CN109576185A - 一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用 - Google Patents
一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。此益生菌混合制剂具有抗流感的作用，具体体现在：(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；(2)显著改善流感小鼠血液指标；(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增值)；(5)显著增强流感小鼠肺部抗病毒蛋白MxA的表达量，因此，此益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗特应性皮炎乃至预防和/或治疗流感的产品中，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
流感常在秋冬季时大流行，主要由流感病毒诱发。流感病毒可分为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒三种，人所患的流感主要是由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。一般动物流感病毒不会感染人，人流感病毒也不会感染动物，但是猪比较例外。猪既可以感染禽流感病毒，也可以感染人流感病毒，但主要还是感染禽流感病毒，不过，它们一旦感染禽流感病毒，就极易传染给人，引起人流感大流行，例如，1819-1920年发生的“西班牙流感”。
“西班牙流感”作为世界历史上最严重的一次流感大流行，涉及范围广，临床发病率高达40％，并伴随多种类型的肺炎并发症，造成2000-4000万人的死亡，死亡人数远远超出第一次世界大战。因受科学技术条件的限制，当时人们未能分离出“西班牙流感”的致病原，直到1997年，美国科学家在《Science》上发表称1918年的流感病毒与猪流感病毒十分相似，是一种与甲型流感病毒(H1N1)密切相关的病毒。
而随后的近一百年时间内，世界范围内仍爆发了多次流感大流行，造成不同程度的人员受难及经济损失。可以说，从流感出现以来，就一直无法完全控制，呈现间断式爆发。
流感无法完全控制的一个主要原因就在于，虽然，多数流感病毒不耐热，于56℃下加热30分钟即可灭活，在室温下传染性亦很快会丧失，但是，流感病毒的变异度极高，其中，变异最频繁的应属甲型流感病毒，每隔十几年便会发生一个抗原大变异，产生一个新的毒株，这种变化称作抗原转变/抗原的质变；在流感病毒亚型内也会发生抗原的小变异，主要是抗原氨基酸序列的点突变，称作抗原漂移/抗原的量变，从而使得人们无法拥有长期有效预防流感的疫苗。
医药领域对流感病毒的致病机理研究早已开展。动物实验研究表明，有多种致病通路可诱发呼吸道的感染，继而引起严重的呼吸系统疾病，而呼吸系统疾病引发的炎症主要集中在动物肺部，表现为肺炎形式，例如，组织病理学检查呼吸道感染小鼠肺部可发现小鼠肺泡结构被破坏，肺间隔断裂，肺泡上皮细胞坏死、脱落等病变；少部分小鼠肺组织可见肺间隔增宽；小鼠局部病变肺组织可见上皮细胞增生。
目前，世界卫生组织认为每年在流感流行高峰前期接种疫苗是最有效的预防手段。现阶段，已经上市的三价流感疫苗有灭活流感疫苗(TIV)和减毒活疫苗(LAIV)两种，由3种病毒组成，包含2种甲型流感病毒株和1种乙型流感病毒株。而相关流感感染的药物治疗主要有两类西药，一类是神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦，其机理是通过作用在病毒表面的糖蛋白神经氨酸酶，使病毒颗粒无法侵害人体细胞；另一类是M2离子通道阻滞剂如金刚烷胺和金刚乙胺，此类药物是作用于质子通道M2蛋白，通过阻扰其蛋白离子通道以抑制甲型流感病毒的复制。
但是，疫苗注射不能长久有效保护机体不受病毒侵染，而药物治疗在杀死病毒的同时对中枢神经系统有副作用。因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既能够长久有效保护机体不受流感病毒侵染，也能够缓解流感的一些临床病症，同时，不会给患者中枢神经系统带来副作用。
近年，大量的研究表明，肠道微生物对于维持人体健康有着重要的作用，同时，益生菌在人类干预研究中对健康的影响包括改善儿童急性腹泻，缓解儿童牛奶过敏、特应性皮炎以及缓解人肠易激综合征，并且，益生菌可能通过肠道粘膜产生影响，通过抑制病原微生物的生长来平衡局部微生物群，进而增强局部和全身免疫反应，此外，益生菌还可能影响肠道内容物中微生物群的组成和活性；也已有报道指出，病毒引起的流感可影响肠道菌群结构，且特定益生菌可有效减轻急性轮状病毒胃肠炎的持续时间和严重程度。因此，或许可从肠道微生物入手，尝试找到预防以及治疗流感的新药物或新方法，以克服现有治疗药物以及治疗方法副作用明显等的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025以及短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的益生菌混合制剂。此益生菌混合制剂具有抗流感的作用，具体体现在：(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；(2)显著改善流感小鼠血液指标；(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增值)；(5)显著增强流感小鼠肺部抗病毒蛋白MxA的表达量，因此，此益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗特应性皮炎乃至预防和/或治疗流感的产品中，具有巨大的应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂，所述益生菌混合制剂含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025以及短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)CCFM1026；
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60459，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025是从人体粪便中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株为粘膜乳杆菌，命名为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025。
