CN104491837B - 一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，该制备方法包括以下步骤：A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化5‑10分钟；B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。发明制备方法工艺简单，成本低廉，可进行大批量规划化生产。且通过本发明的方法制备的抗菌肽制剂包封率高，稳定性好，从而提高了抗菌肽在饲料加工及储存中的稳定性和货架期，也减少了饲料投料时抗菌肽在水体中的溶失，提高了抗菌肽利用率、减少了对水体的污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是动物先天性免疫的重要组成部分，是动植物防御微生物入侵的第一道屏障，具有广谱的抗菌作用，它们对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有杀灭作用，而且有效作用浓度极低，有些甚至在nmol浓度下就可完全抑制细菌的生长。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的特点在于其杀菌机理是疏水性端螺旋直接插入细菌菌胞膜内而造成孔道，将细菌内容物泄出外而死亡，作用迅速，对耐药菌有效且细菌不易产生耐药性。抗菌肽在现行养殖条件下替代抗生素实验数据表明，可有效提高动物抗病能力，促进动物生长,因而抗菌肽具有广泛的应用前景，但由于抗菌肽自身的组成特点，在与其他原料混合、制粒过程中，抗菌肽的生物学活性会受到其他原料中多种微量元素、酸、外源酶等的极大影响，同时制粒过程中瞬时高温过程也会大大影响其生物学活性；另外抗菌肽在水体中易溶失，大大降低了其使用效果。
为提高抗菌肽的稳定性，通常利用目前通用的多肽制备技术将抗菌肽制备为肠溶包衣制剂、胶囊、微丸、微乳、脂质体、微粒、纳米粒等剂型，但微乳、复乳制剂在包封率与稳定性方面较差，无法满足抗菌肽的包封要求，而脂质体的局限在于药物用量大、包封率低、稳定性不佳，也不满足抗菌肽制剂的制备要求。而肠溶包衣制剂、微粒、微囊和纳米粒又存在制备工艺复杂，成本较高，不适于大批量规模化生产的问题，同样不适用抗菌肽制剂的制备。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，旨在解决目前对于抗菌肽制剂制备技术包封率低，稳定性差，成本高的问题。
本发明的技术方案如下：
一种抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：
A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5-10分钟；
B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；
C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌GS115/pPicZaMF57-PLE118，该抗菌肽的氨基酸序列为：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述步骤A具体为：
A1、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，形成固含量为30-40%的浓缩液；
A2、向浓缩液中加入质量分数10-20%的β环糊精、质量分数1-2%的糊精、质量分数5-10%的阿拉伯胶后利用高剪切乳化泵在2000-3000转/分钟的条件下混合5-10分钟。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述高速离心喷雾干燥机的设定条件为：雾化盘转速为3000-5000转/分钟、进风温度为140-160℃，混合液的进料量为800-1100千克/小时。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，利用震荡筛收集对喷雾干燥后形成的半成品颗粒进行筛分，控制所收集的半成品颗粒粒径范围为350-850μm。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述包衣液是由质量分数为80-90%的硬脂酸、质量分数9-18%的单硬脂酸甘油酯及质量分数为1-2%的丙三醇组成。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，所述步骤C具体为：
C1、将筛分合格后的半成品颗粒输入到流化床包衣机中，每次装料量为200kg；
C2、将包衣液的加热至70-100℃进行融化，并将融化好包衣液利用保温泵泵入流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，其中，控制流化床包衣机中包衣液喷雾速度为200-300克/分钟，进风温度为16-20℃，出风温度为30-40℃。
所述的抗菌肽制剂的制备方法，其中，融化好的包衣液暂存于包衣液配料罐中，包衣处理时，通过保温泵将包衣液配料罐中的包衣液泵入流化床包衣机，其中，该包衣液配料罐在包衣处理过程中始终进行加热保温，使包衣液温度始终保持在70-80℃。
