CN116590184B - 一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用 - Google Patents
一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种提升免疫力的后生元及其制备方法和应用。本发明从发酵菌种入手，成功开发出了生产配方及变温发酵工艺，通过层级发酵技术，实现了发酵周期短，易操作，代谢产物全面丰富的优点。利用此方法获得的后生元，其胞外多糖、多肽、氨基酸等的含量分别提升3％、2％和2.5％，发酵时间由常规的38小时，下降到11小时，从而提高设备利用率，降低了生产成本。并且得到的后生元功能明确，可显著提升免疫力，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2013年，西班牙人Katerina正式提出“后生元(postbiotics)”概念。2021年国际益生菌和益生元科学学会(ISAPP)发布后生元共识声明，将其定义为“对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂”。后生元是通过特定的灭活方式，使原本具有活性的微生物丧失活性和生长繁殖能力，但同时一定程度上保留了微生物结构、特性和功效。一般来说后生元可分为菌体成分和菌代谢产物，这些成分包括肽聚糖衍生的胞肽、胞外多糖(EPS)、分泌的蛋白质/肽、细菌素(如嗜酸蛋白、罗伊氏菌素等)、细胞-游离上清液、有机酸如乳酸和乙酸、维生素、短链脂肪酸(SCFA)如丁酸和丙酸盐、神经递质、生物表面活性剂等。近年来已经有不少研究探究了后生元可能存在的健康益处，目前后生元已经被应用于普通食品、营养保健品、特殊医学食品、婴幼儿食品等领域，随着后生元研究的不断深入，后生元也逐渐开始应用于预防或治疗疾病方面。
目前后生元有效组分缺乏，产品质量不稳定，功能不明确，生产工艺复杂，不能大规模生产，因此，亟需开发组分与功能明确、可工业规模化生产的后生元。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种提升免疫力的后生元制品及其制备方法和应用。该后生元能够有效解决现有产品预防病毒感染、提升免疫力效果差，产品制备工艺复杂等缺陷。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的一个方面，提供一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Nice-03，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2023年04月25日，其生物保藏号为CCTCCNO：M2023618。
本发明的第二个方面，提供一种后生元制品，其至少含有灭活的干酪乳杆菌Nice-03及其发酵代谢产物。
其中，所述发酵代谢产物包括但不限于胞外多糖、多肽和氨基酸。
本发明的第三个方面，提供上述后生元制品的制备方法，所述制备方法包括：将活化后的干酪乳杆菌Nice-03制备种子液，将所述种子液进行多级发酵处理。
本发明的第四个方面，提供上述后生元制品在制备抗病毒和/或提高免疫力的产品中的应用。
所述提高免疫力产品可以为食品或药品。
需要说明的是，在本发明中，所使用的术语“食品”应做广义的理解，其可以理解为可以使任何可以被食用的形式，因此所述食品包括普通食品和特殊食品，所述特殊食品包括保健食品和特殊医学用途配方食品；而普通食品时相对于特殊食品而言的，是适合所有人的食品。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案从发酵菌种入手，成功开发出了生产配方及变温发酵工艺，通过层级发酵技术，实现了发酵周期短，易操作，代谢产物全面丰富的优点。利用此方法获得的后生元，其胞外多糖、多肽、氨基酸等的含量分别提升3％、2％和2.5％，发酵时间由常规的38小时，下降到11小时，从而提高设备利用率，降低了生产成本。并且得到的后生元功能明确，可显著提升免疫力，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明效果验证例中后生元作用斑马鱼后T细胞减少症表型图。
图2为本发明效果验证例中后生元作用斑马鱼后T细胞数量结果图，***p<0.001，**p<0.05。
图3为本发明效果验证例中后生元作用斑马鱼后巨噬细胞减少症表型图。
图4为本发明效果验证例中后生元作用斑马鱼后巨噬细胞数量结果图，***p<0.001，**p<0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个具体实施方式中，提供一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Nice-03，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2023年04月25日，其生物保藏号为CCTCCNO：M2023618。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种后生元制品，其至少含有灭活的干酪乳杆菌Nice-03及其发酵代谢产物。
其中，所述发酵代谢产物包括但不限于胞外多糖、多肽和氨基酸。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述后生元制品的制备方法，所述制备方法包括：将活化后的干酪乳杆菌Nice-03制备种子液，将所述种子液进行多级发酵处理。
其中，活化培养基具体成分包括：低聚果糖1-5％，牛肉膏0.1-0.9％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，琼脂粉0.15-0.2％，调pH至7.0。
具体的，活化培养基具体成分为：低聚果糖3％，牛肉膏0.7％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉0.2％，调pH至7.0。
进行多级发酵处理的种子液为三级种子液。
一级种子液的制备方法包括：
将活化后的干酪乳杆菌Nice-03单菌落置于一级液体培养基，在28-30℃静置培养12-16小时即得一级种子液；
所述一级液体培养基的组成如下：低聚果糖1-5％，牛肉膏0.1-0.9％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，调pH至7.0。
具体的，液体培养基具体成分为：低聚果糖3％，牛肉膏0.7％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉0.2％，调pH至7.0。
二级种子液的制备方法包括：
将所述一级种子液按接种量0.1-1％(优选0.5％，v/v)接种于二级液体培养基中，在30-40℃(优选37℃)静置培养10-12小时即得二级种子液；
所述二级液体培养基的组成如下：乳铁蛋白0.1-0.8％，低聚异麦芽酮糖0.5-2％，牛肉膏0.1-1％，乙酸钠0.05-0.2％，吐温-80 0.05-0.2％，pH自然。
具体的，二级液体培养基具体成分为：乳铁蛋白0.5％，低聚异麦芽酮糖1％，牛肉膏0.5％，乙酸钠0.1％，吐温-80 0.1％，pH自然。
三级种子液的制备方法包括：
将所述二级种子液按接种量1-3％(优选2％，w/w)，接种于三级液体培养基中，搅拌培养，温度控制为30-40℃(优选37℃)，pH自然，培养时间12-18小时(优选为16小时)；搅拌转速控制为50-80转/分钟(优选为60转/分钟)。
所述三级液体培养基的组成包括：蛋白胨0.5-2％，低聚异麦芽酮糖2-8％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，甘氨酸0.5-2％，乙酸钠0.1-0.5％、吐温-80 0.05-0.2％，聚醚消泡剂0.05-0.2％，pH自然。
具体的，三级液体培养基的组成如下：蛋白胨1％，低聚异麦芽酮糖5％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，乙酸钠0.2％、吐温-80 0.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH自然。
所述多级发酵具体为五级发酵；具体的，五级发酵的方法包括：
将所述三级种子液按接种量1-3％(优选2％，w/w)，接种至发酵液中，在30℃条件下，控制搅拌转速为50-80转/分钟(优选为60转/分钟)，培养2-5小时进行一级发酵；2-5小时后，搅拌速度不变，发酵温度升高至35℃，pH自然，发酵培养2-6小时进行二级发酵；4-11小时后，搅拌速度不变，发酵温度降为33℃，pH调节至6.5，发酵1-2小时进行三级发酵；5-13小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至40℃，维持pH为6.5，发酵1-2小时进行四级发酵；6-15小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，加入0.05-0.2％(优选为0.1％，v/v)的肽聚糖，随后降温至20℃保持0.5-2小时(优选为1小时)进行五级发酵。
其中，所述发酵液的具体成分包括：低聚异麦芽酮糖1-5％，乳铁蛋白0.1-0.5％，蛋白胨1-3％，低聚果糖3-8％，水溶性淀粉1-5％，吐温-80 0.05-0.2％，甘氨酸0.3-0.8％，酪氨酸0.3-0.8％，聚醚消泡剂0.1-0.5％，pH自然。
本发明的又一具体实施方式中，所述发酵液的具体成分包括：低聚异麦芽酮糖3％，乳铁蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH自然。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括进行升温灭活和喷雾干燥的步骤。其中，所述升温灭活如在70℃保持1小时进行灭活处理，所述喷雾干燥设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元产品粉末。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种后生元制品的制备方法，包括以下步骤：
在无菌操作台下，将-80℃低温冰箱保藏的干酪乳杆菌LactobacilluscaseiNice-03划线到培养基平板，筛选单菌落，重复活化单菌落3次，获得纯种菌株；
挑取单菌落于100mL液体培养基(培养基置于15*200的试管中)，28-30℃静置培养12-16小时；
将以上培养好的种子液接种到三角瓶培养基中，接种量为0.5％，即二级种子培养液100mL，接入一级种子液为0.5mL，完毕后用灭菌纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养静置12h，此称为二级菌种液；
将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量为2％，即100kg种子罐培养基接入二级菌液2kg即可，60转/分钟搅拌培养，温度37℃，pH自然，罐压0.05兆帕，培养时间16小时即可达到要求；
将三级种子液接种到灭菌的发酵罐中，接种量为2％，即每100kg发酵罐中的培养基接入种子罐培养的菌种2kg，30℃，60r/min，培养2-5小时；2-5小时后，搅拌速度不变，发酵温度升高为35℃，罐压保持0.05MPa，pH自然，发酵2-6小时；4-11小时后，搅拌速度不变，发酵温度降为33℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵1-2小时；5-13小时后，搅拌速度不变，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵1-2小时；6-15小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌肽聚糖，降温至20℃保持60分钟，然后再升温至70℃保持60分钟灭活；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元制品粉末。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述后生元制品在制备抗病毒和/或提高免疫力的产品中的应用。