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的菌体呈短杆状；菌落为圆形粗糙、透明；于45℃生长，15℃不生长；37℃下在MRS液体培养基中培养12小时即达到稳定期，异型发酵，从葡萄糖产酸产气。
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026是从人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.2所示，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株与短双歧杆菌的覆盖率(Query cover)为100％、相似度(Ident)为99％，故判定菌株为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026。
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的菌体呈短棒状，革兰氏染色阳性，亚甲基蓝染色着色不规则，无芽孢、鞭毛和荚膜，不运动；菌落为圆形白色；于37℃厌氧条件下培养30h可达稳定期，利用葡萄糖进行非典型异性乳酸发酵途径。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌混合制剂中粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)CCFM1025的活菌数不低于1×106CFU/mL；所述益生菌混合制剂中短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的活菌数不低于1×106CFU/mL。
本发明提供了上述益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的活菌数不低于1×106CFU/mL、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的活菌数不低于1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健食品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有益生菌混合制剂、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有益生菌混合制剂的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有益生菌混合制剂的固体饮料。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗流感的产品，所述产品含有上述一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025的活菌数不低于1×106CFU/mL、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的活菌数不低于1×106CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健食品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品含有益生菌混合制剂、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用含有益生菌混合制剂的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有益生菌混合制剂的固体饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将(Bifidobacteriumbreve)CCFM1026按照占培养基总质量5～8％的接种量接种到培养基中，于37℃的厌氧环境下培养30h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用含100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液真空冷冻法冻干，得到(Bifidobacterium breve)CCFM1026菌粉；
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025按照占培养基总质量5～8％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用含100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液真空冷冻法冻干，得到粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉；
将得到的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉与短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026菌粉混合，得到发酵剂；
所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L的脱脂奶粉、150g/L的海藻糖以及10g/L的L-谷氨酸钠。
有益效果：
本发明提供了一种含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025以及短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的益生菌混合制剂，此益生菌混合制剂具有抗流感的作用，具体体现在：
(1)显著改善流感小鼠体重下降程度；
(2)显著改善流感小鼠血液指标；
(3)显著改善流感小鼠的呼吸道感染炎症状况；
(4)显著降低流感小鼠肺部病毒载量(即显著抑制流感病毒在流感小鼠体内的复制、增值)；
(5)显著增强流感小鼠肺部抗病毒蛋白MxA的表达量，
因此，此益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗特应性皮炎乃至预防和/或治疗流感的产品中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025，分类学命名为Lactobacillus mucosae，已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026，分类学命名为Bifidobacterium breve，已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60459，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别流感小鼠的体重变化对比(粘膜乳杆菌)。
