CN106222160B - 糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法及其在微生物细胞固定化和酶固定化中的应用。本发明通过胶体提取、胶体真空冷冻干燥、胶体酯化、酯化胶体真空冷冻干燥、酯化胶体干粉粉碎、固定化载体制备等步骤获得了一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。本发明将海藻酸盐固定化载体的物理强度提高了30%‑60%，也利用了糖蜜利用过程中被丢弃掉的胶体物质。本发明的实施有利于低劣生物质糖蜜的综合利用，为糖蜜生物炼制提供技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物化工技术领域的方法，特别是一种强化海藻酸盐固定化载体的方法，可用于生物催化过程。
背景技术
固定化微生物细胞和固定化酶的抗逆性能较游离细胞和游离酶强，同时固定化细胞和固定化酶可以达到反复使用、连续操作、节省成本，以及简化产物分离纯化工艺等目的。
目前常用的微生物细胞和酶固定化方法包括结合法、交联法、包埋法等。其中，海藻酸钠-CaCl2包埋是一种常见的固定化微生物和固定化酶方法，具有操作简单、成本低、活性高、对微生物细胞和酶无毒性等优点。但是，海藻酸盐制成的固定化微生物细胞和固定化酶不仅化学和机械稳定性较差，而且在含有大量无机盐离子的溶液中易发生软化、破裂，甚至溶解等现象。不仅如此，在实际的微生物发酵过程中，迅速增殖的微生物细胞，以及连续搅拌、通气和新陈代谢产生的CO2等也会使固定化微生物细胞颗粒易被碎裂，从而导致固定化载体的使用寿命和产品收率降低。
目前，已有多种强化海藻酸盐载体物理化学稳定性的方法被报道，比如：中国专利CN 101117632 A报道将海藻酸钙固定化酵母菌先后放置于三亚乙基四胺和戊二醛溶液一定时间后可形成具有良好物理强度的固定化酵母粒子；中国专利CN 102344917 A将海藻酸钙固定化酵母菌先后放置于五亚乙基六胺和丁二醛溶液中，也得到了具有良好 、发酵性能温度、使用寿命较长的固定化酵母粒子；中国专利CN 101613692 B以多糖物质罗望子胶复配海藻酸钠、氯化钙和四硼酸钠，制备出了机械强度较高、破碎率较小，且微生物固化率高、成本低的复合凝胶固定化细胞载体。
糖蜜是制糖工业的副产品，价格低廉，被广泛作为动物饲料或者生物基化学品的转化底物。糖蜜中含有10%-20%胶体物质，而这些胶体物质因为会抑制微生物和酶活力而在糖蜜预处理过程中被去除掉，从而造成糖蜜原料不能充分利用。本发明提取并酯化糖蜜中的胶体物质，然后将酯化的胶体与海藻酸盐、氯化钙溶液进行混合，制备出复合固定化载体，并将此复合固定化载体用于微生物和酶的固定化及应用。糖蜜胶体提取过程绿色无污染，糖蜜各成分无化学变化；制备得到的复合固定化载体具有良好的物理强度；该复合固定化载体制得的固定化微生物和酶具有性能稳定、可多次重复使用等优点。本发明有利于低劣生物质糖蜜的综合利用，为糖蜜生物炼制提供技术基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的方法，通过该方法既将现有的海藻酸盐固定化载体的物理强度提高了30%-60%，也利用了糖蜜利用过程中被丢弃掉的胶体物质。
为实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：
利用有机溶剂从糖蜜中提取胶体，并将胶体真空冷冻干燥后得到胶体干粉；然后将胶体酯化，并再次通过真空冷冻干燥得到酯化胶体粉末；酯化胶体干粉粉碎至120-200目后，与海藻酸钠溶液充分混合，缓慢滴入氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。
本发明技术方案的具体步骤如下：
1. 胶体提取
1）糖蜜与水以等体积混合得到糖蜜溶液。
2）以有机溶剂石油醚或乙醚为萃取剂，以糖蜜溶液为原料液，在萃取剂和原料液体积比1:1、40 ℃、200 rpm条件下混合10-20 min，室温静置分层后，分别收集上层有机溶液、中层胶体固体和下层水溶液。上层有机溶液中主要包含植物脂蜡、脂溶性多酚；中层胶体固体为凝胶状，组成成分为84.11%多糖、4.14%蛋白、0.39%多酚、8.78%多酚、2.58%色素；下层水溶液中主要包含葡萄糖、蔗糖、果糖等水溶性成分。
