細胞にセンダイウイルスを添加してから２日後、筐体内にｉＰＳ細胞用培地を加えた。培地を交換する際には、筐体に空の容積可変容器を無菌的に接続し、筐体内の培地を容積可変装置に吸引した。次に、筐体に、培地を含む容積可変容器を無菌的に接続し、容積可変容器内の培地を、筐体内に供給した。６日目まで、２日１回、筐体内にｉＰＳ細胞用培地を加えた。その後、ｉＰＳ細胞用培地を用いて、筐体内の培地を２日に１回交換した。培地を交換する際には、筐体に空の容積可変容器を無菌的に接続し、筐体内の培地を容積可変装置に吸引した。次に、筐体に、培地を含む容積可変容器を無菌的に接続し、容積可変容器内の培地を、筐体内に供給した。途中から、筐体が配置されるインキュベーターの温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１８日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日目の細胞の写真を、図１２（ａ）に示す。
　インフェクションから１４日後、筐体に、細胞剥離剤であるトリプルセレクトを含む容積可変容器を無菌的に接続し、筐体内にトリプルセレクトを供給した。筐体を室温で１分静置してから、剥離した細胞を含む溶液を、容積可変容器で吸引した。その後、細胞をｉＰＳ細胞用培地に分散し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞を、筐体に播種して１回目の継代をした。１回目の継代から５日目の細胞の写真を図１２（ｂ）に示す。
　１回目の継代から５日目に、２回目の継代をした。２回目の継代から５日目の細胞の写真を図１２（ｃ）に示す。２回目の継代から７日目に、３回目の継代をした。３回目の継代から５日目の細胞の写真を図１２（ｄ）に示す。
　１０・・・容器、１１・・・筐体、１２・・・蓋、１３・・・フィルター、２０・・・容器用流路、３０、３１、３２、３３・・・容積可変容器、４０、４１、４２、４３・・・容積可変容器用流路、５０・・・カッター、１２１、１３２・・・ホルダー

Claims (30)

  1. 　容器と、
    　前記容器に接続された容器用流路であって、前記容器内に流体を送るための容器用流路と、
    　を備え、
    　前記容器の少なくとも一部が気体透過性である、
    　細胞の培養器。
  2. 　前記容器の気体透過性の部分が、ウイルスを通さない、請求項１に記載の細胞の培養器。
  3. 　前記容器が、開口を有する筐体と、前記開口の蓋と、を備える、請求項１又は２に記載の細胞の培養器。
  4. 　前記容器用流路が、前記容器の前記筐体に接続されている、請求項３に記載の細胞の培養器。
  5. 　前記筐体の少なくとも一部が気体透過性である、請求項３又は４に記載の細胞の培養器。
  6. 　前記容器用流路が、前記容器の前記蓋に接続されている、請求項３に記載の細胞の培養器。
  7. 　前記蓋の少なくとも一部が気体透過性である、請求項３又は６に記載の細胞の培養器。
  8. 　前記容器用流路が閉塞可能である、請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞の培養器。
  9. 　前記容器用流路に接続される容積可変容器をさらに備える、請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞の培養器。
  10. 　前記容積可変容器に接続された容積可変容器用流路をさらに備える、請求項９に記載の細胞の培養器。
  11. 　前記容積可変容器用流路が閉塞可能である、請求項１０に記載の細胞の培養器。
  12. 　前記容器用流路と前記容積可変容器用流路が無菌接合される、請求項１０又は１１に記載の細胞の培養器。
  13. 　前記容積可変容器内の流体が前記容器内に移動する際に、前記容積可変容器の容積が変化するよう構成されている、請求項９から１２のいずれか１項に記載の細胞の培養器。
  14. 　前記容器内の流体が前記容積可変容器内に移動する際に、前記容積可変容器の容積が変化するよう構成されている、請求項９から１３のいずれか１項に記載の細胞の培養器。
  15. 　容器と、前記容器に接続された容器用流路であって、前記容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、前記容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器を用意することと、
    　前記容器用流路に、内部に細胞を含む容積可変容器を接続することと、
    　前記容積可変容器を収縮させ、前記細胞を前記容器内に移動させることと、
    　前記容器内で前記細胞を培養することと、
    　を含む、細胞の培養方法。
  16. 　前記細胞を前記容器内に移動させた後、前記容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項１５に記載の細胞の培養方法。
  17. 　前記容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、
    　前記容器用流路と前記容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、前記容器用流路に前記容積可変容器を接続する、
    　請求項１５又は１６に記載の細胞の培養方法。
  18. 　前記細胞を前記容器内に移動させた後、前記容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項１７に記載の細胞の培養方法。
  19. 　前記容積可変容器を膨張させ、前記容器内の培地を前記容積可変容器内に移動させることをさらに含む、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
  20. 　前記容器内で前記細胞を培養することにおいて、前記容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置する、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の細胞の培養方法。
  21. 　容器と、前記容器に接続された容器用流路であって、前記容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、前記容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器の前記容器内で細胞を培養することと、
    　前記容器用流路に、内部に初期化因子を含む容積可変容器を接続することと、
    　前記容積可変容器を収縮させ、前記初期化因子を前記容器内に移動させることと、
    　前記容器内で前記細胞を初期化することと、
    　を含む、細胞の初期化方法。
  22. 　前記初期化因子を前記容器内に移動させた後、前記容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項２１に記載の細胞の初期化方法。
  23. 　前記容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、
    　前記容器用流路と前記容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、前記容器用流路に前記容積可変容器を接続する、
    　請求項２１又は２２に記載の細胞の初期化方法。
  24. 　前記細胞を前記容器内に移動させた後、前記容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項２３に記載の細胞の初期化方法。
  25. 　前記容器内で前記細胞を初期化することにおいて、前記容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置する、請求項２１から２４のいずれか１項に記載の細胞の初期化方法。
  26. 　容器と、前記容器に接続された容器用流路であって、前記容器内に流体を送るための容器用流路と、を備え、前記容器の少なくとも一部が気体透過性である、細胞の培養器の前記容器内で細胞を培養することと、
    　前記容器用流路に、内部に分化誘導因子を含む容積可変容器を接続することと、
    　前記容積可変容器を収縮させ、前記分化誘導因子を前記容器内に移動させることと、
    　前記容器内で前記細胞を分化誘導することと、
    　を含む、細胞の分化誘導方法。
  27. 　前記分化誘導因子を前記容器内に移動させた後、前記容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項２６に記載の細胞の分化誘導方法。
  28. 　前記容積可変容器に容積可変容器用流路が接続されており、
    　前記容器用流路と前記容積可変容器用流路が無菌接合されることにより、前記容器用流路に前記容積可変容器を接続する、
    　請求項２６又は２７に記載の細胞の分化誘導方法。
  29. 　前記細胞を前記容器内に移動させた後、前記容積可変容器用流路を閉塞することをさらに含む、請求項２８に記載の細胞の分化誘導方法。
  30. 　前記容器内で前記細胞を分化誘導することにおいて、前記容器を、二酸化炭素インキュベーターに配置する、請求項２６から２９のいずれか１項に記載の細胞の分化誘導方法。
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