CN112522160B - 一株具有抗病毒能力的发酵乳杆菌pv22及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有抗病毒能力的发酵乳杆菌PV22及其应用。Lactobacillus fermentum PV22于2020年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No.61376。发酵乳杆菌PV22能显著降低病毒的感染力，短时间内即达明显拮抗病毒的效能，且抗病毒效果随作用时间延长而增加，还可提高感染病毒细胞的感染后存活率。因此发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22可在制备预防或治疗病毒感染的产品(如食品、药品和保健品等)中进行应用，具有巨大的应用前景。

Description

一株具有抗病毒能力的发酵乳杆菌PV22及其应用
技术领域：
本发明属于微生物技术领域以及医药技术领域，具体涉及一种具有抗病毒功能的发酵乳杆菌PV22及其应用。
背景技术：
病毒感染是威胁全世界人类健康、导致人类死亡的重要疾病之一。近20年历发生的3次较中大的病毒性肺炎疫情，尤其是新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease2019,COVID-19)引起的全球疫情暴发，严重威胁人类生物健康，也造成了严重的经济损失。因此，寻找有效、安全的针对病毒防控方法具有重大的应用研究价值。
预防及治疗病毒性感染是一个全球性的公共卫生研究热点议题。目前已被证实确切有效的病毒防控手段主要为抗病毒药物的研制及针对性疫苗的开发。目前，通过化学合成的抗病毒药物主要的作用机制包括：抑制病毒穿入及脱壳、抑制DNA多聚酶逆转录酶、神经氨酸酶及蛋白质的功能。这些药物大部分对正常机体细胞亦有毒性作用，因此其其广泛使用收到一定限制。针对抗病毒药物的不足，研究者们有通过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂，通过增强机体自动识别、清除病毒的能力，达到防控病毒感染的目的。
虽然人类早已认识到病毒感染的严重性，且越来越重视病毒的监测及公共卫生管理，但是近来年各种呼吸道、消化道病毒感染仍呈间断式暴发。病毒难以得到控制的主要原因在于：(1)病毒的种类繁多，数量巨大，致病机制复杂，缺乏广谱抗病毒的药物；(2)病毒具有较高的变异性，容易产生药物耐受及免疫逃逸；(3)病毒与宿主细胞有高度亲和性，抗病毒药物对宿主细胞亦具有一定的毒性作用，因此抗病毒使用受到限制。
益生菌是一种对宿主健康产生促进作用的活性微生物，也是一类被认为具有长期安全的食品级微生物。目前最常用于食品级医药产品的益生菌主要是乳杆菌及双歧杆菌，其已被广泛应用于如酸奶、泡菜等发酵食品中。欧洲食品安全局对于可应用于食品的益生菌有严格的定义，包括：(1)必须能够在胃肠道中存活并在肠道中繁殖；(2)应通过人体的生长和/或活动对宿主产生益处；(3)应无病原，无毒；(4)通过多种机制提供针对病原微生物的保护；(5)应该缺乏可转移的抗生素耐药性。目前，益生菌的多种益生功能已被明确：抗过敏、缓解肠道功能紊乱、恢复肠道微生态平衡、修复肠粘膜。
大量来自人群队列的研究发现使用益生菌产品能增强人体的抗病毒能力。早在2001年，Hatakka K等研究已发现饮用含LGG的牛奶能减少日本儿童感染呼吸道病毒的发生率；而在2012年，Kumpu M等同样证实饮用含LGG的牛奶改善欧洲儿童的流感发生。而Rerksuppaphol S、Lehtoranta L等团队发现，含其它益生菌如干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等的发酵乳同样具有减少呼吸道病毒、肠道病毒感染发生的作用。大量的研究共同指出，饮用含抗病毒作用的益生菌酸奶可降低人群尤其是儿童感染病毒的发生率，而对于不幸罹患病毒感染的患者，益生菌发酵乳亦有缓解症状、缩短病程的功效。
大量益生菌改善病毒防控的报道也促进了研究者们对益生菌抗病毒机制的研究。目前研究认为，益生菌抗病毒的机制包括：(1)益生菌的代谢产物阻碍病毒在细胞上的吸附；(2)益生菌可减少病毒对宿主细胞的内化作用；(3)益生菌的代谢产物可直接消杀病毒；(4)益生菌可上调宿主的免疫功能，增加宿主识别和抵抗病毒的能力。2007年，
Figure BDA0002855491640000021
T等的团队发现某些乳杆菌能产生特异“病毒样”蛋白，与病毒竞争结合受体细胞表面，发挥阻碍病毒入侵的作用。Servin的研究团队也发现，益生菌发酵液中含大量的有机酸、过氧化氢和生物表面活性剂，均能有效杀灭病毒。研究者同样发现，益生菌的代谢产物能抑制病毒的复制。同时，有更多的实验数据提示益生菌能增强宿主细胞的固有免疫和适应性免疫，进而减少病毒的入侵。例如，O’Hara AM等学者发现，益生菌可以调节肠道、呼吸道上皮细胞的免疫受体表型，从而增强机体固有免疫的抗病毒功能。而Weiss G等学者则发现一些乳杆菌如嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌具有调控免疫细胞产生抗病毒效应分子的能力，继而提升机体抗病毒功能。基于大量的生理病理机制研究及人群前瞻性研究，不难发现益生菌制剂在抗病毒领域具有安全性高、抗病毒机制新颖的优点，具有巨大的开发应用潜能。
然而，大量研究已证实通过基因组信息验证为同一种属的不同细菌菌株可能对宿主产生完全不同的作用。而在抗病毒领域，学者们也发现良好的抗病毒效应仅存在于极少部分的益生菌菌株中，而这些性能优良的益生菌菌株目前绝大部分被国外的机构所垄断。
因此，从本土优良的资源出发，寻找有效预防及治疗病毒感染的新药物或者新方法，有利于突破目前病毒防控上的瓶颈问题，研发出有效的抗病毒手段。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种具有抗病毒能力的发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22。其可通过降低MNV病毒的感染力、减少病毒对细胞的损伤，有效预防和治疗病毒引起的感染性疾病。
本发明的发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22已于2020年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No.61376。
