CN113354877A - 一种ε-聚赖氨酸复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种ε‑聚赖氨酸复合物及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：(1)对ε‑聚赖氨酸发酵液进行固液分离，得到ε‑聚赖氨酸清液；(2)将阴离子高分子聚合物与步骤(1)所述ε‑聚赖氨酸清液进行混合，固液分离，得到ε‑聚赖氨酸复合物粗品；(3)对步骤(2)中的ε‑聚赖氨酸复合物粗品进行纯化、干燥，得到ε‑聚赖氨酸复合物纯品。本发明的工艺简单，环保，不仅对ε‑聚赖氨酸的回收率高，且分离纯化得到的ε‑聚赖氨酸复合物稳定性好，产品适用度更加广泛。此外，本发明还将该分离纯化工艺和ε‑聚赖氨酸的应用有机的结合起来，形成了一个完整的生态产业链，为ε‑聚赖氨酸的整体布局提供了良好的思路。

Description

一种ε-聚赖氨酸复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种ε-聚赖氨酸复合物及其制备方法和应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种具有广谱抗菌性的天然发酵产品，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌、噬菌体等均有良好的抑制作用，相比于传统化学防腐剂如苯甲酸类、山梨酸类等，ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、抑菌能力强、耐高温(120℃)、水溶性好、不影响食品风味、使用量低和安全性高等优点，是具有优良防腐性能和巨大商业潜力的天然发酵食品防腐剂。
上世纪八十年代，日本、韩国已经开始作为食品添加剂使用，2003年美国FDA批准使用，而我国2014年国家卫计委才批准ε-聚赖氨酸在食品领域使用。由于我国ε-聚赖氨酸研究起步较晚，近几年，我国几家企业已开始尝试生产，但落后于日本，存在发酵水平低、产品总收率低、生产成本高、品相差等问题，并对其机理缺乏深入研究，极大的限制了ε-聚赖氨酸在我国的开发和应用。因此，针对发酵液后续分离纯化过程中存在的污染严重、产品纯度低、得率不高、色泽差等问题进行工艺研究具有重大意义。
CN111777760A公开了一种ε-聚赖氨酸分离纯化工艺及应用，该发明步骤(1)中微滤前通过对经固液分离后的发酵液清液进行pH调整，从而使得ε-聚赖氨酸从带正电荷状态转变成不带电荷或者带负电荷状态，从而削弱了ε-聚赖氨酸与其他杂质的静电吸附作用，为后续ε-聚赖氨酸的分离纯化降低难度；步骤(3)由于经该工艺步骤(2)得到的ε-聚赖氨酸溶液品质已经达到要求而无需额外的活性炭脱色单元，减少了ε-聚赖氨酸的损失，从而提高了ε-聚赖氨酸产品的回收率。对发酵液的前处理、对离子交换树脂吸附后的洗脱处理的改进提高了ε-聚赖氨酸纯度。该发明工艺整体操作简单，环境友好，不仅对ε-聚赖氨酸的回收率高，且分离纯化得到的ε-聚赖氨酸纯度优异。
CN106380592A公开了一种从发酵液中提取ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的方法，该发明采用超滤对离子交换的上样液进行深度预处理，提高上样液澄清度的同时提高了减树脂的使用寿命；去除了上样液中的大分子杂质(如蛋白质、核酸等)，有效地提升了树脂的吸附量和使用效率；采用两级离子交换对目标产品ε-PL进行正吸附和负吸附，以最大程度地去除杂质，提高离子交换树脂提纯的效果；采用纳滤方式进行脱盐，大程度上去除分离提取过程中因反复调节pH值而引入的盐分，确保成品的灰分控制在合理水平，显著提升了成品纯度，这是ε-PL提取工艺中首次引入脱盐操作单元。
CN108641078A公开了一种提取ε-聚赖氨酸的方法，该发明采用树脂直接从未经预处理的发酵液中提取ε-PL，省去了菌体分离操作，减少了提取步骤，降低了生产成本；工艺流程简单、操作时间短、投资成本低、便于工业放大，具有很高的实际应用价值且优势明显。
然而，上述发明依旧没有摆脱必须先拿到ε-聚赖氨酸纯品才能进行后续产品开发的命运。此外，ε-聚赖氨酸本身的阳离子导致其在使用过程中，特别是在液体中使用时，因和阴离子型的高分子如多糖、蛋白等相互聚集沉淀从而导致抑菌活性降低。
因此，在本领域中，期望开发一种不需分离纯化ε-聚赖氨酸而可以直接使用、并且工艺流程简单的ε-聚赖氨酸复合物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种ε-聚赖氨酸复合物及其制备方法及应用。本发明的工艺操作流程简单，产品回收率高，产品品质高，并且ε-聚赖氨酸复合物的应用对ε-聚赖氨酸的应用提供了思路，对于ε-聚赖氨酸的广泛应用具有鲜明的指导作用。此外，本发明开创性地将聚赖氨酸分离纯化和产品开发有机地融为了一体，缩短了工艺流程，降低了生产成本；通过该工艺得到的聚赖氨酸复合物纯品相较于聚赖氨酸纯品具有等效的抑菌表现。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所制备方法包括以下步骤：
(1)对ε-聚赖氨酸发酵液进行固液分离，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)将阴离子高分子聚合物与步骤(1)所述ε-聚赖氨酸清液进行混合，固液分离，沉淀经干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)对步骤(2)中的ε-聚赖氨酸复合物粗品进行纯化、干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品；
所述阴离子高分子聚合物的等电点为2-6，例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6。
本发明中，步骤(1)中所述ε-聚赖氨酸发酵液指的是将ε-聚赖氨酸生产菌菌种接种于富含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适条件下培养一定时间得到的富含聚赖氨酸的ε-聚赖氨酸发酵液。
优选地，所述ε-聚赖氨酸生产菌菌种为链霉菌属、芽孢杆菌属或一些丝状真菌，优选链霉菌属，包括小白链霉菌和/或淀粉酶产色链霉菌。
优选地，所述ε-聚赖氨酸发酵液中ε-聚赖氨酸的含量大于15g/L。
本发明利用ε-聚赖氨酸的阳离子性，通过添加阴离子高分子化合物与溶液中的ε-聚赖氨酸形成不溶物，从而实现ε-聚赖氨酸与原始溶液的选择性分离，随后通过进一步去除过量的阴离子高分子化合物，从而得到ε-聚赖氨酸复合物。该工艺整体操作简单，环境友好，不仅对ε-聚赖氨酸的回收率高，且分离纯化得到的ε-聚赖氨酸复合物稳定性好，产品适用度更加广泛。
本发明中，步骤(2)采用阴离子高分子聚合物吸附溶液中的ε-聚赖氨酸，该过程相较于利用阳离子交换树脂纯化ε-聚赖氨酸，具有简单、绿色环保、吸附能力强的特点，节省了阳离子交换树脂处理工艺以及相应的损耗，而且经过进一步去除多余的阴离子高分子聚合物，制备的ε-聚赖氨酸复合物纯品具有较好的抑菌表现和产品稳定性。
优选地，步骤(1)所述固液分离前将ε-聚赖氨酸发酵液的pH值调至4-10，例如4、5、6、7、8、9或10等，或不进行pH调节。
优选地，步骤(1)所述固液分离前将ε-聚赖氨酸发酵液的pH值调至5-9。
优选地，步骤(1)所述固液分离包括连续式和/或间歇式。
优选地，步骤(1)所述固液分离包括离心或过滤。
优选地，所述过滤包括膜过滤或板框过滤。
优选地，所述膜过滤的滤膜膜芯包括卷式膜滤膜膜芯、管式膜滤膜膜芯或中空式滤膜膜芯。
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于5000Da，例如5000Da、8000Da、10000Da、50000Da、100000Da、200000Da或300000Da等。
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于100000Da。
优选地，步骤(1)所述固液分离后还包括以下步骤：
(a)将固液分离后的透过液进行浓缩，而后加入有机溶剂进行沉淀；
(b)将步骤(a)的沉淀重新溶解于水中。
在本发明中，步骤(1)的目的是从ε-聚赖氨酸发酵液中得到ε-聚赖氨酸清液，作为本发明的优选技术方案，步骤(1)先通过固液分离如离心、过滤去除菌渣，之后为了进一步纯化ε-多聚赖氨酸溶液，可以通过膜过滤设备去除溶液中大分子的蛋白、多糖等或者通过有机溶剂沉淀去除ε-聚赖氨酸溶液中的非目标成分。经过步骤(1)处理后的ε-聚赖氨酸清液中成分复杂程度明显降低，对于后续阴离子高分子聚合物吸附ε-聚赖氨酸进而得到较高纯度的ε-聚赖氨酸复合物更加有利。
优选地，步骤(a)所述有机溶剂包括甲醇和/或乙醇。
优选地，步骤(a)加入有机溶剂的量为使得有机溶剂占有机溶剂与浓缩液体积之和的30％-90％，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等，进一步优选40％-60％，更优选50％。
优选地，步骤(2)所述阴离子高分子聚合物以溶液的方式与步骤(1)所述ε-聚赖氨酸清液进行混合。
优选地，所述阴离子高分子聚合物溶液浓度为1mg/mL-500mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL或500mg/mL等。
优选地，所述阴离子高分子聚合物与ε-聚赖氨酸的质量比为1:1-20:1，例如1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、15:1或20:1等。
优选地，所述阴离子高分子聚合物包括未经修饰的天然高分子聚合物和/或经修饰改性的高分子聚合物。
优选地，所述未经修饰的天然高分子聚合物包括海藻酸盐、海萝胶、卡拉胶、果胶、明胶、聚谷氨酸盐、聚谷氨酸、葫芦巴胶、黄蜀葵胶、黄原胶、可得然胶、罗望子多糖胶、沙蒿胶、田菁胶、皂荚糖胶、阿拉伯胶或槐豆胶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述经修饰改性的高分子聚合物的修饰方法包括羧基化或磺酸化。
优选地，所述羧基化包括羧甲基化、羧乙基化或羧丙基化中的任意一种。
优选地，所述经修饰改性的高分子聚合物包括羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素、羧乙基纤维素钠、羧甲基淀粉或羧甲基淀粉钠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(3)所述纯化包括以下步骤：
向ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入碱性溶液，搅拌，而后加入有机溶剂进行沉淀，固液分离得到分离液，调节分离液pH值，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液进行减压浓缩。
优选地，所述碱性溶液中的溶质包括氢氧化钠、氢氧化钾或氨水中的任意一种。
优选地，所述碱性溶液的浓度为0.1-2mol/L，例如0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.3mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L或2mol/L等。
优选地，有机溶剂包括甲醇和/或乙醇。
优选地，所述加入有机溶剂的量为使得有机溶剂占有机溶剂与碱性溶液体积之和的30％-90％，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％等，进一步优选60％-80％，更优选80％。
优选地，所述调节分离液pH值之前回收分离液中的有机溶剂。
优选地，所述调节分离液pH值为将分离液pH值调至5-9，例如5、6、7、8或9等。
优选地，所述膜过滤设备的滤膜滤芯包括卷式膜滤膜膜芯、管式膜滤膜膜芯或中空式滤膜膜芯。
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于5000Da，例如5000Da、8000Da、10000Da、50000Da、100000Da、200000Da或300000Da等。
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于100000Da。
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃，例如40℃、43℃、45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃或60℃等。
优选地，所述减压浓缩为浓缩至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为1％-20％，例如1％、3％、5％、7％、8％、10％、13％、15％、18％或20％等。
优选地，步骤(3)所述干燥包括喷雾干燥、冷冻干燥或真空脉动干燥的任意一种。
本发明的目的之二在于提供一种根据目的之一所述的制备方法制备的ε-聚赖氨酸复合物。
优选地，所述ε-聚赖氨酸复合物包括ε-聚赖氨酸复合物粗品或ε-聚赖氨酸复合物纯品。
优选地，以ε-聚赖氨酸复合物粗品的质量为100％计，ε-聚赖氨酸的含量为10％-30％，例如10％、15％、20％、25％或30％等。
优选地，以ε-聚赖氨酸复合物纯品的质量为100％计，ε-聚赖氨酸的含量≥30％，例如30％、35％、40％、45％或50％等，ε-聚赖氨酸含量+阴离子高分子聚合物含量≥98％，例如98％、98.5％、99％或99.5％等。
本发明的目的之三在于提供一种目的之二所述的ε-聚赖氨酸复合物在食品、日化用品或医药中的应用。
优选地，所述应用中ε-聚赖氨酸复合物直接作为产品使用或作为添加剂或辅料使用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过添加阴离子型高分子化合物制备ε-聚赖氨酸复合物，工艺操作简单，降低了生产成本，环境友好，ε-聚赖氨酸的回收率高(70％-80％)，ε-聚赖氨酸复合物纯度高(ε-聚赖氨酸复合物纯品中ε-聚赖氨酸含量+高分子聚合物含量：97％-100％)，且分离纯化得到的ε-聚赖氨酸复合物纯品相较于聚赖氨酸纯品，稳定性更好，并且具有等效的抑菌表现；
(2)本发明提供一种ε-聚赖氨酸分离纯化工艺制备得到的ε-聚赖氨酸复合物，对ε-聚赖氨酸复合物在食品领域以及日化产品中应用进行了细化，开拓了ε-聚赖氨酸应用的深度以及广度，提高ε-聚赖氨酸的应用前景和范围；
(3)本发明将提取工艺和ε-聚赖氨酸复合物的应用有机的结合起来，形成了一个完整的生态产业链，为ε-聚赖氨酸的整体布局提供了良好的思路。
附图说明
图1为实施例1制备的ε-聚赖氨酸复合物的HPLC图。
图2为应用例4中新鲜肉苁蓉经过不同方法处理后进行防腐测试后的外观图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为30g/L的发酵液采用离心设备进行固液分离，固液分离前不调节pH，得到离心清液，离心清液浓缩后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与浓缩液体积之和的50％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为10mg/mL的果胶水溶液，搅拌均匀，果胶的用量为m(果胶):m(ε-聚赖氨酸)＝8:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的80％，进行沉淀，沉淀为果胶，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至7.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在60℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为10％，喷雾干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，步骤(1)中膜过滤的滤膜膜芯为管式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量不小于300KD；果胶的等电点为2；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为管式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为5000Da。
本实施例制备的ε-聚赖氨酸复合物纯品的HPLC色谱峰如图1所示。在HPLC图中，阴离子高分子聚合物不出峰，采用面积归一化分析表明，ε-聚赖氨酸复合物纯品中ε-聚赖氨酸的色谱峰纯度99％；通过对照ε-聚赖氨酸标准曲线，ε-聚赖氨酸复合物纯品中ε-聚赖氨酸含量为42％。
实施例2
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L的发酵液的pH值调至7，采用膜过滤进行固液分离，得到透过液，将透过液浓缩后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与浓缩液体积之和的90％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为50mg/mL的海藻酸钠水溶液，搅拌均匀海藻酸钠的用量为m(海藻酸钠):m(ε-聚赖氨酸)＝12:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与氢氧化钠溶液体积之和的60％，进行沉淀，沉淀为海藻酸钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的甲醇后调节分离液pH值至7.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在50℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为20％，喷雾干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，步骤(1)中膜过滤的滤膜膜芯为卷式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为100KD；海藻酸钠的等电点为3；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为卷式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为10000Da。
实施例3
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为30g/L的发酵液采用板框过滤进行固液分离，固液分离前不调节pH，得到透过液，将透过液浓缩后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与浓缩液体积之和的60％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为100mg/mL的聚谷氨酸钠水溶液，搅拌均匀，聚谷氨酸钠的用量为m(聚谷氨酸钠):m(ε-聚赖氨酸)＝1:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为1mol/L的氢氧化钾溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的40％，进行沉淀，沉淀为聚谷氨酸钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至5.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在50℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为15％，喷雾干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，聚谷氨酸钠的等电点为4；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为中空式滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为15000Da。
实施例4
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L的发酵液采用板框过滤进行固液分离，固液分离前不调节pH，得到透过液，将透过液浓缩后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与浓缩液体积之和的50％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为1mg/mL的果胶水溶液，搅拌均匀，果胶的用量为m(果胶):m(ε-聚赖氨酸)＝10:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为2mol/L的氢氧化钾溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的80％，进行沉淀，沉淀为果胶，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至7.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在40℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为10％，喷雾干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，果胶的等电点为5；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为管式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为100KD。
实施例5
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为30g/L的发酵液的pH值调至4，采用膜过滤进行固液分离，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为500mg/mL的聚谷氨酸钠水溶液，搅拌均匀，聚谷氨酸钠的用量为m(聚谷氨酸钠):m(ε-聚赖氨酸)＝20:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为1.5mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与氢氧化钠溶液体积之和的90％，进行沉淀，沉淀为聚谷氨酸钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的甲醇后调节分离液pH值至7.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在60℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为1％，喷雾干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，步骤(1)中膜过滤的滤膜膜芯为中空式滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为300KD；聚谷氨酸钠的等电点为6；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为卷式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为300KD。
实施例6
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为30g/L的发酵液的pH值调至10，采用离心方式进行固液分离，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为50mg/mL的羧甲基纤维素钠水溶液，搅拌均匀，羧甲基纤维素钠的用量为m(羧甲基纤维素钠):m(ε-聚赖氨酸)＝16:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为0.2mol/L的氨水溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的30％，进行沉淀，沉淀为羧甲基纤维素钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至9.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在50℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为10％，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，羧甲基纤维素钠的等电点为6；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为中空式滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为200KD。
实施例7
