CN116622540A - 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用 - Google Patents

一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116622540A
CN116622540A CN202211368237.6A CN202211368237A CN116622540A CN 116622540 A CN116622540 A CN 116622540A CN 202211368237 A CN202211368237 A CN 202211368237A CN 116622540 A CN116622540 A CN 116622540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactococcus lactis
vhprobi
strain
bacterial
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211368237.6A
Other languages
English (en)
Inventor
段治
步欣萍
郭超群
张景燕
吴松洁
崔洪昌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
QINGDAO VLAND BIOTECH Inc
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Original Assignee
QINGDAO VLAND BIOTECH Inc
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by QINGDAO VLAND BIOTECH Inc, Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd filed Critical QINGDAO VLAND BIOTECH Inc
Priority to CN202211368237.6A priority Critical patent/CN116622540A/zh
Publication of CN116622540A publication Critical patent/CN116622540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株新的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）及其应用。所提供的乳酸乳球菌分离自发酵乳样本，能有效的抑制假中间葡萄球菌的增殖，能有效预防和治疗犬脓皮病及其他假中间葡萄球菌引发的感染疾病，已于2022年8月19日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M20221308。

Description

一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用
技术领域
本发明属于益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用。
背景技术
在健康犬的皮肤上，本身存在一定数量的微生物，以细菌居多，所以称为正常菌群。依据细菌在皮肤和毛发上的增殖情况，又可将正常菌群分为常住菌群和暂住菌群。这些正常菌群，在犬出生7 天后就存在，相互制约，相互依存，在微观生态学上保持一种动态平衡关系，构成机体防御系统的一部分。大量研究表明，犬正常皮肤表面或毛囊菌群中定居的细菌有：微球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和阳性葡萄球菌，α溶血性链球菌、不动杆菌、产气荚膜梭菌、痤疮丙酸杆菌、伪中间型葡萄球菌（易在毛囊处找到 ) 。但任何内部或者外部的因素改变，如pH值、温度、盐度、湿度、白蛋白、脂肪酸等浓度的改变，均会打破正常菌群的平衡关系，导致某种菌的过度增殖，从而引发疾病。
犬脓皮病即是由该原因导致的犬类常见病之一。犬脓皮病是指犬皮肤感染化脓性细菌而引起的化脓性皮肤病，又称为细菌性皮肤病，或犬细菌性毛囊炎。该病若治疗得当，病情会很快痊愈；若治疗失当，则病情反复，久治不愈，极少情况甚至可致病原菌侵入血液循环，引起全身性感染，危及生命。而现代研究表明，假中间葡萄球菌为犬脓皮病的最主要致病菌。
