CN113768949A - ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌或干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ε‑聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌或干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用。实验结果显示，ε‑聚赖氨酸具有抑制克罗诺杆菌及其生物被膜的形成、清除其成熟生物被膜的作用。本发明采用标准微量肉汤稀释法测定ε‑聚赖氨酸对克罗诺杆菌的抑菌活性，MIC值为0.125～0.25mg/mL，MBC值为0.125～0.50mg/mL；通过结晶紫染色法和扫描电镜观察发现亚抑菌浓度ε‑聚赖氨酸对克罗诺杆菌生物被膜的形成有显著抑制作用，且高浓度ε‑聚赖氨酸能破坏成熟的生物被膜。本发明为ε‑聚赖氨酸在制备抑制克罗诺杆菌或干预其生物被膜药物方面的临床应用提供实验依据，具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌或干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用。
背景技术
克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是一种兼性厌氧、周生鞭毛、能运动的革兰氏阴性杆菌，可导致各年龄段人群感染，尤其是对免疫力低下的新生儿及婴幼儿威胁较大，能够引起严重的坏死性小肠结肠炎、败血症和脑膜炎。尽管其感染率低，但感染该菌的婴幼儿病死率高达40％～80％。此外，克罗诺杆菌感染性疾病即使被治愈也会伴有严重的神经系统后遗症，包括脑脓肿、神经发育迟缓、脑积水和四肢瘫痪等。克罗诺杆菌污染源十分广泛，现已从食品、环境及临床标本中检出了该菌。
生物被膜(Biofilm)是一种由非游离细胞所分泌的胞外基质所组成的细菌菌落，是微生物在自然界存在的一种重要方式。生物被膜促进了细菌对外界环境营养物质的摄取，提高了细菌对外界环境的抗逆性，增强了微生物对抗生素、消毒剂、渗透胁迫、热和饥饿等外界环境压力的适应能力。
研究发现克罗诺杆菌在一定条件下可在玻璃、乳胶、硅胶和不锈钢等材料表面形成生物被膜。然而玻璃、乳胶、硅胶和不锈钢等材料广泛使用于食品加工及医疗领域，一旦克罗诺杆菌在上述材料表面形成生物被膜，这将极大地增加人们接触和感染该菌的风险。同时，生物被膜的存在增强了菌体对抗菌药物和消毒剂的抵抗力，使用常规方法难以彻底去除。此外，生物被膜中存在的克罗诺杆菌往往会持续不断的向外界环境释放菌体，从而导致食品和环境中该菌的持续污染，给食品和医疗领域带来灾难性的威胁。
现阶段，国内外学者就克罗诺杆菌的防治策略进行了积极探索，然而相关的研究报道仍然非常有限，提出的方法各有利弊。如采用化学法，由于细菌生物被膜对不同类型的化学消毒剂的敏感性不同，且容易导致化学残留，因此采用化学法具有一定的局限性；如采用超声、施加电磁场、辐照等物理法，由于所采用的物理手段的强度低，并不能有效地抑制细菌生物被膜的形成。因此，迫切需要开发新颖、天然和有效的药物来抑制克罗诺杆菌及其生物被膜。
ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，ε-PL)是一种天然存在的阳离子多肽，主要是链霉菌(Streptomyces albulus)产生的次生代谢产物。ε-聚赖氨酸是一种具有25～35个L-赖氨酸残基的聚阳离子肽，该肽通过α-羧基和ε-氨基之间的一个酰胺键相连，分子量通常为2.5～4.5kDa，具有可生物降解、可食用、水溶性好、热稳定高和对人类无毒的特性。目前，尚无ε-聚赖氨酸或其盐酸盐抑制克罗诺杆菌及其生物被膜的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌或干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用，为进一步开发针对抑制克罗诺杆菌或干预克罗诺杆菌生物被膜的药物提供重要的数据。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌药物中的应用。
优选的，所述ε-聚赖氨酸或其盐酸盐对于克罗诺杆菌的最低抑菌浓度为0.125～0.25mg/ml。
优选的，所述ε-聚赖氨酸或其盐酸盐对于克罗诺杆菌的最低杀菌浓度为0.125～0.50mg/ml。
为实现上述目的，本发明还提供如下另一技术方案：
ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用。
优选的，所述干预克罗诺杆菌生物被膜包括抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成和破坏成熟的克罗诺杆菌生物被膜。
本发明还提供一种抑制克罗诺杆菌的药物制剂，包括(1)有效量的作为活性成分的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐，(2)选择性的药学上可接受的辅料或载体。