一种抗菌剂制剂，其中，所述抗菌剂制剂采用如上所述的方法制备得到。
一种如上所述的抗菌剂制剂的应用，其中，所述抗菌剂制剂用作畜禽饲料添加剂或水产饲料添加剂。
有益效果：本发明提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，相较于使用传统的微粒、微囊、纳米粒、纳米囊技术包封抗菌肽，本发明制备方法工艺更加简单，成本低廉，可进行大批量规划化生产。且通过本发明的方法制备的抗菌肽制剂包封率高，稳定性好，从而提高了抗菌肽在饲料加工及储存中的稳定性和货架期，也减少了饲料投料时抗菌肽在水体中的溶失，提高了抗菌肽利用率、减少了对水体的污染。
具体实施方式
本发明提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明本发明提供一种抗菌肽制剂的制备方法，其中所使用的用于产生抗菌肽的抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌 GS115/pPicZaMF57-PLE118，该重组菌的构建过程如下：
重组质粒构建及筛选转化：根据酵母外源蛋白表达密码子偏好性对菌丝霉素核苷酸序列进行优化及人工合成。将人工合成的菌丝霉素核苷酸序列连接到pUC57的Aval和BamH I酶切位点间，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组质粒 pUC57-plectasin，其中菌丝霉素核苷酸序列为:GGTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAATGTCATAACCATTGTAAGTCTATTAAGGGTTACAAGGGTGGTTACTGTGCTAAGGGTGGTTTTGTTTGTAAGTGTTAC。
用Aval和BamH I双酶切重组质粒pUC57-Plectasin得到菌丝霉素基因片段并连接到毕赤酵母表达载体 pPicZaMF57 (一种α-因子信号肽突变体)的多克隆位点（Aval和BamHI），并位于 α 因子信号肽序列的下游，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组表达载体pPicZaMF57-plectasin。
毕赤酵母重组菌构建、筛选及鉴定：重组表达载体pPicZaMF57-Plectasin经Pme1酶酶切线性后, 用电转仪电击转化进入到到毕赤酵母GS115中,用含0.5-1mg/ml Zeocin(博莱霉素)的 YPD培养基筛选，30℃培养 2～3 d，筛选出阳性多拷贝转化子，初步确定菌丝霉素基因序列重组到毕赤酵母染色体组上。
将上述筛选得到的多个阳性转化子分别接种于含 2 ml BMGY培养基中的 20 ml的离心管中，30℃下 220 r/mim摇床培养 24 h。将1ml菌体转移至 10 ml BMMY诱导培养基中，30℃下 200 r/mim摇床继续培养，每 24 h补加 100 ul 100％甲醇。每 24 h取样，将培养基于 5000 r/mim离心 5 min，收集上清，对上清进行抗菌活性检测；同时对初步筛选得到的阳性转化子进行菌丝霉素目的基因PCR扩增分子鉴定。根据上述抗菌活性检测及PCR扩增分子鉴定结果，将抗菌活性最优且含有菌丝霉素目的基因的菌丝霉素重组毕赤酵母菌株命名为GS115/pPicZaMF57-PLE118。而该菌种所产生的抗菌肽的氨基酸序列为GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。
利用该菌种经发酵后产生上述抗菌肽发酵液制备抗菌肽制剂，该制备方法具体包括以下步骤：
A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5-10分钟。
进一步的，上述步骤具体为：
A1、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，形成固含量为30-40%的浓缩液。该固含量浓度适于与后续加入的辅料进行配比，以便能够有效制粒并保证所制颗粒中抗菌肽的有效含量满足要求。
A2、向浓缩液中加入质量分数10-20%的β环糊精、质量分数1-2%的糊精、质量分数5-10%的阿拉伯胶后利用高剪切乳化泵（具体型号为高剪切乳化泵0NL-140-4（2）南通市欧诺机械制造有限公司生产）在2000-2500转/分钟的条件下混合5-10分钟。经高剪切乳化泵处理后，使混合液中各组分充分混合形成乳状液。
B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒。具体地，根据混合液的物化性质及所要制备的半成品颗粒的物化性质，将所用高速离心喷雾干燥机的设定条件为：雾化盘转速为3000-5000转/分钟（最佳设定转速3500转/分钟）、进风温度为140-160℃（最优设定温度为150℃），混合液的进料量为800-1100千克/小时。上述混合液中β环糊精、糊精及阿拉伯胶与抗菌肽发酵液的充分混合，实际上通过上述混合过程，能够使抗菌肽与上述辅料在液态情况下进行微包合，且包合的较为均匀充分这种微包合有效保护了抗菌肽在喷雾干燥过程中不受外部环境因素影响，保持了其生物学活性。同时，上述的高速离心喷雾干燥机的设定条件满足了抗菌肽的造粒要求，其制得的半成品颗粒的物化性质满足后续的包衣要求。