假中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）又叫伪中间葡萄球菌，它是由Devriese等2005年发现并命名的新型葡萄球菌，是一种新的凝固酶阳性葡萄球菌，是一种常见的条件致病菌。广泛存在于动物皮肤、毛囊、皮毛、鼻咽部黏膜及肠道内，特别是皮肤粘膜部位，如口腔、鼻子、腹股沟、会阴部和肛门。当宿主的抵抗力降低，皮肤屏障被易感因素改变，从而引起动物机体一系列的机会性感染，导致胸腹部和四肢处感染，表现为皮下组织肿胀、化脓、破溃、皮肤结痂，严重者流出黄白色分泌物或散发腐臭味。除了皮肤感染，还会有外耳炎、尿路感染、术后感染、菌血症等其他感染。近年来，随着人们生活质量的提高，宠物的饲养率在不断提高，在犬的主人和兽医身上也发现了假中间葡萄球菌的定植，并相继出现假中间葡萄球菌感染人的报道。因此，假中间葡萄球菌作为一种潜在的重要动物传染性病原菌，将会对人类公共健康造成严重威胁。
目前对于假中间葡萄球菌感染的治疗常采取消毒剂与抗菌药联合应用的方法，该疗法虽然简单有效，却易导致致病菌消毒剂抗性与抗菌药耐药性的增强，且二者之间密切相关，存在共同耐药性。而随着抗生素在伴侣动物中的广泛使用，假中间葡萄球菌的耐药性已经不断增加，尤其是耐甲氧西林假中间葡萄球菌的出现和流行，已经超出兽医临床抗生素用药范围，引起了越来越多的关注。遏制动物源细菌耐药是人类控制细菌耐药的重要组成部分。针对目前细菌耐药性问题，包括抗菌肽、噬菌体、中草药、益生菌等抗菌剂或抗生素替代产品的研发逐步开展。其中，益生菌来源广泛、种属繁多、不会对宿主造成其他伤害，是安全、有效的抗生素替代品。因此，通过筛选有效抑制假中间葡萄球菌的益生菌株来防治假中间葡萄球菌引发的感染疾病尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）及其应用。该菌株分离自发酵乳样本，能有效的抑制假中间葡萄球菌的增殖，能有效预防和治疗犬脓皮病及其他假中间葡萄球菌引发的感染疾病。
本发明所提供的乳酸乳球菌，为乳酸乳球菌VHPribo V60（Lactococcus lactis VHPribo V60），已于2022年8月19日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M20221308。
所述乳酸乳球菌VHPribo V60株，其16s rDNA序列SEQ ID NO:1。
所述乳酸乳球菌VHPribo V60株，其MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图2所示；其Riboprinter 指纹图谱如图3所示；其RAPD指纹图谱如图4所示；rep-PCR指纹图谱如图5所示。
本发明提供的乳酸乳球菌在制备具有抑制假中间葡萄球菌功能的制品中的应用。
本发明提供的乳酸乳球菌在制备用于防治犬脓皮病的制品中的应用。
本发明提供的乳酸乳球菌在制备用于治疗细菌性皮肤感染的制品中的应用。
所述的制品为功能性食品、保健品或药品。
一种治疗犬脓皮病的药品，包含乳酸乳球菌VHPribo V60株和/或其发酵产物。
一种治疗犬脓皮病的药品，包含乳酸乳球菌VHPribo V60株的裂解液。
本发明提供的乳酸乳球菌VHPribo V60耐酸耐胆盐特性良好，对人工肠胃液具有很强的耐受性，经人工胃液消化后活菌量基本没有变化，经过人工肠液消化后活菌量仅下降0.78个Log值。
所述乳酸乳球菌VHPribo V60可以有效的抑制假中间葡萄球菌的生长，其菌液和发酵液的抑菌圈直径分别达到1.68cm和1.54cm；且对假中间葡萄球菌有凝集作用，而其本身并无自凝集特性。
乳酸乳球菌VHProbi V60在动物皮肤微环境体外模拟体系中对假中间葡萄球菌的增殖生长有良好的抑制效果。与对照组相比，与乳酸乳球菌VHProbi V60共培养的实验组假中间葡萄球菌的活菌量显著下降；其中，共培养8h时，其活菌量仅有对照组的31％，共培养24h时，其活菌量仅有对照组的2％，效果非常显著。
乳酸乳球菌VHProbi V60可用于犬脓皮病的预防和治疗，能有效缩小皮损面积，改善红肿、化脓程度，效果显著。
本发明提供的乳酸乳球菌VHProbi V60，对机体无毒害作用，可以添加在食品或药品中，用于防治犬脓皮病，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为V60菌株菌落照片；
图2为V60菌株MALDI-TOF核糖体蛋白峰图；
图3为V60菌株Riboprinter 指纹图谱；
图4为V60菌株的RAPD指纹图谱；
图5为V60菌株的rep-PCR指纹图谱；
图6为V60菌株API50CHL碳源代谢图谱；
图7为抑菌圈照片；
图8为凝集实验结果对比；
图9为假中间葡萄球菌生长趋势对比图；
图10为细胞活性对比图；
图11为患病犬治疗前后皮损面积对比图。
具体实施方式
本发明提供的乳酸乳球菌VHProbi V60符合法规要求，经多相分类学鉴定，乳酸乳球菌VHProbi V60为一株新发现的菌株。本发明提供的乳酸乳球菌VHProbi V60能够有效治疗和缓解犬脓皮病，单独使用该菌株且无需与抗生素复配即可对犬脓皮病有缓解功效；具有重要的应用价值。
申请人于2022年8月19日将所述乳酸乳球菌VHProbi V60保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M20221308。
本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
