CN101671637A - 一种肠道益生菌固态营养载体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的是一种肠道益生菌固态营养载体培养方法：是将益生菌用发酵容器在适宜的培养基中进行分别培养或混合培养一段时间，发酵液中益生菌总数达到1.0×104－1.0×109/mL，此培养液作为种子，然后将种子接入一种适宜的固态营养载体中，可分别接种单独培养，亦可多菌种混合接种培养，混合均匀，然后将接种的固态营养载体在一定温度范围内注入密闭的无菌培养容器中，然后冷却凝固，置于20℃－45℃下培养一段时间即可。本发明生产的固态营养载体益生菌不需要分离冻干，可直接作为益生菌服用，常温下可长期保存，活力不但不降低且有所升高。比液态培养益生菌的产品及益生菌冻干粉有诸多优点和较高的活力，其货架寿命显著的延长。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种肠道益生菌固态营养载体培养方法，生产的固态营养载体益生菌不需要分离冻干，可直接作为益生菌服用，常温下可长期保存，活力不但不降低且有所升高。比液态培养益生菌的产品及益生菌冻干粉有诸多优点和较高的活力，其货架寿命显著的延长。其方法是将两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌等乳酸菌在含有琼脂、明胶、鱼胶粉、果冻粉的营养载体上直接培养，培养一定时间后即可作为产品。
(二)技术背景
益生菌(Probiotics)是一类改善人类肠道微生态平衡，对人体健康具有调理作用的有益的微生物，它们主要是通过维护肠道的微生态平衡而起到促进人体健康的作用，它的生理学功能得到全世界科技界普遍认同。全世界每年发表关于研究益生菌的论文极其丰富，概括起来益生菌具有以下几方面的作用：
(1)提高免疫力：双歧杆菌和嗜酸乳杆菌可产生大量的免疫球蛋白。从而激活机体的免疫细胞，使得外在菌难以留存体内，达到免疫调节作用。(2)改善胃肠道功能：双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在肠道粘膜表面形成保护屏障，抵御有害菌对肠道粘膜的侵袭破坏，能产生乳酸和醋酸等酸性物质，造成不利于有害菌生长的环境，抑制有害菌的生长、繁殖，起到调节肠道菌群的作用。(3)营养作用：双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在人体肠道内发酵后可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，产生乳糖酶帮助消化乳糖。(4)通肠润便：双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在肠内可产生大量的短链脂肪酸等酸性物质，能刺激肠道蠕动，增加粪便湿度，起到通便的效果。(5)恢复因使用抗生素后而被破坏的肠道正常微生物菌群：抗生素是引起肠道菌群失调的重要因素。抗生素在杀灭有害菌的同时，也杀灭了很多的有益菌，及时补充双岐杆菌和嗜酸乳杆菌，对帮助肠道恢复菌群平衡、提高营养吸收能力是非常必要的。(6)降低胆固醇、防止动脉硬化。(7)抑制内毒素的产生，延缓衰老。(8)抑制肠道中致癌因子的产生，预防肿瘤的发生。(9)抗辐射等。因此，肠道微生态制剂的研究已成为当前世界微生物学领域一个研究重点。目前，虽然市场上益生菌产品极其丰富，但是，益生菌产品只有液体益生菌和益生菌冻干粉两种形式。而采用固态营养载体培养肠道益生菌，培养成熟，经包装后作为活性较高、且易于长期保存的固态营养载体益生菌则具有极大的创新性。这项技术的研究和开发会给人类的健康带来积极的促进意义，同时也具有重要的经济价值和社会效益。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种肠道益生菌固态营养载体培养方法，它包括两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和动物双歧杆菌这12种乳酸菌在含有琼脂、明胶、鱼胶粉、果冻粉的营养载体上，在特定的各种材质、各种形状、各种大小的密闭的无菌培养容器中直接进行培养，培养一定时间后，经过包装即可作为产品。
培养方法步骤如下：
(1)首先分别培养试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，然后培养16-72小时，然后接入三角瓶液体培养基中进行分别培养，20℃-45℃培养8-72小时，逐级进行扩大培养，然后再分别进行发酵罐发酵培养，20℃-45℃培养8-72小时，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液；
三角瓶液体培养基与发酵罐培养基制作方法为：将蛋白胨0.1-100.0克、浓度为2.0％-25％的南瓜汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的西红柿汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的胡萝卜汁5-200mL、乳清粉1.0-5.0克、大豆浸汁2.0％-25％、葡萄糖1.0-15.0克、乳糖1.0-15.0克、牛肉膏0.1-10.0克、酵母膏0.1-10.0克、柠檬酸钠0.1-10.0克、醋酸钠0.1-5.5克、磷酸氢二钾0.1-2.5克、硫酸镁0.01-0.75克，食用香精0.001-5克、色素0.001-5克，加水定容至1000毫升，pH5.0-7.0，105℃灭菌15分钟。
