CN107916261B - 一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法 - Google Patents

一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法。该方法包含微流控通路发酵罐，用于微胶囊的制备和微囊化益生菌的培养。过程包括：第一，包被芯材(微生物细胞)和壁材混合液即水相的配制；第二，乳化体系油相混合液的配制；第三，水相的输送和挤出；第四，包被芯材的圆形微胶囊的形成和固化；第五，包被芯材的微胶囊的培养和分离。通过该方法可以制得直径为100‑600微米的微胶囊，且微胶囊球形度良好。本发明创新点在于微流控通路控制微胶囊的尺寸，以保持其具有更好地均一性。通过用安装微流控通路的发酵罐制备微胶囊和后期发酵，实现了益生菌微胶囊的规模化生产。本发明适应于饲料、食品、医药等多个领域微生物微胶囊的制备。

Description

一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
微胶囊技术在保护生物活性分子、组织和细胞以对抗不利环境方面具有工人的良好效果。随着微胶囊技术 的发展，其在包被细胞，尤其是微生物细胞的大批量规模化生产方面也取得了长足的发展。目前投入实际 生产的发酵前包被益生菌微胶囊的制备方法主要有挤压喷雾法和乳化凝胶化法。而挤压喷雾法在用于生产 过程中，单个喷头生产效率低下，很难满足规模化的要求。多个喷头，不但进一步增加了装置的成本和复 杂性，而且往往会导致微胶囊的制备过程成膜材料的通路较差，极大影响产品外形(球形度)和得率，且 产品粒径不能控制。而且挤压喷雾法在用于包被微生物细胞时，还存在微生物活性损失较大，造成最终产 品微生物活性和密度都不高等问题。乳化凝胶化法在某种程度上很好的解决了挤压喷雾法存在的一些问题， 如设备复杂，产能低，球型度差，微生物活性损失大等问题，在规模化益生菌发酵前包被领域展露出良好 的应用前景。但乳化凝胶化法存在的问题是，微胶囊的粒径很难控制，大小不均一，甚至微胶囊聚团现象 严重，导致产品分散性和均匀度不好。且由于微胶囊大小不均一，由于传质问题导致的微胶囊内部微生物 生长不均衡现象严重。这些都极大影响了微囊化发酵前包被益生菌最终产品的质量提高和品质保证。
本发明采用微流控技术，结合了乳化凝胶化法的优点，采用改装后的搅拌桨式发酵罐为生物微胶囊制备设 备生产发酵前包被益生菌微胶囊产品。不但解决了挤压喷雾存在的球型度差，产能低，微生物活性损失大 等问题，同时也是实现了设备产品采用混合淀粉高温干燥的方法进行干燥，最终得到可以实际应用的多功 能生物微胶囊产品。最终产品的良好球型度好、均一粒径和良好单分散性好，进一步提高了产品的品质。 是一种很好的面向规模化的高质量发酵前包被微胶囊制备方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法。该方法利用改装后的 微生物发酵罐实现了微生物微胶囊的工业化制备，操作简单、材料和设备成本低廉。特别地，通过该方法 采用微流控技术使制备的微生物微胶囊形态良好，粒度均一。更适合于高品质微囊化发酵前包被益生 菌产品的工业化生产。本发明适应于饲料、食品、医药等多个领域微生物微胶囊的制备。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)微流控通路及面板发酵罐的装配：在微生物发酵罐中安装微流控通路，微流控通路包括输送泵，流 量控制器，可升降主通路和固定分通路等部分。
(2)芯材(微生物细胞)和壁材混合液即水相的配制：在微生物发酵系统的补料罐中配制浓度为 1.0g/L-2.0g/L的海藻酸钠溶液，按与所述海藻酸钠质量比为1∶1-1.5的比例称取CaCO3，加入至补料罐中， 混合均匀，灭菌，然后冷却至35℃-38℃，加入对数生长末期的微生物种子液，至微生物密度为1×106-5 ×106cfu/ml，充分混匀作为水相。
(3)油相混合液的配制：向液体石蜡中加入司盘80，所述司盘80的体积百分含量为0.1％-0.3％，然后按 冰醋酸与油相体积比为1∶5000-6000的比例加入冰醋酸作为油相，按照水相与油相的体积比为1∶3-5的比 例将油相挤压通过0.22μm的过滤膜加入到发酵罐中。
(4)微胶囊的制备：将主通路降至发酵罐中油相液面以下，通过输送泵将水相经主通路和分通路输送至 油相之中，油相维持600～800rpm的搅拌速度，将水相完全输入油箱中后，继续搅拌10-20min，使微胶囊 进一步固定化，并停止搅拌，再按与水相体积比1∶10-20的比例向反应体系中加入CaCl2溶液，微胶囊缓慢 沉降，依次吸走油相和水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次。
(5)微囊化益生菌的培养：将适于微生物生长的培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化后的微生物至微 生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离得到湿微胶囊产品。通过干燥得到微囊化发酵前包被 益生菌产品。
进一步地，为了的到粒度均一可控的微胶囊产品，该方法利用微流控系统控制微胶囊的生产速率及粒径大 小和均一性。其中微流控系统包括：输送泵，流量控制器，可升降主通路和固定分通路等部分组成。
进一步的，该方法所采用油相包含有液体石蜡、司盘80和冰醋酸。这样的配比方案，使得水相在进入油 相后即可形成固化胶囊，固化胶囊容易沉积到发酵罐体底部，这样既保证了微胶囊的形态和本身的牢固性， 又不影响后面水相形成微胶囊的过程，避免了微胶囊之间的粘连和聚集。
进一步地，该方法还包括利用流化床干燥湿微胶囊产品从而获得干的微胶囊产品。所述流化床干燥的条 件为：按质量百分比为5％-10％的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，40℃干燥4小时。采取上述 方法不但能使微胶囊在干燥过程中保持良好的单分散性，成本便宜，而且40℃的干燥条件充分保证了微胶 囊内部微生物的活性，和最终产品的良好色泽。