实施例1：乳酸乳球菌VHProbi V60的分离筛选
1、初筛
配制MRS琼脂培养基，121℃高压灭菌15 min。
取1g发酵乳制品样本（共计3个样本，取样过程符合生物取样的伦理标准），经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出66株潜在乳酸杆菌，分别命名为V01、V02、……、V60、V61、V62、V63、V64、V65、V66。
2、复筛
配制1L的MRS液体培养基，121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中水浴1h，制成耐酸性培养基。
将筛选得到的66株乳酸杆菌V01、V02、……、V60、V61、V62、V63、V64、V65、V66按6%接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。
结果显示，在所述66株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值中，V60菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.50 Log CFU/g。从而说明V60菌株耐酸能力最高。
实施例2 菌株鉴定
1、菌落形态鉴定
将V60菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见V60单菌落呈乳白色，菌落直径在1.5-2mm左右，表面光滑，显微镜下呈短杆状。菌落及光镜下照片如图1所示。
2、生理生化特性鉴定
本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜V60菌液，5000rpm/min离心5 min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
2.1、过氧化氢酶实验
取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3%过氧化氢溶液，观察到 V60 菌株不产生气泡，是阴性反应。
2.2、碳源代谢试验
利用API 50CHL试剂验证菌株V60的碳源代谢性能。API 50CHL试剂可用来鉴定菌株在属或种水平上的差异。实验方法及结果分析具体参见API 50CHL试剂盒说明书。分析结果显示菌株V60与乳酸乳球菌的ID值为99.8%，碳水化合物代谢活性相同，API试验结果见图6。
2.3 MALDI-TOF-MS检测菌株核糖体蛋白表达
按照0.1%的接种量在MRS液体培养基中接种新鲜菌液，37℃，150rpm培养48h后，收集菌体，无菌水洗涤4次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μL裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μL基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品中蛋白质电离，离子在10~20KV电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同检测蛋白质的分子量。利用Autofms 1000 分析软件Autof Analyzer v1.0获取蛋白指纹图谱，V60菌株主要核糖体蛋白的离子峰为：m/z3329.185、3345.354、3361.879、3865.892、5178.770、6526.478、7853.130、8213.984、9512.515。鉴定结果如图2所示。
3、分子生物学鉴定
3.1 16s rDNA 基因序列分析
3.1.1 基因组DNA提取
参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP302）操作。
3.1.2 16s rDNA 基因扩增
引物序列：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
通过测序获得V60菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI 数据库中进行比对，初步确定V60菌株为乳酸乳球菌。
3.2 Riboprinter指纹图谱
用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter 系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，V60菌株为乳酸乳球菌，其Riboprinter指纹图谱结果见图3。
3.3 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定
3.3.1 RAPD指纹图谱鉴定
1）引物序列： GAGGGTGGCGGTTCT。
2）RAPD 反应体系
表1 RAPD 反应体系
反应成分 体积