本发明的第二个目的是提供上述发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22在制备预防和/或治疗病毒感染的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗病毒感染的产品，其含有发酵乳杆菌PV22、发酵乳杆菌PV22的发酵液或发酵上清液作为活性成分。
所述的预防和/或治疗病毒感染的产品是预防和/或治疗诺如病毒感染的产品，例如利用发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22制备成诺如病毒的抑制剂，或是制备成诺如病毒(MNV)感染的治疗药物或是预防药物。
本发明的一种实施方式中，所述的发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22是以发酵乳杆菌PV22发酵液或发酵上清液在制备预防和/或治疗病毒感染的产品中的应用。。
本发明的一种实施方式中，所述产品可以为食品、药品或保健品。
本发明的第四个目的是提供特异识别发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的靶标核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第五个目的是提供针对上述靶标核苷酸序列设计的特异性扩增引物，包括SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明的第六个目的是提供鉴别上述发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的方法，其是利用上述特异性扩增引物作为引物，以待测发酵乳杆菌的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得PCR产物，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。从而该核苷酸序列能特异区分发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22与其它乳杆菌分离株。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明中的益生菌来源于世界长寿之乡——中国广东省梅州市蕉岭县百岁老人，为本土来源的优良菌株。
2、与传统抗病毒化学药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。
3、本发明使用方便、安全，具有经济高效的有点。
4、本发明具有良好的抗病毒作用，具体体现为：
(1)显著降低病毒的感染力；
(2)短时间内即达明显拮抗病毒的效能，且抗病毒效果随作用时间延长而增加；
(3)提高感染病毒细胞的感染后存活率。
5、本发明从基因组及表型检测多角度已证实无对人体有潜在的危害，其发酵液对细胞无毒性。
6、本发明具有良好的耐受胃肠道环境能力及粘附定植能力，有良好的益生潜能。
因此，发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22在制备预防或治疗病毒感染的产品(如食品、药品和保健品等)中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏信息：
Lactobacillus fermentum PV22于2020年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No.61376。
附图说明：
图1是发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22在乳杆菌属中的进化地位；
图2是不同发酵乳杆菌(L.fermentum)分离株发酵液对MNV病毒感染力的影响，图注：*：P<0.05；**：P<0.01；
图3是发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液作用时间对MNV病毒感染力的影响，图注：*：P<0.05；**：P<0.01；
图4是发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22对感染MNV的RAW264.7细胞细胞存活率的影响，图注：*：P<0.05；
图5是发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的全基因组图，图注：从外至内的各环分别代表该菌的核苷酸序列、正链上的CDS、反向链上的CDS、该菌的RNA基因、与已知抗微生物耐药基因具有同源性的CDS、与已知毒力因子具有同源性的CDS、GC含量和GC偏斜；
图6是发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的分子靶标验证，图注：Marker为DNAmarker，46、93为发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22经引物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)扩增后的PCR产物电泳图，1-22、24-45、47-92为其他乳杆菌经分子靶标序列扩增后的PCR产物电泳图，23为ddH2O。
具体实施方式：
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
下述实施例中涉及的培养基如下
MRS琼脂平板(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0ml/L、K2PO4·3H202.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、MgSO4·7H200.2g/L、MnSO4·4H200.05g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。