图2：不同组别流感小鼠的血液检测指标(中性粒细胞)对比(粘膜乳杆菌)。
图3：不同组别流感小鼠的血液检测指标(淋巴细胞)对比(粘膜乳杆菌)。
图4：不同组别流感小鼠的肺部组织病理学切片对比(粘膜乳杆菌)。
图5：不同组别流感小鼠的肺部病毒载量对比(粘膜乳杆菌)。
图6：不同组别流感小鼠的体重变化对比(短双歧杆菌)。
图7：不同组别流感小鼠的血液检测指标(中性粒细胞)对比(短双歧杆菌)。
图8：不同组别流感小鼠的血液检测指标(淋巴细胞)对比(短双歧杆菌)。
图9：不同组别流感小鼠的肺部组织病理学切片对比(短双歧杆菌)。
图10：不同组别流感小鼠的肺部抗病毒蛋白MxA的表达量对比(短双歧杆菌)。
图11：不同组别流感小鼠的体重变化对比(混菌)。
图12：不同组别流感小鼠的血液检测指标(中性粒细胞)对比(混菌)。
图13：不同组别流感小鼠的血液检测指标(淋巴细胞)对比(混菌)。
图14：不同组别流感小鼠的肺部组织病理学切片对比(混菌)。
图15：不同组别流感小鼠的肺部病毒载量对比(混菌)。
图16：不同组别流感小鼠的肺部抗病毒蛋白MxA的表达量对比(混菌)。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS平板(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H20 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801ml/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1-1：粘膜乳杆菌的筛选及鉴定
1、筛选
以人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS平板上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1025和菌株F1。
2、鉴定
提取CCFM1025、F1的基因组，将CCFM1025、F1的16S rDNA进行扩增和测序(上海生工生物工程股份有限公司)，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株为粘膜乳杆菌，命名为粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025和粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)F1。
实施例1-2：粘膜乳杆菌的培养
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落为圆形粗糙、透明，其菌体为短杆状。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h，制作生长曲线，发现其于37℃下培养12h达到稳定期，同时，观察发现其为异型发酵，可从葡萄糖产酸产气。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中分别于10、15、20、25、30、35、40、45、50℃下培养48h后观察其生长状况，20～35℃生长良好，45℃条件下依旧能够生长，但于15℃或低于15℃或50℃几乎不生长。
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025接入MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，转入新鲜的MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养30h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例1-3：粘膜乳杆菌对流感小鼠体重的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验的5天中，每天灌胃前称重，连续记录五日体重变化，结果如图1所示。
由图1可知，攻毒后的第3天小鼠体重开始出现下降，第4天时体重下降最为明显(P<0.05)，与对照组(Control)相比，模型组(Model)体重下降超过10％，药物治疗组(Treatment)体重下降约5％，粘膜乳杆菌F1干预组体重下降5.5％左右，而粘膜乳杆菌CCFM1025干预组体重下降仅为3％。
说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025可显著改善流感小鼠体重减轻症状。
实施例1-4：粘膜乳杆菌对流感小鼠血液指标的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，将取出的小鼠血液放置在抗凝管中，轻轻晃动，使血液于抗凝剂充分接触，随后送至动物医院进行血常规分析检测(流感病毒感染初期，大量天然免疫细胞，如中性粒细胞和淋巴细胞会参与防御过程，因此，血常规分析检测重点检测中性粒细胞和淋巴细胞变化)，结果如图2-3所示。
由图2-3可知，与空白组(Control)相比，模型组(Model)中性粒细胞显著升高，淋巴细胞显著降低，而其余四组则无显著变化。
说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025同利巴韦林药物一样，对机体可起到相同的免疫调节功能。
实施例1-5：粘膜乳杆菌对流感小鼠呼吸道感染炎症的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠32只，随机分成4组，4组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林的药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，空白对照组以及流感模型组(Control、Model)灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，立即取出小鼠左肺置于4％多聚甲醛中固定，固定后进行组织病理学切片，切片后对小鼠肺部组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，通过职业技术人员对小鼠肺部组织病理学切片进行组织病理评分，结果如图4所示。
由图4可知，空白组(Control)小鼠肺部组织结构较完整，无炎症细胞浸润；模型组(Model)小鼠则出现大规模炎症表征，甚至充血情况；治疗组(Treatment)和粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)组小鼠肺部则轻度炎症细胞浸润，发生在支气管附近。
以上动物实验表明，流感感染可使小鼠患流感性肺炎，肺部被病毒侵染后，其组织结构被破坏，出现大量炎症浸润；而本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025可缓解小鼠肺部炎症状况，减轻其肺炎病症，同流感常用药利巴韦林药物治疗组的效果相当。
实施例1-6：粘膜乳杆菌对流感小鼠肺部病毒载量的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃粘膜乳杆菌F1的粘膜乳杆菌干预组(F1)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余3组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌菌悬稀释液，粘膜乳杆菌F1干预组(F1)灌胃同样数量的粘膜乳杆菌F1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，处死小鼠后，取小鼠右肺组织置于1mL的TRIZOL中，冻存于-80℃冰箱备用，提取时将右肺组织样品置冰上融化后，采用经DEPC处理的无菌研磨器研磨，加入200μL的氯仿，充分混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清500μL，加入等体积的异丙醇，混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清，加入75％的乙醇洗涤RNA一次，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清后，待酒精挥发干，加入40μL的DEPC处理水，溶解RNA，提取的RNA冻存于-80℃冰箱备用。
利用qPCR法测定病毒载量，以GAPDH为内参，采用经典的2-ΔΔt计算方法，以模型组作为对比处理数据，结果如图5所示。
由图5可知，药物治疗组(Treatment)小鼠肺部病毒载量为模型组的38.03％，而本发明的粘膜乳杆菌组干预组(CCFM1025)小鼠肺部病毒载量仅为模型组的16.30％。
以上实验表明，本发明发的粘膜乳杆菌CCFM1025可明显减低流感感染小鼠肺部病毒载量，存在显著性差异(P＝0.0022)，粘膜乳杆菌F1组和药物治疗组(Treatment)小鼠肺部病毒载量降低均存在显著性(P值分别为0.0309和0.0170)，这足以说明本发明的粘膜乳杆菌CCFM1025在抵抗病毒侵染方面效果优于流感药物治疗作用。
实施例2-1：短双歧杆菌的筛选及鉴定
1、筛选
以人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS平板上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS平板上划线纯化，挑取单菌落转接至液体MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1026和菌株B1。
2、鉴定
提取CCFM1026、B1的基因组，将CCFM1026、B1的16S rDNA进行扩增和测序(上海生工生物工程股份有限公司)，将该序列在GenBank中进行比对，结果显示菌株与短双歧杆菌的覆盖率(Query cover)均为100％、相似度(Ident)均为99％，故判定菌株为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026和短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)B1。
实施例2-2：短双歧杆菌的培养
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落为圆形白色；
在显微镜下对其菌体进行观察并对其进行染色，发现其菌体呈短棒状，革兰氏染色阳性，亚甲基蓝染色着色不规则，无芽孢、鞭毛和荚膜，不运动。
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026接入MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h，制作生长曲线，发现其于37℃厌氧条件下培养30h可达稳定期，利用葡萄糖进行非典型异性乳酸发酵途径。
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026于MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，转入新鲜的MRS培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养30h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例2-3：短双歧杆菌对流感小鼠体重的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠32只，随机分成4组，4组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林的药物治疗组(Treatment)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃短双歧杆菌B1的短双歧干预组(B1组)，每组8只。
实验前2周，每天给短双歧杆菌干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，短双歧杆菌干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，短双歧杆菌(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验的5天中，每天灌胃前称重，连续记录五日体重变化，结果如图6所示。
由图6可知，攻毒后的第3天小鼠体重开始出现下降，第4天时体重下降最为明显(P<0.05)，与对照组(Control)相比，模型组(Model)体重下降超过10％，药物治疗组(Treatment)体重下降约5％，而短双歧杆菌干预组(CCFM1026)和短双歧杆菌B1组体重下降也仅为5％。
说明本发明的短双歧杆菌CCFM1026和B1均可显著改善流感小鼠体重减轻症状。
实施例2-4：短双歧杆菌对流感小鼠血液指标的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃短双歧杆菌B1的短双歧干预组(B1组)，每组8只。
实验前2周，每天给短双歧杆菌CCFM1206干预组(CCFM1206)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，短双歧杆菌干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，短双歧杆菌(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，将取出的小鼠血液放置在抗凝管中，轻轻晃动，使血液于抗凝剂充分接触，随后送至动物医院进行血常规分析检测(流感病毒感染初期，大量天然免疫细胞，如中性粒细胞和淋巴细胞会参与防御过程，因此，血常规分析检测重点检测中性粒细胞和淋巴细胞变化)，结果如图7-8所示。
由图7-8可知，与空白组(Control)相比，模型组(Model)小鼠中性粒细胞和淋巴细胞百分比明显出现异常，显著异于空白组(Control)(p值分别为0.0015和0.0011)，然而短双歧杆菌干预组(CCFM1026)和药物治疗组(Treatment)小鼠的中性粒细胞和淋巴细胞百分比趋向空白对照组(Control)，且无显著性差异。
说明本发明的短双歧杆菌同利巴韦林药物效果一样，可积极参与到小鼠的流感相关免疫调节中，缓解小鼠流感病症。
实施例2-5：短双歧杆菌对流感小鼠呼吸道感染炎症的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃短双歧杆菌B1的短双歧干预组(B1组)，每组8只。
实验前2周，每天给短双歧杆菌CCFM1206干预组(CCFM1206)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，短双歧杆菌干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，短双歧杆菌(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，立即取出小鼠左肺置于4％多聚甲醛中固定，固定后进行组织病理学切片，切片后对小鼠肺部组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，通过职业技术人员对小鼠肺部组织病理学切片进行组织病理评分，结果如图9所示。
由图9可知，空白组(Control)小鼠肺部组织结构较完整，无炎症细胞浸润；模型组(Model)小鼠则出现严重炎症浸润现象，甚至出现局部出血现象；短双歧杆菌B1干预组(B1)支气管附近出现中度炎症浸润，而治疗组(Treatment)和短双歧杆菌干预组(CCFM1026)组小鼠肺部则炎症情况相对较轻。
以上动物实验表明，流感感染可使小鼠患流感性肺炎，肺部被病毒侵染后，其组织结构被破坏，出现大量炎症浸润；而本发明的短双歧杆菌可缓解小鼠肺部炎症状况，减轻其肺炎病症，同流感常用药利巴韦林药物治疗组的效果相当。
实施例2-6：短双歧杆菌对流感小鼠肺部病毒载量的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠40只，随机分成5组，5组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃短双歧杆菌B1的短双歧干预组(B1组)，每组8只。
实验前2周，每天给短双歧杆菌CCFM1206干预组(CCFM1206)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余4组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，短双歧杆菌干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，短双歧杆菌(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，短双歧杆菌B1干预组(B1)灌胃同样数量的短双歧杆菌B1菌悬稀释液，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。攻毒后的第5天取血后处死小鼠，处死小鼠后，取小鼠右肺组织置于1ml的TRIZOL中，冻存于-80℃冰箱备用，提取时将右肺组织样品置冰上融化后，采用经DEPC处理的无菌研磨器研磨，加入200ul的氯仿，充分混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清500μL，加入等体积的异丙醇，混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清，加入75％的乙醇洗涤RNA一次，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清后，待酒精挥发干，加入40μL的DEPC处理水，溶解RNA，提取的RNA冻存于-80℃冰箱备用。
利用qPCR法测定MxA相对表达量(机体对流感病毒会做出防御反应，以清除入侵病毒，恢复健康，MxA是其分泌的一种抗病毒蛋白，可有效阻止病毒的复制)，以GAPDH为内参，采用经典的2-ΔΔt计算方法，以模型组作为对比处理数据，结果如图10所示。
由图10可知，药物治疗组(Treatment)小鼠肺部MxA表达量为模型组(Model)的2.62倍，短双歧杆菌B1干预组小鼠肺部MxA表达量为模型组(Model)的2.67倍，无显著性差异，而短双歧杆菌干预组(CCFM1026)小鼠肺部MxA表达量则为模型组(Model)的3.46倍，可显著提高MxA表达量(p值为0.0292)。
以上实验表明，本发明的短双歧杆菌CCFM1026可以明显增强流感小鼠免疫能力，促使其MxA抗病毒蛋白表达量增加，从而对抗病毒的复制，帮助机体恢复健康，呼吸道炎症明显减轻，效果甚至优于药物治疗。
实施例3-1：混菌对流感小鼠体重的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠48只，随机分成6组，6组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余5组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验的5天中，每天灌胃前称重，连续记录五日体重变化，结果如图11所示。
由图11可知，攻毒后的第3天小鼠体重开始出现下降，第4天时体重下降最为明显(P<0.05)，与对照组(Control)相比，模型组(Model)体重下降超过10％，药物治疗组(Treatment)体重下降约5％，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)体重下降约为3％，短双歧杆菌干预组(CCFM1026)体重下降约为5％，而菌剂干预组(CCFM1025+1026)小鼠体重下降最小，为不到3％，比药物治疗组(Treatment)、粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、短双歧杆菌干预组(CCFM1026)干预效果更佳，足以说明摄入本发明的益生菌混合制剂可明显缓解流感小鼠因流感感冒导致的体重下降。
实施例3-2：混菌对流感小鼠血液指标的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠48只，随机分成6组，6组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余5组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，将取出的小鼠血液放置在抗凝管中，轻轻晃动，使血液于抗凝剂充分接触，随后送至动物医院进行血常规分析检测(流感病毒感染初期，大量天然免疫细胞，如中性粒细胞和淋巴细胞会参与防御过程，因此，血常规分析检测重点检测中性粒细胞和淋巴细胞变化)，结果如图12-13所示。
由图12-13可知，在小鼠患流感感冒后，其体内天然免疫细胞的比例会发生不同变化，即模型组(Model)小鼠体内中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞水平出现不同趋势的变化，显著异于空白对照组(Control)，而摄入益生菌的干预组小鼠的各项指标趋于正常值，与空白对照组(Control)无显著性差异，其中，同模型组相比，摄入益生菌组中性粒细胞百分比均下降(Control：22.60％、CCFM1025+1026：33.10％、CCFM1025：35.75％、CCFM1026：37.10％)，相应淋巴细胞百分比提高(Control：73.70％、CCFM1025+1026：63.95％、CCFM1025：60.56％、CCFM1026：62.10％)，可以看出益生菌混合制剂组(CCFM1025+1026)趋向空白对照组(Control)程度略微强于两个单菌(CCFM1025、CCFM1026)组别，说明小鼠摄入的益生菌可参与到机体的免疫调节中，协助机体共同抵抗流感病毒的入侵，维持机体健康，而混菌制剂的效果优于单菌。
实施例3-3：混菌对流感小鼠呼吸道感染炎症的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠48只，随机分成6组，6组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余5组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃0.2mL的109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，立即取出小鼠左肺置于4％多聚甲醛中固定，固定后进行组织病理学切片，切片后对小鼠肺部组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，通过职业技术人员对小鼠肺部组织病理学切片进行组织病理评分，结果如图14所示。
由图14可知，空白组(Control)小鼠肺部组织结构较完整，无炎症细胞浸润；模型组(Model)小鼠则出现大规模炎症表征，甚至充血情况；治疗组(Treatment)和益生菌混合制剂干预组(CCFM1025+1026)小鼠肺部也可观察到一定中轻度的炎症，但支气管等结构还算完整，病理程度得到一定程度缓解，其中，混合菌剂干预组(CCFM1025+1026)相比两组单菌组，其支气管的绒毛完整度更好，周围炎症更少，尽管各组的病理组织评分相近，但仍可以说明，混合菌剂干预组(CCFM1025+1026)可以使流感感染小鼠的呼吸道感染程度得到一定程度的降低，而混菌制剂的效果优于单菌。
实施例3-4：混菌对流感小鼠肺部病毒载量的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠48只，随机分成6组，6组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余5组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，处死小鼠后，取小鼠右肺组织置于1ml的TRIZOL中，冻存于-80℃冰箱备用，提取时将右肺组织样品置冰上融化后，采用经DEPC处理的无菌研磨器研磨，加入200ul的氯仿，充分混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清500μL，加入等体积的异丙醇，混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清，加入75％的乙醇洗涤RNA一次，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清后，待酒精挥发干，加入40μL的DEPC处理水，溶解RNA，提取的RNA冻存于-80℃冰箱备用。
利用qPCR法测定病毒载量，以GAPDH为内参，采用经典的2-ΔΔt计算方法，以模型组作为对比处理数据，结果如图15所示。
由图15可知，摄入益生菌的干预组小鼠肺部病毒载量均有所降低，均低于50％，其中，混合菌剂干预组(CCFM1025+1026)和粘膜乳杆菌干预组显著降低，p值分别为0.0097和0.0032，平均值分别为27.68％、16.3％，药物治疗组相对病毒载量均值为38.03％，以上数据说明，益生菌混合制剂可显著降低流感感染小鼠肺部病毒载量，且效果优于药物治疗的效果。
实施例3-5：混菌对流感小鼠肺部病毒载量的影响
取体重20-24g的健康ICR雌鼠48只，随机分成6组，6组分别命名为：空白对照组(Control)、流感模型组(Model)、给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)、灌胃粘膜乳杆菌CCFM1025的粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)、灌胃短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)、灌胃益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)，每组8只。