TaqDNA 聚合酶(5U/μL) 0.2 μl
10×Buffer（含Mg2+） 2 μl
引物（10 uM） 1 μl
dNTPs（2.5 mM） 0.8 μl
DNA模板 2 μl
无菌双蒸水 14 μl
总体积 20 μl
3）电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶板，DL2000DNA Marker 作为结果对照，稳压100V电80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。V60菌株的RAPD指纹图谱如图4所示。
3.3.2 rep-PCR指纹图谱
1)引物序列：CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。
2)rep-PCR 的反应体系
表2 rep-PCR 的反应体系
反应成分 体积
r TaqDNA聚合酶 0.2 μl
10×Ex Taq DNA Buffer（含Mg2+） 2 μl
引物（10 uM） 1 μl
dNTPs（2.5 mM） 2 μl
DNA模板 2 μl
无菌双蒸水 12.8 μl
3）电泳
DL2000 DNA Marker 作为结果对照。电压100 V，电泳时间80min 检测扩增结果。V60菌株的rep-PCR 指纹图谱如图5所示。
综上，结合V60 菌 株 的 菌 落 形 态 、生 理 生 化 特 性 结 果 以及分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，V60 菌株为一株新的乳酸乳球菌，将其命名为乳酸乳球菌VHProbi V60。
实施例3 乳酸乳球菌VHProbi V60对人工胃液和人工肠液的耐受性试验
1、人工胃液的配制
分别称取蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
2、人工肠液的配制
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐 3.0g，加入77mL 的0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
3、试验方法
取2mL新鲜菌液，5000rpm/min 离心5min 收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL 生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床（200rpm/min）3h，取样1mL，检测活菌量。
活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量（Log CFU/mL）见表3。
表3 人工胃肠液消化后的活菌量
消化前 人工胃液消化后 人工肠液消化后
7.23±0.17 7.18±0.06 6.45±0.03
从表3可知，本发明筛选到的乳酸乳球菌 VHProbi V60 经人工胃液消化后活菌量基本没有变化，经过人工肠液消化后活菌量仅下降0.78个Log值。说明该菌株对人工胃肠液具有很强的耐受性。
实施例4 乳酸乳球菌VHProbi V60对酸和胆盐的耐受性试验
1、接种液的准备：取20ul乳酸乳球菌VHProbi V60菌液，加入980ul生理盐水稀释混匀，作为接种液。
2、培养基的配置：MRS液体培养基调pH3.5，MRS液体培养基加入0.3%牛胆盐，121℃，高压灭菌15min。
3、在96孔板中按分别加入180ul MRS液体培养基、pH3.5的MRS液体培养基和含0.3%牛胆盐的MRS液体培养基，然后再加入20ul接种液。每孔加入50ul液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。
4、将96孔板置于37℃培养箱培养3天，观察菌株是否生长，并测0h和72h的OD600值。
菌株在普通MRS生长的前提下，结合0h和72h的OD600值差异显著，且肉眼观察到pH3.5的MRS液体培养基或含0.3%牛胆盐的MRS液体培养基变浑浊，则该菌株耐受酸或胆盐。OD600值见表4。
表4 V60株0h和72h OD600值
时间 空白 耐酸 耐胆盐
0h 0.1536 0.0881 0.1532
72h 2.1854 1.4876 2.1068
通过肉眼观察可知，pH3.5的MRS液体培养基和含0.3%牛胆盐的MRS液体培养基均变浑浊，由OD600值也可得出乳酸乳球菌VHProbi V60耐酸及耐胆盐特性良好。
实施例5 乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌的抑制实验
1、抑菌圈实验
配置MRS肉汤培养基、琼脂培养基，121℃高压灭菌15min，琼脂培养基倒平板。
称取3.85gBHI肉汤培养基，0.6g琼脂，加入100ml纯水混匀，121℃高压灭菌15min，配置成BHI半固体培养基。
在琼脂平板上放置无菌的牛津杯。