本发明基于微流控技术，结合乳化凝胶化原理对微生物进行微胶囊包被。其优势表现在：①本发明微生物 微胶囊的制备基于基于微流控技术，能够更好的控制微胶囊粒径的大小和均匀度，比现有挤压喷雾法和乳 化凝胶化法的发酵前包被具有更好的球形度和单分散性；②包被属于发酵前包被，通过包彼后的培养，使 菌体可继续在微胶囊微环境下增殖，细胞密度大小可控；微胶囊粒度均一，不同微胶囊之间，传质一致， 因此微生物生长一致化程度更高，微囊化产品的微生物密度均匀；③将微囊化微生物发酵并干燥后，转变成一种稳定的细粉颗粒，在更好的保护了微生物活性的同时，改变了其存在的形态，产品具有良好的流动 性和分散性，和微生物活性；④微生物存在于微胶囊形成的独立微环境中，可与配伍禁忌的各种成分在同 一产品中隔开。
附图说明
图1 微流控结构示意图
图2 微流控技术的发酵前包被益生菌制备生产示意图。
图3 1000升发酵罐生产的微囊化酵母菌示意图。
图4 1000升发酵罐生产的酵母菌微胶囊粒径分布图
图5 1000升发酵罐生产的微囊化乳酸菌示意图。
图6 1000升发酵罐生产的乳酸菌微胶囊粒径分布图
图7微流控技术、挤压喷雾和乳化凝胶化制备的发酵前包被益生菌产品外观形态对比
图8微流控技术、挤压喷雾和乳化凝胶化制备的发酵前包被益生菌产品粒径分布
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范 围。
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。
实施例1：1000升发酵罐生产酵母菌微胶囊
1、种子液的制备：将保存的酵母菌菌种接种在YPD培养基中，30±1℃，摇瓶培养8-10小时，至酵母菌 生长至对数生长末期，停止培养备用。
2、芯材(微生物细胞)和壁材混合液即水相的配制：在微生物发酵系统的补料罐中加入60L水，称取120g 食品级海藻酸钠，加入到补料罐中，搅拌至全部溶解，配成浓度为2.0g/L的海藻酸钠溶液。按与所用海藻 酸钠质量比为1∶1.5的比例称取180gCaCO3，加入至补料罐中，混合均匀，115℃蒸汽灭菌25min，冷却 至38℃左右，加入对数生长未期的微生物种子液，至106cfu/ml左右密度，再次充分混匀作为水相。
3、油相混合液的配制：向300L液体石蜡中加入Span80，作为油相，所述Span80的体积百分含量为0.1％。 并将油相加入到1000L发酵罐中，115℃蒸汽灭菌25min。
4、发酵前包彼微胶囊的制备：将发酵罐内微流控系统的微孔面板降低至油相液面下10cm，在400～500rpm 的搅拌速度下，将水相通过微流控系统缓慢注入发酵罐油相中，至水相与油相的体积比为1∶5，保持转速， 搅拌10min，停止搅拌，然后按照与水相体积比为1∶10的比例往反应体系中加入0.1-0.3mol/L的氯化钙溶 液，分离微胶囊，依次吸走油相及水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次(见图1，图2)。
5、微囊化包被后微生物的培养：将600L的YPD培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的酵母菌培养12-16 小时，至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品。产品如 图3所示。
其中产品得率为93.2％，用激光粒度仪测定产品粒径大约为200μm，单分散系数CV＝21％，如图4所示。
6、微胶囊的干燥：将按质量百分比10％的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，45℃干燥3小时， 得微囊化益生菌干产品。
实施例2：1000升发酵罐生产的乳酸菌微胶囊
1、种子液的制备：将保存的乳酸菌菌种接种在MRS培养基中，30±1℃，摇瓶培养8-10小时，至酵母菌 生长至对数生长末期，停止培养备用。
2、芯材(微生物细胞)和壁材混合液即水相的配制：在微生物发酵系统的补料罐中加入60L水，称取120g 食品级海藻酸钠，加入到补料罐中，搅拌至全部溶解，配成浓度为2.0g/L的海藻酸钠溶液。按与所用海藻 酸钠质量比为1∶1.5的比例称取180gCaCO3，加入至补料罐中，混合均匀，115℃蒸汽灭菌25min，冷却 至38℃左右，加入对数生长未期的微生物种子液，至106cfu/ml左右密度，再次充分混匀作为水相。
3、油相混合液的配制：向300L液体石蜡中加入Span80，作为油相，所述Span80的体积百分含量为0.1％。 并将油相加入到1000L发酵罐中，115℃蒸汽灭菌25min。
4、发酵前包被微胶囊的制备：将发酵罐内微流控系统的微孔面板降低至油相液面下10cm，在400～500rpm 的搅拌速度下，将水相通过微流控系统缓慢注入发酵罐油相中，至水相与油相的体积比为1∶5(因为是 3L∶15L)，保持转速，搅拌10min，停止搅拌，然后按照与水相体积比为1∶10的比例往反应体系中加入 0.1-0.3mol/L的氯化钙溶液，分离微胶囊，依次吸走油相及水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次。
5、微囊化包被后微生物的培养：将600L的MRS培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化的乳酸菌培养18 小时，至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品。产品如 图5所示。
其中产品得率为97.5％，用激光粒度仪测定产品粒径大约为100μm，单分散系数CV＝20％，如图6所示。
6、微胶囊的干燥：将按质量百分比10％的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，45℃干燥3小时， 得微囊化益生菌干产品。
实施例3：微流控技术、挤压喷雾和乳化凝胶化制备的发酵前包被益生菌产品形态对比
采用实施例1的制备方法制备的微胶囊分别于目前流行的积压喷雾法和乳化凝胶化法制备的微胶囊进行形 态对比，如图7所示。由图可见基于微流控技术制备的微胶囊大小更为均一，形态更加良好。激光粒度仪 测定粒度分布结果显示，基于微流控技术制备的微胶囊粒径分布更为集中，即大小均一性好。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无 法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发 明的保护范围之列。