上述抗菌肽微包合也是本发明与现有技术的区别点之一，本发明是直接从发酵液进行包合制粒，这样就减少了常规产品从发酵液制成粉剂或颗粒再包合的工艺路径。
进一步地，利用震荡筛（具体型号为YBS-1600，新乡市振泰机械有限公司生产）收集对喷雾干燥后形成的半成品颗粒进行筛分，控制所收集的半成品颗粒粒径范围为350-850μm。实验及实际生产过程中，所用的高速离心喷雾干燥机的型号为YPGII-56，常州普耐尔干燥设备有限公司生产
，当设定其混合液进料量为800~1100千克/小时，雾化盘转速3500转/分钟，进风温度为150℃时，所制得的粒径在350-850μm的半成品颗粒比重最多，因而，上述高速离心喷雾干燥机的设定条件为其最优选择。
C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品。
进一步地，所述包衣液是由质量分数为80-90%的硬脂酸、质量分数9-18%的单硬脂酸甘油酯及质量分数为1-2%的丙三醇组成。
基于以上描述，所述步骤C具体为：
C1、将筛分合格后的半成品颗粒输入到流化床包衣机中，每次装料量为200kg；
C2、将包衣液的加热至70-100℃进行融化，并将融化好包衣液利用保温泵泵入流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，结合半成品颗粒的物化性质及包衣液的性质特点设置流化床包衣机中包衣液喷雾速度为200-300克/分钟，进风温度为16-20℃，出风温度为30-40℃。
进一步地，融化好的包衣液暂存于包衣液配料罐中，包衣处理时，通过保温泵将包衣液配料罐中的包衣液泵入流化床包衣机，其中，该包衣液配料罐在包衣处理过程中始终进行加热保温，使包衣液温度始终保持在70-80℃。这样保证了包衣液始终处于溶融状态，实现了包衣处理的连续进行。
步骤C的包衣处理相当于第二次包衣，经过二次包衣，抗菌肽制剂外观呈球形，其包封率进一步提高，且其释放度也满足施用要求。本发明通过两次包衣实现了对抗菌肽高包封率的要求，其最终包合率可达90%以上，这就使得本发明抗菌肽具有高稳定性的特点。另外本发明在第二次包衣处理中使用的包衣液为疏水性包衣材料，这就使得所制得的抗菌肽制剂如果作为水产饲料添加剂在使用时，就能有效减少抗菌肽水溶失现象。
以下为对本发明的抗菌肽制剂稳定性进行的测定实验
1、本发明抗菌肽制剂的酸碱稳定性
目的：考察包合抗菌肽在在不同pH值的生物活性稳定性
试验方案：取本专利制备的抗菌肽制剂1g，精密称定，分别以不同pH值的溶剂10ml使溶解，放置4h，点样，培养16h，测定效价。
试验数据：
表1.本发明抗菌肽制剂与对照在不同pH值下的效价
从表1可以看出，包衣后产品在较宽的PH范围内（胃酸及肠道的PH范围内2~7）的较好的稳定性，减少产品在消化过程中的损失。
2、本发明抗菌肽制剂的耐酶的稳定性
目的：考察本发明的抗菌肽制剂在不同酶的稳定性
试验数据：
表2、胃蛋白酶对本发明抗菌肽制剂的影响
表3、肠蛋白酶对本发明抗菌肽制剂的影响
从表2及表3的数据可以看出，本发明的抗菌肽制剂对抗菌肽实现包合后，可耐受消化酶对其的影响，从而减少产品（抗菌肽）在消化过程中的损失。
3、本发明抗菌肽制剂的热稳定性试验
目的：考察本发明抗菌肽制剂在120℃蒸汽加热时不同时间的稳定性
试验方案：取本专利制备的抗菌肽制剂1g，精密称定，加水10ml超声使溶解，分别在120℃加热10min、20min、30 min、60 min、120 min后，点样，培养16h，测定效价，再与不加热的样品效价对比。
表4、本发明抗菌肽制剂稳定性试验数据
从表4数据可以看出，本发明的抗菌肽制剂在模拟饲料制粒温度下能保持较好的稳定性，该良好的稳定性可使本发明的抗菌肽制剂在饲料制粒过程中加热时的肽活性损失大大降低。
4、本发明抗菌肽制剂的水溶失率试验
目的：考察本发明抗菌肽制剂在在水中的溶失情况
试验方案：取本专利制备的抗菌肽制剂1g，精密称定，加水100mlPH6。3的室温水中（26~28度），30 min、60 min、120 min、180 min、240 min、300min、取样检测水中抗菌肽含量，
表5、本发明抗菌肽制剂水溶失率试验结果
从上表可以看出，本发明抗菌肽制剂经测定其在水中2小时溶失率小于20%，4小时释放率90%，本发明抗菌肽制剂在溶失率和释放率性能上都远远好于现有的抗菌肽包封技术，因而使本发明的抗菌肽制剂能够作为水产饲料添加剂使用，且由于溶失率低，相应减少了损失及对水体的污染，同时提高抗菌肽的利用率。
本发明上述两次包衣过程所使用的包衣材料价格便宜，且采取了最合理的搭配，使得本发明的制备成本大大低于现有的采用微粒、微囊、脂质体包封抗菌肽的技术。
本发明还提供一种抗菌剂制剂，其中，所述抗菌剂制剂采用如上所述的方法制备得到。
所述抗菌剂制剂可用作畜禽饲料添加剂或水产饲料添加剂，该抗菌肽制剂与饲料混合后，其稳定性好（生物活性在饲料制做前后、储存期内（二年）生物活性减失量低于5%，因而使本发明的抗菌肽制剂具有广泛的应用前景。