假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874、乳酸乳球菌VHProbi V60活化两代后，取假中间葡萄球菌ATCC49444菌液50ul、假中间葡萄球菌ATCC51874菌液菌液50ul置于BHI半固体培养基中，摇匀倒入琼脂平板中，待其凝固，取出牛津杯，在孔洞中分别加入100ul乳酸乳球菌VHProbi V60菌液及乳酸乳球菌VHProbi V60发酵液，另一孔洞加入100ul MRS液体培养基做对照，37℃ 有氧条件下静置培养48小时。
观察并测量抑菌圈直径（cm），结果见表5：
表5 抑菌圈直径（cm）
对照 菌液 发酵液
无 1.68 1.54
结果如图7所示，加入MRS肉汤培养基的对照孔洞周围无抑菌圈出现，而加入乳酸乳球菌VHProbi V60菌液和发酵液的孔洞周围均出现界限清晰的抑菌圈，表明乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌具有显著的抑制生长作用。
实施例6 乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌的凝集实验
假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874、乳酸乳球菌VHProbi V60活化两代后，取新鲜菌液，6000rpm离心 4min，假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874浓缩两倍，乳酸乳球菌VHProbi V60浓缩4倍，用Tris盐缓冲液洗2次，同种缓冲液重悬。
取乳酸乳球菌VHProbi V60菌悬液300ul加入24孔酶标板，再分别加入300ul假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874菌悬液作为反应样本，另取等量乳酸乳球菌VHProbi V60菌悬液和缓冲液混合作为对照，每个对照及样本设2平行。
将24孔酶标板置于微孔板恒温振荡器中，400rpm，室温，振荡孵育。
振荡孵育至少24h，期间，每振荡30min，停机30min，观察结果，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态，得到凝集结果。
如图8所示，在振荡6h时，反应样本出现明显的凝集点，而对照组样本无凝集点出现；反应进行到24h时，反应样本有明显的凝集点，而对照组样本仍无凝集点出现。实验结果表明，乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌有凝集作用，而其本身并无自凝集特性。
实施例7 乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌的增殖抑制实验
构建动物皮肤微环境体外模拟体系：取2.5g蛋白胨、1.6g酪蛋白胨、0.2g牛肉浸粉、0.3g氯化钠、1g葡萄糖、溶解于100ml纯净水混匀，121℃，高压灭菌15min。
假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874、乳酸乳球菌VHProbi V60活化两代后，取1.5ml新鲜菌液，6000rpm离心4min，取菌泥。加入1.5ml动物皮肤微环境体外模拟体系重悬混匀，得到假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874及乳酸乳球菌VHProbi V60菌液样本。
将假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874按1：1体积比混匀，得到致病菌菌液样本。
取1.3ml致病菌菌液样本、1.3ml乳酸乳球菌VHProbi V60菌液样本混匀，得到实验组样本，取1.3ml致病菌菌液样本加入等量动物皮肤微环境体外模拟体系混匀，作为对照组样本，置于37℃，有氧条件下培养。分别在0h、4h、8h、12h、24h时取100ul实验组及对照组，用甘露醇高盐琼脂培养基检测假中间葡萄球菌活菌量。
活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，结果见表6。
表6 24h内假中间葡萄球菌活菌量（CFU/ml）变化
时间 对照组样本活菌量 实验组菌液样本活菌量
0 h 1.55×108 1.68×108
4 h 2.46×108 1.55×108
8 h 3.95×108 1.23×108
12 h 5.42×108 0.52×108
24 h 6.70×108 0.16×108
从表6和图9的数据可以看出，与对照组相比，与乳酸乳球菌VHProbi V60共培养的实验组假中间葡萄球菌的活菌量显著下降；其中，共培养8h时，其活菌量仅有对照组的31％，共培养24h时，其活菌量仅有对照组的2％，从而说明乳酸乳球菌VHProbi V60在动物皮肤微环境体外模拟体系中对假中间葡萄球菌的增殖生长有良好的抑制效果。