MRS肉汤培养基(g/L)：酪蛋白酶消化物10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、柠檬酸三铵2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、MgSO4·7H200.2g/L、MnSO4·4H200.05g/L、K2PO4·3H202.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0g/L，溶剂为水，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。
DMEM细胞培养基(mg/L)：二水合氯化钙265.00mg/L、九水合硝酸铁0.10mg/L、氯化钾400.00mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400.00mg/L、无水磷酸二氢钠109.00mg/L、丁二酸75.00mg/L、丁二酸钠100.00mg/L、L-盐酸精氨酸84.00mg/L、L-盐酸胱氨酸63.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、L-盐酸组氨酸42.00mg/L、L-异亮氨酸105.00mg/L、L-亮氨酸105.00mg/L、L-盐酸赖氨酸146.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L、L-丝氨酸42.00mg/L、L-苏氨酸95.00mg/L、L-色氨酸16.00mg/L、L-酪氨酸72.00mg/L、L-缬氨酸94.00mg/L、D-泛酸钙4.00mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.00mg/L、肌醇7.20mg/L、烟酰胺4.00mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、葡萄糖1000.00mg/L、丙酮酸钠110.00mg/L、酚红15.00mg/L。
实施例1乳酸菌的分离、鉴定
1.1.乳酸菌的分离
采集世界长寿之乡——中国广东省梅州市蕉岭县百岁老人的粪便作为样本，在无菌环境下，取0.1g粪便样本加入10mlMRS液体培养基，震荡混匀后于37℃厌氧条件下富集培养24h，吸取0.5ml菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10-1至10-8稀释梯度菌悬液，选取10-6、10-7、10-8三个梯度菌悬液，分别吸取100μl至MRS琼脂培养基，使用涂布棒涂抹均匀，再于37℃厌氧条件下培养48h。挑取平板上形态典型的菌落至MRS琼脂培养基上进行划线纯化，纯化后挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，30％甘油保藏于-80℃超低温冰箱中，由此获得菌株PV22。
1.2.乳酸菌的鉴定
采用细菌DNA提取试剂盒(Mabio，CHINA)对菌株PV22进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix(Dongshengbio，CHINA)进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16SrRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；下游引物序列为1492R：5’-CTACGGC TAC CTT GTT ACG A-3’。PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。获得的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与发酵乳杆菌同源性最高，命名为发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22。发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22与NCBI数据库其他乳杆菌标准株的亲缘进化关系如附图1所示。
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)PV22，于2020年12月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCCNo.61376。
实施例2乳酸菌的培养及乳酸菌发酵液的制备
2.1.乳酸菌的培养
将发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22从甘油管中接种至MRS琼脂平板上，于37℃厌氧培养48h，观察其菌落形态，并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落呈白色圆形，其菌体为短杆状。
挑取发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22单菌落接入MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养48h，制作生长曲线。发现该菌在37℃培养12h达稳定期，其发酵方式为异型发酵，可从葡萄糖产酸产气。
2.2.乳酸菌发酵液的制备
挑取发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22单菌落接入MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养48h。采用10000g×4℃离心15min，获取发酵上清，采用1mol/LNaOH将发酵液pH调整至7.35-7.45。采用0.22μm滤膜过滤调整pH值后的发酵上清，获得乳杆菌发酵的无细胞上清液，冻存于-80℃待用。
实施例3乳酸菌抗病毒能力的评估
3.1.细胞培养及传代
采用鼠源性诺如病毒(murine norovirus,MNV)的扩增及感染体系。
细胞培养：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞培养于含10％胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5％CO2。培养48h后细胞可铺满T25细胞培养瓶底部80％，此时可进行细胞的传代。
