CN105567669A - 益生菌微胶囊制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种益生菌微胶囊制剂及其制备方法，微胶囊制剂包括囊材和壁材，壁材由大豆油和Span？80组成，囊材中含有屎肠球菌和干酪乳杆菌，通过采用发酵前包被微胶囊技术，将低密度微生物细胞包裹在囊材中，继续发酵获得更高的菌体浓度和细胞活性，通过简单的分离，直接得到含有高密度屎肠球菌和干酪乳杆菌共存的双乳酸菌微胶囊制剂。本发明的有益效果为：本发明的益生菌微胶囊制剂是利用发酵前包被技术，将两种不同的乳酸菌细胞同时包被到同一微胶囊内，实现不同微生物细胞的共生；能够发挥两种乳酸菌的协同益生作用；采用发酵前包被技术，两种微生物细胞获得了再次增殖的机会，从而容易获得更高活性。

Description

益生菌微胶囊制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种益生菌微胶囊制剂及其制备方法。
背景技术
屎肠球菌作为畜禽肠道土著菌群，属于乳酸菌类。屎肠球菌对维持动物肠道菌群生态平衡起到重要作用，特别是在幼龄动物的肠道保健和疾病的防疫和治疗上有突出的表现。
干酪乳杆菌作为一种乳酸菌类益生菌，在医学和食品工程领域得到广泛应用。干酪乳杆菌具有高效降血压、降胆固醇，产生抗体免疫，增强人体免疫等功能。
屎肠球菌和干酪乳杆菌在生长过程中，不形成芽胞，抗逆性较差，在液体条件下难以长期保存。导致产品的有效成分损失较大，产品的保质期也较短，限制了其大规模应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种益生菌微胶囊制剂制备方法及其应用，是能够同时包被屎肠球菌和干酪乳杆菌两种微生物活细胞的微胶囊制备技术和产品。
本发明所采用的技术方案为：
一种益生菌发酵前包被微胶囊制剂，包括囊材和壁材，所述壁材由大豆油和Span80组成，所述囊材中含有屎肠球菌和干酪乳杆菌。
一种所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的培养：在液体培养基中，分别独立培养屎肠球菌和干酪乳杆菌至对数生长末期，制得屎肠球菌种子液和干酪乳杆菌种子液；
(2)微胶囊囊材溶液的配制：将屎肠球菌种子液和干酪乳杆菌种子液加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中，混合均匀制成种子相，其中屎肠球菌浓度为(1-3)×106cfu/ml、干酪乳杆菌浓度为(1-5)×106cfu/ml；将所述对数生长末期的屎肠球菌加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为(1-3)×106cfu/ml，同时将所述对数生长末期的干酪乳杆菌也加入到所述海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为(1-5)×106cfu/ml，混合均匀制成种子相；
(3)微胶囊壁材溶液配制：在大豆油中添加Span80，所述span80的添加量为所述大豆油体积的0.3-0.7％，混合均匀制成油相；
(4)微胶囊制剂的制备：在搅拌条件下，向所述油相中加入所述种子相，其中所述种子相与所述油相的体积比为1∶3-1∶7，混合均匀后，向混合液中滴入冰醋酸，固定化8-12分钟后，停止搅拌；待微胶囊沉降后，取待培养微胶囊，用无菌水清洗1-3次，得到待培养微胶囊；
(5)包被后培养：将所述待培养微胶囊接入到微生物培养基中，培养至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊得到益生菌微胶囊制剂。
进一步的，步骤(1)中所述液体培养基为MRS液体培养基。
进一步的，步骤(2)中所述海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液所述海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液是按以下步骤制备得到的：
I：海藻酸钠溶液的制备：配制浓度为1.0g/L的海藻酸钠溶液，灭菌，4℃保存备用；II：复合水溶液的制备：向步骤I得到的所述海藻酸钠溶液中添加与所述海藻酸钠溶液中的海藻酸钠等重量的CaCO3，混合均匀后灭菌，冷却至35℃-38℃，制得海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液。
更进一步的，所述灭菌均为在115℃下，灭菌20分钟。
进一步的，步骤(2)中所述种子相中的所述对数生长末期的屎肠球菌的浓度为2×106cfu/ml，所述种子相中的所述对数生长末期的干酪乳杆菌的浓度为3×106cfu/ml。以保证两种微生物细胞在微胶囊内能够更好的协同增殖和代谢。
进一步的，步骤(4)中所述种子相与所述油相的体积比为1∶5；所述冰醋酸与所述油相的体积比为1∶10000。冰醋酸是浓度为98％w/v的无水乙酸水溶液。
进一步的，步骤(4)中所述搅拌速度为800-1200rpm；所述固定化的时间为10分钟；所述待培养微胶囊制剂的粒径为100-400微米。
