CN103275966B - 一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法。该方法包括：囊材溶液的配制，水相混合液的配制，油相混合液的配制，沉降剂的配制，微胶囊的制备及包被后培养等步骤。通过该方法可以制得直径为100-400微米的微胶囊，且微胶囊球形度良好，产品得率95%以上。本发明创新点在于在不经过任何改造的基础上用常规发酵罐进行微胶囊制备和发酵，真正实现了益生菌微胶囊的大规模生产，并且产品得率、球形度和分散性均优于现有工业化发酵前包被生产方法。本发明适应于饲料、食品、医药等多个领域微生物微胶囊的制备。

Description

一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法

技术领域

本发明涉及一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法，属于生物技术领域。

背景技术

微胶囊化技术在保护生物活性分子、组织和细胞以对抗不利环境方面取得了较好的成效。微胶囊技术尽管早已广泛应用于医药、化工、食品等领域，但微胶囊，尤其是以包被细胞，包括微生物细胞和动物细胞的大批量规模化生产仍然存在瓶颈，导致其应用受到一定的限制。工业化生产的设备，应该具备低生产成本、生产效率高，尽可能减少人工操作等条件。目前发酵前包被生物微胶囊生产设备，除挤压喷雾的设备比较成熟，可以满足工业化生产的需要外，其他几种方法无论是工作效率，还是机械化自动化程度都不能达到要求。而挤压喷雾法需要特殊喷头、空气压缩等装置，在用于生产过程中，喷头和空气压缩装置不但会增加设备的复杂性和成本，而且由于单个喷头生产效率低下，通常要在一个制备罐体内安装多个喷头，不但进一步增加了装置成本和复杂性，而且往往会导致微胶囊制备过程中成膜材料的通路较差，影响产品外形（球形度）和得率，且产品粒径过大，难以控制。探讨新的适于工业化生产的方法，设计适合的生产设备，是益生菌微胶囊化包被工业化生产亟待解决的问题。

本发明采用普通微生物搅拌桨式发酵罐为生物微胶囊制备设备，采用具有良好生物相容性的天然材料和温和工艺，对益生菌细胞进行微囊化，制备的生物微胶囊直接在发酵罐中培养后，得高微生物细胞密度的微胶囊产品。本发明方法操作简单、材料和设备成本低廉，是一种很好的面向工业化的微胶囊制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法。该方法利用普通微生物发酵罐实现了微生物微胶囊的工业化制备，操作简单、材料和设备成本低廉。特别地，通过该方法使微生物微胶囊的包被及微胶囊包被后的增殖培养均在发酵罐中进行，简化了操作，更适合工业化生产。本发明制备的微生物微胶囊适应于饲料、食品、医药等多个领域微生物微胶囊的制备。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法，该方法包括以下步骤：

（1）囊材溶液的配制：在普通微生物发酵系统的补料罐中配制浓度为10g/L-20g/L的海藻酸钠溶液；

（2）水相混合液的配制：按与所述海藻酸钠质量比为1∶1-1.5的比例称取碳酸钙，加入补料罐中，混合均匀，灭菌，然后冷却至35℃-38℃，加入对数生长末期的微生物种子液，至微生物密度为1×10⁶-5×10⁶cfu/ml，充分混匀作为水相；

（3）油相混合液的配制：向液体石蜡中加入司盘80作为油相，所述司盘80的体积百分含量为0.1%-0.3%，并将油相加入到发酵罐中，灭菌；

（4）沉降剂的配制：在另一补料罐中配制0.1-0.3mol/L的氯化钙溶液，灭菌；

（5）微胶囊的制备：在400～500rpm的搅拌速度下，按照水相与油相的体积比为1∶3-5的比例，将水相混合液缓慢转入发酵罐的油相中，搅拌2-5min，然后按冰醋酸与油相体积比为1∶500-600的比例加入冰醋酸，固定化10-20min，停止搅拌，再按与水相体积比1∶10-20的比例向反应体系中加入沉降剂，微胶囊缓慢沉降，依次吸走油相和水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次，得到直径为100-400微米的微胶囊；

（6）包被后培养：将适于微生物生长的培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的微生物至微生物细胞充满微胶囊内部80%以上的空间，过滤分离得到湿微胶囊产品。