细胞传代：采用无菌巴氏吸管移除瓶内旧培养基，用PBS溶液洗去残留培养基。向瓶内加入2ml 0.25％含EDTA的胰酶，室温孵育3min后显微镜下观察细胞收回突触或细胞间隙增大后立即用含血清培养基终止消化。用无菌巴氏滴管轻柔吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。将细胞悬液转至15ml无菌离心管中，500g×离心5分钟，弃上清后采用PBS细胞2次，后重悬细胞于含10％FBS的DMEM培养基中，计数后分装至新的T25细胞培养瓶中，并补足培养基。
3.2.MNV病毒增殖与感染力评估
MNV病毒增殖：将-80℃保存的MNV病毒液接种到长有单层RAW264.7细胞的T25培养瓶中，37℃5％CO2吸附1-2h。弃去病毒接种液，加入6ml含2％FBS的DMEM培养基，继续置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养，每日观察细胞生长情况及确定何时出现致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。当50％或以上细胞出现CPE时收毒。将细胞培养瓶在-80℃及37℃水浴中反复冻融3次，后将细胞悬液完全转至离心管中。3000g×4℃离心5min，弃沉淀，收集上清分装保存于-80℃，得到病毒液。
MNV病毒感染力测定：MNV病毒感染力采用其半数组织培养感染剂量(mediantissue culture infective dose，TCID50)测量确定。在无菌离心管中将病毒液作连续10倍的倍比稀释，从10-1-10-7。将培养至可传代的RAW264.7细胞接种于96孔微量培养板中，接种浓度为104/孔，每孔加入含2％FBS的DMEM培养基体积100μl。将稀释好的病毒液100μl接种到含RAW264.7的96孔板中，每一个稀释度接种8孔，同时设8孔不接种病毒作为正常对照。每日观察平板，10-102倍稀释度实验孔感染病毒后48小时出现细胞病变，103-106倍稀疏度实验孔感染病毒后72小时出现细胞病变。持续观察7天，正常对照孔未发生与感染孔不同的变化，即可统计数据计算结果。
TCID50统计采用Karber法。其计算公式为lgTCID50＝最高稀释度的对数-稀释度对数间差值×(阳性孔比率总和-0.5)
3.3.乳酸菌发酵液对MNV病毒感染力的影响评估
将乳酸菌发酵液与病毒液以体积比1:1比例混合、在室温共孵育一定时间后，再按照3.2的方法评估MNV的病毒感染力。
3.3.1.不同来源发酵乳杆菌(L.fermentum)分离株的发酵液对MNV病毒感染力评估
不同来源发酵乳杆菌分离株的发酵液(无细胞上清液)在体积比1:1比例与病毒液于室温孵育15分钟后，MNV病毒的TCID50如附图2所示，以MRS和DMEM与病毒液共孵育作为对照。由附图2可知，人源分离株发酵乳杆菌(L.fermentum)PV18、PV22与病毒共孵育15分钟后，MNV的TCID50降至10-3.83/0.1ml、10-2.21/0.1ml，而发酵乳制品分离株发酵乳杆菌XJC21、XJC65与病毒共孵育15分钟后MNV的TCID50为10-4.54/0.1ml、10-3.92/0.1ml。与孵育MRS相比，发酵乳杆菌PV22的发酵液能明显减低MNV病毒的感染力。
3.3.2.发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液作用时间对MNV病毒感染力评估
发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液(无细胞上清液)与病毒液以体积比1:1比例混合后孵育不同时间后，MNV病毒TCID50如附图3所示。由附图3可见，PV22发酵液孵育5分钟后，MNV病毒的-lgTCID50由4.54降至2.71(P<0.05)，即MNV感染力已出现明显下降。随着孵育时间延长，MNV感染力逐步下降，至孵育至45分钟，MNV的-lgTCID50降至1.67。结果提示发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液对病毒感染力的抑制作用会随着时间的延长而增加。
实施例4乳酸菌提高细胞抗病毒能力的评估
4.1.细胞存活率评估
采用细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法对活细胞进行定量。细胞培养及传代方法如前所述。将RAW264.7细胞以1×104/孔密度接种于96孔板中，加入100μl培养基培养(含或不含待测物质)，于37℃5％CO2培养箱中培养24h。24h后在每孔细胞中加入10μl CCK-8溶液，后置入培养箱中孵育2h。2h后取出96孔板，在轨道振动器上轻轻混合1分钟，使用酶标仪测量每孔在450nm处的吸光度。同时设置仅含培养基的空白孔(Blank)和含细胞及纯培养基的对照孔(Control)。
细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100
As：实验孔在450nm处的吸光度。
Ab：空白孔在450nm处的吸光度。
Ac：对照孔在450nm处的吸光度。
4.2.乳酸菌发酵液提高细胞抗病毒能力评估
将RAW264.7细胞以104/孔密度接种于96孔板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养24h。每孔加入10μl发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22乳酸菌发酵液(无细胞上清液)，置入37℃5％CO2培养箱中培养4h。4小时后吸走孔内所有培养基，用PBS洗涤细胞2次。在每孔细胞中加入100μl含2％FBS的DMEM细胞培养基及10μl病毒液，重新置入37℃5％CO2培养箱中培养24h。24小时后对处理的细胞进行细胞存活率检测，以MRS或DMEM替代发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22乳酸菌发酵液作为对照。
由附图4可知，采用发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的发酵液(无细胞上清液)预处理后RAW264.7细胞在感染MNV后存活率明显提升(38.26％vs15.43％，P＝0.025)。结果提示发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的发酵液有提高RAW264.7细胞抗病毒能力。
实施例5乳酸菌基因组及表型的安全性评价
5.1.乳酸菌的基因组特征及安全性评估
采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina(CISTRO,CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit(Illumina,USA)试剂盒测序。三代测序采用Rapid Barcoding Sequencing Kit(Nanopore,UK)建库，后采用R9.4.1芯片(Nanopore,UK)测序。下机数据分别采用Trimmomatic(v0.39)及Filtlong(v0.2.0)软件进行质控，后采用Unicycler(v0.4.8)软件进行组装。组装后发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的基因组采用Quast(v5.0.2)软件进行基因组质控评估，采用Abricate(v0.8.13)软件查找并注释毒力基因及耐药基因。
经测序获得发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22基因组完成图，附图5为该菌的可视化基因组图，该菌基因组大小为2.19Mb，GC比为51.22％，其基因组含2278个CDS、170个重复区、58个tRNA和15个rRNA，不含质粒。采用prokka软件注释发现PV22基因组中含有1669个有功能的编码基因以及609个假想蛋白。
采用Abricate软件比对VFDB(Virulence Factor Database)、ARG-Annot(Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation)、CARD(the Comprehensive AntibioticResearch Database)、Resfinder数据库，均未发现该菌含有毒力基因或耐药基因。
5.2.乳酸菌对抗生素的敏感性
根据欧盟食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)标准，使用微量肉汤稀释法检测发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22对8种抗生素的敏感性。该8种抗生素为：氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。将生长至对数生长期的乳酸菌悬液调整至0.5麦氏浊度，后加入不同浓度的抗生素稀释剂(浓度从0.5-64μg/ml)，37℃厌氧培养48小时。48小时后读取菌株对每种抗生素的最小抑菌浓度(minimalinhibit concentration，MIC)，根据EFSA提供的细菌耐药性标准判定菌株对该抗生素为敏感(sensitive，S)、中介(intermediated，I)、耐药(resistant，R)。
发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的MIC依次为：0.5μg/ml、2μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，即该菌对EFSA规定的8种抗生素菌敏感。
5.3.乳酸菌的溶血试验
在无菌环境下，用接种环接种目标乳酸菌于血平板上，37℃厌氧培养48h，观察溶血现象。48h后观察发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22菌落周围未出现溶血现象，而阳性对照金黄色葡萄球菌ATCC25923菌落周围出现透明溶血环，提示发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22不具有溶血风险。
5.4.乳酸菌发酵液对RAW264.7细胞的安全性评价
采用CCK8检测乳酸菌发酵液对RAW264.7细胞的安全性，检测方法同前述。将RAW264.7细胞以104/孔密度接种于96孔板中，加入含10％FBS的DMEM培养基，37℃5％CO2培养24h。将10μl乳酸菌发酵液加入每孔细胞中，重新置于37℃5％CO2细胞箱中培养24h。24h后进行CCK8检测评价RAW264.7细胞存活率。
检测发现发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液作用RAW264.7细胞24h后细胞存活率为109.66±16.86％，与不加入发酵液的正常细胞存活率不存在差异(P＝0.919)。因此认为发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22发酵液对于RAW264.7细胞无毒性作用。
实施例6乳酸菌益生性能评价
6.1.乳酸菌的耐受人工胃肠液实验
模拟胃液：将0.35％(w/v)胃蛋白酶溶于PBS中，用1mol/L盐酸调整pH至3.0。模拟胰液：将1.1％(w/v)NaHCO3、0.1％(w/v)胰蛋白酶加入PBS中，用1mol/LNaOH调整pH至8.0。
在无菌环境中将发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22单菌落接种入MRS培养基中，37℃厌氧培养48小时后取1ml，3000g×室温离心5min收集菌体，用无菌PBS洗涤2次后重悬于1ml模拟胃液中，37℃厌氧培养，分别在0h和3h取菌液进行平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。收集经人工胃液处理后的菌体，悬浮于等体积的模拟胰液中，37℃厌氧培养，分别在0h和24h用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。最终乳酸菌经过模拟胃肠液存活率(％)＝经模拟胰液处理24h的活菌数/经模拟胃液处理0h的活菌数×100％。
发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22在模拟胃液0h时活菌计数为108.2CFU/ml，模拟胃液3h时活菌数为107.7CFU/ml，经模拟胰液24h时活菌计数为107.6CFU/ml，存活率为25.12％，活菌计数超过1×106CFU/ml。
6.2.乳酸菌的肠粘附定植能力测定
采用乳酸菌的疏水性与自聚集能力评估该菌的肠粘附定植能力。
收集发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的菌体，用PBS洗涤2次后，用PBS重悬菌体，调节菌浊度为OD600nm＝0.6。取3ml菌悬液加入1ml二甲苯，涡旋90s混匀，静置10min至分层，对照组为不加入二甲苯自然沉降的菌悬液。记录两组下层水相沉淀物在600nm处的吸光度。
乳酸菌疏水率(％)＝[(G0-GA)/G0]×100
G0：自然沉降菌体在600nm处的吸光度。
GA：二甲苯沉降菌体在600nm处的吸光度。
实验发现发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的疏水率为50.63％。
收集发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的菌体，用PBS洗涤2次后，用PBS重悬菌体，调节菌浊度为OD600nm＝0.6。将菌悬液放于37℃厌氧孵育6h，每隔2h取样检测菌悬液在600nm处的吸光度。
乳酸菌自聚率(％)＝[1-At/A0]×100
At：不同时间采样点菌悬液在600nm处的吸光度。
A0：起始菌悬液在600nm处的吸光度。
实验发现发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22在2h的自聚率为74.68％，在4h的自聚率为82.11％。
上述结果提示发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)PV22有较好的肠道定植潜能。
实施例7乳酸菌的特异分子靶标识别
7.1.乳酸菌的特异分子靶标挖掘
采用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件对发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22及NCBI数据库内其他73株发酵乳杆菌及其它种的1400株乳杆菌的全基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins(v2.4.1)软件识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22有别于其它乳杆菌的特异序列SEQID No.4。SEQ ID No.4位于发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22基因组上的一个假定蛋白编码基因上，是一段长度397bp核苷酸序列。采用Oligo(v7)软件针对特异序列进行引物设计，获得识别该菌的特异性分子靶标序列SEQ.IDNo.2(5’-AAG GCT AAG CAG GAA CGG AC-3’)和SEQ.ID No.3(5’-TGG TCG GAT CAA AGG GTT GG-3’)。
7.2.乳酸菌特异分子识别靶标有效性验证
采用PCR及琼脂糖电泳验证发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法同前。
PCR反应体系配置如下：
Figure BDA0002855491640000171
以下为PCR反应条件：
Figure BDA0002855491640000172
PCR结束后取5-10μlPCR产物进行1.5％琼脂糖电泳。若发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22能在397bp处形成单一特异条带，而其他乳杆菌不能形成397bp的单一条带，则说明该对靶标具有良好识别发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的效能。
如附图6和表1所示，除发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22的DNA经SEQ.IDNo.2和SEQ.IDNo.3扩增后形成397bp的特异性扩增产物外，其余乳杆菌分离株均未见特异扩增产物形成。将该特异的PCR产物进行一代测序，获得SEQ.IDNo.4所示的核苷酸序列。结果提示分子靶标序列SEQ.IDNo.2、SEQ.IDNo.3和SEQ.IDNo.4能特异的鉴别发酵乳杆菌(L.fermentum)PV22与其它乳杆菌。
表1 PCR扩增结果
Figure BDA0002855491640000181
Figure BDA0002855491640000191
Figure BDA0002855491640000201
Figure BDA0002855491640000211
虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
广东环凯生物科技有限公司
<120> 一株具有抗病毒能力的发酵乳杆菌PV22及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌PV22(Lactobacillus fermentum)
<400> 1
ttaaaagatg gcttctcgct atcacttctg gatggacctg cggtgcatta gcttgttggt 60
ggggtaacgg cctaccaagg cgatgatgca tagccgagtt gagagactga tcggccacaa 120
tgggactgag acacggccca tactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 180
ggcgcaagcc tgatggagca acaccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaagctc 240
tgttgttaaa gaagaacacg tatgagagta actgttcata cgttgacggt atttaaccag 300
aaagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc 360
ggatttattg ggcgtaaaga gagtgcaggc ggttttctaa gtctgatgtg aaagccttcg 420
gcttaaccgg agaagtgcat cggaaactgg ataacttgag tgcagaagag ggtagtggaa 480
ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 540
acctggtctg caactgacgc tgagactcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc 600
ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg 660
ccggagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 720
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa 780
gaaccttacc aggtcttgac atcttgcgcc aaccctagag atagggcgtt tccttcggga 840
acgcaatgac aggtggtgca tggtcgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 900
cccgcaacga gcgcaaccct tgttactagt tgccagcatt aagttgggca ctctagtgag 960
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca gatcatcatg ccccttatga 1020
cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcgaactcg cgagggcaag 1080
caaatctctt aaaaccgttc tcagttcgga ctgcaggctg caactcgcct gcacgaagtc 1140
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1200
caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg 1260
agccagccgc ctaaggtggg acagatgatt agggtgaagt cgtaacaagg tagccgtagg 1320
agaacctgcg gctggatcac ctccttt 1347
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌PV22(Lactobacillus fermentum)
<400> 2
aaggctaagc aggaacggac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌PV22(Lactobacillus fermentum)
<400> 3
tggtcggatc aaagggttgg 20
<210> 4
<211> 397
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌PV22(Lactobacillus fermentum)
<400> 4
aaggctaagc aggaacggac gtcggacaag gaaccggcgg ctaaggccgg ggagaccgaa 60
aaagttgccg atttgcaaaa gcaagttgaa gaattaacca agcaactgga tgaccaaaag 120
gaccagaacc tgcgggccca agccgaaatg caaaacatga ccaagcgctt taaaaaggaa 180
caggcgcaac tgctcaagta cgatggtcag gacctggcca agggcatttt gccggttttg 240
gacaacttaa agcgggccct ggaaattgaa gttgaagacg aaaacggtca acaactcaag 300
aaggggatcc aaatggtaca cgaccacctg gaaaaggcct tagccgacca cgacatcaaa 360
gaagttgagg cgttaaacca accctttgat ccgacca 397

Claims (7)

1.发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）PV22，保藏编号为：GDMCC No.61376。
2.权利要求1所述的发酵乳杆菌（L. fermentum）PV22在制备预防和/或治疗病毒感染的药品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗病毒感染的药品是预防和/或治疗诺如病毒感染的药品。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵乳杆菌（L. fermentum）PV22是以发酵乳杆菌PV22发酵液或发酵上清液在制备预防和/或治疗病毒感染的药品中的应用。
5.一种预防和/或治疗病毒感染的药品，其特征在于，含有权利要求1所述的发酵乳杆菌PV22、发酵乳杆菌PV22的发酵液或发酵上清液作为活性成分。
6. 一种鉴别权利要求1所述的发酵乳杆菌（L. fermentum）PV22的特异性扩增引物，其特征在于，引物为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
7. 一种鉴别权利要求1所述的发酵乳杆菌（L. fermentum）PV22的方法，其特征在于，是利用权利要求6所述的特异性扩增引物作为引物，以待测发酵乳杆菌的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得PCR产物，测序或电泳进行鉴别。
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