(2)将培养成熟的种子液按浓度为0.01-20.0％单独或混合接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀，然后将接种的固态营养载体在38℃-55℃注入到密闭的无菌培养容器中，然后冷却至38℃以下凝固，再置于20℃-45℃下培养10-120小时，观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
固态营养载体培养方法，其特征在于所述的固态营养载体制作方法为：将琼脂0.1-100.0克(可用明胶0.1-100.0克或鱼胶粉0.1-100.0克或果冻粉0.1-100.0克替代)、白砂糖1.0-200.0克、蜂蜜1.0-200克、蛋白胨0.1-10.0克、浓度为2.0％-25％的南瓜汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的西红柿汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的胡萝卜汁5-200mL、乳清粉1.0-5.0克、浓度为2.0％-25％的大豆浸汁5-200mL、葡萄糖1.0-15.0克、乳糖1.0-15.0克、牛肉膏0.1-10.0克、酵母膏0.1-10.0克、柠檬酸钠0.1-10.0克、醋酸钠0.1-5.5克、磷酸氢二钾0.1-2.5克、硫酸镁0.01-0.75克、食用香精0.001-5克、色素0.001-5克，加水定容至1000毫升，pH5.0-7.0，105℃灭菌15分钟，冷却至38℃-55℃备用。
本发明生产的固态营养载体益生菌不需要分离冻干，可直接作为益生菌服用，常温下可长期保存，活力不但不降低且有所升高。比液态培养益生菌的产品及益生菌冻干粉有诸多优点和较高的活力，其货架寿命显著的延长。
(四)具体实施方式
实施例一：
1、首先培养嗜酸乳杆菌试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，培养48小时，然后将试管斜面菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，37℃培养24小时，再逐级进行扩大培养，进行100L发酵罐培养，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液。
液体三角瓶及大罐培养基制备方法：蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。
2、将培养成熟的种子液按浓度为3.0％接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀。然后将接种的固态营养载体在44℃注入到50mL的聚乙烯塑料小盒中，密封，然后冷却至37℃凝固，再置于37℃培养室中，培养48小时。
固态营养载体制备：琼脂8.0克、白砂糖80.0克、蜂蜜20.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。冷却至44℃，置于44℃恒温水浴中备用。
3、观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
实施例二：
1、首先培养干酪乳杆菌试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，培养48小时，然后将试管斜面菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，37℃培养24小时，再逐级进行扩大培养，进行100L发酵罐培养，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液。
液体三角瓶及发酵罐培养基配方：蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。
2、将培养成熟的种子液按浓度为3.0％接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀。然后将接种的固态营养载体在44℃注入到50mL的聚乙烯塑料小盒中，密封，然后冷却至37℃凝固，再置于37℃培养室中，培养48小时。
固态营养载体配方：果冻粉35.0克、白砂糖80.0克、蜂蜜20.0克、蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。冷却至44℃，置于44℃恒温水浴中备用。
3、将培养成熟的种子接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀。然后将接种的固态营养载体在44℃注入到50mL的聚乙烯塑料小盒中，密封，然后冷却至37℃凝固，再置于37℃培养室中，培养48小时。
3、观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
实施例三：
1、首先培养鼠李糖乳杆菌试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，培养48小时，然后将试管斜面菌种接入三角瓶液体培养基中进行培养，37℃培养24小时，再逐级进行扩大培养，进行100L发酵罐培养，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液。
液体三角瓶及发酵罐培养基配方：蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。
2、将培养成熟的种子液按浓度为3.0％接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀。然后将接种的固态营养载体在44℃注入到50mL的聚乙烯塑料小盒中，密封，然后冷却至37℃凝固，再置于37℃培养室中，培养48小时。
固态营养载体配方：鱼胶粉70.0克、琼脂5.0克、白砂糖80.0克、蜂蜜20.0克、蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。冷却至44℃，置于44℃恒温水浴中备用。
3、观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
实施例四：
两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌的培养方法：
1、首先分别培养试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，然后培养16-72小时，然后接入三角瓶液体培养基中进行分别培养，20℃-45℃培养8-72小时，再逐级进行扩大培养，然后再分别进行发酵罐发酵培养，20℃-45℃培养8-72小时，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液；
液体三角瓶及发酵罐培养基配方：蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。
2、将培养成熟的种子液按等比例混合，按浓度为3.0％接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀。然后将接种的固态营养载体在44℃注入到50mL的聚乙烯塑料小盒中，密封，然后冷却至37℃凝固，再置于37℃培养室中，培养48小时。
固态营养载体配方：鱼胶粉70.0克、琼脂5.0克、白砂糖80.0克、蜂蜜20.0克、蛋白胨5.0克、浓度为15％的南瓜汁100mL、浓度为15％的西红柿汁100mL、浓度为15％的胡萝卜汁100mL、乳清粉1.5克、浓度为10％的大豆浸汁100mL、葡萄糖2.0克、乳糖1.5克、牛肉膏2.0克、酵母膏2.0克、柠檬酸钠1.5克、醋酸钠1.5克、磷酸氢二钾0.5克、硫酸镁0.1克，加水定容至1000毫升，pH6.5，105℃灭菌15分钟。冷却至44℃，置于44℃恒温水浴中备用。
3、观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
Claims (4)
1、一种肠道益生菌固态营养载体培养方法其特征在于步骤如下：
(1)首先分别培养试管斜面菌种，斜面菌种培养基中加入琼脂，使琼脂浓度达到2％，然后培养16-72小时，然后接入三角瓶液体培养基中进行分别培养，20℃-45℃培养8-72小时，再逐级进行扩大培养，然后再分别进行发酵罐发酵培养，20℃-45℃培养8-72小时，使发酵液中益生菌总数达到1.0×104-1.0×109/mL，此培养液作为种子液；
(2)将培养成熟的种子液按浓度为0.01-20.0％接入制备好的固态营养载体中，彻底混合均匀，然后将接种的固态营养载体在38℃-55℃注入到密闭的无菌培养容器中，冷却至38℃以下凝固，再置于20℃-45℃下培养10-120小时，观察待长出肉眼可见的菌落，进行检验分析，包装成产品。
2、根据权利要求1所述的一种肠道益生菌固态营养载体培养方法，其特征在于所述的三角瓶液体培养基与发酵罐培养基制作方法为：将蛋白胨0.1-100.0克、浓度为2.0％-25％的南瓜汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的西红柿汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的胡萝卜汁5-200mL、乳清粉1.0-5.0克、大豆浸汁2.0％-25％、葡萄糖1.0-15.0克、乳糖1.0-15.0克、牛肉膏0.1-10.0克、酵母膏0.1-10.0克、柠檬酸钠0.1-10.0克、醋酸钠0.1-5.5克、磷酸氢二钾0.1-2.5克、硫酸镁0.01-0.75克，食用香精0.001-5克、色素0.001-5克，加水定容至1000毫升，pH5.0-7.0，105℃灭菌15分钟。
3、根据权利要求1所述的一种肠道益生菌固态营养载体培养方法，其特征在于所述的固态营养载体制作方法为：将琼脂0.1-100.0克、白砂糖1.0-200.0克、蜂蜜1.0-200.0克、蛋白胨0.1-10.0克、浓度为2.0％-25％的南瓜汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的西红柿汁5-200mL、浓度为2.0％-25％的胡萝卜汁5-200mL、乳清粉1.0-5.0克、浓度为2.0％-25％的大豆浸汁5-200mL、葡萄糖1.0-15.0克、乳糖1.0-15.0克、牛肉膏0.1-10.0克、酵母膏0.1-10.0克、柠檬酸钠0.1-10.0克、醋酸钠0.1-5.5克、磷酸氢二钾0.1-2.5克、硫酸镁0.01-0.75克、食用香精0.001-5克、色素0.001-5克，加水定容至1000毫升，pH5.0-7.0，105℃灭菌15分钟，冷却至38℃-55℃备用。
4、根据权利要求3所述的固态营养载体制作方法，其特征在于所述的琼脂0.1-100.0克可用明胶0.1-100.0克或鱼胶粉0.1-100.0克或果冻粉0.1-100.0克替代。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100317 |