本发明提供一种抗菌肽制剂及其制备方法及其应用，相较于使用传统的微粒、微囊、纳米粒、纳米囊技术包封抗菌肽，本发明制备方法采取直接从发酵液进行每次包合制粒，减少了常规产品从发酵液制成粉剂或颗粒再包合的工艺路径；通过二次包合，有效保扩展了产品的稳定性及应用效果。减少了工艺环节，提高生产效率，降低生产成本。且通过本发明的工艺优化使得所制备的抗菌肽制剂包封率高，稳定性好，同时也减少了饲料投料时抗菌肽在水体中的溶失，提高了抗菌肽利用率、减少了对水体的污染。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.一种抗菌肽制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
A、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液进行浓缩，向浓缩液中加入β环糊精、糊精、阿拉伯胶进行乳化混合5-10分钟；
B、将混合液输入高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，制得半成品颗粒；
C、利用硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、丙三醇构成的包衣液在流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，制得成品；
根据酵母外源蛋白表达密码子偏好性对菌丝霉素核苷酸序列进行优化及人工合成，将人工合成的菌丝霉素核苷酸序列连接到pUC57的Aval和BamH I酶切位点间，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组质粒 pUC57-plectasin，其中菌丝霉素核苷酸序列为:GGTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAATGTCATAACCATTGTAAGTCTATTAAGGGTTACAAGGGTGGTTACTGTGCTAAGGGTGGTTTTGTTTGTAAGTGTTAC；用Aval和BamH I双酶切重组质粒pUC57-Plectasin得到菌丝霉素基因片段并连接到毕赤酵母表达载体 pPicZaMF57的多克隆位点，并位于 α 因子信号肽序列的下游，构建成含有菌丝霉素目的基因的重组表达载体pPicZaMF57-plectasin；
所述抗菌肽产生菌为毕赤酵母重组菌 GS115/pPicZaMF57-PLE118，该抗菌肽的氨基酸序列为GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY；
所述步骤A具体为：
A1、将抗菌肽产生菌的菌体发酵液浓缩，形成固含量为30-40%的浓缩液；
A2、向浓缩液中加入质量分数10-20%的β环糊精、质量分数1-2%的糊精、质量分数5-10%的阿拉伯胶后利用高剪切乳化泵在2000-2500转/分钟的条件下混合5-10分钟；
所述高速离心喷雾干燥机的设定条件为：雾化盘转速为3000-5000转/分钟、进风温度为140-160℃，混合液的进料量为800-1100千克/小时；
利用震荡筛收集对喷雾干燥后形成的半成品颗粒进行筛分，控制所收集的半成品颗粒粒径范围为350-850μm；
所述包衣液是由质量分数为80-90%的硬脂酸、质量分数9-18%的单硬脂酸甘油酯及质量分数为1-2%的丙三醇组成；
所述步骤C具体为：
C1、将筛分合格后的半成品颗粒输入到流化床包衣机中，每次装料量为200kg；
C2、将包衣液的加热至70-100℃进行融化，并将融化好包衣液利用保温泵泵入流化床包衣机中对半成品颗粒进行包衣处理，其中，控制流化床包衣机中包衣液喷雾速度为200-300克/分钟，进风温度为16-20℃，出风温度为30-40℃；
融化好的包衣液暂存于包衣液配料罐中，包衣处理时，通过保温泵将包衣液配料罐中的包衣液泵入流化床包衣机，其中，该包衣液配料罐在包衣处理过程中始终进行加热保温，使包衣液温度始终保持在70-80℃。
2.一种抗菌剂制剂，其特征在于，所述抗菌剂制剂采用如权利要求1中所述的方法制备得到。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 528515 Guangdong province Foshan Gaoming Cangjiang Industrial Park West Sand Water District Heyuan Yang Road Applicant after: GUANGDONG HINABIOTECH CO., LTD. Address before: 528515 Guangdong province Foshan Gaoming Cangjiang Industrial Park West Sand Water District Heyuan Yang Road Applicant before: Hinapharm Pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: HINAPHARM PHARMACEUTICAL CO., LTD. TO: GUANGDONG HINAPHARM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |