CN216155857U - 一种用于自动化可持续大规模3d细胞生产系统装置 - Google Patents
一种用于自动化可持续大规模3d细胞生产系统装置 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型涉及一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置及应用,其包括智能配气系统、生产系统、收集系统,智能配气系统可以满足细胞培养所需气体;生产系统包括生产细胞、控温系统、微载体、搅拌器、输送泵,其中,控温系统为各种细胞提供良好的生产环境,微载体为细胞提供良好黏附生长表面,极大提升细胞生长所需微面,在搅拌器的搅拌下实现细胞3D立体悬浮培养;生产细胞黏附于微载体表面后,作为新的细胞种子接种到后续投入的微载体表面;收集系统包括滤膜、第二容器、回料口、输送泵,输送泵和滤膜的使用实现培养基和微载体的循环利用以及生产细胞的不断产出,达到3D自动化可持续、大规模细胞生产。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置。
背景技术
细胞尤其是各种干细胞由于独特的分化潜能、修复能力及靶向载药运输性能,使得其在临床应用及科学研究中引起广泛兴趣。然而在干细胞使用过程中仍存在各种问题,其中最显著在于对干细胞数量的需求大难以解决。各种细胞治疗需要尽可能的维持细胞在一定数量,才能显示出其特定疗效。而传统细胞采用贴壁培养的过程中,由于培养器皿二维(2D)表面积大小有限,需要不断传代满足来细胞数量需求,然而2D平面上由于生长空间的挤压以及频繁传代中胰酶消解化液的使用会一定程度地影响细胞的基因和蛋白质表达,且在长期传代培养的过程中干细胞的扩增和分化能力会逐渐丧失,引起质量的下降,因而限制了细胞在临床及科学研究上的应用。近年来,三维(3D)细胞培养技术的兴起被认为是解决细胞生产数量与质量优选方式。3D细胞培养技术是指可以使细胞在体外条件下进行3D生长的培养方式,通常利用微米级别微载体作为细胞黏附生长基质,不仅使得细胞生长所需表面积增加,而且细胞悬浮于培养体系中生长,这使得细胞的培养与体在内的生存状态及环境相接近,可实现细胞的放大培养及高质量产出需求。
然而现有的关于3D细胞培养报道,存在培养规模较小难以放大、投入的培养基及微载体往往难以循环利用以及操作复杂等缺点,难以实现生产细胞的自动化大规模生产。
发明内容
为克服目前生产细胞数量、质量及操作复杂等问题,本实用新型目的在于提供一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,适合G.M.P标准环境下生产细胞的自动化大规模3D循环培养。
本实用新型目的通过以下方案实现:一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,包括智能配气系统、生产系统、收集系统,通过管道系统连接;
所述配气系统,通过管道系统和管道连接器与生产系统密封相连,由配气系统提供生产系统生产细胞所需气体;
所述生产系统,包括第一容器、装配在第一容器上的电动机、装配在第一容器内的搅拌器、第一容器中生产细胞、第一容器中微载体和第一容器中培养基,装配在第一容器内的搅拌器由电机轴带动旋转,第一容器中生产细胞、第一容器中微载体和第一容器中培养基自第一容器的进料口投入第一容器内,由控温系统控制生产系统温度,可为各种细胞提供良好的生产环境;
所述的收集系统包括倒锥形的第二容器、第二容器中生产细胞及第二容器中微载体,第二容器底部为出料口,用于收集其内的第二容器中生产细胞及第二容器中微载体;
生产系统与收集系统通过输送管上的第一泵和减压阀控制第一容器中微载体、生长第一容器中在微载体表面的第一容器中生产细胞和第一容器中培养基被输送到收集系统,以及回流管上的第二泵将第二容器内多余的第二容器中培养基自回流口回流至生产系统的第一容器内。
在上述方案基础上,所述的管道系统通过管道连接器和法兰将配气系统和生产系统密闭连接。
在上述方案基础上,生产系统中,第一容器的下部有第一容器的出液口,经第二减压阀和第一泵,将生产系统中完成生产第一容器中的微载体和生长在该微载体表面的第一容器中生产细胞自第二容器的进液口输送至收集系统的第二容器内;在第一容器的中部连接有培养基输送管,连接了第一减压阀的培养基输送管的另一端连接在第一容器的出液口和第一泵之间,将生产系统中的第一容器中培养基输送入收集系统的第二容器中,用于更新培养基。