3）向中层胶体固体中加入无水乙醇，胶体固体沉淀，收集沉淀，即为提取的胶体。
2. 胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50℃、2-4 h。
3. 胶体酯化
1）将浓硫酸、正丙醇混合，其中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:1-1:3，优选1:2；
2）在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉，加入量为20%-40%，优选30%；
3）常温，300 rpm条件下搅拌4-6 h，优选5 h；
4）8000 rpm离心10 min，取下层固体；
5）用正丙醇反复清洗下层固体，至洗涤液pH约为5.5；
6）将得到的固体物用20%（w/v）NaOH 溶液中和，调节pH约为9。
7）加无水乙醇沉淀、离心沉淀并真空冷冻干燥，得酯化胶体干粉。
4. 酯化胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50℃、2-4 h。
5. 酯化胶体粉碎
将真空冷冻干燥得到的酯化胶体干粉粉碎至粒径为0.05-0.15 mm。
6. 固定化载体制备
将酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化2-4 h，优选3 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。
本发明固体化载体可用于固定化酿酒酵母等真菌、固定化大肠杆菌等细菌、固定化酶，其物理强度较海藻酸盐固定化载体增加30%-60%。
现有的糖蜜利用工艺几乎只有糖蜜中的糖组分转化利用，而糖蜜中的胶体因会阻碍糖组分的转化而通常被去除，本发明利用糖蜜胶体制得高性能的固定化载体，可为糖蜜的综合利用，提高低劣生物质附加值提供技术支持。本发明制备的固定化载体的物理强度较海藻酸盐固定化载体有大幅度的提高。
具体实施方式
下面的实施例对本发明方法作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法
1. 胶体提取
1）糖蜜与水以等体积混合得到原料液。
2）以石油醚为萃取剂，以糖蜜溶液为原料液，在萃取剂和原料液体积比1:1、40℃、200 rpm条件下混合10 min，室温静置分层后，分别收集上层有机溶液、中层胶体固体和下层水溶液.
3）向中层胶体固体中加入无水乙醇，胶体固体沉淀，收集沉淀，即为提取的胶体。
2. 胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50℃、2 h。
3. 胶体酯化
1）将浓硫酸、正丙醇混合，其中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:1；
2）在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉，加入量为20%；
3）常温，300 rpm条件下搅拌6 h；
4）8000 rpm离心10 min，取下层固体；
5）用正丙醇反复清洗下层固体，至洗涤液pH约为5.5；
6）将得到的固体物用20%（w/v）NaOH 溶液中和，调节pH约为9。
7）加无水乙醇沉淀、离心沉淀并真空冷冻干燥，得酯化胶体干粉。
4. 酯化胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50 ℃、2 h。
5. 酯化胶体粉碎
将真空冷冻干燥得到的酯化胶体干粉粉碎至粒径为0.05-0.15 mm。
6. 固定化载体制备
将酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化2 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的载体强度较海藻酸盐载体高30%。
实施例2本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法
1. 胶体提取
1）糖蜜与水以等体积混合得到原料液。
2）以石油醚为萃取剂，以糖蜜溶液为原料液，在萃取剂和原料液体积比1:1、40℃、200 rpm条件下混合20 min，室温静置分层后，分别收集上层有机溶液、中层胶体固体和下层水溶液。.