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L的发酵液采用板框过滤进行固液分离，固液分离前不调节pH，得到透过液，将透过液浓缩后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与浓缩液体积之和的40％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为50mg/mL的聚谷氨酸钠水溶液，搅拌均匀，聚谷氨酸钠的用量为m(聚谷氨酸钠):m(ε-聚赖氨酸)＝8:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为0.3mol/L的氨水溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的80％，进行沉淀，沉淀为聚谷氨酸钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至7.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在60℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为5％，冷冻干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，聚谷氨酸钠的等电点为3；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为卷式膜滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为300KD。
实施例8
在本实施例中提供一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L的发酵液的pH值调至7，采用离心方式进行固液分离，得到透过液，将透过液浓缩后加入甲醇，使得甲醇体积占甲醇与浓缩液体积之和的50％，进行沉淀，离心分离，将ε-聚赖氨酸沉淀重新溶解于水溶液中，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)向步骤(1)中的ε-聚赖氨酸清液中缓慢加入浓度为10mg/mL的聚谷氨酸钠水溶液，搅拌均匀，聚谷氨酸钠的用量为m(聚谷氨酸钠):m(ε-聚赖氨酸)＝6:1，静置2h后固液分离，沉淀经干燥，即为ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)向步骤(2)的ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌，使得ε-聚赖氨酸复合物粗品充分溶解，而后加入乙醇，使得乙醇体积占乙醇与氢氧化钠溶液体积之和的70％，进行沉淀，沉淀为聚谷氨酸钠，静置4h后固液分离，得到分离液，采用减压浓缩回收分离液中的乙醇后调节分离液pH值至6.0，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液在60℃下进行减压浓缩，至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为10％，真空脉动干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品。
其中，聚谷氨酸钠的等电点为4；步骤(3)膜过滤设备的滤膜滤芯为中空式滤膜膜芯，滤膜膜芯的分子量为300KD。
应用例1
将200μL分别加入有ε-聚赖氨酸和ε-聚赖氨酸复合物纯品的牛肉膏蛋白胨液体培养基分别加入96孔板的孔内，之后加入20μL浓度为106FU/mL的大肠杆菌溶液，37℃恒温培养24h后测定620nm下测定吸光度值，每个试验都进行了3次，同时做空白对照试验，实验结果(如表1所示)表明，ε-聚赖氨酸复合物纯品和ε-聚赖氨酸具有等效的抑菌效果。
表1
Figure BDA0003104694740000161
应用例2
将200μL分别加入有ε-聚赖氨酸和ε-聚赖氨酸复合物纯品的牛肉膏蛋白胨液体培养基分别加入96孔板的孔内，之后加入20μL浓度为106FU/mL的枯草芽孢杆菌溶液，37℃恒温培养24h后测定620nm下测定吸光度值，每个试验都进行了3次，同时做空白对照试验，实验结果(如表2所示)表明，ε-聚赖氨酸复合物纯品和ε-聚赖氨酸具有等效的抑菌效果。
表2
Figure BDA0003104694740000162
应用例3
ε-聚赖氨酸复合物纯品作为湿面条保鲜剂使用：将实施例1制备的ε-聚赖氨酸复合物纯品按0.1％的质量分数混入面粉中，经加工得到新鲜的湿面条，以普通面粉的新鲜湿面条作为对照，分别正常放置一周时间，对两种不同处理的面条外观和气味进行比较，实验组放置一周后鲜面条外观和气味基本没有表明变化，而对照组的面条放置7天后发酸，并且可以观察到其发生霉变，这表明ε-聚赖氨酸复合物纯品作为面条保鲜剂可以有效的延长鲜面条的保藏期。
应用例4
ε-聚赖氨酸复合物纯品在新鲜肉苁蓉防腐中的应用：取新鲜的肉苁蓉，用纯净水刷洗一下，将肉苁蓉进行切片处理，沥干水分后将其浸泡在含有壳聚糖和实施例2制备的ε-聚赖氨酸复合物纯品的水溶液中，浸泡5min后捞出，沥干表面水分，装入无菌袋内，在4℃的冰箱中贮藏，以未经处理的新鲜肉苁蓉和经过1％壳聚糖溶液浸泡的肉苁蓉作为对照，按照间隔天数对肉苁蓉新鲜切片的微生物生长情况进行评价，结果表明，加入ε-聚赖氨酸复合物纯品后，新鲜肉苁蓉切片的保鲜期由7天延长至30天以上，实验组和对照组的肉苁蓉的外观图如图2所示。因此，ε-聚赖氨酸复合物纯品作为新鲜肉苁蓉的防腐剂大大延长了肉苁蓉的贮藏期。
应用例5
ε-聚赖氨酸复合物纯品作为抑制痤疮杆菌效果评价：在无菌操作下,取适当浓度的痤疮杆菌悬液,用涂布棒均匀涂抹在培养基上；采用牛津杯法评价实施例1制备的ε-聚赖氨酸复合物纯品的抑菌效果，以ε-聚赖氨酸作为对照，实验结果表明相同浓度的ε-聚赖氨酸复合物纯品和ε-聚赖氨酸对于痤疮杆菌均具有较为显著的抑制效果，且两种聚赖氨酸产品的抑制效果没有明显差异，可以作为针对痤疮杆菌的产品使用。