实施例8 乳酸乳球菌VHProbi V60对细胞活性的影响实验
1、益生菌/致病菌样品处理：假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874、乳酸乳球菌VHProbi V60分别培养至稳定期，12000转离心，取上清液，0.22μm无菌滤膜过滤后备用。
2、细胞处理：
（1）从液氮罐中取出角质形成细胞hacat，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。所用培养基为RPMI1640+10%FBS+1%双抗。倒置显微镜下观察细胞生长融汇接近80%时可进行后续实验。
（2）弃掉原培养基，PBS润洗两遍，加入适量胰酶。加入胰酶后将细胞放回培养箱，肉眼观察到细胞完全脱落后，加入2~3倍胰酶体积的培养液终止消化，反复吹打十次左右，镜下观察，尽量成单细胞状态。
（3）单细胞悬液吸入15ml或50ml离心管，1000转离心5分钟。离心后弃上清，轻弹散细胞沉淀，加入适量新培养基吹打重悬。
（4）血球计数板进行细胞计数，使用PBS适量稀释细胞悬液，细胞稀释至每大格20~50细胞。细胞浓度计算公式：
细胞浓度（cells/ml）=4个大格细胞数量 ╳ 10000╳稀释倍数。
（5）96孔板中每个孔细胞的铺板个数为1╳104cells，每孔培养液的添加量为100μl。将96孔板放置二氧化碳培养箱中24小时，待细胞完全贴壁后，进行后续实验。
3、更换培养基，益生菌/致病菌样品在培养基中的添加量为1/50。分组如下（每组3个平行）：
空白对照组：细胞正常条件下培养；
益生菌组：加入乳酸乳球菌VHProbi V60；
致病菌组：分别加入假中间葡萄球菌ATCC49444、假中间葡萄球菌ATCC51874；
实验A组：同时加入假中间葡萄球菌ATCC51874和乳酸乳球菌VHProbi V60
实验B组：同时加入假中间葡萄球菌ATCC49444和乳酸乳球菌VHProbi V60
4、继续培养24h后使用CKK-8试剂盒检测细胞活力，每孔加入10μlCKK-8溶液，培养箱内孵育2h。酶标仪450nm下测吸光度值。
通过酶标仪测得的吸光度值绘制细胞活性变化柱形图如图10所示。
从图10可知，与对照组相比，加入乳酸乳球菌VHProbi V60的益生菌组细胞活性基本没有影响，加入假中间葡萄球菌的致病菌组细胞活性明显降低。与致病菌组相比，同时加入假中间葡萄球菌和乳酸乳球菌VHProbi V60的实验组A组、B组细胞活性有了明显改善。从而说明，本发明提供的乳酸乳球菌VHProbi V60能有效改善假中间葡萄球菌对细胞的损伤。
实施例9 乳酸乳球菌VHProbi V60对犬脓皮病的治疗效果实验
申请人挑选了3只患脓皮病的犬进行治疗试验。
在每只犬的皮损处一半涂抹生理盐水为对照组，另一半涂抹乳酸乳球菌VHProbiV60发酵上清液为实验组，涂抹量均为每日2次，早晚各一次，每次于患处用药 0.3 mL/cm2，连续涂抹7天，测量记录涂抹前后皮损面积。
实验结果如图11所示，涂抹生理盐水的对照组犬只皮损面积几乎无变化，皮损情况无好转；而涂抹乳酸乳球菌VHProbi V60发酵上清液的实验组犬只皮损面积明显减小，且红肿、化脓程度有所改善，效果显著。
综上所述，本发明提供的乳酸乳球菌VHProbi V60对于模拟人工肠胃液具有很强的耐受能力，耐酸耐胆盐特性良好，这对于益生菌顺利经过胃肠道并在结肠处定植及发挥益生功能奠定了基础。同时，细胞活性实验证实乳酸乳球菌VHProbi V60对细胞的活性没有影响，生物安全性良好。乳酸乳球菌VHProbi V60对假中间葡萄球菌的增殖生长有良好的抑制作用，可广泛用于犬脓皮病及人类感染假中间葡萄球菌的防治。

Claims (9)

1.一种乳酸乳球菌，其特征在于，所述乳酸乳球菌的保藏号为CCTCC NO：M20221308。
2.如权利要求1所述的乳酸乳球菌，其特征在于，所述乳酸乳球菌的16s rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的乳酸乳球菌，其特征在于，所述乳酸乳球菌的MALDI-TOF核糖体蛋白分子量图谱如图2所示；其Riboprinter 指纹图谱如图3所示；其RAPD指纹图谱如图4所示；rep-PCR指纹图谱如图5所示。
4.权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备具有抑制假中间葡萄球菌功能的制品中的应用。
5.权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备用于防治犬脓皮病的制品中的应用。
6.权利要求1所述的乳酸乳球菌在制备用于治疗细菌性皮肤感染的制品中的应用。
7.如权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的制品为食品、保健品或药品。
8.一种治疗犬脓皮病的药品，其特征在于，所述的药品包含权利要求1所述的乳酸乳球菌和/或其发酵产物。
