CN104664044A - 一种谷朊蛋白胶体颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷朊蛋白胶体颗粒及其制备方法和用途，制备方法包括：谷朊蛋白在谷氨酰胺转氨酶作用下发生交联反应，形成谷朊蛋白胶体颗粒，反应体系中添加有带伯胺基团的亲水小分子，所述带伯胺基团的亲水小分子为L-赖氨酸、氨基葡萄糖和L-谷氨酸中的至少一种，所述带伯胺基团的亲水小分子与谷朊蛋白的质量比为1:10-100。本发明在反应体系中添加了带伯胺基团的亲水小分子，谷朊蛋白发生分子间和分子内交联的同时，与带伯胺基团的亲水小分子发生交联反应，一方面可以抑制谷氨酰胺转氨酶催化谷朊蛋白中的谷氨酰胺或天冬酰胺进行去酰胺反应，另一方面由于带伯胺基团的亲水小分子含有带电荷的基团，将赋予谷朊蛋白更高的表面电荷。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质乳化剂领域，尤其涉及一种谷朊蛋白胶体颗粒及其制备方法和用途。
背景技术
谷朊粉是小麦淀粉加工的副产物，谷朊粉中含有80％左右的谷朊蛋白，其主要成分是麦醇溶蛋白和麦谷蛋白。麦醇溶蛋白为球蛋白，水化后粘性大，但无弹性。麦谷蛋白为纤维状大分子，水化后弹性良好，但无粘性。这两种蛋白赋予了谷朊蛋白黏弹的网络结构特性，赋予焙烤食品特有的质构特性。但谷朊蛋白中含有较多疏水氨基酸和无电荷氨基酸，其分子内疏水作用区域较大，在水溶液中极易聚合成团，阻碍了谷朊蛋白在水溶液环境中的应用。目前，乳化剂市场植物蛋白产品匮乏，动物蛋白价格昂贵且其安全性常受到质疑。因此利用量大价廉的谷朊粉制备谷朊蛋白胶体颗粒用作植物蛋白乳化剂，具有研究意义和实用价值。制备谷朊蛋白胶体颗粒，首先要增大谷朊蛋白溶解性或使其良好地分散于溶液体系。
目前，主要通过物理法、化学法、酶法对谷朊蛋白进行改性增加其溶解性。
物理手段改性谷朊蛋白：利用超声处理，通过空穴效应破坏谷朊蛋白间的相互作用，从而实现谷朊蛋白在水溶液环境的均匀分散。中国专利申请CN102058013A通过超声提高谷朊粉的溶解性，超声脉冲振幅为40％～100％，超声时间为40s～160s。黄达伟、马宁等人探究了超声对小麦面筋蛋白功能性质的影响，通过氮溶指数证实了超声能提高其溶解性(超声对小麦面筋蛋白功能性质的影响，食品与发酵科技，2014，50(3):42-49)。
酰化改性封闭氨基阳离子：利用乙酸酐、琥珀酸酐处理谷朊蛋白，实现氨基阳离子的酰化封闭，增加蛋白质的净负电荷，提高蛋白质分子内斥力，使蛋白空间结构舒展开，从而显著提高谷朊蛋白的溶解性。张红印等人利用琥珀酸酐对小麦面筋蛋白进行酰化改性，当温度为40℃时，加入10％(W/W)的小麦面筋蛋白及小麦面筋质量15％的琥珀酸酐进行酰化改性，提高了其溶解性、乳化性及起泡性(小麦面筋蛋白琥珀酰化改性研究，中国农业科学，2003，36(3):313-317)。
去酰胺化生成羧基阳离子：利用酸法、酶法处理，实现谷氨酰胺、天冬酰胺的去酰胺和蛋白质肽键的断裂，增加蛋白质的羧基数目，增大电荷密度，增加亲水性，从而改善蛋白的溶解性。Woodar等人利用1.0mol/L的HCL溶液，将谷朊粉置于75℃下水解30min，提高了谷朊粉的溶解性和乳化性(Prepation and properties ofacid-solubilized bluten conformation.Nutrition,1973:103-105)。
虽然，就谷朊蛋白改性而言，物理法和化学法都能有效改善谷朊蛋白的溶解性和乳化性，但是，现有的这些方法还存在着一些缺点和局限性，如蛋白改性后不利于其生物利用，有时会使氨基酸发生消旋作用等。