进一步的,所述第一容器和第二容器采用经过防止细胞黏附处理的50 mL-60 L石英培养容器或者普通培养容器。可根据生产细胞规模和实际所需选用,其中容器经过特殊处理可防止细胞黏附在容器表面生长,使得生产细胞能尽可能悬浮于容器内部,实现生产细胞与收集细胞含量相一致,同时使得容器易于清洗,避免同其它类型生产细胞交叉污染。
进一步的,所述的培养基输送管中设有输送管滤膜,阻截第一容器中微载体和第一容器中生产细胞,该滤膜优选可更换卡扣式滤膜。
在上述方案基础上,所述的第一容器中生产细胞为包含脐带间充质干细胞的贴壁黏附性生长细胞,如如间充质干细胞(MSC);所述的第一容器中微载体为直径20-200 μm无细胞毒性且可满足细胞黏附性生长特性的微米材料。所述电动机、搅拌器可以根据调节其尺寸和转速来满足不同类型细胞悬浮培养所需最佳生长环境。
在上述方案基础上,所述的回流口设有回流口滤膜,阻截收集系统内的第二容器中微载体和第二容器中生产细胞,该滤膜优选可更换卡扣式滤膜。
可根据实际第二容器中生产细胞和第二容器中微载体大小选择不同孔隙大小的滤膜。
本实用新型使用方法,包括:
准备:关闭第一减压阀和第二减压阀,将生产细胞、微载体和培养基自第一容器的进料口投入第一容器内,由控温系统控制生产系统温度,由智能配气系统向生产系统提供培养气体;
生产:采用间歇搅拌培养方式,将所述生产细胞接种到微载体表面,当细胞在微载体表面融合度达到80%左右时,收集,形成核壳结构的生产细胞/微载体(CB)结构,新形成的CB在培养一段时间后,可作为新的种子接种到新投入生产系统的微载体表面,以“球转球”方式实现生产细胞连续化生产;
收集:打开第一泵,关闭第一减压阀、打开第二减压阀,由第一泵将悬浮于培养基中的生产细胞及微载体由出液口经第二容器的进液口运输到收集系统的第二容器内,通过第二容器底部的出料口收集产物;
第二容器中培养基回流,将收集产物后第二容器中培养基通过回液口由第二泵经第一容器的进液口重新回流到第一容器内部,使得培养基可以循环利用降低浪费,极大降低生产成本。
进一步的,将第一减压阀打开、第二减压阀关闭,由第一泵将第一容器中培养基通过培养基输送管由第二容器的进液口排出,新的培养基由进料口加入,实现新旧培养基的更换。
进一步的,所述的产物为收集系统内的第二容器中生产细胞及第二容器中微载体,出料口收集产物后,经细胞消化液处理、静止或密度梯度离心后实现生产细胞与微载体分离,实现生产细胞的富集,同时分离后的微载体和富集的生产细胞作为新的载体和生产细胞由进料口投入生产系统中,实现微载体的循环反复利用以及生产细胞的长期连续化培养。
具体的,按下述步骤操作:
第一步,所述的无细胞毒性且可满足细胞黏附性生长特性的微载体的准备:为直径20-200 μm微米材料,将水化后的商业微载体Cytodex 1型溶液,浸泡在无血清的培养基如DMEM中过夜稳定,500 g 下离心10 min或静置20 min,去除上清液后,用培养基重悬;
将待接种细胞如间充质干细胞(MSC)与微载体按一定数量比由进料口投入第一容器内部,第一容器中培养基最大体积由第一容器决定,最大体积保持在50 ml-60 L,优选为50 mL-30 L;
由智能配气系统提供的气体,如5 % CO2;
控温系统保持37 ℃;
第二步,搅拌器转速为20-100 rpm,优选为30 rpm下,对MSC与第一容器中微载体Cytodex 1混合物进行培养,其中,搅拌5 min 、静置30 min循环程序,在24 h后,保持30rpm搅拌速率连续培养,每2-7天更换30-50 %培养基;
第三步:当细胞在第一容器中微载体表面融合度达到80 %左右时,第一减压阀关闭、第二减压阀打开,在第一泵输送下,使得悬浮于第一容器中培养基的第一容器中生产细胞及第一容器中微载体由出液口自动运输到收集系统内;关闭第一泵,将收集系统静置20min,在重力作用下,使得收集系统内的第二容器中生产细胞同第二容器中微载体下沉于第二容器底部,上清第二容器中培养基由第二泵输送重新回流入第一容器内;
第四步:将收集到的第二容器中生产细胞及第二容器中微载体经无酶细胞消化液处理、静止或密度梯度离心后实现生产细胞与微载体分离,实现生产细胞的富集收集,将收集到的生产细胞计数后加入细胞冻存液储存。
本实用新型有益效果:
相对于传统2D细胞生产,本实用新型系统装置具有工业化大量培养生产细胞的优势,同时解决3D细胞培养中操作复杂难以连续批量生产等问题。此外本装置使得培养基能够循环回流入生产系统,降低了培养基的消耗成本;且生产细胞在与微载体分离后的单独体以及两者形成核壳结构的CB可作为后续培养新的原材料种子,投入生产系统中继续生产,在极大降低了生产成本的同时实现生产细胞的可持续生产化。本系统装置使得3D悬浮培养技术得以应用于生产细胞的自动持续化生产,实现G.M.P标准环境下生产细胞的自动化大规模扩增生产,也为生产细胞在临床及科学研究中提供了广泛的应用前景。