9.一种治疗犬脓皮病的药品，其特征在于，所述的药品包含权利要求1所述的乳酸乳球菌的裂解液。
CN202211368237.6A 2022-11-03 2022-11-03 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用 Pending CN116622540A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211368237.6A CN116622540A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211368237.6A CN116622540A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116622540A true CN116622540A (zh) 2023-08-22

Family

ID=87637098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211368237.6A Pending CN116622540A (zh) 2022-11-03 2022-11-03 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116622540A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112625979B (zh) 一种对抗幽门螺杆菌的干酪乳杆菌及其应用
Shi et al. Evaluation of safety and probiotic properties of a strain of Enterococcus faecium isolated from chicken bile
CN112940970B (zh) 一种肠道益生菌及其在治疗肿瘤和替代抗生素中的应用
CN113040390B (zh) 一株益生、耐盐约氏乳杆菌及其在畜禽水产养殖中防治病原菌的应用
CN112812999B (zh) 一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌slb01及其衍生产品和应用
RU2455355C1 (ru) ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Pseudomonas aeruginosa, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ОСНОВЫ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ
CN114672443A (zh) 一株具有预防或改善面部泛红和i型玫瑰痤疮功能的植物乳植杆菌
CN110004072A (zh) 一株益生性粪肠球菌分离株a3-1及其应用
CN108542954A (zh) 一种抑菌抗病毒的中药凝胶组合物
CN111019858A (zh) 一种抑制细菌生物膜形成的饲用地衣芽孢杆菌及其应用
CN117143767B (zh) 可调节肠道菌群的母乳源发酵粘液乳杆菌msjk0025及其应用
CN112322553B (zh) 一种抗艰难梭菌的乳酸乳球菌及其应用
CN117431173A (zh) 一种抗菌高原戊糖片球菌tr-37及其无细胞提取物和应用
CN113088468A (zh) 干酪乳杆菌Ma.GLRGJ 1及其应用
CN116254187A (zh) 一株植物乳植杆菌及其在抗肺炎链球菌呼吸道感染中的应用
CN116622540A (zh) 一株用于防治犬脓皮病的乳酸乳球菌及其应用
CN115925832A (zh) 一种乳酸菌素及其在防控畜禽细菌感染的应用
CN112877239B (zh) 一株乳酸杆菌菌株及其应用
CN115637240A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN113215067A (zh) Vbnc状态短乳杆菌cshrr5-3菌株及其应用
RU2203947C1 (ru) Штамм бактерий bacillus licheniformis, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы
AU2023226655B8 (en) Breast Milk-Derived Lactobacillus Plantarum HM-P2 and Use Thereof
CN115154489B (zh) 一种治疗羊干酪性淋巴结炎的多菌群复合制剂及培养物
CN114015598B (zh) 分离自藏灵菇的乳酸片球菌及其在防治轮状病毒感染中的应用
CN112522160B (zh) 一株具有抗病毒能力的发酵乳杆菌pv22及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination