CN112795503A - 一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，主要应用于水产养殖中水体氨氮处理。以地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的混菌悬液为芯材，以高酰基结冷胶、乳清分离蛋白为壁材，制备双层结构微胶囊，包埋率达到90％。本产品应用于水产养殖，主要作用为降解养殖水体氨氮，拮抗病原菌，提高养殖水产品免疫力，促进水产品生长，使用周期达90天以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和微生态制剂领域。具体涉及一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法。
技术背景
水产养殖过程中，大量剩余饵料和养殖动物排泄物在水体中积累，使水体环境恶化，包括氨氮和亚硝酸盐含量增加，溶解氧降低等，导致养殖动物病害频发，经济效益降低。因此养殖水环境控制是水产养殖的重中之重。微生态制剂是利用有益微生物加工而成的活菌制剂，在水产养殖中具有调控水质、拮抗病原菌、提高免疫力的作用。常用的益生菌主要有光合细菌、硝化细菌、乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等。
目前用于降解水体氨氮的芽孢杆菌制剂的类型主要有粉剂、水剂(浓缩液)和颗粒剂。上述三种类型在已经公开的专利中制备过：专利CN201810896519.0一种用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂及其应用；专利CN201711323291.8一种用于降解氨氮的制剂及其制备方法和应用；专利CN201910912051.4一种用于污水处理的微生物缓释饼及其制备方法。颗粒剂的制备方法大多数为硅藻土吸附法，描述微胶囊颗粒剂的制备方法较少，如专利号：CN201410088965.0“一种用于处理水中有机物和氨氮的磁性生物微胶囊的制备方法”中描述了将假丝酵母和海藻酸钠混匀后滴入氯化钙溶液制备成假丝酵母微胶囊，但此方法制备的微胶囊具有粒径大、包埋率低、产量低等缺点。此外，目前的生物微胶囊制剂对氨氮的降解率在60％～70％，降解效果并不显著。
发明内容
本发明的目的是针对水产养殖过程中水体氨氮增加，影响水生动物生存的问题，而提供一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法。本法得到的微胶囊制剂能够解决活菌在恶劣水体环境中存活力不强，作用时间短，作用效果弱的问题。
具体是通过以下方法实现的：
本发明的技术方案为：一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其具体步骤为：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以体积比为1:(1～3)混合后接入活化培养基中，液体培养基体积装液量15～20％，活化培养温度35～38℃，初始pH为7.5～8.0，转速为180～220r/min；活化培养36～48h后，获得种子液；
(2)发酵培养：将步骤(1)中获得的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度35～38℃，初始pH为7.5～8.0，转速为180～220r/min；发酵培养36～48h后，获得发酵液；
(3)菌悬液制备：将步骤(2)发酵液离心后收集菌泥，用生理盐水洗涤菌泥，重复上述步骤，直至洗涤干净；再用缓冲溶液将洗涤干净的菌泥配制成有效活菌数为5×109～8×109CFU/mL的菌悬液；
(4)复合芽孢杆菌微胶囊制备：①在去离子水中加入高酰基结冷胶，加热至溶解完全；②加入乳清分离蛋白，溶液加热使蛋白质热变性，冷却得到壁材溶液；③在壁材溶液中加入配制的菌悬液，进行搅拌、均质、预冻；④在真空冷冻干燥机中干燥，研磨得粉末状微胶囊。
优选步骤(1)中所述的蜡状芽孢杆菌菌悬液和地衣芽孢杆菌菌悬液混合后按3％～5％体积比的接种量接入活化培养基中。
优选步骤(1)中所述的活化培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0～10.0、蛋白胨5.0～10.0、玉米粉5.0～10.0、NaCl 5.0～10.0。
优选步骤(2)中种子液以4～8％(w/w)的接种量接种于发酵培养基中。
优选步骤(2)中所述的发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0～10.0、黄豆粉10.0～20.0、玉米粉10.0～15.0、NaCl 3.0～5.0、MgSO4.7H2O 1.0～2.0、KH2PO4 1.0～3.0、CaCO32.0～3.0、维生素VH 1.0～2.0。
优选步骤(3)中所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为10～15min；缓冲溶液为PBS溶液。
优选步骤(4)的步骤①中高酰基结冷胶的质量浓度为0.2％～0.4％；加热时间5～8min，加热温度为90～100℃；步骤②中乳清分离蛋白的质量分数为8％～12％；加热时间30～45min，使乳清分离蛋白热变性温度为80～90℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)的步骤③中菌悬液与壁材溶液的体积比为1:(2～4)；所述的搅拌转速为300～400r/min，搅拌时间为15～20min；均质转速为10000～12000r/min，均质时间为2～4min；预冻温度为-18～20℃，预冻时间10～15h。
优选步骤(4)的步骤④中干燥温度为-38～40℃，干燥时间为36～48h。
