CN110038497A - 一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法 - Google Patents

一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法，本发明通过设置第一容器、第二容器和混合存储器，实现了用于制备微球的主要原料氧化石墨烯/壳聚糖分散液的持续供给；通过设置蠕动泵和接收器，实现了氧化石墨烯/壳聚糖分散液在氢氧化钠水溶液中能够连续自动生成微球；通过设置离心分离器，可以将接收器内生成的微球不断分离出来；通过设置氢氧化钠水溶液存储器，可以持续补充接收器内氢氧化钠水溶液的量，由此实现了氧化石墨烯/壳聚糖的连续生产。本发明的制备方法简单高效，能够实现壳聚糖微球的连续大批量制备；所制备的壳聚糖微球粒径均匀、大小可控，且具有良好的生物相容性，可用于干细胞的立体培养。

Description

一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制 备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法。
背景技术
干细胞是一种具有自我更新能力的多潜能细胞，可以分化为多种功能细胞。由于其可从成人体内提取、没有免疫原性等特点，在自身免疫性疾病、心血管疾病、神经系统疾病治疗以及组织工程等领域具有巨大的应用前景。然而，干细胞在人体，尤其是成年人体内的含量相对很少，比如成人骨髓内10,000个有核细胞中才有一个间充质干细胞。因此，在干细胞治疗等临床应用中，需要将提取、分离出来的干细胞进行快速体外扩增，同时保持其分化为多种细胞类型的能力，然后再将扩增后的干细胞植入体内用于疾病治疗或组织修复。
传统的干细胞体外扩增方法是将提取、分离的干细胞培养于细胞培养皿中，进行传代扩增。然而对于贴壁细胞来说，细胞只能在培养皿内单层生长，因此，需要进行多次消化、传代培养来扩增干细胞。这种方法不仅导致干细胞扩增效率较低，而且干细胞经过多次消化、传代会导致干细胞增殖能力下降且易引起干细胞的自然分化。基于这一问题，近年来，通过微载体立体培养干细胞实现干细胞的快速批量扩增，在干细胞治疗等领域受到越来越多的关注。微载体立体培养是将干细胞种植于微载体的内部或表面，并使其悬浮于培养基中进行培养、生长，可以克服传统培养皿培养细胞单层生长的限制，充分利用空间和营养，可以快速批量扩增干细胞。然而，如何大量制备支持干细胞立体培养的微球载体一直是相关领域的一个难题。
壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖，系甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物。壳聚糖具有优良的生物亲和性和低毒性，在人体内能被溶解酶溶解并代谢。壳聚糖微球粘附性好，表面带正电荷，利于细胞贴附生长。氧化石墨烯氧化石墨烯薄片是一种具有多种官能团的二维材料，具有优良的生物相容性和吸附能力。现有报道的氧化石墨烯/壳聚糖复合微球主要是作为吸附剂，用于吸附废水中阴离子染料。目前还未见有利用氧化石墨烯/壳聚糖微球进行干细胞立体培养的报道。
另外，现有的微球制备方法多为非连续工艺，无法实现微球的连续自动批量化生产，导致微球的粒径不均一，不利于产品稳定性和质量的提升。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法。本发明的制备方法简单高效，能够实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续大批量制备；所制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球粒径均匀、大小可控，且具有良好的生物相容性，可用于干细胞的立体培养。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的装置，包括：
第一容器，其容纳氧化石墨烯分散液；
第二容器，其容纳壳聚糖溶液；
混合存储器，所述第一容器内的氧化石墨烯分散液以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
蠕动泵，所述蠕动泵的一端与混合存储器连通，蠕动泵的另一端通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液滴入至接收器内；
接收器，其容纳氢氧化钠水溶液；所述接收器的上部开口，用于接收所述蠕动泵滴入的氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
氢氧化钠水溶液存储器，其与所述接收器连通，连续将氢氧化钠水溶液加入至接收器内；
离心分离器，所述离心分离器与接收器连通；
交联反应器，其容纳京尼平溶液，所述交联反应器与离心分离器连通。
优选的，所述混合存储器和所述接收器内均设有搅拌装置。
优选的，所述软管的管径为200-600μm。
本发明的第二方面，提供一种利用上述装置连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的方法，包括以下步骤：
(1)将第一容器内的氧化石墨烯分散液以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
(2)利用蠕动泵连续吸取混合存储器内的氧化石墨烯/壳聚糖分散液，并通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液连续滴入至盛有氢氧化钠水溶液的接收器内，搅拌反应，在接收器内形成微球；