3）向中层胶体固体中加入无水乙醇，胶体固体沉淀，收集沉淀，即为提取的胶体。
2. 胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50 ℃、4 h。
3. 胶体酯化
1）将浓硫酸、正丙醇混合，其中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:3；
2）在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉，加入量为40%；
3）常温，300 rpm条件下搅拌4 h；
4）8000 rpm离心10 min，取下层固体；
5）用正丙醇反复清洗下层固体，至洗涤液pH约为5.5；
6）将得到的固体物用20%（w/v）NaOH 溶液中和，调节pH约为9。
7）加无水乙醇沉淀、离心沉淀并真空冷冻干燥，得酯化胶体干粉。
4. 酯化胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50 ℃、4 h。
5. 酯化胶体粉碎
将真空冷冻干燥得到的酯化胶体干粉粉碎至粒径为0.05-0.15 mm。
6. 固定化载体制备
将酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的载体强度较海藻酸盐载体高50%。
实施例3本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法
1. 胶体提取
1）糖蜜与水以等体积混合得到原料液。
2）以石油醚为萃取剂，以糖蜜溶液为原料液，在萃取剂和原料液体积比1:1、40℃、200 rpm条件下混合15 min，室温静置分层后，分别收集上层有机溶液、中层胶体固体和下层水溶液。.
3）向中层胶体固体中加入无水乙醇，胶体固体沉淀，收集沉淀，即为提取的胶体。
2. 胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50 ℃、4 h。
3. 胶体酯化
1）将浓硫酸、正丙醇混合，其中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:2；
2）在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉，加入量为30%；
3）常温，300 rpm条件下搅拌5 h；
4）8000 rpm离心10 min，取下层固体；
5）用正丙醇反复清洗下层固体，至洗涤液pH约为5.5；
6）将得到的固体物用20%（w/v）NaOH 溶液中和，调节pH约为9。
7）加无水乙醇沉淀、离心沉淀并真空冷冻干燥，得酯化胶体干粉。
4. 酯化胶体冷冻干燥
真空冷冻干燥条件为-50℃、4 h。
5. 酯化胶体粉碎
将真空冷冻干燥得到的酯化胶体干粉粉碎至粒径为0.05-0.15 mm。
6. 固定化载体制备
将酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的载体强度较海藻酸盐载体高60%。
实施例4本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化大肠杆菌
出发菌株为大肠杆菌ZY0217（CCTCC No. M2015079），种子培养基为LB液体培养基；5 g/L 酵母膏, 10.0 g/L 细菌蛋白胨, 10.0 g/L 氯化钠。种子装液量为50 mL/500mL三角瓶。37℃、200 r/min培养12 h，作为种子液备用。将大肠杆菌种子液、酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的固定化大肠杆菌强度较海藻酸盐固定化大肠杆菌高53%。
将固定化大肠杆菌以10%（v/v）的接种量添加至发酵培养基中，发酵培养基初始pH值6.5、培养基装液量为150 ml/500 mL三角瓶。在37℃，200 rpm下发酵48 h，再静置发酵至终点。糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化大肠杆菌得到的L-赖氨酸收率为理论收率的80%，载体破碎率为9.23%；而海藻酸盐固定化大肠杆菌的L-赖氨酸收率仅为理论收率的67%，载体破碎率为46.67%。
实施例5本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化酿酒酵母
出发菌株为酿酒酵母AQ（CCTCC AY 2015007），种子培养基为YPD液体培养基；发酵培养基包括总糖20%（以糖蜜为唯一碳源），蛋白胨2%，磷酸氢二铵 0.05%，尿素0.05%，磷酸氢二钾 0.02%，硫酸镁 0.02%。
种子装液量为50 mL/500 mL三角瓶。37℃、200 r/min培养至对数生长中后期，作为种子液备用。将酿酒酵母种子液、酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的固定化酿酒酵母强度较海藻酸盐固定化酿酒酵母高56%。
将固定化酿酒酵母以10%（v/v）的接种量添加至发酵培养基中，发酵培养基初始pH值6.0、培养基装液量为150 ml/500 mL三角瓶。在37℃，200 rpm下发酵36 h，再静置发酵至终点。糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化酿酒酵母得到的乙醇收率为理论收率的40%，载体破碎率为8.18%；而海藻酸盐固定化酿酒酵母的乙醇收率仅为理论收率的29%，载体破碎率为39.55%。
实施例6本实施例说明糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化蔗糖酶
将蔗糖酶、酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。制备的固定化酿酒酵母强度较海藻酸盐固定化酿酒酵母高62%。
酶催化过程中，初始糖蜜装液量为200 mL/500 mL三角瓶，总糖浓度在20%。将固定化蔗糖酶以10%（v/v）的接入量添加至糖蜜溶液中，发酵培养基初始pH值4.0，反应条件为30℃、200 r/min， 24 h后反应终止。糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化蔗糖酶得到的蔗糖水解率为100%，载体破碎率为2.02%；而海藻酸盐固定化蔗糖酶的蔗糖水解率为89.33%，载体破碎率为42.65%。
Claims (10)
1.一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于制备步骤包括：
（1）利用有机溶剂从糖蜜中提取胶体：
（1-1）以有机溶剂石油醚或乙醚为萃取剂，以糖蜜溶液为原料液，在萃取剂和原料液体积比1:1、40 ℃、200 rpm条件下混合10-20 min，室温静置分层后，分别收集上层有机溶液、中层胶体固体和下层水溶液；
（1-2）向中层胶体固体中加入无水乙醇，胶体固体沉淀，收集沉淀，即为提取的胶体；
（2）将胶体真空冷冻干燥后得到胶体干粉；
（3）将胶体酯化，并再次通过真空冷冻干燥得到酯化胶体粉末：
（3-1）将浓硫酸、正丙醇混合，其中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:1-1:3；
（3-2）在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉，加入量为20%-40%；
（3-3）常温，300 rpm条件下搅拌4-6 h；
（3-4）8000 rpm离心10 min，取下层固体；
（3-5）用正丙醇反复清洗下层固体，至洗涤液pH为5.5；
（3-6）将得到的固体物用20%（w/v）NaOH 溶液中和，调节pH为9；
（3-7）加无水乙醇沉淀，离心沉淀并真空冷冻干燥，得酯化胶体干粉；
（4）将酯化胶体干粉颗粒与2%海藻酸钠溶液混合，缓慢滴入4%氯化钙溶液中，形成的白色颗粒在氯化钙溶液中固化2-4 h，然后用生理盐水洗涤3次，即得糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体。
2.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于步骤（3-1）中浓硫酸和正丙醇的体积比为1:2。
3.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于步骤（3-2）中在浓硫酸和正丙醇的混合溶液中加入胶体干粉的加入量为30%。
4.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于步骤（3-3）中的搅拌时间为5h。
5.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于所述的固化的时间为3h。
6. 根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于所述的酯化胶体干粉粉碎，是将真空冷冻干燥得到的酯化胶体干粉粉碎至粒径为0.05-0.15 mm。
7.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于所述的糖蜜溶液指糖蜜与水以等体积混合得到的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于所述的上层有机溶液中主要包含植物脂蜡、脂溶性多酚；中层胶体固体为凝胶状，组成成分为84.11%多糖、4.14%蛋白、0.39%多酚、8.78%灰分、2.58%色素；下层的水溶液中包含葡萄糖、蔗糖、果糖、色素、氨基酸。
9. 根据权利要求1所述的一种糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的制备方法，其特征在于所述的真空冷冻干燥条件为-50℃、2-4 h。
10.权利要求1所述制备方法得到的糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体的应用，其特征在于所述的糖蜜胶体复合海藻酸盐固定化载体用于固定化真菌、固定化细菌、固定化酶，其物理强度较海藻酸盐固定化载体增加30%-60%。
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