Claims (5)

1.一种基于微流控技术的发酵前包被益生菌制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)微流控通路及面板发酵罐的装配：在微生物发酵罐中安装微流控通路及面板，微流控通路和面板包括输送泵，流量控制器，可升降主通路，固定分通路部分；
(2)芯材微生物细胞和壁材混合液即水相的配制：在微生物发酵系统的补料罐中配制浓度为1.0g/L-2.0g/L的海藻酸钠溶液，按与所述海藻酸钠质量比为1∶1-1.5的比例称取CaCO3，加入至补料罐中，混合均匀，灭菌，然后冷却至35℃-38℃，加入对数生长末期的微生物种子液，至微生物密度为1×106-5×106cfu/ml，充分混匀作为水相；
(3)油相混合液的配制：向液体石蜡中加入司盘80制备油相1，所述司盘80的体积百分含量为0.1％-0.3％，然后按冰醋酸与油相1体积比为1∶5000-6000的比例加入冰醋酸作为油相2，按照水相与油相2的体积比为1∶3-5的比例将油相2挤压通过0.22μm的过滤膜加入到发酵罐中；
(4)微胶囊的制备：将主通路降至发酵罐中油相2液面以下，通过输送泵将水相经主通路和分通路输送至油相2之中，油相2维持600～800rpm的搅拌速度，将水相完全输入油相2中后，继续搅拌10-20min，使微胶囊进一步固定化，并停止搅拌，再按与水相体积比1∶10-20的比例向反应体系中加入CaCl2溶液，微胶囊缓慢沉降，依次吸走油相2和水相，截留微胶囊，并用清水清洗1～2次；
(5)微囊化益生菌的培养：将适于微生物生长的培养基加入到发酵罐中，培养微胶囊化后的微生物至微生物细胞充满微胶囊内部80％以上的空间，过滤分离得到湿微胶囊产品，通过干燥得到微囊化发酵前包被益生菌产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵罐带有微流控系统，所述微流控系统包括：输送泵，流量控制器，可升降主通路，固定分通路和微孔面板。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油相2包含有液体石蜡、司盘80和冰醋酸。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微生物为酵母菌、乳酸菌或双歧杆菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥为利用流化床干燥湿微胶囊产品，且所述流化床干燥的条件为：按质量百分比为5％-10％的量向微胶囊湿产品中加入淀粉，搅拌均匀，40℃干燥4小时。
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