(3)将接收器内的微球溶液连续输送至离心分离器内，分离出微球；
(4)将分离出的微球输送至盛有京尼平溶液的交联反应器内进行交联反应，交联反应后出料，即实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备。
优选的，步骤(1)中，所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液中，氧化石墨烯的浓度0.1-0.3g/100ml；壳聚糖的浓度为3-5g/100ml。
优选的，步骤(2)中，所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液的滴入速度为0.05-5mL/min。
优选的，步骤(2)中，搅拌速度为50-300rpm。
优选的，步骤(2)中，所述氢氧化钠水溶液的浓度为1-20M。
优选的，步骤(4)中，所述京尼平溶液的浓度为0.025-0.25mg/ml，交联反应的时间为2-12h。
本发明的第三方面，提供上述方法制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球。所述氧化石墨烯/壳聚糖微球的粒径为200-600μm。
本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球具有良好的生物相容性，结构稳定，粘附细胞能力强，可以使细胞贴壁生长，具有吸附和运载生长因子的能力，可以调控干细胞的增殖和分化。因此，本发明的第四方面，提供上述氧化石墨烯/壳聚糖微球在如下1)-4)至少一项中的应用：
1)干细胞的立体培养；
2)作为干细胞立体培养的微球载体；
3)促进干细胞增殖、并维持干细胞干性；
4)制备促进干细胞增殖、并维持干细胞干性的培养基。
本发明的第五方面，提供一种干细胞立体培养的方法，包括以下步骤：将干细胞接种至上述氧化石墨烯/壳聚糖微球上，然后将氧化石墨烯/壳聚糖微球悬浮于培养基中进行扩增培养。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过设置第一容器、第二容器和混合存储器，实现了用于制备微球的主要原料氧化石墨烯/壳聚糖分散液的持续供给；通过设置蠕动泵和接收器，实现了氧化石墨烯/壳聚糖分散液在氢氧化钠水溶液中能够连续自动生成微球；通过设置离心分离器，可以将接收器内生成的微球不断分离出来；通过设置氢氧化钠水溶液存储器，可以持续补充接收器内氢氧化钠水溶液的量，由此实现了氧化石墨烯/壳聚糖的连续生产。
(2)本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球粒径均匀，并且粒径大小可控。
(3)本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球具有良好的生物相容性，可适用于微载体立体培养干细胞。
附图说明：
图1：本发明的连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的装置的结构示意图；其中，1-第一容器，2-第二容器，3-混合存储器，4-蠕动泵，5-接收器，6-氢氧化钠水溶液存储器，7-离心分离器，8-交联反应器，9-输送泵，10-搅拌装置。
图2：本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球的扫描电镜图。
图3：干细胞立体培养示意图。
图4：干细胞培养在微球上后的扫描电镜图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，现有的微球制备方法多为非连续工艺，无法实现微球的连续自动批量化生产。微流控液滴技术是近年来发展起来制备微球的新方法，较常规的微球制备方法，具有制备的微球粒径可控、球形度高等优点；但是微球的产量受注射器容量影响很大，注射器内的样品耗尽即微球制备停止，必须手动向注射器内添加样品才能继续制备微球，也无法实现微球的连续制备。
基于此，本发明设计研发了一种能够实现连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的装置，其结构示意图如图1所示。该装置包括：
第一容器1，其容纳有氧化石墨烯分散液；
第二容器2，其容纳有壳聚糖溶液；
所述第一容器1内的氧化石墨烯分散液以及第二容器2内的壳聚糖溶液通过输送泵9连续加入至混合存储器3内，混合存储器3内设有搅拌装置10，通过搅拌装置搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
蠕动泵4，所述蠕动泵4的一端与混合存储器3连通，蠕动泵4的另一端通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液持续滴入至接收器5内；
接收器5，其容纳有氢氧化钠水溶液；所述接收器5的上部开口，用于接收所述蠕动泵4滴入的氧化石墨烯/壳聚糖分散液；接收器5内也设有搅拌装置，所滴入的氧化石墨烯/壳聚糖分散液与氢氧化钠水溶液混合后，在搅拌状态下可自动生成微球。
离心分离器7与接收器5连通；所述离心分离器7为常规的离心分离装置，用于将微球从溶液中分离出来。
由于接收器5内的溶液会连续流入至离心分离器7内，因此，本发明在装置中设有氢氧化钠水溶液存储器6，其与所述接收器5连通，能够连续将氢氧化钠水溶液补入至接收器5内。
为了提高微球的机械强度，本发明在装置中设置有交联反应器8，其容纳有京尼平溶液，所述交联反应器8与离心分离器7连通，离心分离器7中分离出来的微球在交联反应器8中进行交联处理，可以显著提高微球的机械强度。
由此，本发明实现了氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备，采用本发明装置制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球(图2)，其粒径均匀性好、机械强度高，具有良好的生物相容性，结构稳定，粘附细胞能力强，可以使细胞贴壁生长，具有吸附和运载生长因子的能力，可以调控干细胞的增殖和分化。因此，本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球可以用于干细胞的立体培养。
用于干细胞立体培养的微球需要具备一定的机械强度和结构稳定性。本发明发现，氧化石墨烯/壳聚糖分散液在氢氧化钠水溶液中生成的微球，其机械强度不足，无法用于干细胞的立体培养。因此，本发明在微球制备过程中考虑对微球的机械强度进行增强。京尼平是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，如人造骨骼、伤口包扎材料等，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，本发明采用京尼平溶液对微球进行交联处理，以提高微球的机械强度和结构稳定性。京尼平溶液的浓度和交联处理时间会影响微球的机械强度，京尼平溶液浓度越高，机械强度越大，但浓度高的京尼平溶液会影响微球的生物相容性。经综合考虑，本发明选择浓度为0.025-0.25mg/m的京尼平溶液进行交联，其既能有效提高微球的机械强度，又能保证微球的生物相容性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备
采用图1所示的装置进行氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备，步骤如下：
(1)将第一容器内的氧化石墨烯分散液(分散溶剂为乙酸水溶液)以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液中，氧化石墨烯的浓度0.2g/100ml；壳聚糖的浓度为4g/100ml。
(2)利用蠕动泵连续吸取混合存储器内的氧化石墨烯/壳聚糖分散液，并通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液连续滴入至盛有浓度为10M氢氧化钠水溶液的接收器内，滴入速度为1mL/min，搅拌反应，搅拌速度为100rpm，在接收器内形成微球。氢氧化钠水溶液存储器与所述接收器连通，能够连续将氢氧化钠水溶液补入至接收器内。
(3)将接收器内的微球溶液连续输送至离心分离器内，通过离心分离出微球。
(4)将分离出的微球输送至盛有浓度为01mg/ml京尼平溶液的交联反应器内进行交联反应，交联反应的时间为6h，交联反应后出料，即实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备；再经洗涤、干燥，即得到氧化石墨烯/壳聚糖微球。
实施例2：氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备
采用图1所示的装置进行氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备，步骤如下：
(1)将第一容器内的氧化石墨烯分散液(分散溶剂为乙酸水溶液)以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液中，氧化石墨烯的浓度0.1g/100ml；壳聚糖的浓度为5g/100ml。
(2)利用蠕动泵连续吸取混合存储器内的氧化石墨烯/壳聚糖分散液，并通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液连续滴入至盛有浓度为1M氢氧化钠水溶液的接收器内，滴入速度为0.05mL/min，搅拌反应，搅拌速度为100rpm，在接收器内形成微球。氢氧化钠水溶液存储器与所述接收器连通，能够连续将氢氧化钠水溶液补入至接收器内。
(3)将接收器内的微球溶液连续输送至离心分离器内，通过离心分离出微球。
(4)将分离出的微球输送至盛有浓度为0.25mg/ml京尼平溶液的交联反应器内进行交联反应，交联反应的时间为2h，交联反应后出料，即实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备；再经洗涤、干燥，即得到氧化石墨烯/壳聚糖微球。
实施例3：氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备
采用图1所示的装置进行氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备，步骤如下：
(1)将第一容器内的氧化石墨烯分散液(分散溶剂为乙酸水溶液)以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液中，氧化石墨烯的浓度0.3g/100ml；壳聚糖的浓度为3g/100ml。
(2)利用蠕动泵连续吸取混合存储器内的氧化石墨烯/壳聚糖分散液，并通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液连续滴入至盛有浓度为20M氢氧化钠水溶液的接收器内，滴入速度为5mL/min，搅拌反应，搅拌速度为50rpm，在接收器内形成微球。氢氧化钠水溶液存储器与所述接收器连通，能够连续将氢氧化钠水溶液补入至接收器内。