综上所述,该系统装置具大规模、自动化、可持续、成本低等生产优点,装置具备显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为实用新型本系统装置的结构示意图;
图2显示出不同培养天数下生产细胞在微载体上生长情况显微照片;
图3显示出得到的生产细胞与回收后的微载体培养生长情况的荧光显微镜照片;
图4显示出CB作为种子接种到新填料的微载体上生长情况的荧光显微镜照片;
图中标号说明:
1——智能配气系统;2——管道系统;3——管道连接器;
4——控温系统;5——进料口;6——电机轴;
7——第一容器中微载体;8——第一容器中生产细胞;9——第一容器;10——搅拌器;
11——第一容器中培养基;12——第一泵、13——第二泵;14——第二容器;15——回流口;
16——第二容器中培养基;17——出料口;18——法兰;
19——第一容器的出液口;20——第一容器的进液口;21——第二容器的进液口;
22——电动机;23——生产系统;24——收集系统;
25——生产细胞;26——微载体;27——回流口滤膜;28——培养基输送管滤膜;
29——第一减压阀;30——第二减压阀;
31——培养基输送管。
具体实施方式
为达到此实用新型目的,本实用新型采用以下技术方案。
实施例
一种自动化大规模3D细胞生产系统装置,如图1所示,包括智能配气系统1、生产系统23、收集系统24,通过管道系统2连接;
所述配气系统1通过管道系统2和管道连接器3与生产系统23密封相连,由配气系统1提供生产系统23生产细胞所需气体;
所述生产系统23包括第一容器9、装配在第一容器9上的电动机22、装配在第一容器9内的搅拌器10、第一容器中生产细胞8、第一容器中微载体7和第一容器中培养基11,装配在第一容器9内的搅拌器10由电机轴6带动旋转,第一容器中生产细胞8、第一容器中微载体7和第一容器中培养基11自第一容器9的进料口5投入第一容器9内,由控温系统4控制生产系统23温度;
所述的收集系统24包括倒锥形的第二容器14、第二容器中生产细胞25及第二容器中微载体26,底部为出料口17,用于收集第二容器中生产细胞25及第二容器中微载体26;
生产系统23与收集系统24通过输送管上的第一泵12和减压阀控制第一容器中微载体7、生长在第一容器中微载体7表面的第一容器中生产细胞8和第一容器中培养基11被输送到收集系统(24),以及回流管上的第二泵13将第二容器14内多余的第二容器中培养基16自回流口15回流至生产系统23的第一容器9内。
本实施例中,所述的管道系统2通过管道连接器3和法兰18将配气系统1和生产系统23密闭连接。
生产系统23中,第一容器9的下部有第一容器的出液口19经第二减压阀30和第一泵12,将生产系统23中完成生产的第一容器中微载体7和生长在第一容器中微载体7表面的第一容器中生产细胞8自第二容器的进液口21输送至收集系统24的第二容器14内;在第一容器9的中部有培养基输送管31,连接了第一减压阀29的培养基输送管31的另一端连接在第一容器的出液口19和第一泵12之间,将生产系统23中的第一容器中培养基11输送入收集系统24的第二容器14中。
本实施例中,所述第一容器9和第二容器14采用经过防止细胞黏附处理的50 mL-60 L石英培养容器。也可以是普通培养容器。
所述的培养基输送管31中设有培养基输送管滤膜28,阻截生产系统中的微载体7和生产细胞8,所述滤膜28选用更换卡扣式滤膜滤材。
所述的第一容器中生产细胞8为包含脐带间充质干细胞的贴壁黏附性生长细胞;所述的第一容器中微载体7为直径20-200 μm无细胞毒性且可满足细胞黏附性生长特性的微米材料。
所述的回流口15设有回流口滤膜27,阻截收集系统24内的第二容器中微载体26和第二容器中生产细胞25,所述回流口滤膜27也选用可更换卡扣式滤膜滤材。
应用例1
本实施例自动化大规模3D细胞生产系统装置,按下述步骤操作:
第一步:首先,将水化后的商业微载体Cytodex 1型溶液,浸泡在无血清的培养基如DMEM中过夜稳定,500 g 下离心10 min或静置20 min,去除上清液后,用培养基重悬,将计数后待接种细胞如间充质干细胞(MSC)与该微载体按5:1数量比由进料口投入第一容器内部,第一容器中培养基11最大体积由第一容器9决定,最大体积保持在50 ml-60 L,优选为50 mL-30 L;
第二步,在智能配气系统1提供的气体如5 % CO2、控温系统(4)保持37 ℃、搅拌器转速为20-100 rpm,优选为30 rpm下,对MSC与微载体Cytodex 1混合物进行培养,其中,电动机设置为搅拌5 min 、静置30 min循环程序,在24 h后,保持30 rpm搅拌速率连续培养,每2-7天更换30-50 %培养基;