所述提高免疫力产品可以为食品或药品。
需要说明的是，在本发明中，所使用的术语“食品”应做广义的理解，其可以理解为可以使任何可以被食用的形式，因此所述食品包括普通食品和特殊食品，所述特殊食品包括保健食品和特殊医学用途配方食品；而普通食品时相对于特殊食品而言的，是适合所有人的食品。
所述食品包括但不限于固体食品、液体食品；所述固体食品包括但不限于烘焙食品、糖果、固体饮料等；所述液体食品包括但不限于液体饮料等。
所述药品可以单位剂量形式给药，液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型等。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、丸剂、粉剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、包合物、填埋剂等。
本发明的药品中还可以含有常用的载体，这里的可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，甘油，山梨酯，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质等。载体在药品中的含量可以是1％重量-98％重量，通常大约是占到80％重量。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种后生元的制备方法，包括以下步骤：
在无菌操作台下，将-80℃低温冰箱保藏的干酪乳杆菌LactobacilluscaseiNice-03划线到培养基(每100毫升培养基中含有低聚果糖3％，牛肉膏0.7％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉0.2％，氢氧化钾调pH至7.0)平板，筛选单菌落，重复活化单菌落3次，获得纯种菌株；
挑取单菌落于100mL液体培养基(每100毫升培养基中含有低聚果糖3％，牛肉膏0.7％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，氢氧化钾调pH至7.0，培养基置于15*200的试管中)，28-30℃静置培养12小时；
将以上培养好的种子液接种到三角瓶培养基中，接种量为0.5％，即二级种子培养液(每100毫升培养基中含有乳铁蛋白0.5％，低聚异麦芽酮糖1％，牛肉膏0.5％，乙酸钠0.1％，吐温-80 0.1％，pH自然)100mL，接入一级种子液为0.5mL，完毕后用灭菌纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养静置12h，即为二级种子液；
将上述二级种子液在无菌条件下接种到含三级种子培养液(每100毫升培养基中含有蛋白胨1％，低聚异麦芽酮糖5％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，乙酸钠0.2％、吐温-800.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH自然)的种子罐中去，接种量为2％，即100kg种子罐培养基接入二级菌液2kg即可，60转/分钟搅拌培养，温度37℃，pH自然，罐压0.05兆帕，培养时间16小时即可得三级种子液；
将三级种子液接种到灭菌的发酵罐中，接种量为2％，即每100kg发酵罐中的培养液(每100毫升培养基中含有低聚异麦芽酮糖3％，乳铁蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH值自然)接入种子罐培养的三级种子液2kg，30℃，60r/min，培养3小时；3小时后，搅拌速度不变，发酵温度升高为35℃，罐压保持0.05MPa，pH值自然，发酵4小时；7小时后，搅拌速度不变，发酵温度降为33℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵1小时；8小时后，搅拌速度不变，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH6.5，发酵1小时；9小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌肽聚糖，降温至20℃保持1小时，然后再升温至70℃保持1小时灭活；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元粉末。
通过实施例1获得的后生元，胞外多糖含量为21.2％，多肽含量为21.1％，氨基酸含量为45.2％。
实施例2
菌种活化及种子液制备步骤与实施例1相同；
将三级种子液接种到灭菌的发酵罐中，接种量为2％，即每100kg发酵罐中的培养液(每100毫升培养基中含有低聚异麦芽酮糖3％，乳铁蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH值自然)接入种子罐培养的三级种子液2kg，30℃，60r/min，培养5小时；5小时后，搅拌速度不变，发酵温度升高为35℃，罐压保持0.05MPa，pH值自然，发酵5小时；10小时后，搅拌速度不变，发酵温度降为33℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵2小时；12小时后，搅拌速度不变，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵1小时；13小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌肽聚糖，降温至20℃保持1小时，然后再升温至70℃保持1小时灭活；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元粉末。
通过实施例2获得的后生元，胞外多糖含量为21.5％，多肽含量为21.2％，氨基酸含量为45.3％。
实施例3
菌种活化及种子液制备步骤与实施例1相同；
将三级种子液接种到灭菌的发酵罐中，接种量为2％，即每100kg发酵罐中的培养液(每100毫升培养基中含有低聚异麦芽酮糖3％，乳铁蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH值自然)接入种子罐培养的菌种2kg，30℃，60r/min，培养36小时后向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌肽聚糖，降温至20℃保持1小时，然后再升温至70℃保持1小时灭活；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元粉末。
通过实施例3获得的后生元，胞外多糖含量为18.5％，多肽含量为19.2％，氨基酸含量为42.8％。
效果验证例
所述抗病毒、提升免疫力的后生元，其验证方法为：
(1)以正常发育4dpf(day post fertilization)的野生AB系斑马鱼为实验动物，并设置转基因T细胞红色荧光斑马鱼和转基因巨噬细胞荧光斑马鱼，静脉注射长春瑞滨造模斑马鱼免疫力低下模型。分别用Vc和不同浓度0.5％、0.1％、0.15％的后生元(实施例1制备产品)作用后，将各组斑马鱼置于28℃恒温培养箱培养，培养结束后观察T细胞和巨噬细胞的数量。
(2)后生元作用后，斑马鱼的T细胞和巨噬细胞的数量均有增多。
如图1、图2、图3和图4所示，经斑马鱼试验证明，本发明产品具有抗病毒、提升免疫力的作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (3)
1.一种后生元制品在制备提高免疫力的产品中的应用，其特征在于，
所述后生元制品，其至少含有灭活的干酪乳杆菌Nice-03及其发酵代谢产物；
其中，所述发酵代谢产物包括胞外多糖、多肽和氨基酸；
所述提高免疫力的产品具体表现为促进T细胞和巨噬细胞的数量增多；
所述干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Nice-03，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年04月25日，其生物保藏号为CCTCCNO：M2023618；
所述后生元制品的制备方法包括：将活化后的干酪乳杆菌Nice-03制备种子液，将所述种子液进行多级发酵处理；
其中，活化培养基的具体成分为：低聚果糖3％，牛肉膏0.7％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉0.2％，调pH至7.0；
其中，进行多级发酵处理的种子液为三级种子液；
其中，一级种子液的制备方法包括：
将活化后的干酪乳杆菌Nice-03单菌落置于一级液体培养基，在28-30℃静置培养12-16小时即得一级种子液；
二级种子液的制备方法包括：
将所述一级种子液按接种量0.1-1％接种于二级液体培养基中，在30-40℃静置培养10-12小时即得二级种子液；
三级种子液的制备方法包括：
将所述二级种子液按接种量1-3％，接种于三级液体培养基中，搅拌培养，温度控制为30-40℃，pH自然，培养时间12-18小时；搅拌转速控制为50-80转/分钟；
所述一级液体培养基的组成如下：低聚果糖1-5％，牛肉膏0.1-0.9％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，调pH至7.0；
所述二级液体培养基的组成如下：乳铁蛋白0.1-0.8％，低聚异麦芽酮糖0.5-2％，牛肉膏0.1-1％，乙酸钠0.05-0.2％，吐温-800.05-0.2％，pH自然；
所述三级液体培养基的组成包括：蛋白胨0.5-2％，低聚异麦芽酮糖2-8％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，甘氨酸0.5-2％，乙酸钠0.1-0.5％、吐温-800.05-0.2％，聚醚消泡剂0.05-0.2％，pH自然；
所述多级发酵具体为五级发酵，所述五级发酵的方法包括：
将所述三级种子液按接种量1-3％，接种至发酵液中，在30℃条件下，控制搅拌转速为50-80转/分钟，培养2-5小时进行一级发酵；2-5小时后，搅拌速度不变，发酵温度升高至35℃，pH自然，发酵培养2-6小时进行二级发酵；4-11小时后，搅拌速度不变，发酵温度降为33℃，pH调节至6.5，发酵1-2小时进行三级发酵；5-13小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至40℃，维持pH为6.5，发酵1-2小时进行四级发酵；6-15小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，加入0.05-0.2％的肽聚糖，随后降温至20℃保持0.5-2小时进行五级发酵；
其中，所述发酵液的具体成分包括：低聚异麦芽酮糖3％，乳铁蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-800.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH自然。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述制备方法还包括进行升温灭活和喷雾干燥的步骤。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述提高免疫力的产品为药品。
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