(3)将接收器内的微球溶液连续输送至离心分离器内，通过离心分离出微球。
(4)将分离出的微球输送至盛有浓度为0.025mg/ml京尼平溶液的交联反应器内进行交联反应，交联反应的时间为12h，交联反应后出料，即实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备；再经洗涤、干燥，即得到氧化石墨烯/壳聚糖微球。
试验例1：
测定实施例1-实施例3制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球的粒径和粒度分布。结果见表1。
表1：
试验例2：
将人源脂肪间充质干细胞接种在实施例1-实施例3制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球上进行立体培养(如图3所示)，分别培养1、3、5天后，检测细胞存活率。通过CCK8染色，发现与对照材料(培养皿)相比，在微球上生长的细胞增殖明显，在相同的空间内具有更多的细胞数量，扫面电镜结果显示人源脂肪间充质干细胞在微球上贴壁良好(图4)，说明本发明制备的壳聚糖微球具有很好的生物相容性；钙黄素AM-PI染色表明在氧化石墨烯/壳聚糖微球上生长的细胞保持良好的生物活性，其中，实施例1制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球的细胞存活率最高(99.5％)。在成骨和成脂诱导液的作用下，微球上收获的脂肪间充质干细胞能够分化为成骨和脂肪细胞。
结果表明，本发明制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球能够促进脂肪间充质干细胞的增殖，并能够维持细胞的干性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的装置，其特征在于，包括：
第一容器，其容纳氧化石墨烯分散液；
第二容器，其容纳壳聚糖溶液；
混合存储器，所述第一容器内的氧化石墨烯分散液以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
蠕动泵，所述蠕动泵的一端与混合存储器连通，蠕动泵的另一端通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液滴入至接收器内；
接收器，其容纳氢氧化钠水溶液；所述接收器的上部开口，用于接收所述蠕动泵滴入的氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
氢氧化钠水溶液存储器，其与所述接收器连通，连续将氢氧化钠水溶液加入至接收器内；
离心分离器，所述离心分离器与接收器连通；
交联反应器，其容纳京尼平溶液，所述交联反应器与离心分离器连通。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述混合存储器和所述接收器内均设有搅拌装置。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述软管的管径为200-600μm。
4.一种利用权利要求1-3任一项所述的装置连续制备氧化石墨烯/壳聚糖微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一容器内的氧化石墨烯分散液以及第二容器内的壳聚糖溶液连续加入至混合存储器内，搅拌均匀，形成氧化石墨烯/壳聚糖分散液；
(2)利用蠕动泵连续吸取混合存储器内的氧化石墨烯/壳聚糖分散液，并通过软管将氧化石墨烯/壳聚糖分散液连续滴入至盛有氢氧化钠水溶液的接收器内，搅拌反应，在接收器内形成微球；
(3)将接收器内的微球溶液连续输送至离心分离器内，分离出微球；
(4)将分离出的微球输送至盛有京尼平溶液的交联反应器内进行交联反应，交联反应后出料，即实现氧化石墨烯/壳聚糖微球的连续制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液中，氧化石墨烯的浓度0.1-0.3g/100ml；壳聚糖的浓度为3-5g/100ml。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氧化石墨烯/壳聚糖分散液的滴入速度为0.05-5mL/min；
优选的，搅拌速度为50-300rpm；
优选的，所述氢氧化钠水溶液的浓度为1-20M。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述京尼平溶液的浓度为0.025-0.25mg/ml，交联反应的时间为2-12h。
8.权利要求4-7任一项所述的方法制备的氧化石墨烯/壳聚糖微球。
9.权利要求8所述的氧化石墨烯/壳聚糖微球在如下1)-4)至少一项中的应用：
1)干细胞的立体培养；
2)作为干细胞立体培养的微球载体；
3)促进干细胞增殖、并维持干细胞干性；
4)制备促进干细胞增殖、并维持干细胞干性的培养基。
10.一种干细胞立体培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：将干细胞接种至权利要求8所述的氧化石墨烯/壳聚糖微球上，然后将氧化石墨烯/壳聚糖微球悬浮于培养基中进行扩增培养。
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