CN106434786A - 一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W的方法及一种从干酪乳杆菌发酵液中制备胞外多糖的方法。所述发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W的方法包括在有氧条件下发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W。所述从干酪乳杆菌发酵液中制备胞外多糖的方法包括发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W，从发酵液中收集胞外多糖，所述发酵为有氧条件下发酵。本发明的方法在发酵过程中胞外多糖产量显著提高，NADH氧化酶活性显著提高，乳酸产生量显著降低。所制备的胞外多糖在提高免疫力的药品、保健品或者食品的应用方面具有广阔的前景。

Description

一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法。

背景技术

胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外，常渗于培养基中的一类糖类化合物。这些高分子糖类聚合物因具有多种多样的化学组成、分子结构和独特的流变学特性，赋予发酵食品优良的功能特性，可作为增稠剂、乳化剂和稳定剂等在食品和非食品工业中发挥重要作用。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类公认的具有较高经济价值的食品级微生物，具有公认的食用安全性(Generally recognized as safe，GRAS)，其作为人和动物体内重要的正常生理菌群，常定殖于肠道等部位，起到维持体内微生态平衡和健康的作用，已广泛应用于食品、轻工业、医药、饲料等多个领域。其在发酵过程中产生的胞外多糖本身具有增稠、乳化、保湿和稳定等作用，同时还有助于改善发酵的流变学特性，减少发酵乳乳清析出现象，改善发酵乳质地和感官质量。一些乳酸菌胞外多糖还具有增强粘膜吸附、促进免疫、降低胆固醇和抗肿瘤等生理功能。因此，产胞外多糖乳酸菌在食品工业中具有广阔的市场前景。然而,乳酸菌胞外多糖的产量一般来说都比较低，因此其应用也受到一定的限制。提高胞外多糖产量的研究，目前备受关注。通过筛选优良菌种，优化发酵条件，或对菌种进行改良，可以在一定程度上提高胞外多糖的产率。近年来,随着一些乳酸菌全基因组序列的报道和胞外多糖合成相关基因簇的克隆和功能分析，使得利用基因工程技术提高胞外多糖的产量成为可能。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2W(CGMCC No.0828)是一株功能性益生菌。中国专利申请CN104480056A公开了其发酵液中具有能够降低血压的胞外多糖成分，然而该菌株的胞外多糖产量较低，不能满足工业化生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量不高的技术问题，提供一种利用改造的干酪乳杆菌LC2W基因工程菌株高效生产胞外多糖的方法。本发明的方法在发酵过程中胞外多糖产量显著提高，NADH氧化酶活性显著提高，乳酸产生量显著降低。

本发明人意外地发现过表达NADH氧化酶的产胞外多糖的干酪乳杆菌LC2W菌株在有氧条件下发酵相比在无氧条件下发酵，胞外多糖的产量明显提高，从而完成了本发明。

本发明技术方案之一：一种发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W的方法，所述方法包括以下步骤：在有氧条件下发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W。

本发明技术方案之二：一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法，包括发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W，从发酵液中收集胞外多糖的步骤，所述发酵为有氧条件下发酵。

本发明中，所述干酪乳杆菌LC2W见中国专利申请CN1566326A，其保藏编号为CGMCC No.0828。所述表达载体可以为本领域常规的载体，较佳地选自各种质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体中的一种或多种，更佳地为pIB184。所述发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W较佳地为干酪乳杆菌基因工程菌184-1。所述干酪乳杆菌基因工程菌184-1见中国专利申请CN104480056A，其包含表达来源于变异链球菌CGMCC 1.2499的NADH氧化酶基因nox的表达载体pIB184-nox。所述发酵为有氧条件下发酵。其中，所述有氧可以为本领域常规所指的有氧条件，例如在大气条件下或在发酵罐中向培养基中通入氧气。所述发酵的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为35-40℃，更佳地为35-37℃，最佳地为37℃。所述发酵的时间为20-36h，更佳地为20-24h，最佳地为24h。所述发酵较佳地为振荡发酵。所述振荡的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为200-240rpm，更佳地为200-220rpm，最佳地为220rpm。

本发明中，所述发酵的接种量可以为本领域常规的接种量。所述发酵的培养基可以为本领域常规的培养乳杆菌的培养基，较佳地为MRS培养基。

所述从发酵液中收集胞外多糖的方法可以为本领域常规的方法，较佳地包括以下步骤：(1)将所得发酵液煮沸后冷却，离心收集上清液；(2)将步骤(1)所述上清液用醇沉淀；(3)将步骤(2)所得沉淀重悬，然后加入三氯乙酸沉淀，离心，所得上清再用水透析即得。

步骤(1)中，所述煮沸的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为10min。所述冷却较佳地为冷却至室温。所述离心的速度可以为本领域常规的速度，较佳地为8000-12000g，更佳地为8000-10000g，最佳地为10000g。所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15-25min，更佳地为15-20min，最佳地为20min。所述离心的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为4℃。

步骤(2)中，所述醇沉淀法可以为本领域常规的方法，较佳地包括加入醇后静置，离心收集沉淀。所述醇较佳地为乙醇，所述加入醇后的终浓度较佳地为75％，所述百分比为体积百分比。所述静置的时间较佳地为12小时，所述静置较佳地为在4℃下静置。所述离心的速度可以为本领域常规的速度，较佳地为8000-12000g，更佳地为8000-10000g，最佳地为10000g。所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15-25min，更佳地为15-20min，最佳地为20min。所述离心的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为4℃。

步骤(3)中，所述重悬较佳地为用水重悬。所述三氯乙酸沉淀是除蛋白的常规方法，包括加入三氯乙酸、静置和离心除去沉淀。所述加入三氯乙酸所达到的终浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为8％，所述百分比为质量百分比。所述离心的速度可以为本领域常规的速度，较佳地为8000-12000g，更佳地为8000-10000g，最佳地为10000g。所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15-25min，更佳地为15-20min，最佳地为20min。所述离心的温度可以为本领域常规的温度，较佳地为4℃。所述透析可以为本领域常规的操作，所述透析较佳地为用水透析。所述透析的透析袋的截留分子量较佳地为12-14kDa。所述透析的温度较佳地为4℃。所述透析的时长较佳地为3天，其中每隔8小时换一次水。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供制备胞外多糖的方法中NADH氧化酶活性显著提高，乳酸产生量显著降低，在发酵过程中过表达NADH氧化酶的干酪乳杆菌LC2W菌株胞外多糖产量比不表达NADH氧化酶的干酪乳杆菌LC2W菌株的胞外多糖产量可以高出89％-110％；过表达NADH氧化酶的干酪乳杆菌LC2W菌株在有氧条件下发酵得到的胞外多糖的产量比在无氧条件下发酵得到的常量高30％。所制备的胞外多糖在提高提高免疫力的药品、保健品或者食品的应用方面具有广阔的前景。

附图说明

图1为发酵培养时菌体的生长曲线图。LC2W为干酪乳杆菌出发菌株，184-1为其重组菌株。

图2为184-1重组菌株在无氧及有氧条件下的菌体生长曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所用到的培养基成分如下：

MRS培养基：蛋白胨1g、牛肉浸膏1g、酵母浸膏0.5g、葡萄糖2g、醋酸钠0.5g、吐温800.1mL、柠檬酸二胺0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.058g、MnSO₄·4H₂O 0.025g、K₂HPO₄0.2g、水100mL，pH6.2-6.6，115℃，杀菌15min。

本发明所用到的菌株：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2W，光明乳业股份有限公司，见中国专利申请CN1566326A；干酪乳杆菌基因工程菌184-1，光明乳业股份有限公司，见中国专利申请CN104480056A。

本发明HPLC检测乳酸的方法请见“葡萄酒苹果酸—乳酸发酵HPLC分析方法的研究”郎咏梅,王传芬,蒋文强中国酿造，2006,154:64-66；

硫酸-苯酚法测定胞外多糖含量的方法请见：Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and RelatedSubstances.Anal Chem,1956,28:350-356；

NADH氧化酶活性测定方法请见：De Felipe FL,Kleerebezem M,De VosWM,Hugenholtz J.Cofactor engineering:a novel approach to metabolicengineering in Lactococcus lactis by controlled expression of NADH oxidase.JBacteriol 1998；180:3804-3808。

以下实施例所涉及到的浓度单位中乳酸产量单位g/L指每升发酵液中含有乳酸的克数，NADH氧化酶的活性单位U/mL指每毫升发酵液中含有的NADH氧化酶的酶活单位数，胞外多糖的产量mg/L指每升发酵液中含有的胞外多糖的毫克数。

实施例1

将干酪乳杆菌LC2W与干酪乳杆菌基因工程菌184-1分别接种于MRS培养基37℃有氧发酵24h，所述有氧发酵具体指在大气条件下220rpm振荡发酵培养。发酵结束，检测发酵液中乳酸产量，干酪乳杆菌LC2W乳酸产量为42.5g/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1乳酸产量为29.6g/L。

胞外多糖的提取方法包括以下步骤：

(1)收集发酵液在沸水浴中放置10分钟，冷却至室温后，4℃10000×g离心20min，收集上清液；

(2)加入发酵液3倍体积的无水乙醇，4℃放置12h，4℃10000×g离心20min；

(3)沉淀溶于发酵液1/10体积的去离子水，加入三氯乙酸至终浓度为8％(v/v)，4℃放置12小时，4℃10000×g离心20min，上清液在去离子水中利用透析袋进行透析，所述透析袋的截留分子量为12-14kDa，4℃透析，每8小时换一次水，透析3天。

用硫酸-苯酚法测定胞外多糖，测定结果为：干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量为125.6mg/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1胞外多糖产量为263.7mg/L，提高110.0％。

菌体经超声破碎后，进行NADH氧化酶活性测定。结果显示，干酪乳杆菌LC2W NADH氧化酶活性为0.055U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性为2.65U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1比干酪乳杆菌LC2W株高48.2倍。

菌体生长曲线如图1所示，过表达NADH氧化酶的干酪乳杆菌基因工程菌184-1生长明显慢于干酪乳杆菌LC2W，最终的菌体浓度也显著降低。

实施例2

将干酪乳杆菌基因工程菌184-1接种于MRS培养基，在37℃下分别无氧发酵和有氧发酵。所述无氧发酵具体指在厌氧箱中静置培养24h；所述有氧发酵指在大气条件下220rpm振荡培养24h。通过HPLC检测发酵液中的乳酸含量。当24小时发酵结束，无氧条件下重组菌株184-1乳酸产量为37.1g/L，有氧条件下重组菌株184-1乳酸产量为29.6g/L，比无氧发酵降低20％。

胞外多糖的提取方法同实施例1所述。经测定，干酪乳杆菌LC2W基因工程重组菌株184-1在无氧条件下胞外多糖产量为202.7mg/L，在有氧条件下胞外多糖产量为263.7mg/L，有氧条件下发酵产量提高30％。

菌体经超声破碎后，进行NADH氧化酶活性测定。结果显示，干酪乳杆菌基因工程菌184-1在无氧条件下NADH氧化酶活性为0.70U/mL，在有氧条件下NADH氧化酶活性为2.65U/mL，有氧条件下比无氧条件下NADH氧化酶活性提高3.8倍。

菌体生长曲线如图2所示，过表达NADH氧化酶的干酪乳杆菌基因工程菌184-1在有氧条件下生长明显慢于无氧条件培养，最终的菌体浓度也显著降低。

实施例3

将干酪乳杆菌LC2W与干酪乳杆菌基因工程菌184-1分别接种于MRS培养基，35℃有氧发酵20h。所述有氧发酵具体指在大气条件下200rpm振荡发酵培养。发酵结束，检测乳酸产量，干酪乳杆菌LC2W乳酸产量为35.4g/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1乳酸产量为29.5g/L，干酪乳杆菌LC2W比干酪乳杆菌LC2W基因工程菌降低17％。

胞外多糖的提取方法同实施例1。

用硫酸-苯酚法测定胞外多糖，测定结果为：干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量为106.8mg/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1胞外多糖产量为202.3mg/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1比干酪乳杆菌LC2W提高89％。

菌体经超声破碎后，进行NADH氧化酶活性测定。结果显示，干酪乳杆菌LC2W NADH氧化酶活性为0.051U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性为1.87U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1比干酪乳杆菌LC2W株高36.7倍。

实施例4

将干酪乳杆菌LC2W与干酪乳杆菌基因工程菌184-1分别接种于MRS培养基，40℃有氧发酵36h，所述有氧发酵具体指在大气条件下240rpm振荡发酵培养。发酵结束，检测乳酸产量，干酪乳杆菌LC2W乳酸产量为40.9g/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1乳酸产量为35.3g/L，干酪乳杆菌LC2W比干酪乳杆菌LC2W基因工程菌降低14％。

胞外多糖的提取方法与实施例1相同。

用硫酸-苯酚法测定胞外多糖，测定结果为：干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量为95.6mg/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1胞外多糖产量为182.3mg/L，干酪乳杆菌基因工程菌184-1比干酪乳杆菌LC2W提高91％。

菌体经超声破碎后，进行NADH氧化酶活性测定。结果显示，干酪乳杆菌LC2W NADH氧化酶活性为0.058U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1NADH氧化酶活性为1.96U/mL，干酪乳杆菌基因工程菌184-1比干酪乳杆菌LC2W株高33.8倍。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在有氧条件下发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W。

2.一种由干酪乳杆菌发酵制备胞外多糖的方法，包括发酵含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W并从发酵液中收集胞外多糖的步骤，其特征在于，所述发酵为有氧条件下发酵。

3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述表达载体包括质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体中的一种或多种。

4.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述表达载体为pIB184。

5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述含有NADH氧化酶基因表达载体的干酪乳杆菌LC2W为干酪乳杆菌基因工程菌184-1。

6.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述在有氧条件下发酵为在大气条件下发酵。

7.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述发酵的温度为35-40℃。

8.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述发酵的时间为20-36小时。

9.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述发酵为振荡发酵。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述振荡发酵的振荡的转速为200-240转/分钟。