CN107752039A - 一种益生菌菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种益生菌菌剂的制备方法。本发明从酸奶和泡菜中分离筛选得到高产γ‑氨基丁酸的菌剂，增加机体食欲、促进生长、调节肠道菌群，增加消化道吸收的作用，更具有促进营养物质吸收、促进生长等保健作用；本发明通过提取构树叶中黄酮类物质和野木瓜中的皂甙类物质，具有益生菌重要的生长因子，通过与益生菌的协同作用，提高益生菌的生存率，延长其作用时间，使益生菌以最大的数量到达体内，而且能够刺激肠道内源性及外源性益生菌的定植和生长，此外还能够增强益生菌的代谢活性，可增强机体的免疫功能、直接拮抗病原菌和刺激机体内源性抗菌物质的产生。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种益生菌菌剂的制备方法。
背景技术
益生菌是指能够改善宿主肠道菌群生态平衡，提高宿主健康水平和健康状态的活 菌制剂及其代谢产物。益生菌能够在数量和种类上补充肠道内减少或缺乏的正常微生物， 调整或维持肠道内微生物平衡，增强机体免疫功能，促进营养物质的消耗和吸收，从而达到防病治病的目地。益生菌包括枯草芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠球菌、明串珠菌、片球菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及酵母菌等。因此，益生菌在医药、农业、工业、食品和饲料等与人类生活密切相关的领域中发挥越来越重要的作用。
国内外的益生菌制剂的工业发酵中，通常采用单一菌株纯化发酵制成菌剂或由单一菌剂再复合而成，但是单一菌种研制成复合益生菌制剂，其在肠道微环境中也存在协同作用不好，相容性差等问题。因此，由单一菌剂发酵转向混菌发酵是国内外益生菌制剂的重要发展趋势，但目前混菌发酵的细菌大多由专性厌氧菌组成，通常是由两种或两种以上的肠道菌种通过混合厌氧发酵而成，这种混合厌氧发酵方式设备复杂，工艺繁琐，必须严格控制厌氧环境，制备成本高。
综上所述，目前国内对益生菌制剂的研究过程中，缺乏将需氧发酵和厌氧发酵相结合的混合发酵方法制备的益生菌制剂，即使将多个单一菌种研制成复合益生菌制剂，其在肠道微环境中也存在协同作用不好，相容性差、成本高等问题，除此之外，益生菌制剂在口服时，容易受到胃酸和胆汁的作用，在达到起效部位肠道之前活菌数会大幅度下降，从而影响益生菌产品的疗效或保健作用。
因此，我们有必要重新的研制出一款新型的益生菌制剂，以此来解决现如今市场上的益生菌制剂间所存在的问题，以此更好的适应于社会与有关行业的需求，这也将是一件十分有意义的事情。
发明内容
4.本发明所要解决的技术问题：针对目前益生菌制剂其在肠道微环境中协同作用不好，在口服时，容易受到胃酸和胆汁的作用，在达到起效部位肠道之前活菌数会大幅度下降，从而影响益生菌产品的疗效或保健作用的问题，提供一种益生菌菌剂的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种益生菌菌剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶加入生理盐水中，振荡，接种至分离琼脂平板上，厌氧培养，挑取菌径最大的菌落重复划线培养2~3次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株接种至种子培养基中，培养，将培养物接种至发酵培养基中，培养，干燥，粉碎过筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温，超声提取，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A加入石油醚萃取，调节pH至2~3，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取3~4次，再用正丁醇萃取，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取70~100份步骤（1）备用的发酵物粉末，50~60份步骤（2）备用的构树叶提取物，40~50份野木瓜提取物，20~30份混合保护剂，20~35份海藻酸钠，20~25份碳酸钙，20~30份色拉油，8~12份吐温-80，乳化10~15min，得乳化液，向乳化液中加入冰醋酸，静置，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻1~2h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
所述步骤（1）中分离液体培养基：按质量份数计，取5~8份牛肉膏、10~12份蛋白胨、3~5份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.2~7.4，121℃高压灭菌15~20min；分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量1.8~2%的琼脂，即得；种子培养基：按质量份数计，取10~15份葡萄糖、8~10份酵母粉、3~5份蛋白胨、1~3份醋酸钠、0.02~0.05份硫酸镁、0.001~0.003份硫酸锰、0.001~0.004份硫酸亚铁、0.001~0.006份氯化钠、1000份蒸馏水，pH6.8~7.0，121℃高压灭菌15~20min；发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量1~2%的L-谷氨酸钠，即得。