对比例1
本对比例与实例1不同之处仅在于，步骤(1)中不进行固液分离。
对比例2
本对比例与实施例1不同之处仅在于，步骤(2)中果胶的等电点为7。
对比例3
本对比例与实施例1不同之处仅在于，步骤(3)中不包括ε-聚赖氨酸复合物粗品的纯化步骤。
对实施例1-8以及对比例1-3的ε-聚赖氨酸复合物纯品进行性能测试，测试方法如下：
(1)ε-聚赖氨酸复合物粗品中ε-聚赖氨酸含量测定：1)称取20mg粗品样品于水解管中，加入10mL 6mol/L的盐酸溶液；2)在冰浴的辅助下，抽真空脱气；然后通入保护气体氮气，反复脱空气，充入氮气2次；3)置于110℃的烘箱中，水解22h；4)水解完全的蛋白质，定容至50mL，配制1mg/mL的溶液；5)精密吸取2mL，置于真空烘箱中，保持40℃，真空脱酸；然后加入2mL的水继续真空脱酸，重复2次；然后加入2mL的氨基酸溶剂，配制1mg/mL的氨基酸溶液；6)精密量取1000μL，置于10mL的离心管中，精密量取500μL 1mol/L的三乙胺乙腈溶液，500μL 0.1mol/L的PITC乙腈溶液，混匀，室温静置1h，加入4mL的正己烷玩，剧烈摇振，放置10min，取下层溶液过膜上机分析；7)液相条件如下，色谱柱：waters C18；流速1.0mL/min，柱温40℃；检测波长：254nm；进样量10微升；流动相A为0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH:6.5)-乙腈(93:7)，B为乙腈-水(80:20)，洗脱梯度为(0-14min，100％-85％A；14-29min，85％-66％A；29-30min，66％-0A；30-37min，0A；37-37.1min，0-100A；37.1-45min，100％A)。
(2)ε-聚赖氨酸复合物纯品中ε-聚赖氨酸含量测定：称取1.7g的磷酸氢二钾和1.42g的硫酸钠溶于800mL的水中，用磷酸调pH至3.4后，用水定容至1000mL，取此溶液920mL，然后加入80mL乙腈，混匀。用0.45μm的膜过滤器过滤，作为流动相备用。精确称量约20.00mg试样，加入到25mL的容量瓶中，加流动相到刻度下1cm处超声10min，待冷至室温用流动相定容至刻度混合均匀。将此溶液用0.45μm的膜过滤器过滤，采用HPLC进行含量测定，检测条件为：C18反向色谱柱(250mm×4.6mm)，流速0.4mL/min，柱温箱30℃，检测波长215nm。
(3)ε-聚赖氨酸复合物纯品中阴离子高分子聚合物含量测定：称取样品5mg，溶解于2mL 2mol/L的三氟乙酸中，110℃下水解3h。水解完成后，烘干水解液。加入0.5mL去离子水溶解，吸取0.25mL溶解液，加入0.25mL 0.6mol/L NaOH，在离心管中混匀，加入0.5mL0.4mol/L的PMP甲醇溶液，涡旋震荡，70℃下水浴100min。冷却后，加入0.6mL 0.3mol/L HCl中和，并用去离子水稀释至3mL。用3mL氯仿萃取残余的PMP，重复萃取3次。过0.45μm滤膜，装入液相小瓶。以葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖胺、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸为标准品，经与样品相同的处理后，以DAD为检测器进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱：C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A：100mM磷酸钠缓冲液(pH＝6.7)，流动相B：乙腈，检测波长：250nm，柱温30℃，流速：1mL/min，进样量：5μL。根据检测的单糖结果换算ε-聚赖氨酸复合物纯品中阴离子高分子聚合物的含量。
性能测试结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003104694740000201
由表3可以看出，实施例1-8制备的ε-聚赖氨酸复合物纯度较高(ε-聚赖氨酸复合物纯品中ε-聚赖氨酸含量+高分子聚合物含量：97％-100％)，ε-聚赖氨酸复合物粗品中的ε-聚赖氨酸含量和ε-聚赖氨酸复合物纯品中的ε-聚赖氨酸含量均较高(粗品中的ε-聚赖氨酸含量：19％-27％，纯品中的ε-聚赖氨酸含量：34％-46％)，并且，采用本发明的制备方法ε-聚赖氨酸的回收率高(70％-80％)。
与实施例1相比，对比例1和对比例3制备的ε-聚赖氨酸复合物，粗品和纯品中ε-聚赖氨酸含量均明显降低；对比例2制备的ε-聚赖氨酸复合物，粗品和纯品中ε-聚赖氨酸含量均明显降低，并且ε-聚赖氨酸的回收率也降低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的ε-聚赖氨酸复合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种ε-聚赖氨酸复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)对ε-聚赖氨酸发酵液进行固液分离，得到ε-聚赖氨酸清液；