第三步:当细胞在微载体表面融合度达到80 %左右时,第一减压阀29关闭、第二减压阀30打开,在第一泵12作用下,使得悬浮于第一容器中培养基11中的第一容器中生产细胞8及第一容器中微载体7由出液口19经第二容器的进液口21自动运输到收集系统24内;关闭第一泵12,将收集系统静置20 min,在重力作用下,使得收集系统24中第二容器中生产细胞25同第二容器中微载体26下沉于第二容器14底部,上清第二容器中培养基16由第二泵13输送重新回流入第一容器9内,使得培养基可以循环利用,降低浪费,极大降低生产成本,同时,打开出料口17收集第二容器中生产细胞25及第二容器中微载体26;
第四步:将收集到的第二容器中生产细胞25及第二容器中微载体26经无酶细胞消化液处理、静止或密度梯度离心后实现第二容器中生产细胞25与第二容器中微载体26分离,实现生产细胞的富集收集。将收集到的生产细胞计数、加入细胞冻存液储存。具备操作简单可自动化的优点。
应用例2
本实施例自动化大规模3D细胞生产系统装置,按下述步骤操作:
第一步:首先,将水化后的商业微载体Cytodex 1型约190μm溶液,浸泡在无血清的培养基如DMEM中过夜稳定,500 g 下离心10 min或静置20 min,去除上清液后,用培养基重悬,将待接种细胞如间充质干细胞(MSC)与微载体按5:1数量比由进料口5投入第一容器内部,第一容器中培养基11最大体积由第一容器9决定,最大体积保持在50 ml-60 L,优选为50 mL-30 L;
第二步,在智能配气系统1提供的气体如5 % CO2、控温系统4保持37 ℃、搅拌器转速为20-100 rpm,优选为30 rpm下,对MSC与微载体Cytodex 1混合物进行培养,其中电动机设置为搅拌5 min 、静置30 min循环程序,在24 h后,保持30 rpm搅拌速率连续培养,其中每2-7天更换30-50 %培养基;
第三步:分别收集第0 d、1 d、3 d、 5 d生产系统23)内的生产细胞和微载体,用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色,分别生产细胞在微载体Cytodex 1微球上的生长情况。如图2所示,A图为接种后第0天微载体Cytodex 1在明场下的光学图片,可看出单独的微载体Cytodex 1表面光滑均匀,细胞还未黏附生长;在连续培养1 d、3 d、 5 d后,从B、C、D图可看出,在DAPI细胞核染色后,荧光显微镜下观察到微载体表面显示出细胞特有蓝色荧光斑点,且随着培养时间的增加微载体表面荧光斑点数明显增加,表明细胞不断在微载体表面快速增长繁殖,该实用新型系统装置能实现3D细胞数量快速增加扩增。
应用例3:
本应用例与应用例1的区别在于,将第四步富集得到的生产细胞作为种子与回收的微载体作为基质投入生产系统中再次生产,在培养2天后,对新形成的CB进行DAPI 染色。如图3所示,细胞再次接种到回收的微载体上生长,极大降低了生产成本,表明本实用新型系统装置能满足生产细胞的可持续性循环培养工艺。
应用例4:
本应用例与应用例1的区别在于,当生产系统内部的生产细胞在微载体8在微载体7表面融合度达到80 %左右,形成核壳结构的生产细胞/微载体(CB)结构体时,通过收集系统24将第一容器9内的部分CB收集作为产物,剩余5%-20% CB,优选10%剩余部分CB作为种子留在第一容器内部9,通过进料口5补充未使用过的微载体Cytodex 1,作为新的3D载体,在培养1 d后,DAPI染色观察CB种子上的生产细胞接种到新加入微载体Cytodex 1上的生长情况。如图4,荧光显微镜下观察到微载体表面显示出细胞特有蓝色荧光斑点,表明CB种子上的生产细胞能够再次接种到新加入微载体Cytodex 1上继续生产,CB在与新加入的Cytodex1接触后,出发CB表面上的生产细胞转移到新的Cytodex 1微球上以获得更好的黏附生长空间,实现细胞从一微球转移到另一微球,即“球转球”工艺。CB种子的再次利用,极大降低了生产成本,表明本实用新型系统装置能满足生产细胞的可持续性循环培养工艺。
Claims (7)
1.一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,包括配气系统(1)、生产系统(23)、收集系统(24),通过管道系统(2)连接;
所述配气系统(1)通过管道系统(2)和管道连接器(3)与生产系统(23)密封相连,由配气系统(1)提供生产系统(23)生产细胞所需气体;
所述生产系统(23)包括第一容器(9)、装配在第一容器(9)上的电动机(22)、装配在第一容器(9)内的搅拌器(10)、第一容器中生产细胞(8)、第一容器中微载体(7)和第一容器中培养基(11),装配在第一容器(9)内的搅拌器(10)由电机轴(6)带动旋转,第一容器中生产细胞(8)、第一容器中微载体(7)和第一容器中培养基(11)自第一容器(9)的进料口(5)投入第一容器(9)内,由控温系统(4)控制生产系统(23)温度;
所述的收集系统(24)包括倒锥形的第二容器(14)、第二容器中生产细胞(25)及第二容器中微载体(26),第二容器的底部为出料口(17),用于收集第二容器中生产细胞(25)及第二容器中微载体(26);
生产系统(23)与收集系统(24)通过输送管上的第一泵(12)和减压阀控制第一容器中微载体(7)、生长在第一容器中微载体(7)表面的第一容器中生产细胞(8)和第一容器中培养基(11)被输送到收集系统(24),以及回流管上的第二泵(13)将第二容器(14)内多余的第二容器中培养基(16)自回流口(15)回流至生产系统(23)的第一容器(9)内。
2.根据权利要求1所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,所述的管道系统(2)通过管道连接器(3)和法兰(18)将配气系统(1)和生产系统(23)密闭连接。
3.根据权利要求1所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,生产系统(23)中,第一容器(9)的下部有第一容器的出液口(19)经第二减压阀(30)和第一泵(12),将生产系统(23)中完成生产的第一容器中微载体(7)和生长在第一容器中微载体(7)表面的第一容器中生产细胞(8)自第二容器的进液口(21)输送至收集系统(24)的第二容器(14)内;在第一容器(9)的中部连接有培养基输送管(31),连接了第一减压阀(29)的培养基输送管(31)的另一端连接在第一容器的出液口(19)和第一泵(12)之间,将生产系统(23)中的第一容器中培养基(11)输送入收集系统(24)的第二容器(14)中。
4.根据权利要求3所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于所述第一容器(9)和第二容器(14)采用经过防止细胞黏附处理的50 mL-60 L石英培养容器或者普通培养容器。
5.根据权利要求3所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,所述的培养基输送管(31)中设有培养基输送管滤膜(28),阻截第一容器中微载体(7)和第一容器中生产细胞(8),所述培养基输送管滤膜(28)包括可更换卡扣式滤膜。
6.根据权利要求1所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,所述的第一容器中生产细胞(8)为包含脐带间充质干细胞的贴壁黏附性生长细胞;所述的第一容器中微载体(7)为直径20-200 μm无细胞毒性且可满足细胞黏附性生长特性的微米材料。
7.根据权利要求1所述的一种用于自动化可持续大规模3D细胞生产系统装置,其特征在于,所述的回流口(15)设有回流口滤膜(27),阻截收集系统(24)内的第二容器中微载体(26)和第二容器中生产细胞(25),所述回流口滤膜(27)包括可更换卡扣式滤膜。
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CN202121720895.8U CN216155857U (zh) | 2021-07-27 | 2021-07-27 | 一种用于自动化可持续大规模3d细胞生产系统装置 |
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CN116606713A (zh) * | 2023-07-12 | 2023-08-18 | 无锡海拓环保装备科技有限公司 | 一种菌群培养装置 |
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2021
- 2021-07-27 CN CN202121720895.8U patent/CN216155857U/zh active Active
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
GR01 | Patent grant | ||
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