CN113856576B - 一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用海藻酸盐‑分离乳清蛋白‑可得然胶制备微囊化益生菌，配置海藻酸钠溶液冷却至室温；配备成pH＞11的碱性溶液，将可得然胶加入碱性溶液中使其溶解，调节pH为中性；取分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；3种溶液混合并冷却至室温；将益生菌培养后离心得到的菌泥，加入混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为1%‑3%的氯化钙溶液中，静置固化，得到复合凝胶球ALG‑WPl‑CUR，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2‑3h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，洗涤后并用滤纸吸去表面水分，即可。本发明所得微球，封装率高，疏水性强，具有制备防潮、生物相容、可控释和生物可降解益生菌载体的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料领域，具体涉及一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌。
背景技术
微胶囊化是提高益生菌抵抗不同压力的有效手段。然而，有两个问题与当前的微囊化技术有关。首先，许多微胶囊通常会迅速溶解在消化液中，并将益生菌直接暴露于胃酸和胆汁盐中。为解决这一问题，采用包衣技术或添加耐酸壁材来控制益生菌微胶囊在消化道的释放。其次，益生菌在常温储存期间益生菌的存活率很差。冻干益生菌制剂的挑战之一是环境储存过程中的水分吸附，这会降低玻璃化转变温度并导致益生菌失活的显著加速。
可得然胶Cur是一种由粪产碱杆菌发酵生成的胞外多糖，其分子结构绝大部分呈三螺旋构象，糖链间有强烈的氢键作用，螺旋链与链间通过氢键结合形成胶束区，胶束与胶束发生缠结形成的缠结区构成了可得然胶凝胶网络结构的交联区。可得然胶表现出优异的凝胶性能和包封性能，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。此外，可得然胶不溶于水，但在碱性溶液中容易分散，该物质具有加热后能凝固的特性，当加热到80℃以上温度条件，处理15分钟以上即可形成坚实的热不可逆性的高度胶，胶体细腻Q弹。
海藻酸盐ALG作为一种高效的生物黏附剂和pH敏感性的凝胶材料，其应用研究日益增多。海藻酸盐是一种为褐藻提供主要结构成分的多糖，由甘露糖醛酸(M)和古罗糖醛酸(G)二种单体连接后形成。当二个G单体相连时，它们形成一个对多价金属离子(Ca2"、Zn2*、A13.等)的交联点，从而产生凝胶化。
分离乳清蛋白WPI是在浓缩乳清蛋白的基础上经过进一步的工艺处理得到的高纯度乳清蛋白，纯度可达90%以上，比普通乳清蛋白粉更容易被身体消化和吸收，具有形成乳液和耐胃水凝胶的特性。分离乳清蛋白的亲水性和疏水性氨基酸的存在使疏水性化合物的包封变得平滑。此外，低透氧性和被用作益生菌的营养物质也很有吸引力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌，获得的凝胶球弹性高、结构均一性好、稳定性高。在微胶囊化后，提高益生菌的包封率及存活率，缓解环境中的水分吸附。此外，该凝胶球的制备方法可实现快速、大规模连续生产，破坏率低。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌，包括以下步骤：
步骤1，配置质量浓度是1.5%-2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸钠溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤2，在去离子水中添加NaOH，配备成pH＞11的碱性溶液，将质量浓度为0.1%-2.5%的可得然胶加入碱性溶液中搅拌均匀使其溶解，再用柠檬酸调节pH为中性；
步骤3，取质量浓度为2%-14 %的分离乳清蛋白溶液在25 ℃下恒温搅拌2h，备用；
步骤4，将步骤1-3制备的3种溶液混合，搅拌均匀得混合溶液，待冷却至室温后，备用；
步骤5，将益生菌培养后，离心得到的菌泥，加入步骤4的混合将混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为1%-3%的氯化钙溶液中，静置固化2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-CUR，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2-3h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，再用去离子水洗涤2-3次复合凝胶球，并用滤纸吸去表面水分，即得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球。
作为改进的是，所述海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3 mm。
作为改进的是，所述益生菌为植物乳杆菌或酵母菌。
作为改进的是，所得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3 mm。
作为改进的是，还包括步骤6，将海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球进行冷冻干燥，过筛，方便保存与运输。
作为改进的是，步骤5中氯化钠的质量分数为2%。
有益效果
与现有技术相比，本发明一种海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球的制备方法及其在微囊化益生菌中的应用，具有如下优势：
本发明提供的制备方法制成的海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球，具有较好弹性，可制成圆润且均一的球状，利用海藻酸钙凝胶的耐高温特性、可得然胶的热凝胶性质，将两者性质组合在一起，协同作用使得凝胶球的耐高温特性明显加强。并且，分离乳清蛋白的加入可增强凝胶的耐酸性，其亲水性和疏水性氨基酸的存在使疏水性化合物的包封变得平滑。
上述海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球冻干后的SEM显示结构形态完整、饱满。如果用单一海藻酸钠制成的凝胶球表面皱缩，易发生破损等问题，凝胶颗粒的稳定性和机械强度差，不利于益生菌的微囊化。而分离乳清蛋白和可得然胶本身无法单独成球。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球的制备方法及其在微囊化益生菌中的应用，具有如下优势：
1、本发明以海藻酸钠、分离乳清蛋白和可得然胶为原料，氯化钙作为固化剂，制成微囊化益生菌的载体。原材料廉价易得，制备方法简单，在室温下操作的凝胶载体成型速度快，减少益生菌的活性损失；
2、本方明具有良好的操作性能和反应活性等优点外，载体材料的机械强度和弹性更好，破损率小，减少了微生物流失，提高了包封效率；
3、本发明的组成配方，无毒、无害、安全性高，所提供配方可形成微囊化结构，保持产品在长期常温贮存及功能稳定性，具有良好的生物相容性和生物可降解性；
4、本发明中采用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球形成凝胶，凝胶成型时间短，不易破损，且相比常规单独使用海藻酸钠和钙盐结合形成的凝胶层说，复合胶赋予凝胶更佳的柔软性、可塑性和弹性，通过比较图1的扫描电镜图，ALG/WPI凝胶缓解单独使用ALG凝胶的皱缩问题，ALG/WPI/CUR混合使用使得凝胶表面更加致密、圆滑。
附图说明
图1为本发明海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球的SEM照片，（a）ALG ，（b）ALG/WPI，（c）ALG/WPI/CUR。
图2为本发明海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球的接触角照片，其中，（A）为ALG ，（B）ALG/WPI，（C）ALG/WPI/CUR。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明所用的植物乳杆菌为Lactobacillusmplantarum CGMCC 15013，中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明所用的酵母菌为Saccharomyces cerevisiaeA和Saccharomyces cerevisiaeAQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC AY 2015007和CCTCC AY 2015008。（何珣，蒋学剑，花加伟，陈可泉，柏建新.原位预处理甘蔗糖蜜对耐高温酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiaeAQ生产乙醇的影响[J]. 广西科学, 2016,23(1): 1-6。）
实施例1
