KR102447714B1 - 액상의 배지 조성물의 제조 방법 및 그것에 이용되는 제조 장치 - Google Patents

액상의 배지 조성물의 제조 방법 및 그것에 이용되는 제조 장치 Download PDF

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닛산 가가쿠 가부시키가이샤
고진바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 당해 제조 방법은, 특정 화합물을 함유하는 제 1 액체(A1)와, 연결 물질을 함유하는 제 2 액체(B1)를 혼합하여 액상의 배지 조성물을 제조하는 방법으로서, 당해 제조 장치를 이용하여 실시된다. 당해 제조 장치는, 적어도 2개의 개구부(2, 3)가 벽부에 설치된 용기(1)를 갖고, 상기 2개의 개구부는, 용기 바깥의 튜브(4)에 의해 서로 연결되며, 해당 튜브는, 연동 펌프(5)에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는다. 당해 제조 방법은, 연동 펌프를 작동시켜, 제 1 액체와 제 2 액체를 순환시켜 혼합하여 목적으로 하는 액상의 배지 조성물을 용기 내에 형성한다.

Description

액상의 배지 조성물의 제조 방법 및 그것에 이용되는 제조 장치
본 발명은, 액상(液狀)의 배지(培地) 조성물의 제조 방법 및 해당 제조 방법을 실시하기 위해 이용되는 제조 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 상기 배지 조성물을 형성하기 위해 혼합해야 하는 적어도 2종류의 액체(특정의 화합물을 함유하는 제 1 액체 및 해당 특정의 화합물끼리를 결합시켜 구조체를 형성하는 물질을 함유하는 제 2 액체)를 적절히 혼합하고, 상기 구조체가 분산한 배지 조성물을 제조하는 제조 방법과, 그 제조 방법을 바람직하게 실시하기 위해 이용되는 제조 장치에 관한 것이다.
근래, 동물이나 식물체 내에서 다른 역할을 하고 있는 여러 가지 기관, 조직 및 세포를 생체외(in vitro)에서 증식 또는 유지시키기 위한 기술이 발전해 오고 있다. 이들 기관, 조직을 생체외에서 증식 또는 유지하는 것은, 각각 기관 배양, 조직 배양이라고 불리고 있고, 기관, 조직에서 분리된 세포를 생체외에서 증식, 분화 또는 유지하는 것은 세포 배양이라고 불리고 있다.
세포 배양은, 분리한 세포를 배지 중에서 생체외에서 증식, 분화 또는 유지하는 기술이고, 생체내(in vivo)의 각종 기관, 조직, 세포의 기능 및 구조를 상세하게 해석하기 위해 불가결한 것으로 되어 있다.
또, 당해 기술에 의해 배양된 세포 및/또는 조직은, 화학물질, 의약품 등의 약효 및 독성 평가나, 효소, 세포 증식 인자, 항체 등의 유용 물질의 대량 생산, 질환이나 결손에 의해 상실된 기관, 조직, 세포를 보완하는 재생 의료, 식물의 품종 개량, 유전자 재조합 작물의 작성 등 여러 가지 분야에서 이용되고 있다.
세포 등(기관, 조직, 세포)을 배양하기 위한 배지의 하나로서, 액체 배지를 들 수 있으며, 본 발명자들은, 세포 등을 부유(浮遊) 상태에서 배양하는 것이 가능한 액상의 배지 조성물의 개발에 성공했다(특허문헌 1 및 2).
특허문헌 1에 기재된 액상의 배지 조성물은, 특정의 화합물(특히, 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물)이 2가 금속 양이온 등을 개재해 집합하여 부정형의 구조체가 되고, 해당 구조체가 액체 배지 중에 분산하여 부유한 상태로 되어 있는 것이다. 이하, 음이온성 관능기를 갖는 고분자 화합물 등과 같은 상기 특정의 화합물을 「특정 화합물」이라고도 하고, 해당 특정 화합물끼리를 결합시키는 2가 금속 양이온 등의 물질을 「연결 물질」이라고도 한다.
해당 배지 조성물은, 세포 등의 장해나 기능 상실을 일으킬 위험이 있는 진탕이나 회전 등의 조작을 수반하지 않고, 세포 등을 부유 상태에서 배양할 수 있는 바람직한 액상의 배지가 된다.
국제공개 제2014/017513호 공보 미국 특허출원공개 제2014/0106348 A1호 명세서
상기 특허문헌 1에 기재된 액상의 배지 조성물의 본래 의도된 바람직한 상태는, 특정 화합물끼리가 2가 금속 양이온 등의 연결 물질을 개재하여 연결됨으로써 형성된 구조체가 액체 배지 중에 균일하게 분산한 상태이다.
그러나, 본 발명자들이, 해당 액상의 배지 조성물의 실제의 제작 공정을 상세하게 검토한바, 그와 같은 바람직한 상태를 얻기 위해서는, 구조체가 배지 조성물 중의 국소(局所)에 편재하여 형성되지 않도록, 혼합 방법이나 혼합 조건에 유의하지 않으면 안 되는 것을 알았다.
예를 들면, 특정 화합물이 탈아실화 젤란검인 경우, 해당 탈아실화 젤란검은, 액체 배지와 혼합했을 때에, 액체 배지 중의 연결 물질(예를 들면, 칼슘 이온)을 개재하여 부정형인 구조체를 형성하고, 이것이 세포 등을 부유시키기 위한 담체가 된다.
그러나, 연결 물질을 포함한 액체 배지를 교반하면서, 그 안에, 특정 화합물을 포함한 액체를 부어 넣는 것과 같은 혼합 방법에서는, 양 액(液)이 외기(外氣)에 접촉하고, 그것에 의해 외기 중의 세균이 배지 중에 혼입한다는 문제가 발생할 가능성이 있다.
또, 연결 물질을 포함한 액체 배지를 용기 내에 수용하고, 거기에 특정 화합물을 고농도로 포함한 액체를 부어 넣는 것과 같은 혼합 방법에서는, 양 액이 합류한 순간에 특정 화합물이 연결 물질과 접하여 구조체가 되고, 따라서 해당 구조체는, 혼합액 중에 끈 형상으로 길게 줄지어 부유하는 상태(또는, 끈 형상의 구조체가 덩어리 형상으로 서로 얽힌 상태)가 되어, 본래 의도된 균일한 분산 상태로는 되지 않는 경우가 있는 것을 알았다. 또, 그와 같은 상태는, 비교적 고속으로 교반을 행하였다고 하더라도 발생하는 것을 알았다. 또, 액체 배지 중에 그와 같은 끈 형상의 구조체가 일단 형성되면, 분자쇄가 형성하는 이중 나선(double helix)이 서로 연결 물질(예를 들면, 칼슘 이온)을 개재하여 강고한 삼차원 네트워크를 형성하고 있다는 해당 구조체의 성질상, 그것을 가늘게 절단하여 모재(母材) 중에 분산시키는 것은 용이하지 않은 것도 알았다.
따라서, 목적한 구조체가 바람직하게 분산한 혼합액을 얻기 위해서는, 양 액을 고속으로 접촉시킬 수 있는 것과 같은 특수한 교반 장치가 필요하게 되지만, 그와 같은 특수한 교반 장치의 교반 작용은, 일반적으로, 3L(L은 리터를 나타낸다) 이하 정도의 소량의 액체에 대하여 유효하게 되는 것과 같은 한정된 것인 경우가 많고, 상기의 구조체가 바람직하게 분산한 혼합액을 대량(예를 들면, 20L 이상 등)으로 제조하는 데는 적합하지 않은 것도 알았다.
본 발명의 목적은, 상기의 문제를 해결하고, 2가 금속 양이온 등의 연결 물질을 포함한 임의의 액체와, 특정 화합물을 포함한 액체를, 무균적으로 혼합할 수 있어, 미세한 구조체가 분산한 액상의 배지 조성물을 대량으로 얻을 수 있는 제조 방법, 및 해당 제조 방법을 실시하기 위해 바람직하게 이용되는 제조 장치를 제공하는 것에 있다.
상기 목적을 달성할 수 있는 본 발명의 주된 구성은, 이하와 같다.
[1] 하기 (ⅰ)의 특정 화합물을 함유하는 제 1 액체와, 하기 (ⅱ)의 연결 물질을 함유하는 제 2 액체를 혼합하여, 액상의 배지 조성물을 제조하는 방법으로서,
적어도 2개의 개구부가 벽부에 설치된 용기를 이용하고, 여기에서, 상기 적어도 2개의 개구부는, 용기 바깥의 튜브에 의해 서로 연결되며, 해당 튜브는, 연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는 것이고,
상기 튜브를 상기 연동 펌프에 장착하고, 해당 연동 펌프를 작동시켜, 상기 제 1 액체와 제 2 액체를 상기 튜브와 상기 용기의 사이를 순환시켜 혼합하고, 상기 특정 화합물이 상기 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체가 분산한 액상의 배지 조성물을 용기 내에 형성하는 것을 특징으로 하는, 상기 액상의 배지 조성물의 제조 방법:
(ⅰ) 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성할 수 있는, 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물인 특정 화합물
(ⅱ) 2가 금속 양이온인 연결 물질.
[2] 상기 (ⅰ)의 특정 화합물이 탈아실화 젤란검이고, 제 1 액체가 해당 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액이며,
상기 (ⅱ)의 연결 물질이 칼슘 이온 및 마그네슘 이온 중 한쪽 또는 양쪽이고, 제 2 액체가 칼슘 이온 및 마그네슘 이온 중 한쪽 또는 양쪽을 함유하는 액체 배지의 농축액인, 상기 [1] 기재의 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
[3] 상기 액상의 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란검의 농도가, 0.001％(w/v)∼1.0％(w/v)인, 상기 [2] 기재의 배지 조성물의 제조 방법.
[4] 제 1 액체와 제 2 액체의 체적 혼합 비율이, 제 1 액체의 체적 100에 대하여 제 2 액체의 체적 50∼200인, 상기 [1]∼[3] 중 어느 것에 기재한 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
[5] 상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면(底面)을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부(底部)에 출구로서 설치되고,
상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 입구로서 설치되어 있으며,
상기 연동 펌프를 작동시켜, 제 1 액체와 제 2 액체를, 그들 액체가 튜브 내를 상기 출구에서 상기 입구를 향하는 방향으로 이동시키고, 그것에 의해, 용기 내의 제 1 액체와 제 2 액체를 위쪽에서 아래쪽으로 향하는 방향으로 이동시키는, 상기 [1]∼[4] 중 어느 것에 기재한 제조 방법.
[6] 상기 2개의 개구부가 출구와 입구로서 1쌍으로 되어 있고, 상기 용기에는 상기 2개의 개구부가 복수 쌍 설치되며, 각 쌍에 있어서의 2개의 개구부가 각각 튜브로 접속되어 있고,
각각의 튜브를 별개의 연동 펌프에 장착하고, 해당 연동 펌프를 작동시켜, 상기 제 1 액체와 제 2 액체를 각 튜브를 통하여 순환시키는, 상기 [1]∼[5] 중 어느 것에 기재한 제조 방법.
[7] 상기 용기가, 해당 용기의 내부에 수용되는 액체의 체적에 따라 해당 용기의 용적이 변동할 수 있도록 유연한 재료로 이루어지는 것이며, 그것에 의해, 해당 용기 내의 밀폐성을 확보하면서도 해당 용기 내에 액체를 주입하고 또한 해당 용기 외로 액체를 배출하는 것이 가능하게 되어 있는, 상기 [1]∼[6] 중 어느 것에 기재한 제조 방법.
[8] 상기 용기에는, 해당 용기 내로의 액체의 출입에 이용하는 출입구용 개구부가 설치되어 있고,
상기 용기에 제 1 액체 및 제 2 액체 중 어느 한쪽의 액체를 먼저 넣어 두고, 해당 액체를 상기 연동 펌프로 순환시키면서 다른쪽의 액체를 상기 출입구용 개구부로부터 용기 내로 주입하는, 상기 [1]∼[7] 중 어느 것에 기재한 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
[9] 상기 [1] 기재의 액상의 배지 조성물의 제조 방법을 실시하기 위해 이용되는 제조 장치로서,
당해 제조 장치는, 상기 제조 방법에 있어서 혼합되는 제 1 액체와 제 2 액체를 수용하기 위한 용기를 갖고,
해당 용기의 벽부에는 적어도 2개의 개구부가 설치되며, 이들 개구부는, 용기 바깥의 튜브에 의해 서로 연결되어 있고,
상기 튜브는, 해당 튜브 내의 액체를 보내도록 구성된 연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착할 수 있고 또한 해당 연동 펌프에 있어서 펌핑 튜브로서 작동할 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는 것인, 상기 제조 장치.
[10] 상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부에 설치되고,
상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 설치되어 있는, 상기 [9] 기재의 제조 장치.
[11] 상기 2개의 개구부가 출구와 입구로서 1쌍으로 되어 있고, 상기 용기에는 상기 2개의 개구부가 복수 쌍 설치되며, 각 쌍에 있어서의 2개의 개구부가 각각 튜브로 접속되어 있는, 상기 [9] 또는 [10] 기재의 제조 장치.
[12] 추가로, 상기 연동 펌프를 당해 제조 장치의 구성요소로서 갖고, 해당 연동 펌프는, 상기 튜브를 장착하여 해당 튜브를 펌핑 튜브로서 작동시키는 것인, 상기 [9]∼[11] 중 어느 것에 기재한 제조 장치.
[13] 상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부에 설치되고,
상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 설치되어 있으며,
상기 튜브 내의 액체가 하측의 개구부에서 상측의 개구부로 이동하도록, 상기 연동 펌프가 작동하도록 구성되고, 그것에 의해, 용기 내에 수용된 액체가 위쪽에서 아래쪽으로 이동하도록 되어 있는, 상기 [12] 기재의 제조 장치.
[14] 상기 용기가, 해당 용기의 내부에 수용되는 액체의 체적에 따라 해당 용기의 용적이 변동할 수 있도록 유연한 재료로 이루어지는 것이고, 그것에 의해, 해당 용기 내의 밀폐성을 확보하면서도 해당 용기 내에 액체를 주입하고 또한 해당 용기 외로 액체를 배출하는 것이 가능하게 되어 있는, 상기 [9]∼[13] 중 어느 것에 기재한 제조 장치.
[15] 상기 용기에는, 해당 용기 내로의 액체의 출입에 이용하는 출입구용 개구부가 추가로 설치되어 있는, 상기 [9]∼[14] 중 어느 것에 기재한 제조 장치.
본 발명의 제조 방법(이하, 당해 제조 방법이라고도 한다)에 의하면, 도 1의 튜브(4)에 대한 연동 펌프(5)의 작용에 의해, 제 1 액체와 제 2 액체를, [용기로부터 튜브로 나와, 해당 튜브를 통과하여, 원래의 용기로 돌아간다]라고 하는 폐쇄 경로를 순환시킬 수 있다. 이 폐쇄 경로의 순환에 의해, 양 액체를, 외기 등의 오염원에 접촉시키는 일 없이, 또한 용기와 튜브(이들을 접속하기 위한 커넥터 부품을 포함한다) 이외의 다른 부재에 접촉시키는 일 없이 혼합하는 것이 가능하게 된다.
이하, 연동 펌프의 작동에 의해, 용기 내의 액체가, 한쪽의 개구부로부터 튜브 내로 나가서, 해당 튜브를 통과하여, 다른쪽의 개구부로부터 해당 용기 내로 다시 돌아와서 순환하는 이동을, [액체가 용기와 튜브 사이에서 순환한다]라고도 표현하며, 단지 [액체가 순환한다]라고도 표현한다.
또, 당해 제조 방법에 의하면, 양 액체의 합계가 100L에나 달하는 것과 같은 대량의 액상의 배지 조성물을 무균적으로 효율 좋게 제조할 수 있게 된다.
또, 본 발명의 제조 장치(이하, 당해 제조 장치라고도 한다)는, 용기와 튜브를 가지고 형성되는 구성에 의해, 당해 제조 방법을 실시 가능하게 하고, 상기의 무균적 또한 대량의 혼합을 가능하게 한다. 특히, 용기를 유연한 합성 수지 등의 유기 고분자 재료로 이루어지는 주머니 형상물로 하면, 장치 전체를 염가인 주머니 형상물과 튜브로 구성할 수 있으므로, 혼합마다의 일회용이 가능하게 된다. 이것에 의해, 용기 내나 튜브 내의 세정이 불필요하게 되고, 또, 용기 내나 튜브 내의 무균성이 보다 높아진다.
또, 당해 제조 장치는, 연동 펌프를 필수로 포함한 장치여도, 튜브는 연동 펌프의 구동 부분에 장착될 뿐으로서, 일체적으로 연결되는 것은 아니다. 따라서, 용기와 튜브를 가지고 형성되는 순환 경로에 관련되는 주요한 부분은, 혼합마다의 일회용이 가능하여, 용기 내나 튜브 내의 세정이 불필요하다.
도 1은, 본 발명의 제조 방법 및 제조 장치를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2는, 본 발명의 제조 장치의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 3은, 본 발명의 제조 장치의 다른 구성예를 나타내는 도면이다.
도 4는, 본 발명의 제조 장치의 기타 구성예를 나타내는 도면이다. 도 4(a)는 용기의 한쪽의 단면을 나타내고 있다. 도 4(b)는 용기의 다른쪽의 단면을 나타내고 있다. 도 4(c)는 제조 장치 전체의 접속 구조를 나타내는 블럭도로서, 용기를 사시도로 나타내고 있다. 도 4(c)에서는, 숨은 부분을 파선으로 표시하고 있고, 그 숨은 부분에 부호를 부여하기 위한 인출선에도 파선을 이용하고 있다.
도 5는, 본 발명의 제조 방법 및 제조 장치에 이용되는 연동 펌프의 구조의 일례를 나타내는 도면이다.
도 6은, 본 발명의 실시예에 있어서, 제조한 액상의 배지 조성물의 혼합 상태를 평가하기 위한 판정 기준을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 제조 방법을 상세하게 설명하면서, 본 발명의 제조 장치를 언급하고, 당해 제조 장치의 구조도 상세하게 설명한다.
본 발명의 제조 방법은, 하기 (ⅰ)의 특정 화합물을 함유하는 제 1 액체와, 하기 (ⅱ)의 연결 물질을 함유하는 제 2 액체를 혼합하여, 액상의 배지 조성물을 제조하는 방법이다. 이들 특정 화합물, 연결 물질 및, 각각을 함유하는 제 1 액체, 제 2 액체의 상세에 대해서는 후술한다:
(ⅰ) 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성할 수 있는, 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물인 특정 화합물
(ⅱ) 2가 금속 양이온인 연결 물질.
당해 제조 방법은, 도 1에 예시하는 바와 같이, 적어도 2개의 개구부(2, 3)가 벽부에 설치된 용기(1)를 이용한다. 상기 적어도 2개의 개구부(2, 3)는, 용기 바깥의 튜브(4)에 의해 서로 연결되어 있고, 해당 튜브(4)는, 연동 펌프(5)에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을, 해당 튜브의 일부 또는 전부로서 갖는 것이다.
도 1에서는, 용기(1) 내의 액체가 제 1 액체(A1)와 제 2 액체(B1)로 명확하게 분리되어 있는 것으로는 표현하고 있지 않지만, 용기 내의 액체에 대하여 부호 A1, B1을 부여함으로써, 제 1 액체(A1)와 제 2 액체(B1)가 혼합되는 도중인 것을 시사하고 있다.
상기 용기(1)의 벽부에는 적어도 2개의 개구부(2, 3)가 설치되고, 이들 적어도 2개의 개구부(2, 3)는, 용기(1)의 외측에 있는 튜브(4)에 의해 서로 연결되어 있다. 해당 튜브(4)는, 연동 펌프(5)에 장착되어 펌핑 튜브로서 기능할 수 있는 형상과 유연성을 갖는 것이다. 도 1에서는, 연동 펌프(5)의 상세한 구조는 도시하고 있지 않고, 파선에 의해 해당 연동 펌프의 존재를 시사하고 있다. 해당 연동 펌프(5)는, 본 발명의 제조 장치의 일부로서 포함되어 있어도 되고, 또, 외부 장치여도 된다.
당해 제조 방법에서는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 튜브(4)를 연동 펌프(5)에 장착한다. 즉, 해당 튜브(4)가 연동 펌프(5)의 펌핑 튜브가 되도록, 해당 튜브(4)를 해당 연동 펌프(5)에 걸어맞춤시킨다. 그리고, 해당 연동 펌프(5)를 작동시켜, 제 1 액체(A1)와 제 2 액체(B1)를 용기(1)와 튜브(4) 사이에서 순환시키고, 해당 순환에 의해, 양 액체를 교반, 혼합하여, 액상의 배지 조성물을 형성한다. 양 액체가 충분히 교반, 혼합된 액상의 배지 조성물 중에는, 특정 화합물이 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체가 균일하게 분산하고 있어, 세포 등을 부유 상태에서 배양하는 데 적합한 것으로 되어 있다.
당해 제조 방법에 의해, 상기한 바와 같이, 양 액체의 합계가 1000L에나 달하는 것과 같은, 또는 그 이상의 임의의 대량의 제 1 액체(A1)와 제 2 액체(B1)를 취급할 수 있고, 게다가, 외기 등의 오염원에 접촉시키는 일 없이, 간단한 조작으로 양 액을 충분히 혼합하는 것이 가능하게 된다.
본 발명에 의한 제조 장치는, 상술한 본 발명에 의한 제조 방법을 실시하기 위해 이용되는 장치이다. 당해 제조 장치는, 도 1에 나타내는 바와 같이, 당해 제조 방법에 있어서 혼합되는 제 1 액체(A1)와 제 2 액체(B1)를 수용하기 위한 용기(1)를 갖는다. 해당 용기(1)의 벽부에는 적어도 2개의 개구부(2, 3)가 설치되고, 이들 적어도 2개의 개구부는, 용기 바깥의 튜브(4)에 의해 서로 연결되어 있고, 이것에 의해, 용기(1) 내에 수용된 액체가, 한쪽의 개구부(2)로부터 나와 해당 튜브(4)를 통과하여 다른쪽의 개구부(3)로부터 상기 용기(1) 내로 돌아오는 것이 가능한 순환 유로가 형성되어 있다. 해당 튜브(4)는, 해당 튜브 내의 액체를 보내도록 구성된 연동 펌프(5)에 장착할 수 있는 펌핑 튜브로서의 특성을 갖는 것이다. 해당 튜브를 연동 펌프에 장착하고, 해당 연동 펌프를 작동시킴으로써, 용기 내의 액체는, 외기 등의 오염원에 접촉하는 일 없이, 용기(1)와 튜브(4) 사이에서 순환하고, 충분히 혼합되어, 목적한 액상의 배지 조성물이 얻어진다.
본 발명의 제조 방법 및 본 발명의 제조 장치에 이용 가능한 상기 용기(1)는, 제 1 액체 및 제 2 액체에 영향을 주는 일 없이 수용할 수 있는 재료로 이루어지는 것이 바람직하다.
해당 용기의 용적은, 특별히 한정은 되지 않지만, 용적이 크면, 양 액체를 대량으로 혼합할 수 있는 본 발명의 이점이 현저해진다. 해당 용기의 바람직한 용적은, 특별히 한정은 되지 않고, 요구에 따라 적절히 결정하면 되지만, 예를 들면, 100L∼1000L 정도가 일반적인 세포 배양을 위한 액체 배지를 대량 생산하기 위해서는 바람직한 용적으로서 예시된다.
상기 용기(1)의 재료는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 경질 또는 연질의 유기 고분자 재료(특히 합성수지 재료 등), 유리, 금속 등을 들 수 있다. 경질 또는 연질의 유기 고분자 재료는, 판상물(板狀物)이어도 필름이어도 된다. 상기의 판상물이나 필름은, 단일의 재료로 형성되는 것(단층품)이어도 되고, 후술하는 바와 같이, 서로 다른 재료로 형성되는 층을 포함한 다층 구조(2층 이상)여도 된다.
용기(1)의 형상도 또한, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 입방체, 직방체, 원주체, 연질의 유기 고분자 재료제(製)의 필름으로 형성되는 벽면을 가진 주머니 형상물(예를 들면, 2장의 필름의 외주연부(外周緣部)를 서로 접합한 주머니 형상물, 저면과 측면을 가진 주머니 형상물, 상면과 저면과 측면을 가진 주머니 형상물 등) 등이어도 된다.
용기(1)가 연질의 유기 고분자 재료제의 필름 등으로 형성되는 유연한 주머니 형상물이면, 다음에 나타내는 (a)∼(c)의 바람직한 작용이 얻어진다.
(a) 제 1 액체 또는 제 2 액체를 용기(1)에 맨 처음 주입하기 전에, 해당 용기를 수축시켜 내부의 공기를 빼놓을 수 있다. 용기(1)는, 액체의 주입에 따라 팽창할 수 있기 때문에, 주입되는 액체는 공기와 접촉하는 일이 없다.
(b) 제 1 액체와 제 2 액체를 순환시킴으로써 충분히 혼합된 혼합물(액상의 배지 조성물)을, 해당 용기를 수축시키면서, 공기와 접촉시키지 않도록 해당 용기(1)로부터, 외부 용기로 꺼낼 수 있다.
(c) 용기(1)가 연질의 유기 고분자 재료제의 필름 등으로 형성되는 유연한 주머니 형상물이면, 해당 용기가 염가로 얻어지는 점에서, 해당 용기와 튜브를 혼합마다 사용하고 버릴 수 있어, 당해 제조 장치 내의 세정의 수고를 덜 수 있는 동시에, 용기와 튜브 내의 무균성이 보다 높아진다.
상기와 같은 연질의 유기 고분자 재료제의 필름으로 형성되는 유연한 주머니 형상물로는, 종래 공지의 세포 배양용의 백(bag)과 마찬가지의 것을 들 수 있다. 그와 같은 세포 배양용의 유연한 백의 벽부를 구성하는 필름의 재료로는, 예를 들면, 에틸렌·초산(酢酸)비닐 공중합 수지(EVA 수지), 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 폴리우레탄계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리아미드계 수지, 염화비닐계 수지 등을 들 수 있다. 필름이 다층 구조인 경우, 각층의 재료는 기능에 따라 적절히 선택하면 된다. 예를 들면, 3층 구조이면, (폴리에틸렌 테레프탈레이트층(내층)/폴리에틸렌층(중간층)/나일론층(외층))과 같은 조합이 예시된다.
해당 벽부의 필름의 두께는, 특별히 한정은 되지 않지만, 통상, 50㎛∼150㎛ 정도, 바람직하게는 100㎛ 정도이다.
상기의 유연한 주머니 형상물의 전체적인 형태로는, 2장의 필름의 외주연부를 서로 접합한 주머니 형상물, 저면과 측면을 가진 주머니 형상물, 상면과 저면과 측면을 가진 주머니 형상물, 여러 가지의 형상(직방체, 육각기둥(도 4에 나타낸다), 다각기둥, 원기둥 등)을 가진 주머니 형상물이 예시된다.
상기의 유연한 주머니 형상물에는, 시판의 세포 배양용의 백을 전용(轉用)해도 되고, 본 발명 전용(專用)의 용기로서 상기 필름을 이용하여 제작해도 된다. 어느 경우도, 용기의 벽면에 적어도 2개의 개구부를 형성하고, 그들 개구부끼리를 튜브로 연결하여, 폐쇄된 순환 경로를 구성하면, 본 발명에 의한 제조 장치가 얻어진다.
도 1에 예시하는 바와 같이, 용기(1)의 벽부에는, 적어도 2개의 개구부(2, 3)가 설치된다. 적어도 2개의 개구부 중 한쪽의 개구부(도면의 예에서는 하측의 개구부(2))는, 용기(1) 내로부터 튜브(순환용 튜브)(4) 내로 액체(A1, B1)가 나가기 위한 출구이며, 다른쪽의 개구부(도면의 예에서는 상측의 개구부(3))는, 순환용 튜브(4) 내로부터 용기(1) 내로 액체가 들어가기 위한 입구이다.
이들 적어도 2개의 개구부 중 어느 한쪽 또는 양쪽은, 순환용 튜브를 떼어냄으로써, 용기 내에 상기 제 1 액체와 제 2 액체를 주입하기 위한 개구부로서, 또는 용기 내로부터 양 액체의 혼합물을 꺼내기 위한 개구부로서 사용해도 된다.
액체의 순환에 이용되는 상기 2개의 개구부(2, 3)는, 외계에 개방되는 일이 없도록, 순환용 튜브(4)에 의해 무균적으로 연결되는 것이 바람직하다. 한편, 액체를 용기 내에 주입하기 위한 튜브(주입용 튜브)는, 여과 멸균 전의 액체에 접촉하고 있다. 따라서, 그것을, 여과 멸균 후의 튜브 부분에서 분리하여, 순환용으로 연결하여 사용하면, 내용액을 오염시킬 가능성이 있다.
이상의 점으로부터는, 용기 내에 제 1 액체 및/또는 제 2 액체를 주입하기 위한 개구부는, 순환용의 2개의 개구부와는 다른 개구부로서 필요 수만큼 설치하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 도 3에 나타내는 바와 같이, 전용의 출입구로서의 개구부(6)를 1개만 설치하여, 해당 개구부(6)로부터, 제 1 액체와 제 2 액체를 순차적으로 용기 내에 주입해도 되고, 도 4에 나타내는 바와 같이, 2 이상의 개구부를 설치하여, 제 1 액체와 제 2 액체를 동시에 용기 내로 주입해도 된다. 여기에서 말하는 「출입구로서의 개구부」는, 액체를 외부로부터 용기 내로 주입하기 위한 입구용 개구부 및, 혼합 후의 액체(액상의 배지 조성물)를 용기 외로 배출하기 위한 출구용 개구부도 의미한다. 예를 들면, 입구용 개구부를 설치해 두고, 제 1 액체와 제 2 액체를 해당 입구용 개구부로부터 용기 내로 주입하고, 혼합 후의 액체를, 순환을 위한 개구부로부터 꺼내도 된다. 또 예를 들면, 출구용 개구부를 설치해 두고, 순환을 위한 개구부로부터 제 1 액체와 제 2 액체를 용기 내로 주입하고, 혼합 후의 액체를 출구 전용의 개구부로부터 꺼내도 된다. 또, 입구용 개구부와 출구용 개구부를 각각 별개로 용기에 설치해도 된다.
이들 제조 장치 내의 무균성을 유지하기 위해서는, 주입용 튜브의 도중에, 여과 필터를 삽입하고, 여과된 액체를 용기에 주입하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 도 3에 나타내는 튜브(4c)의 도중에 카트리지식의 필터를 내장하여 경로에 삽입하는 구성이 가능하다.
또, 용기, 튜브, 멸균 필터, 커넥터를 접속할 때에, 외기에 의해 오염될 우려가 있기 때문에, 용기, 튜브, 멸균 필터, 커넥터를 모두 접합하여, 폐쇄적인 제조 장치를 구성한 후에, γ선 조사 멸균을 실시하는 것이 바람직하다.
도 2는, 용기에 설치되는 개구의 위치의 다른 예를 나타내는 도면이다. 동 도면에서는, 용기와 튜브를 접속하기 위한 커넥터나 커플링은 도시를 생략하고 있다. 본 발명에서는, 용기의 벽부에 설치되는 개구부(2, 3)에 튜브(4)를 접속하고, 연동 펌프의 작용에 의해 제 1 액체와 제 2 액체를 순환시켜, 양 액체를 혼합한다. 따라서, 출구가 되는 개구부(2)와 입구가 되는 개구부(3)는, 서로 가능한 한 떨어져 있는 편이 양 액체는 효율 좋게 혼합된다. 출구와 입구가 접근하고 있으면, 이들 개구부 부근의 액체만이 국소적으로 순환하여, 용기 내의 남은 액체가 순환의 흐름에 더해지지 않고 남겨질 가능성이 높아진다.
도 2(a)의 양태에서는, 용기의 하면을 구성하는 벽부에 출구가 되는 개구부(2)가 설치되고, 입구가 되는 개구부(3)는 상면을 구성하는 벽부에 설치되며, 이들이 튜브(4)로 접속되어 있다. 이것에 의해, 용기 내에는 화살표로 나타내는 바와 같은, 위쪽에서 아래쪽으로 향하는 흐름이 발생하고, 제 1 액체와 제 2 액체는 효율 좋게 혼합된다.
도 2(b)의 양태에서는, 출구가 되는 개구부(2)가 상기 용기의 1개의 벽부에 설치되고, 다른쪽의 개구부(3)가 상기 벽부에 대향하는 벽부에 설치되며, 이들이 튜브(4)로 접속되어 있다. 이것에 의해, 용기 내에 화살표로 나타내는 바와 같이, 용기 내를 수평으로 건너는 흐름이 발생하고, 제 1 액체와 제 2 액체는 남김없이 혼합된다.
도 2(c)의 양태에서는, 출구가 되는 복수의 개구부(도면의 예에서는 2a, 2b의 2개)가 상기 용기의 1개의 벽부(도면의 예에서는, 용기의 저면을 구성하는 벽부)에 설치되고, 입구가 되는 복수의 개구부(도면의 예에서는 3a, 3b의 2개)가, 상기 벽부에 대향하는 벽부(도면의 예에서는, 용기의 상면을 구성하는 벽부)에 설치되며, 이들이 복수 쌍의 입구와 출구로 되어 있고, 각 쌍의 개구부(2a, 3a), (2b, 3b)가 각각 튜브(4a, 4b)로 접속되며, 해당 튜브(4a, 4b)가 각각 연동 펌프(5a, 5b)에 장착되어 있다. 이것에 의해, 용기 내에 화살표로 나타내는 바와 같이, 용기 내에는 위쪽에서 아래쪽으로의 폭넓은 평행한 흐름이 발생하여, 용기 내의 액체가 순환의 흐름에 더해질 가능성이 높아져, 제 1 액체와 제 2 액체는 효율 좋게 혼합된다. 또, 도 2(c)의 양태와 같이, 복수의 튜브가 접속되어 있는 경우, 한쪽의 튜브 내를 액체가 이동하는 방향(예를 들면, 도 2(c)에서는 상승 방향)에 대하여, 다른쪽의 튜브 내를 액체가 이동하는 방향을 역방향(예를 들면, 도 2(c)에서는 하강 방향)으로 하여, 용기 내의 흐름에 의도적인 난류를 발생시켜도 된다.
연동 펌프를 작동시켰을 때에 한쪽의 개구부로부터 다른쪽의 개구부로 향하는 흐름의 방향은, 도 1, 도 2(a)∼(c)에 나타내는 바와 같이, 연직 방향(강하 방향, 상승 방향), 수평 방향, 경사 방향 등이면 되고, 그 밖에 소용돌이가 발생하는 것과 같은 방향, 난류가 발생하는 것과 같은 방향이어도 된다. 제 1 액체가 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액인 경우에는, 탈아실화 젤란검이 배양액 중에서 부상하는 경향이 보이기 때문에, 도 1, 도 2(a), 도 2(c), 도 3에 나타내는 바와 같은, 용기의 위쪽에서 아래쪽으로 액체가 강하하는 흐름은, 그와 같은 부상에 저항하여 보다 효과적으로 혼합을 진행시키는 바람직한 흐름이다.
도 1, 도 2(a)∼(c)에 나타낸 개구부의 배치나 수는 일례이며, 이들은 방향을 바꾸어 적절히 조합해도 된다. 예를 들면, 도 1의 양태에서는, 용기의 수직인 벽부에 2개의 개구부(2, 3)가 설치되어 있지만, 이들 2개의 개구부는, 용기의 상면(또는 저면)의 벽부에 2개 설치되어 있어도 되고, 도 1의 용기의 자세를 바꾸어 이용해도 된다. 또, 도 1의 양태에서는, 용기의 우측의 벽부에만 2개의 개구부(2, 3)가 설치되어 있지만, 해당 벽부에 대향하는 좌측의 벽부에도 한 쌍의 개구부가 설치되어 있어도 되고, 각 쌍의 개구부가 각각 튜브로 접속되어 있어도 된다. 또, 용기의 상면에 설치된 개구부와 용기의 측면에 설치된 개구부가 쌍을 이루어, 튜브로 접속되어도 된다.
도 2(a)∼(c)의 양태도 마찬가지이며, 용기의 자세를 적절히 변경하여 이용해도 된다.
용기에 설치되는 개구부는, 반드시 2개의 개구부가 출구와 입구로서 1쌍으로 되어 있을 필요는 없고, 튜브를 분기시킴으로써, 1개의 개구부(예를 들면, 출구)와 복수의 개구부(예를 들면, 입구)가 대응하고 있어도 된다(도시하지 않음).
개구부의 구경(口徑)은, 특별히 한정은 되지 않지만, 접속되는 튜브의 구경과 동등한 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 개구부의 구경이란, 해당 개구부에 튜브를 접속하기 위한 커넥터나 커플링이 장착되는 경우에는, 해당 커넥터나 커플링의 유로의 내경이다. 용기 내의 무균성을 유지하기 위해, 모든 개구부는, 마개체, 개폐 밸브, 커넥터, 커플링, 시일(seal) 부재 등에 의해 사용시까지 닫혀져 있는 것이 바람직하다. 커넥터나 커플링은, 각각의 상대 커넥터나 커플링이 연결될 때까지는 유로가 폐쇄된 구조를 갖고 또한 상대 커넥터나 커플링이 연결됨으로써 유로가 무균적으로 연통하는 구조를 갖는 것이 바람직하다.
또, 개구부에는, 상기의 커넥터나 커플링 대신에, 짧은 튜브가 결합되어, 해당 튜브의 외계측 출구가 상기의 커넥터나 커플링에 의해 닫혀져 있어도 된다.
튜브는, 후술의 연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있고, 또한 펌핑 튜브로서 기능·작동할 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는다.
연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있고, 또한 펌핑 튜브로서 기능·작동할 수 있는 형상과 유연성을 갖는 것이란, 사용되는 연동 펌프에 적합한 튜브의 내경, 외형 및 길이를 갖는 것 및, 연동 펌프의 액추에이터(롤러 등)에 눌려(押壓) 찌부러지는 유연도(softness), 해당 액추에이터에 의한 눌림으로부터 해방되었을 때에 원형으로 복귀할 수 있는 탄성을 갖는 것을, 적어도 의미한다.
튜브는, 전체가 펌핑 튜브가 될 수 있는 것이어도 되고, 연동 펌프에 장착되는 부분만이 펌핑 튜브가 될 수 있는 것이어도 된다.
펌핑 튜브가 되는 부분을 연동 펌프에 장착하고, 해당 연동 펌프를 작동시킴으로써, 상기 제 1 액체와 제 2 액체가 상기 튜브 내를 이동한다. 이것에 의해, 양 액체가 순환하고, 혼합되어, 특정 화합물이 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체가 균일하게 분산한 액상의 배지 조성물이 용기 내에 형성된다.
튜브의 양태는, 펌핑 튜브가 되는 부분 이외는, 특별히 한정은 되지 않고, 금속관 등이어도 되지만, 제 1 액체와 제 2 액체에 영향을 주지 않고, 세포 배양에 이용 가능하며, 유연하고 염가인 수지제의 튜브인 것이 바람직하다. 튜브 전체가 펌핑 튜브로서 이용 가능한 양태는 바람직한 일례이다.
펌핑 튜브가 되는 부분의 재료는, 제 1 액체와 제 2 액체에 영향을 주지 않고, 세포 배양에 이용 가능하며, 또한 탄성과 유연성을 가진 수지 재료, 특히 합성수지 재료가 바람직하고, 스티렌계 열가소성 엘라스토머, 실리콘계 수지, 불소계 수지, 폴리염화비닐계 수지 등을 들 수 있다.
펌핑 튜브가 되는 부분의 내경, 두께, 길이는, 사용하는 연동 펌프에 따른 것이면 되고, 내경은 5mm∼50mm 정도, 튜브의 두께는 2mm∼6mm 정도이다. 일례를 들면, 실시예에서 이용한 튜브는, 내경 13mm, 두께 3mm(외경 19mm)이다.
튜브 전체의 길이는, 접속해야 하는 개구부끼리의 사이의 거리나, 용기의 크기에 따라 적절히 결정하면 되고, 예를 들면, 1500mm∼3000mm 정도를 들 수 있다.
순환용 튜브는, 용기의 한쪽의 개구에 접속되는 부분에서부터, 다른쪽의 개구에 접속되는 부분까지, 일체로 연속한 1개의 튜브여도 되고, 커넥터나 커플링에 의해, 적절히 접속되어 1개의 튜브로 된 것이어도 된다. 연동 펌프에 접속할 때의 취급성(장착성)을 높이기 위해, 펌핑 튜브가 되는 부분의 양단부에 커넥터나 커플링이 설치되어, 튜브 전체로부터 착탈할 수 있는 구성이어도 된다. 그와 같은 커넥터나 커플링은, 무균 커넥터 등으로 불리는, 무균적으로 접속이 가능한 커넥터를 이용하는 것이 바람직하다.
도 3은, 당해 제조 장치의 다른 구성예를 나타낸 도면이다. 동 도면의 예에서는, 도 2(c)의 예와 마찬가지로, 출구가 되는 2개의 개구부(2a, 2b)가 용기(1)의 저면의 벽부에 설치되고, 입구가 되는 2개의 개구부(3a, 3b)가 용기의 상면의 벽부에 설치되며, 이들이 2쌍의 입구와 출구로 되어 있고, 각 쌍의 개구부(2a, 3a), (2b, 3b)가, 각각 튜브(4a, 4b)로 접속되며, 해당 튜브(4a, 4b)가 각각 연동 펌프(5a, 5b)에 장착되어 있다. 그리고, 용기(1)의 벽면(도면의 예에서는 상면)에는, 출입구용 개구부(6)가 추가로 설치되어, 외부 용기(7)로부터 튜브(4c)를 통하여 액체를 용기(1) 내로 주입할 수 있는 구성으로 되어 있다.
도 3에 예시한 구성에 의해, 한쪽의 액체를 연동 펌프로 순환시키면서, 거기에 다른쪽의 액체를 주입한다는 순서가 가능하게 된다. 특히, 도 3에 나타낸 바와 같이, 제 2 액체(B1)를 먼저 수용해 두고, 이것을 순환시키면서, 제 1 액체(A1)를 외부 용기(7)로부터 소정의 유량으로 용기(1) 내로 주입한다는 혼합 순서가 가능하게 된다.
또, 외부 용기(7)로부터 용기(1)로 액체를 이동시킬 때에는, 튜브(4c)를 연동 펌프에 장착하고, 해당 연동 펌프의 이송 능력을 이용해도 되고, 외부 용기(7)를 용기(1)보다도 위쪽에 배치하고, 외부 용기(7) 내의 액체를 중력에 의해 튜브 내를 이동시켜, 용기(1) 내로 낙하시켜도 된다.
도 4는, 당해 제조 장치의 바람직한 구성예를 나타낸 도면이다.
용기(1)의 전체적인 형상은, 도 4(c)에 나타내는 바와 같이 육각기둥을 띠는 유연한 백이다. 도면의 예에서는, 해당 육각기둥을 띠는 유연한 백 그 자체는, 시판의 세포 배양 백을 이용한 것이다. 도 4(a)는 용기(1)의 한쪽의 단면(1a)을 나타내고 있고, 도 4(b)는 용기(1)의 다른쪽의 단면(1b)을 나타내고 있다. 이들 양 단면(1a, 1b)은, 육각기둥의 단면으로서 육각형을 띠고 있고, 이들 양 단면이 수직면이 되도록 용기의 자세가 유지되고 있다.
　도 4(a)에 나타내는 바와 같이, 단면(1a)의 상부에는, 용기(1) 내에 제 1 액체를 유입시키기 위한 개구부(6a)와, 용기(1) 내에 제 2 액체를 유입시키기 위한 개구부(6b)가 설치되어 있다. 개구부(6c)는 폐쇄되어 있고, 혼합액의 꺼냄 등에 이용될 수 있다. 한편, 도 4(b)에 나타내는 바와 같이, 단면(1b)의 하부와 상부에는, 순환용 개구부(2, 3)가 각각 설치되어 있다. 도면의 예에서는, 모든 개구부에는, 관로가 되는 튜브를 접속하기 위한 커넥터가 설치되어 있다.
도 4(c)는, 당해 제조 장치 전체의 접속 구성을 나타내는 블럭도이다. 용기(1)의 단면(1a)에서는, 개구부(6a)에 대해서는, 제 1 액체가 수용된 외부 용기(7a)가 관로(튜브)(41)를 개재하여 접속되고, 개구부(6b)에 대해서는, 제 2 액체가 수용된 외부 용기(7b)가 튜브(42)를 개재하여 접속되어 있다. 이들 외부 용기(7a, 7b)는, 당해 제조 장치의 요소로서 포함시켜도 되고, 외부의 액체 공급원으로 간주해도 된다.
개구부(6a)에 접속된 튜브와, 외부 용기(7a)에 접속된 튜브가, 무균 커넥터(C1)에 의해 1개의 튜브(41)로 연결되어 있다. 마찬가지로, 개구부(6b)에 접속된 튜브와, 외부 용기(7b)에 접속된 튜브가, 무균 커넥터(C2)에 의해 1개의 튜브(42)로 연결되어 있다. 한편, 용기(1)의 단면(1b)에서는, 개구부(2)에 튜브(43)가 접속되고, 해당 튜브(43)는 무균 커넥터(C3)에 의해 펌핑 튜브(44)에 접속되며, 해당 펌핑 튜브(44)는 롤러 펌프(5)에 장착되고 또한 통과하여, 무균 커넥터(C4)에 의해 튜브(45)에 접속되고, 해당 튜브(45)는 개구부(3)에 접속되어 있다.
도 4(c)의 예에서는, 우선, 공기가 빼내어져 수축한 상태의 용기(1)에 대하여, 외부 용기(7b)에 수용된 제 2 액체가 용기(1)에 주입된다. 용기(1)는, 주입된 제 2 액체의 분만큼 부푼다. 이어서, 롤러 펌프(5)가 작동하여, 제 2 액체를 순환시키면서, 외부 용기(7a)에 수용된 제 1 액체가 용기(1)에 주입되고, 그 후의 순환에 의해 혼합이 진행된다. 롤러 펌프(5)는, 액체가 개구부(2)로부터 개구부(3)로 향하도록, 펌핑 튜브(44)로의 압축 포인트를 이동시킨다. 이것에 의해, 용기(1) 내의 액체는, 위쪽에서 아래쪽으로 향하도록 이동한다.
본 발명에 이용 가능한 연동 펌프는, 튜브 펌프(롤러 펌프라고도 불린다)로 대표되는 바와 같이, 탄성 및 유연성을 가진 펌핑 튜브를 눌러 찌부러뜨리는 위치를, 이송 방향으로 이동시킴으로써, 해당 관로 내의 액체를 이동시키는 작용을 가진 펌프이다.
도 5는, 연동 펌프의 구성의 일례를 개략적으로 나타낸 도면이다. 동 도면의 예에서는, 하우징(11)에 원호상이나 반원상의 외주 벽면(11a)이 설치되고, 해당 외주 벽면(11a)을 따라 펌핑 튜브(4)가 만곡하여 장착되어 있다. 해당 외주 벽면(11a)은, 펌핑 튜브(4)를 외주측에서 지지하고 있다. 해당 펌핑 튜브(4)의 만곡의 내주측에서는, 아암(12)에 지지된 롤러(13)가 회전축(14)을 중심으로, 액체 이송 방향(화살표 f의 방향)으로 회전하고, 그것에 의해, 연동 운동과 같이 펌핑 튜브(4)가 액체 이송 방향으로 순차 압축되어, 펌핑 튜브 내의 액체가 보내어진다. 연동 펌프에 튜브를 장착한다는 것은, 도 5에 예시하는 바와 같이, 튜브(4)가 연동 펌프의 펌핑 튜브로서 기능하도록, 튜브(4)를 연동 펌프의 이송 구동 부분(튜브를 순차 압축하는 부분)에 삽입하여 세트하는 것을 의미한다.
도 5의 예에서는, 직선상의 아암(12)의 양단에 2개의 롤러(13)가 설치되어 있지만, 연동 펌프에 따라서는, 보다 다수의 롤러가 설치된 것이나, 아암을 갖지 않는 1개의 큰 롤러가 편심된 축을 중심으로 회전하는 것 등도 있다. 연동 펌프는, 도 5와 같이 경로가 만곡한 구조의 것이어도 되고, 직선적으로 배열된 다수의 액추에이터가 펌핑 튜브를 국소적으로 순차 압축하고, 해당 펌핑 튜브에 연동 운동을 가하는 구조의 것이어도 된다. 연동 펌프의 이송 구조의 상세에 대해서는, 종래 기술을 참조할 수 있다.
연동 펌프의 이송 능력(튜브 내를 이동하는 액체의 매분(每分)의 유량)은, 시판의 것에서는, 미소(微小) 유량부터 대(大)유량까지 폭넓게 0.01(mL/분)∼10(L/분) 정도가 예시된다. 본 발명에 있어서 이용되는 연동 펌프의 이송 능력은, 용기의 용적에 따라 결정하면 되고, 특별히 한정은 되지 않지만, 용기의 용적이 20L∼100L 정도인 경우에는, 연동 펌프의 이송 능력은 3∼18(L/분) 정도가 바람직한 범위로서 예시된다.
제 1, 제 2 액체를 혼합하기 위한 그들 액체의 순환의 유량을 증대시키기 위해서는, 보다 큰 내경의 펌핑 튜브와, 보다 큰 이송 능력을 가진 연동 펌프를 이용해도 되고, 작은 이송 능력을 가진 튜브와 연동 펌프의 페어를 필요한 페어 수만큼 평행하게 이용하여, 액체를 평행하게 순환시켜도 된다.
용기의 용적에 대하여, 연동 펌프에 의한 액체의 유량이 과도하게 작으면, 혼합에 장시간을 필요로 하고, 또, 혼합이 충분히 이루어지지 않는 상태가 국소적으로 발생하는 경우가 있다.
연동 펌프의 작동 시간(즉, 순환을 계속시켜 혼합하는 시간)은, 연동 펌프의 이송량에 따라, 또, 혼합 상태에 기초하여 적절히 결정하면 된다. 일례를 들면, 용기의 용적이 50L∼150L 정도이고, 연동 펌프의 이송 능력이 10(L/분) 정도인 경우에는, 2∼4시간 정도가 바람직한 작동 시간으로서 예시된다.
연동 펌프는 본 발명의 제조 장치의 일부를 구성하는 것이어도 되고, 본 발명의 장치에 있어서, 이용해야 하는 외부 장치여도 된다.
연동 펌프에 의해, 제 1 액체와 제 2 액체를 순환시켜 혼합할 때에는, 제 1 액체와 제 2 액체 중 어느 한쪽의 액체를 먼저 용기에 넣어 두고, 해당 한쪽의 액체를 연동 펌프로 순환시키면서, 다른쪽의 액체를 용기 내에 주입하면, 양자는 그 후의 순환에 의해 바람직하게 혼합된다.
제 1 액체가 해당 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액이고, 제 2 액체가 2가 금속 양이온인 연결 물질을 함유하는 액체(예를 들면, 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온을 함유하는 액체 배지)인 것과 같은 경우에는, 한쪽의 액체를 연동 펌프로 순환시키면서, 다른쪽의 액체를 용기 내에 주입한다는 순서가 바람직하고, 미리 양 액체를 소정의 비율로 용기 내에 주입한 뒤에 순환을 개시하는 경우에 비해, 탈아실화 젤란검이 배양액의 국소에 편중하기 어려워진다는 효과가 얻어진다. 특히, 제 2 액체(상기 액체 배지)를 먼저 용기에 수용하고, 이것을 연동 펌프로 순환시키면서, 제 1 액체(해당 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액)를 용기 내에 주입하는 경우에는, 탈아실화 젤란검이 보다 바람직하게 분산하는 경향이 보인다.
혼합 시의 일례를 들면, 용기의 용적이 50L∼150L 정도이고, 제 1 액체와 제 2 액체의 체적 비율이 1:1이며, 연동 펌프의 이송 능력이 10(L/분) 정도인 경우에는, 한쪽의 액체를 먼저 용기(1)에 수용하고, 연동 펌프를 작동시켜 액체를 순환시키면서, 0.5시간∼1.0시간 정도의 사이에, 다른쪽의 액체를 전량 용기(1)에 주입하고, 그 후 추가로 2.0시간∼4.0시간 정도 혼합액의 순환을 계속하는 것이 바람직하다.
또, 한쪽의 액체를 연동 펌프로 순환시키면서, 다른쪽의 액체를 용기 내에 주입한다는 순서에서는, 도 3에 당해 제조 장치의 구성예를 나타내는 바와 같이, 액체를 순환시키기 위한 2개의 개구부에 더하여, 나중에 용기 내에 액체를 주입하기 위한 개구부(6)를 별도 설치하는 것이 바람직하다. 해당 개구부(6)는, 출입구용이어도 된다.
연동 펌프는, 수동에 의해 작동과 정지의 제어를 행하여도 되고, 당해 제조 장치에 제어장치를 설치하고, 해당 제어장치에 의해, 미리 정해진 시간만 연동 펌프가 자동적으로 작동하도록 제어해도 된다.
[제 1 액체]
제 1 액체는, 특정 화합물로서, 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성할 수 있는, 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물을 함유한다.
음이온성의 관능기로는, 카르복시기, 술포기, 인산기 및 그들의 염을 들 수 있고, 카르복시기 또는 그의 염이 바람직하다. 본 발명에 이용되는 고분자 화합물에는, 상기 음이온성의 관능기의 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 이용되는 고분자 화합물의 바람직한 구체예로는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단당류(예를 들면, 트리오스, 테트로오스, 펜토오스, 헥소오스, 헵토오스 등)가 10개 이상 중합한 다당류를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 음이온성의 관능기를 갖는 산성 다당류를 들 수 있다. 여기에서 말하는 산성 다당류란, 그 구조 중에 음이온성의 관능기를 가지면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 우론산(예를 들면, 글루쿠론산, 이두론산, 갈락투론산, 만누론산)을 갖는 다당류, 구조 중의 일부에 황산기 또는 인산기를 갖는 다당류, 또는 그 양쪽의 구조를 갖는 다당류로서, 천연으로부터 얻어지는 다당류뿐만 아니라, 미생물에 의해 산생된 다당류, 유전자 공학적으로 산생된 다당류, 또는 효소를 이용하여 인공적으로 합성된 다당류도 포함된다. 보다 구체적으로는, 히알루론산, 젤란검, 탈아실화 젤란검(이하, DAG라고 하는 경우도 있다), 람산검, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난, 헥수론산, 후코이단, 펙틴, 펙틴산, 펙티닌산, 헤파란황산, 헤파린, 헤파리틴황산, 케라토황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 람난황산 및 그들의 염으로 이루어지는 군으로부터 1종 또는 2종 이상으로 구성되는 다당류가 예시된다. 다당류는, 바람직하게는, 히알루론산, DAG, 디우탄검, 크산탄검, 카라기난 또는 그들의 염이며, 보다 바람직하게는, DAG 또는 그의 염이다. DAG는 인산화한 것을 사용할 수도 있다. 당해 인산화는 공지의 수법으로 행할 수 있다.
여기에서 말하는 염이란, 예를 들면, 리튬, 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리 금속의 염, 칼슘, 바륨, 마그네슘과 같은 알칼리 토류 금속의 염 또는 알루미늄, 아연, 구리, 철, 암모늄, 유기 염기 및 아미노산 등의 염을 들 수 있다.
이들 고분자 화합물(다당류 등)의 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 10,000 내지 50,000,000이고, 보다 바람직하게는 100,000 내지 20,000,000, 더욱 바람직하게는 1,000,000 내지 10,000,000이다. 예를 들면, 당해 분자량은, 겔 침투 크로마토그래피(GPC)에 의한 풀루란 환산으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 음이온성의 관능기를 갖는 다당류를 복수 종(바람직하게는 2종) 조합하여 사용할 수 있다. 음이온성의 관능기를 갖는 다당류와 음이온성의 관능기를 갖지 않는 다당류를 조합해도 된다. 다당류의 조합의 종류는, 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 상술의 구조체를 액체 배지 중에 형성할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 당해 조합은 적어도 DAG 또는 그의 염을 포함한다. 즉, 적합한 다당류의 조합에는, DAG 또는 그의 염, 및 DAG 또는 그의 염 이외의 다당류(예, 크산탄검, 알긴산, 카라기난, 디우탄검, 메틸 셀룰로오스, 로커스트빈검 또는 그들의 염)가 포함된다. 구체적인 다당류의 조합으로는, DAG와 람산검, DAG와 디우탄검, DAG와 크산탄검, DAG와 카라기난, DAG와 로커스트빈검, DAG와 κ-카라기난, DAG와 알긴산 나트륨, DAG와 메틸 셀룰로오스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
탈아실화 젤란검이란, 1-3 결합한 글루코오스, 1-4 결합한 글루쿠론산, 1-4 결합한 글루코오스 및 1-4 결합한 람노스의 4 분자의 당을 구성 단위로 하는 직쇄상의 고분자 다당류이고, 이하의 일반식 (Ⅰ)에 있어서, R1, R2가 모두 수소 원자이며, n은 2 이상의 정수로 표시되는 다당류이다. 단, R1이 글리세릴기를, R2가 아세틸기를 포함하고 있어도 되지만, 아세틸기 및 글리세릴기의 함유량은, 바람직하게는 10％ 이하이고, 보다 바람직하게는 1％ 이하이다.
[화학식 1]
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특정 화합물은, 화학 합성법으로 얻어진 것이어도 되지만, 당해 특정 화합물이 천연물인 경우는, 당해 화합물을 함유하고 있는 각종 식물, 각종 동물, 각종 미생물로부터 관용 기술을 이용하여 추출 및 분리 정제함으로써 얻어진 것이어도 된다. 예를 들면, 젤란검은, 발효 배지에서 생산 미생물을 배양하며, 균체외에 생산된 점막물을 통상의 정제 방법으로 회수하고, 건조, 분쇄 등의 공정 후, 분말상으로 함으로써 제조할 수 있다. 또, 탈아실화 젤란검의 경우는, 점막물을 회수할 때에 알칼리 처리를 실시하고, 1-3 결합한 글루코오스 잔기에 결합한 글리세릴기와 아세틸기를 탈아실화한 후에 회수하면 된다. 젤란검의 생산 미생물의 예로는, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 스핀고모나스·엘로데아(Sphingomonas elodea) 및 당해 미생물의 유전자를 개변한 미생물을 들 수 있다.
탈아실화 젤란검의 경우, 시판의 것, 예를 들면, 산쇼 가부시키가이샤 제조 「KELCOGEL(시피·켈코사의 등록상표) CG-LA」, 산에이겐 에프·에프·아이 가부시키가이샤 제조 「켈코겔(시피·켈코사의 등록상표)」 등을 사용할 수 있다. 또, 네이티브형 젤란검으로서, 산에이겐 에프·에프·아이 가부시키가이샤 제조 「켈코겔(시피·켈코사의 등록상표) HT」 등을 사용할 수 있다.
제 1 액체는, 통상, 특정 화합물의 용액이다. 당해 용액을 위한 용매는, 특정 화합물을 용해 가능한 것인 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 물 또는 친수성 용매이고, 바람직하게는 물이다. 즉, 바람직한 양태에 있어서 제 1 액체는, 특정 화합물의 수용액이다.
제 1 액체 중에 함유되는 특정 화합물의 농도는, 제 2 액체와 혼합했을 때에, 혼합액 중에서, 특정 화합물이 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성하고, 또한 해당 구조체가 혼합액 중에 균일하게 분산하며, 더 나아가, 최종적으로 얻어지는 액상의 배지 조성물이, 당해 구조체를 포함함으로써 세포 또는 조직을 부유 배양 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 아래에 상세하게 서술한, 세포 또는 조직을 부유 배양 가능한 배지 조성물 중의 특정 화합물의 농도와, 최종 산물에서 얻어지는 배지 조성물의 체적에 대한, 제 1 액체의 체적의 비율로부터, 제 1 액체 중의 특정 화합물의 농도를 산출하는 것이 가능하다. 예를 들면, 체적 V1의 제 1 액체와, 체적 V2의 제 2 액체를 혼합하여, 체적 V1＋V2의 액상의 배지 조성물을 최종적으로 얻는 경우, 당해 액상의 배지 조성물 중의 특정 화합물의 농도를 C％(w/v)로 하기 위해서는, 제 1 액체 중의 특정 화합물의 농도를, C×(V1＋V2)/V1％(w/v)로 하면 된다.
제 1 액체 중의 2가 금속 양이온 농도는, 제 1 액체 중의 특정 화합물이, 구조체를 형성하는 농도를 하회할 필요가 있다. 2가 금속 양이온으로는, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 망간 이온, 철 이온, 구리 이온 등을 들 수 있다. 특히, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온 중 한쪽 또는 양쪽(이하, 「칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온」이라고도 표현한다)이, DAG 등의 특정 화합물의 구조체 형성에 기여한다.
제 1 액체에는, 특정 화합물, 용매 이외의 인자가 포함되어 있어도 된다. 해당 인자로는, 생리적으로 허용 가능한 완충제, 염, 등장제(等張劑)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
제 1 액체의 조제는, 특정 화합물을 상기 용매(예, 물)에 첨가하고, 당해 특정 화합물을 용해 가능한 온도(예를 들면, 60℃ 이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상)에서 교반하고, 투명한 상태가 될 때까지 용해함으로써 행할 수 있다. 탈(脫)2가 금속 양이온 처리를 한 DAG를 이용하면, 가열을 필요로 하는 일 없이 물에 용해하므로, 용해 조작이 용이하다. 필요하면, 얻어진 특정 화합물의 용액을, 탈2가 금속 양이온 처리를 하여, 용액 중의 2가 금속 양이온 농도가 구조체 형성 농도를 하회하도록 한다. 필요에 따라서, 용매 중에 미리 특정 화합물 이외의 인자를 첨가해 두어도 되고, 얻어진 특정 화합물의 용액에 특정 화합물 이외의 인자를 첨가해도 된다. 제 1 액체는 멸균 처리되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리의 방법으로는, 오토클레이브, 여과 멸균 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
[제 2 액체]
제 2 액체는, 연결 물질로서 2가 금속 양이온을 함유한다. 2가 금속 양이온으로는, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 망간 이온, 철 이온, 구리 이온 등을 들 수 있다. 2가 금속 양이온의 종류는, 제 1 액체 중에 포함되는 특정 화합물이, 당해 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성하는 것이 가능하면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 칼슘 이온이다.
제 2 액체는, 통상, 연결 물질(즉, 2가 금속 양이온)의 용액이다. 당해 용액을 위한 용매는, 연결 물질을 용해 가능한 것인 한, 특별히 한정되지 않지만, 통상, 물 또는 친수성 용매이며, 바람직하게는 물이다. 즉, 바람직한 양태에 있어서 제 2 액체는, 연결 물질(즉, 2가 금속 양이온)의 수용액이다.
제 2 액체에는, 제 1 액체와 제 2 액체를 혼합하여, 최종적으로 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 2가 금속 양이온 농도가, 제 1 액체 중의 특정 화합물이 구조체를 형성하는 데 충분하게 되는 양(量)의 2가 금속 양이온이 포함된다.
제 2 액체 중의 2가 금속 양이온 농도는, 최종적으로 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 2가 금속 양이온 농도와, 제 1 액체와 제 2 액체의 혼합비율로부터 산출할 수 있다.
제 2 액체에는, 연결 물질(즉, 2가 금속 양이온), 용매 이외의 인자가 포함되어 있어도 된다. 해당 인자로는, 의도한 세포를 배양하는 데 적합한 배지 구성 성분을 들 수 있다. 당해 배지 구성 성분으로는, 완충제(탄산 완충제, 인산 완충제, HEPES 등), 무기염(NaCl 등), 각종 아미노산, 각종 비타민(콜린, 엽산 등), 당류(글루코오스 등), 항산화제(모노티오글리세롤 등), 피루빈산, 지방산, 혈청, 항생물질, 인슐린, 트란스페린, 락토페린, 콜레스테롤, 각종 사이토카인, 각종 호르몬, 각종 증식 인자, 각종 세포외 매트릭스 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 제 2 액체는 멸균 처리되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리의 방법으로는, 오토클레이브, 여과 멸균 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
바람직한 양태에 있어서, 제 2 액체는, 구조체 형성 농도의 2가 금속 양이온(바람직하게는, 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온)을 함유하는 액체 배지의 농축액이다. 제 2 액체는, 2가 금속 양이온(바람직하게는, 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온) 및 물에 더하여, 의도한 세포를 배양하는 데 적합한 배지 구성 성분을 함유한다. 일반적으로 사용되는 세포 배양용 액체 배지 중의 칼슘 이온 농도의 범위는 0.1∼2.0mM 정도, 마그네슘 이온 농도는 0.1∼1.0mM 정도이므로, DAG 등의 특정 화합물에 의한 구조체 형성에 충분하다. 제 2 액체에 있어서의, 2가 금속 양이온(바람직하게는, 칼슘 이온 및/또는 마그네슘 이온)의 농도는, 제 1 액체와의 혼합 비를 고려하여, 최종적으로 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 2가 금속 양이온 농도가, 구조체 형성 농도가 되도록 조정된다. 다른 연결 물질에 대해서도 마찬가지이다. 또, 제 2 액체에 있어서의, 의도한 세포를 배양하는 데 적합한 배지 구성 성분의 농도는, 제 1 액체와의 혼합비를 고려하여, 최종적으로 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 배지 구성 성분의 농도가, 의도한 세포를 배양하는 데 적합한 농도 범위 내가 되도록 조정된다. 예를 들면, 체적 V1의 제 1 액체와, 체적 V2의 제 2 액체를 혼합하여, 체적 V1＋V2의 액상의 배지 조성물을 최종적으로 얻는 경우, 당해 액상의 배지 조성물 중의 2가 금속 양이온의 농도를 Cⅰ로 하기 위해서는, 제 2 액체 중의 2가 금속 양이온의 농도를, Cⅰ×(V1＋V2)/V2로 하면 된다. 다른 연결 물질에 대해서도 마찬가지이다. 이와 같이, 체적 V1의 제 1 액체와, 체적 V2의 제 2 액체를 혼합하여, 체적 V1＋V2의 액상의 배지 조성물을 최종적으로 얻는 경우, 당해 액상의 배지 조성물 중의 배지 구성 성분의 농도를 Cm으로 하기 위해서는, 제 2 액체 중의 배지 구성 성분의 농도를, Cm×(V1＋V2)/V2로 하면 된다.
본 양태에 있어서는, 본 발명의 제조 방법에 의해, 제 1 액체와 제 2 액체를 혼합함으로써, 제 1 액체에 포함되어 있었던 특정 화합물이 제 2 액체에 포함되어 있었던 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체를 포함하는, 목적으로 하는 액상의 배지 조성물을 즉시 얻을 수 있다.
단, 제 2 액체에는, 상술의 세포 배양용 배지 구성 성분의 일부 또는 전부가 포함되어 있지 않아도 된다. 그 경우, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 제 1 액체와 제 2 액체를 혼합하여, 제 1 액체에 포함되어 있었던 특정 화합물이 제 2 액체에 포함되어 있었던 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체를 포함하는 혼합액을 얻으며, 당해 혼합액 중에, 상기 세포 배양용 액체 배지 구성 성분의 일부 또는 전부를 첨가함으로써, 목적으로 하는 액상의 배지 조성물을 얻을 수 있다.
제 1 액체와 제 2 액체의 체적 혼합비율은, 제 1 액체의 체적 100에 대하여, 제 2 액체의 체적이 50∼200, 바람직하게는 100이다.
적합한 양태에 있어서, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 액상의 배지 조성물 중에 함유되는 특정 화합물의 90 몰％ 이상(바람직하게는, 95 몰％ 이상, 보다 바람직하게는 99 몰％ 이상, 가장 바람직하게는 100 몰％)은 제 1 액체에서 유래하고, 해당 배지 조성물 중에 함유되는 2가 금속 양이온의 90 몰％ 이상(바람직하게는, 95 몰％ 이상, 보다 바람직하게는 99 몰％ 이상, 가장 바람직하게는 100 몰％)은 제 2 액체에서 유래한다.
[액상의 배지 조성물]
본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물은, 제 1 액체에 포함되어 있었던 특정 화합물이 제 2 액체에 포함되어 있었던 연결 물질(즉, 2가 금속 양이온)을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체를 함유하고, 또한 해당 배지 조성물 중에 해당 구조체가 균일하게 분산되어 있으므로, 당해 배지 조성물을 이용하면, 부유 상태를 유지한 채로 세포나 조직을 배양하는 것이 가능하다.
배양의 대상이 되는 세포나 조직이 유래하는 생물의 종류는, 특별히 한정되지 않고, 동물(곤충, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 범갑각류, 육각류(六脚類), 포유류 등)뿐만 아니라, 식물도 포함된다.
일양태에 있어서, 배양의 대상이 되는 세포는, 부착의존성의 세포이다. 본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물을 이용하면, 부착의존성의 세포를, 부착구(anchorage)가 되는 담체를 이용하는 일 없이, 부유 상태를 유지한 채로 배양하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 세포 및/또는 조직의 부유란, 배양 용기에 대하여 세포 및/또는 조직이 저면에 대해 접촉은 할 수 있지만 부착하지 않는 상태(비접착)인 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서, 세포 및/또는 조직을 증식, 분화 또는 유지시킬 때, 액체의 배지 조성물에 대한 외부로부터의 압력이나 진동 또는 당해 조성물 중에서의 진탕, 회전 조작 등을 수반하지 않고 세포 및/또는 조직이 당해 액상의 배지 조성물 중에서 균일하게 분산하고 또한 부유 상태에 있는 상태를 「부유 정치(浮遊靜置)」라고 하고, 당해 상태에서 세포 및/또는 조직을 배양하는 것을 「부유 정치 배양」이라고 한다. 또, 「부유 정치」에 있어서 부유시킬 수 있는 기간으로는, 5분 이상, 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 7일 이상 등이 포함되지만, 부유 상태를 유지하는 한 이들 기간에 한정되지 않는다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물은, 세포나 조직의 유지나 배양이 가능한 온도 범위(예를 들면, 0∼40℃) 중 적어도 한 점에 있어서, 세포 및/또는 조직의 부유 정치가 가능하다. 본 발명에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물은, 바람직하게는 25∼37℃의 온도 범위 중 적어도 한 점에 있어서, 가장 바람직하게는 37℃에 있어서, 세포 및/또는 조직의 부유 정치가 가능하다.
부유 정치가 가능한지 여부는, 예를 들면, 배양 대상의 세포를, 2×10 4cells/mL의 농도로, 평가 대상의 배지 조성물 중에 균일하게 분산시키고, 15mL 코니칼 튜브(conical tube) 중에 10mL 주입하여, 적어도 5분 이상(예, 1시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 7일 이상), 4℃ 정도의 저온하에서 정치하고, 당해 세포의 부유 상태가 유지되는지 여부를 관찰함으로써, 평가할 수 있다. 부유 상태의 평가는, 예를 들면, 전체 세포 중의 70％ 이상이 부유 상태인 경우, 부유 상태가 유지되었다고 결론지을 수 있다. 세포를 대신하여, 폴리스티렌 비즈(Size 500-600㎛, Polysciences inc. 제조)로 대체하여 평가해도 된다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물은, 상기 구조체를 포함함으로써, 그 점도가 실질적으로 높아지고 있지 않다. 「액체의 점도를 실질적으로 높이지 않는다」란, 액체의 점도가 8mPa·s를 상회하지 않는 것을 의미한다. 이때의 당해 액체의 점도(즉, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물의 점도)는, 37℃에 있어서, 8mPa·s 이하이고, 바람직하게는 4mPa·s 이하이며, 보다 바람직하게는 2mPa·s 이하이다. 구조체를 포함하는 액체의 점도는, 37℃ 조건하에서 E형 점도계(도키 산교 가부시키가이샤 제조, TV-22형 점도계, 기종: TVE-22L, 콘로터: 표준 로터 1°34'×R24, 회전수 100rpm)를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 액상의 배지 조성물 중의 특정 화합물의 농도는, 특정 화합물의 종류에 의존하고, 특정 화합물이 상술의 구조체를 액상의 배지 조성물 중에 형성하여, (바람직하게는, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이는 일 없이) 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시킬 수 있는(바람직하게는 부유 정치시킬 수 있는) 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, DAG의 경우, 0.001％ 내지 1.0％(w/v), 바람직하게는 0.003％ 내지 0.5％(w/v), 보다 바람직하게는 0.005％ 내지 0.3％(w/v), 더욱 바람직하게는 0.01％ 내지 0.05％(w/v), 가장 바람직하게는 0.01％ 내지 0.03％(w/v)이다. 크산탄검의 경우, 0.001％ 내지 5.0％(w/v), 바람직하게는 0.01％ 내지 1.0％(w/v), 보다 바람직하게는 0.05％ 내지 0.5％(w/v), 가장 바람직하게는, 0.1％ 내지 0.2％(w/v)이다. κ-카라기난 및 로커스트빈검 혼합계의 경우, 양 화합물의 총계로서, 0.001％ 내지 5.0％(w/v), 바람직하게는 0.005％ 내지 1.0％(w/v), 보다 바람직하게는 0.01％ 내지 0.1％(w/v), 가장 바람직하게는 0.03％ 내지 0.05％(w/v)이다. 네이티브형 젤란검의 경우, 0.05％ 내지 1.0％(w/v), 바람직하게는 0.05％ 내지 0.1％(w/v)이다.
특정 화합물로서 상기 다당류를 복수 종(바람직하게는 2종) 조합하여 사용하는 경우, 당해 다당류의 농도는, 당해 다당류의 조합이 상술의 구조체를 액상의 배지 조성물 중에 형성하여, (바람직하게는, 당해 액체 배지의 점도를 실질적으로 높이는 일 없이) 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시킬 수 있는(바람직하게는 부유 정치시킬 수 있는) 범위에서, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, DAG 또는 그의 염과, DAG 또는 그의 염 이외의 다당류와의 조합을 이용하는 경우, DAG 또는 그의 염의 농도로는 0.005∼0.02％(w/v), 바람직하게는 0.01∼0.02％(w/v)가 예시되고, DAG 또는 그의 염 이외의 다당류의 농도로는, 0.0001∼0.4％(w/v), 바람직하게는 0.005∼0.4％(w/v), 보다 바람직하게는 0.1∼0.4％(w/v)가 예시된다. 구체적인 농도 범위의 조합으로는, 이하가 예시된다.
DAG 또는 그의 염: 0.005∼0.02％(바람직하게는 0.01∼0.02％)(w/v)
DAG 이외의 다당류
크산탄검: 0.1∼0.4％(w/v)
알긴산 나트륨: 0.0001∼0.4％(w/v)(바람직하게는, 0.1∼0.4％(w/v))
네이티브 젤란검: 0.0001∼0.4％(w/v)
로커스트빈검: 0.1∼0.4％(w/v)
메틸 셀룰로오스: 0.1∼0.4％(w/v)(바람직하게는 0.2∼0.4％(w/v))
카라기난: 0.05∼0.1％(w/v)
디우탄검: 0.05∼0.1％(w/v)
또한 해당 농도는, 이하의 식으로 산출할 수 있다.
농도[％(w/v)]＝특정 화합물의 중량(g)/배지 조성물의 체적(mL)×100
바람직한 양태에 있어서, 특정 화합물로서 DAG 또는 그의 염을 이용하고, 연결 물질로서 칼슘 이온을 이용한다. 제 1 액체는, DAG 또는 그의 염의 수용액이다. 제 2 액체는, 칼슘 이온을 함유하는 액체 배지의 농축액이다. 제 1 액체와 제 2 액체의 체적 혼합비는, 상기한 바와 같이, 제 1 액체의 체적(V1) 100에 대하여, 제 2 액체의 체적(V2)이 50∼200, 바람직하게는 100이다. 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 DAG 농도는, 바람직하게는 0.01％∼ 0.05％(w/v), 가장 바람직하게는 0.01％∼0.03％(w/v)이다. 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 칼슘 이온 농도는, DAG가 구조체를 형성하는 농도이며, 통상, 0.1∼2.0mM 정도이다. 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 배지 구성 성분의 농도는, 의도한 세포(예, 포유동물 세포)를 배양하는 데 적합한 농도 범위 내이다.
제 1 액체 중의 DAG 농도는, 상술의 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 DAG 농도에, (V1＋V2)/V1(즉, 150/100∼300/100, 바람직하게는 200/100)을 곱하여 얻어지는 농도이다.
제 2 액체 중의 칼슘 이온 농도는, 상술의 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 칼슘 이온 농도에, (V1＋V2)/V2(즉, 150/50∼300/200, 바람직하게는 200/100)를 곱하여 얻어지는 농도이다.
제 2 액체 중의 배지 구성 성분의 농도는, 상술의 혼합의 결과로서 얻어지는 액상의 배지 조성물 중의 배지 구성 성분의 농도에, (V1＋V2)/V2(즉, 150/50∼300/200, 바람직하게는 200/100)를 곱하여 얻어지는 농도이다.
해당 액상의 배지 조성물에는, DAG가 칼슘 이온을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체가 균일하게 분산하여 포함됨으로써, 점도가 실질적으로 높아지는 일 없이, 세포 및/또는 조직을 균일하게 부유시킬 수 있다(바람직하게는 부유 정치시킬 수있다).
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 액상의 배지 조성물을 이용하면, 세포나 조직의 장해나 기능 상실을 일으킬 위험이 있는 진탕이나 회전 등의 조작을 수반하지 않고 세포 및/또는 조직을 부유 상태에서 배양할 수 있다. 또한, 당해 배지 조성물을 이용하면, 배양 시, 용이하게 배지를 교환할 수 있을 뿐만 아니라, 배양한 세포 및/또는 조직을 용이하게 회수할 수도 있다. 당해 배지 조성물을 이용하면, 종래 플레이트 상에서 단층으로, 세포 용기에 접착한 상태에서의 배양을 필요로 하고 있었던 세포를, 부유 상태에서 배양할 수 있으므로, 접착성의 세포를 그 기능을 손상시키는 일 없이 효율적으로 대량으로 조제할 수 있다.
제 1 액체와 제 2 액체의 혼합액은, 제조 목적의 배지 조성물이어도 되지만, 해당 혼합액에 첨가물을 추가로 첨가함으로써 제조 목적의 배지 조성물이 되는 것이어도 된다.
실시예
본 발명의 제조 장치를 이용하여, 본 발명의 제조 방법을 실시함으로써, 제 1, 제 2 액체를 혼합하여, 얻어지는 배지 조성물의 혼합 상태(2액의 혼합에 의해 형성되는 구조체의 분산 상태)를 평가했다.
[제조 장치의 각 부의 사양]
도 4에 나타낸 용기(유연한 백)(1)와 각 튜브(41∼45) 및 연동 펌프로서의 롤러 펌프(5)를 이용해, 제 1, 제 2 액체를 혼합하여, 액상의 배지 조성물을 제조했다.
제 1 액체는, 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액(농도: 0.040％)이고, 제 2 액체는, 칼슘 이온을 함유하는 액체 배지(칼슘 이온 농도: 3.29mM)이다.
용기(1)는, 폴리에틸렌제의 유연한 필름을 벽부의 소재로서 이용한 주머니 형상물(백)이며, 용적은 100L이다.
롤러 펌프는, 후루에 사이언스(주) 제조의 RP-KGⅠ이다. 롤러 펌프에 장착되는 순환용 튜브의 내경은 13mm이고, 외형은 19mm이다. 롤러 펌프의 이송량은, 약 10L/분이다. 롤러 펌프(5)에 의한 액체의 이송 방향은, 액체가 개구부(2)로부터 나와 롤러 펌프(5)를 거쳐 개구부(3)로 향한다는 방향이다.
[액상의 배지 조성물의 제조]
공기가 빼내어져 수축한 상태의 용기(1)에 대하여, 외부 용기(7b)에 수용된 제 2 액체 50L를 용기(1)에 주입했다. 이어서, 롤러 펌프(5)를 작동시켜, 제 2 액체를 순환시키면서, 외부 용기(7a)에 수용된 제 1 액체 50L를 용기(1)에 0.5 시간을 들여 주입했다. 또, 제 1 액체 50L의 주입이 완료된 시점부터 추가로, 순환을 3시간 계속시켜 혼합을 완료하여, 액상의 배지 조성물을 얻었다.
[혼합 상태의 평가]
상기에서 얻어진 액상의 배지 조성물이, 바람직하게 혼합된 것인지 여부, 즉, 제 1 및 제 2 액체의 혼합에 의해 형성된 구조체(제 1 액체에 포함되어 있었던 특정 화합물이, 제 2 액체에 포함되어 있었던 2가 금속 양이온을 개재하여 집합한 구조체)가, 액상의 배지 조성물 중에 바람직하게 분산하여 부유한 상태로 되어 있는지 여부를, 하기에 나타내는 성능 평가 시험 방법(본 발명을 위해 새롭게 규정한 시험 방법)을 실시하여, 평가했다.
[성능 평가 시험 방법]
(1) 구조체의 형성 시간을 충분히 확보하는 점에서, 시험은, 배지 조성물의 혼합을 완료한 시점부터 48시간 후에 개시한다.
(2) 폴리스티렌제의 비즈(직경 600㎛, Polysciences사 제조) 10mg을, 용적 15mL의 멸균 완료 코니칼 튜브에 넣고, 해당 코니칼 튜브 내로 추가로, 평가해야 하는 배지 조성물을 10mL 주입하여, 전도(轉倒) 혼화한다.
(3) 전도 혼화 종료의 직후에 있어서, 코니칼 튜브 내의 배지 조성물의 액 면까지 비즈가 균일하게 분산하고 있는 것을 육안으로 확인한다.
(4) 상기 (3)의 상태의 시료를, 코니칼 튜브를 세운 상태로 하고, 배지 성분의 열화 방지의 점에서 4℃의 온도로 하여, 12시간 이상 정치한 후, 비즈의 분산 상태(분산한 채로인지, 침강하는 경향이 있는지)를 육안으로 판정한다. 구조체가 배지 조성물 중에 바람직하게 분산하여 부유한 상태로 되어 있으면, 도 6(a)에 모식적으로 나타내는 바와 같이, 해당 구조체의 분산적인 부유의 영향을 받아, 비즈도 또한 배지 조성물 중에 분산하여 부유한 채가 된다. 한편, 혼합이 바람직하지 않고, 배지 조성물 중에 구조체가 보다 큰 집합체로 되어 부유하고 있는 경우에는, 배지 조성물 중의 나머지인 구조체가 없는 부분도 커지기 때문에, 도 6(b)에 모식적으로 나타내는 바와 같이, 구조체의 부유의 영향을 받지 않고 침강하는 비즈도 많아진다. 이와 같이, 배지 조성물에 비즈를 혼합하면, 육안으로는 확인하기 어려운 구조체의 분산 모습을, 해당 비즈를 통해 확인할 수 있다.
(5) 비즈의 분산 상태의 판정 기준
합격: 비즈가 배지 조성물의 액면까지 균일하게 분산하고 있는 것. 본 실시예에서는, 15mL의 코니칼 튜브에 10mL의 배지 조성물을 주입한 경우의 판정 기준으로서, 도 6(a)에 모식적으로 나타내는 바와 같이, 9mL의 라인 이상에 비즈가 분산하고 있고, 튜브의 바닥에 비즈의 침강에 의한 모임이 전혀 보이지 않는 것으로 했다.
불합격: 비즈가 배지 조성물의 액면까지 균일하게 분산하고 있지 않은 것. 본 실시예에서는, 상기의 합격 기준과는 반대로, 15mL의 코니칼 튜브에 10mL의 배지 조성물을 주입한 경우, 도 6(b)에 모식적으로 나타내는 바와 같이, 9mL의 라인 이상에는 비즈가 없고, 튜브의 바닥(특히, 1.5mL 라인보다도 하부)에 비즈의 침강에 의한 모임이 보이는 것으로 했다.
[평가 결과]
상기에서 얻어진 배지 조성물에 대하여, 상기 성능 평가 시험 방법을 실시한 결과, 비즈의 분산 상태는 합격이며, 본 발명의 제조 방법 및 제조 장치가, 제 1 및 제 2 액체를 바람직하게 혼합할 수 있는 뛰어난 방법 및 장치인 것을 알았다.
본 발명의 제조 방법 및 제조 장치에 의해, 2가 금속 양이온 등의 연결 물질을 포함한 임의의 액체에 대하여, 특정 화합물을 포함한 액체를 무균적으로 또한 간단하게 또한 바람직하게 혼합할 수 있어, 미세한 구조체가 분산한 액상의 배지 조성물을 염가로 또한 대량으로 얻을 수 있게 되었다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특원 2016-144929(출원일: 2016년 7월 22일)를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.
1: 용기 　　 2, 3: 개구부
4: 튜브 5: 연동 펌프

Claims (15)

  1. 하기 (ⅰ)의 특정 화합물을 함유하는 제 1 액체와, 하기 (ⅱ)의 연결 물질을 함유하는 제 2 액체를 혼합하여, 액상의 배지 조성물을 제조하는 방법으로서,
    적어도 2개의 개구부가 벽부에 설치된 용기를 이용하고, 여기에서, 상기 적어도 2개의 개구부는, 용기 바깥의 튜브에 의해 서로 연결되며, 상기 튜브는, 연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착될 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는 것이고,
    상기 튜브를 상기 연동 펌프에 장착하고, 상기 연동 펌프를 작동시킴으로써, 상기 용기 내의 상기 제 1 액체와 상기 제 2 액체가 외기에 접촉하는 일이 없는 폐쇄계의 구성으로, 상기 제 1 액체와 상기 제 2 액체를 상기 튜브와 상기 용기 사이를 순환시켜 혼합하고, 상기 특정 화합물이 상기 연결 물질을 개재하여 결합되어 형성되는 구조체가 분산한 액상의 배지 조성물을 용기 내에 형성하는 것을 특징으로 하는, 상기 액상의 배지 조성물의 제조 방법:
    (ⅰ) 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성할 수 있는, 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물인 특정 화합물.
    (ⅱ) 2가 금속 양이온인 연결 물질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (ⅰ)의 특정 화합물이 탈아실화 젤란검이고, 제 1 액체가 상기 탈아실화 젤란검을 함유하는 수용액이며,
    상기 (ⅱ)의 연결 물질이, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온 중 한쪽 또는 양쪽이고, 제 2 액체가, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온 중 한쪽 또는 양쪽을 함유하는 액체 배지의 농축액인, 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 액상의 배지 조성물 중의 탈아실화 젤란검의 농도가, 0.001％(w/v)∼1.0％(w/v)인, 배지 조성물의 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 액체와 제 2 액체의 체적 혼합 비율이, 제 1 액체의 체적 100에 대하여 제 2 액체의 체적 50∼200인, 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면(底面)을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부(底部)에 출구로서 설치되고,
    상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 입구로서 설치되어 있으며,
    상기 연동 펌프를 작동시켜, 제 1 액체와 제 2 액체를, 그들 액체가 튜브 내를 상기 출구에서 상기 입구를 향하는 방향으로 이동시키고, 그것에 의해, 용기 내의 제 1 액체와 제 2 액체를 위쪽에서 아래쪽으로 향하는 방향으로 이동시키는, 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 2개의 개구부가 출구와 입구로서 1쌍으로 되어 있고, 상기 용기에는 상기 2개의 개구부가 복수 쌍 설치되며, 각 쌍에 있어서의 2개의 개구부가 각각 튜브로 접속되어 있고,
    각각의 튜브를 별개의 연동 펌프에 장착하고, 상기 연동 펌프를 작동시켜, 상기 제 1 액체와 제 2 액체를, 각 튜브를 통하여 순환시키는, 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기가, 상기 용기의 내부에 수용되는 액체의 체적에 따라 상기 용기의 용적이 변동할 수 있도록 유연한 재료로 이루어지는 것이며, 그것에 의해, 상기 용기 내의 밀폐성을 확보하면서도 상기 용기 내에 액체를 주입하고 또한 상기 용기 외로 액체를 배출하는 것이 가능하게 되어 있는, 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용기에는, 상기 용기 내로의 액체의 출입에 이용하는 출입구용 개구부가 설치되어 있고,
    상기 용기에 제 1 액체 및 제 2 액체 중 어느 한쪽의 액체를 먼저 넣어 두고, 상기 액체를 상기 연동 펌프로 순환시키면서 다른쪽의 액체를 상기 출입구용 개구부로부터 용기 내로 주입하는, 액상의 배지 조성물의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 기재한 액상의 배지 조성물의 제조 방법을 실시하기 위해 이용되는 제조 장치로서,
    상기 제조 장치는, 상기 제조 방법에 있어서 혼합되는 제 1 액체와 제 2 액체를 수용하기 위한 용기를 갖고,
    상기 용기의 벽부에는 적어도 2개의 개구부가 설치되며, 이들 개구부는, 용기 바깥의 튜브에 의해 서로 연결되어 있고,
    상기 튜브는, 상기 튜브 내의 액체를 보내도록 구성된 연동 펌프에 펌핑 튜브로서 장착할 수 있고 또한 상기 연동 펌프에 있어서 펌핑 튜브로서 작동할 수 있는 형상과 유연성을 가진 부분을 갖는 것이며,
    상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부에 설치되고,
    상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 설치되어 있되,
    여기서 상기 제 1 액체는 하기 (ⅰ)의 특정 화합물을 함유하며, 상기 제 2 액체는 하기 (ⅱ)의 연결 물질을 함유하고, 또한,
    상기 용기 내의 상기 제 1 액체와 상기 제 2 액체가 외기에 접촉하지 않도록 폐쇄계의 구성을 갖는, 상기 제조 장치:
    (ⅰ) 2가 금속 양이온을 개재하여 결합됨으로써 세포 또는 조직을 부유시킬 수 있는 구조체를 형성할 수 있는, 음이온성의 관능기를 갖는 고분자 화합물인 특정 화합물.
    (ⅱ) 2가 금속 양이온인 연결 물질.
  10. 삭제
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 2개의 개구부가 출구와 입구로서 1쌍으로 되어 있고, 상기 용기에는 상기 2개의 개구부가 복수 쌍 설치되며, 각 쌍에 있어서의 2개의 개구부가 각각 튜브로 접속되어 있는, 제조 장치.
  12. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서,
    추가로, 상기 연동 펌프를 상기 제조 장치의 구성요소로서 갖고, 상기 연동 펌프는, 상기 튜브를 장착하여 상기 튜브를 펌핑 튜브로서 작동시키는 것인, 제조 장치.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 한쪽의 개구부가, 상기 용기의 저면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 저부에 설치되고,
    상기 다른쪽의 개구부가, 상기 용기의 상면을 구성하는 벽부에, 또는 측면을 구성하는 벽부의 상부에 설치되어 있으며,
    상기 튜브 내의 액체가 하측의 개구부에서 상측의 개구부로 이동하도록, 상기 연동 펌프가 작동하도록 구성되고, 그것에 의해, 용기 내에 수용된 액체가 위쪽에서 아래쪽으로 이동하도록 되어 있는, 제조 장치.
  14. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 용기가, 상기 용기의 내부에 수용되는 액체의 체적에 따라 상기 용기의 용적이 변동할 수 있도록 유연한 재료로 이루어지는 것이고, 그것에 의해, 상기 용기 내의 밀폐성을 확보하면서도 상기 용기 내에 액체를 주입하고 또한 상기 용기 외로 액체를 배출하는 것이 가능하게 되어 있는, 제조 장치.
  15. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 용기에는, 상기 용기 내로의 액체의 출입에 이용하는 출입구용 개구부가 추가로 설치되어 있는, 제조 장치.
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