谷氨酰胺转氨酶是一种催化酰胺基转移的转移酶，催化蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和伯胺之间发生反应。利用该反应可以将赖氨酸引入蛋白质来改善蛋白质的营养特性。当蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体时，蛋白质在分子内或分子间形成共价键，通过该反应蛋白质分子发生交联，使得蛋白质发生结构变化，从而赋予产品特有的质构特性和粘合性能，已有研究者(贾光锋)通过直接添加谷氨酰胺转氨酶改善谷朊蛋白的乳化性质(凝胶特性)。虽然已公布的专利CN102907557A公开了一种谷朊粉的改性工艺，在pH＝5～6，20％～25％(W/W)的谷朊粉悬浊体系中直接添加1％谷氨酰胺转氨酶，但当伯胺基团不足时，谷氨酰胺转氨酶会催化谷氨酰胺或天冬酰胺进行去酰胺反应，不容易造成谷朊蛋白分子内的交联，具有不可控性。
发明内容
本发明提供了一种谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，以解决现有方法伯胺不足，引起谷氨酰胺转氨酶催化谷氨酰胺或天冬酰胺进行去酰胺反应以及分子间、分子内的交联等多种反应造成谷朊蛋白胶体颗粒点修饰不充分，产品纯度低、粒径差异大的问题。
一种谷朊蛋白胶体颗粒及其制备方法和应用，所述制备方法包括：谷朊蛋白在谷氨酰胺转氨酶作用下发生交联反应，形成谷朊蛋白胶体颗粒，反应体系中添加有带伯胺基团的亲水小分子，所述带伯胺基团的亲水小分子为L-赖氨酸、氨基葡萄糖和L-谷氨酸中的至少一种，所述带伯胺基团的亲水小分子与谷朊蛋白的质量比为1:10-100。
所述交联反应为分子内交联或分子间交联。
所述谷朊蛋白可以通过如下方法制备：
取谷朊粉，加入乙醇水溶液中进行搅拌提取，完成后分离得到上清液，除去所述上清液中的乙醇，即制得谷朊蛋白。
原料谷朊粉的谷朊蛋白中含有较多疏水氨基酸和无电荷氨基酸，其分子内疏水作用区域较大，加上难以洗脱的淀粉、脂类、纤维的存在，谷朊粉遇水即凝聚结块。利用乙醇水溶液溶解提取，可以得到乳化特性较好的麦醇溶蛋白。
因谷朊遇水即凝结成块，提取过程中需进行搅拌和调整pH值，一般情况下，整个体系的pH值为3～5，无水乙醇和水的体积比为1～3:1，谷朊粉加入量为乙醇水溶液的2～10％(W/V)，搅拌提取1小时以上。
当选用带伯胺基团的亲水小分子为L-谷氨酸、或氨基葡萄糖和L-谷氨酸的混合物时，可以采用L-谷氨酸调节提取体系的pH值，避免杂质的引入。
因乙醇沸点低于水，可以采用减压蒸馏除去上清液中的乙醇，因过高的温度会导致蛋白变性，减压蒸馏的温度应控制在55℃以下，而真空度在小于0.1MPa。当气泡不再产生时，视为乙醇除尽。
所述谷氨酰胺转氨酶可以选用链霉菌属来源的谷氨酰胺转氨酶，其用量优选为反应底物总质量的0.1％～2％，反应底物包括谷朊蛋白和带伯胺基团的亲水小分子。
优选的，所述交联反应的温度为4℃-45℃，时间为1h～24h，反应体系pH值为4-9。
交联反应形成谷朊蛋白胶体颗粒后，可以利用透析或超滤除去反应液中多余的小分子物质，然后经过灭活、喷雾干燥，制得朊谷蛋白胶体颗粒粉末。
本发明还提供了所述制备方法制得的谷朊蛋白胶体颗粒，其粒径为100nm-800nm，zeta-电位绝对值为30mV-60mV。
本发明又提供了所述胶体颗粒作为乳化稳定剂的用途。
相对于现有技术，本发明在反应体系中添加了带伯胺基团的亲水小分子，谷朊蛋白发生分子间和分子内交联的同时，与带伯胺基团的亲水小分子发生交联反应，一方面可以抑制谷氨酰胺转氨酶会催化谷朊蛋白中谷氨酰胺或天冬酰胺进行去酰胺反应，另一方面由于带伯胺基团的亲水小分子含有带电荷的基团，将赋予谷朊蛋白更高的表面电荷，使谷朊蛋白胶体颗粒自身获得更佳的在水相体系中的稳定性，能防止乳化体系因胶体颗粒的聚集而被破坏。
具体实施方式
以下实施例中使用的谷朊粉、大豆油、L-谷氨酸、L-赖氨酸、无水乙醇均是食品级市售产品，食品级谷氨酰胺转氨酶是通过市售获得。
实施例1
(1)将6％(W/V)谷朊粉和与谷朊粉质量比为1:100的L-谷氨酸放入350mL乙醇水溶液中通过磁力搅拌提取目标蛋白，乙醇与水的体积比为2.5：1；提取1h后，2000rpm离心5min，收集上清液。
(2)将收集的上清液放入500mL圆底烧瓶，置于45℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至出现二次沸腾3min后停止；收集旋蒸残留液，8000rpm离心5min，取沉淀再溶于40mL水中，并加入与谷朊粉质量比为1:100的L-谷氨酸；将复溶水溶液放入500mL圆底烧瓶，置于30℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至不再产生气泡。
(3)将占提取蛋白质量1％的谷氨酰胺转氨酶(购自泰兴市东圣食品科技有限公司)添加到二次旋蒸后的固液悬浊体系中继续旋蒸，温度为30℃，pH为4.5真空压力为0.1MPa条件下反应4h。
(4)将交联反应后的产物通过注射方式添加到40mL pH＝8.0的NaOH水溶液中，注射过程中保持磁力搅拌并控制pH在7.0-7.5的范围内；注射完成后，取100uL目标蛋白悬浊液添加到40mL水溶液中，调整pH为7.5，通过马尔文Zetasizer Nano 90S测得粒径峰值为249.9nm，zeta-电位为-31.9mV，微米级胶体颗粒在水相中基本稳定.
取6mL目标蛋白悬浊液与9mL大豆油添加到20mL菌种瓶中，15000rpm高速均质3min制得Pickering乳化体系，3天后体系未析出水相。总水相体积比为71.3％，Pickering乳化体系基本稳定。
实施例2
(1)将6％(W/V)谷朊粉放入350mL乙醇水溶液中通过磁力搅拌提取目标蛋白，乙醇与重蒸水的体积比为2.5:1，pH为4.0；提取1h后，2000rpm离心5min，收集上清液。
(2)将收集的上清液放入500mL圆底烧瓶，置于45℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至出现二次沸腾3min后停止；收集旋蒸残留液，8000rpm离心5min，取沉淀再溶于80mL重蒸水中，并添加与谷朊粉质量比为1:100的L-赖氨酸，pH为4.0；将复溶水溶液放入500mL圆底烧瓶，置于30℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至不再产生气泡。
(3)将占提取蛋白质量0.5％的谷氨酰胺转氨酶(购自泰兴市东圣食品科技有限公司)添加到二次旋蒸后的固液悬浊体系中继续旋蒸，温度为20℃，pH为4.5真空压力为0.1MPa条件下反应6h。
(4)取100uL目标蛋白悬浊液添加到40mL水溶液中，调整pH为4.0，通过马尔文Zetasizer Nano 90S测得粒径峰值为212.2nm，zeta-电位为30.1mV，微米级胶体颗粒在水相中基本稳定；取6mL目标蛋白悬浊液与9mL大豆油添加到20mL菌种瓶中，15000rpm高速均质3min制得Pickering乳化体系。3天后化体系未析出水相，与总水相体积比为70.1％，Pickering乳化体系基本稳定。
实施例3
(1)将6％(W/V)谷朊粉和与谷朊粉质量比为1:100的L-谷氨酸放入350mL乙醇水溶液中通过磁力搅拌提取目标蛋白，乙醇与水的体积比为2.5：1；提取24h后，2000rpm离心5min，收集上清液。
(2)将收集的上清液放入500mL圆底烧瓶，置于45℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至出现二次沸腾3min后停止；收集旋蒸残留液，8000rpm离心5min，取沉淀再溶于40mL重蒸水中，并添加与谷朊粉质量比为1:100的L-谷氨酸和氨基葡萄糖；将复溶水溶液放入500mL圆底烧瓶，置于30℃水浴锅中进行旋蒸，真空压力为0.1MPa，旋蒸至不再产生气泡。
(3)将占提取蛋白质量1％的谷氨酰胺转氨酶(购自泰兴市东圣食品科技有限公司)添加到二次旋蒸后的固液悬浊体系中继续旋蒸，温度为4℃，pH为4.5真空压力为0.1MPa，旋蒸24h。
(4)将交联反应后的产物通过注射方式添加到40mL pH＝8.0的NaOH水溶液中，注射过程中保持磁力搅拌并控制pH在7.0-7.5的范围内；注射完成后，取100uL目标蛋白悬浊液添加到40mL水溶液中，调整pH为7.5，通过马尔文Zetasizer Nano 90S测得粒径峰值为249.9nm，zeta-电位为-30.3mV，微米级胶体颗粒在水相中基本稳定；取6mL目标蛋白悬浊液与9mL大豆油添加到20mL菌种瓶中，15000rpm高速均质3min制得Pickering乳化体系。3天后化体系未析出水相，与总水相体积比为92.2％，Pickering乳化体系稳定。
Claims (9)
1.一种谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，包括：谷朊蛋白在谷氨酰胺转氨酶作用下发生交联反应，形成谷朊蛋白胶体颗粒，其特征在于，反应体系中添加有带伯胺基团的亲水小分子，所述带伯胺基团的亲水小分子为L-赖氨酸、氨基葡萄糖和L-谷氨酸中的至少一种，所述带伯胺基团的亲水小分子与谷朊蛋白的质量比为1:10-100。
2.如权利要求1所述的谷朊蛋白的制备方法，其特征在于，所述谷朊蛋白通过如下方法制备：
取谷朊粉，加入乙醇水溶液中进行搅拌提取，完成后分离得到上清液，除去所述上清液中的乙醇，即制得谷朊蛋白。
3.如权利要求2所述的谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，其特征在于，提取体系的pH值为3-5，谷朊粉与乙醇水溶液的重量体积百分比为2％-10％，乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为1-3:1。
4.如权利要求3所述的谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，其特征在于，所述带伯胺基团的亲水小分子为L-谷氨酸或L-谷氨酸与氨基葡萄糖的混合物，提取前用L-谷氨酸调节体系的pH值。
5.如权利要求2所述的谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，其特征在于，所述除去乙醇的方法为减压蒸馏。
6.如权利要求1所述的谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，其特征在于，所述交联反应的温度为4℃-45℃，时间为1h～24h，反应体系pH值为4-9。
7.如权利要求1所述的谷朊蛋白胶体颗粒的制备方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转氨酶选用链霉菌属来源的谷氨酰胺转氨酶，其用量为反应底物总质量的0.1％～2％。
8.如权利要求1-7任一所述的制备方法制得的谷朊蛋白胶体颗粒，其特征在于，粒径为100nm-800nm，zeta-电位绝对值为30mV-60mV。
9.如权利要求8所述的谷朊蛋白胶体颗粒作为乳化稳定剂的用途。
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