上述的一种蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名Bacillus cereus。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.4348，参据的微生物株NJYH 63305，保藏日期是2010年11月15日。一种地衣芽孢杆菌，菌种的拉丁学名Bacillus licheniformis.。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.6155，参据的微生物株NJWGYH 833051，保藏日期是2012年05月25日。以上两个菌种的保藏和存活证明分别在本课题组的以下两个专利中已经提供(1、专利号：ZL201310006174.4一种纯化蜡样芽孢杆菌发酵液中抑菌蛋白的方法，2、专利号：ZL201210464008.4一种地衣芽孢杆菌及多阶段发酵的方法)。
有益效果：
(1)采用复合芽孢杆菌作为主要功能菌种，其能够产生芽孢，芽孢具有抗性强的作用，在高温、紫外线、干燥等恶劣环境下均能生存，因此在微胶囊的制备过程中不会失活，在适合的环境条件下，芽孢能够重新萌发发挥作用。
(2)由于高酰基结冷胶胶体的多孔特性，当其作为壁材制备微胶囊时，不能在受到污染的水环境中完全保护其中的菌体，因此本专利采用乳清分离蛋白与高酰基结冷胶联用，形成结构致密的凝胶，以充分保护菌体。乳清分离蛋白营养价值高，含有免疫球蛋白、血清白蛋白、乳铁蛋白等多种活性成分，同时具有成胶性和成膜性，与高酰基结冷胶联用作为微胶囊的壁材能够使结构更为致密，同时其有较多碱性氨基酸残基，能够中和渗透进微胶囊内部的氢离子，使微胶囊内部环境pH保持稳定，为菌株提供良好的生长环境。
(3)本专利产品应用于近南美白对虾水产养殖中，其水体控制pH为7.5～8.0之间，与对照组相比水体氨氮降解率达到76％，溶解氧含量高于3.0mg/L，南美白对虾存活率达到97％以上，达到了净化养殖水体和提高对虾免疫力、降低发病率的作用。
保藏信息
上述的蜡状芽孢杆菌，其分类命名为蜡状芽孢杆菌，菌种的拉丁学名是Bacilluscereus，参据的微生物：NJYH63305，该菌株是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所)，其简称为CGMCC，保藏日期是2010年11月15日，保藏中心登记入册编号是CGMCCNo.4348。
上述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CGMCC No.6155是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.6155，保藏日期是：2012年5月25日。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施案例1：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以体积比为1:1混合后按3％(v/v)的接种量接入活化培养基中，液体培养基体积装液量15％，活化培养温度35℃，初始pH为7.5，转速为185r/min；活化培养36h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0、蛋白胨10.0、玉米粉5.0、NaCl 5.0。
(2)发酵培养：以5％(w/w)的接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度35℃，初始pH为7.5，转速为185r/min；发酵培养36h后，获得发酵液；其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0、黄豆粉10.0、玉米粉10.0、NaCl 3.0、MgSO4.7H2O 1.0、KH2PO41.0、CaCO32.0、维生素VH 1.0。
(3)菌悬液制备：将步骤(2)发酵液6000r/min离心15min后收集菌泥，用生理盐水洗涤菌泥，重复上述步骤，直至洗涤干净。用PBS缓冲溶液将洗涤干净的菌泥配制成有效活菌数为5×109CFU/mL的菌悬液。
(4)复合芽孢杆菌微胶囊制备：①在去离子水中加入质量分数为0.2％高酰基结冷胶，90℃加热8min，使溶解完全；②加入质量分数为8％乳清分离蛋白，80℃加热45min，使蛋白质热变性，冷却至室温；③加入配制的菌悬液(菌悬液(v)：壁材溶液(v)＝1:4)，300r/min搅拌20min、10000r/min均质4min、-18℃预冻15h；④在真空冷冻干燥机中-38℃主干燥48h，研磨得粉末状微胶囊。
(5)南美白对虾养殖中，其水体控制pH为7.7±0.3，水体氨氮降解率为74.6％，溶解氧含量高于3.0mg/L，南美白对虾存活率达到97％。使用周期93天。
实施案例2：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以体积比为1:2混合后按4％(v/v)的接种量接入活化培养基中，液体培养基体积装液量18％，活化培养温度37℃，初始pH为7.8，转速为200r/min；活化培养40h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/L)：葡萄糖8.0、蛋白胨8.0、玉米粉6.0、NaCl7.0。
(2)发酵培养：以6％(w/w)的接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度37℃，初始pH为7.8，转速为200r/min；发酵培养40h后，获得发酵液；其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖8.0、黄豆粉20.0、玉米粉12.0、NaCl 4.0、MgSO4.7H2O 1.5、KH2PO42.0、CaCO3 3.0、维生素VH 1.5。
(3)菌悬液制备：将步骤(2)发酵液7000r/min离心12min后收集菌泥，用生理盐水洗涤菌泥，重复上述步骤，直至洗涤干净。用PBS缓冲溶液将洗涤干净的菌泥配制成有效活菌数为6.5×109CFU/mL的菌悬液。
(4)复合芽孢杆菌微胶囊制备：①在去离子水中加入质量分数为0.3％高酰基结冷胶，100℃加热5min，使溶解完全；②加入质量分数为8％乳清分离蛋白，90℃加热40min，使蛋白质热变性，冷却至室温；③加入配制的菌悬液(菌悬液(v)：壁材溶液(v)＝1:3)，350r/min搅拌18min、12000r/min均质3min、-20℃预冻12h；④在真空冷冻干燥机中-40℃主干燥46h，研磨得粉末状微胶囊。
(5)南美白对虾养殖中，其水体控制pH为7.7±0.2，水体氨氮降解率为75.5％，溶解氧含量高于3.0mg/L，南美白对虾存活率达到98％。使用周期95天。
实施案例3：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以体积比为1:3混合后按5％(v/v)的接种量接入活化培养基中，液体培养基体积装液量20％，活化培养温度38℃，初始pH为8.0，转速为220r/min；活化培养48h后，获得种子液；其中活化培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0、蛋白胨5.0、玉米粉10.0、NaCl 10.0。
(2)发酵培养：以8％(w/w)的接种量将步骤(1)种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度38℃，初始pH为8.0，转速为220r/min；发酵培养48h后，获得发酵液；其中发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0、黄豆粉15.0、玉米粉15.0、NaCl 5.0、MgSO4.7H2O 2.0、KH2PO43.0、CaCO3 2.5、维生素VH 2.0。
(3)菌悬液制备：将步骤(2)发酵液8000r/min离心10min后收集菌泥，用生理盐水洗涤菌泥，重复上述步骤，直至洗涤干净。用PBS缓冲溶液将洗涤干净的菌泥配制成有效活菌数为8×109CFU/mL的菌悬液。
(4)复合芽孢杆菌微胶囊制备：①在去离子水中加入质量分数为0.4％高酰基结冷胶，95℃加热6min，使溶解完全；②加入质量分数为12％乳清分离蛋白，85℃加热30min，使蛋白质热变性，冷却至室温；③加入配制的菌悬液(菌悬液(v)：壁材溶液(v)＝1:2)，400r/min搅拌15min、11000r/min均质2min、-19℃预冻10h；④在真空冷冻干燥机中-39℃主干燥36h，研磨得粉末状微胶囊。
(5)南美白对虾养殖中，其水体控制pH为7.8±0.2，水体氨氮降解率为73.8％，溶解氧含量高于3.0mg/L，南美白对虾存活率达到97％。使用周期90天。
Claims (9)
1.一种复合芽孢杆菌微胶囊制剂的制备方法，其具体步骤为：
(1)活化培养：将蜡状芽孢杆菌菌悬液、地衣芽孢杆菌菌悬液以体积比为1:(1～3)混合后接入活化培养基中，液体培养基体积装液量15～20％，活化培养温度35～38℃，初始pH为7.5～8.0，转速为180～220r/min；活化培养36～48h后，获得种子液；
(2)发酵培养：将步骤(1)中获得的种子液接种于发酵培养基中，发酵培养温度35～38℃，初始pH为7.5～8.0，转速为180～220r/min；发酵培养36～48h后，获得发酵液；
(3)菌悬液制备：将步骤(2)发酵液离心后收集菌泥，用生理盐水洗涤菌泥，重复上述步骤，直至洗涤干净；再用缓冲溶液将洗涤干净的菌泥配制成有效活菌数为5×109～8×109CFU/mL的菌悬液；
(4)复合芽孢杆菌微胶囊制备：①在去离子水中加入高酰基结冷胶，加热至溶解完全；②加入乳清分离蛋白，溶液加热使蛋白质热变性，冷却得到壁材溶液；③在壁材溶液中加入配制的菌悬液，进行搅拌、均质、预冻；④在真空冷冻干燥机中干燥，研磨得粉末状微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的蜡状芽孢杆菌菌悬液和地衣芽孢杆菌菌悬液混合后按3％～5％体积比的接种量接入活化培养基中。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的活化培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0～10.0、蛋白胨5.0～10.0、玉米粉5.0～10.0、NaCl 5.0～10.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中种子液以4～8％质量比的接种量接种于发酵培养基中。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖5.0～10.0、黄豆粉10.0～20.0、玉米粉10.0～15.0、NaCl 3.0～5.0、MgSO4.7H2O 1.0～2.0、KH2PO4 1.0～3.0、CaCO3 2.0～3.0、维生素VH 1.0～2.0。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的离心转速为6000～8000r/min，离心时间为10～15min；缓冲溶液为PBS溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)的步骤①中高酰基结冷胶的质量浓度为0.2％～0.4％；加热时间5～8min，加热温度为90～100℃；步骤②中乳清分离蛋白的质量分数为8％～12％；加热时间30～45min，使乳清分离蛋白热变性温度为80～90℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)的步骤③中菌悬液与壁材溶液的体积比为1:(2～4)；所述的搅拌转速为300～400r/min，搅拌时间为15～20min；均质转速为10000～12000r/min，均质时间为2～4min；预冻温度为-18～20℃，预冻时间10～15h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)的步骤④中干燥温度为-38～40℃，干燥时间为36～48h。
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Citations (2)
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