所述步骤（1）中泡菜和酸奶与生理盐水的质量比为1：2：9；厌氧培养35~37℃厌氧培养2~3d；纯化培养菌株与种子培养基的质量比为1：50，培养条件为：30~33℃培养18~24h；培养物的接种量为5%，培养条件为：30~35℃培养2~3d。
所述步骤（2）中干燥的构树叶与质量分数为50％的乙醇溶液的质量比为1：20；膏状物与石油醚的质量比为1：5。
所述步骤（3）中干燥的野木瓜粉末与质量分数为95%的乙醇的质量比为1：10；膏状物B与超纯水的质量比为1：12。
所述步骤（4）中混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉15~20份，菊粉30~40份，甘油100~120份混合，115℃灭菌10min。
所述步骤（4）中乳化液中与冰醋酸的质量比为20：1。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明从酸奶和泡菜中分离筛选得到高产γ-氨基丁酸的菌剂，增加机体食欲、促进生长、调节肠道菌群，增加消化道吸收的作用，更具有促进营养物质吸收、促进生长等保健作用；
（2）本发明通过提取构树叶中黄酮类物质和野木瓜中的皂甙类物质，具有益生菌重要的生长因子，通过与益生菌的协同作用，提高益生菌的生存率，延长其作用时间，使益生菌以最大的数量到达体内，而且能够刺激肠道内源性及外源性益生菌的定植和生长，此外还能够增强益生菌的代谢活性，可增强机体的免疫功能、直接拮抗病原菌和刺激机体内源性抗菌物质的产生；
（3）本发明通过益生菌菌剂各组分与海藻酸钠作为原料，制备一种微胶囊形式的益生菌菌剂，通过酸化海藻酸钠包埋的水不活性钙盐，缓慢放出钙离子进行凝胶的内源凝胶法，微囊粒径分布最窄，表面光滑球形最好，径也相对要小的多，由于低pH值对益生菌的杀伤力比较大，制备的微囊具有耐酸性，保护包裹的活性物质通过胃部进入肠道，具有很好的肠溶性，分解后没有对机体有害的物质，制备过程中通过添加冷冻干燥保护剂，在冷冻干燥过程中缓解细胞膜破裂、脱水等原因致使菌体死亡，所以通过加入保护剂来减少活菌的死亡；
（4）本发明通过筛选泡菜和酸奶中活性较强的益生菌，再提取构树叶中黄酮类物质和野木瓜中的皂甙类物质，通过与益生菌的协调作用使进入机体内活性物质释放时，增强益生菌代谢活性，延长作用时间，同时也调整了肠道内微环境，提高机体肠道机能以及免疫功能，并且为了保证益生菌剂在胃部极酸性条件下失活，通过微囊技术将制剂靶向肠道，保持了益生菌的活性。
具体实施方式
酸奶和泡菜：购于乐购超市。
分离液体培养基：按质量份数计，取5~8份牛肉膏、10~12份蛋白胨、3~5份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.2~7.4，121℃高压灭菌15~20min。
分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量1.8~2%的琼脂，即得。
种子培养基：按质量份数计，取10~15份葡萄糖、8~10份酵母粉、3~5份蛋白胨、1~3份醋酸钠、0.02~0.05份硫酸镁、0.001~0.003份硫酸锰、0.001~0.004份硫酸亚铁、0.001~0.006份氯化钠、1000份蒸馏水，pH6.8~7.0，121℃高压灭菌15~20min。
发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量1~2%的L-谷氨酸钠，即得。
混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉15~20份，菊粉30~40份，甘油100~120份混合，115℃灭菌10min。
野木瓜预处理：取野木瓜洗净，按质量比1：10加入蒸馏水，匀浆，干燥，研磨粉碎，过80目筛。
一种益生菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶按质量比1：2：9加入生理盐水中，35~37℃，200 r/min振荡1~2 h，接种至分离琼脂平板上，35~37℃厌氧培养2~3 d，挑取菌径最大的菌落重复划线培养2~3次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株按质量比1：50接种至种子培养基中，30~33℃培养18~24h，将培养物按质量分数为5％的接种量接入至发酵培养基中，30~35℃培养2~3d，干燥，粉碎过100目筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶按质量比1：20加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温至50~60℃超声提取1~2h，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A按质量比1：5加入石油醚萃取，调节pH至2~3，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取2~3次，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末按质量比1：10加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡30~40 min，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B按质量比1：12加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取3~4次，再用正丁醇萃取2~3次，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取70~100份步骤（1）备用的发酵物粉末，50~60份步骤（2）备用的构树叶提取物，40~50份野木瓜提取物，20~30份混合保护剂，20~35份海藻酸钠，20~25份碳酸钙，20~30份色拉油，8~12份吐温-80，乳化10~15min，得乳化液，向乳化液中按质量比20：1加入冰醋酸，静置30min，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻1~2h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