进一步地，该方法还包括利用流化床干燥湿微胶囊产品从而获得干的微胶囊产品。优选地，所述流化床干燥的条件为：按质量百分比为5%-10%的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，45℃干燥3-5小时。采取上述方法主要是因为采用海藻酸盐为壁材的微胶囊产品存在一个共性问题是，由于其材料本身粘度较大，脱离水后，微胶囊之间很容易粘连在一起，干燥后粘连更加严重，几乎得不到单个的胶囊。因此本发明采用混合淀粉干燥的方法，不但有效解决了上述问题，而且成本低廉，产品最终形态和色泽都得到很大提升。

进一步地，灭菌的条件为115℃蒸汽灭菌15-25min。

进一步地，步骤（5）中吸走的油相用于下一批微胶囊的制备。由于油相是本发明制备微胶囊过程成本的主要组成部分，占微胶囊整个制备成本的90%以上，因此液体石蜡每重复利用一次可降低最终产品成本近45%，重复利用次数越多，成本降低越显著。

本发明基于乳化凝胶化原理对微生物进行微胶囊包被。其优势表现在：①直接利用普通发酵罐进行发酵前微生物微胶囊的制备及微胶囊包被后的发酵，与现有发酵前包被技术（仅在发酵罐中进行包被后的微胶囊的增殖培养）相比，降低了方法的复杂性，大大减少了设备成本。而且不需要复杂喷头的安装和高压空气压缩装置的安装；②本发明微生物微胶囊的制备基于乳化凝胶化原理，比现有挤压喷雾法的发酵前包被具有更好的球形度、产品得率和单分散性，其产品得率可达95%以上，单分散系数CV值小于30%，可用于水产行业益生菌类饲料添加剂的生产和使用；③包被属于发酵前包被，通过包被后的培养，使菌体可继续在微胶囊微环境下增殖，细胞密度大小可控，并可达到比后包埋更高的微囊化菌体密度；前包被大大减少了微囊化过程细胞的利用量，避免了后包埋过程由于受细胞密度影响而造成的微囊化效率和产率较低的不利因素，更易于得到形态和稳定性更好的微囊化产品，也更有利于微生物细胞保持更高的活性；④将微囊化微生物发酵并干燥后，转变成一种稳定的细粉颗粒，改变微生物存在的形态，产品具有良好的流动性和分散性，能够有效地防止菌体失活，提高微生物类产品的稳定性。体内应用时还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗的作用；可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。由此可见，本发明方法最大的优势在于大大优化了以发酵前包被微生物细胞为主的生物微胶囊的工业化生产。

附图说明

图1  微生物发酵前包被微胶囊的生产示意图。

图2  50升发酵罐生产的微囊化酵母菌示意图。

图3  50升发酵罐生产的酵母菌微胶囊粒径分布图

图4  1000升发酵罐生产的微囊化酵母菌示意图。

图5  1000升发酵罐生产的酵母菌微胶囊粒径分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。

实施例1：50升发酵罐生产酵母菌微胶囊

1、种子液的制备：将保存的酵母菌菌种接种在YPD培养基中，30±1℃，摇瓶培养8-10小时，至酵母菌生长至对数生长末期，停止培养备用。

2、囊材溶液的配制：在补料罐中加入3L水，称取45g食品级海藻酸钠，加入到补料罐中，搅拌至全部溶解，配成浓度为15g/L的海藻酸钠溶液，115℃灭菌15～20min。

3、水相混合液的配制：按与所用海藻酸钠质量比为1∶1的比例称取45gCaCO₃，加入补料罐中，混合均匀，115℃蒸汽灭菌20min，冷却至35℃左右，加入对数生长末期的微生物种子液，培养至密度为10⁶cfu/ml左右，再次充分混匀作为水相。

4、油相混合液的配制：向15L液体石蜡中加入Span80，作为油相，所述Span80的体积百分含量为0.1%。并将油相加入到50L发酵罐中，115℃蒸汽灭菌20min。

5、沉降剂的配制：在另一补料罐中配制2L浓度为0.1-0.3mol/L的氯化钙溶液，115℃蒸汽灭菌20min。

6、生物微胶囊的制备：在400～500rpm的搅拌速度下，将水相缓慢转入发酵罐油相中，至水相与油相的体积比为1∶5，保持转速，搅拌2min，然后逐滴加入30mL冰醋酸，继续保持转速，固定化10min，停止搅拌，然后按照与水相体积比为1∶10的比例往反应体系中加入沉降剂，微胶囊缓慢沉降，分离微胶囊，依次吸走油相及水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次，得微胶囊直径为100-400微米。分离后油相用于下一批微胶囊制备。

7、包被后培养：将30L YPD培养基微生物培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的微生物12小时，至微生物细胞充满微胶囊内部80%以上的空间，过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品。产品如图2所示。

其中产品得率为96.2%，用激光粒度仪测定产品粒径大约为230μm，单分散系数CV=25%，如图3所示。

实施例2：1000升发酵罐生产的酵母菌微胶囊

1、种子的制备：将保存的酵母菌菌种接种在YPD培养基中，30±1℃，摇瓶培养8-10小时，至酵母菌生长至对数生长末期，停止培养备用。

2、囊材溶液的配制：在补料罐中加入60L水，称取1.2kg食品级海藻酸钠，加入到补料罐中，搅拌至全部溶解，配成浓度为20g/L的海藻酸钠溶液，115℃灭菌15～20min。

3、水相混合液的配制：按与所用海藻酸钠质量比为1∶1.5的比例称取1.8kgCaCO₃，加入补料罐中，混合均匀，115℃蒸汽灭菌25min，冷却至38℃左右，加入对数生长末期的微生物种子液，至10⁶cfu/ml左右密度，再次充分混匀作为水相。

4、油相混合液的配制：向300L液体石蜡中加入Span80，作为油相，所述Span80的体积百分含量为0.1%。并将油相加入到1000L发酵罐中，115℃蒸汽灭菌25min。

5、沉降剂的配制：在另一补料罐中配制40L0.1-0.3mol/L的氯化钙溶液，115℃蒸汽灭菌25min。

6、生物微胶囊的制备：在400～500rpm的搅拌速度下，将水相缓慢转入发酵罐油相中，至水相与油相的体积比为1∶5，保持转速，搅拌2min，然后加入600ml冰醋酸，继续保持转速，固定化20min，停止搅拌，然后按照与水相体积比为1∶20的比例往反应体系中加入3L沉降剂，微胶囊缓慢沉降，分离微胶囊，依次吸走油相及水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次，得微胶囊直径为100-400微米。分离后油相用于下一批微胶囊制备。

7、包被后培养：将600L YPD培养基微生物培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的微生物12小时，至微生物细胞充满微胶囊内部80%以上的空间，过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品。产品如图4所示。

其中产品得率为95.3%，用激光粒度仪测定产品粒径大约为300μm，单分散系数CV=29%，如图5所示。

8、微胶囊的干燥：将按质量百分比10%的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，45℃干燥3小时，得微囊化益生菌干产品。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.一种利用普通发酵罐制备微生物发酵前包被微胶囊的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 

（1）囊材溶液的配制：在普通微生物发酵系统的补料罐中配制浓度为10g/L-20g/L的海藻酸钠溶液，灭菌； 

（2）水相混合液的配制：按与所述海藻酸钠质量比为1:1-1.5的比例称取碳酸钙，加入补料罐中，混合均匀，灭菌，然后冷却至35℃-38℃，加入对数生长末期的微生物种子液，至微生物密度为1×10⁶-5×10⁶ cfu/ml，充分混匀作为水相；

（3）油相混合液的配制：向液体石蜡中加入司盘80作为油相，所述司盘80的体积百分含量为0.1%-0.3 %，并将油相加入到发酵罐中，灭菌；

（4）沉降剂的配制：在另一补料罐中配制0.1-0.3 mol/L的氯化钙溶液，灭菌；

（5）微胶囊的制备：在400-500 rpm的搅拌速度下，按照水相与油相的体积比为1: 3-5的比例，将水相混合液缓慢转入发酵罐的油相中，搅拌2-5 min，然后按冰醋酸与油相体积比为1: 500-600的比例加入冰醋酸，固定化10-20 min，停止搅拌，再按与水相体积比1: 10-20的比例向反应体系中加入沉降剂，微胶囊缓慢沉降，依次吸走油相和水相，截留微胶囊，并用清水清洗1-2次，得到直径为100-400微米的微胶囊；

（6）包被后培养：将适于微生物生长的培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的微生物至微生物细胞充满微胶囊内部80%以上的空间，过滤分离得到湿微胶囊产品；

（7）利用流化床干燥湿微胶囊产品：按质量百分比为5%-10%的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，45℃干燥3-5小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，灭菌的条件为115℃蒸汽灭菌15-25min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中吸走的油相用于下一批微胶囊的制备。