CN110616167A - 能够缓解特应性皮炎的双歧杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能够缓解特应性皮炎的双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明的短双歧杆菌CCFM1067、青春双歧杆菌CCFM1066以及两歧双歧杆菌CCFM1063能够预防和/或治疗特应性皮炎，因此，本发明的短双歧杆菌CCFM1067、青春双歧杆菌CCFM1066以及两歧双歧杆菌CCFM1063在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。

Description

能够缓解特应性皮炎的双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及能够缓解特应性皮炎的双歧杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
特应性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)，又称特应性湿疹、异位性皮炎，是一种伴随反复瘙痒的慢性、复发性、炎症性皮肤病。
特应性皮炎已经逐渐发展为全球性疾病，流行病学调查显示，特应性皮炎的患病率逐年增加。目前，澳大利亚报道学龄儿童AD发病率为9.6～13.3％。在美国和英国的儿童中，AD流行率达到约20％。丹麦儿童和青少年的AD发病率在1986～2001年的15年间由17.3％增至27.3％。1998年的调查研究显示，6～20岁年龄段AD患者病为0.7％，占皮肤科儿童就诊患者的30％。遗传因素、早年的应变原敏感、工作环境是导致AD发病的重要因素。大约60％的儿童特应性皮炎患者在青春期初期症状消退。但是，超过50％的患者在成人期病情复发。特应性皮炎给社会增加了高额的经济负担，美国每年直接用于特应性皮炎的费用高达10亿美元。治疗特应性皮炎的总费用与哮喘相当。
由于特应性皮炎多从儿童、青少年开始发病，病情容易反复，患者长期遭受着瘙痒、失眠、药物不良反应，以及出现焦虑、烦躁等精神症状，甚至某些患者有自杀倾向。英国的调查显示，2.1％的特应性皮炎患者有自杀的想法。日本的调差显示，轻度、中度、重度的成人AD患者(15～49岁)，产生自杀想法的流行率分别达到0.21％、6％和19.6％；轻度、中度、重度的AD患儿父母产生自杀想法的流行率分别达到0.11％、0.35％和3.28％。德国的调查显示成人AD患者的心理负担与病情的严重度强相关，16.1％的成人AD患者有自杀的想法。
可见，特应性皮炎是世界性的公共卫生问题之一，积极寻找可有效预防和/或治疗特应性皮炎的药物或治疗方式十分重要。
不幸的是，现阶段，尚未寻找到针对特应性皮炎的具有明确疗效的治疗药物，因此，目前，大多数AD患者主要是通过使用外用药物如糖皮质激素类药物，钙调神经磷酸酶抑制剂，外用抗微生物制剂，抗组胺药和抗炎症介质药物，免疫抑制剂等缓解特应性皮炎的症状。
但是，上述药物，尤其是其中的激素类药物，均存在较大的不良反应，这不仅给特应性皮炎治疗带来了极大的困难，同时，也给AD患者的生活带来了极大的困扰，此外，这些药物对于个别AD患者来说耐受性很差，很多多次复发的患者均可能面临无药可用的困境。
因此，仍需继续寻找一种药物或治疗方式，既能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展，缓解患者皮肤瘙痒、湿疹等症状，也不会给AD患者带来副作用，同时，对AD患者具有良好的耐受性。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供可用于预防和/或治疗特应性皮炎(AD)的菌株。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067，所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60703，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067来源于北京朝阳区的健康人体粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067。
所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067在MRS培养基上的菌落凸面至垫状，表面平滑或波曲，质度柔软。
本发明还提供了一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066，所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCN o.60702，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066来源于江苏盐城地区的健康人体粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为青春双歧杆菌，命名为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066。
所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066在MRS培养基上的菌落呈圆形突起，不透明，边缘整齐，柔软。
本发明还提供了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60701，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063来源于江苏盐城地区的健康人体粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063。
所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063在MRS培养基上的菌落呈圆形，凸面，微白，不透明，有平滑至粘液状的柔软表面。
本发明还提供了一种制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品的方法，其特征在于，使用上述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品除菌株外，还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的保健食品；或所述食品包含使用含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的固体饮料。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，所述产品含有上述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述药品除菌株外，还含有药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的保健食品；或所述食品包含使用含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的固体饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L的脱脂奶粉、150g/L的海藻糖以及10g/L的L-谷氨酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品。
在本发明的一种实施方式中，所述保健食品为上述短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063的冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干粉的制备方法为将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到冻干粉。
在本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂包含100g/L的脱脂奶粉、150g/L的海藻糖以及10g/L的L-谷氨酸钠。
有益效果：
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067：
1、本发明筛选出了一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067，此短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067能够预防和/或治疗特应性皮炎(AD)，具体体现在：(1)改善AD小鼠的耳朵肿胀程度；(2)显著改善AD小鼠皮肤病理症状以及肥大细胞浸润的作用；(3)降低AD小鼠皮肤组织中IL-4水平；(4)显著降低AD小鼠皮肤组织中IL-13和CCL11水平；(5)提高AD小鼠局部组织中与Th1细胞相关的细胞因子IL-10水平，因此，本发明的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067在制备预防和/或治疗特应性皮炎(AD)的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景；