实施例1
酸奶和泡菜：购于乐购超市。
分离液体培养基：按质量份数计，取5份牛肉膏、10份蛋白胨、3份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.2，121℃高压灭菌15~20min。
分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量1.8%的琼脂，即得。
种子培养基：按质量份数计，取10份葡萄糖、8份酵母粉、3份蛋白胨、1份醋酸钠、0.02份硫酸镁、0.001份硫酸锰、0.001份硫酸亚铁、0.001份氯化钠、1000份蒸馏水，pH6.8，121℃高压灭菌15min。
发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量1%的L-谷氨酸钠，即得。
混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉15份，菊粉30份，甘油100份混合，115℃灭菌10min。
野木瓜预处理：取野木瓜洗净，按质量比1：10加入蒸馏水，匀浆，干燥，研磨粉碎，过80目筛。
一种益生菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶按质量比1：2：9加入生理盐水中，35℃，200 r/min振荡1h，接种至分离琼脂平板上，35℃厌氧培养2 d，挑取菌径最大的菌落重复划线培养2次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株按质量比1：50接种至种子培养基中，30℃培养18h，将培养物按质量分数为5％的接种量接入至发酵培养基中，30℃培养2d，干燥，粉碎过100目筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶按质量比1：20加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温至50℃超声提取1h，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A按质量比1：5加入石油醚萃取，调节pH至2~3，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取2次，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末按质量比1：10加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡30 min，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B按质量比1：12加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取3次，再用正丁醇萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取70份步骤（1）备用的发酵物粉末，50份步骤（2）备用的构树叶提取物，40份野木瓜提取物，20份混合保护剂，20份海藻酸钠，20份碳酸钙，20份色拉油，8份吐温-80，乳化10min，得乳化液，向乳化液中按质量比20：1加入冰醋酸，静置30min，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻1h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
实施例2
酸奶和泡菜：购于乐购超市。
分离液体培养基：按质量份数计，取7份牛肉膏、11份蛋白胨、4份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.3，121℃高压灭菌17min。
分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量1.9%的琼脂，即得。
种子培养基：按质量份数计，取12份葡萄糖、9份酵母粉、4份蛋白胨、2份醋酸钠、0.03份硫酸镁、0.002份硫酸锰、0.003份硫酸亚铁、0.005份氯化钠、1000份蒸馏水，pH6.9，121℃高压灭菌17min。
发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量1%的L-谷氨酸钠，即得。
混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉17份，菊粉35份，甘油110份混合，115℃灭菌10min。
野木瓜预处理：取野木瓜洗净，按质量比1：10加入蒸馏水，匀浆，干燥，研磨粉碎，过80目筛。
一种益生菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶按质量比1：2：9加入生理盐水中，36℃，200 r/min振荡1h，接种至分离琼脂平板上，36℃厌氧培养2 d，挑取菌径最大的菌落重复划线培养2次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株按质量比1：50接种至种子培养基中，32℃培养20h，将培养物按质量分数为5％的接种量接入至发酵培养基中，32℃培养2d，干燥，粉碎过100目筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶按质量比1：20加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温至55℃超声提取1h，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A按质量比1：5加入石油醚萃取，调节pH至2，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取2次，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末按质量比1：10加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡35min，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B按质量比1：12加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取3次，再用正丁醇萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取85份步骤（1）备用的发酵物粉末，55份步骤（2）备用的构树叶提取物，45份野木瓜提取物，25份混合保护剂，30份海藻酸钠，21份碳酸钙，25份色拉油，10份吐温-80，乳化12min，得乳化液，向乳化液中按质量比20：1加入冰醋酸，静置30min，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻1h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
实施例3
酸奶和泡菜：购于乐购超市。
分离液体培养基：按质量份数计，取8份牛肉膏、12份蛋白胨、5份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.4，121℃高压灭菌20min。
分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量2%的琼脂，即得。
种子培养基：按质量份数计，取15份葡萄糖、10份酵母粉、5份蛋白胨、3份醋酸钠、0.05份硫酸镁、0.003份硫酸锰、0.004份硫酸亚铁、0.006份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.0，121℃高压灭菌20min。
发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量2%的L-谷氨酸钠，即得。
混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉20份，菊粉40份，甘油120份混合，115℃灭菌10min。
野木瓜预处理：取野木瓜洗净，按质量比1：10加入蒸馏水，匀浆，干燥，研磨粉碎，过80目筛。
一种益生菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶按质量比1：2：9加入生理盐水中，37℃，200 r/min振荡2 h，接种至分离琼脂平板上，37℃厌氧培养3 d，挑取菌径最大的菌落重复划线培养3次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株按质量比1：50接种至种子培养基中，33℃培养24h，将培养物按质量分数为5％的接种量接入至发酵培养基中，35℃培养3d，干燥，粉碎过100目筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶按质量比1：20加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温至60℃超声提取2h，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A按质量比1：5加入石油醚萃取，调节pH至3，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取3次，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末按质量比1：10加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡40 min，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B按质量比1：12加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取4次，再用正丁醇萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取100份步骤（1）备用的发酵物粉末，60份步骤（2）备用的构树叶提取物，50份野木瓜提取物，30份混合保护剂，35份海藻酸钠，25份碳酸钙，30份色拉油，12份吐温-80，乳化15min，得乳化液，向乳化液中按质量比20：1加入冰醋酸，静置30min，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻2h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
对比例：广州某生物医药有限公司生产的益生菌菌剂
方法：取实施例与对比例所制备的益生菌制剂各3g（有效囊的制品应除去胶囊），溶于27 ml pH值为7.2的缓冲液中，摇匀后，做10倍倍比稀释，从适当梯度的稀释液中吸取20μl，点种于相应的固体培养基平板上，放置20min后，送入37℃恒温培养箱中，进行适当时间的培养。根据标准NY-T 8832004检测初始的活菌数。
初始活菌数具体检测情况如表1
表1
| 检测项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例 |
| 活菌数（cfu/ml） | 8.692±0.08 | 8.987±0.05 | 9.00±0.02 | 9.12±0.07 |
取前期已经检测过活菌数的益生菌菌剂，将其分别溶于四份20ml的人工胃液中，摇匀后，放入 37℃的恒温培养箱中，检测其活菌数的变化情况。
试验后的活菌数具体检测情况如表2
表2
| 检测项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例 |
| 活菌数（cfu/ml） | 8. 16±0. 04 | 8. 75±0. 04 | 8. 98±0. 04 | 4. 57±0. 02 |
由上可知，本发明所制备的益生菌菌剂存活率高，不会受到胃酸的影响，是一种安全且高效的益生菌菌剂，值得推广和使用。
Claims (7)
1.一种益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
（1）取泡菜和酸奶加入生理盐水中，振荡，接种至分离琼脂平板上，厌氧培养，挑取菌径最大的菌落重复划线培养2~3次，得纯化培养菌株，将纯化培养菌株接种至种子培养基中，培养，将培养物接种至发酵培养基中，培养，干燥，粉碎过筛，得发酵物粉末，备用；
（2）取构树叶加入质量分数为50％的乙醇溶液混合，升温，超声提取，抽滤，取滤液，旋转蒸发，浓缩至膏状，取膏状物A加入石油醚萃取，调节pH至2~3，再加入石油醚质量分数50%的乙酸乙酯萃取，离心，取沉淀干燥，得构树叶提取物，备用；
（3）取野木瓜粉末加入质量分数为95%的乙醇，超声振荡，过滤，取滤液，将滤液减压浓缩至膏状，取膏状物B加入超纯水搅拌混合，用乙醚萃取3~4次，再用正丁醇萃取，合并萃取液，旋转蒸发，得野木瓜提取物，备用；
（4）按质量份数计，取70~100份步骤（1）备用的发酵物粉末，50~60份步骤（2）备用的构树叶提取物，40~50份野木瓜提取物，20~30份混合保护剂，20~35份海藻酸钠，20~25份碳酸钙，20~30份色拉油，8~12份吐温-80，乳化10~15min，得乳化液，向乳化液中加入冰醋酸，静置，离心，收集沉淀 ，-40℃预冻1~2h，解冻，冷冻干燥，得益生菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中分离液体培养基：按质量份数计，取5~8份牛肉膏、10~12份蛋白胨、3~5份氯化钠、1000份蒸馏水，pH7.2~7.4，121℃高压灭菌15~20min；分离琼脂培养基：分离液体培养基中其他组分不变，再加入分离液培养基质量1.8~2%的琼脂，即得；种子培养基：按质量份数计，取10~15份葡萄糖、8~10份酵母粉、3~5份蛋白胨、1~3份醋酸钠、0.02~0.05份硫酸镁、0.001~0.003份硫酸锰、0.001~0.004份硫酸亚铁、0.001~0.006份氯化钠、1000份蒸馏水，pH6.8~7.0，121℃高压灭菌15~20min；发酵培养基：种子培养基中其他组分不变，加入种子培养基质量1~2%的L-谷氨酸钠，即得。
3.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中泡菜和酸奶与生理盐水的质量比为1：2：9；厌氧培养35~37℃厌氧培养2~3d；纯化培养菌株与种子培养基的质量比为1：50，培养条件为：30~33℃培养18~24h；培养物的接种量为5%，培养条件为：30~35℃培养2~3d。
4.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中干燥的构树叶与质量分数为50％的乙醇溶液的质量比为1：20；膏状物与石油醚的质量比为1：5。
5.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中干燥的野木瓜粉末与质量分数为95%的乙醇的质量比为1：10；膏状物B与超纯水的质量比为1：12。
6.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中混合保护剂：按质量份数计，取玉米淀粉15~20份，菊粉30~40份，甘油100~120份混合，115℃灭菌10min。
7.根据权利要求1所述的益生菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中乳化液中与冰醋酸的质量比为20：1。
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