进一步的，步骤(5)中所述微生物培养基为：葡萄糖15g/l，大豆蛋白胨4.8g/l，酵母浸膏2.5g/l，柠檬酸铵1.8g/l，乙酸钠5g/l，K2HPO42g/l，吐温801ml/l，MgSO4·7H2O0.6g/l，MnSO4·4H2O：0.3g/l。
进一步的，步骤(5)中所述待培养微胶囊制剂的培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养。从而保证两种微生物细胞均能达到较高的密度。
益生菌只有具备稳定的生理活性，才能发挥其益生作用。微胶囊化技术在保护生物活性分子、组织和细胞以对抗不利环境方面取得了较好的成效，并且微胶囊内部网络状结构还能为不同的微生物细胞提供独立的生长空间，从而实现多种微生物细胞共生的微环境。如果包被的微生物细胞都为益生菌细胞，则还可实现多种益生功能并存的复合型益生菌制剂。
本发明采用发酵前包被微胶囊技术，将低密度微生物细胞包裹在囊材中，首先将屎肠球菌和干酪乳杆菌两种微生物种子细胞同时包被在同一微胶囊媒介中，通过简单的分离之后加入特定培养基进行包被后培养，使两种微生物细胞分别继续独立增殖达一定的密度，收集微胶囊，从而得到含有高密度屎肠球菌和干酪乳杆菌的微囊化双乳酸菌产品。
本发明的有益效果为：①本发明的益生菌微胶囊制剂是利用发酵前包被技术，将两种不同的乳酸菌细胞同时包被到同一微胶囊内，实现不同微生物细胞的共生；②本发明的产品为复合微生物剂型，能够发挥两种乳酸菌的协同益生作用；③采用发酵前包被技术，两种微生物细胞获得了再次增殖的机会，从而容易获得更高活性；④屎肠球菌和干酪乳杆菌稳定性较差，但将其制成微胶囊产品后，由于微胶囊的保护，能够有效地防止菌体失活，提高其产品的稳定性。在体内，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到益生菌的保健和治疗的作用；⑤可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。
附图说明
图1是实施例1中的待培养微胶囊制剂的示意图；
图2是实施例1所制备的益生菌微胶囊制剂的示意图；
图3是实施例1所制备的屎肠球菌和干酪乳杆菌的平板计数图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：
本发明所用的干酪乳杆菌选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，保藏号：CGMCC1.62；屎肠球菌选购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，保藏号：CGMCC1.2334。
实施例1
如图1和图2所示，本发明提供了一种益生菌微胶囊制剂，包括囊材和壁材，囊材中含有益生菌，益生菌为屎肠球菌和干酪乳杆菌。
一种的益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的培养：将屎肠球菌和干酪乳杆菌分别在液体培养基中，独立培养屎肠球菌至对数生长末期，成为对数生长末期的屎肠球菌；独立培养干酪乳杆菌至对数生长末期，成为对数生长末期的干酪乳杆菌；本方法要求屎肠球菌和干酪乳杆菌种子液分别独立进行培养，以保证其具有最佳的增殖活性。
(2)微胶囊囊材溶液的配制：将对数生长末期的屎肠球菌加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为2×106cfu/ml，同时将对数生长末期的干酪乳杆菌也加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为3×106cfu/ml，混合均匀制成种子相；
(3)微胶囊壁材溶液配制：在大豆油中添加Span80，Span80的添加量为大豆油体积的0.5％，混合均匀后在115℃下，灭菌20分钟，制成油相；
(4)微胶囊制剂的制备：在搅拌下，按种子相：油相的体积比为1∶5，向油相中加入种子相，混合均匀后，逐滴加入冰醋酸发生胶凝化反应，固定化后停止搅拌；直到待培养益生菌微胶囊制剂沉降后，先分离出待培养微胶囊，再用无菌水清洗3次，得到待培养微胶囊制剂；
(5)包被后培养：将待培养微胶囊制剂接入到微生物培养基中，培养至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊得到益生菌微胶囊制剂。
待培养微胶囊制剂(发酵培养前)的形态如图1所示，益生菌微胶囊制剂(发酵培养后)的形态如图2所示。由图可见，微囊化屎肠球菌和干酪乳杆菌发酵前表面结构平滑，而经发酵培养以后，微生物在微胶囊表面及内部各部位挤压空间大量繁殖，尽管两者均有轻微膨胀，但都没发现破囊现象。
微囊化的屎肠球菌和干酪乳杆菌发酵后，破囊，并采用倾注法在琼脂糖MRS培养基上培养后生成的单菌落照片，如图3所示。由图可见菌落形态为圆润，表面光滑、凸起，乳白色的菌落，为典型的乳酸菌菌落形态。菌落计数结果表明两种微生物的密度共计约为5×1011cfu/g。
屎肠球菌单菌落进行16sRNA鉴定后的结果见表1，16SrDNA测序结果如SEQIDNO：1所示；干酪乳杆菌单菌落进行16sRNA鉴定后的结果见表2，27F测序结果如SEQIDNO：2所示，1492R测序结果如SEQIDNO：3所示。
表1屎肠球菌鉴定结果
表2干酪乳杆菌鉴定结果
结果显示，单菌落存在的两种微生物菌种，分别是屎肠球菌和干酪乳杆菌。
实施例2
一种益生菌微胶囊制剂，包括囊材和壁材，囊材中含有益生菌，益生菌为屎肠球菌和干酪乳杆菌。
一种的益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的培养：将屎肠球菌和干酪乳杆菌分别在MRS液体培养基中，独立培养屎肠球菌至对数生长末期，成为对数生长末期的屎肠球菌；独立培养干酪乳杆菌至对数生长末期，成为对数生长末期的干酪乳杆菌；本方法要求屎肠球菌和干酪乳杆菌种子液分别独立进行培养，以保证其具有最佳的增殖活性。
(2)微胶囊囊材溶液的配制：先配置海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液，I：海藻酸钠溶液的制备：配制浓度为1.0g/L的海藻酸钠溶液，在115℃下，灭菌20分钟，4℃保存备用；II：复合水溶液的制备：向步骤I得到的海藻酸钠溶液中添加与海藻酸钠溶液中的海藻酸钠等重量的CaCO3，混合均匀后在115℃下，灭菌20分钟，冷却至35℃，制得海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液；
然后将对数生长末期的屎肠球菌加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为1×106cfu/ml，同时将对数生长末期的干酪乳杆菌也加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为5×106cfu/ml，混合均匀制成种子相；
(3)微胶囊壁材溶液配制：在大豆油中添加Span80，Span80的添加量为大豆油体积的0.3％，表面活性剂Span80充分分散于液体石蜡中，混合均匀后在115℃下，灭菌20分钟，制成油相；
(4)微胶囊制剂的制备：将所述油相加入发酵罐中，灭菌，然后降至室温，在400rpm搅拌下，按种子相：油相的体积比为1∶3，向油相中加入种子相，搅拌5分钟形成稳定的乳化液后，逐滴加入冰醋酸酸解碳酸钙后发生胶凝化反应，固定化反应时间为10分钟后停止搅拌；直到待培养益生菌微胶囊制剂沉降后，先通过分液漏斗分离沉降出微胶囊，再用无菌水清洗1次，得到待培养微胶囊制剂；
(5)包被后培养：将待培养微胶囊制剂接入到微生物培养基中，培养至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊得到益生菌微胶囊制剂。
实施例3
一种益生菌微胶囊制剂，包括囊材和壁材，囊材中含有益生菌，益生菌为屎肠球菌和干酪乳杆菌。
一种的益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子液的培养：将屎肠球菌和干酪乳杆菌分别在MRS液体培养基中，独立培养屎肠球菌至对数生长末期，成为对数生长末期的屎肠球菌；独立培养干酪乳杆菌至对数生长末期，成为对数生长末期的干酪乳杆菌；本方法要求屎肠球菌和干酪乳杆菌种子液分别独立进行培养，以保证其具有最佳的增殖活性。
(2)微胶囊囊材溶液的配制：先配置海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液，
I：海藻酸钠溶液的制备：配制1L浓度为1.0g/L的海藻酸钠溶液，在115℃下，灭菌20分钟，4℃保存备用；II：复合水溶液的制备：向步骤I得到的海藻酸钠溶液中添加1.0g的CaCO3，混合均匀后在115℃下，灭菌20分钟，冷却至38℃，制得海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液；
然后将对数生长末期的屎肠球菌加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为3×106cfu/ml，同时将对数生长末期的干酪乳杆菌也加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为1×106cfu/ml，混合均匀制成种子相；
(3)微胶囊壁材溶液配制：在大豆油中添加Span80，Span80的添加量为大豆油体积的0.7％，混合均匀后在115℃下，灭菌20分钟，制成油相；
(4)微胶囊制剂的制备：在1200rpm搅拌下，按种子相：油相的体积比为1∶7，向油相中加入种子相，搅拌5分钟混合均匀后，逐滴加入冰醋酸发生胶凝化反应，冰醋酸与油相的体积比为1∶10000，固定化10分钟后停止搅拌；直到待培养益生菌微胶囊制剂沉降后，先分离出待培养微胶囊，再用无菌水清洗2次，得到粒径为100-400微米的待培养微胶囊制剂；
(5)包被后培养：将待培养微胶囊制剂接入到微生物培养基中，培养至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊得到益生菌微胶囊制剂。
步骤(4)中搅拌速度为800-1200rpm；固定化的时间为8-12分钟；待培养微胶囊制剂的粒径为100-400微米。
制备培养基葡萄糖15g/l，大豆蛋白胨4.8g/l，酵母浸膏2.5g/l，柠檬酸铵1.8g/l，乙酸钠5g/l，K2HPO42g/l，吐温801ml/l，MgSO4·7H2O0.6g/l，MnSO4·4H2O：0.3g/l。
步骤(5)中微生物培养基的培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养。从而保证两种微生物细胞均能达到较高的密度。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种益生菌发酵前包被微胶囊制剂，包括囊材和壁材，其特征在于：所述壁材由大豆油和Span80组成，所述囊材中含有屎肠球菌和干酪乳杆菌。
2.一种如权利要求1所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)种子液的培养：在液体培养基中，分别独立培养屎肠球菌和干酪乳杆菌至对数生长末期，制得屎肠球菌种子液和干酪乳杆菌种子液；
(2)微胶囊囊材溶液的配制：将屎肠球菌种子液和干酪乳杆菌种子液加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中，混合均匀制成种子相，其中屎肠球菌浓度为(1-3)×106cfu/ml、干酪乳杆菌浓度为(1-5)×106cfu/ml；将所述对数生长末期的屎肠球菌加入到海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为(1-3)×106cfu/ml，同时将所述对数生长末期的干酪乳杆菌也加入到所述海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液中至其浓度为(1-5)×106cfu/ml，混合均匀制成种子相；
(3)微胶囊壁材溶液配制：在大豆油中添加Span80，所述Span80的添加量为所述大豆油体积的0.3-0.7％，混合均匀制成油相；
(4)微胶囊制剂的制备：在搅拌条件下，向所述油相中加入所述种子相，其中所述种子相与所述油相的体积比为1∶3-1∶7，混合均匀后，向混合液中滴入冰醋酸，固定化8-12分钟后，停止搅拌；待微胶囊沉降后，取待培养微胶囊，用无菌水清洗1-3次，得到待培养微胶囊；
(5)包被后培养：将所述待培养微胶囊接入到微生物培养基中，培养至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊得到益生菌微胶囊制剂。
3.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述液体培养基为MRS液体培养基。
4.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液是按以下步骤制备得到的：
I：海藻酸钠溶液的制备：配制浓度为1.0g/L的海藻酸钠溶液，灭菌，4℃保存备用；II：复合水溶液的制备：向步骤I得到的所述海藻酸钠溶液中添加与所述海藻酸钠溶液中的海藻酸钠等重量的CaCO3，混合均匀后灭菌，冷却至35℃-38℃，制得海藻酸钠-碳酸钙复合水溶液。
5.根据权利要求4所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：所述灭菌均为在115℃下，灭菌20分钟。
6.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述种子相中的所述对数生长末期的屎肠球菌的浓度为2×106cfu/ml，所述种子相中的所述对数生长末期的干酪乳杆菌的浓度为3×106cfu/ml。
7.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述种子相与所述油相的体积比为0∶5；所述冰醋酸与所述油相的体积比为1∶10000。
8.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述搅拌速度为800-1200rpm；所述固定化的时间为10分钟；所述待培养微胶囊制剂的粒径为100-400微米。
9.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述微生物培养基为：葡萄糖15g/l，大豆蛋白胨4.8g/l，酵母浸膏2.5g/l，柠檬酸铵1.8g/l，乙酸钠5g/l，K2HPO42g/l，吐温801ml/l，MgSO4·7H2O0.6g/l，MnSO4·4H2O：0.3g/l。
10.根据权利要求2所述的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述待培养微胶囊制剂的培养条件为：37℃，150rpm转速，恒温培养。
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