本发明还提供一种干预克罗诺杆菌生物被膜的药物制剂，包括(1)有效量的作为活性成分的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐，(2)选择性的药学上可接受的辅料或载体。
优选的，所述干预克罗诺杆菌生物被膜包括抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成和破坏成熟的克罗诺杆菌生物被膜。
本发明首先采用微量肉汤稀释法考察ε-聚赖氨酸对不同来源浮游态克罗诺杆菌的抑菌活性，借助扫描电镜观察菌体表面微观结构的变化。建立克罗诺杆菌生物被膜体外模型，通过结晶紫染色法和扫描电镜观察法评价ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌生物被膜的干预作用。
实验结果显示：(1)ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌标准菌株、食品分离株、临床分离株均有很好的抑菌活性，MIC值在0.125～0.25mg/mL之间，MBC值在0.125～0.50mg/mL之间。扫描电镜结果显示，经MIC浓度的ε-聚赖氨酸处理2h后的克罗诺杆菌细胞表现出显著的形态变化，细胞边界不清楚，随着ε-聚赖氨酸作用浓度的增加，细胞显示出严重的变形以及褶皱程度加深。
(2)结晶紫染色结果显示亚抑菌浓度ε-聚赖氨酸处理后，克罗诺杆菌生物被膜的形成受到了抑制，扫描电镜观察发现对照样品中的细菌细胞与许多不规则的胞外聚合物黏连在一起，细菌表面光滑、完整，而处理组胞外聚合物变薄，细菌细胞产生的胞外分泌物明显减少，且细胞形态发生了明显的改变，细胞膜被破坏，这进一步说明了ε-聚赖氨酸可以抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成。
(3)为了探究ε-聚赖氨酸对成熟生物被膜的抑制和破坏作用，进一步分析了更高浓度的ε-聚赖氨酸对预制生物被膜的影响。结果发现1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC的ε-聚赖氨酸可以显著破坏成熟的生物被膜。扫描电镜的结果也证实了这一点。未经ε-聚赖氨酸处理的克罗诺杆菌生物被膜呈现出具有三维结构的复合物形态，而暴露于4MIC的ε-聚赖氨酸后，细菌细胞松散地附着于表面，且伴随着细胞损伤。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果：
本发明中所用ε-聚赖氨酸或其盐酸盐是一种天然生物活性物质，其安全性高、无毒副作用，可应用于食品领域及医疗领域。本发明中ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌具有很好的杀菌效果，对标准菌株、食品分离株及临床分离株菌均有抑菌活性，扫描电镜结果揭示了其对克罗诺杆菌菌体的杀伤作用，为ε-聚赖氨酸应用于克罗诺杆菌的防治提供了理论基础；另外，ε-聚赖氨酸还可以显著抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成，并且可以清除成熟的生物被膜。本发明拓宽了ε-聚赖氨酸的应用领域，为ε-聚赖氨酸在制备抑制克罗诺杆菌或干预其生物被膜药物方面的临床应用提供实验依据，具有良好的应用前景和巨大的潜在价值。
附图说明
图1为阪崎克罗诺杆菌ATCC29544在不同ε-聚赖氨酸浓度(0、MIC、MBC)处理的TSB培养基中处理2h后的SEM图(35000X)；
图2为不同亚抑菌浓度ε-聚赖氨酸对阪崎克罗诺杆菌XZCRO43生物被膜形成的抑制效果统计图；
图3为阪崎克罗诺杆菌XZCRO43在不同ε-聚赖氨酸浓度(0、1/8MIC)处理的培养基中处理24h后的SEM图(65000X)；
图4为不同浓度ε-聚赖氨酸对阪崎克罗诺杆菌XZCRO43生物被膜的生物量的清除效果统计图；
图5为阪崎克罗诺杆菌XZCRO43在不同ε-聚赖氨酸浓度(0、4MIC)处理的培养基中处理24h后的SEM图(20000X，65000X)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明中ε-聚赖氨酸标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
本发明中所用菌株见下表1，其中包含克罗诺杆菌标准菌株4株、食品分离株2株、临床分离株2株。所有菌株由徐州医科大学环境与健康实验室保存，储存于-20℃、25％甘油(v/v)的冷冻管中。
所用菌株的选取原则：第一，由于不同来源菌株自身特性存在差异，为了保证实验结果的可靠性，故分别选取标准菌株、食品分离株及临床分离株用于抑菌活性研究；第二，根据近年来采样结果发现阪崎克罗诺杆菌分离株最为常见，其检出率高，并且现有文献资料表明，阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属中最具传染性的物种，故本发明选取阪崎克罗诺杆菌作为后续试验菌株；第三，由于标准菌株具有稳定的生物学特性，且具有可溯源性，故选取阪崎克罗诺杆菌ATCC29544用于抑菌作用评估；第四，以发明人前期筛选得到的一株强生物被膜产生株阪崎克罗诺杆菌XZCRO43为试验菌株用于生物被膜研究。
表1本发明所用克罗诺杆菌菌株及其来源