(2)将阴离子高分子聚合物与步骤(1)所述ε-聚赖氨酸清液进行混合，固液分离，沉淀经干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物粗品；
(3)对步骤(2)中的ε-聚赖氨酸复合物粗品进行纯化、干燥，得到ε-聚赖氨酸复合物纯品；
所述阴离子高分子聚合物的等电点为2-6。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述固液分离前将ε-聚赖氨酸发酵液的pH值调至4-10或不进行pH调节；
优选地，步骤(1)所述固液分离前将ε-聚赖氨酸发酵液的pH值调至5-9；
优选地，步骤(1)所述固液分离包括连续式和/或间歇式；
优选地，步骤(1)所述固液分离包括离心或过滤；
优选地，所述过滤包括膜过滤或板框过滤；
优选地，所述膜过滤的滤膜膜芯包括卷式膜滤膜膜芯、管式膜滤膜膜芯或中空式滤膜膜芯；
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于5000Da；
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于100000Da。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述固液分离后还包括以下步骤：
(a)将固液分离后的透过液进行浓缩，而后加入有机溶剂进行沉淀；
(b)将步骤(a)的沉淀重新溶解于水中；
优选地，步骤(a)所述有机溶剂包括甲醇和/或乙醇；
优选地，步骤(a)加入有机溶剂的量为使得有机溶剂占有机溶剂与浓缩液体积之和的30％-90％，进一步优选40％-60％，更优选50％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述阴离子高分子聚合物以溶液的方式与步骤(1)所述ε-聚赖氨酸清液进行混合；
优选地，所述阴离子高分子聚合物溶液浓度为1mg/mL-500mg/mL；
优选地，所述阴离子高分子聚合物与ε-聚赖氨酸的质量比为1:1-20:1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子高分子聚合物包括未经修饰的天然高分子聚合物和/或经修饰改性的高分子聚合物；
优选地，所述未经修饰的天然高分子聚合物包括海藻酸盐、海萝胶、卡拉胶、果胶、明胶、聚谷氨酸盐、聚谷氨酸、葫芦巴胶、黄蜀葵胶、黄原胶、可得然胶、罗望子多糖胶、沙蒿胶、田菁胶、皂荚糖胶、阿拉伯胶或槐豆胶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述经修饰改性的高分子聚合物的修饰方法包括羧基化或磺酸化；
优选地，所述羧基化包括羧甲基化、羧乙基化或羧丙基化中的任意一种；
优选地，所述经修饰改性的高分子聚合物包括羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧乙基纤维素、羧乙基纤维素钠、羧甲基淀粉或羧甲基淀粉钠中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化包括以下步骤：
向ε-聚赖氨酸复合物粗品中加入碱性溶液，搅拌，而后加入有机溶剂进行沉淀，固液分离得到分离液，调节分离液pH值，采用膜过滤设备对分离液进行脱盐处理，将脱盐后的ε-聚赖氨酸复合物溶液进行减压浓缩。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液中的溶质包括氢氧化钠、氢氧化钾或氨水中的任意一种；
优选地，所述碱性溶液的浓度为0.1-2mol/L；
优选地，有机溶剂包括甲醇和/或乙醇；
优选地，所述加入有机溶剂的量为使得有机溶剂占有机溶剂与碱性溶液体积之和的30％-90％，进一步优选60％-80％，更优选80％；
优选地，所述调节分离液pH值之前回收分离液中的有机溶剂；
优选地，所述调节分离液pH值为将分离液pH值调至5-9；
优选地，所述膜过滤设备的滤膜滤芯包括卷式膜滤膜膜芯、管式膜滤膜膜芯或中空式滤膜膜芯；
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于5000Da；
优选地，所述滤膜膜芯的分子量不小于100000Da；
优选地，所述减压浓缩的温度为40-60℃；
优选地，所述减压浓缩为浓缩至ε-聚赖氨酸复合物的质量浓度为1％-20％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述干燥包括喷雾干燥、冷冻干燥或真空脉动干燥的任意一种。
9.一种根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的ε-聚赖氨酸复合物；
优选地，所述ε-聚赖氨酸复合物包括ε-聚赖氨酸复合物粗品或ε-聚赖氨酸复合物纯品；
优选地，以ε-聚赖氨酸复合物粗品的质量为100％计，ε-聚赖氨酸的含量为10％-30％；
优选地，以ε-聚赖氨酸复合物纯品的质量为100％计，ε-聚赖氨酸的含量≥30％，ε-聚赖氨酸含量+阴离子高分子聚合物含量≥97％。
10.根据权利要求9所述的ε-聚赖氨酸复合物在食品、日化用品或医药中的应用；
优选地，所述应用中ε-聚赖氨酸复合物直接作为产品使用或作为添加剂或辅料使用。
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