2、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌，因此，本发明筛选得到的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067对人体而言，相对健康，且不易产生不良反应。
青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066：
1、本发明筛选出了一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066，此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066能够预防和/或治疗特应性皮炎(AD)，具体体现在：(1)显著改善AD小鼠的耳朵肿胀程度；(2)显著改善AD小鼠皮肤病理症状以及肥大细胞浸润的作用；(3)通过调节小鼠体内免疫系统进而显著提高AD小鼠脾脏中Tregs比例；(4)显著降低AD小鼠皮肤组织中CCL22和血清中IgE水平；(5)显著提高AD小鼠局部组织中与Th1细胞相关的细胞因子(IFN-γ、IL-10)水平，因此，本发明的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066在制备预防和/或治疗特应性皮炎(AD)的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景；
2、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，具有调节肠道健康、治疗慢性腹泻和便秘、以及抗衰老的功效，因此，本发明筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066对人体而言，健康且无毒副作用。
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063：
1、本发明筛选出了一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063，此两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063能够预防和/或治疗特应性皮炎(AD)，具体体现在：(1)显著改善AD小鼠耳朵的肿胀程度；(2)显著改善AD小鼠皮肤病理症状以及肥大细胞浸润的作用；(3)显著降低AD小鼠皮肤组织中IL-4水平；(4)显著降低AD小鼠皮肤组织中CCL11水平；(5)显著提高AD小鼠局部组织中与Th1细胞相关的细胞因子IL-10的水平，因此，本发明的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063在制备预防和/或治疗特应性皮炎(AD)的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景；
2、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，并且，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)作为一种益生菌，已被证实具有以下功能：(1)维护肠道正常细菌菌群平衡，抑制病原菌的生长，防止便秘，下痢和胃肠障碍等疾病；(2)抗肿瘤；(3)在肠道内合成维生素和氨基酸等营养物质；(4)提高机体对钙离子的吸收；(5)降低血液中胆固醇水平，防治高血压；(6)改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率；(7)增强人体免疫机能；(8)抗衰老；(9)增强机体的非特异和特异性免疫反应；(10)控制体内毒素血症的作用；(11)提高宿主对放射线的耐受性，因此，本发明筛选得到的两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063对人体而言，健康、无毒副作用且有一定的益处。
生物材料保藏
一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067，分类学命名为Bifidobacterium breve，已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60703，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066，分类学命名为Bifidobacterium adolescentis，已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60702，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063，分类学命名为：Bifidobacterium bifidum，保藏机构为：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为：2019年06月27日，保藏编号为：GDMCC No.60701，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别降低特应性皮炎小鼠耳朵厚度的效果对比。
图2：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤病理学症状的效果对比。
图3：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤厚度的效果对比。
图4：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞浸润的效果对比。
图5：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞数量的效果对比。
图6：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4水平的效果对比。
图7：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织IL-13水平的效果对比。
图8：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL11水平的效果对比。
图9：不同组别提高特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-10水平的效果对比。
图10：不同组别降低特应性皮炎小鼠耳朵厚度的效果对比。
图11：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤病理学症状的效果对比。
图12：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤厚度的效果对比。
图13：不同组别抑制特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞浸润的效果对比。
图14：不同组别降低特应性皮炎小鼠肥大细胞数量的效果对比。
图15：不同组别提高特应性皮炎小鼠脾脏中Tregs比例的效果对比。
图16：不同组别降低特应性皮炎小鼠血清总IgE水平的效果对比。
图17：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL22水平的效果对比。
图18：不同组别提高特应性皮炎小鼠皮肤组织中IFN-γ水平的效果对比。
图19：不同组别提高特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-10水平的效果对比。
图20：不同组别降低特应性皮炎小鼠耳朵厚度的效果对比。
图21：不同组别缓解特应性皮炎小鼠皮肤病理学症状的效果对比。
图22：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤厚度的效果对比。
图23：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞浸润的效果对比。
图24：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞数量的效果对比。
图25：不同组别降低特应性皮炎小鼠血清IL-4水平的效果对比。
图26：不同组别降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL11水平的效果对比。
图27：不同组别提高特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-10水平的效果对比。
图1-27中，“*”表示与DNFB组具有显著性差异(P<0.05)，“**”表示与DNFB组具有极其显著的差异(P<0.01)，“***”表示与DNFB组具有极其显著的差异(P<0.001)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的脱脂乳和鲜奶购自光明乳业股份有限公司，葡萄糖与酵母浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨购自英国OXOID公司，酶联免疫吸附测定试剂盒、甲苯胺蓝染液(0.5％磷酸盐)均购自南京森贝伽生物技术有限公司，eBioscienceTMMouse Regulatory T Cell StainingKit#1染色试剂购自Invitrogen Corporation，酮替芬(ketotifen)购自Sigma-Aldrich；下述实施例中16SrDNA的扩增和测序由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7 H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7 H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1-1：短双歧杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
取来源于北京朝阳区地区的健康人体粪便作为样本，将样本经预处理后，从混匀样本中吸取0.5mL加到4.5mL无菌水中，以0.9％的生理盐水(含有0.05％半胱氨酸)进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基(含有0.05％半胱氨酸)上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1067(原始编号BJCY3M3)、菌株FFJND14L2和菌株AHWH11M1。
2、鉴定
提取CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1的基因组，将CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1的16S rDNA进行扩增和测序，CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1的16S rDNA扩增的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，菌种鉴定的上游引物27F序列如SEQ ID NO.6所示：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、下游引物1492R序列如SEQ ID NO.7所示：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示三个菌株均为短双歧杆菌，分别命名为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)FFJND14L2和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)AHWH11M1。
实施例1-2：短双歧杆菌的菌落
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落凸面至垫状，表面平滑或波曲，质度柔软。
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067接入MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例1-3：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模开始前(即第0天)利用数显螺旋测微尺测定6组小鼠的耳朵厚度，造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后立刻测定小鼠耳朵厚度，检测结果如图1。
由图1可知，短双歧杆菌CCFM1067可显著降低AD小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度；短双歧杆菌FFJND14L2和短双歧杆菌AHWH11M1也可一定程度的降低AD小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度，但是，效果不明显。以上实验结果说明，短双歧杆菌CCFM1067具有缓解AD小鼠耳朵的厚度及肿胀程度的作用。
实施例1-4：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤病理症状的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行组织病理评分(结果如图2-3)。
由图2-3可知，与空白组(Control)相比，模型组(DNFB)小鼠背部皮肤厚度和炎症浸润情况显著增加；短双歧杆菌CCFM1067可显著降低小鼠皮肤厚度的增加，缓解皮肤炎症浸润情况；短双歧杆菌FFJND14L2和短双歧杆菌AHWH11M1则无此作用。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067可显著改善AD小鼠皮肤炎症。
实施例1-5：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肥大细胞浸润的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行甲苯胺蓝染液(0.5％磷酸盐)染色，然后通过职业技术人员进行肥大细胞计数分析(结果如图4-5)。
由图4-5可知，短双歧杆菌CCFM1067显著降低了皮肤组织中肥大细胞的数量，降低了肥大细胞产生的炎症浸润，从而抑制了皮肤组织炎症；短双歧杆菌FFJND14L2和短双歧杆菌AHWH11M1则不能抑制组织中肥大细胞的数量，对组织炎症浸润无显著影响，不能缓解小鼠的皮肤炎症。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067可显著抑制AD小鼠皮肤肥大细胞数量以及由此产生的炎症浸润。
实施例1-6：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤组织，利用酶联免疫吸附测定试剂盒测定皮肤组织中IL-4的水平(结果如图6)。
由图6可知，与模型组(DNFB)相比，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌FFJND14L2可显著降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4的水平；而短双歧杆菌AHWH11M1则无明显降低作用。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌FFJND14L2有助于抑制特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4水平的升高。
实施例1-7：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-13水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤组织，利用酶联免疫吸附测定试剂盒测定皮肤组织中IL-13的水平(结果如图7)。
由图7可知，与模型组(DNFB)相比，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌FFJND14L2可显著降低AD小鼠皮肤组织中IL-13的水平，有利于抑制Th2型免疫反应，从而有助于缓解特应性皮炎的病理炎症；而短双歧杆菌AHWH11M1则无明显降低作用。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌FFJND14L2有助于抑制AD小鼠皮肤组织中IL-13水平的升高。
实施例1-8：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL11水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定皮肤组织中CCL11的水平(结果如图8)。
由图8可知，与模型组(DNFB)相比，短双歧杆菌CCFM1067显著降低了小鼠皮肤组织中CCL11的水平；短双歧杆菌FFJND14L2和短双歧杆菌AHWH11M1虽也可降低小鼠皮肤组织中CCL11的水平，但是，效果不明显。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067可显著降低AD小鼠皮肤组织中嗜酸粒细胞活化趋化因子CCL11的水平，有助于缓解由Th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态。
实施例1-9：不同短双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-10水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药短双歧杆菌CCFM1067的BR1组、给药短双歧杆菌FFJND14L2的BR2组、给药短双歧杆菌AHWH11M1的BR3组，其中，BR1组、BR2组、BR3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃短双歧杆菌CCFM1067、FFJND14L2、AHWH11M1菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定免疫反应调节细胞因子IL-10的水平(结果如图9)。
由图9可知，与模型组(DNFB)相比，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌AHWH11M1提高了小鼠皮肤组织IL-10的水平，有助于抑制Th2免疫反应，恢复Th1/Th2的免疫平衡；而短双歧杆菌FFJND14L2则无此作用。以上实验表明，短双歧杆菌CCFM1067和短双歧杆菌AHWH11M1提高了皮肤组织中IL-10的水平，有助于抑制皮肤组织中Th2免疫反应上调的情况，从而缓解了小鼠皮肤的瘙痒，阻止了AD的进一步发展。
实施例1-10：短双歧杆菌CCFM1067冻干粉的制备
将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067冻干粉；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的pH为6.8。
取1×109CFU的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CCFM1067冻干粉，用水复溶后灌胃给特应性皮炎小鼠，连续三周，可有效缓解AD小鼠的症状。
实施例2-1：青春双歧杆菌的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于江苏盐城地区的健康人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL无菌水中，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至含有0.05％半胱氨酸的MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1066(原始编号FJSYC5M10)、菌株FJSYC6M8和菌株FJSYC7M3。
2、鉴定
提取CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3的基因组，将CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3的16S rDNA进行扩增和测序(由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行，CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3的16SrDNA扩增的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，菌种鉴定的上游引物27F序列如SEQ ID NO.10所示：5'-TCC GAT TAC GAY CGY GAG AAGCT-3'、下游引物1492R序列如SEQ ID NO.11所示：5'-CSG CYT CGG TSG TCA GGA ACA G-3')，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为青春双歧杆菌，命名为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)FJSYC6M8和青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)FJSYC7M3。
实施例2-2：青春双歧杆菌的培养
将青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066接入MRS固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆形突起，不透明，边缘整齐，柔软。
将青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066接入MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例2-3：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模开始前(即第0天)利用数显螺旋测微尺测定6组小鼠的耳朵厚度，造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后立刻测定小鼠耳朵厚度，检测结果如图10。
由图10可知，青春双歧杆菌CCFM1066可显著降低特应性皮炎小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度；而青春双歧杆菌FJSYC6M8和青春双歧杆菌FJSYC7M3则无明显缓解作用。以上实验结果说明，青春双歧杆菌CCFM1066具有缓解特应性皮炎小鼠耳朵的厚度及肿胀程度的作用。
实施例2-4：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤病理症状的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行组织病理评分(结果如图11-12)。
由图11-12可知，空白组(Control)小鼠背部皮肤表皮细胞结构正常，表皮各层未见炎症反应；模型组(DNFB)小鼠背部皮损病理学呈明显炎症増生性改变，淋巴细胞和浆细胞浸润，同时背部皮肤糜烂，存在纤维组织增生，皮肤厚度较空白组(Control)小鼠显著增加；Ad1组和Ad3组小鼠背部皮肤无较为严重的炎症反应，皮肤厚度较模型组(DNFB)小鼠显著降低，皮肤炎症被显著缓解；而Ad2组小鼠皮肤纤维组织增生明显，存在较为明显的炎症，推测皮肤有破溃、结痂，存在较为严重的炎症反应，皮肤肿胀程度无缓解。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著改善特应性皮炎小鼠皮肤炎症。
实施例2-5：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肥大细胞浸润的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行甲苯胺蓝染液(0.5％磷酸盐)染色，然后通过职业技术人员进行肥大细胞计数分析(结果如图13-14)。
由图13-14可知，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3显著抑制了皮肤组织中肥大细胞的浸润，降低了肥大细胞的数量，从而抑制了皮肤组织炎症；而青春双歧杆菌FJSYC6M8则不能降低小鼠皮肤组织中肥大细胞的数量，对组织炎症浸润无显著影响，不能缓解小鼠的皮肤炎症。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著抑制特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞数量以及由此产生的炎症浸润。
实施例2-6：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠脾脏中Tregs比例的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠脾脏，利用eBioscienceTM MouseRegulatory T Cell染色试剂按照试验说明书处理脾脏细胞，通过流式细胞仪测定小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例(结果如图15)。
由图15可知，与模型组(DNFB)相比，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著提高小鼠脾脏中Tregs的比例；而青春双歧杆菌FJSYC6M8则无明显提高作用。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著提高特应性皮炎小鼠脾脏中Tregs的比例，有助于恢复小鼠的正常免疫反应。
实施例2-7：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠血清总IgE水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清总IgE水平(结果如图16)。
由图16可知，与模型组(DNFB)相比，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著降低小鼠血清总IgE水平；而青春双歧杆菌FJSYC6M8则无明显降低作用。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC7M3可显著降低小鼠血清IgE水平，有利于抑制Th2型免疫反应，从而有助于缓解特应性皮炎的病理炎症。
实施例2-8：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL22水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定巨噬细胞来源的趋化因子CCL22的水平(结果如图17)。
由图17可知，与模型组(DNFB)相比，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC6M8显著降低了小鼠皮肤组织CCL22水平；而青春双歧杆菌FJSYC7M3则无明显降低作用。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC6M8可显著降低巨噬细胞来源的趋化因子CCL22的水平，有助于缓解异常免疫反应引起的病理炎症状态。
实施例2-9：不同青春双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IFN-γ和IL-10水平的影响
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药青春双歧杆菌CCFM1066的Ad1组、给药青春双歧杆菌FJSYC6M8的Ad2组、给药青春双歧杆菌FJSYC7M3的Ad3组，其中，Ad1组、Ad2组、Ad3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃青春双歧杆菌CCFM1066、FJSYC6M8、FJSYC7M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定与Th1免疫反应相关的细胞因子：IFN-γ和IL-10(结果如图18-19)。
由图18-19可知，与模型组(DNFB)相比，青春双歧杆菌CCFM1066和青春双歧杆菌FJSYC6M8显著提高了小鼠皮肤组织中IFN-γ的水平，此外，青春双歧杆菌CCFM1066显著提高了小鼠皮肤组织中IL-10的水平；而青春双歧杆菌FJSYC7M3则无提高作用。以上实验表明，青春双歧杆菌CCFM1066可显著提高皮肤组织中IFN-γ和IL-10的水平，从而可推断出青春双歧杆菌CCFM1066可显著的上调Th1相关的免疫反应，抑制皮肤组织中Th2免疫反应上调的情况，从而缓解小鼠皮肤的瘙痒，阻止特应性皮炎的进一步发展。
实施例2-10：含有青春双歧杆菌CCFM1066固体饮料的制备
将青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066菌粉；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的pH为6.8；
将含有1×1010CFU的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066菌粉同麦芽糊精进行混合，菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066的固体饮料。
取10克上述含有青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)CCFM1066的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20mL，每只小鼠每天灌胃0.2mL，连续三周，可有效缓解小鼠特应性皮炎的症状，在预防和/或治疗特应性皮炎有极好的效果。
实施例3-1：两歧双歧杆菌的筛选及菌种鉴定
具体步骤如下：
1、筛选
以来源于江苏盐城地区的健康人体粪便作为菌株分离的样本，将样本进行预处理后，放入20％左右的甘油中并保存于-80℃的冰箱，进行菌株分离时，将保存的样本从冰箱中取出并解冻，从混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL无菌水中，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至加了0.05％半胱氨酸的MRS液体培养基进行增菌处理，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1063(原始编号FJSYC2M2)、菌株FAHWH24M3和菌株FAHWU21M3。
2、鉴定
提取CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3的基因组，将CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3的16S rDNA进行扩增和测序(由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行，CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3的16SrDNA扩增的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，菌种鉴定的上游引物27F序列如SEQ ID NO.14所示：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、下游引物1492R序列如SEQ ID NO.15所示：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为两歧双歧杆菌，命名为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)FAHWH24M3和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)FAHWU21M3。
实施例3-2：两歧双歧杆菌的培养
具体步骤如下：
将两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063接入含有0.05％半胱氨酸的MRS固体培养基中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落呈圆形、凸面，微白，不透明，有平滑至粘液状的柔软表面。
将两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063接入含有0.05％半胱氨酸的MRS液体培养基中于37℃厌氧培养24h后，转入新鲜的含有0.05％半胱氨酸的MRS液体培养基中，同样条件培养24h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存在-80℃待用。
实施例3-3：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，利用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模开始前(即第0天)利用数显螺旋测微尺测定6组小鼠的耳朵厚度，造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后立刻测定小鼠耳朵厚度，检测结果如图20。
由图20可知，两歧双歧杆菌CCFM1063、两歧双歧杆菌FAHWH24M3和两歧双歧杆菌FAHWU21M3均可显著降低特应性皮炎小鼠耳朵的厚度，缓解小鼠耳朵的肿胀程度。可见，两歧双歧杆菌CCFM1063、两歧双歧杆菌FAHWH24M3和两歧双歧杆菌FAHWU21M3均具有缓解特应性皮炎小鼠耳朵的厚度及肿胀程度的作用。
实施例3-4：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤病理症状的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行组织病理评分(结果如图21-22)。
由图21-22可知，与空白组(Control)相比，模型组(DNFB)小鼠背部皮肤厚度和炎症浸润情况显著增加；两歧双歧杆菌CCFM1063显著降低小鼠皮肤厚度的增加，缓解了皮肤炎症浸润情况；两歧双歧杆菌FAHWU21M3和两歧双歧杆菌FAHWH24M3则无法缓解小鼠皮肤的炎症状态。可见，两歧双歧杆菌CCFM1063可显著改善特应性皮炎小鼠皮肤炎症。
实施例3-5：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肥大细胞浸润的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行甲苯胺蓝染液(0.5％磷酸盐)染色，然后通过职业技术人员进行肥大细胞计数分析(结果如图23-24)。
由图23-24可知，两歧双歧杆菌CCFM1063显著抑制了皮肤组织中肥大细胞的浸润，同时，降低了肥大细胞产生的数量，抑制了皮肤组织炎症；而两歧双歧杆菌FAHWU21M3和两歧双歧杆菌FAHWH24M3则不能降低皮肤组织中肥大细胞的数量，对组织炎症浸润无显著影响，不能缓解小鼠的皮肤炎症。可见，两歧双歧杆菌CCFM1063可显著抑制特应性皮炎小鼠皮肤肥大细胞引起的炎症浸润。
实施例3-6：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4比例的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定IL-4的水平(结果如图25)。
由图25可知，与模型组(DNFB)相比，两歧双歧杆菌CCFM1063可显著降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4的水平；两歧双歧杆菌FAHWU21M3和两歧双歧杆菌FAHWH24M3虽也有一定的降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-4水平的效果，但是效果不明显。可见，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063有助于抑制特应性皮炎小鼠皮肤中IL-4水平的升高。
实施例3-7：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL11水平的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定CCL11的水平(结果如图26)。
由图26可知，与模型组(DNFB)相比，两歧双歧杆菌CCFM1063可显著降低特应性皮炎小鼠皮肤组织中CCL11的水平，有利于抑制Th2型免疫反应，从而有助于缓解特应性皮炎的病理炎症；两歧双歧杆菌FAHWU21M3和两歧双歧杆菌FAHWH24M3则不能抑制皮肤组织CCL11的升高。可见，灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063有助于降低特应性皮炎小鼠皮肤组织CCL11的水平，有利于缓解特应性皮炎的病理炎症。
实施例3-8：不同两歧双歧杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤组织中IL-10水平的影响
具体步骤如下：
取6周龄健康雌性C57BL/6小鼠30只，随机分为6组，每组5只，6组分别为：空白组(Control)、给药2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)的模型组(DNFB)、给药酮替芬的阳性药物组(Keto)、给药两歧双歧杆菌CCFM1063的BI1组、给药两歧双歧杆菌FAHWH24M3的BI2组、给药两歧双歧杆菌FAHWU21M3的BI3组，其中，BI1组、BI2组、BI3组均为治疗组。
实验共四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，治疗组分别灌胃两歧双歧杆菌CCFM1063、FAHWH24M3、FAHWU21M3菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，阳性药物组灌胃酮替芬药液，以0.2mL药液(单次灌胃药物总量为按小鼠体重一次1mg/kg)/只/次的剂量进行灌胃，空白组与模型组不进行菌液与药液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模第1天，对6组小鼠背部皮肤进行脱毛处理，面积大约为2.5cm×2.5cm，并用50μL浓度为0.5％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％的DNFB溶液涂搽模型组、治疗组以及阳性药物组小鼠背部脱毛区，空白组小鼠背部脱毛区仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照；所有分组均为自由饮水和摄食。
造模结束后(即第15天)取血并处死小鼠，然后取小鼠背部脱毛区皮肤组织，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定IL-10的水平(结果如图27)。
由图27可知，与模型组(DNFB)相比，两歧双歧杆菌CCFM1063和两歧双歧杆菌FAHWH24M3显著降低了小鼠皮肤组织IL-10水平；而两歧双歧杆菌FAHWU21M3则无明显降低作用。可见，两歧双歧杆菌CCFM1063和两歧双歧杆菌FAHWH24M3可显著提高调节免疫反应的细胞因子IL-10的水平，有助于缓解由Th2型异常免疫反应引起的病理炎症状态。
实施例3-9：含有两歧双歧杆菌CCFM1063发酵乳的制备
具体步骤如下：
将两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063菌粉；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的pH为6.8；
将鲜奶加糖溶解后在65℃、20Mpa的条件下均质，得到发酵原料；将发酵原料于95℃下杀菌5min，得到杀菌后的发酵原料；将杀菌后的发酵原料冷却至35℃后在杀菌后的发酵原料加入两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)CCFM1063菌粉、商业保加利亚乳杆菌发酵剂与嗜热链球菌发酵剂三者组成的混合发酵剂，混匀，于35℃下发酵至凝乳，得到发酵乳；将发酵乳于4℃下冷藏24h，得到发酵乳成品；其中，两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)CCFM1063菌粉、商业保加利亚乳杆菌发酵剂与嗜热链球菌发酵剂的质量比为1﹕1﹕1，混合发酵剂在鲜奶中的接种量为鲜奶重量的0.03％。
每只小鼠每天灌胃0.2mL发酵乳成品，连续一月，可有效缓解小鼠特应性皮炎的症状。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 能够缓解特应性皮炎的双歧杆菌及其应用
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> Bifidobacterium breve
<400> 1
ctcctcccgc aaggggttag gccaccggct tcgggtgctg cccactttca tgacttgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgcatt caccgcgacg ttgctgattc gcgattacta 120
gcgactccgc cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga ccggttttca 180
gggatccgct ccagctcgca ctgtcgcatc ccgttgtacc ggccattgta gcatgcgtga 240
agccctggac gtaaggggca tgatgatctg acgtcatccc caccttcctc cgagttaacc 300
ccggcggtcc cccgtgagtt cccggcacaa tccgctggca acacggggcg agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacgacca tgcaccacct 420
gtgaacccgc cccgaaggga aaccccatct ctgggatcgt cgggaacatg tcaagcccag 480
gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaat ccgcatgctc cgccgcttgt gcgggccccc 540
gtcaatttct ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc aggcgggatg cttaacgcgt 600
tagctccgac acggaacccg tggaacgggc cccacatcca gcatccaccg tttacggcgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtaa 720
cggcccagag acctgccttc gccattggtg ttcttcccga tatctacaca ttccaccgtt 780
acaccgggaa ttccagtctc ccctaccgca ctcaagcccg cccgtacccg gcgcggatcc 840
accgttaagc gatggacttt cacaccggac gcgacgaacc gcctacgagc cctttacgcc 900
caataattcc ggataacgct tgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccggtgctta ttcgaaaggt acactcaaca caaagtgcct tgctccctaa caaaagaggt 1020
ttacaacccg aaggcctcca tccctcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg 1080
tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtatctcag tcccaatgtg 1140
gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt cgaagccatg gtgggccgtt accccgccat 1200
caagctgata ggacgcgacc ccatcccatg ccgcaaaggc tttcccaaca caccatgcgg 1260
tgtgatggag catccggcat taccacccgt ttccaggagc tattccggtg catggggcag 1320
gtcggtcacg cattactcac ccgttcgcca ctctcaccac caagcaaagc ccgatggatc 1380
ccgttcgac 1389
<210> 2
<211> 443
<212> DNA
<213> Bifidobacterium adolescentis
<400> 2
agagcggacg agtcaccttg accgggtcgg tgacgcctgc ggccagcagg tcctcgtact 60
cgttggtggc cgcgttcagg ccctggccgt caggcaggga gcggaccttg tcgatcacca 120
cgtcgccgga caggccagcg ttttcggcga tctgcttgat cggggcttcg acggcacgga 180
acacgatcgc ggcaccggtg gcctcgtcgc cttcgagctt gacgtcgtcc ttggccttgg 240
cggcagcctg gatcagggcg acaccgccgc ccggcagcag accttcctcg atagcggcct 300
tggcgttgcg cacggcatcc tcgatgcggt gcttgcgttc cttggcctcg acttcggtgg 360
cagcgccgac cttgatgacg gcgacaccgc cggccagctt ggccaggcgc tcctgcagct 420
tctcacgatc ggttaatcgg aat 443
<210> 3
<211> 1376
<212> DNA
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 3
aggggttagg ccaccggctt cgggtgctgc ccactttcat gacttgacgg gcggtgtgta 60
caaggcccgg gaacgcattc accgcggcgt tgctgatccg cgattactag cgactccgcc 120
ttcacggagc cgggttgcag gctccgatcc gaactgagac cggttttcag ggatccgctc 180
catgtcgcca tgtcgcatcc cgctgtaccg gccattgtag catgcgtgaa gccctggacg 240
taaggggcat gatgatctga cgtcatcccc accttcctcc gagttaaccc cggcggtccc 300
ccgtgagttc ccaccataac gtgctggcaa cacggggcga gggttgcgct cgttgcggga 360
cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat gcaccacctg tgaacccgcc 420
ccgaagggaa acgccatctc tggcgtcgtc gggaacatgt caagcccagg taaggttctt 480
cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg cgggcccccg tcaatttctt 540
tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggacgc ttaacgcgtt agctccgaca 600
cggaacacgt ggaacgtgcc ccacatccag cgtccaccgt ttacggcgtg gactaccagg 660
gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtgac ggcccagaga 720
cctgccttcg ccatcggtgt tcttcccgat atctacacat tccaccgtta caccgggaat 780
tccagtctcc cctaccgcac tccagcccgc ccgtacccgg cgcagatcca ccgttaagcg 840
atggactttc acaccggacg cgacgagccg cctacgagcc ctttacgccc aataaatccg 900
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tcgaaaggta cactcacccg aaggcttgct cccaaacaaa agaggtttac aacccgaagg 1020
cctccatccc tcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc ccattgtgca atattcccca 1080
ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc aatgtggccg gtcgccctct 1140
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<210> 4
<211> 1020
<212> DNA
<213> Bifidobacterium breve
<400> 4
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gatgctccat cacaccgcat ggtgtgttgg gaaagccttt gcggcatggg atggggtcgc 180
gtcctatcag cttgatggcg gggtaacggc ccaccatggc ttcgacgggt agccggcctg 240
agagggcgac cggccacatt gggactgaga tacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatggagg 360
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cgaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt 480
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<212> DNA
<213> Bifidobacterium breve
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ccttcgccat cgggcagaga acgaaccttg ttgatcacca cgtcgccgga cacgccagcg 60
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gcctcttcgc cggtcaggga ggtgacggcc tcagccttct cggccttggc agcagcctga 180
acgagggcca cgccaccgcc gggcagcagg ccttcctcaa tggcggcctt ggcgttacgc 240
acggcatctt cgatgcggtg cttgcgctcc ttggcctcga cctcggtggc agcgccgacc 300
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 8
<211> 432
<212> DNA
<213> Bifidobacterium adolescentis
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tcaccttgac cgggtcggtg acgcctgcgg ccagcaggtc ctcgtactcg ttggtggccg 60
cgttcaggcc ctggccgtca ggcagggagc ggaccttgtc gatcaccacg tcgccggaca 120
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tcagggcgac accgccgccc ggcagcagac cttcctcgat agcggccttg gcgttgcgca 300
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<212> DNA
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<211> 1375
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gggttaggcc accggcttcg ggtgctgccc actttcatga cttgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgcattcac cgcggcgttg ctgatccgcg attactagcg actccgcctt 120
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gtgagttccc accataacgt gctggcaaca cggggcgagg gttgcgctcg ttgcgggact 360
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ggccggctac ccgtcgaagc cttggtgagc cgttacctca ccaacaagct gataggacgc 1200
gaccccatcc cacgccgata gaatctttcc cacaatcaca tgcgatcatg tggaacatcc 1260
ggcattacca cccgtttcca ggagctattc cggagcatgg ggcaggtcgg tcacgcatta 1320
ctcacccgtt cgccactctc accaccaagc aagcttgatg gatcccgttc gactg 1375
<210> 13
<211> 978
<212> DNA
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 13
acggaaccta cttagacggc tccatcccac aaggggttag gccaccggct tcgggtgctg 60
cccactttca tgacttgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgcatt caccgcggcg 120
ttgctgatcc gcgattacta gcgactccgc cttcacggag ccgggttgca ggctccgatc 180
cgaactgaga ccggttttca gggatccgct ccatgtcgcc atgtcgcatc ccgctgtacc 240
ggccattgta gcatgcgtga agccctggac gtaaggggca tgatgatctg acgtcatccc 300
caccttcctc cgagttaacc ccggcggtcc cccgtgagtt cccaccataa cgtgctggca 360
acacggggcg agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacgacca tgcaccacct gtgaacccgc cccgaaggga aacgccatct ctggcgtcgt 480
cgggaacatg tcaagcccag gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaat ccgcatgctc 540
cgccgcttgt gcgggccccc gtcaatttct ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc 600
aggcgggacg cttaacgcgt tagctccgac acggaacacg tggaacgtgc cccacatcca 660
gcgtccaccg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt 720
tcgctcctca gcgtcagtga cggcccagag acctgccttc gccatcggtg ttcttcccga 780
tatctacaca ttccaccgtt acaccgggaa ttccagtctc ccctaccgca ctccagcccg 840
cccgtacccg gcgcagatcc accgttaagc gatggacttt cacaccggga cgcgacgagc 900
cgcctacgag ccctttacgc ccaataaatc cggataacgc ttgcgcccta cgtattaccg 960
cggctgctgg cacgtagt 978
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，其特征在于，所述短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60703，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，其特征在于，所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60702，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
3.一株两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于，所述两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)已于2019年06月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60701，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
4.一种制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品的方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一所述的菌株。
5.如权利要求4所述的一种制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品的方法，其特征在于，所述产品中，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
6.一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1-3任一所述的菌株。
7.如权利要求6所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品中，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的活菌数不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
8.如权利要求6或7所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品包含食品或药品。
9.如权利要求8所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述药品除菌株外，还含有药物载体和/或药用辅料。
10.如权利要求8所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的保健食品；或所述食品包含使用含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的固体饮料。
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