实施例一：ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌浮游菌的最低抑菌浓度(minimuminhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration,MBC)检测
采用微量肉汤稀释法测定ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌的抑制作用。
ε-聚赖氨酸用无菌水溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，配制成64mg/mL储存液。将冻存于-20℃中的表1中的菌种分别划线接种于TSA培养基上，37℃静置培养16～18h。随后挑取单菌落接种于TSB培养基中，37℃摇床震荡培养至对数生长期，离心收集菌体沉淀并使用新鲜TSB培养基重悬菌体，调OD600nm＝0.5，获得细菌总数约为108CFU/mL的菌悬液，再次使用TSB培养基将菌液稀释成1.0×106CFU/mL，备用。将ε-聚赖氨酸储备液在含有TSB培养基的96孔培养板中对倍稀释，向其中加入等体积的菌悬液，至ε-聚赖氨终浓度为32～0.016mg/mL。空白对照孔加200μL TSB培养基，生长对照孔加100μL TSB培养基和100μL菌悬液，阳性对照孔加入100μL 0.1mg/ml氨苄西林和100μL菌悬液，然后将板置于37℃恒温培养箱中孵育24h后观察测定结果。
以肉眼观察，无细菌生长的药物最低孔浓度为ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌的MIC。测出MIC后，取100μL各孔培养物于TSA平板中，用玻璃刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，待菌液渗透于培养基内，将平板于37℃培养箱中倒置培养16-18h。无细菌生长的最小药物浓度即为其MBC。试验结果具体见表2，从表2中可以看出，ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌标准菌株、食品分离株及临床分离株均有很好的抑菌活性，其MIC值在0.125～0.25mg/mL之间，MBC值在0.125～0.50mg/mL之间。
表2ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌MIC和MBC测定结果(mg/mL)
实施例二：ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌微观形态的影响
以阪崎克罗诺杆菌ATCC29544作为实验菌株，菌液的准备同实施例一。将添加不同浓度ε-聚赖氨酸(0、MIC和MBC)的菌液(OD600nm＝0.5)置于37℃培养箱中培养2h后，离心收集菌体沉淀，使用PBS洗涤菌体3次，并将菌体重新悬浮于2.5％戊二醛溶液中常温固定1～2h，之后转入4℃固定过夜，然后用磷酸缓冲液(PH＝7.2)洗涤三次，每次10min，随后使用不同浓度(25％、50％、70％、80％、90％和95％)的乙醇溶液中逐步脱水处理，每次15min，去除95％的乙醇溶液，用无水乙醇处理样品两次，每次15min。最后，将样品进行临界点干燥，使用离子溅射仪在盖玻片表面喷金镀膜，通过扫描电镜在35000倍下观察细胞形态结构，并拍照记录。
实验结果由图1可知，对照组(control)中的细胞完整光滑，内容物饱满，无细胞损伤；MIC组中的细胞形态发生改变，细胞膜发生皱缩、凹陷，细胞边界不清楚；随着ε-聚赖氨酸作用浓度的增加，MBC组中的细胞显示出严重的变形以及褶皱程度加深，进一步说明了ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌具有不可逆的杀伤作用。
实施例三：亚抑菌浓度ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌生物被膜形成的影响
将冻存于-20℃中的强生物被膜产生菌株XZCRO43接种于LB肉汤中，37℃摇床震荡培养至对数生长期，调OD600nm＝0.5，获得细菌总数约为108CFU/mL的菌液，备用。使用LB肉汤将ε-聚赖氨酸进行等倍稀释，各取100μL加入到96孔培养板中，然后加入等体积的已用LB肉汤稀释至1.0×106CFU/mL的菌悬液。此时，ε-聚赖氨酸的终浓度为1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC、1/64MIC。细菌生长对照组加入等体积的LB肉汤。每组浓度做3个重复。混匀后将培养板置于37℃培养24h，然后进行结晶紫染色：去掉上清液，用无菌蒸馏水洗板3次以除去浮游菌。用0.1％结晶紫染色30min后，再次用无菌蒸馏水洗板3次去除游离染料，自然风干后，用95％乙醇洗脱结晶紫。10min后，使用酶标仪测定其OD595nm值，实验平行3次。
实验结果由图2可知，经不同亚抑菌浓度的ε-聚赖氨酸处理后，各处理组的OD595nm值与对照组存在显著性差异(p<0.0001)，且各处理组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。实验结果表明，即使较低浓度的ε-聚赖氨酸也能有效抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成。
实施例四：ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌生物被膜形成的影响
菌液的准备同实施例三，使用新鲜LB肉汤将菌液稀释至1.0×106CFU/ml，取1ml1/4MIC的ε-聚赖氨酸与1ml菌悬液等体积混合后加入预先放置有无菌盖玻片的6孔板中，同时，以不含ε-聚赖氨酸的培养液作为对照，置于37℃培养箱中培养培养24h。取出培养板，弃去培养基，用PBS缓冲液轻柔漂洗3次，洗去浮游状态的细菌，然后将盖玻片置于2.5％的戊二醛溶液中，常温固定1～2h，之后转入4℃固定过夜，然后用磷酸缓冲液洗涤3次，每次10min，再将盖玻片置于不同浓度(25％、50％、70％、80％、90％和95％)的乙醇溶液中逐步脱水处理，每次15min，去除95％的乙醇溶液，用无水乙醇处理样品两次，每次15min。最后，将样品进行临界点干燥，使用离子溅射仪在盖玻片表面喷金镀膜，通过扫描电镜在65000倍下观察生物被膜的形态结构，并拍照记录。
实验结果由图3可知，对照样品中的细菌细胞与许多不规则的胞外聚合物黏连在一起，细菌表面光滑、完整，而经1/8MICε-聚赖氨酸处理后，胞外聚合物变薄，细菌细胞产生的胞外分泌物明显减少，且细胞形态发生了明显的改变，细胞膜遭到破坏，进一步证实ε-聚赖氨酸可以抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成。
实施例五：ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌成熟生物被膜的清除作用
菌液的准备同实施例三，使用新鲜LB肉汤将细菌悬浮液稀释成5×105CFU/mL，然后分别取200μL上述稀释菌液接种至96孔培养板中，在37℃下培养24h。培养结束后，吸出残留的培养液。然后用无菌PBS冲洗3次，再加入不同浓度ε-聚赖氨酸(0、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC)的LB肉汤，在37℃下培养24h后，使用结晶紫染色法测定生物被膜的生物量并计算抑制率。同时，按照实施例四中的方法采用扫描电子显微镜进行观察ε-聚赖氨酸对生物被膜的破坏作用。
实验结果由图4可知，与对照组相比，经1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC的ε-聚赖氨酸处理后，克罗诺杆菌生物被膜生物量分别减少了42％、39％、63％和73％。由图5可知，未经ε-聚赖氨酸处理的克罗诺杆菌形成的生物被膜呈现出复杂的三维立体结构，且盖玻片上覆盖着一层厚厚的胞外基质，而暴露于4MIC的ε-聚赖氨酸后，细菌细胞松散地附着于表面，且伴随着细胞损伤，此外，盖玻片表面的胞外基质成分似乎被清除，覆盖表面变得光滑。由此结果表明ε-聚赖氨酸能显著破坏成熟的生物被膜。
由上述实验结果说明，ε-聚赖氨酸具有抑制克罗诺杆菌及其生物被膜的形成、清除其成熟生物被膜的作用。本发明采用标准微量肉汤稀释法测定ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌的抑菌活性，MIC值为0.125～0.25mg/mL，MBC值为0.125～0.50mg/mL；通过结晶紫染色法和扫描电镜观察发现亚抑菌浓度ε-聚赖氨酸对克罗诺杆菌生物被膜的形成有显著抑制作用，且高浓度ε-聚赖氨酸能够破坏成熟的生物被膜。
Claims (8)
1.ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌药物中的应用，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸或其盐酸盐对于克罗诺杆菌的最低抑菌浓度为0.125～0.25mg/ml。
3.根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备抑制克罗诺杆菌药物中的应用，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸或其盐酸盐对于克罗诺杆菌的最低杀菌浓度为0.125～0.50mg/ml。
4.ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐在制备干预克罗诺杆菌生物被膜药物中的应用，其特征在于，所述干预克罗诺杆菌生物被膜包括抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成和破坏成熟的克罗诺杆菌生物被膜。
6.一种抑制克罗诺杆菌的药物制剂，其特征在于，包括(1)有效量的作为活性成分的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐，(2)选择性的药学上可接受的辅料或载体。
7.一种干预克罗诺杆菌生物被膜的药物制剂，其特征在于，包括(1)有效量的作为活性成分的ε-聚赖氨酸或其盐酸盐，(2)选择性的药学上可接受的辅料或载体。
8.根据权利要求7所述的一种干预克罗诺杆菌生物被膜的药物制剂，其特征在于，所述干预克罗诺杆菌生物被膜包括抑制克罗诺杆菌生物被膜的形成和破坏成熟的克罗诺杆菌生物被膜。
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