步骤一，配置质量浓度是1.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为0.1%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为2%的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将益生菌培养后，离心得到的菌泥，加入步骤4的混合将混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为2%的氯化钙溶液中，静置固化2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-CUR，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2-3h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，再用去离子水洗涤2-3次复合凝胶球，并用滤纸吸去表面水分，即得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球，所述海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3mm。
实施例2
步骤一，配置质量浓度是2 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为0.5%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为8%的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将益生菌培养后，离心得到的菌泥，加入步骤4的混合将混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为1%的氯化钙溶液中，静置固化2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-CUR，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2-3h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，再用去离子水洗涤2-3次复合凝胶球，并用滤纸吸去表面水分，即得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球，所述海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3mm。
实施例3
步骤一，配置质量浓度是2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为2.5%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为14 %的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将益生菌培养后，离心得到的菌泥，加入步骤4的混合将混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为3%的氯化钙溶液中，静置固化2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-CUR，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2-3h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，再用去离子水洗涤2-3次复合凝胶球，并用滤纸吸去表面水分，即得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球，所述海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3mm。
实施例4
步骤一，配置质量浓度是2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为2.5%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为14 %的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将培养并离心好的Lactobacillusmplantarum CGMCC 15013菌泥加入溶液中，混合均匀，得到混合溶液；
步骤六，将混合溶液用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为2%的氯化钙溶液中，放置2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-Cur。
步骤七，室温下，过滤去除氯化钙溶液，用去离子水洗涤2-3次，用滤纸吸去表面水分，即得到海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球。
实施例5
步骤一，配置质量浓度是2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为2.5%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为14 %的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将培养并离心好的Saccharomyces cerevisiaeA菌泥加入溶液中，混合均匀，得到混合溶液；
步骤六，将混合溶液用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为2%的氯化钙溶液中，放置2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-Cur。
步骤七，室温下，过滤去除氯化钙溶液，用去离子水洗涤2-3次，用滤纸吸去表面水分，即得到海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球。
实施例6
步骤一，配置质量浓度是2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸盐溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤二，在去离子水中添加NaOH，配备成碱性溶液；将质量浓度为2.5%的可得然胶添加入碱性溶液中，使其溶解并搅拌均匀，再加柠檬酸调节pH为中性。
步骤三，将质量浓度为14 %的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2h；
步骤四，将以上溶液混合，搅拌均匀，然后冷却至室温，备用；
步骤五，将培养并离心好的Saccharomyces cerevisiaeAQ菌泥加入溶液中，混合均匀，得到混合溶液；
步骤六，将混合溶液用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为2%的氯化钙溶液中，放置2-3h，得到复合凝胶球ALG-WPl-Cur。
步骤七，室温下，过滤去除氯化钙溶液，用去离子水洗涤2-3次，用滤纸吸去表面水分，即得到海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，配置质量浓度是1.5%-2.5 %的海藻酸钠溶液，将25 mL的海藻酸钠溶液在60℃水浴锅中不断搅拌15 min，然后冷却至室温，备用；
步骤2，在去离子水中添加NaOH，配备成pH＞11的碱性溶液，将质量浓度为0.1%-2.5%的可得然胶加入碱性溶液中搅拌均匀使其溶解，再用柠檬酸调节pH为中性；
步骤3，取质量浓度为2%-14 %的分离乳清蛋白溶液在25℃下恒温搅拌2 h，备用；
步骤4，将步骤1-3制备的3种溶液混合，搅拌均匀得混合溶液，待冷却至室温后，备用；
步骤5，将益生菌培养后，离心得到的菌泥，加入步骤4的混合将混合溶液中，用无菌注射器滴加到30 mL质量浓度为1%-3%的氯化钙溶液中，静置固化2-3h，得到复合凝胶球，再将复合凝胶球置于CaCl2溶液中2-3 h，室温下，过滤去除氯化钙溶液，再用去离子水洗涤2-3次复合凝胶球，并用滤纸吸去表面水分，即得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球，即微囊化益生菌，其中，所得海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球呈球形，形态均一，直径为2-3 mm。
2.根据权利要求1所述的一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌，其特征在于，所述益生菌为植物乳杆菌或酵母菌。
3.根据权利要求1所述的一种利用海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶制备微囊化益生菌，其特征在于，还包括步骤6，将海藻酸盐-分离乳清蛋白-可得然胶凝胶球进行冷冻干燥，过筛，方便保存与运输。
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