实验前2周，每天给粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第1天，除空白对照组(Control)外，其余5组均在乙醚轻微麻醉后鼻滴法以流感病毒对小鼠进行攻毒，当天仍需灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
实验第2天，给药利巴韦林药物治疗组(Treatment)腹腔注射药物利巴韦林进行治疗。
攻毒之后的4天继续灌胃，其中，粘膜乳杆菌干预组(CCFM1025)灌胃109CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025菌悬稀释液，短双歧杆菌CCFM1026干预组(CCFM1026)灌胃109CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026菌悬稀释液，益生菌混合制剂组的菌剂干预组(CCFM1025+1026)灌胃109CFU菌量的益生菌混合制剂(益生菌混合制剂中含有5×108CFU菌量的粘膜乳杆菌CCFM1025、5×108CFU菌量的短双歧杆菌CCFM1026)，其余组(Control、Model、Treatment)每天灌胃0.2mL生理盐水。
攻毒后的第5天取血后处死小鼠，处死小鼠后，取小鼠右肺组织置于1ml的TRIZOL中，冻存于-80℃冰箱备用，提取时将右肺组织样品置冰上融化后，采用经DEPC处理的无菌研磨器研磨，加入200ul的氯仿，充分混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清500μL，加入等体积的异丙醇，混匀后，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清，加入75％的乙醇洗涤RNA一次，于4℃、12000rpm下离心10min，去上清后，待酒精挥发干，加入40μL的DEPC处理水，溶解RNA，提取的RNA冻存于-80℃冰箱备用。
利用qPCR法测定MxA相对表达量(机体对流感病毒会做出防御反应，以清除入侵病毒，恢复健康，MxA是其分泌的一种抗病毒蛋白，可有效阻止病毒的复制)，以GAPDH为内参，采用经典的2-ΔΔt计算方法，以模型组作为对比处理数据，结果如图16所示。
由图16可知，菌剂干预组(CCFM1025+1026)小鼠肺部抗病毒蛋白MxA表达量最高，可达模型组的5.311倍，说明本发明的益生菌混合制剂可有效参与机体对抗流感病毒的过程，增强其抗病毒蛋白MxA的表达量，共同协助机体抑制病毒复制，而短双歧杆菌干预组(CCFM1026)和粘膜乳杆菌(CCFM1025)也可一定程度增加抗病毒蛋白MxA的表达量(分别为模型组的3.464、3.074倍)，表达量比药物治疗组(Treatment)要多，但都不如混合菌剂干预组(CCFM1025+1026)效果好。
实施例3-6：含有混菌的固体饮料的制备
具体步骤如下：
将(Bifidobacterium breve)CCFM1026按照占培养基总质量5～8％的接种量接种到培养基中，于37℃的厌氧环境下培养30h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用含100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液真空冷冻法冻干，得到(Bifidobacteriumbreve)CCFM1026菌粉；
将粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025按照占培养基总质量5～8％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗2～4次后用含100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液真空冷冻法冻干，得到粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉；
将含有1010CFU的粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025菌粉和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026菌粉分别同麦芽糊精1g进行混合，得到富含粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)CCFM1025和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1026的固体饮料。
取10克此含有粘膜乳杆菌CCFM1025和短双歧杆菌CCFM1026的固体饮料用20毫升的生理盐水复溶，每只小鼠灌胃200微升，连续两周，可有效缓解流感小鼠症状，在治疗和/或预防流感有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
江南大学（扬州）食品生物技术研究所
<120> 一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtcgaacgc gttggcccaa ctgattgaac gtgcttgcac ggacttgacg ttggtttacc 60
agcgagtggc ggacgggtga gtaacacgta ggtaacctgc cccaaagcgg gggataacat 120
ttggaaacag atgctaatac cgcataacaa tttgaatcgc atgattcaaa tttaaaagat 180
ggcttcggct atcactttgg gatggacctg cggcgcatta gcttgttggt agggtaacgg 240
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tgcgtgaccg acctgcccca tgcaccggaa tagctcctgg aaacgggtgg taatgccgga 120
tgctccatct caccgcatgg tgttttggga aagcctttgc ggcatgggat ggggtcgcgt 180
cctatcagct tgatggcggg gtaacggccc accatggctt cgacgggtag ccggcctgag 240
agggcgaccg gccacattgg gactgagata cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg gatggaggcc 360
ttcgggttgt aaacctcttt tgttagggag caaggcattt tgtgttgagt gtacctttcg 420
aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg caagcgttat 480
ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgtag gcggttcgtc gcgtccggtg tgaaagtcca 540
tcgcttaacg gtggatccgc gccgggtacg ggcgggcttg agtgcggtag gggagactgg 600
aattcccggt gtaacggtgg aatgtgtaga tatcgggaag aacaccaatg gcgaaggcag 660
gtctctgggc cgttactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 720
ccctggtagt ccacgccgta aacggtggat gctggatgtg gggcccgttc cacgggttcc 780
gtgtcggagc taacgcgtta agcatcccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc 840
aaagaaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgc ggattaattc gatgcaacgc 900
gaagaacctt acctgggctt gacatgttcc cgacgatccc agagatgggg tttcccttcg 960
gggcgggttc acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1020
gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccccgt gttgccagcg gattgtgccg ggaactcacg 1080
ggggaccgcc ggggttaact cggaggaagg tggggatgac gtcagatcat catgcccctt 1140
acgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaac gggatgcgac agcgcgagct 1200
ggagcggatc cctgaaaacc ggtctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1260
aggcggagtc gctagtaatc gcgaatcagc aacgtcgcgg tgaatgcgtt cccgggcctt 1320
gtacacaccg cccgtcaagt catgaaagtg ggcagcaccc gaagccggtg gcctaacccc 1380
ttgcgggagg gagcc 1395
Claims (10)
1.一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂，其特征在于，所述益生菌混合制剂含有粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)以及短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；
所述粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60460，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)已于2018年10月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60459，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂，其特征在于，所述益生菌混合制剂中粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的活菌数不低于1×106CFU/mL；所述益生菌混合制剂中短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的活菌数不低于1×106CFU/mL。
3.权利要求1或2所述的益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用。
4.如权利要求3所述的益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)的活菌数不低于1×106CFU/mL、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的活菌数不低于1×106CFU/mL。
5.如权利要求3或4所述的益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健食品。
6.如权利要求5所述的益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述药品含有益生菌混合制剂、药物载体和/或药用辅料。
7.如权利要求5所述的益生菌混合制剂在制备预防和/或治疗流感的产品中的应用，其特征在于，所述食品包含使用含有益生菌混合制剂的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有益生菌混合制剂的固体饮料。
8.一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1-3任一所述的一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂。
9.如权利要求8所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述产品包含食品、药品或保健食品。
10.如权利要求9所述的一种用于预防和/或治疗流感的产品，其特征在于，所述药品含有益生菌混合制剂、药物载体和/或药用辅料。
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